clonage, organisation et expression des gènes des protéines ribosomiques des eucaryotes

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1983, 65, n ° 7.

Clonage, organisation et expression des gbnes

des prot6ines ribosomiques des eucaryotes

Chez les bact~ries, la structure des protdines ribosomiques (r-prot~ines) et beaucoup d'aspects de I'orga'nisation fonction- nelle de ces constituants sont actuelle- ment bien connus [ I , 2]. Parall~lement, au cours des cinq dernidres ann~es, les m~canismes qui assurent la synth~se coordonnde des prot~ines ribosomiques ont dt~ en partie pr~cis~s [3, 4, §]. Les informations dan s ces diff~rents domaines sont encore tr~s fragmentaires chez les organismes eucaryotes. La sdquence de quelques protdines a pu ~tre dtablie, mais seuls quelques domaines l imi t ,s de la fonction des r-prot~ines ont ~t~ abord~s par des approches g~n~tiques [6, 1]. Depuis environ trois ans, des s~quen'ces correspondant aux g~nes de structure de prot~ines ribosomiques ont pu ~tre clo- ndes chez diff~rents organismes: les levures Sacicha,romyc~es cerevi,~i~e [8, §] et S. c~l;sbergens'i,s [10], /a drosophile [ I I, 12], lex~nope [13] et la souris [14].

Nous pr~senterons ici les m~thodes qui ont &t~ utilis~es pour isoler les g~nes de r-prot~ines et nous examinerons les r~sultats obtenus par l'utilisation des sondes que constituent ces sdquences, pour suivre en particulier I" expression des g~nes correspondants.

Clonage des g~nes des prot~ines ribosomiques

La synth~se de certaines prot~ines est considdrablement amp/ifi~e ~ certains

stades du d6veloppement ou dans des types cellu/aires particuliers. Les RNA messagers abondants correspondant ~ de relies prot~ines peuvent ~tre purifies et utilis~s comme sonde pour identifier, par hybridation, les s~quences compl~mentaires dans une collection de fragments de DNA g~nomique total. Une tel/e appro- che ne peut ~tre utilisde dans le cas des prot~ines ribosomiques, dont le taux de synth~se varie peu par rapport ~ celui des autres prot6ines cellulaires. Cependant, plusieurs considerations ont permis de d~finir une stratdgie g~ndrale, permettant d'identifier les sdquences codant pour les r-prot~ines [8] . En premier lieu, ces pro- t~ines sont des constituants cellulaires moyennement abondants et les mRNA de chacune des 70 ~ 80 prot~ines ribosomiques repr6sentent de O, 1 ~} 0,2 p. cent des messagers cel/ulaires [1§]. Les messagers des r-prot~ines son t de taille homog~ne et rdduite. De ce fait, ces messagers peuvent ~tre enrichis 5 ~ 10 fois par fractionnement des mRNA polyad~- ny/ds sur gradient de saccharose. Les mRNA des r-prot~ines so'nt pr6sents dans les fractions ayant un coefficient de s6di- mentation inf~rieur ~ 12S [14, 16, 17]. Ces mRNA peuvent ~tre traduits avec une bonne efficacit~ dans les syst~mes de traduction i~n Vi~tpo, extraits de germe de big ou lysat de r~ticulocytes. Le carac- tare basique de la tr~s grande majoritd des prot~tnes ribosomiques permet d'identifier les pro duits de traduction correspondant ~ ces mRNA apr~s ~lectropho- r~se bidimensionnelle, dans des conditions ob les r-prot~ines sont presque totalement sdpardes des autres prot~tnes cel/ulaires [ 18].

