cinÉtique enzymatique - esi

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BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 1/15 Revue et prolongement du modèle michaelien Modèle cinétique à un substrat : - où E, S, ES et P symbolisent l'enzyme, le substrat, le complexe enzyme- substrat, et les produits respectivement. Selon ce modèle, lorsque la concentration de substrat devient suffisamment importante afin de capter tout enzyme sous forme ES, la deuxième étape de la réaction est limitante et la réaction globale devient insensible aux augmentations supplémentaires en concentration de substrat. - Dans une réaction enzymatique, le taux de catalyse (v) est dépendent de la concentration du produit final par unité de temps. - La vitesse de la réaction est donc représentée par : - La vitesse de production de ES est la différence entre les vitesses des deux réactions élémentaires décrivant la formation de ES et sa disparition: - Cette équation différentielle ne peut pas être intégrée de façon explicite pour tous les cas sans des approximations qui la simplifient. k1 k2 E + S ES E + P k-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Saturation [S] vitesse ] ES [ k = t d ] S [ d - = t d ] P [ d = v 2 ] ES [ k - ] ES [ k - ] S [ ] E [ k = t d ] ES [ d 2 1 - 1

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Page 1: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 1/15

Revue et prolongement du modèle michaelien

Modèle cinétique à un substrat :

- où E, S, ES et P symbolisent l'enzyme, le substrat, le complexe enzyme-

substrat, et les produits respectivement.

Selon ce modèle, lorsque la concentration de substrat devient suffisamment

importante afin de capter tout enzyme sous forme ES, la deuxième étape de la

réaction est limitante et la réaction globale devient insensible aux augmentations

supplémentaires en concentration de substrat.

- Dans une réaction enzymatique, le taux de catalyse (v) est dépendent de la

concentration du produit final par unité de temps.

- La vitesse de la réaction est donc représentée par :

- La vitesse de production de ES est la différence entre les vitesses des deux

réactions élémentaires décrivant la formation de ES et sa disparition:

- Cette équation différentielle ne peut pas être intégrée de façon explicite pour

tous les cas sans des approximations qui la simplifient.

k1 k2

E + S ⇌ ES E + P

k-1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Saturation

[S]

vit

esse

] ES [ k = t d

] S[ d - =

t d

] P [ d = v 2

] ES [ k -] ES [ k -] S[] E [ k = t d

] ES [ d 21-1

Page 2: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 2/15

1. Équilibre rapide

En 1913, Léonure Michaelis et Maud Menten ont assumé que k-1 >> k2 pour

que la première étape de la réaction soit toujours en équilibre. Donc Ks = k-1 /

k1 = [E][S] / [ES] qui est la constante dissociation du substrat de l'enzyme.

Le complexe non-covalent ES entre enzyme et substrat est connu par le nom

de complexe Michaelis.

2. État stationnaire

La concentration d'ES est relativement constante pendant la réaction si [S] >>

[E]. Donc, la vitesse de production de ES doit être égale à sa disparition pour

la plupart de la réaction. Par conséquent, si [ES] est relativement constant,

d[ES]/dt = 0. Désignation comme sous forme d'approximation de l'état

stationnaire proposé d'abord par Briggs et Haldane en 1925.

Points à noter dans des approximations Michaelis-Menten et Briggs-Haldane

1) La formation du produit est proportionnelle à la concentration du complexe

enzyme-substrat (ES)

2) Décomposition du complexe central représente l'étape limitante

3) Condition de mesure de vitesse doit minimiser la réaction du retour

E + P EP ES

4) Imposition de la notion de la vitesse initiale; autrement la solution est difficile

à aborder.

Traitement Briggs-Haldane; état stationnaire

L'approximation de l'équilibre rapide n’est pas appropriée dans les systèmes

biochimiques, et ce, pour plusieurs raisons :

1) Les intermédiaires enzymatiques sont chimiquement plus réactifs par rapport

à la notion de décomposition du ES lente vers le produit.

2) Le temps disponible pour une réaction d'atteindre son équilibre dans les étapes

précédentes de l'étape limitante est très souvent insuffisant; donc, pas

d'équilibre véritable entre des complexes intermédiaires.

