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Biologie des Entomophages UPRES 2084 Faculté des Sciences Université de Picardie Jules Verne

Amiens, 14-16 avril 2003

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XIVème Colloque de Physiologie de l’Insecte


ité d’organisation

ilippe Giordanengo

as Cherqui

ançoise Dubois

thalie Rocard

elise Fourdrain

ité Scientifique

ilippe Giordanengo

as Cherqui

Avec le soutien de

• l’Université de Picardie Jules Verne • Amiens Métropole • Bio-Rad

XIVème Colloque de Physiologie de l’Insecte ; Amiens 14-16 avril 2003

Université de Picardie Jules Verne Biologie des Entomophages



PROGRAMME SCIENTIFIQUE

XIVème Colloque de Physiologie de l’Insecte ; Amiens 14-16 avril 2003 Programme Scientifique

Lundi 14 avril 2002

13h00-15h00 Accueil des participants Mise en place des Posters

15h00-15h30 Ouverture du Colloque 15h30-16h15 Gérard Devauchelle, Conférence introductive

Les baculovirus vecteurs d'expression: outil pour l'étude de la physiologie des lépidoptères G Devauchelle, M Cerutti

16h15-17h30 Présentation des posters 17h30-19h30 Coktail de bienvenue

Mardi 15 avril

Session Comportement / Nutrition modérateur : Laure Kaiser8h45-9h30 Felix Wäckers, Conférence plénière Sugars in parasitoid nutrition: trick or treat? 9h30-9h50 Hichem Azzouz

Influence of carbohydrate diets on the longevity of the aphid parasitoid: Aphidius ervi (Hymenoptera: Braconidae) H Azzouz, FL Wäckers, P Giordanengo, L Kaiser

9h50-10h10 Isabelle Leoncini

Pouvoir inhibiteur des butineuses sur le développement comportemental des jeunes ouvrières : comparaison de trois races géographiques d’abeilles domestiques, Apis mellifera L. I Leoncini, C Brillet, Y Le Conte

10h10-10h40 Pause / Session Posters 10h40-11h00 David Guez Le methyl parathion, un stimulant mnésique chez l’abeille domestique

D Guez, H Zhu, S-W Zhang, MV Srinivasan


Session Parasitisme / Symbiose modérateur : Nathalie Volkoff11h00-11h45 Francesco Pennacchio, Conférence plénière Molecular and functional bases of host regulation by Toxoneuron nigriceps

and its associated polydnavirus 11h45-12h05 Catherine Dupuy

Caractérisation du contenu du génome d'un virus symbiote du parasitoïde Cotesia congregata (Braconidae, Microgastrinae) C Dupuy, E Huguet, E Espagne, L Cattolico, B Provost, JM Drezen

12h05-12h25 Fabrice Vavre Quand les microparasites manipulent la physiologie des insectes

F Vavre, F Dedeine, J Varaldi, P Couble, P Mavingui 12h25-14h00 Déjeuner 14h00-14h20 Franck Dedeine

Une bactérie parasite nécessaire à l'ovogenèse chez l'Hyménoptère Asobara tabida (Braconidae) F Dedeine, F Vavre, M Boulétreau

14h20-14h40 Yvan Rahbé

Buchnera aphidicola, bactérie endosymbiotique des pucerons : génomes et physiologie symbiotique Y Rahbé, Z Al-Ayoubi, F Calevro, H Charles, JM Fayard, G Febvay, AA Heddi

14h40-15h00 Federica Calevro

Transcriptome analysis of Buchnera,the intracellular symbiotic bacteria of aphids : a methodological approach F Calevro, H Charles, N Reymond, V Dugas, JP Cloarec, J Bernillon, Y Rahbé, G Febvay, JM Fayard

Session Système Immunitaire modérateur : Bernard Duvic

15h00-15h45 Michel Bréhelin, Conférence plénière Dépression des réactions d'immunité cellulaire chez les Insectes

M Brehélin, N Volkoff 15h45-16h05 Corinne Labrosse

Les facteurs immunosuppresseurs dans le système Leptopilina boulardi / Drosophila melanogaster C Labrosse, K Stasiak, P Eslin, G Doury, J Lesobre, Y Carton, M Poirié

16h05-16h35 Pause / Session Posters


16h35-16h55 Sébastien JM Moreau Interactions physiologiques entre l'Hyménoptère parasitoïde Asobara tabida et

son hôte Drosophila melanogaster 16h55-17h15 Patrice Eslin Causes physiologiques d'une incapacité à encapsuler chez D. subobscura

P Eslin, G Doury, G Prévost 17h15-17h35 Fabienne Vigneux

Apoptose provoquée par une cytotoxine bactérienne sur des macrophages d'insecte F Vigneux, S Baghdiguian, M Brehélin

19h00 Banquet

Mercredi 16 avril

Session Système Immunitaire (suite) modérateur : Jean Jacques Lenoir-Rousseaux

8h45-9h05 Gérard Devauchelle

Du projet "Bombyx +" à la "Spodo-base" E d'Alençon, P Cerutti, M Duonor-Cerutti, G Devauchelle, R Feyereisen, P Fournier, S Gimenez, F Hiliou, I Landais, M Lopez-Ferber, K Mita, J Nohata, M Ogliastro, P Pifanelli, X Sabau, T Shimada, L Sofer, C Tonon, N Volkoff

9h05-9h25 Nathalie Volkoff

L'analyse d'ESTs de la lignée cellulaire du Lépidoptère Spodoptera frugiperda Sf9 permet la mise en évidence de gènes codant pour des défensin-like A-N Volkoff, E d'Alençon, I Landais, J Rocher, M Ogliastro, M Lopez-Ferber, G Devauchelle, K Mita, R Feyereisen, P Fournier

Session Développement / Reproduction / Résistance aux xénobiotiques 9h25-9h45 Denis Tagu

Etude du polyphénisme de reproduction chez les pucerons : catalogue de gènes exprimés chez le puceron des cérélales Rhopalosiphum padi D Tagu, N Leterme, B Sabater-Munõz, J Bonhomme, JC Simon

9h45-10h05 Violaine Mottier

Action de la 20-hydroxyecdysone sur le cycle des cellules épidermiques d'un Lépidoptère V Mottier, S Bordenave, S Debernard, P Porcheron


10h05-10h35 Pause / Session Posters modérateur : Yvan Rahbé

10h35-10h55 Marcel Amichot Polymorphisme des cytochromes P450 chez la Drosophile

A Brun-Barale, D Crochard, S Tares, L Arthaud, JM Bride, M Amichot 10h55-11h15 Isabelle Darboux

Résistance des insectes aux biopesticides : bases moléculaires d'un mécanisme développé par le moustique Culex pipiens contre Bacillus sphaericus I Darboux, Y Pauchet, C Castella, M-H Silva-Filha, C Nielsen-Leroux, J-F Charles, D Pauron

Session Plantes / Insectes 11h15-12h00 Yvan Pelletier, Conférence plénière Un goût sauvage: La résistance de la Pomme de terre aux Insectes 12h00-12h20 Anas Cherqui Effets probiotiques de la béta-glucuronidase sur le puceron Myzus persicae

A Cherqui, S Alla, J Saguez, G Doury, BS Sangwan, P Giordanengo 12h20-14h00 Déjeuner modérateur : Marcel Amichot

14h00-14h20 Julien Saguez Effets des chitinases sur le puceron Myzus persicae

J Saguez, A Cherqui, R Hainez, L Jouanin, BS Sangwan, P Giordanengo 14h20-14h40 Frédéric Gressent

Caractérisation chez Sitophilus oryzae d'un site de liaison de haute affinité pour le peptide entomotoxique PA1b F Gressent, I Rahioui, G Febvay, Y Rahbé

14h40-15h00 Salah Alla Tolérance de l'épinard par le puceron Myzus persicae

S Alla, O Malek, N Takvorian, A Maria, A Berthier, R Lafont, F Marion-Poll 15h00-15h20 Yvan Rahbé

Les peptides de défense végétaux et leur potentiel d’utilisation pour la résistance contre les pucerons Y Rahbé, C Deraison, F Gressent, L Jouanin, S Louis

15h20-15h40 Bilan et Clôture du Colloque





COMMUNICATIONS ORALES

XIVème Colloque de Physiologie de l’Insecte ; Amiens 14-16 avril 2003 Communications orales

Les baculovirus vecteurs d'expression: outil pour l'étude de la physiologie des lépidoptères G Devauchelle, M Cerutti Les Baculovirus constituent un groupe de virus très vaste. Ils sont présents uniquement chez les Arthropodes et on les a décrit chez plus de 600 espèces d'insectes ainsi que chez quelques crustacés. Ce sont des virus enveloppés en forme de bâtonnets, d'une longueur d'environ 350 nm et d'un diamètre moyen de 50 nm. Ils contiennent un génome constitué d'une molécule d'ADN bicaténaire, circulaire, superenroulée dont la taille varie entre 88 et 153 Kpb. Dans la nature les virus sont présents à l'intérieur de polyèdres, structures cristallines facilement observables en microscopie photonique, qui forment de véritables "corps d'inclusion". La matrice protéique de ces corps d'inclusion est constituée par la polyédrine qui est une protéine codée par le génome viral. Le virus, protégé des facteurs de l'environnement par ce corps d'inclusion, est ainsi disséminé à la mort de l' insecte. Après ingestion par un autre insecte, les polyèdres sont dissous dans le suc intestinal, libérant les particules virales qui pourront pénétrer les cellules de l'épithélium intestinal par fusion membranaire ou par endocytose. Après passage de l'épithélium intestinal les virus infectent les tissus de l'hôte. Dans les cellules, la nucléocapside est amenée jusqu'au noyau où elle libère son ADN. La transcription des gènes précoces peut alors commencer. La réplication de l'ADN commence environ 7 heures après l'infection et l'expression des gènes précoces est alors réprimée au bénéfice des gènes tardifs. A partir de 10 heures, des particules virales bourgeonnent à la surface des cellules et permettent après leur libération d'infecter les autres cellules. Plus tard, en fin d'infection, deux gènes au moins la polyédrine et la protéine P10, qui forme des structures fibrillaires dans le noyau et le cytoplasme, sont exprimés en très grande quantité. Le rôle de la P10 n'est pas encore très clair, elle interviendrait dans la lyse cellulaire, par contre la polyédrine est essentielle à la formation des corps d'inclusions permettant la dissémination des virus dans la nature. Par contre en culture cellulaire ces polyèdres ne sont pas infectieux et dans ces conditions l’expression du géne de la polyédrine, comme celui du gène de la P10, n'est pas indispensable pour obtenir un cycle de multiplication Le principe de l'utilisation des baculovirus comme vecteur de gènes étrangers est simple: il suffit de remplacer la région du génome qui code pour la polyédrine et/ou la protéine P10 par un fragment d'ADN qui code pour une protéine étrangère d’intérêt. Ainsi aujourd'hui plus de 3 000 gènes d'origine très variée ont été exprimés. Les protéines exprimées en grande quantité dans les cellules d'insectes présentent, dans la grande majorité des cas, des activités biologiques semblables à celles des protéines natives. C'est ainsi que l'on peut étudier différents aspects de la physiologie cellulaire, comme les canaux ioniques, les récepteurs hormonaux ou, tout récemment, des récepteurs olfactifs. D'autres exemples pourront ilustrer ces aspects.


Sugars in parasitoid nutrition: trick or treat? FL Wäckers Many arthropods are dependent on carbohydrate-rich food sources such as (extrafloral) nectar, and honeydew to cover their energetic requirements. The composition of natural food sources can vary considerably. Besides the common sugar sucrose and its hexose components glucose and fructose, insects may encounter a range of mono-, di- and oligosaccharides in nectar and honeydew. In the first part of my talk I will provide data on physiological suitability of various sugars as insect food. I will address criteria such as gustatory response; enzymatic hydrolysis following digestion; and efficacy of metabolism. While the emphasis in my talk will be on parasitic Hymenoptera, data from a range of insect species will be presented as well, showing that large differences exist in sugar utilization both among as well as within insect taxa. Such differences between keystone species likely represent evolutionary forces driving the composition of sugar sources in various entomophilic mutualisms. I argue that Those attributes that result in a selective nectar suitability, i.e. high suitability for the intended consumer in combination with a low suitability for unintended consumers, likely represent the evolutionary optimal solution. Considering behavioral attributes and the nutritional needs of both second and third trophic level I test whether extrafloral nectar and honeydew actually manifest such selectivity with regard to their sugar composition.