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Ces caract~ristiques ont dt~ utilis~es par Woofford e~ ~11,. [8] pour cloner les g~nes de quatre p[ot6ines de la levure S. cerevi~si~e. Les mRNA presents dans los polysomes de petite taille (2-4 parti- cules ribosomiques par polysome) ont ~t~ purifids. Ces mRNA, qui ont un coefficient de s~dimentation de I'ordre de 9S, ont ~td traduits ;i~n vitro. L'identif ication des produits de traduction a montr~ que la population de mRNA obtenue est enri- chie en messagers codant pour une ving- taine de prot~ines ribosomiques de poids mol~culaire in, f~rieur ~ 25 000. Les RNA ont ~t~ marquis ~i,n vi,t~o par du phosphate ~P par la polynucl~otide kinase et hybri- d~s sur fi ltre au DNA de clones bac't~riens transform~s par des plasmides recombinants contenant des fragments du DNA total de la levure. Parall~lemetTt, les bac- t~ries ~taient hybrtd~es avec des mRNA poly A + totaux ~ g a l e ~ n t marquis en 5". Environ 100 colonies rnontraient une r~- ponse positive beaucoup plus forte avec la fraction des mRNA enrichis qu'avec los mRNA tGtaux. Pour analyser les s~- quences du DNA de levure contenues dans cos clones, le DNA de 40 plasmides recombinants a 6t~ isol~ et hybrid~ sdpa- r~ment en mil ieu liquide avec le mRNA poly A + total, dans des conditions ob los duplex DNA : RNA sont plus stables que les duplex DNA : DNA [19] . Des boucles R (R Loops) sont formdes pendant rhybri- dation et les molecules hybrides peuvent ~tre s~par~'es des mRNA non hybrid~s par fi l tration sur gel [20] . Los mRNA hybrid~s ont ~t~ traduits iin vi,tro et ies produits de traduction ont ~t~ caract~ris~s par ~lectrophor~se. Sur 25 plasmides analysds par cette m~thode, 5 cen tenaient une s d- quence capable de s'hybrider avec un mRNA codant pour un polypeptide qui comigre en dlectrophor~se bidimensionnelle avec une prot~ine ribosomique d~ter- mince. Les s~quences correspondant aux g~nes de structure de 4 prot~ines difi~- rentes ont ~t~ ainsi purifi~es. Suivant un protocole comparable, Bollen ~et a~l. [10] on t isol~ les g~nes de 11 prot~ines ribosomiques de Saccha~ro,myces ca,rlsberg~n,si~.

Chez la drosophile [ I I, 12], des copies compl~mentaires en DNA (c-DNA), des mRNA poly A+ enrichis en messagers de petite taitle, ont servi de sonde pour r ident i f icat ion des clones recombinants.

Chez la levure S. cerev.i~iae, Fried ~ a,I. [9] ont isol~ les g~nes de 14 r-prot~ines

en utilisant comme sonde le c-DNA pr~- pard ~ partir des messagers poly A ÷ totaux. Dans cecas , des g~nes codant pour des prot~ines de plus grande taille ont pu ~tre isol~s.

Chez des organismes comme la souris ou le x~nope, la complexit~ du g~nome rend diff ici le la s~lection directe des clones recombinants et une m~thode dif- f~rente a ~t6 utilis~e, Des fractions de mRNA polyad~n)rl~ contenant 10 ~ 20 p. cent de messagers des r-prot~ines ont ~t~ pr~par~es. Les c-DNA correspondants ont 6t6 ins~r~s dans le plasmide p BR 322. Les clones recombinants portant des s~- quences capables de s'hybrider avec los mRNA de prot~ines ribosomiques ont ~t~ identifies par la m~thode d'hybridation- traduction d~crite plus haut. Neuf clones contenant des c-DNA correspondant aux prot~ines S16, L32/33, LT, L30, L19, L13 et L18 de la souris ont ainsi ~t~ isol~s [14] . Chez le x~nope, six clones de ce type ont pu ~tre obtenus [13] . Les fragments c[e c-DNA ont 6t~ s~quenc6s , ils ne contiennent qu'une partie de la s~- quence codante des prot~ines correspondantes [21]. Ces fragments ont ~t~ utili- s6s ult~rieurement pour identifier les g~nes des r-prot~ines correspondantes dans une librairie de DNA g~nomique total de x~nope construite dans le charon 4 [22] .

Ces m~thodes utilis~es pour le clonage des r-prot~ines peuvent ~tre appliqu~es de fagon plus g~n~rale ~ r identif ication de s~quences auxquelles correspondent des mRNA moyennement ou m~me peu abondants. Elles n~cessitent seulement de disposer d" un moyen permettant d'identifier, apr~s la traduction i,n vitro, la prot~ine correspondant au g~ne recherche. Cette identification peut ~tre con- duite par ~lectrophor~se, comme cela a ~t~ fait pour les r,prot~ines, mais ~galement par immunopr~cipitation.