3) Les systèmes biochimiques représentent fréquemment des séquences de

réactions consécutives où le produit devient le substrat de la réaction subsé-

quente, pas d'équilibre véritable possible.

Page 3: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 3/15

L’approximation simplifiée permet la dérivation mathématique d’une relation

explicite entre la vitesse d’une réaction catalysée enzymatiquement (v) et la

concentration du substrat (S); cette relation est connue sous le nom de Michaelis-

Menten.

où 1

212max ][

k

kkKetEkV MT

Donc kcat = Vmax / [E]T

Les paramètres VMAX et KM permettent de cerner trois aspects de la

catalyse :

1) Caractérisation de la spécificité enzymatique.

2) Type de mécanisme : « état stationnaire » ou « équilibre rapide ».

3) Rôle métabolique de l'enzyme.

][

][max

SK

SVv

M

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[S]

Vit

es

se

KM

Courbe hyperbolique

Vmax

Vmax/2

Équation Michaelis-Menten Représentation graphique

Page 4: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 4/15

] S[] E [ K

k v

M

cat

1) Spécificité

Si la vitesse enzymatique est décrite par :

alors quand Km >> [S], [E]T [E]; donc

où kcat / Km représentent une constante apparente de deuxième ordre qui décrit la

réaction entre un enzyme libre et un substrat libre - spécificité.

- s’il y a deux substrats, S1 et S2, qui sont utilisés par le même enzyme.

- donc au même [S],

- Ce rapport de vitesses peut être utilisé afin d’évaluer la spécificité de l'enzyme

Exemple : fumarate hydratase

Substrat kcat/Km (M-1 s-1)

fumarate 1.6 x 108

fluorofumarate 9.8 x 107

chlorofumarate 2.0 x 105

bromofumarate 2.5 x 104

- L’enzyme est hautement spécifique pour le fumarate et le dérivé fluoro.

] S [] E [ )K

k( v ] S [] E [ )

K

k( v 2S

M

cat

S1SM

cat

S 2211

2

1

2

1

SM

cat

SM

cat

S

S

K

k

K

k

v

v

][

][][

SK

SEkv

M

Tcat

Page 5: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 5/15

2) Type de mécanisme

Si k2 > k-1 (forme extrême de l’« état stationnaire »)

Km = k2/k1 et puisque kcat = k2

kcat/Km = k1 qui est la constante de vitesse d'association entre enzyme et

substrat

L’association entre enzyme et substrat est limitée par diffusion, donc k1 ne

peut pas dépasser la valeur de la constante de diffusion du substrat ~ 109 M-1 s-1.

si kcat/Km sont de cet ordre de valeur, le mécanisme « état stationnaire » est

applicable.

Enzyme kcat/Km (M-1s-1)

fumarate hydratase 1.6 X 108

catalase 4 x 107

triosephosphate isomérase 2.4 x 108

si kcat/Km est plus petit, le mécanisme de type "équilibre rapide" s’applique.

3) Rôle métabolique

Le rôle de l'enzyme dans le métabolisme peut être évalué en comparaison avec

son KM et la concentration in vivo du substrat;

o Par exemple, l'isozyme IV de la glucokinase provenant du foie possède un KM

à 10mM tandis que les isozymes I - III (qui se retrouvent partout dans le

corps) ont tous des KM ~ 40 µM.

o Chez un individu à jeun, les niveaux de glucose sanguins sont ~ 5mM.

A cette concentration, les isozymes I-III fonctionnent "à planche"

tandis que l’isozyme IV est seulement ~25% activé. Après un repas

d’hydrates de carbone, la concentration de glucose sanguin monte à

10mM et isozyme IV fonctionnera à Vmax/2

o à cause du Km élevé de l'isozyme IV, le foie est capable de gérer le glucose

supplémentaire en glucose-6-P

o cette réaction représente la première étape de glycolyse.

