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Consultez le site de Nicolas BERTRAND, vous y trouverez les

articles que vous devrez présenter en trinome le 27 février

avec Françoise MUSCATELLI

CARTOGRAPHIE PHYSIQUECARTOGRAPHIE PHYSIQUECLONAGE POSITIONNELCLONAGE POSITIONNEL

Laurent VILLARDInserm Unité 491

Faculté de Médecine de La Timone

http://www.team3-u491.net

M1Génétique des Mammifères2006 - LUMINY

1

CARTES PHYSIQUES

Etablir la carte physique d’un génome consiste à localiser les gènes, les marqueurs génétiques, le centromère etc… le long des chromosomes à leur position correcte.

Il existe différentes résolutions pour une carte physique :

Basse

Haute

Chromosome

Hybrides d’irradiation

Contig de YACs

Contig de cosmides

Sequence

Reso

lutio

n

29

CARTES PHYSIQUES - HYBRIDATION IN SITU

FISHFISH (Fluorescent In Situ Hybridization)

Un fragment d’ADN (gène, marqueur etc…) est marqué avec une molécule fluorescente.

Cette sonde est hybridée directement sur une préparation de noyau où les chromosomes sont en métaphase (et donc reconnaissables).

Précision obtenue : environ 5 Mb (i.e. basse résolution)

Il existe une technique de FISH sur fibre de chromatine étirée où la précision peut atteindre 10 kb mais on ne peut plus reconnaître le chromosome (cette technique est utilisée pour positionner les sondes les unes par rapport aux autres dans une région déjà cartographiée à basse résolution).

30

Caryotype humain standard

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22

X Y

31

Caryotype « spectral » - SKY (Spectral KarYotyping) 32

Exemple de FISH utilisant deux sondes :

1- centromère du chromosome X (Xcen) 2- gène STS (Xp22.3)

33

Que se passe-t-il chez cet individu ?Délétion de la région contenant le gène STS

CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES SOMATIQUES

Hybrides somatiques (SCH, Somatic Cell Hybrids)Hybrides somatiques (SCH, Somatic Cell Hybrids)

C’est le résultat de la fusion cellule humaine / cellule de rongeur.Certains chromosomes humains sont retenus par l’hybride.

Le contenu chromosomique des hybrides est déterminé et ils sont ensuite utilisés pour localiser un gène, un marqueur…

L’information obtenue est de l’ordre de la région chromosomique.

+

Cellule humaine Cellule de rongeur Cellule de rongeur + chromosome(s) humains

Fusion

34

CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES SOMATIQUES

Exemple d’utilisation d’un « panel » de localisation

Chromosomes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X YHybride #1 + + + + + + + +Hybride #2 + + + + + + +Hybride #3 + + + + +Hybride #4 + + + + + + + +Hybride #5 + + + + + + +Hybride #6 + + + + + + + +

Le gène testé par PCR sur l’ADN des hybrides donne un signal positif dans les hybrides 1 et 4. Tous les autres hybrides sont négatifs.

Quel est le chromosome sur lequel est situé ce gène ?

35

36CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES SOMATIQUES

Exemple d’utilisation d’un « panel » de localisation

Chromosomes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X YHybride #1 + + + + + + + +Hybride #2 + + + + + + +Hybride #3 + + + + +Hybride #4 + + + + + + + +Hybride #5 + + + + + + +Hybride #6 + + + + + + + +

Le gène testé par PCR sur l’ADN des hybrides donne un signal positif dans les hybrides 1 et 4. Tous les autres hybrides sont négatifs.

Quel est le chromosome sur lequel est situé ce gène ? Chr.18

CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES d’IRRADIATON

Une précision supérieure peut être obtenue en utilisant des cellules cellules humaines lourdement irradiées et fusionnées à des cellules de hamster (hybrides d’irradiation(hybrides d’irradiation).

Deux marqueurs initialement localisés à proximité l'un de l'autre ont plus de chance d'être simultanément retrouvés dans les mêmes hybrides que deux marqueurs éloignés. Les distances se mesurent en centiray (cR).