Influence of carbohydrate diets on the longevity of the aphid parasitoid: Aphidius ervi (Hymenoptera: Braconidae) H Azzouz, FL Wäckers, P Giordanengo, L Kaiser Aphidius ervi (Hym. Braconidae) is a solitary endoparasitoid of several aphid species. Adults feed on aphid honeydew and possibly on nectar and pollen. Sugar sources can vary qualitatively and quantitatively according to aphid and plant species, cultivars, and genetic transformation of plants. So the profitability of various sugar diet has to be evaluated in IPM or biological control context. In the first experiment, we determined the influence of the quality of different carbohydrate diets, and of oviposition activity, on the longevity of male and female A. ervi. Results showed that carbohydrate nutrition increased considerably the longevity of both sexes in comparison with water only. Contrary to males, sugar composition influenced female lifetime significantly. For females, the average longevity was higher with monosaccharides diets (glucose, fructose; 50% w:v), compared to the diets rich in trisaccharide (melezitose). Females longevity was reduced by oviposition activity. Glucose, fructose and sucrose are the principal carbohydrates of nectars whereas melezitose is frequently present in honeydews. Therefore our results suggest that nectars would be more profitable to A. ervi than honeydew rich in melezitose. However, in some cases nectars are not accessible to parasitoids because of their unspecialised mouth parts and of flower architecture. The nutritive value of sugar depends on digestive enzymes and on gustatory responses. These hypotheses were verified by studying sugar digestion and consumption. The sugar quality did not affect the consumption of A. ervi, as both sexes consumed approxiamtely 25% of their weight during a five min intake. The digestion of carbohydrates in the insect body according to the type of ingested diet is now being investigated. The next experiments were conducted to determine the influence of quantitative variations of sugar diets on males and females longevity. We studied the effects of sugar concentration and availability on the longevity of A. ervi, using sugars maximising longevity, i.e. glucose-fructose in equal proportion. Females fed with concentrations of 15%, 22% and 33 % (w:v) had a significantly longest lifetime compared to higher sugar concentrations (50% and 75% w:v) and water. For males, the longest lifetime was obtained with 15% (w:v) of sugar. Their longevity decreased significantly when the sugar concentration increased. A behavioural study of feeding duration, intake frequency and grooming activity according to sugar concentration showed that there was no significant difference between sugar concentrations. The experiment on sugar availability showed that A. ervi needs two food intakes per day to attain maximum longevity (about 18-19 days measured for continuous availability of the sugar source). These complementary experiments provide insight in the nutritive requirements of A. ervi under laboratory conditions. Such information is needed to improve the longevity of this biocontrol agent. It is also a basis to estimate potential risk of exposure to toxins expressed by plants, and potential effect of variations in nectar and honeydew according to plant cultivars.


Pouvoir inhibiteur des butineuses sur le développement comportemental des jeunes ouvrières : comparaison de trois races géographiques d’abeilles domestiques, Apis mellifera L. I Leoncini, C Brillet, Y Le Conte Chez l’abeille domestique, Apis mellifera L., les travaux nécessaires au fonctionnement de la colonie, sont répartis selon l’âge des ouvrières, chacune exécutant au cours de sa vie adulte, tout d’abord les tâches intranidales telles que les soins au couvain, le nettoyage ou la construction des rayons puis les tâches d’extérieur dont l’étape ultime est le butinage. Cependant, le développement comportemental des ouvrières peut être accéléré, ralenti voire même inversé en réponse à des conditions de déséquilibre de la colonie. L’objectif de ce travail est de mettre en évidence deux mécanismes qui interviennent dans la régulation du développement comportemental des ouvrières : un facteur endogène, le génotype de l’abeille, et un facteur exogène, l’effet inhibiteur des ouvrières âgées, les butineuses, sur le développement comportemental des plus jeunes. Pour cela, nous avons comparé trois races géographiques d’Apis mellifera L.: A. m. ligustica, A. m. caucasica et A. m. mellifera qui diffèrent non seulement par leur origine géographique mais également par certaines caractéristiques comportementales. Les colonies expérimentales sont composées chacune de 1200 ouvrières : 600 butineuses de l’une des trois races et 200 jeunes ouvrières de chacune des trois races. Ces jeunes ouvrières ont été marquées d’un point de peinture sur leur thorax lors de leur premier jour de vie adulte, chaque couleur correspond à une race donnée. Toutes les colonies reçoivent des quantités identiques de phéromones de reine et de couvain, qui sont des facteurs environnementaux de régulation du développement comportemental des ouvrières. Ainsi, la race des butineuses représente le seul paramètre qui varie entre les colonies. Deux critères de développement comportemental ont été étudiés chez les jeunes ouvrières : l’âge auquel elles commencent à butiner et la mesure de leur taux d’hormone juvénile dans l’hémolymphe. Cette hormone est déjà connue comme activant le développement comportemental des ouvrières. Nos résultats indiquent que les jeunes ouvrières de la race ligustica partent butiner le plus tôt, elles ont donc le développement comportemental le plus rapide. De plus, elles présentent le taux d’hormone juvénile le plus élevé dans l’hémolymphe et cette quantité augmente en fonction de l’âge. Enfin, dans les colonies contenant les butineuses ligustica, les jeunes ouvrières des trois races butinent plus tard que dans les colonies ayant des butineuses des deux autres races. Les butineuses ligustica possèdent donc le pouvoir inhibiteur le plus fort sur le développement des jeunes ouvrières. Ces résultats confirment les expériences de Brillet et al. (2002) sur les différences raciales d’âge au butinage réalisées sur des abeilles placées dans de véritables colonies. De plus, ils soulignent que les différences de rythme de développement comportemental entre les races géographiques sont liées à des différences de production d’hormone juvénile et aussi à un pouvoir inhibiteur des butineuses variable suivant la race. Les caractéristiques génétiques de l’abeille ainsi que la présence d’ouvrières âgées sont deux facteurs de régulation du développement comportemental qui agissent à des niveaux différents de la colonie.


Le methyl parathion, un stimulant mnésique chez l’abeille domestique D Guez, H Zhu, S-W Zhang, MV Srinivasan A travers deux apprentissages associatifs, nous nous sommes intéressés aux effets d’un insecticide, le methyl parathion (MeP), sur les performances mnésiques des abeilles. Le methyl parathion fait partie de la famille des organophosphates, et agit en bloquant l’activité enzymatique de l’acethylcholinesterase. Dans un premier temps nous avons étudié les effets du MeP sur des abeilles en vol libre, lors d’un apprentissage associatif visuel. Dans un second temps nous sommes intéressés aux effets de la même molécule sur les performances des abeilles lors du conditionnement olfactif du réflexe d’extension du proboscis en un seul essai. Nos travaux indiquent que le MeP induit une amélioration significative des performances des abeilles dans ces deux paradigmes, par une action sur le rappel de l’information mnésique. De plus nous montrons que le MeP n’agit que sur le rappel de l’information stockée en mémoire à moyen terme ou, en mémoire a long terme SPI (synthèse protéique indépendante). En effet le MeP ne semble pas améliorer le rappel de l’information stockée en mémoire à long terme SPD (synthèse protéique dépendante), ceci pouvant indiquer que le système cholinergique n’est pas impliqué dans les processus de rappel de cette forme de mémoire. L’utilisation du MeP pourrait, de plus, se révéler très fructueuse pour comprendre quels sont réellement les indices que les abeilles utilisent/apprennent lors d’un apprentissage visuel tel que celui que nous avons étudié ici.


Molecular and functional bases of host regulation by Toxoneuron nigriceps and its associated polydnavirus F Pennacchio Toxoneuron nigriceps (Viereck) (Hymenoptera, Braconidae) is an endophagous parasitoid of the tobacco budworm, Heliothis virescens (F.) (Lepidoptera, Noctuidae). Parasitized host larvae show a complex array of pathological symptoms. The most evident alterations registered are the suppression of the immune response and the developmental arrest of host mature larvae, which, when parasitized, fail to pupate and provide the required nutritional resources to the developing parasitoid larva. The phenoloxydase activity in the haemolymph of parasitized host larvae suddenly decrease within 15 min after parasitoid oviposition, and resumes by 4 hours later, when polydnavirus (TnBV - T. nigriceps Bracovirus) expression is already detectable in host tissues. Haemocytes from parasitized host larvae loose their ability to spread and adhere to the glass substrate in vitro, and show clear signs of cytoskeleton disruption. The endocrine balance of mature larvae, which are unable to pupate, is dramatically altered. The 20-hydroxyecdysone titre in parasitized last instar larvae is very low, compared to synchronous nonparasitized controls. This reduction in the hormonal titre is due to the combined action of teratocytes and TnBV. Teratocytes, cells deriving from the dissociation of the embryonic membrane of the parasitoid, readily convert into inactive polar metabolites the little 20-hydroxyecdysone produced by the prothoracic glands of parasitized mature larvae. This depression of the biosynthetic activity of prothoracic glands is due to the disruption of the PTTH signal transduction pathway, which is induced and modulated by TnBV infection. In contrast, JH biosynthesis of corpora allata explanted from H. virescens mature larvae is not affected by T. nigriceps parasitism, and this is associated to JH titres and metabolism in vivo not substantially different between parasitized and nonparasitized host larve. The sequence of TnBV genome is in progress. The screening of TnBV genomic libraries and of cDNA libraries, prepared with RNA poly A+ from parasitized host larvae and haemocytes, allowed the isolation of various viral genomic clones and their corresponding cDNAs. Different viral genes have been cloned, fully sequenced and characterized so far, evidencing the occurrence of interesting homologies. The expression of these TnBV genes has been analysed by Northern blot experiments and in situ hybridization on different host tissues and their functional characterization has been undertaken.


Caractérisation du contenu du génome d’un virus symbiote du parasitoïde Cotesia congregata (Braconidae, Microgastrinae) C Dupuy, E Huguet, E Espagne, L Cattolico, B Provost, JM Drezen Les polydnavirus sont des entités virales, symbiotes de plusieurs dizaines de milliers d’espèces de parasitoïdes de la famille des Braconidés et des Ichneumonidés et sont indispensables à la réussite parasitaire. Les particules de polydnavirus sont injectées dans le corps de l’hôte lors de la ponte du parasite. Elles pénètrent dans les cellules et conduisent à l’expression d’une série de protéines qui altèrent la physiologie de l’hôte dans l’intérêt du parasite modifiant à la fois son immunité et son développement. Le séquençage du génome du CcPDV polydnavirus du parasitoïde Cotesia congregata (bracovirus) en collaboration avec le Centre National de Séquençage (Génoscope) et l’analyse de l’expression des gènes viraux dans l’hôte Manduca sexta ont permis d’identifier de nouveaux gènes codant pour des protéines ayant un rôle potentiel dans l’immunosuppression. Certains de ces gènes sont en cours d’expression afin de tester leur fonction in vitro et in vivo.


Quand les microparasites manipulent la physiologie des insectes F Vavre, F Dedeine, J Varaldi, P Couble, P Mavingui De très nombreux insectes vivent en association avec des microorganismes symbiotiques. Dans de nombreux cas, ces symbiotes sont mutualistes et participent activement à la physiologie de leurs hôtes en leur apportant de nouvelles capacités métaboliques. Toutefois, une autre catégorie de symbiotes, les parasites de la reproduction, manipulent les insectes à leur propre avantage en ciblant des fonctions essentielles de la reproduction des hôtes. Trois exemples seront présentés où les microparasites agissent sur le développement précoce, l'ovogenèse ou le comportement des hôtes. Outre l'intérêt de ces modèles dans l'étude de l'évolution des relations symbiotiques, l'analyse des mécanismes impliqués dans les manipulations pourrait constituer une nouvelle approche de la physiologie des insectes.


Une bactérie parasite nécessaire à l’ovogenèse chez l’Hyménoptère Asobara tabida (Braconidae) F Dedeine, F Vavre, M Boulétreau Les bactéries du genre Wolbachia sont des parasites intracellulaires qui infectent de nombreuses espèces d’insectes. Facultatives pour les individus hôtes, elles induisent une très grande diversité d’effets sur leur physiologie en agissant notamment sur le développement ou le déterminisme du sexe. Chez le parasitoïde de drosophile Asobara tabida (Hymenoptera, Braconidae), la présence de Wolbachia semble obligatoire à une fonction essentielle de la reproduction : l’ovogenèse. Pour la plupart des souches étudiées, les femelles aposymbiotiques (traitées aux antibiotiques) émergent sans aucun ovocyte dans les ovarioles. Pour d’autres souches, les femelles produisent quelques ovocytes, mais ceux-ci possèdent un volume réduit et sont incapables de se développer. Ainsi, il semble que la bactérie soit nécessaire à la maturation des ovocytes, faisant de la bactérie un symbiote obligatoire pour l’insecte. Cette symbiose peut paraître singulière comparée aux autres cas d’infection par Wolbachia chez les insectes, et pose de nombreuses questions d’ordre physiologique et évolutif.


