Biologie et Physiologie Animale

Licence 3

Chapitre III

Physiologie Cellulaire et Moléculaire

Les Structures Biochimiques des Constituants de

la Membrane Plasmique

Introduction

Les membranes cellulaires sont composées d’un assemblage complexe de molécules

lipidiques et protéiques. Les glucides ne sont pas présents en tant que tels mais plutôt comme

constituants partiels de protéines (glycoprotéines) ou de lipides (glycolipides).

La plupart des membranes contiennent environ 40% de lipides et 60% de protéines (cas des

érythrocytes soit environ 75 molécules de lipides pour 1 molécule de protéines, en considérant

que le PM des protéines est 90000 et des lipides 800).

Actuellement, alors que les composants lipidiques sont bien connus, les structures protéiques

ou glycoprotéiques sont loin d’être complètement identifiées. Ce fait tient surtout aux

difficultés d’extraction des composants protéiques, en majorité insolubles dans les solvants

aqueux et souvent dénaturés pendant leur isolement.

I. Les lipides membranaires

1.1. Extraction

L’extension rapide de la chromatographie tout particulièrement la chromatographie sur

couche mince (CCM) et la chromatographie en phase gazeuse (CPG), a permis l’étude des

mélanges complexes des phopholipides membranaires.

Généralement, des mélanges du type chloroforme-méthanol permettent d’extraire

sélectivement les lipides à partir de systèmes membranaires préalablement isolés. L’extraction

doit permettre d’obtenir une fraction exempte de protéines ou de tout autre contaminant.

1.2. Les composés lipidiques des membranes

On trouve principalement des phospholipides, tels que la phosphatidylsérine (PS), la

phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), le phospahatidylglycérol (PG),

le phosphatidylinositol (PI). D’une façon générale, l’ensemble complexe des lipides les plus

fréquemment rencontrés dans les membranes biologiques, peut être résumé par les formules

simplifiées que rassemble le tableau suivant :

Radical phosphatidyl :

/\/\/\/\/\/\/\/\/\/\/\CO─O─CH2

|

/\/\/\/\/\/\/\/\/\/\/\CO─O─CH O

| |

CH2─O─P─O─X

| | O

Dérivés du radical phosphatidyl :

(où X correspond à un des groupes de la colonne de gauche)

X Nom .

H Acides phosphatidiques

─CH2─CH2─NH2 Phosphatidyléthanolamine (PE) : Céphalines

─CH2─CH2─N+ ─[CH3] 3 Phosphatidylcholine (PC) : Lécithines

─CH2─CH─COOH Phosphatidylsérines (PS)

| NH2

─CH2─COOH─CH2OH Phosphatidylglycérol (PG)

Phosphatidylinositol (PI)

.

1.2.1. Les phosphatidylcholines

La classe des phosphatidylcholines joue un rôle de premier plan, quantitatif et

qualitatif parmi les lipides complexes de la membrane. Les anciennes lécithines (actuelles

phosphatidylcholines) d’origine exogène, par leur caractère polyinsaturée, possèdent une

grande disponibilité pour servir de ravitailleur de phospholipides et de lipoprotéines normales

chez l’homme. De ce fait, leur intérêt en thérapeutique est considérable (présence d’une

molécule d’acide gras insaturé, e.g., l’acide oléique).

Certains auteurs pensent que les phosphatidylcholines sont plus abondants dans la couche

externe du plasmalemme et les phophatidyléthanolamines dans la couche interne. Les

premières sont neutres et les secondes chargées négativement, ce qui revêt une grande

importance fonctionnelle surtout dans les cellules et les prolongements nerveux.

L’acide phosphatidique, le phosphatidylglycérol, le cardiolipide ou la cardiolipine (CL)

(diphosphatidylglycérol) on les trouve en abondance dans les membranes bactériennes, le

cardiolipide existe aussi dans les membranes internes des mitochondries.

Cardiolipine : comporte quatre chaînes hydrophobes lui conférant une structure stable

1.2.2. Les sphingolipides

La classe des sphingolipides (sans glycérol mais avec dialcool aminé) contient un

composé très important la sphingosine (base apparentée, représente le squelette carbonée)).

