CONTEXTE

Groupe CIDPHARMEF 2008/09

CONAKRY : Pr Aliou BALDE

ANGERS : Pr Olivier DUVAL

« Thématiques structurées et spécialités scientifiques »

BUT

Identifier les molécules et extraits d’origine végétale possédant

des propriétés anti-oxydantes et anti-AGEs et

valider leurs effets thérapeutiques sur certaines maladies

groupe « PROVASC »: Développement de molécules anti-oxydantes et/ou anti-AGEs d’origine

naturelle pour la protection vasculaire. coordonné par Pierre Pacaud (UMR 915, Inserm / Université de Nantes)

Moyens 8 laboratoires sur la région Pays de Loire

> 2 M € sur 4 ans

laboratoires

* Biologie Neurovasculaire Intégrée (BNVI) Dir. D. Henrion

* Substances d’Origine Naturelle et Analogues Structuraux (SONAS) Dir. P. Richomme

« Thématiques structurées et spécialités scientifiques »

RESULTATS PRELIMINAIRES

Extraits hydroalcooliques de 4 plantes Guinéennes

Laboratoire de Biologie Neurovasculaire Intégrée

(BNVI)

UMR CNRS 6214 / INSERM 771 Dir. D. Henrion

Membre du groupe « PROVASC »:

Développement de molécules anti-oxydantes et/ou anti-AGEs d’origine

naturelle pour la protection vasculaire.

Test de la fonction vasculaire sur artères isolées

Mulvany, M.J., Halpern, W., 1977. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation 41, 19-27.

Myographe pour Artères de résistance

1- Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales :

Exemples des deux substances contrôles : Tempol (SOD-mimétique) et apocynine (inhibiteur des NAD(P)H-

oxydases).

Tempol 10-4 M

Apocynin 10-4 M

WWW

W

WW

WW

WW

U46619

W W

U46619

U46619

U46619

U46619

U46619

B

A

Wal

l for

ce (

mN

)W

all f

orce

(m

N)

W

W

U46619

Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales :

Les substances testées (50 µg/ml) diminuent l’action vasoconstrictrice du U46619. Une partie de cette effet résulte de la

stimulation de l’endothélium.

SONAS 177 = HafSONAS 178 = Haf 3SONAS 179 = Haf 5SONAS 180 = PerSONAS 181 = U. t.SONAS 182 = S. bowal

% in

hib

itio

n d

e la c

on

tracti

on

Sans endothéliumAvec endothélium

Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales:

Les 6 substances testées (50 µg/ml) induisent une vasorelaxation, en partie via la stimulation de l’endothélium.

SONAS 177 = HafSONAS 178 = Haf 3SONAS 179 = Haf 5SONAS 180 = PerSONAS 181 = U. t.SONAS 182 = S. bowal

% r

ela

xati

on

Sans endothéliumAvec endothélium

Conclusion: Vasorelaxation en partie par un effet direct sur

l’appareil contractile et en partie par stimulation de

l’endothélium vasculaire.

Perspectives:1- Eclaircir le mécanisme d’interaction avec avec

l’appareil contractile (effet anti-oxydant et/ou

autre(s) mécanisme(s))

2- Eclaircir le mécanisme de stimulation de

l’endothélium et la voie impliquée (NO, EDHF,

prostanoïdes…).

• Extractions et analyses chromatographiques : GC, CC, MPLC, CLHP-DAD & CLHP-DDL, FCPC (collaboration Kromaton Technologies)

• Analyses structurales : RMN 270, 300 & 500 MHz, Spectromètres de masse : Haute résolution (B/E), LC-MSn & maldi-tof

SONAS : SONAS : UPRES EA 921UPRES EA 921, Dir. Pr P. Richomme

VEGEPOLYSVEGEPOLYS

LE CONTRAT DE PÔLE : UN LABEL ET UN ENGAGEMENT

5 axes thématiques validés par le et la Recherche

Innovation Variétale

Qualité Sanitaire des Semences et Plants

Santé et Végétal

Horticulture et Paysage Urbain

Veille et l’Intelligence Economique

VEGEPOLYS : VEGEPOLYS : Les Centres Techniques

Veille et intelligence économique

dans le végétal

CIETCentre d’Intelligence

Economique Territorial Horticulture et Paysage urbain

Plante et Cité

Innovation Variétale Qualité sanitaire des semences et

des plants

Santé et Végétal

Centre d’Innovation et de Transfert de Technologie du Végétal SpécialiséValValtechtech