Chez la levure, des m~thodes de s~lection i~n vi,vo ont ~galement ~t~ utilis~es, pour isol~r les g~nes de plusieurs pro- t~ines ribosomiques. Chez cot organisme, des mutants r~sist~nt ~ des inhibiteurs de la traduction (cycloheximide, trfcho- dermine, cryptopleurine...) sont connus [23] , mais le plus souvent, les prot~ines ribosomiques cod~es par les g~nes correspondants n'ont pas pu ~tre identifi~es. Seule une mutation du g~ne cyh2 conf,-

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rant la r~sistance ~ la cyclohex,imide con- duit ~ une altdration de la mobiiitd ~lectrophor~tique de la prot~ine L29 [24]. Le clonage des g~nes, dor~t 'les mutations confdrent la r~sistance ~ la trichodermine ou ~ la cryptopleurine a permis d'identifier les r-protdines correspondant ~ ces g~nes. De m~me, le clonage du g~ne cyh2 a con- firm~ que ce gdne est le gbne de structure de la prot~ine L29.

Fried et Warner [2§] ont transform~ des cellules de levure sensibles ~ la trichodermine par des plasm~des recombinants con.tenant une collection de fragments de DNA total d'une souche r~sis- tante portant la mutation tom1. Certaines cellules transform~es montraient un niveau de r~sistance ~ la trichodermine sup~rieur ~ celui des cellules non trans- form6es. Le plasmide recombinant a ~t~ isol~ de I'une de ces souches et hybrid~ avec le mRNA poly A ÷ total. La traduction i~n vi¢ro du mRNA hybrid~ a montr~ que le fragment insdr~ dans ce plasmide porte la s~quence codant pour la prot~ine L3.

La m~me m~thodologie s'est r~vdlde infructueuse pour cloner le g~ne cyh2 de r~sistance ~ la cycloheximide, ou le g~ne cry1 de r~sistance ~ la cryptopleurine. Ces deux g~nes ont ~t~ cependant isot~s indirectement par s~lection iin vivo. Les analyses g~ndtiques avaient en effet montr~ que le g~ne cyh2 est ~li~ ~ la mutation thermosensible tsm 437 et le g~ne dry1 proche du locus du type sexuel (locus MA T). Des fragments de DNA g~nomique portont chacun de ces loci ont ~td identi- fids par s~lection i~n vivo. Ces fragments ont ~t~ utilis~s pour identifier de proche en proche les s~quences g~n'omiques ad]acentes permettant d'~soler le g~ne cyh2 Ioc,alisd ~ environ 8Kb du locus tsm 437 [25] et le g~ne cry1 Iocalis~ 21Kb du locus MAT [2~]. L'analyse par hybridation-traduction des mRNA a montr~ que le gbne cyh2 code pour la protdine L29 et le g~ne dry1 pour une pro t~ine de la sous-unit~ 40S (rp 59). Ces m~thodes de sdlection i,n vivo ne peuvent ~tre util i- s~es que chez des organismes oD des gbnes ctes r-prot~ines ont pu ~tre iden.ti- fi~s au pr~alable par des mutations con- f~rant un ph~notype permettant une sdlection ; elles impliquent d'autre part que l'on dispose chez ces organismes d'un syst~me de transformation et d'un vecteur

replication autonome.

Organisation des g~nes des ((prot6ine))

Des ~tudes g~ndtiques classiques r~ali- s~es en particulier chez /e champignon Podo,spora a~n~seri~na,, ~ partir de mutants de pro t~ines ribosomiques ou par hybridation intersp6ciftque, avaient montr~ que les g~nes des r-prot~ines sont disperses sur le g6nome [28, 29]. L'isolement chez la levure, d'un nombre important de gbnes de ces r-prot~ines, a permis de confirmer cette dispersion. Les s~quences clon~es d'une taille de 2 ~ 14 Kb ne contiennent g~n~ralement qu'un seul g~ne de prot~ine ribosomique, bien qu'i ls puissent porter des s~quences codant pour d'autres pro- t~ines. Dans un seul cas, chez S. cerevi- si'ae et S. ca¢l',sbergensi,s, un fragment de 2 Kb contie'nt les g~nes de deux prot6ines, I'une de la sGus-unit~ 60S, I'autre de la so us-unit~ 40S [9, I0]. Cette dispersion implique que la transcription des g~nes des r-protdines est monocistronique.