Sphingosine

Ce sont d’importants constituants des membranes cellulaires, tant végétales qu’animales. On

en trouve des quantités particulièrement importantes dans le cerveau et le tissu nerveux. La

sphingosine est amidifiée par un acide gras de 18 à 26 atomes de carbone saturé ou

monoinsaturé. Le composé ainsi obtenu, ou céramide est le chef de file de tous les

sphingolipides. Il comporte deux chaînes aliphatiques à son extrémité non polaires. Différents

groupements polaires peuvent se fixer sur le groupement hydroxyl en 1 de la sphingosine

base.

1.2.2.1. Les sphingomyélines

Les sphingomyélines résultent de l’estérification du groupement 1-

hydroxyl du céramide par de la phosphoryléthanolamine ou de la phosphorylcholine. Chez les

animaux supérieurs, ce sont les sphingolipides les plus abondants.

1.2.2.2. Les glycosphingolipides neutres

Ce sont des sphingolipides comprenant à leur extrémité polaire un ou

plusieurs résidus osidiques, ils ne sont donc pas chargés. Les plus simples sont les

cérébrosides; leur groupement polaires est un ose lié par une liaison β-osidique à l’hydroxyle

libre du céramide.

Cérébroside

1.2.2.3. Les glycosphingolipides acides (gangliosides)

Ce troisième groupe de glycosphingolipides est le plus complexe: ce

sont les gangliosides. Leur extrémité osidique comprend un acide sialique qui leur donne une

charge nette négative à pH 7.0. L’acide N-acétylneuraminique est l’acide sialique habituel des

gangliosides humains.

Les gangliosides sont surtout abondants dans la matière grise du cerveau où ils représentent

6% des lipides totaux. Particulièrement abondants dans les terminaisons nerveuses, les

gangliosides ont été impliqués dans la transmission de l’influx nerveux au niveau des

synapses. Ils semblent également présents dans les sites récepteurs de l’acétylcholine et

d’autres neurotranmetteurs.

1.2.3. Le cholestérol

Le cholestérol en majeure partie hydrophobe sauf par son extrémité OH,

hydrophile. On le trouve dans les membranes plasmiques de nombreuses cellules animales. Le

cholestérol se rencontre rarement dans les végétaux supérieurs où il est remplacé par une autre

classe de stérols : les phytostérols, parmi ceux-ci, le stigmastérol et le sitostérol. Les levures

et les champignons contiennent d’autres types de stérols : les mycostérols comme l’ergostérol.

Les bactéries ne contiennent pas de stérols.

Cholestérol

1.3. Variations de la composition des phospholipides suivant le type membranaire

Le pourcentage des acides gras saturés et insaturés varie en fonction de la membrane

considérée : les acides gras saturés sont très abondants dans les membranes des gaines de

myéline alors que les acides gras insaturés sont beaucoup plus abondants dans les membranes

mitochondriales. Par conséquent, les gaines de myéline, riches en cholestérol et en acides gras

saturés à longues chaînes sont des structures très stables alors que les membranes

mitochondriales qui possèdent très peu de cholestérol et de très nombreux d’acides gras

insaturés sont plus fluides.

D’une façon générale, dans toutes les membranes, PC, SM, PE et Ch sont les lipides

principaux, représentant environ 80% des lipides totaux. En particulier, la membrane interne

de la mitochondrie contient beaucoup de protéines (70%) et est la seule à contenir le

diphosphatidylglycérol ou cardiolipine (CL). Les glycolipides sont présents uniquement dans

la membrane plasmique mais à des concentrations toujours faibles puisque inférieure à 10%

des lipides totaux. Cependant, leur rôle est important dans les phénomènes de reconnaissance

cellulaire.

1.4. Particularités de la répartition des phospholipides

La répartition des phospholipides dans les membranes est, comme pour les protéines,

asymétrique. Chaque classe d’organites, isolés par ultracentrifugation différentielle, a été

traitée par les phospholipases.

On note que les pourcentages de chaque classe sont très proches pour l’appareil de Golgi et

pour le RE. On note également la répartition presque symétrique de la phosphatidylcholine

(PC) et celle, plus asymétrique de la cardiolipine (CL) dont la valeur quantitative se substitue,

dans la mitochondrie, à celle de PS et de SM (voir, tableau ci-dessous).