Potentiel antioxydant

de l’organisme

Radicaux libres et ROS endogènes (respiration,

système immunitaire…) ou exogènes (UV, radiations

ionisantes, métaux…)

Stress Oxydatif

Balance oxydativeBalance oxydative

Enzymatique (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase…) ou non (acide ascorbique, vitamine E, flavonoïdes, Polyphénols…)

Radicaux libres et ROS

Tests d’activitésAntioxydantes

Tests AntiOxydant - AOTests AntiOxydant - AO

Principe : Sous l'action des radicaux libres introduits

volontairement dans un milieu réactionnel, un

substrat particulier* ainsi détruit perd sa capacité

de fluorescence tandis que cette dernière persiste

lorsqu’un (des) capteur(s) de radicaux libres

est(sont) incorporé(s) dans le milieu.

Objectifs : Evaluation de l’AO d’un extrait, d’un

composé, d’un mélange… exprimée en équivalent

Trolox** par g, par mL (TE/g, TE/mL) …

*-phycoerythrine, fluoresceine.(*acide hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylique, analogue synthétique hydrosoluble de la vitamin E)

Tests AO – ORAC Tests AO – ORAC (Total Oxygen Radical Absorbance Capacity)

Intensitˇ de fluorescence=f(temps)

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Temps (min)

Inte

nsitˇ

de

fluor

esce

nce

blanctrolox 6.25trolox 12.5trolox 25trolox 50trolox 100

Tests AO - ORACTests AO - ORAC

Oxydation de la fluorescéine en présenced’AAPH (Ou et al, 2001)

=> valeur ORAC exprimée en équivalents TROLOX

Tests AO - ORACTests AO - ORAC

Test DPPH

• Principe : Une solution méthanolique d’un radical stable, le DiPhénylPicrylHydrazyl

présente une coloration violette (max 517

nm) qui disparaît avec la destruction du radical.

• Objectif : Evaluation de l’AO d’un extrait, d’un composé, d’un mélange… exprimée en équivalent Trolox ou comparée à celle de conservateurs utilisés dans l’industrie agro-alimentaire : BHA (butylhydroxyanisole), BHT (butylhydroxytoluène)…

Tests AO - DPPHTests AO - DPPH

Garcinia viellardii (Clusiaceae):

A.-E. HAY, M.-C. AUMOND, S. MALLET, V. DUMONTET, M. LITAUDON, D. RONDEAU and P. RICHOMME : "Antioxidant xanthones from Garcinia viellardii", J. Nat. Prod., 67 (4), 707-09 (2004)

Tests AO - DPPHTests AO - DPPH

Test de Peroxydation des Lipides

• Principe:A partir d’un modèle « naturel » (microsomes hépatiques), dosage des peroxydes en présence ou non d’un(d’) agent(s) AO => dosage colorimétrique (532 nm) des TBARS/MDA après oxydation (Fe2+/Vc ou AAPH)

• Objectif : Evaluation du degré de protection des acides gras polyinsaturés vis à vis de la peroxydation.

Tests AO - Peroxydation lipidiqueTests AO - Peroxydation lipidique

• Principe : Génération photochimique de radicaux libres détectés par chemiluminescence.

• Objectif : évaluation automatisée du potentiel antioxydant de composés/mélanges hydro ou lipophiles.

• Mesure de l’activité de la superoxyde dismutase

• Inconvénient : Technique manuelle (10/j)

Tests AO - Photochem®Tests AO - Photochem®

RESULTATS PRELIMINAIRES

Tests DPPH

Tests Anti-AGEs = Tests Anti-AGEs = D. SERAPHIN, D. SERAPHIN, S. DERBRE S. DERBRE Advanced Glycated Endproducts, Advanced Glycated Endproducts, inhibitorsinhibitors and and breakersbreakers

● ● Formation des AGEs ou réaction non-enzymatique de MaillardFormation des AGEs ou réaction non-enzymatique de Maillard

- Complications des diabètes

- Maladies neurologiques (Alzheimer…)