Chez les esp~ces ob elles ont ~t~ iso- Ides, les s6quences codant pour les dif- f~rentes protdines ribosomiques ont ~'t~ utilis~es comme sonde pour analyser les fragments de DNA total dig~r~ par des enzymes de restriction, aprds s~paration de ces fragments par ~lectrophordse et transfert sur nitrocellulose, selon la md- thode d~crite par Southern [30]. Chez la levure, six gbnes hybrident avec un seul fragment de restriction, montrant que les s~quences correspondantes sont uniques da~s le g~nome. Douze g~nes orlt des s6quences homologues sur deux ou trois fragments diff~rents, indiquar~t que ces g~nes sont prdser~ts ren piusieurs exem- plaires [8, g, I0, 25, 26]. Chez la drosophile, une s6quence un, ique existe pour les deux g~nes isolds [11, 12]. Chez le x~nope, deux ~ cinq copies par g~nome haploTde ont ~t~ identifi~es pour les six g~nes dont des sdquences ont dt~ clon~es [ 13]. Cette rdit~ration para]t augmen,ter avec la complexit~ phylogdnique, puisque, chez la souris, Monk ~t a~l ~. [31] ont trou- v~ que, seton les g~nes, ia muttipficitd du nombre de copies varie de 7 ~ 20. Dans ce cas, ies g~nes homologues sont disperses dans le g~nome et les g~nes d'une m~me famille peuvent ~tre locaiis~s sur diffdrents chromosomes [32].

II n'est pas encore clairernent ~tabli, si les dfff~rentes copies d'un m~me g~ne sont fonctionnelles. Si toutes ces s~que~- ces son,t exprim~es, i l faut supposer I" exis-

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tence de m~canismes de r~gulation assu- rant une compensation de cette multipli- cit~ in,gale des g~nes des diff~rentes r- pro t~ines. Cependant, it est n~cessaire d'envisager que, pour certains g~n'es au moins, m~me chez ]es mammifdres ob le niveau de r~it~ration est tr~s important, une seule copie est exprim~e- En effet, des mutants des prot~ines ribosomiques ont ~td analysds et I'anal~se ~lectrophord- tique a montr~ I'existence dans la souche mutante d'une seule forme ~lectrophor~- tique de la protdine concern~e et d'une seule poputation de mRNA [33].

Diffdrentes approches m~thodologiques orrt permis d'~tablir que la plupart des g~nes des r-prot~ines isol~s chez la levure contie~nen,t un intron, qui est Ioca- lis~ pros de I'extr~mit~ 5" du mRNA [34, 35, 36]. Le premier exon ne contient que quelques codons de I'e~tr~mitd N-termi- nale de la protd~ne. Les sdquences utili- s~es pour I'dpissage correspondent aux s~quences consensus ddfinies pour les autres organismes. L" existence de cet intron dans les g~nes des prot~ines ribosomiques est surprenante. Chez la lev, ure, en effet, bien qu'u~ grand nombre de g~nes nucf~aires aient ~t~ anatys~s, la presence d'un .intron a seulement dtd mise en ~vidence dans /e g~ne de I'actine [31, 38]. II est int~ressan't de ~oter que #es pr~curseurs non matures des mRNA de certaines r-prot~ines [9, 34, 3g] s'accu- mulent ~ la tempdrature non permissive dans les souches portant des mutations des gdnes ma, mutants thermosensibles pour ta sy~th~se des ribosomes [40, 23]. Ces mutations ma bloquent, dans les m~mes conditions, l 'dllmination de Fin- tron du gdne de I'actine [41]. Ces g~nes rna pourraient donc coder pour des ~l~- ments indispensables ~ l'dpissage des pr~messagers.

Chez ia souris, les pr~curseurs nucl~aires des mRNA des r-protdines ont une taille 3 ~ 7 lois s~p~rieure ~ celle des messagers mzttures [14], indiquant ta presence d'in~,rons nombreux ou de tail- ie importante dans les g~nes correspondants. L'existence de plusieurs introns a ~t~ ddmonCr&e pour les g~nes des pro- t~ines L 1 et L4 de X. ~l~a,m/is. Le g~ne de la protdine L 1 s'dtend sur une rdgion d'envi- ton 5,5 Kb ; ,il contient 9 introns de 80 200 paires de bases, la tail le de la sdquence codante (1500 paires de bases) correspond seulement ~ environ 1 /3 du g~ne [22].