Phospholipid composition (mole % of total phospholipid) of liver cell membranes

Rough Mitochondrial

Plasma Nuclear Endoplasmic Golgi Membranes

Phospholipid Membranes Membranes Membranes Membranes Inner Outer

Phosphaidylcholine 34.9 61.4 60.9 45.3 45.4 49.7

Phosphatidylethanolamine 18.5 22.7 18.6 17.0 25.3 23.2 Phosphatidylinositol 7.3 8.6 8.9 8.7 5.9 12.6

Phosphatidylserine 9.0 3.6 3.3 4.2 0.9 2.2

Phosphatidylglycerol 4.8 * * * 2.1 2.5

Phospatidic acid 4.4 1.0 1.0 * 0.7 1.3

Cardiolipin trace 0.0 * * 17.4 3.4

Sphingomyelin 17.7 3.2 3.7 12.3 2.5 5.0

* Asterisk indicates no value available

1.5. Variations de la composition des phospholipides en fonction de l’espèce

La proportion des différents lipides varie en fonction de l’espèce considérée. Ainsi les

membranes plasmiques des hématies humains sont composés d’environ 30% de

phosphatidylcholines (PC) et de 17% de sphingomyélines (SM), alors que chez le mouton ces

pourcentages sont très différents soit 8% de PC et environ 35 - 40% de SM. Ceci expliquerait

le peu de sensibilité de ces animaux aux venins de certains serpents.. Ces venins contiennent

en effet une enzyme, la phospholipase A, qui détruisant spécifiquement les PC et les

phosphatidyléthanolamines (PE), détruisent ainsi les membranes cellulaires et lysent les

cellules. Cette enzyme est par contre inactive sur les SM.

En général, les hématies représentent des taux presque constants de PE et de Cholestérol en

fonction des espèces, par contre ces taux varient en ce qui concerne les PC et les SM (voir,

figures ci-dessous).

Figure 1. Sheep Figure 2. Rat

Figure 3. Ox Figure 4. Pig

Comparative lipid compositions in erythrocyte plasma membranes for four (4) different

species. Sphingomyelin (S) and phosphatidylcholine (PC) show wide variations in their

proportions, however, their sum constitues a relatively constant proportions of the total

lipids, C, cholesterol; PE, phosphatidylcholine.

1.6. Bicouche lipidique et médicaments

De nombreux médicaments amphiphiles (e.g., anesthésiques locaux, antidépresseurs

tricycliques, phénothiazines, chlorpromazine, etc.) ont à la fois une activité spécifique sur le

récepteur précis et un effet plus général sur la structure lipidique de la membrane. L’effet de

ces produits est une fluidification de la membrane avec une expansion de 5 à 7% de sa

surface. Cet accroissement est dix fois plus important que ne le voudrait la simple interaction

de ces agents pharmacologiques dans les couches lipidiques. La modification du rapport entre

la surface de la cellule et son volume augmente sa résistance osmotique.

II. Les protéines membranaires

Longtemps moins étudiées que les lipides pour des raisons techniques. Les méthodes

physiques sont certainement d’une importance capitale dans l’étude de la structure

membranaire. Les plus importants sont représentées par les divers types de spectroscopie :

spectre de diffraction des rayons X, spectre infrarouge qui a montré la présence de structure

de type hélice α et la rareté des couches (feuillets) β, spectre de dispersion optique rotatoire et

les divers types de spectres de résonance (Résonance de Spine Electronique # ESR,

Résonance Magnétique Nucléaire # RMN).

2.1. Isolement des protéines membranaires

Pour isoler les protéines membranaires, il faut rompre leurs liens avec les lipides et

avec les autres protéines. Deux autres faits son essentiels : d’une part, beaucoup de protéines

membranaires ne sont pas solubles dans l’eau, d’autre part, elles ont tendance à former des

agrégats moléculaires complexes, surtout en présence d’ions calcium. De multiples artifices

ont été utilisés pour obtenir une solubilisation totale des protéines membranaires : l’exposition

des stromas à des milieux de force ionique soit très faible, en présence d’EDTA (Ethylen

diamin tetra acetic acid) ou d’ATP, ou très élevée, l’urée ou la guanidine à forte

concentration, les solvants organiques (butanol, pyridine, chloréthanol, hexafluoroacétone,

etc) et surtout les détergents. Le plus employé de ceux-ci est un détergent anionique, le

dodécylsulfate de sodium (SDS).

Le matériel solubilisé peut être analysé quantitativement par électrophorèse sur gel de

polyacrylamide en présence de SDS (PAGE-SDS). Donc, les protéines sont parfaitement

individualisées par électrophorèse, la nomenclature utilisée pour les désigner fait souvent

référence à leur migration dans ce système.