Page 6: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 6/15

] ES [ ) k - ] P [ k+] S[ k

) k + k (] S[ k ( = v 1-

2-1

21-1

Prolongement du modèle

i) réaction réversible

La condition de conservation de masse pour la réaction avec une intermédiaire

est [E]T = [E] + [ES] et en utilisant la condition du régime stationnaire de

qui simplifie à

En faisant la substitution pour [E]= [E]T - [ES]

]ES [ 1) + ] P [ k+] S[ k

k + k( = ] E [

2-1

21-

T

La vitesse de la réaction s’exprime par

] ES [ k -] S[] E [ k = t d

] S[ d - = v 1-1

qui se simplifie en utilisant l’expression pour [E]

et en combinant avec la relation entre [E]T et [ES] on obtient

] E [ ) ] P [ k+] S[ k + k + k

] P [ k k -] S[ k k ( = v

T

2-121-

2-1-21

E + S ⇌ ES|EP ⇌ E + P

k1

k-1 k-2

k2

0 =] ES [ k -] ES [ k -] P [] E [ k +] S[] E [ k = t d

] ES [ d 21-2-1

] ES [ )] P [ k+] S[ k

k + k( =] E [

2-1

21-

Page 7: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 7/15

] E [ )

] P [ k + k

k+] S[

k + k

k + 1

] P [ k + k

k k -] S[

k + k

k k

( = v T

21-

2-

21-

1

21-

2-1-

21-

12

La division par (k-1 + k2) dans le numérateur et dénominateur donne ensuite

Si on définit les termes suivants :

V fmax = k2[E]T ; V rmax = k-1[E]T ;

K SM = (k-1 + k2) / k1 ; K PM = (k-1 + k2) / k-2

on obtient la relation de Michaelis-Menten pour une réaction réversible avec un

intermédiaire

Par exemple, lorsque [P] = 0, v = v0, la vitesse initiale, et l’équation devient

identique à celle de Michaelis-Menten.

Relation Haldane

À l’équilibre, v = 0, et la relation ci-haut peut être résolu et donne

o par cette relation on démontre que les paramètres cinétiques d’une réaction

réversible catalysée de façon enzymatique ne sont pas indépendants l’un

de l’autre,

o les paramètres cinétiques sont en effet reliés à travers la constante

d’équilibre de la réaction globale qui est indépendante de la présence de

l’enzyme

K

] P [ +

K

] S[ + 1

] P [ K

V -] S[

K

V

= v

PM

SM

PM

r

SM

fMAXMAX

K V

K V =

] S[

] P [ = K S

Mr

PM

f

eq

MAX

MAX

Page 8: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 8/15

ii) Plus qu'un intermédiaire

où ES‡ représente un intermédiaire activé

En appliquant les équations « état stationnaire », on obtient la même forme

d'équation que celle de M-M réversible sauf que l'interprétation des Vmax et Km pour

les réactions en avant et de retour seront plus compliquées puisqu’ils représentent

des fonctions de six paramètres cinétiques k1, k2, k3, k-1, k-2, et k-3.

- ceci est également juste s’il s’agit de trois ou plus intermédiaires

Il n’est pas possible de caractériser une réaction de plus qu’un seul

intermédiaire à partir des quatre paramètres cinétiques : V fmax , V r

max , KSM , et

KPM,

Les mesures cinétiques faites en régime stationnaire fournissent une

description phénoménologique du comportement de l’enzyme et laissent la nature

des intermédiaires indéterminée. Les intermédiaires doivent être caractérisés par

d’autres moyens, par exemple la spectroscopie.

Une analyse en régime stationnaire ne peut pas démontrer de façon non

équivoque le mécanisme d’une réaction. Cependant si les paramètres

cinétiques ne sont pas cohérents avec un mécanisme, ce mécanisme doit être

rejeté.

iii) Inhibition par substrat

- Décroissance de la vitesse v à hautes concentrations de substrats.

Dans la représentation double réciproque, ceci signifie une courbure croissante à la

valeur 1/[S] faible.

o Une explication possible est la liaison avec un 2e site de substrat de faible

affinité qui inhibe l'activité

k-1 k-2

E + S ⇌ ES ⇌ ES‡ ⇌ E + P k1 k2

k-3

k3

Page 9: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

Inhibition par excès de substrat

• Cas particulier de l’inhibition incompétitive : 2 molécules de S peuvent se lier à E, mais ne

peuvent être transformées en P (autorégulation de l’activité enzymatique).