+

Cellule humaine Cellule de rongeur Cellule de rongeur + Fragment(s) de chromosome(s) humains

Rayons X

Fusion

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CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES d’IRRADIATON

Il existe des hybrides d’irradiation pour plusieurs espèces : Homme ,vache, souris, rat, cochon, poisson zèbre, chien, cheval.

La dose d'irradiation (rayons X) appliquée aux cellules humaines va conditionner la résolution de la carte : plus la dose de rayons est forte, plus les fragments générés sont petits et donc plus la résolution sera grande.

Les doses varient de 3.000 à 50.000 rads, c’est-à-dire une taille moyenne des fragments allant de 10 Mb à 800 kb.

Ces outils sont disponibles dans le commerce.

38

Comparaison entre carte des hybrides d’irradiation et carte génétique (basse résolution) du chromosome 13 humain.

La carte des hybrides d’irradiation est plus proche de la carte physique que de la carte génétique.

39

CARTES PHYSIQUES - Les Contigs de Clones

On utilise des clones afin d’isoler la région du génome qui nous intéresse et de disposer de l’ADN correspondant de manière illimitée (facile d’accès, reproductible).

Un contig de clones est une série de fragments d’ADN clonés dont chacun chevauche son voisin dans l’ordre correct le long des chromosomes.

Types de clones utilisés :

Plasmides E. Coli - 10 kb ---Phages E. Coli - 20 kb ---Cosmides E. Coli - 40 kb -PACs E. Coli - 100 kb (80-150 kb) ++BACs E. Coli - 150 kb (100-300 kb) +++YACs S. cerevisiae - 1.000 kb (1 Mb) (0,5 - 2 Mb) +++

43

CARTES PHYSIQUES - Marqueurs STS & EST

STSSTSs (Sequence Tagged Sites)

Loci spécifiques pour lesquels suffisamment d’information de séquence est disponible pour faire des amorces PCR et amplifier le locus correspondant (quelques centaines de pb). La seule information nécessaire pour définir un STS est la séquence des amorces PCR.

ESTESTs (Expressed Sequence Tag)

Etiquettes spécifiques de chacun de gènes. Ils proviennent des informations de séquence des ADNc et donc représentent des séquences transcrites.Ils peuvent provenir du 3’, du 5’ d’un ADNc ou des deux côtés.Il existe plusieurs ESTs pour chaque gène.

47

!

!

CARTES PHYSIQUES - La Séquence Du Génome 53

CARTES INTÉGRÉES 54

CARTES PHYSIQUES - La Séquence Du Génome

• Le génome humain est composé de 3.272 millions de nucléotides.

• La taille moyenne d’un gène est de 3000 bases, mais la taille varie beaucoup (ex : le gène de la dystrophine a une taille de 2,4 millions de bases).

• Le nombre total de gène se situe entre 25.000 et 30.000.

• 99.9% des nucléotides sont identiques entre deux personnes. Il existe donc 0,1% de différences (soit environ 3,5 millions de différences par génome).

• Plus de 50% des gènes ont une fonction inconnue.

55

CARTES PHYSIQUES - La Séquence Du Génome

• Les régions riches en gènes sont également les régions riches en nucléotides G/C

• Les régions pauvres en gènes sont riches en A/T. Ces différentes régions peuvent généralement être visualisées comme des bandes claires ou sombres des chromosomes métaphasiques.

• Le chromosome 1 contient le plus grand nombre de gènes estimés (environ 3000) tandis que le chromosome Y en a le moins (231).

• Moins de 2% de l’ADN code pour des protéines.

• Les séquences répétées composent environ 50% de la totalité du génome.