- Maladies articulaires…

- Vieillissement tissulaire

► ► Médicaments potentielsMédicaments potentiels

► ► Actifs de produits cosmétiques ou de Actifs de produits cosmétiques ou de compléments alimentairescompléments alimentaires

●● Obtention de la quantité maximale d’AGEs en un minimum de tempsObtention de la quantité maximale d’AGEs en un minimum de temps

- Plaque 96 puits ; détection : fluorescence λexc 370 nm ; λem 440 nm

- Nature et concentration de la protéine : BSA 10 mg/mL

- Sucre réducteur : ribose 0,5 M

- Conditions physiologiques : 37 °C / tampon phosphate 50 mM pH 7,4

- Durée de l’incubation : 24 h

1. J. A. Vinson et al., J. Nutr. Biochem. 1996, 7, 659-663.

Tests Anti-AGEsTests Anti-AGEs

Méthode de criblage des anti-AGEsMéthode de criblage des anti-AGEs

●● Criblage de molécules Criblage de molécules purespures

- Molécule testée : gamme de concentration 10-5 à 10-2 M

- Soustraction de la fluorescence intrinsèque de la molécule

→ détermination de la CI50

H2N NH

NH

NH2

Aminoguanidine

O O

Coumarine 1exc = 270 nmem = 352 nm

Coumarine 2exc = 333 nmem = 416 nm

OO OH

CF3

Coumarine 3exc = 370 nmem = 438 nm

O O

O

Cl

●● Criblage de molécules Criblage de molécules purespures

→ test efficace

N

O

O

O

O

Berbérine

OH

HO N

N

5-(4-benzylpiperazin-1-yl)benzene-1,3-diol

OO O

O

O

O

H

H

Roténone

Test Anti-AGEsTest Anti-AGEs

●● CICI5050

Test Anti-AGEs : application au Test Anti-AGEs : application au SONASSONAS

Echantillon n°CI50%

en mol/LEchantillon n°

CI50%

en mol/L

22 0,0011 59 0,000130 0,0002 60 0,001531 0,0002 61 0,001740 0,0002 62 0,005248 0,0027 63 0,000156 0,0010 64 0,000257 0,0017 69 0,000658 0,0006 71 0,0006

12

=> analyse complémentaire

16

inhibiteurs

52

inactifs

2

inducteurs 82 éch./SONAS

●● Criblage d’extraits végétauxCriblage d’extraits végétaux

Derris ferruginea

Tiges

Feuilles

Callophyllum wallichianumEcorces de tiges

→ Problèmes de quenching

Test Anti-AGEsTest Anti-AGEs

RESULTATS

PERPECTIVES

RESULTATS

•Résultats encourageants pour les AOs + sur vaisseaux

•En attente de mise au point pour la méthode AGEs

PERPECTIVES

•Mise en place du projet (conventions avec Angers et autres)

•Convention entre pays membre

•Identification de la plante

•Échanges de chercheurs

•…

Protocole de tests de l’effet vasodilatateur des substances végétales:

Application sur une artère précontractée en présence ou en absence d’endothélium.

Exemple de l’acétylcholine entièrement endothélium dépendante.

ACh bulles ACh

Bulles: le passage de quelques bulles d’air dans la lumière de l’artère enlève l’endothélium

1. J. Peyroux M. Sternberg, Pathologie Biologie. 2006, 54, 405-419.

NH

O

O

NH2

Protein (lysine)

+

Reducing sugar(glucose, fructose, pentoses)

OHH

HOH

OHH

OHH

CH2OH

O H

NH

O

O

NH

R

OHOH

Schiff base

NH

O

O

NH

R

OOH

Amadorirearrangement

AGEs

Albumine

OHH

OHH

OHH

CH2OH

O H

OO OH

CF3

AGEs AGEs

Rinçage

Test anti-AGEs sur Extraits brutsTest anti-AGEs sur Extraits bruts

- Développement et automatisation d’un criblage adapté aux extraits végétaux

→ immobilisation de l’albumine au fond des plaques 96 puits

→ rinçage des interférents possible

Albumine

OHH

OHH

OHH

CH2OH

O H

OO OH

CF3

Albumine

Test anti-AGEs sur Extraits brutsTest anti-AGEs sur Extraits bruts

Doctorat co-encadréPCDA/SONAS