2.1.1. Cas des protéines de la membrane des érythrocytes humains

Les principaux composants protéiques séparés par électrophorèse-SDS sont

échelonnés dans les gels selon leur masse moléculaire

Bandes ↑ KDa

1 ▀ Spectrine α 250

2 ▀ Spectrine β 2.1 ▀

3 ▀ Bande 3 95

4.1 ▀ ▀ Glycophorine A

4.2 ▀

5 ▀ Actine 43

6 ▀ G3PDH ▀ Glycophorine B et C

7 25

Coloration au bleu de Comassie Coloration au PAS

Représentation schématique d’un tracé électrophorétique des protéines membranaires

G3PDH : glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase;

PAS : periodic acid Schiff (coloration spécifique des esters d’acide sialique)

A chaque bande correspondent une protéine largement majoritaire et plusieurs protéines

minoritaires. Ainsi à la position de la protéine Bande 3, migrent également le calcium-ATPase

et les dimères de glycophorine A. Trois protéines, les spectrines, la Bande 3 et la

glycophorine, forment l’essentiel des protéines membranaires (> 60% des protéines

membranaires.

Localisation et interactions des principales protéines membranaires

2.1.1.1. La spectrine

La spectrine, composant majeur du squelette, est une longue protéine

fibrillaire constituée de deux chaînes polypeptidiques, α et β de masse moléculaire 240 KDa

et 220 KDa, correspondant respectivement aux bandes 1 et 2 de l’électrophorèse, elles sont

deux molécules allongées de 100A° de long, enroulées l’une sur l’autre.

Avec la protéine 5, protéine extrinsèque analogue à l’actine, la spectrine se dispose en un

réseau accolé à la face interne de la membrane érythrocytaire. La spectrine joue un rôle

essentiel dans le maintien de la forme du globule rouge et dans la distribution des protéines

membranaires dont elle freine la mobilité latérale. Elle représente à elle seule 30% des

protéines membranaires, il existe environ 3.105 copies par hématie.

Spectrine

2.1.1.2. La bande 3

La bande 3 (encore appelée protéine bande 3 ou échangeur d’anions

érythrocytaire), dont la masse moléculaire est d’environ 95 KDa, est la principale protéine

intrinsèque de la membrane. Elle représente à elle seule 25% des protéines membranaires ; il

en existe environ 106 copies par hématies. Elle peut schématiquement se diviser en 3

segments :

- un segment externe, siège de l’extrémité carboxyterminale de la molécule sur peptide de 34

à 45 KDa porteur des radicaux glucosidiques responsables de l’hétérogénéité de la Bande 3 et

de deux des radicaux sulfhydriles.

- un segment médian de 17 KDa inclus dans la double couche lipidique, traversant 12 à 13

fois la bicouche. Il est, avec le segment précédent, support du canal des anions, Le transport

intéresse, avec une très forte spécificité, le chlorure et le bicarbonate.

- un segment cytoplasmique d’environ 43 KDa et siège de l’extrémité NH2-terminale de la

molécule. Il est également le siège des sites de fixation à haute affinité de protéines

cytoplasmiques ayant la propriété de se lier à la membrane tels que l’hémoglobine, l’aldolase,

la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (G3PDH) et la phosphofructokinase (PFK).

Ces sites, observés in vitro, pourraient avoir une signification physiologique dans la

régulation de la glycolyse, en aidant à la formation de complexes multi-enzymatiques. Le

segment cytoplasmique peut être facilement clivé du reste de la Bande 3 par protéolyse sans

dénaturation du segment transmembranaire et sans modification importante du transfert des

anions.

Protéine Bande 3

2.1.1.3. Les glycophorines

La glycophorine A principale glycoprotéine membranaire représente

environ 1 à 2% de la totalité des protéines membranaires. De même que la protéine 3, la

glycophorine A traverse la membrane de part en part et est divisée en 3 segments ; un segment

externe portant les radicaux oligosaccharidiques, un segment lipophile inclus dans la double

couche lipidique et un segment interne cytosolique.

Présente dans la membrane au nombre d’environ 370000 molécules, la glycophorine a une

masse moléculaire de 31 KDa et elle est formée par 131 acides aminés.

- le segment externe de la glycophorine A est formé des amino-acides 1 à 72 à partir de

l’extrémité NH2 terminale qui est exposée vers l’extérieur à l’inverse de ce qui se passe pour

la protéine 3. Sur ce segment, sont fixés les radicaux oligosaccharidiques qui forment 60% de

la masse de la molécule; cette région glycolysée porte 16 petites chaînes polysaccharidiques

dont certaines ont les motifs antigéniques des groupes sanguins et d’autres fixent

spécifiquement les lectines et le virus de l’influenza.