56

Cytogénétique

Points de cassure chromosomique

STS

Couverture basse resolution

YACs

Couverture Haute resolution

Autres clones génomiques

Contigs

Cosmides

Pathologies localisées

Gènes clonés

Marqueurs génétiques

Marqueurs murins homologues

Régions de synténie

57

www.ensembl.org58

Sta

tisti

qu

es

59

D7S1790

CLONAGE POSITIONNEL

IDENTIFICATION DE GÈNES DE PATHOLOGIEIDENTIFICATION DE GÈNES DE PATHOLOGIE

- Clonage Fonctionnel

- Clonage Positionnel- Clonage Positionnel

- Approche gène candidat position-indépendant

- Approche gène candidat positionnel

61

62

Gène non identifié de la maladieGène non identifié de la maladie

Produit Produit du gènedu gène

Essai Essai fonctionnelfonctionnel

Idée générale de Idée générale de la pathogenèse la pathogenèse

moléculairemoléculaire

Pathogenèse Pathogenèse moléculaire connues moléculaire connues pour des pathologies pour des pathologies

similaires (chez similaires (chez l ’Homme ou l ’animal)l ’Homme ou l ’animal)

APPROCHE GENE CANDIDATAPPROCHE GENE CANDIDATINDEPENDANT DE LA POSITIONINDEPENDANT DE LA POSITION

CLONAGE POSITIONNELCLONAGE POSITIONNEL

APPROCHE GENE CANDIDATAPPROCHE GENE CANDIDATPOSITIONNELPOSITIONNEL

Localisation sous-Localisation sous-chromosomique chromosomique

connueconnue

Bases biochimiques de la Bases biochimiques de la pathologie connuespathologie connues

CLONAGE FONCTIONNELCLONAGE FONCTIONNEL

Clonage Fonctionnel (exemples)Clonage Fonctionnel (exemples)

- Hémophilie AObtention de la séquence protéique du facteur VIII de porc. Obtention d ’oligonucléotides susceptibles de coder pour une partie de la séquence criblage d ’une banque d ’ADNc humaine avec des oligonucléotides

63

- Anémie de Fanconi groupe CComplémentation fonctionnelle par transformation de cellules déficientes avec des fragments d ’ADN générés au hasard jusqu ’à sauver le phénotype mutant.

- PhénylcétonurieL’enzyme responsable de la pathologie était connue (phénylalanine hydroxylase). L ’enzyme a été purifiée et des anticorps spécifiques ont été produits. Les anticorps ont servi à immunoprécipiter des polysomes contenant l ’ARN d ’intérêt.

Les étapes d’un clonage positionnelLes étapes d’un clonage positionnel

1- disposer de la localisation sous-chromosomique du locus morbide

2- réaliser une carte physique de la région identifiée en utilisant des clones génomiques et des nouveaux marqueurs

3- identifier tous les gènes présents dans la région

4- rechercher des mutations dans ces gènes et identifier le gène responsable

64

Obtenir une localisation sous-chromosomiqueObtenir une localisation sous-chromosomique

Analyse de liaison génétique

Permet d’identifier un marqueur donnant un lod score supérieur à 3 dans des études familiales. C’est la plus utilisée des méthodes de localisation génétique.

65

Marqueur lod score ()

à = 0

A - B 0.45 C 0.87

D -

gène muté

A1

B2C4D8

Gène mutéGène muté

D9

B2C4

A1A1

B3C7

B2C4

A

D D8

B2C7

A3

A3

C7D9

B3

66Obtenir une localisation sous-chromosomiqueObtenir une localisation sous-chromosomique

Mise en évidence d’un déséquilibre de liaison

Il s’agit de l’association non aléatoire d’allèles pris à des loci différents.

Les patients atteints d’une maladie ont hérité, d’un ancêtre commun, un segment de chromosome contenant le gène pathologique et les marqueurs qui lui sont liés sous leur forme allélique spécifique (ceux-ci sont donc en déséquilibre de liaison).

A3

B4

C2

D7

A1

B2

C6

D1

Mutation

A3

B4

C2

D7

A1

B2

C6

D1

Apparition d’une mutationSur l’haplotype A3-B4-C2-D7

Les allèles proches de la mutation (ex. B4 et C2) peuvent être transmis en même temps que la mutation et donc se retrouver en déséquilibre de liaison chez les individus atteints.


Mise en évidence d’une perte d’hétérozygotie(LHO - Loss of heterozygosity)

Permet d ’identifier une région chromosomique délétée par analyse familiale de la transmission de marqueurs polymorphes.