Exemple de l’excès d’acétylcholine vs acétylcholinestérase :

Site allostérique

Site actif

PDB 2HA4

E + S ES E + P

+

S

ESS

kcat

KS

KI

inactif

Bourne et al., J. Biol. Chem. 2006, 281, 29256

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 9/15

Page 10: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

Inhibition par excès de substrat (suite)

[ES]

[E][S]m K

[ESS]

[ES][S]i K

Vo = kcat[ES]

[E]T = [E] + [ES] + [ESS] i

2

m

max

[S][S]

[S]VVo

KK

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 10/15

Page 11: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 11/15

Effet du pH sur les réactions enzymatiques

Le changement de pH peut avoir plusieurs effets directs sur des réactions

catalysées de façon enzymatique :

1) inactivation de l'enzyme

2) changement dans l'état d'ionisation du substrat

3) changement dans l'équilibre d'une réaction

o par exemple :

Créatine + MgATP2- ⇌ Phosphocréatine + MgADP2-+ H+

L’augmentation du pH favorise la synthèse de phosphocréatine.

a) Dérivation du profil pH

L’effet indirect est celui du changement de l'état d'ionisation des chaînes

latérales des acides aminés, et qui sont essentiels pour l'expression de l'activité

catalytique. L'effet du pH sur la vitesse d'un enzyme peut être complexe puisque

Vmax et Km sont à la fois perturbés.

Considérant le cas où il y aurait deux chaînes latérales dont l'état d'ionisation

influence la liaison du substrat et possiblement deux autres dont l'état d'ionisation

modifie l'activité de l'enzyme

La compréhension réside dans le fait que la protonation et la déprotonation

soient parmi les réactions les plus rapides et par conséquent, ils sont toujours en

équilibre rapide avec l’enzyme. On peut donc résumer la répartition des

intermédiaires enzymatiques en fonction des constantes d’équilibres.

Par exemple, dans la réaction avec l’enzyme libre ci-haut pour les étapes:

EH + H+ ⇌ EH2+ et E- + H+ ⇌ EH

EH + S ESH +E P

E-

ES-

EH2+

ESH2+

k2k1

k-1

KE2

KE1

KES2

KES1

Page 12: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 12/15

Les constantes d’équilibre (dissociation) sont définies par KE1 =

[H+][EH]/[EH2+] et KE2 = [H+][E-]/[EH] (une pareille relation définie les autres

constantes d’équilibres - KES1, KES2).

La condition de conservation de l’enzyme exige, où [E]T représente la

concentration de l’enzyme totale, que :

[E]T = [ESH]T + [EH]T

Les deux termes [ESH]T et [EH]T peuvent être récrit en fonction des constants

d’équilibres en définissant :

[EH]T = [EH+2] + [EH] + [E-]

qui devient

de façon similaire, [ESH]T = [ESH+2] + [ESH] + [ES-] et qui devient

En utilisant la notion du régime stationnaire,

0][][]][[][

211 ESHkESHkSEHkdt

ESHd.

Cette relation est résolue dans la même façon comme le précédent et après la

même démarche qu’avant on obtient

Avec

] S[ + ) f

f ( K

] S[ ] E [ f

k

=H] S[E k = v

2

1M

T

2

2

2

f] H E [ = ) ] H [

K+1 +

K

] H[ (] H E [ = ] H E [

1+

E2

E1

+

T

f] H S[E = ) ] H [

K+1 +

K

] H[ (] H SE [ = ] H SE [

2+

ES2

ES1

+

T

Page 13: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 13/15

En définissant des valeurs apparentes de KM et Vmax par

K’M = KM (f1 / f2) et V’MAX = VMAX / f2

ceci définit alors une relation Michaelis-Menten modifiée pour les effets de pH

Cette relation nous informe que :

1. Le changement en V’MAX reflète l'état d'ionisation d'enzyme-substrat f2.

2. Le changement en V’MAX / K’M reflète l'état d'ionisation de l'enzyme libre

f1.