Buchnera aphidicola, bactérie endosymbiotique des pucerons : génomes et physiologie symbiotique Y Rahbé, Z Al-Ayoubi, F Calevro, H Charles, JM Fayard, G Febvay, AA Heddi Au cours de leur évolution de phytophages à alimentation spécialisée sur les tissus conducteurs des plantes, les « Homoptères » ont pratiquement tous développé une symbiose microbienne intracellulaire. Les pucerons, s’alimentant exclusivement sur la sève phloémienne, hébergent depuis plus de 150 millions d’années la g-protéobacterie Buchnera aphidicola, proche des entérobactéries. Trois génomes de cette bactérie ont été séquencés dans les 2 dernières années, et leur organisation génétique a été amplement analysée du point de vue évolutif, un peu moins du point de vue fonctionnel. Nous analyserons d’abord l’apport spécifique des données génomiques des trois premières souches séquencées de Buchnera, par rapport aux données physiologiques antérieures obtenues sur cette symbiose. Nous nous intéresserons ensuite à des voies métaboliques cruciales de cette association symbiotique, obligatoire et à transmission verticale exclusive, comme les voies de biosynthèse (lipides, vitamines, acides aminés), et les mécanismes d’échange et de transport. La comparaison des génomes de Buchnera disponibles, ainsi que des points de repères externes particuliers (bactéries libres, ou à petits génomes, ou autres types symbiotiques), permettent d’analyser les spécificités de ce groupe, de même que les différences apparues dans les trois lignages de symbioses de pucerons. Enfin, nous nous focaliserons sur la question des échanges symbiotiques, en établissant un parallèle entre l’évolution de cette fonction dans les endosymbioses primitives (mitochondrie et chloroplastes) et les symbioses d’insectes, plus récentes et qui associent des métazoaires déjà évolués à des organismes unicellulaires. Structures membranaires, mécanismes d’échange et de transport, implications fonctionnelles de la composition en transporteurs de ces génomes seront nos principaux axes d’analyse et d’approche expérimentale.


Transcriptome analysis of Buchnera,the intracellular symbiotic bacteria of aphids: a methodological approach F Calevro, H Charles, N Reymond, V Dugas, JP Cloarec, J Bernillon, Y Rahbé, G Febvay, JM Fayard Aphids are among the major pests of agriculturally important plants. Almost all aphid species rely on intracellular bacteria (Buchnera) for their viability and fecundity. The Buchnera/aphid mutualism is so tight that neither partner can reproduce independently. Phylogenetic studies indicate that this relationship has been established 200 - 250 million years ago and led to co-speciation of the two organisms. The adaptation of the endosymbiont Buchnera to intracellular life involved a massive reduction in its genome and some of its lineages have the smallest prokaryotic genomes reported to date. Actually, endocellular parasites with a dramatically reduced genome are very often recipient of biosynthetic products from their hosts and the reduction of their genome size is, at least partly, due to the loss of biosynthetic genes for nutrients. However, genomic analysis revealed that Buchnera conserved the genes for the biosynthesis of amino acids essential for the aphid. Nutritional and physiological studies have shown that this organism retains the ability to provide essential amino acids to the host insects, using host-derived precursors. Moreover, biosynthetic pathways in Buchnera seem to be very original compared to the most related free-living Enterobacteriaceae, like E. coli. At present, very little is known about the expression and regulation of biosynthetic genes in Buchnera. This work is a preliminary study aimed at developing DNA chip technology to explore global and parallel expression of the genes involved in the Buchnera amino acids metabolism. Our microarray is composed of 64 spots, including 4 Buchnera genes, namely aroH, eno, ilvH and pheA, and several controls (oligonucleotides spotted at different concentrations, mismatches, positive and negative controls). Based on a statistical analysis of the results, we present here a systematic study of the critical steps in microarray manufacturing, probe design, target labeling, hybridization and analysis of data. Our results showed that for 3 out of 4 selected genes, oligonucleotides located on 5' end gave us significantly higher signal than the 3' side oligonucleotides. Rosatech slides gave us significantly higher signal when compared to Corning slides. However, signal specificity was higher on Corning slides. The so-called indirect method for preparing labeled cDNA gave us higher signal intensities than the direct method. These differences have been observed for each of the tested genes and for the two used dyes. A filtration method is also proposed and our "spiked RNAs" should allow us to estimate differential gene expression rates. A complete DNA chip, containing the 617 ORF of Buchnera is under development. We are convinced that the large-scale expression data obtained from this chip will provide us exciting new insights about the original expression and regulation patterns of biosynthetic pathways in Buchnera.


Dépression des réactions d'immunité cellulaire chez les Insectes M Brehélin, N Volkoff Les effecteurs de l'immunité cellulaire sont pour la plupart de type actif et cela est surtout vrai pour les macrophages dont l'action peut être mise en évidence dès l'arrivée (quelques minutes) du corps étranger dans l'hémocoele. Un parasite/pathogène potentiel ne pourra donc coloniser le "milieu insecte" que s'il dispose rapidement de moyens d'échapper aux réactions cellulaires. Trois grands types de stratégies d'échappement peuvent être mises en place: le corps étranger peut soit ne pas être reconnu par les immunocytes (= certains hémocytes), soit se réfugier dans des endroits inaccessibles à ces cellules, soit inhiber les réactions qui dans un premier temps ont pu être déclenchées. La non-reconnaissance a été très rarement observée et le refuge dans des niches inaccessibles sera développé par ailleurs. Nous discuterons donc de la troisième possibilité qui s'offre au parasite/pathogène potentiel et qui concerne la stratégie d'inhibition d'une réaction déja mise en place, en prenant un exemple dans chaque type de réaction cellulaire, la formation de capsule et la phagocytose. Au premier abord, il semblerait que la stratégie d'absence de reconnaissance procure à l'agent qui l'utilise un avantage évolutif. D'une part cela lui permettrait de ne pas avoir à mettre en place des moyens nécessaires pour surpasser les premières étapes de la réaction de défense, moyens coûteux en consommation d'énergie. D'autre part cela laisse à l'hôte toutes ses capacités de défense contre un autre parasite/pathogène concurrent du premier. Pourtant il apparaît que l'échappement aux réactions d'immunité cellulaire chez les insectes se fasse, dans l'énorme majorité des cas, essentiellement non pas par une absence de reconnaissance du parasite/pathogène potentiel mais par une inhibition de la réaction de défense qui s'est installée. Il y a une raison essentielle à ce "choix stratégique" qui par ailleurs présente en fait des conséquences particulièrement avantageuses pour son auteur. * La raison est qu'il est en fait pratiquement impossible à un corps étranger de ne pas être reconnu par le système immunitaire de son hôte. Dans tout le règne animal, vertébrés et invertébrés confondus, les réactions immunitaires se mettent en place à la suite de la reconnaissance d'un ligand (chez le corps étranger), à qui on a donné le nom générique de "Pathogen Associated Molecular Pattern" (PAMP), par un récepteur (chez l'hôte) appelé "Pattern Recognition Receptor" (PRR). Les PAMP sont des molécules présentes à la surface de tous les parasites ou pathogènes potentiels (ex: LPS, peptidoglycanes, b-glucanes). Ce sont des constituants essentiels des parois et il est impossible pour ces organismes de s'en affranchir ou même très difficile de les masquer. La mise en place de la réaction contre ces molécules apparaît inéluctable. Il restait donc aux parasite/pathogènes potentiels à essayer d'inhiber cette réaction, ce qu'ils ont fait de manières fort diverses et souvent très efficaces. * Les conséquences de cette stratégie apparaissent particulièrement avantageuses pour le parasite/pathogène potentiel qui trouve à sa disposition de nombreuses cibles sur lesquelles il peut agir. Il n'y a qu'à penser par exemple au nombre d'enzymes ou de protéines mis en jeu par l'insecte (donc par l'hôte) pour la formation de mélanines: l'inhibition ou la dégradation d'une seule de ces molécules, à quelque niveau que ce soit, arrête complètement toute la chaîne de réactions. Beaucoup de pathogènes semblent avoir à leur disposition des inhibiteurs différents agissant sur des cibles moléculaires différentes, assurant ainsi une redondance à laquelle l'hôte échappe difficilement.


Les facteurs immunosuppresseurs dans le système Leptopilina boulardi / Drosophila melanogaster C Labrosse, K Stasiak, P Eslin, G Doury, J Lesobre, Y Carton, M Poirié Les parasitoïdes sont des insectes dont les stades immatures vont se développer à l'intérieur d'un organisme hôte, généralement un autre insecte, et dont le stade adulte vit librement. Au niveau immunitaire, la réponse au parasitisme consiste en la construction d'une capsule multicellulaire mélanisée autour de cet œuf. Face aux mécanismes de défense de l’hôte, les parasitoïdes ont développé des stratégies de virulence ayant généralement pour cible les cellules immunitaires et/ou une cascade enzymatique impliquée dans la mélanisation et la production de radicaux cytotoxiques : la cascade phénol-oxydase. Leptopilina boulardi, parasitoïde de Drosophila melanogaster appartient à la famille des Figitidés. Nous avons montré que les femelles injectent, lors de la ponte, des facteurs sécrétés dans la glande impaire (annexe à l'appareil génital) qui confèrent une protection active contre le système immunitaire de D. melanogaster. Le facteur immunosuppresseur majeur a pu être isolé. Il s’agit d’une protéine d’environ 35kDa (P4) appartenant à la famille des Rho-GAP, classiquement impliquées dans la régulation de nombreux processus physiologiques et notamment du cytosquelette d’actine. L’effet physiologique de P4 sur les hémocytes des larves hôtes a été testé. Il s’avère que la protéine P4 est responsable d’une altération de la forme des lamellocytes, cellules classiquement impliquées dans la formation de la capsule autour d’un corps étranger. La production de P4 en système bactérien m’a permis d’obtenir des anticorps anti-P4 qui ont été utilisés pour localiser la protéine au sein de la glande impaire des femelles parasitoïdes et du réservoir associé. Les résultats obtenus montrent clairement une localisation de P4 au niveau de structures particulières appelées VLPs (Virus-like particules) dont l’implication dans le succès parasitaire n’avait encore jamais été démontrée. Les VLPs constitueraient donc bien le facteur immunosuppresseur majeur utilisé par L. boulardi contre D. melanogaster.


Interactions physiologiques entre l'Hyménoptère parasitoïde Asobara tabida et son hôte Drosophila melanogaster. SJM Moreau L’endoparasitoïde solitaire Asobara tabida (Hyménoptère: Braconide) se développe dans les larves de plusieurs espèces de Drosophiles (Diptères). Les différentes études physiologiques menées au cours de ce travail ont eu pour objectif de caractériser les facteurs parasitaires responsables de la virulence d’A. tabida vis-à-vis des larves de l’hôte Drosophila melanogaster. Des altérations significatives du poids, de la durée de développement et de la survie ont été mises en évidence chez les larves parasitées. En outre, l’injection de sécrétions venimeuses d’une souche non virulente d’A. tabida provoque un effet paralysant temporaire ainsi qu’une mortalité élevée de l’hôte D. melanogaster. Le parasitisme par A. tabida induit par ailleurs une réduction significative de l’activité phénoloxydase, enzyme clé du système immunitaire des larves de D. melanogaster. Contrairement à l’espèce Asobara citri, A. tabida n’altère pas le système de défense cellulaire des larves qu’il infeste. Nos résultats confirment que le principal mécanisme de virulence d’A. tabida repose sur la capacité de ses œufs à adhérer aux tissus hôtes dans les premières heures suivant l’infestation. Ce mécanisme, qui offre aux œufs du parasitoïde une protection envers les cellules immunitaires de l’hôte, a fait l’objet d’une étude ultrastructurale et biochimique. La présence d’un complexe protéique de 80 kDa dans des extraits du chorion de ces œufs semble être associée à la protection d’A. tabida vis-à-vis du système immunitaire de son hôte. Enfin, nous avons caractérisé une activité enzymatique de type aspartylglucosaminidase dans les sécrétions venimeuses des femelles parasitoïdes. Il s’agit de la première description d’une enzyme de ce type dans un venin d’arthropode. L’ensemble des résultats collectés suggère que les sécrétions venimeuses et la surface des œufs du parasitoïde jouent un rôle prépondérant dans le succès parasitaire d’A. tabida envers son hôte D. melanogaster.


Causes physiologiques d’une incapacité à encapsuler chez D. subobscura. P Eslin, G Doury, G Prévost Chez les insectes, l’intrusion d’un parasite volumineux se traduit par une réaction d’encapsulement faisant appel à des effecteurs cellulaires et humoraux. Chez la drosophile, de nombreux travaux confirment que les lamellocytes sont majoritairement responsables de l’élaboration de la multicouche cellulaire constituant la capsule. Une espèce de drosophile très répandue dans le Nord de l’Europe, Drosophila subobscura, semblait incapable de former une capsule contre le parasitoïde Asobara tabida pour lequel elle constitue d’ailleurs un hôte de prédilection. Il s’agissait donc de tester l’incapacité de D. subobscura à former une capsule, puis d’en rechercher les causes physiologiques. Des comptages hémocytaires quantitatifs et qualitatifs ainsi que des mesures de paramètres physiologiques (taux d’encapsulement, taux de succès parasitaire et taux de mortalité) ont été réalisés sur 6 souches d’origine géographique très différente de D. subobscura, dont les larves ont été infestées par une souche référence d’Asobara tabida. Des observations complémentaires ont été effectuées sur les larves de notre souche de référence de D. subobscura soit infestées par une autre espèce de parasitoïde (Leptopilina heterotoma) également inféodée à cet hôte, soit injectées avec des éléments étrangers. Les résultats obtenus confirment l’incapacité totale de D.subobscura à former une capsule autour d’un corps étranger qu’il s’agisse d’un œuf parasitoïde ou d’un corps inerte. Chez les larves saines, parasitées, voire injectées, aucun lamellocyte n’a jamais été observé. L’incapacité de D.subobscura à se défendre efficacement contre les parasites volumineux serait donc associée à la déficience de cette catégorie cellulaire normalement présente chez les autres espèces de drosophiles. Nos résultats constituent un exemple rare d’immunodéficience innée dans des populations naturelles fortement soumises aux pressions parasitaires et soulèvent le problème du maintien de ces populations dans un écosystème.