Mise en évidence d’une anomalie chromosomique

Permet de déterminer la région du génome impliquée dans une maladie. Les anomalies peuvent être de plusieurs types : inversions, translocations, délétions, duplications.

chromatide

p

q

centromère

chromosomea bt(a;b)

TRANSLOCATION RÉCIPROQUE

Obtenir une localisation sous-chromosomiqueObtenir une localisation sous-chromosomique

Cartographie d'exclusionCartographie d'exclusion

QuickTime™ et undécompresseur Sorenson Video 3

sont requis pour visionner cette image.

69Les étapes d’un clonage positionnelLes étapes d’un clonage positionnel





70Les étapes d’un clonage positionnelLes étapes d’un clonage positionnel





Identifier les gènes dans la région d’intéret

1- Cartographie des îlots CpG

2- Sélection directe d’adn complémentaire

3- Recherche de séquences conservées au cours de l’évolution

4- Piégeage d’exons

5- Utilisation de méthodes bioinformatiques

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Identifier les gènes dans la région d’intéret

1- Cartographie des îlots CpG

2- Sélection directe d’adn complémentaire

3- Recherche de séquences conservées au cours de l’évolution

4- Piégeage d’exons

5- Utilisation de méthodes bioinformatiques

72

73www.ensembl.org

http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Registered/Webapp/nix/

Les étapes d’un clonage positionnelLes étapes d’un clonage positionnel



3- identifier tous les gènes dans la région d’intérêt


74

Types d’anomalies moléculaires a l’origine d’une pathologie

75

?

Anomalies structurellesdélétions - insertions - expansions de tripletduplicationstranslocations

Anomalies d’expression du transcritabsence d’expressionexpression bi-allélique anormale

Mutations ponctuellesmutations faux-sensmutations non-sensmutations d’épissage

Comment savoir si une mutation est pathogène ?Comment savoir si une mutation est pathogène ?80

- peut-on complémenter le phénotype avec une copie normale du gène ?

- une inactivation chez un animal modèle reproduit-elle le phénotype humain ?

- cette mutation est-elle absente chez les individus normaux ?

- cette mutation modifie-t-elle la protéine produite ?

Le clonage d’un gène de pathologie permet 81

- A terme, éventuellement, thérapie génique / pharmacologique

- Analyse de la protéine et de ses interacteurs potentiels

- Analyse de la fonction normale et pathologique du produit du gène

- Corrélations génotype / phénotype

- Conseil génétiquerisque de récurrencediagnostic prénatal

Adresses électroniques utiles

Chromosomes humains (cartographie)http://www.ornl.gov/hgmis/launchpad/http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/human-gen-db-chromosomes.html

Maladies génétiqueshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htmlhttp://bisance.citi2.fr/GENATLAS/http://orphanet.infobiogen.fr/http://www.icondata.com/health/pedbase/pedlynx.htmhttp://gdbwww.org/

Cartographie du génome humain - Marqueurs polymorpheshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/http://genome.ucsc.edu/index.htmlhttp://www.ensembl.org/http://www.chlc/org/http://www.genethon.fr/http://www.cephb.fr/ceph-genethon-map.html

Bases de données de séquenceshttp://www.ebi.ac.uk/embl/index.htmlhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/

82

EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989)

La mucoviscidose (CF = cystic fibrosis) est la maladie génétique autosomique

récessive mortelle la plus fréquente chez les caucasiens.

La prévalence est de 1/2.000 nouveaux-nés.

1 adulte sur 22 est porteur de l'allèle mutant !

Le gène CF a été le troisième gène isolé grâce au clonage positionnel (après celui

de la granulomatose chronique et celui de la myopathie de Duchenne).

Il n'y avait aucun remaniement chromosomique disponible pour localiser le gène,

et il n'existait pas de carte très précise du génome à l'époque (ni génétique, ni

physique).

Le gène CFTR a été localisé initialement en 7q21 parce qu'il co-ségrégeait avec

deux marqueurs RFLP (les seuls disponibles à l'époque).

Ces marqueurs ont été utilisés comme points de départ pour isoler des clones

d'ADN de la région concernée et pour reconstruire la carte physique de la région.

Le gène a été identifié en utilisant différentes méthodes (zoo blots,

northern blots et criblage de banques d'ADNc fabriquées à partir de

patients CF).