Ezpression des g6nes des prot6ines ribosomiques

Chez les eucaryotes, i l existe, comme chez /es bact~ries, une coord, ination de la synth~se des diff~rents composants ribosomiques. En particulier, la plupart des r-prot~ines sant synth~tis~es en quantitd ~quimolaire [ 18, 42]. Cette synth~se coordonn~e semble r~sulter, en premier lieu, d" une coordination de la transcription des g~nes correspondants. Une analyse d6tail- /de du m~tabolisme des mRNA des r-pro- t~ines, entreprise chez la levure par Kim et Warner [39], a mon trd que les mRNA de quatre prot~ines son t presents en quan- tit6 ~quimolaire, m~me si le nombre de copies des diff~rents g~nes n'est pas identique. Par ailleurs, le taux de transcription des gdnes des r-prot~ines varie de fagon coordonn~e Iors de changements de conditiotTs qui affectent ta croissance cellulaire et le taux de synth~se de ces prot~ines [43, 44]. Une tefle coordination au niveau de la transcription a ~galement ~t~ raise en ~vidence au cours du d~ve- Ioppement embryonnaire du xdnope, o~ une stimulation synchrone de la synth~se des mRNA de diff~rentes prot~ines ribosomiques est observ~e au stade gastrula [45]. Par contre, dans les cellules de mammif~res, la concentration de d i f f , - rents mRNA pourrait ~tre in,gale [14].

Cependant, certains r~sultats indiquent clairement qu'H existe dgalement une rdgulation post-transcriptionnelle. Ainsi, des ceflules de levure ont ~td transfor- mc~es par un plasmide ~ replication autonome portant le gdne de ia prot~ine L3. Dans les cellules transform~es, le nombre de copies de ce g~ne par cellule est d'environ 7. La syn.th~se des mRNA correspondants cro~t dans les m~mes propor- tions. Cependat~t, la synth~se de la pro- t~ine concern~e n'est pas signfficative- ment supdrieure ~ celle observde clans des cellules ne renfermant qu'une seule copie ,de ce gdne. La synth~se ~quimolaire de L3 par rapport aux autres protdines rdsuiterait d'une diminution de l 'efficacitd de la traduction des mRNA correspondants et, corrdlativement, une r~duction de leur temps de 1/2 vie [46]. II faut noter que, chez la levure, dans les conditions normales de croissance, les mRNA des protdines ribosomiques son t traduits avec une efficacitd de seulement 25 p, cent de teur utilisation maximale [39] ce qui pourrait tndiquer, par compa-

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raison aux rdsultats observes chez E. col'i [ 41 ] , qu'une rdgulation pourrait intervenir au niveau de leur trad'uction.

Une r6gulation de la traduction des mRNA des r-prot~ines est dgalement sug- gdr~e par les r~sultats obtenus au cours d,u d~veloppement embryonnaire chez X. I!eavi's. La synth~se des r-prot~ines da~s los embryons est d~cal~e de 24 heures par rapport ~ ta synth~se des mRNA ; par ailleurs, la synthdse des dfff~rentes pro- t~ines n'est pRs synchrone [45 ] . De m~me, iors de la reprise de la croi~ssance de fibroblastes en culture, la synth~,se des r-prot~ines est fortement stimul~e, sans qu' i l y air augmentation de la s)~nthdse des mRNA. Les messagers des pro t~ines ribosomiques seraier~t traduits 4 ~ 5 fois plus efficacement dans los cellules en croissance que dans les cellules au repos [48 ] .

Les mdcanismes impl~iuds dans ces r~gulations tcanscript~onnet/es et post- transcriptionnelles sont encore inconnus. Chez E. ,coal!i,, un module de r~gulation autog~ne a dt~ proposd pour expliquer la synth~se coordonnde des r,prc~t~ines [49, 5] . Dans ce module, certai~es protdines agiraient comme un rdpresseu[ de la traduction de /eur messager et, par conse- quent, des dfffdr, entes prGt~ines faisant partie du m~me op~ron. Dans /es conditions ob ia concentration des RNA ribosomiques devient #mitante, ces prot~ines rdpresseurs ne pouvant plus se lier aux rRNA, r~primeraient t ' initi~tion de la traduction en se fixa~t sur leur messager, en un site sp~cifique ayant de grandes analogies structu~ales avec leur site de fixation sur les rRNA. Ce mdcanisme assure un co~p~age ef~icace de ,la bio- synth~se de diff~rentes prot~ines ribosomiques, mais ~ga/ement une coor<$i~ation entre le taux de synth~se des rRNA et des r-prot~ines.