Apoptose provoquée par une cytotoxine bactérienne sur des macrophages d'insecte F Vigneux, S Baghdiguian, M Brehélin La défense cellulaire des insectes est immédiatement capable de reconnaître et de réagir contre des corps étrangers sans avoir jamais eu de contact préalable avec ceux-ci. C’est pourquoi nos études se focalisent sur la réponse cellulaire de l'insecte où la phagocytose constitue la première ligne de défense de l'hôte contre l'invasion des pathogènes bactériens. Xenorhabdus nematophila, bactérie gram négative de la famille des Enterobacteriacae, est symbiotiquement associée, de façon hautement spécifique, au nématode Steinernema carpocapsae (Steinernematidae). Ce couple symbiotique est entomopathogène pour de nombreuses espèces d'insectes au stade larvaire. Cette bactérie sécrète divers facteurs de virulence et notamment une cytotoxine de type protéique, l'alpha-Xenorhabdolysine (alphaX). In vitro, cette toxine induit la nécrose des granulocytes de Spodoptera littoralis. Ces derniers sont assimilables aux macrophages des mammifères car ils possèdent la capacité de phagocyter les corps étrangers. Certaines toxines utilisées à des concentrations élevées induisent une nécrose cellulaire, alors que pour des faibles concentrations, ces mêmes molécules provoquent une mort cellulaire par apoptose. Nous avons donc tester les effets de l'alphaX à faible dose sur des hémocytes de S. littoralis. A l'aide d'approches complémentaires, plusieurs étapes caractéristiques de l'apoptose ont été mise en évidence sur les hémocytes traités. Ainsi, avons nous pu montrer la re-localisation des phosphatidylsérines sur le feuillet externe de la membrane cellulaire, la fragmentation de l'ADN génomique, la désorganisation du cytosquelette d'actine et la condensation de la chromatine. L'ensemble de ces résultats, montrent que l'alphaX très peu concentrée induit la mort des granulocytes par apoptose. Il se pourrait donc que les effets nécrotiques qui ont permis la mise en évidence de l' alphaX ne soient qu'un artefact, l'effet "naturel" de cette molécule étant d'induire l'apoptose dans ses cellules cibles in vivo. La mort cellulaire programmée induite par Xenorhabdus nematophila chez son hôte peut conférer de multiples avantages à cette bactérie, l'apoptose, n'entraînant ni lésion, ni inflammation au sein des tissus.


Du projet "Bombyx +" à la "Spodo-base" E d'Alençon, P Cerutti, M Duonor-Cerutti, G Devauchelle, R Feyereisen, P Fournier, S Gimenez, F Hiliou, I Landais, M Lopez-Ferber, K Mita, J Nohata, M Ogliastro, P Pifanelli, X Sabau, T Shimada, L Sofer, C Tonon, N Volkoff. L'objectif de l' "International Lepidopteran Genome Project" est de susciter une coopération internationale pour séquencer le génome complet de Bombyx mori et de faire une analyse comparée des génomes de différents lépidoptères qui présentent un intérêt scientifique et/ou économique. Que peut-on attendre d'une telle approche ? de très nombreux aspects peuvent être abordés. A titre d'exemple, on peut citer: - de nouvelles cibles d'insecticides "lépidoptères spécifiques" - des molécules bioactives, antimicrobiens, antifongiques, enzymes, antigels....- améliorer la production de protéines recombinantes en culture cellulaire ou dans la glande séricigène...-des biosenseurs, pour des essais in vitro ou des "cyber-insects" pour des environnement extrêmes...et bien d'autres cibles (on trouvera sur le site http://www.ab.a.u-tokyo.ac.jp/lep-genome/new_lepgenome.htm un excellent document de synthèse réalisé par René Feyereisen). En ce qui nous concerne, nous sommes en train d'élaborer la "Spodo-base". L'objectif est de pouvoir développer des recherches dans différents domaines comme la structure des chromosomes, l'infection virale par baculovirus ou densovirus, l'immunité cellulaire et la maturation post-traductionnelle dans les cellules d'insectes. Bien entendu la comparaison avec les séquences de B.mori se révèle particulièrement intéressante dans la spécificité des gènes. Aujourd'hui nous disposons de l'élevage de 4 espèces de Spodoptera, de plus de 15 lignées cellulaires issues de cet insecte, des vecteurs d'expression de protéines recombinantes, de plusieurs virus pathogènes... Une première banque de cDNA a été réalisée à partir d'EST de la lignée Sf9 (S.frugiperda). 5938 séquences ont été analysées (un exemple de l'utilisation de cette banque est présenté par N.Volkoff)., 20 000 autres EST sont en cours d'analyse à partir d'autres tissus. De plus une librairie de BAC génomique a été réalisée à partir du même insecte. 36 000 clones de 130kb de moyenne ont été obtenus et les filtres correspondants, ce qui représente environ 11 fois le génome total.


L’analyse d’ESTs de la lignée cellulaire du Lépidoptère Spodoptera frugiperda Sf9 permet la mise en évidence de gènes codant pour des défensin-like. A-N Volkoff, E d’Alençon, I Landais, J Rocher, M Ogliastro, M Lopez-Ferber, G Devauchelle, K Mita, R Feyereisen, P Fournier L’analyse d’une banque d’expression issue de cellules Sf9 a permis l’identification de 1857 gènes distincts. De façon surprenante, parmi ces gènes, plusieurs correspondent à des gènes a priori tissu-spécifiques. Nous avons identifié trois cDNAs qui codent pour des protéines présentant la signature de peptides antibactériens, les défensines d’insectes (six résidus cystéines). L’une est décrite ici pour la première fois, les deux autres sont homologues à des protéines identifiées chez un autre lépidoptère, Galleria mellonella. Pour deux d’entre elles, la séquence génomique a pu être caractérisé, notamment grâce à une banque BAC couvrant 10 fois le génome de Spodoptera frugiperda. Suite à l’injection de micro-organismes (bactéries et spores de Beauveria bassiana) nous montrons une augmentation de leur transcription suggèrant un rôle antimicrobien des peptides correspondants. Cette étude montre l’intérêt que peut apporter l’outil qu’est la banque EST Sf9 pour l’étude de la physiologie au sens large des lépidoptères.


Etude du polyphénisme de reproduction chez les pucerons : catalogue de gènes exprimés chez le puceron des cérélales Rhopalosiphum padi D Tagu, N Leterme, B Sabater-Munõz, J Bonhomme, JC Simon La nuisibilité des pucerons découle principalement de leur mode de reproduction particulier, la parthénogenèse cyclique. Au cours du cycle annuel des pucerons, plusieurs générations parthénogénétiques se succèdent, suivies d’une seule génération de sexués qui sont produits en automne. Les femelles pondent alors des œufs diapausant sur l’hôte d’hiver. Ces œufs éclosent au printemps et initient un nouveau cycle de reproduction parthénogénétique sur l’hôte d’été qui fait intervenir des formes aptères ou ailées. La capacité pour un génotype donné de produire des morphes très différents (asexués – sexués) reflète la plasticité phénotypique des pucerons, encore appelée «polyphénisme». La perception des modifications du rythme circadien est un élément déclencheur du passage de l’asexualité à la sexualité. Elle modifie probablement la production d’hormones qui influent à leur tour sur le devenir du développement sexué ou asexué des ovocytes. Afin d’identifier les fonctions cellulaires impliquées dans le polyphénisme de reproduction des pucerons, nous avons entrepris une analyse comparative de l’expression des gènes au sein d’un même génotype entre des individus non–induits et induits pour la reproduction sexuée. Cette approche transcriptomique consiste en 1) l’établissement d’une collection d’étiquettes de séquences exprimées (Expressed Sequence Tags ou ESTs) chez des individus induits et 2) des hybridations comparatives sur lames de verre contenant ces ESTs. Nous présentons ici les premiers résultats concernant la construction d’une collection d’ESTs chez le puceron des céréales Rhopalosiphum padi. Des femelles ailées parthénogénétiques d’un génotype parthénogénétique cyclique ont été élevées sur du blé dans des conditions d’induction de la reproduction sexuée. 75 larves de premier stade produites par ces ailées ont été placées individuellement en condition d’induction, prélevées au 3ème stade larvaire, congelées dans l’azote liquide et conservées à –80 C. Les ARN totaux ont été extraits et une banque d’ADNc a été construite dans le plasmide pDNR-LIB (Clontech). Après transformation, 1056 bactéries ont été prélevées et conservées dans du glycérol à –80 C. Chacun des 1056 ADNc a été partiellement séquencé (AB 3100, Roscoff, Génopole Ouest) pour constituer la collection d’ESTs. L’annotation a été réalisée manuellement par interrogation des banques de données (GenBank). Nous décrivons dans ce travail les 800 premières EST obtenues. L’annotation a montré un faible pourcentage (2%) de protéines hypothétiques, et une grande proportion (39 %) de séquences inconnues. Un fort pourcentage (28 %) de gènes de ménage (protéines ribosomiques…) ainsi que la présence (5%) de séquences bactériennes provenant de l’endosymbiote obligatoire des pucerons (Buchnera) montrent les inconvénients à réaliser une collection de gènes exprimés chez un puceron entier : les gènes présentant des expressions tissus-spécifiques y sont sous représentés, et les gènes de Buchnera (riches en A/T) peuvent interférer lors de la confection des ADNc. Cependant, un certain nombre (4%) de gènes impliqués dans l’embryogenèse (exuperantia), la transduction de signaux a été identifié. ou la régulation de la méiose (pelota) représentent de futurs candidats impliqués dans le polyphénisme de reproduction.


Action de la 20-hydroxyecdysone sur le cycle des cellules épidermiques d'un Lépidoptère V Mottier, S Bordenave, S Debernard, P Porcheron La programmation du développement post-embryonnaire des insectes est régie par des signaux exogènes et par des signaux endogènes de nature hormonale. Parmi les hormones impliquées, les ecdystéroïdes jouent un rôle clé dans le contrôle des périodes de prolifération et de différenciation des cellules épidermiques. L’objectif de ce travail consiste à identifier les cibles intracellulaires impliquées dans l’intégration du signal hormonal. La lignée cellulaire IAL-PID2, établie à partir des disques imaginaux alaires du lépidoptère Plodia interpunctella, répond à la 20-hydroxyecdysone (20E) par un arrêt de la prolifération cellulaire et à plus long terme par une différenciation cellulaire caractérisée par la formation de structures pseudo-épithéliales. Nous avons montré par des analyses en cytométrie en flux que cet arrêt de prolifération était consécutif à une accumulation des cellules en phase G2 du cycle cellulaire. La progression des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire est contrôlée par des systèmes régulateurs universels, tels les complexes cdk-cyclines. Les cellules IAL-PID2 étant bloquées en phase G2, nous avons recherché si la 20 E contrôlait l’expression des cyclines A et/ou B qui régulent la transition G2/M. A partir des séquences connues des cyclines A et B, nous avons choisi un couple d’amorces dégénérées et fabriqué une sonde qui nous a permis de révéler deux transcrits, nommés PCyc-X et PCyc-Y. Nous avons montré que la 20E à la concentration physiologique de 10-6M diminue significativement le niveau des transcrits PCyc-X et PCyc-Y. Cette diminution précède le début de l’accumulation des cellules en phase G2 ce qui indique qu’elle serait à l’origine de l’arrêt prolifératif. Ces résultats montrent pour la première fois dans un modèle in vitro d’Insecte que les ecdystéroïdes contrôlent la prolifération cellulaire par un mécanisme similaire à celui des stéroïdes de Mammifères, via une action sur l’expression des cyclines.