Le gène CFTR (cystic fibrosis conductance regulator) code pour une protéine ayant

la fonction de canal chlore.

Cette protéine est responsable du transport de chlore à travers la membrane

plasmique des cellules épithéliales qui bordent les voies respiratoires.

Il y a un co-transport chlore-eau qui permet la sécrétion d'eau et donc la dilution

du mucus des voies respiratoires.

Chez les patients atteints de mucoviscidose, cette sécrétion d'eau se fait mal et le

mucus s'accumule dans les voies respiratoires créant des difficultés respiratoires.

L'espérance de vie des patients est fortement diminuée (d'autres signes cliniques

son présents).


Le gène CFTR (cystic fibrosis conductance regulator) code pour une protéine ayant

la fonction de canal chlore.

On pense que les personnes conductrices d'un allèle mutant CF pourraient avoir

un avantage sélectif dans les populations où la diarrhée de l'enfant suite à des

infections intestinales est commune.

Les hétérozygotes auraient un fonction de CFTR réduite et perdraient ainsi moins

d'eau (et seraient donc moins sujets à la déshydratation) que ceux qui ont deux

allèles fonctionnels.

Cela expliquerait le fort taux d'hétérozygotes dans certaines populations.

90% des hétérozygotes sont porteurs de l'allèle F508 (effet fondateur)


EXEMPLE 2 : MYOPATHIE CENTRONUCLÉAIRE (2005)

Analyse de liaison sur tout le génome avec des microsatellites en utilisant deux

grandes familles de myopathie centronucléaire (6 et 8 individus atteints).

3 marqueurs ont donné des lods scores positifs : D19S884, D19S865 et D19S226.

D'autres petites familles de CNM ont été génotypé pour ces marqueurs et les

évènements de recombinaison ont permi de définir un intervalle critique en

19p13.2 d'une taille de 11 Mb.



Dans la région minimale critique se trouve le gène de la dynamine, impliquée dans la cohésion des centrosomes.

EXEMPLE 3 : TEST DE PATERNITÉ

Article 312 du Code Civil"L'enfant conçu pendant le mariage a pour père le mari".

Depuis 1972, cet article a un second alinéa :"Néanmoins, celui-ci pourra désavouer l'enfant en justice, s'il justifie de faits propres à démontrer qu'il ne peut en être le père".

Ce test consiste à calculer la probabilité que l'enfant et son père présumé portent un allèle commun par hasard et non par filiation.

On utilise le génotypage à plusieurs microsatellites :

- plusieurs marqueurs- marqueurs très informatifs

Le taux d'erreur est d'environ 1 / 1.000.000.000Le taux d'erreur est de 0 si l'enfant et le père n'ont pas les mêmes allèles

Cellules utilisées : cellules jugalesInterdit en France sauf dans le cadre d'une procédure judiciaire.

EXEMPLE 4 : POLICE SCIENTIFIQUE

Le principe est le même.On cherche ici à calculer la probabilité que le suspect d'un crime et l'ADN retrouvé sur les lieux soient identiques par hasard et non parce qu'ils appartient au même individu.

On utilise le génotypage à plusieurs microsatellites :

- plusieurs marqueurs- marqueurs très informatifs

Problème ici : plusieurs suspects apparentés peuvent avoir les mêmes allèles…Le travail est donc plus complexe que dans le cas d'un test de paternité.

EXEMPLE 5 : LE FNAEG

Fichier National Automatisé des Empreintes Génétiques

Créé en 1998, commun à la Police et à la Gendarmerie.

Date de la loi Champ d'application .

17-06-1998 Infractions de nature sexuelleConservation des empreintes seulement pour lespersonnes condamnéesRefus de prélèvement possible

15-11-2001 Extension aux crimes d'atteinte grave aux personnes(homicides, violences criminelles…)Conservation des empreintes seulement pour lespersonnes condamnéesSanction en cas de refus de prélèvement

18-03-2003 Extension à tous les délits (vols simples, recel…)Conservation du profil des personnes mises en examenet pas uniquement des coupablesSanction en cas de refus, y compris pour les personnesmises en cause

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