Un tel couplage existe ~galemen~ chez les eucaryotes, f/ a ~td bien 6tudi~ chez ia levure dans diff~rentes conditions de croissance [23 ] . Ce coup/age est beauco,up moi, ns net dans les ce,l'lu~es de mammif~res oD, par exemple, une inhi- bi t ion de la ~transcripti~n des ~-DNA ne s'accompagne pas d'une ctiminution de la synth~se des pr,ot~ines ribosomiques [50, 42] . Cependant, Iors de la reprise de la croissance de fibroblas~es en culture, i l y a un paralldtisme 6troit entre une aug-

mentation de la synth~se des rRNA et de la traduction des messagers des r-pro- t~ines [48] .

Des s~quences communes aux mRNA de plusieurs prot6ines ribosomiques dif- f~rentes ont ~t~ raises en dvidence chez le x~nope [22] et la drosophile [61] . De plus, des fragments de la s~quence du rDNA sorr~ presents chez la drosophile au voisinage c['un g~ne codant pour une pro- t~ine ribosomique [62] . De te//es s~quences rdp~t~es pourraient ~ventue#ement jouer un r61e clans la coordina#on de rex- pression de ces diff~rents gdnes.

Los moddles que ron pourralt proposer pour explique{, chez les eucaryotes, ces diff~rents niveaux de coord, ination, doivent prendre en compte le fait que, chez cos organismes, traduction et trans- criptio'n ne sont ni temporel!ement, ni spatialement coupl~es, comme c'est le cas chez /es bact~ries. Par ailleurs, la transcription eP la traduction des g~nes des r-prot~ines sont monocistroniques et /'expression de chaque g~ne doit donc ~tre contr61~e individuellement.

Jo'~l BEGUERET, I,aboratoi~re ~e G,~r~(~tique,

U,r~ivers, i~t~ de Bord~a,ux II, Avenue d~s Facurl~td~s,

33405 T~l~nce - Ced~x.

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Enseignements de statistique en m6decine,

en 6pid6miologie et en biologie

L'U.E.R. M~dicale de Kremlin-Bic~tre de I'Universit~ de Paris-Sud et le Centre d'Enseignement de la Statistique appliqude ~ la Mddecine et ~) la Biotogie (C.E.S.A.M.) de I ' lnstitut de Statistique de I'Universitd Pierre et Marie Curie organisent chaque annde divers enseignements de s~tisEque dest}nds aux cher- cheurs, aux techniciens et aux ~tudiants en m~decine, pharmacie et biologie, sous la direction du Professeur Daniel Schwartz. Ces enseignements peuvent ~tre suivis sur place ~ Paris ou par corres- pondance. IIs ne requi~rent aucune con- naissance math~matique prdatable. Its comprennent un enseignement de mdtho- dologie statistique (premier semestre) suivi de I'une ou I'autre de trois options : statistique appliqude ~ la recherche c/i- nique, statistique appliqu~e ~) l'~pid~miologie et statistique appliqude ~ la biologie (second semestre ).

e~og,ra,mme

M~thod'(~l~g=ie statistiCllue : Ces enseignements sont organis~s par le Pr D. Schwartz et par /e Pr J. Le//ouch. /Is com- mencent en octobre. Iis permettent d" abor- de r /es aspects m~thodologiques soit de facon pratique ( CESAM), soit ~) un niveau plus th~orique (Ma~trise de bio/ogie hu- maine).

S~a~tisCique ap1~l~iq~e ~ ~la reche rche Ct;i~iqrL~e : Cet enseignement est organis~ par le Pr. R, Flamant. I! vise #} donner les connaissances de base et s'adresse par-

1983, 65, n ° 7.

clonage, organisation et expression des gènes des protéines ribosomiques des eucaryotes

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