Polymorphisme des cytochromes P450 chez la Drosophile A Brun-Barale, D Crochard, S Tares, L Arthaud, JM Bride, M Amichot Chez les insectes, les cytochromes P450 (P450) sont impliqués dans de nombreux cas de résistance aux insecticides et d'adaptation à des stress chimiques mais aussi dans la synthèse ou la dégradation d'hormones. Les progrès réalisés avec la génomique permettent d'envisager une étude globale du polymorphisme des P450 d'insecte. Le fait de disposer de grandes collections de souches, la facilité de capture de populations sauvages et la connaissance de son génome font de la drosophile un modèle de choix pour ce type d'étude. De plus, certains de ses P450 ont des fonctions connues : Cyp6a2 et Cyp6g1 jouent un rôle actif dans la métabolisation de xénobiotiques (1,2), Cyp302a1 et Cyp315a1 sont impliqués dans la voie de synthèse de l'ecdysone (dib et sad ; 3,4). Nous avons choisi de travailler avec ces quatre gènes et aussi avec Cyp6u1 et Cyp6w1 car ils sont physiquement proches de Cyp6a2 (5). Pour chaque gène, des amorces ont été conçues pour amplifier des fragments ne dépassant pas 320 bp mais couvrant la totalité des parties codantes. Les résultats sont obtenus par SSCP sur 7 souches. Il apparaît que Cyp6a2, Cyp6g1 et Cyp302a1 (dib) sont polymorphes avec 6, 4 et 6 allèles respectivement au contraire de Cyp315a1 (sad) qui ne présente que 2 allèles. Le travail est toujours en cours avec Cyp6u1 et Cyp6w1. Il y a une région polymorphe dans tous les gènes, elle code les hélices G, H et I mais le polymorphisme n'est pas distribué uniformément sur les gènes. Nous avons été surpris de classer Cyp302a1 dans la catégorie des gènes polymorphes. En effet, ce gène est impliqué dans la synthèse de 20-OH ecdysone et on pourrait s'attendre à une forte pression de sélection défavorable à l'existence de polymorphisme. REFERENCES 1. Berge J.B., et al. : Philos. Trans. R. Soc. London 353, 1701 (1998). 2. Daborn P.J., et al. : Science 297, 2253 (2002). 3. Chavez V.M., et al. : Development 127, 4115 (2000). 4. Warren J.T., et al. : PNAS 99, 11043 (2002). 5. http://p450.antibes.inra.fr


Résistance des insectes aux biopesticides : bases moléculaires d’un mécanisme développé par le moustique Culex pipiens contre Bacillus sphaericus I Darboux, Y Pauchet, C Castella, M-H Silva-Filha, C Nielsen-Leroux, J-F Charles, D Pauron Les biopesticides dérivés des bactéries entomopathogènes de type Bacillus constituent une alternative efficace à l'utilisation d'insecticides chimiques toxiques pour l'environnement. Bacillus sphaericus (Bs) est une bactérie au spectre d’action très spécifique restreint aux larves de certaines espèces de moustiques du genre Culex et Anopheles. Ses propriétés insecticides sont principalement dues à la production d’une toxine binaire qui se fixe sur une alpha-glucosidase, appelée Cpm1, présente à la surface des cellules de l’intestin moyen des larves. Certaines souches de Culex pipiens résistantes à Bs ont pu être sélectionnées en laboratoire et quelques cas de résistance ont également été observés dans des populations naturelles prélevées dans différentes régions du monde sur des sites traités avec Bs. La gestion de la résistance des moustiques à ces biopesticides nécessite notamment une connaissance précise des mécanismes moléculaires impliqués dans le phénomène. Dans le cadre de cette thématique, nous avons plus particulièrement étudié le mécanisme de résistance développé par la souche GEO de C. pipiens, obtenue en laboratoire en soumettant les larves à une forte pression de sélection. Les études biochimiques avaient préalablement mis en évidence l'incapacité de la toxine à se fixer sur les préparations membranaires de cellules intestinales des larves GEO. Des expériences de Northern blot, d’hybridation in situ et d’immunohistochimie nous ont permis de démontrer que, bien que les transcripts cpm1 sont correctement exprimés, le récepteur Cpm1 n’est pas détecté dans l’intestin des larves résistantes. La comparaison de la séquence nucléique de cpm1 chez la souche GEO par rapport à la séquence cpm1 d’une souche sensible de référence a révélé la présence de sept mutations. Six d’entre elles changent la nature de l’acide aminé normalement présent dans la séquence cpm1 de la souche sensible. La septième mutation introduit un codon stop aberrant au niveau du signal d'ancrage du récepteur à la membrane. Les expériences d’expression hétérologue que nous avons réalisées ont démontré que la présence de cette mutation induit la sécrétion de Cpm1 dans le compartiment extracellulaire. L’activité alpha-glucosidase de cette forme mutante, ainsi que son interaction avec la toxine binaire ne sont pas altérés. Ainsi la résistance des larves GEO à la toxine binaire, est dû, non pas à une diminution de l’affinité de la toxine pour son récepteur, mécanisme déjà décrit dans plusieurs cas de résistance des insectes à des pesticides, mais à l’impossibilité pour la toxine d’interagir avec la membrane des cellules épithéliales, une étape clé pour les propriétés insecticides de Bs.


Un goût sauvage: La résistance de la Pomme de terre aux Insectes Y Pelletier La pomme de terre est la quatrième culture vivrière en importance au monde. À partir de son aire de diversification au Pérou, cette plante a été introduite sur tous les continents. Plusieurs insectes ravagent cette culture. En Amérique du Nord, le doryphore de la pomme de terre est l'insecte le plus nuisible à la culture de la pomme de terre. Des études visant au développement d'une variété de pomme de terre résistante au doryphore ont été entreprises, il y a quelques années. Plus récemment, nous avons initié des travaux sur les pucerons et l'altise de la pomme de terre. Les espèces de Solanum apparentées et produisant des tubercules peuvent être utilisées comme source génétique de résistance. L'évaluation de la variabilité génétique des facteurs de résistance entre les génotypes d'une même espèce est d'intérêt pour les améliorateurs. Nos travaux ont porté sur la définition du mode de résistance de plusieurs espèces de Solanum sauvages. Nous avons noté que bien que la majorité des espèces étudiées pour leur résistance au doryphore démontrent une résistance de type antibiose, certaines autres sont protégées par antixénose. Le comportement menant à l'acceptation de l'hôte du doryphore varie selon le stade de développement ce qui complique l'élaboration et l'utilisation de bio-essais pour la détermination du niveau de résistance de la plante. De plus, des travaux sur l'effet sur la prise alimentaire des composés chimiques présents dans la plante nous indiquent que l'effet répulsif croît avec la pureté du produit. Par ailleurs, des différences de perception de la plante par les larves ou l'adulte du doryphore ont été mis en évidence en étudiant les facteurs antixénotiques de S. tarijense.

XIVème Colloque de Physiologie de l’Insecte ; Amiens 14-16 avril 2003 Communications orales Effet probiotique de la ß-glucuronidase sur Myzus persicae

A Cherqui, S Alla, J Saguez, G Doury, BS Sangwann-Norrel, P Giordanengo Les travaux antérieurs ont montré que des pommes de terre transformées uniquement pour les gènes marqueurs nptII et uid A gus codant respectivement pour la néomycine phosphotransférase et la ß-glucuronidase altèrent significativement et de façon inattendue la physiologie du doryphore. Si la première enzyme induit une résistance des tissus transformés aux antibiotiques, la seconde permet une visualisation des tissus transformés. En étudiant un phytophage piqueur-suceur, Myzus persicae, nous avons pu observer que la période pré-reproductive, la longévité et la fécondité du puceron sont spécialement altérées lorsque les insectes sont élevés sur des plants de pomme de terre transformés par la construction nptII-uid A gus. Les résultats comparatifs des travaux effectués à la fois sur les doryphores et les pucerons montrent que la variation de ces paramètres physiologiques est en étroite relation avec l’activité enzymatique contenue dans les plantes. La protéine GUS, exprimée dans les plantes transgéniques semble donc influencer le développement de ces insectes. Des tests in vitro ont permis d’incorporer la protéine recombinante dans des milieux de culture et de constater que les paramètres physiologiques varient en fonction des concentrations de GUS, montrant un effet probiotique sur le puceron. Les résultats obtenus sur le milieu artificiel corroborent ceux obtenus sur les plantes transgéniques. Des anticorps anti-GUS ont permis d’identifier par Western blot des molécules de type Gus dans des extraits de broyat de pucerons élevés sur milieu artificiel et sur plantes transgéniques. Les analyses biochimiques ont suggéré que la protéine GUS présente quelques variations moléculaires vraisemblablement dues à des protéolyses lors du transit intestinal. Une étude immuno-histologique a montré une accumulation de cette protéine GUS principalement au niveau de la muqueuse intestinale mais aussi dans d’autres organes. GUS semble traverser la barrière intestinale et s’accumuler dans les embryons, les bactériocytes et les oenocytes. Les modalités d’interaction de cette enzyme avec le métabolisme des pucerons sont discutées.


Effet probiotique d’une chitinase d’insecte et d’une chitinase bactérienne sur le puceron Myzus persicae. J Saguez, A Cherqui, R Hainez, L Jouanin, BS Sangwan, P Giordanengo La chitine, un polymère de N-acétyl glucosamine, est le deuxième composé du vivant le plus représenté à la surface de la Terre, après la cellulose. Présente dans les parois bactériennes, on la trouve également chez les levures et dans la paroi fongique. Essentiellement présente au sein du règne animal chez les Arthropodes, la chitine est le constituant majeur des structures exosquelettiques sclérifiées: cuticule, trachées, membrane péritrophique et exochorion. La chitine représente donc une cible potentielle dans le développement de moyens de lutte contre les ravageurs des cultures. Des pommes de terre transgéniques (Solanum tuberosum L.) cultivar Désirée ont été transformées via Agrobacterium tumefasciens avec un gène de chitinase de Phaedon cochleariae inséré en tandem avec le gène de sélection nptII sous le contrôle du promoteur constitutif CaMV35S Ces lignées transgéniques induisent un effet inattendu lorsqu’elle sont fournies au puceron Myzus persicae Sulzer. Ce dernier, phytophage non-cible puisque dépourvu de membrane péritrophique, présente en effet une altération très significative des paramètres démographiques qui caractérisent ses populations lorsque celles-ci sont élevées pommes de terre exprimant la chitinase. L'utilisation d'une chitinase bactérienne (Serratia marcescens) fournie aux aphides via un milieu alimentaire artificiel a permis de confirmer l’influence directe de la chitinase sur les populations de pucerons.les effets probiotiques déjà mis en évidence. Les effets probiotiques inattendus rapportés par cette étude semblent remettre en question l’utilisation d'une telle stratégie chitinase dans un programme de lutte contre les insectes ravageurs.


Caractérisation chez Sitophilus oryzae d’un site de liaison de haute affinité pour le peptide entomotoxique PA1b F Gressent, I Rahioui, G Febvay, Y Rahbé PA1b (pour Pea Albumin 1b) est un peptide de 37 acides aminés extrait de la graine de pois (Pisum sativum) et comportant trois ponts disulfure. Ce peptide s’est avéré létal per os pour certains ravageurs, comme les charançons des céréales (genre Sitophilus) ou le puceron du pois. Un criblage de 90 souches des trois espèces de charançons a permis de sélectionner trois souches, toutes de l’espèce S. oryzae, résistantes à la toxine. Le déterminisme génétique de la résistance s’est révélé être monogénique et récessif, ces caractéristiques suggérant que la toxine puisse agir via un récepteur spécifique présent chez l’insecte. La détermination du mécanisme d’action de la toxine a donc été initiée par la recherche d’un (de) site(s) de liaison spécifique à PA1b par les techniques classiques d’études des interactions ligand récepteur (expériences de liaison). Le marquage radioactif du ligand, première étape nécessaire à ces études, a été obtenu par synthèse d’un peptide marqué à l’iode 125 présentant une activité spécifique d’environ 900 Ci.mmol-1. Ce ligand radioactif a ensuite permis de mettre en évidence une forte activité de liaison dans des extraits membranaires d’une souche référence de S. oryzae (souche WAA42). La caractérisation de ce site de liaison a montré qu’il était saturable, réversible, et de nature protéique (perte de l’activité de liaison par la chaleur et par l’action de la protéinase K). Un seul site de liaison est présent dans l’extrait membranaire, l’affinité de PA1b pour la protéine affine est très forte (Kd = 2 nM), et le site de liaison est très fortement représenté (Bmax = 40 pmol.mg de protéines-1). Des tests de liaison menés sur neuf souches de Sitophilus appartenant aux trois espèces, ont mis en évidence une très forte activité dans les extraits protéiques des cinq souches sensibles à la toxine, tandis que cette activité est indétectable dans les extraits des quatre souches résistantes, même en augmentant dix fois la quantité de protéines lors des essais. Comme le ligand radioactif n’est pas modifié lors des tests de liaison, que ce soit en présence des extraits de souches sensibles ou résistantes, cette spécificité semble montrer que le site de liaison est probablement impliqué dans le mécanisme d’action de la toxine, et que la résistance au sein de l’espèce S. oryzae passe par une modification ou une absence de la protéine cible. Cependant, cette activité de liaison est présente dans des extraits protéiques d’autres insectes, qu’ils soient sensibles (puceron du pois, coccinelle) ou résistants (drosophile, Tribolium castaneum) à la toxine. Il semble donc qu’un ou plusieurs autres mécanismes de résistance à la toxine existent chez les insectes autres que Sitophilus, et que ce mécanisme est indépendant du site de liaison caractérisé.