- Le segment intramembranaire est fortement hydrophobe. Il traverse la doble couche

lipidique sous forme d’une hélice α simple et entre en interaction avec les lipides voisins. Une

séquence de 23 résidus (73 à 95) qui ne contient que des acides aminés hydrophobes non

chargés (tels que: Phe, leu, Ile, val, thr, tyr).

- Le segment interne de la glycophorine A (résidu 96 à 131) porte le COOH-terminal et est en

interaction avec le squelette membranaire et les constituants du cytosol.

III. Les sucres membranaires

3.1. Mise en évidence in situ des polysaccharides au niveau de la

membrane plasmique

Diverses méthodes cytochimiques prouvent que les chaînes polysaccharidiques sont

essentiellement localisées du côté extracellulaire au niveau du revêtement fibreux.

Lorsque le revêtement fibreux est épais (amibe, plateau strié des entérocytes) l’oxydation par

l’acide périodique (certaines fonctions alcool des unités glucidiques sont oxydées en fonctions

aldéhyde) et la coloration par le réactif de Schiff, mettent en évidence un liséré pourpre bien

visible dans les coupes observées au microscope à lumière.

L’emploi des sels d’argent après l’oxydation périodique pratiquée sur coupes minces, montre

que les régions de la cellule qui sont riches en polysaccharides se distinguent sur les

micrographies prises au microscope électronique, par un fort contraste puisque l’argent

diffuse les électrons.

La présence de polysaccharides de surface est également, révélée par l’emploi des lectines,

protéines d’origine végétale et extraites principalement de légumineuses (haricot jacquier,

Canavalia ensiformis). Les lectines ont des sites stéréospécifiques qui leur permettent de se

lier spécifiquement à certains sucres. La plus employée est la Concanavaline A (Con. A) qui

se lie spécifiquement au glucose ou au mannose. La présence de la lectine à la surface

cellulaire, est révélée par l’utilisation des marqueurs comme la fluorescéine ou la ferritine ou

la péroxydase.

3.2. Méthodes d’extraction des sucres membranaires

Certaines des protéines membranaires sont des glycoprotéines. Quand on incube des

cellules isolées comme des érythrocytes humains dans un milieu contenant une protéase

(trypsine ou pronase) il se décroche de la surface cellulaire des glycopeptides. Parmi les unités

glucidiques de ces glycopeptides, il faut noter la présence d’acides sialiques (principalement

de l’acide N-acétyl neuraminique # NANA) dont les groupements acides sont responsables

pour la plus grande part des charges négatives de la surface. Ces charges sont mises en

évidence par l’électrophorèse des cellules elles-mêmes, placés dans un champ électrique, des

érythrocytes, des cellules normales sont entraînées vers la cathode. Si les cellules sont traitées

par la neuraminidase, enzyme qui détache spécifiquement l’acide neuraminique, des

glycoprotéines de la membrane plasmique, leur mobilité électrophorétique est très diminuée.

Ces résultats montrent donc que la membrane plasmique, est constituée de chaînes

polysaccharidiques accrochées à des polypeptides.

3.3. Glycoprotéines et glycolipides

Toutes les cellules en possèdent des sucres à la surface qu’on trouve sur les lipides

et sur les protéines, dont l’appellation est : glycolipides ou glycoprotéines. Un glycolipide ne

présente qu’une seule chaîne oligosaccharidique, par contre une glycoprotéine présente

plusieurs chaînes oligosaccharidiques variables. Dans la nature, on trouve plus de 100

molécules différentes de glucides, mais leur présence au niveau membranaire se limite à peu

près à 12 sucres dont les plus importants sont : D-glucose, D-galactose, D-mannose, L-fucose,

L-arabinose, D-xylose, N-acétyl-D-glucosamine, N-acétyl-D-galactosamine et N-acétyl-

neuraminque acid (sialic acid). Ce dernier porté exclusivement par les glycoprotéines

membranaires est responsable de l’électronégativité qui maintient les globules rouges à une

certaine distance les unes des autres (potentiel Zêta) en évitant leurs agrégations in vivo. Des

glycoprotéines et des glycolipides humains importants sont les antigènes des groupes sanguins

responsables du déclenchement d’immunoréactions dangereuses.