3. Le changement en K’M reflète l'état d'ionisation de l'enzyme libre et son

complexe enzyme-substrat f1/f2.

La vitesse initiale de beaucoup

d'enzymes démontre en fonction du pH un

profil ressemblant à une cloche prédit par

une telle relation

- par exemple : la cinétique

d’aldolase de muscle de lapin

Il n’est pas toujours possible

d’observer tout le profil de pH, de façon

expérimentale, dus aux constantes

d’ionisation qui sont soit trop acides ou

basiques

voir comportement du mutant

Glu187Gln de l’aldolase de lapin.

Mutant

Native

ESH2+ ES-

] S[ + ’K

] S[ ’V= v

M

0MAX

Page 14: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 14/15

Rappel : Seulement EH et ESH contribuent à la valeur catalytique et

l’échange des protons est implicite dans le régime de l’équilibre rapide.

• Ceci est raisonnable puisque la constante de deuxième ordre pour l’échange

d'un proton est rapide ~ 109 M-1 s-1.

• L'échange rapide des populations fait en sorte que les espèces EH et ESH,

possédant de la compétence catalytique, sont réduites par des facteurs f1 et f2.

L'analyse des pKa

L’étude des profils de pH de l’enzyme consiste à analyser les paramètres

cinétiques, V’max et K’M, déterminés à des pH différents, en fonction des constantes

d'ionisation, KE1, KE2, KES1, et KES2.

• La variation de V’MAX en pH, décrite par la fonction f2, dépend uniquement

des valeurs de KES1 et KES2.

• La variation du rapport V’max/K’M en pH, décrite par la fonction f1, informe

uniquement sur les valeurs de KE1 et KE2.

• La détermination mathématique des valeurs KEi et KESi est faite par des

méthodes d’estimation non-linéaire disponibles sous forme logicielle.

Cependant, à partir d’inspection visuelle des graphiques, soit V’MAX vs pH ou

V’max/K’M vs pH, il est possible d’obtenir des estimations approximatives.

Les pKa (log KEi ou log KESi) fournissent des indices importants sur l'identité

des acides aminés au site actif.

Rappel : pKE1 = - logKE1, pKE2 = - logKE2, pKES1 = - logKES1, et pKES2 = - logKES2

Alors,

1. Les pKEi informent sur l’identité des acides aminés impliqués dans

l’interaction de l’enzyme avec le substrat

2. Les pKESi informent sur l’identité des acides aminés impliqués dans la

catalyse.

➢ pK ~ 4 suggère qu’un résidu Asp ou Glu soit essentiel pour l'activité de

l'enzyme.

➢ Des valeurs pK ~ 6 ou ~ 10 indiquent des résidus His ou Lys.

Page 15: CINÉTIQUE ENZYMATIQUE - ESI

BCM 2505 Cinétique enzymatique – 1 Page 15/15

Cependant, les pKa des acides aminés peuvent être modifiés au sein du site actif

de plusieurs façons importantes.

1. Le groupement carboxylate d'un résidu Asp en pont salin (électrostatique) avec

un groupement Lys est stabilisé par la charge positive de Lys et possède un pKa

plus bas (plus difficile à protoner).

2. Inversement un groupement aminé dans une région peu polaire est moins basique

que dans une région polaire. Dans ce cas, il s’agit du fait qu’un résidu chargé est

toujours plus difficile à stabiliser dans une région hydrophobe que sa forme

neutre correspondante.

3. Également, il existe la possibilité que deux acides aminés voisins (distance ~ 3-

4Å – pont hydrogène) possédant la même charge qui déstabilisera une des deux

charges en le rendant neutre.

Donc il faut être prudent dans l'identification des groupements essentiels pour

l'activité catalytique.

N C

O

O

H

HH

pKa

Lys Asp

NH3

pKa

NH2 Micro-environnement

hydrophobique

NH3

pKa

NH2NH3 NH3