Tolérance de l’épinard par le puceron Myzus persicae S Alla, O Malek, N Takvorian, A Maria, A Berthier, R Lafont, F Marion-Poll Les phytoecdystéroïdes (PE), analogues des hormones de mue chez les insectes, sont des substances de défense identifiées chez de nombreuses plantes qui les protègeraient contre les insectes phytophages. Certaines espèces d’insectes semblent cependant adaptés à ces PE, comme le puceron Myzus persicae qui s’alimente sur l’épinard Spinacia oleracea (Chenopodiacée). Les feuilles de cette plante accumulent des concentrations élevées de PE (environ 800 mg/kg de poids frais) dont La 20-hydroxyecdysone (20E) et la polypodine B (dérivé 5-B hydroxylé de la 20E) sont les composés majoritaires. M. persicae préfère s’alimenter sur des feuilles jeunes plutôt que sur des feuilles âgées. Ce comportement pourrait suggérer que le puceron soit insensible aux PE, puisque les feuilles jeunes sont justement celles dans lesquelles la concentration en phytoecdystéroïdes est la plus élevée. Nous avons évalué l'effet de la 20E sur le puceron par des approches physiologique et comportementale et d’autre part, nous avons analysé la teneur en PE dans la sève des feuilles jeunes et âgées, en récoltant le miellat des pucerons. Nos résultats montrent qu’en situation de choix, le puceron évite de s'installer et de pondre sur un milieu artificiel contenant la 20E, de manière dose-dépendante. Cependant, en situation de non-choix, le puceron tolère un milieu riche en 20E. La quantification des PE présents dans le miellat de pucerons s’alimentant sur des feuilles apicales et basales montre pour la première fois l'existence d'une compartimentation dans les concentrations en 20E du phloème : les PE sont moins concentrés dans la sève des feuilles apicales par rapport aux feuilles basales, ce qui pourrait expliquer la distribution des pucerons le long du plant d’épinard. Mots clés : antiappétence, sève phloemienne, 20-hydroxyecdysone, puceron, épinard, miellat, exsudat


Les peptides de défense végétaux et leur potentiel d’utilisation pour la résistance contre les pucerons Y Rahbé, C Deraison, F Gressent, L Jouanin, S Louis Durant leur longue évolution et confrontation avec les insectes, les plantes ont développé des arsenaux insecticides divers pour contrôler ces agresseurs majeurs ; cette panoplie métabolique est dominée par des substances dites secondaires, à la chimie et la biosynthèse souvent complexes et botaniquement spécialisées. A coté de cette « coévolution chimique », des métabolites d’origine biosynthétique plus simple ont également été utilisés, comme certains polypeptides toxiques. La disponibilité des méthodologies recombinantes a permis de tester l’importance potentielle de nombreux polypeptides dans les fonctions de défense des plantes, notamment contre les insectes. Les insectes à alimentation spécialisée, comme les piqueurs suceurs, posent des problèmes particuliers tant au niveau des cibles potentielles (à cause de leurs adaptations physiologiques) que des stratégies d’expression (à cause de la compartimentation extrême de leur alimentation). Un certain nombre de petits peptides végétaux ont révélé des activités délétères in vitro contre plusieurs espèces de pucerons, et l’utilisation de certains d’entre eux comme facteur de défense contre des pucerons a été validée par transgénèse. Parmi eux plusieurs inhibiteurs de protéases, classe a priori peu favorable pour cibler les insectes strictement phloémophages, et dont nous tirerons l’essentiel de nos exemples. Une phytocystatine de riz a montré une activité de faible intensité in vitro, mais un spectre d’activité intéressant aux niveau des espèces cibles. L’effet de ce peptide sur la reproduction des pucerons a été validé in planta, et sa cible moléculaire majeure caractérisée dans le tube digestif du puceron cible (comme probablement dans les bactériocytes). Le potentiel d’utilisation des phytocystatines semble actuellement bien défini. Dans un autre groupe structural et fonctionnel, celui des inhibiteurs bifonctionnels de type Bowman-Birk, une activité biologique importante a été identifiée, avec cependant une variabilité spécifique plus grande que pour la phytocystatine. Cette activité a été attribuée à la boucle de site actif dirigée contre la chymotrypsine, bien qu’aucune activité chymotrypsique n’ait pu être caractérisée dans le tube digestif des pucerons. Enfin, dans une autre famille structurale d’inhibiteurs, les inhibiteurs trypsiques de Brassicaceae, la conversion d’un peptide monofonctionnel naturel, peu actif, d’une cible trypsine à une cible chymotrypsine a permis de générer une activité biologique anti-puceron, significativement plus importante que celle des anti-chymotrypsines de type Bowman-Birk. Quelques autres classes de peptides peuvent présenter un potentiel pour la résistance végétale aux pucerons, comme des thionines de céréales ou des albumines-knottines de légumineuses. Les peptides constituent donc une classe particulière de facteurs / gènes de défense contre les insectes, dont nous essayerons de dégager les spécificités et le potentiel d’utilisation contre les phloémophages.





COMMUNICATIONS AFFICHEES

XIVème Colloque de Physiologie de l’Insecte ; Amiens 14-16 avril 2003 Posters

L'expression rythmique du gène Period et sa régulation par les ecdystéroïdes M Mesnier, N Partiaoglou, N Richard-Mercier La lignée cellulaire IAL-PID2 a été établie à partir de disques imaginaux alaires de la chenille du Lépidoptère Plodia interpunctella. Ces cellules épidermiques synthétisent des ecdystéroïdes. Lorsque la lignée a été cultivée dans du milieu de Grace sans sérum (SVF) pendant au moins 10 jours, une sous population est sélectionnée. Il s'agit de cellules de petite taille et à la membrane cytoplasmique irrégulière, nous les avons appelées cellules frisées. Les prélèvements de milieu effectués toutes les 4 heures montrent que les ecdystéroides (dosés par EIA) présents dans le milieu varient cycliquement. Après renouvellement complet du milieu de Grace, 24 heures plus tard, les taux d'ecdystéroïdes dans le milieu atteignent environ 2 pmoles /106 cellules, puis leur taux baisse et un autre maximum est détecté environ 24h plus tard. L'expression du gène du récepteur des ecdystéroïdes ECR et du facteur de transcription E75 montre que ces ecdystéroïdes déclenchent la cascade d'activation de l'hormone. Cette sous- population produit donc des ecdystéroïdes et les métabolisent. La variation rythmique des taux d'ecdystéroïdes nous a incité à rechercher si elle est en relation avec une horloge biologique. Nous avons choisi comme gène de l'horloge, le gène Period dont la séquence de l'ARNm est connue chez Plodia interpunctella. L'expression du gène Period a été étudiée toutes les 4h durant 28 à 32h conjointement avec les niveaux d'ecdystéroïdes présents dans le milieu. Les variations de l'expression de Per suivent les variations du taux d'ecdystéroïdes du milieu lorsque ce taux est de l'ordre de 0,5 pmoles/106cellules. Cette expression varie régulièrement avec un maximum toutes les 8h lorsque les niveaux d'ecdystéroïdes sont environ 1,5 pmoles /106 cellules. Cependant, quand le niveau d'ecdystéroïdes atteint environ 2 pmoles /106 cellules, l'expression de Per diminue puis devient indétectable. Après addition dans le milieu d'ecdysone et de 20 hydroxyecdysone à des concentrations croissantes de 10-12 à 10-6M l'expression du gène Period varie selon la concentration hormonale. De plus, l'expression de Per est différente selon l'hormone ajoutée dans le milieu. Ainsi, pour des concentrations d'ecdysone de 10-12 à 10-6M et de 20 hydroxyecdysone de 10-12 à 10-8M l'expression de Per varie plus ou moins régulièrement. En revanche, pour des concentrations de 10-6M de 20 hydroxyecdysone l'expression de Per est supprimée pendant 24h consécutives puis reprend avec un rythme de 8h. Il semble donc y avoir une interaction entre le niveau d'ecdystéroïdes et l'expression de Period. Ce mécanisme pourrait assurer, au niveau d'une horloge périphérique, la synchronisation des signaux exogènes et endogènes contrôlant les mues.


Clonage d'un homologue du gène d'horloge period dans les antennes d'une noctuelle C Merlin, MC François, I Queguiner, M Maïbèche-Coisné, E Jacquin-Joly Les horloges circadiennes sont présentes chez la plupart des organismes vivants et interviennent dans la régulation de fonctions physiologiques variées, comme par exemple les rythmes d’éclosion ou l’activité locomotrice chez les insectes. Les approches génétiques développées chez la drosophile et chez la souris, ont conduit à la caractérisation de gènes d’horloge, largement conservés au cours de l’évolution, comme le gène period (per). Les mécanismes moléculaires responsables de l’établissement et du maintien des rythmes biologiques reposent sur des boucles d’autorégulation négative, les facteurs de l’horloge réprimant leur propre transcription lorsqu’ils atteignent des taux d’expression critique. Outre les horloges centrales, situées dans le système nerveux central, l’existence d’horloges périphériques a été démontrée en 1997 chez la drosophile avec la mise en évidence d’oscillations du gène per dans des tissus tels que les antennes, les pattes et les ailes, et notamment dans les cellules chimiosensorielles. Chez la noctuelle Mamestra brassicae nous avons cloné par RT-PCR et RACE-PCR un ADNc codant pour un homologue de period (Mbra-per) dans le cerveau ainsi que dans les antennes. La séquence protéique déduite présente 27 % et 50 % d'identité avec les séquence sde drosophile et du papillon Antheraea pernyi, respectivement. L'étude de l'expression tissulaire de Mbra-per a révélé l'existence du transcrit correspondant dans tous les tissus testés. En particulier, le patron d'expression dans les antennes montre une expression dans les sensilles olfactives. Ce travail suggère l'existence d'une horloge périphérique antennaire dont le rôle dans l'olfaction reste à étudier.


A serpin mutant links Toll activation to melanisation in the host defense of Drosophila N Pelte, P Ligoxygakis, C Ji, V Leclerc, B Duvic, M Belvin, H Jiang, JA Hoffmann, JM Reichhart Une analyse par BLAST nous a permis d'identifier un inhibiteur de serine protéase, Spn27A, homologue des serpines d'insectes connues pour inhiber PPAE, la protéase d'activation de la prophénoloxydase. La mobilisation d'un élément P, inseré en amont du gène codant pour Spn27A, a permis d'obtenir un mutant perte de fonction. A l'aide de ce mutant et d'anticorps dirigés contre la partie C-terminale de la protéine, nous avons mis en évidence que Spn27A participe à la régulation de la cascade de mélanisation et que l'activation de celle-ci est dépendante de la voie de signalisation Toll. Un modèle du contrôle de la cascade de mélanisation par Spn27A est proposé.


Étude de la résistance au parasitoïde Leptopilina boulardi chez Drosophila yakuba A Dubuffet, Y Carton, M Poirié Les parasitoïdes sont des insectes dont le développement larvaire ne peut s’effectuer qu’aux dépens d’un autre arthropode, tandis que le stade adulte est libre (Godfray, 1993). Bien que les parasitoïdes soient en général virulents sur leurs hôtes, certaines souches, dites avirulentes, sont incapables de contourner la réaction immunitaire de souches hôtes résistantes. Cette réaction immunitaire consiste en l’élaboration d’une capsule multicellulaire autour de l’œuf du parasitoïde, composée de certains types d'hémocytes (Carton and Nappi, 1997). Nous connaissons, chez l’espèce hôte Drosophila yakuba, 2 types de résistance au parasitoïde Leptopilina boulardi. La résistance dite R2 permet l’encapsulement de toutes les souches de L. boulardi connues tandis que la résistance R1 n’est pas efficace face à une souche africaine bien caractérisée de ce parasitoïde. Pour comprendre l’origine physiologique de cette différence d’efficacité de la réaction immunitaire j’ai comparé le nombre et l’aspect des différentes types d’hémocytes avant et après parasitisme dans ces 2 souches. Les résultats obtenus ont été comparés avec les études menées sur les systèmes hôte-parasitoïde D. melanogaster – L. boulardi (Russo et al., 2001) et D. melanogaster - Asobara tabida (Kraaijeveld et al., 2001). Par ailleurs, j’ai recherché l’existence d’un coût à la résistance de type R2 afin de comprendre notamment pourquoi ce caractère n’est pas fixé dans les populations naturelle. Carton, Y. and Nappi, A.J. (1997) Drosophila cellular immunity against parasitoids. Parasitol. Today 13, 218-227. Godfray, H.C.J. (1993) Parasitoids: Behavioral and evolutionary ecology. University Press, Princeton. Kraaijeveld, A.R., Limentani, E.C. and Godfray, H.C. (2001) Basis of the trade-off between parasitoid resistance and larval competitive ability in Drosophila melanogaster. Proc R Soc Lond B Biol Sci 268, 259-261. Russo, J., Brehelin, M. and Carton, Y. (2001) Haemocyte changes in resistant and susceptible strains of D. melanogaster caused by virulent and avirulent strains of the parasitic wasp Leptopilina boulardi. J Insect Physiol 47, 167-172.


Lipophorines de termites : spécificité et titrage par ELISA chez différentes espèces et différentes castes à l’aide d’un antiserum Y Fan, C Schal, EL Vargo, AG Bagnères Le transport de lipides, dont ceux constituant la signature chimique, constitue une fonction vitale chez les insectes, et nécessite des lipoprotéines présentes dans l’hémolymphe, les lipophorines. Les lipophorines de haute densité (HDLp) ont été isolées chez le termite américain Reticulitermes flavipes. La pureté est vérifiée par SDS-Page. Un anti-serum a été généré dans des lapins et sa réactivité est étudiée par immunodiffusion chez 10 espèces de termites de différents genres (Reticulitermes, Coptotermes, Zootermopsis, et Kalotermes) et 5 espèces de blattes. La spécificité de cet anticorps vis à vis des lipophorines est étudiée par Western blot. Des tests d’immunoprécipitation confirment que les hydrocarbures de l’hémolymphe, chez les espèces testées (deux de termites et une de blatte), sont bien associés spécifiquement aux lipophorines. Un test ELISA a été développé et utilisé pour titrer les lipophorines de différentes castes de R. flavipes.


Synchronisation de la lignée cellulaire IAL-PID2 du lépidoptère Plodia interpunctella par un traitement à l'hydroxyurée D Siaussat, V Mottier, F Bozzolan, P Porcheron, S Debernard Le développement post embryonnaire des insectes est contrôlé par une hormone de nature stéroïdienne, la 20-hydroxyecdysone (20E) qui induit des modifications cellulaires associées aux processus de mues. L'utilisation de plusieurs lignées cellulaires d'insectes a permis de préciser le mode d'action de la 20E. La lignée cellulaire épidermique IAL-PID2 du lépidoptère Plodia interpunctella répond à la 20E par un arrêt de la prolifération avec un blocage des cellules dans la phase G2 suivi d'une différentiation morphologique. En utilisant, l'hydroxyurée, un inhibiteur réversible de la synthèse d'ADN, nous avons mis au point un protocole de synchronisation des cellules IAL-PID2 afin d’étudier les événements moléculaires et cytologiques impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire par la 20E. Un simple traitement de 36 h à l'hydroxyurée pour des concentrations de 0,5 mM et 1 mM entraîne un ralentissement de la croissance cellulaire avec un blocage de 80 à 90% des cellules dans la transition G1/S. Après retrait de la drogue, les cellules reprennent leur activité cyclique en progressant dans les phases S puis G2 et l'entrée en mitose s'étale sur une fenêtre de 8h. Un double traitement à l'hydroxyurée permet une optimisation de la synchronisation reflétée par un doublement de la population sur un intervalle de 4h. Sachant que la cycline A contrôle la progression des cellules dans la phase S et la transition G2/M, nous l'avons utilisé pour tester l'efficacité de cette synchronisation. Nous avons donc cloné un ADNc de 3Kb codant pour Plodia cyclin A et constaté que cette cycline A est préférentiellement exprimée pendant la phase S et à la fin de la phase G2. Nous avons ensuite testé l'effet de la 20E sur l'activité proliférative des cellules. Ainsi, un traitement à la 20E à une concentration physiologique de 10-6 M induit un arrêt de la prolifération cellulaire par blocage de 85% des cellules en G2. Ce résultat démontre que le traitement à l'hydroxyurée ne modifie pas la sensibilité des cellules à la 20E. Par ailleurs, nous avons montré que la 20E induit une expression maximale du récepteur nucléaire Plodia HR3 à la transition S/G2. Ce récepteur serait impliqué dans la cascade génétique induite par la 20E conduisant à l'arrêt en G2. L'utilisation de ce protocole de synchronisation constitue un bon outil pour étudier les évènements moléculaires et cytologiques induits par la 20E dans le contrôle du cycle cellulaire.


La résistance du moustique Culex pipiens à la toxine binaire de Bacillus Sphaericus sur le terrain : Etude de la souche SPHAE. Y Pauchet, C Castella, I Darboux, D Pauron Bacillus sphaericus (Bs) est utilisé comme agent larvicide pour le contrôle du moustique Culex pipiens. La toxicité de Bs provient essentiellement de la synthèse, lors de la sporulation, d'une toxine sous forme d'inclusions parasporales cristallines. Ces Inclusions sont composées de deux polypeptides (protoxine) appelés BinA (42 kDa) et BinB (51 kDa) agissant en synergie après leur activation par des protéases digestive, d’où son nom de toxine binaire (Bin). Bin se lie spécifiquement à une alpha-glucosidase digestive d'un poids moléculaire d’environ 67 kDa ancrée à la membrane plasmique des cellules intestinales par glycosylphosphatidylinositol (GPI), qui a été nommée Cpm1 pour Culex pipiens maltase 1 (Silva-Filha et coll., 1999 ; Darboux et coll., 2001). Plusieurs cas de résistance à Bs ont été décrits dans le Monde et notamment sur le littoral méditerranéen français. Ce travail s'est attaché à caractériser le mécanisme de résistance à Bs chez une de ces populations appelée SPHAE. Celle-ci possède un niveau de résistance très élevé (R = 10.000). Cette résistance est monogénique et récessive (Nielsen-LeRoux et coll., 2002). Contrairement à d’autres souches résistantes à Bs où l’étape clé de fixation de Bin sur Cpm1 est altérée (Darboux et coll., 2002), des expériences préliminaires de biochimie ont montré que cette étape n’est pas modifiée chez les larves SPHAE (Nielsen-LeRoux et coll., 1997). Nous avons confirmé ces résultats en analysant la séquence de l’allèle Cpm1 chez SPHAE, nous n’avons mis en évidence aucune mutation non silencieuse par rapport à la séquence de l’allèle Cpm1 d’une souche sensible de référence contrairement à ce que nous avions observé chez une autre souche résistante nommée GEO (Darboux et coll., 2002). L’ajout d’un dérivé fluorescent de Bin dans l’eau des larves SPHAE nous a permis de mettre en évidence l’absence de Bin au niveau de l’épithélium intestinal alors que celle-ci est retrouvée chez les larves de la souche sensible de référence. Cette expérience met en évidence que, chez les larves SPHAE, bien que l’interaction Bin/Cpm1 proprement dite n’est pas modifiée, Bin n’est pas capable d’aller se fixer sur Cpm1 alors qu’elle le peut chez les larves sensibles suggérant que le mécanisme de résistance chez les larves SPHAE touche une étape du mode d’action de Bin située en amont de la fixation de Bin sur Cpm1. Les deux principales étapes pouvant être altérées en amont de Cpm1 sont d’une part l’activation par des protéases digestives de la protoxine Bin en toxine Bin active. Cette étape est cruciale car Bin non activée n’est pas du tout toxique sur les larves. D’autre part, une modification de la perméabilité de la membrane péritrophique soit par épaississement soit par modification d’un de ces constituants pourrait empêcher Bin d’atteindre l’épithélium intestinal et donc se fixer sur Cpm1 (Granados et coll., 2001).


Eco-Etho-Toxicologie d’enzymes à cytochrome P-450 et d’acetylcholinestérases chez le crustacé d’eau douce Gammarus pulex JJ Lenoir-Rousseaux, C Chauvin Nous avons entrepris d’identifier et de mesurer les activités d’enzymes à cytochrome P450 (CYPs) chez un crustacé amphipode d’eau douce (Gammarus pulex) pour apprécier l’impact du stress environnemental aquatique par les polluants organiques. Le spectre d’absorption à 450 nm, en conditions réductrices (méthode de Omura et Sato, 1964) a permis de mettre en évidence des activités CYPs dans des extraits membranaires de dérivés du tube digestif : les coeca. La capsule céphalique contenant le cerveau du gammare présente une activité acetylcholinestérasique (AChE) significative, mesurable par la méthode d’Ellmann (1961) Grâce à l’utilisation de dérivés fluorescents de la coumarine (ECOD), selon la technique d’incubation in vitro développée sur l’abdomen de la drosophile par de Sousa et al. (1995), nous avons mesuré la fluorescence c. à d. l’activité P450 rapportée à la quantité de protéines (activité spécifique) de chacun des 4 diverticules du tube digestif ou coeca. L’activité spécifique P450 (en pmol de substrat transformé par µg de protéines de coeca), en milieu non pollué est significativement inférieure à celle observée en site pollué. Les sites d’expérimentation sont constitués, pour le premier type, par une exsurgence karstique exempte de contamination significative, et pour le deuxième type, par une station en cours d’eau de qualité moyenne, contaminé par des rejets urbains diffus (traversée d’une agglomération). L’immersion d’animaux de source en site « rivière » provoque une élévation significative de l’activité P450 dès 24h, l’inverse induit une chute de cette activité suggérant un mécanisme d’induction classique, d’enzymes de détoxication par les polluants. L’incubation des coeca en présence de barbituriques induit une activité P450 proportionnelle de type courbe dose-réponse. L’activité P450 mesurée en site pollué évolue significativement chez les mâles isolés sains solitaires ou en période de préaccouplement (précopula), en relation avec la pluviométrie du site, rendant compte du débit des eaux de ruissellement de la rivière lessivant des sites plus ou moins pollués. L’activité AChE spécifique (n moles /h/g de protéines) des mêmes animaux, au même site, évolue également de façon significative. Si les valeurs P450 s’élèvent, les mesures AChE s’abaissent, rendant compte au cours d’un lessivage de ruissellement pollué d’une détoxication à cytochromes P450 accrue et d’une inhibition comparable à celle observée en présence de pesticides sur l’activité AChE. Ces données suivies sur deux ans suggèrent que ces profils enzymatiques P450 et AChE obtenus sur ce crustacé pourraient permettent d’exploiter ce gammare comme marqueur biologique du stress environnemental, peu onéreux, applicable aux eaux douces.


Degrés d'infestation de différentes espèces fruitières par les Tephritidae en Guyane française et pourcentages de parasitisme des espèces de mouches des fruits d'intérêt économique. JF Vayssières, JP Cayol, M Chambaud, M Blanc Les niveaux d'infestation, en Guyane française, des différentes espèces fruitières par les 4 espèces de Tephritidae d'intérêt économique montrent que nous pouvons séparer les hôtes en trois catégories, les primaires (+++), les secondaires (++) et les accidentels (+).

- Pour B. carambolae (CFF) les hôtes primaires sont la carambole (Averrhoa carambola L.), la pomme–rosa (Syzygium samarangense Merr. & Perry), la pomme de Cythère (Spondias dulcis Foster), tandis que les hôtes secondaires sont l'acérole (Malpighia punicifolia L.), la mangue (Mangifera indica L.), la pomme d'amour (S. malaccense Merr. & Perry) et la goyave (Psidium guajava L.).

- Pour A. striata l'hôte primaire est la goyave (P. guajava), tandis que la carambole (A. carambola) et la

pomme–rosa (S. samarangense) sont davantage des hôtes accidentels en fonction des chiffres et résultats d'élevage obtenus.

- Pour A. obliqua l'hôte secondaire est le mombin (Spondias mombin L.) tandis que la pomme–rosa (S.

samarangense) et la carambole (A. carambola) sont davantage des hôtes accidentels en fonction des chiffres et résultats d'élevage obtenus.

- Pour A. serpentina l'hôte primaire est la caîmite (Chrysophyllum caînito L.).

En classant les hôtes par famille on peut en conclure que B. carambolae est inféodée principalement à une Oxalidaceae, à deux Anacardiaceae, à une Malpighiaceae et à trois Myrtaceae. A striata est inféodée principalement à une Myrtaceae tandis qu' A. obliqua est inféodée principalement à une Anacardiaceae. A. serpentina est inféodée essentiellement à une Sapotaceae. Le pourcentage moyen de parasitisme est très faible avec 1.8 %. Trois espèces de parasitoîdes ont été recensées avec plus des trois quart des effectifs représentés par Doryctobracon areolatus (Szépligeti), espèce endémique de la famille des Braconidae. Seules les larves d'Anastrepha hébergent les larves de ces micro-hyménoptères. Ces premiers résultats, concernant à la fois l'absence de parasitoîdes vis à vis de B. carambolae comme les faibles pourcentages de parasitisme vis à vis des Anastrepha, nous permettent de penser que des introductions de nouvelles espèces d'auxiliaires peuvent être prometteuses dans le cadre du projet de lutte biologique que nous allons initier.


Stérols et ecdysteroïdes impliqués dans l’ovogenèse du parasitoïde synovigénique Eupelmus vuilleti N Mondy, M-F Corio-Costet, C Blais, J-P Monge Dans le systèmes tri-trophiques plante (Vigna unguiculata) –phytophage (Callosobruchus maculatus) –parasitoïde (Eupelmus vuilleti), les hyménoptères parasitoïdes produisent leur ovocytes tout au long de leur vie. Cette production est très modulable. En effet, elle peut être rapide et importante lorsque cela est nécessaire, et s’arrêter brusquement si aucun hôte n’est disponible. Cette stratégie implique que les ovarioles et les mécanismes endocrines contrôlant l’ovogenèse restent fonctionnels tout au long de la vie de l’adulte. Les stérols, constituants essentiels des membranes, sont également des précurseurs des ecdystéroïdes chez les insectes. Or, ces derniers sont incapables de les synthétiser de novo, ils doivent donc les puiser dans leur alimentation. De ce fait, la parfaite connaissance de l’origine et des flux des différents stérols associé à la production d’ecdystéroïdes est primordiale pour appréhender le fonctionnement. du système. Les résultats obtenus montre que le phytophage C. maculatus est capable de déalkyler les stérols végétaux et de les convertir en cholestérol. Le profil stérolique du parasitoïde signale une nette prédominance du cholestérol (75 % des stérols totaux) avec une accumulation surprenante de stigmastérol (15%). De plus, l’ecdysone est le l’ecdysteroide majeur d’E. vuilleti et les femelles sont bien capables de moduler leur ovogenèse en relation avec la disponibilité en hôte.


Toxicité et mode d’action des substances allélochimiques des Allium vis à vis des insectes urbains et des denrées stockées S Dugravot, M Magnin-Robert, N Mondy, D Macherel, J Huignard, J Auger, B Lapied Les plantes du genre Allium, lorsqu’elles sont endommagées ou attaquées par des insectes émettent des composés soufrés volatils. Ces substances soufrées sont principalement des thiosulfinates (Ti) pouvant donner naissance sous certaines conditions aux disulfures (DS). Ces composés volatils interviennent très certainement dans les réactions de défense des Allium contre les insectes généralistes. Des études de laboratoire ont montré que ces composés allélochimiques s’avèrent toxiques contre un très large spectre d’insectes (Auger et al. 1994, Dugravot et al., 2002) mais leurs modes d’actions sur le système nerveux et le métabolisme des insectes étaient jusqu’à maintenant inconnus. Par des techniques de neuroelectrophysiologie effectuées sur des corps cellulaires de neurones isolés (DUM neurones) de la blatte Periplaneta americana nous avons tout d’abord pu montrer que le DMDS et le DMTi induisaient une hyperpolarisation du potentiel de membrane associée à une diminution de la résistance membranaire, aboutissant à la disparition totale du potentiel d’action. L’hyperpolarisation induite par le DMDS est fortement réduite en présence de glibenclamide et de tolbutamide qui sont des bloqueurs spécifiques des canaux potassiques ATP-dépendants, laissant présager que le DMDS agit directement ou indirectement sur ces canaux potassiques ATP-dépendants, jusqu’alors jamais caractérisés sur neurones d’insectes. Dans un deuxième temps, des techniques de spectrophotométrie réalisées sur des mitochondries isolées de pois nous ont permis de mettre en évidence que le DMDS inhibe l’activité de la cytochrome oxydase et provoque donc une diminution considérable de la concentration en ATP intracellulaire expliquant les effets observés sur le neurone de blatte (Dugravot et al. 2003). Cette très forte toxicité des composés allélochimiques des Allium peuvent très certainement expliquer pourquoi les insectes généralistes évitent de se développer aux dépens des Allium et notamment du poireau.


Les métabolites secondaires des plantes : biosynthèse et rôle des phytoecdystéroïdes chez l’épinard (Spinacia oleracea) N Takvorian, S Alla, A Maria, F Marion-Poll, R Lafont Les phytoecdystéroïdes (PEs) représentent des composés identiques ou apparentés aux hormones de mue des arthropodes. Ils sont accumulés de façon significative (jusqu’à 3% du poids sec dans certains organes végétaux) par environ 6% des espèces végétales appartenant aussi bien aux Ptéridophytes et aux Gymnospermes qu’aux Angiospermes. Les PEs sont supposés protéger les plantes qui les produisent contre les ravageurs. Cette protection peut se faire soit par un effet toxique, soit tout simplement par un effet répulsif/antiappétant. Parmi les plantes cultivées pour l’alimentation humaine, l’épinard est la seule espèce qui contienne des concentrations élevées de PEs. L’accumulation des PEs dans cette plante se fait selon un gradient croissant allant des feuilles âgées vers les plus jeunes. Les jeunes feuilles apicales contiennent les plus fortes quantités (jusqu’à 800 mg/g de poids frais). L’incorporation de précurseurs marqués au 14C a montré que la biosynthèse des PEs peut se faire dans les feuilles matures et les racines. Leur accumulation dans les racines est induite par blessure mécanique, par attaque par les insectes ainsi que par l’application d’acide jasmonique. Ces résultats renforcent l’hypothèse de leur rôle dans la défense des plantes contre les ravageurs. A côté de ce rôle de protection, on a attribué à ces molécules des effets anabolisants, vertus déjà rapportées pour l’épinard (cf. Popeye). Cet effet anabolisant serait dépourvu des effets secondaires connus pour les androgènes. D’autres effets pharmacologiques sont également avancés pour ces molécules, notamment comme antidépresseurs ou anticancéreux.





ANNUAIRE DES PARTICIPANTS

XIVème Colloque de Physiologie de l’Insecte ; Amiens 14-16 avril 2003 Annuaire des participants

ALLA Salah [email protected] INA P-G INRA Phytopharmacie route de Saint Cyr 78026 VERSAILLES AMELINE Arnaud [email protected] Biologie des Entomophages Université de Picardie Jules Verne Faculté des Sciences 33 rue Saint Leu 80039 AMIENS CEDEX 1 AMICHOT Marcel [email protected] INRA, UMR n 1112 "ROSE" équipe API 123, Bd. F. Meilland, BP2078 6606 ANTIBES AZZOUZ Hichem [email protected] INRA Laboratoire de Neurobiologie Comparée des Invertébrés La Guyonnerie, BP 23 91440 BURES-SUR-YVETTE BAGNERES Anne-Geneviève [email protected] Institut de Recherche sur la Biologie de l'Insecte UMR CNRS 6035 Université de Tours Faculté des Sciences et Techniques Parc Grandmont Avenue Monge 37200 TOURS BOIVIN Solen [email protected] INRA Laboratoire de Zoologie Forestière Avenue de la Pomme de Pin BP 20619 Ardon 45166 OLIVET CEDEX BREHELIN Michel [email protected] CNRS Université Montpellier II Place E. Bataillon 34000 MONTPELLIER CALEVRO Federica [email protected] INRA / INSA de Lyon BF2I INSA Batiment L. Pasteur 69621 VILLEURBANNE CEDEX CHERQUI Anas [email protected] Biologie des Entomophages Université de Picardie Jules Verne Faculté des Sciences 33 rue Saint Leu 80039 AMIENS CEDEX 1


CHRISTIDES Jean-Philippe [email protected] Institut de Recherches sur la biologie de l'insecte Fac des sciences - Parc Grandmont Université de Tours 37200 TOURS COUTY Aude Biologie des Entomophages Université de Picardie Jules Verne Faculté des Sciences 33 rue Saint Leu 80039 AMIENS CEDEX 1 DARBOUX Isabelle [email protected] UMR ROSE INRA UNSA 1112 123, Bd F. Meilland BP 2078 6606 ANTIBES DEBERNARD Stéphane [email protected] Université Pierre et Marie Curie Physiologie Cellulaire des Invertébrés 12 Rue Cuvier 75005 PARIS DEDEINE Franck [email protected] Biométrie et Biologie Evolutive (UMR CNRS 5558) Université Claude Bernard - Lyon 1 Bât Gregor Mendel, 43 Bd du 11 novembre 1918 69100 VILLEURBANNE DEVAUCHELLE Gérard [email protected] INRA-CNRS Saint Christol-lez-Alès 30380 ST CHRISTOL-LEZ -ALÈS DOURY Géraldine [email protected] Biologie des Entomophages Université de Picardie Jules Verne Faculté des Sciences 33 rue Saint Leu 80039 AMIENS CEDEX 1 DUBUFFET Aurore [email protected] I.R.B.I. Parc Grandmont Avenue Monge 37 200 TOURS DUPUY Catherine [email protected] Institut de Recherche sur la Biologie de l'Insecte Faculté des Sciences; Avenue Monge 37200 TOURS


DUVIC Bernard [email protected] UMR EMIP INRA-UMII n 1133 Ecologie microbienne des Insectes et Interaction Hôte-pathogène Université Montpellier II CC 101, Place E. Bataillon 34000 MONTPELLIER ESLIN Patrice [email protected] Biologie des Entomophages Université de Picardie Jules Verne Faculté des Sciences 33 rue Saint Leu 80039 AMIENS CEDEX 1 GIORDANENGO Philippe [email protected] Biologie des Entomophages Université de Picardie Jules Verne Faculté des Sciences 33 rue Saint Leu 80039 AMIENS CEDEX 1 GRESSENT Frédéric [email protected] INRA / INSA de Lyon BF2I INSA Batiment L. Pasteur 69621 VILLEURBANNE CEDEX GUEZ David [email protected] Research School of Biological Sciences Australian National University 200 CANBERRA ACT AUSTRALIE KAISER-ARNAULD Laure [email protected] INRA Neurobiologie Comparée des Invertébrés rue de la Guyonnerie BP23 91440 BURES-SUR-YVETTE KUTNIK Magdalena Institut de Recherche sur la Biologie de l'Insecte UMR CNRS 6035 Université de Tours Faculté des Sciences et Techniques Parc Grandmont Avenue Monge 37200 TOURS LABROSSE Corinne [email protected] Institut de Recherche sur la Biologie de l'Insecte Avenue Monge Parc Grandmont 37200 TOURS


LE CONTE Yves [email protected] INRA UMR 406 Site Agroparc Domaine Saint Paul 84914 AVIGNON CEDEX 9 LE CORRONC Hervé [email protected] Laboratoire de Neurophysiologie UPRES EA 2647 UFR Sciences 2 bd Lavoisier 49045 ANGERS CEDEX LENOIR-ROUSSEAUX Jean Jacques [email protected] Laboratoire de Zoologie Université de Bourgogne 6 bd Gabriel 21000 DIJON LEONCINI Isabelle [email protected] Université de Rennes I UMR 6552 Ethologie Evolution Ecologie Batiment 25 Campus de Beaulieu 35042 RENNES MAIBECHE Martine [email protected] INRA Phytopharmacie route de St-Cyr 78026 VERSAILLES CEDEX MANDON NICOLE [email protected] Institut de Recherche sur la Biologie de l'Insecte Parc Grandmont 37200 TOURS MERCHAT Laurent [email protected] ALTERNATECH 70, rue des Jacobins 80000 AMIENS MERCIER Noelle [email protected] Université Pierre et Marie Curie Physiologie Cellulaire des Invertébrés 12 rue Cuvier 75005 PARIS MERLIN Christine [email protected] INRA Phytopharmacie et Médiateurs Chimiques Route de St-Cyr 78026 VERSAILLES CEDEX MONDY Nathalie [email protected] Institut de Recherches sur la biologie de l'insecte Fac des sciences - Parc Grandmont Université de Tours 37200 TOURS


MOREAU Sébastien [email protected] Biologie des Entomophages Université de Picardie Jules Verne Faculté des Sciences 33 rue Saint Leu 80039 AMIENS CEDEX 1 MOTTIER Violaine [email protected] Université Pierre et Marie Curie Physiologie Cellulaire des Invertébrés 12 rue Cuvier 75005 PARIS NAGNAN-LE MEILLOUR Patricia [email protected] INRA Unité de Phytopharmacie et Médiateurs Chimiques Bâtiment A-route de Saint-Cyr 78026 VERSAILLES CEDEX PAUCHET Yannick [email protected] Institut National de la Recherche Agronomique 123, Boulevard Francis Meilland BP2078 6606 ANTIBES CEDEX PELLETIER Yvan [email protected] Potato Research Centre Agriculture Agri-Food Canada PO Box 20280 850 Lincol Rd Fredericton NEW BRUNSWICK CANADA E3B4Z7 PENNACCHIO Francesco [email protected] Dipartimento di Biologia Università della Basilicata Macchia Romana 85100 POTENZA ITALY PREVOST Geneviève [email protected] Biologie des Entomophages Université de Picardie Jules Verne Faculté des Sciences 33 rue Saint Leu 80039 AMIENS CEDEX 1 RAHBE Yvan [email protected] INRA UMR INRA-INSA BF2I 20 ave. A. Einstein 69621 VILLEURBANNE RAMIREZ-ROMERO Ricardo [email protected] Neurobiologie Comparée des Invertébrés INRA BP23 91440 BURES-SUR-YVETTE


RENOU Michel [email protected] INRA Phytopharmacie et Médiateurs Chimiques Route de Saint Cyr 78026 VERSAILLES ROUAULT Gaëlle [email protected] INRA Avenue de la Pomme de Pin BP 20619 Ardon 45166 OLIVET CEDEX SABATER-MUNOZ Beatriz [email protected] INRA UMR INRA/ENSAR BiO3P BP35327 35653 LE RHEU CEDEX SAGUEZ Julien [email protected] Biologie des Entomophages Université de Picardie Jules Verne Faculté des Sciences 33 rue Saint Leu 80039 AMIENS CEDEX 1 SIAUSSAT David [email protected] Université Pierre et Marie Curie Physiologie Cellulaire des Invertébrés 12 Rue Cuvier 75005 PARIS TAGU Denis [email protected] INRA UMR INRA/ENSAR BiO3P BP35327 35653 LE RHEU CEDEX THIERY Denis [email protected] Unité de Recherches en Santé Végétale INRA BP 81 33883 VILLENAVE D'ORNON CEDEX VAVRE Fabrice [email protected] UMR CNRS 5558, Biométrie et Biologie Evolutive Université Lyon I 43 bd du 11 Novembre 1918 69622 VILLEURBANNE CEDEX VAYSSIERES Jean-François [email protected] C.I.R.A.D. B.P. 701 KOUROU 97387 Cx 97387 KOUROU


VIGNEUX Fabienne [email protected] UMR 1133 INRA Laboratoire EMIP Université Montpellier II Place Eugène Bataillon cc.101 34095 MONTPELLIER CEDEX 5 VOLKOFF Anne-Nathalie [email protected] INRA Laboratoire Pathologie Comparée 30380 SAINT CHRISTOL LES ALES WÄCKERS Felix [email protected] NIOO CTO PO Box 40 6666 ZG HETEREN THE NETHERLANDS

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