CEA-R 2590 - SIMON Claude • . .UNE NOUVELLE MÉTHODE D'ÉTUDE DU MÉTABOLISME DE L'IODE :LA MÉTHODE D'ÉQUILIBRE ISOTOPIQUE - ASPECTS CINÉTIQUES ET QUANTITATIFSOBTENUS CHEZ LE RAT.Sommaire : ,

La méthode d'équilibre isotopique, mise au point chez le rat, a permis de mesurer envaleur absolue les principaux paramètres du métabolisme de l'iode chez cet animal.

Les quantités ou les concentrations d'iode ont été mesurées pour la thyroïde et pourle plasma avec une sensibilité de 0,001 jig 1 S 7 I . Cette sensibilité a permis de doser des poolsaussi petits que Piodure et les iodotyrosines libres" de la thyroïde ainsi que de démontrerl'absence des iodotyrosines libres dans le plasma du rat normal.

In vivo, la méthode d'équilibre isotopique a permis de mesurer le contenu en iode dela thyroïde et de calculer l'intensité de la sécrétion de cette glande sans qu'il soit nécessairede la prélever.

Par double marquage avec aa5l et 1 S 1 I , la méthode d'équilibre isotopique a permis demesurer l'intensité du flux de recyclage intrathyroïdien ainsi que les vitesses de renouvelle-ment de tous les composés iodés de la thyroïde. Pour .cette glande, aucune relation précurseur-produit n'a été trouvée entre les iodotyrosines (MIT et DIT) et les iodothyronines (T4 et T3).L'absence de cette relation résulte de l'hétérogénéité de renouvellement de la thyroglobuline.

-D'autre part, il a été montré qu'il existait dans le plasma une fraction d'iode organiquedifférente de la thyroglobuline et se renouvelant plus rapidement que les hormonescirculantes T4 et Ta.

La méthode d'équilibre isotopique est très favorable aux dosages d'iode en grandesséries. Elle permet de plus d'améliorer les fractionnements biochimiques en ajoutant desentraîneurs sans que le dosage ultérieur d'iode ia7l soit perturbé.1964 84 pages.Commissariat à l'Energie Atomique - France.

CEA-R 2590 - SIMON ClaudeA NEW METHOD FOR STUDYING IODINE METABOLISM ; THE ISOTOPIC EQUILI-BRIUM METHOD - K.NETIC AND QUANTITATIVE ASPECTS OF MEASUREMENTS MADEON RATS.Summary :

The isotopic equilibrium method which has been developed in the case of the rathas made it possible to measure the absolute values of the principal parameters of iodinemetabolism in this animal.

The quantities and concentrations of iodine have been measured in the thyroid glandand in the plasma with a sensitivity of 0.001 ug of 1 2 7 I . This sensitivity has made it possibleto measure pools as small as the iodide and the free iodotyrosines of the thyroid and todemonstrate the absence of free iodotyrosines in the plasma of the normal rat.

In vivo, the'isotopic equilibrium method has made it possible to measure the iodinecontent of the thyroid gland and to calculate the intensity of this gland's secretion withoutremoving it.

By double labelling with 12BI and 13ll the isotopic equilibrium method has made it possibleto measure the flux, intensity of the intrathyroidal recyclina as well as the turnover ratesof all the iodine containing compounds of the thyroid gland. For this gland no precursor-product relationship has been found between The iodotyrosines (MIT and DIT) and the iodo-thyronines (T4 and T8). The absence of this relationship is due to the heterogeneity of thethyroglobulin turnover. It has been shown furthermore that there exists in the plasma anorganic fraction of the iodine which is different to thyroglobulin and which is renewed morerapidly than the circulating hormones T8 and T4.

• The isotopic equilibrium method is very useful for series measurements of iodine. Itmakes it possible furthermore to improve the biochemical fractionations by adding carrierswithout affecting the subsequent a27 measurements. „1964 84 pages.Commissariat à l'Energie Atomique - France.

PREMIER MINISTRE C E A - R 2590

COMMISSARIAT A

L'ÉNERGIE ATOMIQUE

UNE NOUVELLE METHODE D'ÉTUDE

DU MÉTABOLISME DE L'IODE :

LA MÉTHODE D'ÉQUILIBRE ISOTOPIQUE.

ASPECTS CINÉTIQUES ET QUANTITATIFS

OBTENUS CHEZ LE RAT

par

SIMON Claude

Rapport CE A- R 2590

C E N T R E D ' É T U D E S

NUCLÉAIRES DE SACLAY

Les rapports du COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE sont, à partir du n° 2200,en vente à la Documentation Française, Secrétariat Général du Gouvernement, Direction dela Documentation, 16, rue Lord Byron, PARIS VIII'.

The C.E.A. reports starting with n" 2200 are available at the Documentation Française,Secrétariat Général du Gouvernement, Direction de la Documentation, 16, rue Lord Byron,PARIS vin:

SÊKtt A, N» 4290

N° D'ORDRB :

5141

THESESPRÉSENTÉES

A LA FACULTÉ DES SCIENCESDE L'UNIVERSITÉ DE PARIS

POUR OBTENIR

LE GRADE DE DOCTEUR ES SCIENCES NATURELLES

PAR

SIMON Claude

PREMIÈRE THÈSE

Une nouvelle méthode d'étude du métabolisme de l'iode :

La méthode d'équilibre isotopique.

Aspects cinétiques et quantitatifs obtenus chez le rat

DEUXIÈME THÈSE

Propositions données par la Faculté

Biosynthèse de la thyroglobuline

Soutenues le 21 Mai 1964 devant la Commission d'examen

MM. JOST Président

MORELExaminateurs

LISSITZKY

I FDCUOUM

A mes Parents

A Monsieur Pierre PAUWELS in memoriam

A Monsieur Roger CHEVALIER

A ma Fiancée

"Ce qui reste éternellement

incompréhensible dans la nature,

c'est qu'on puisse la comprendre. "

Albert EINSTEIN

LISTE DES ABREVIATIONS

RAS

MP

MIT

DIT

miT13

MITCJ

PBI

EB

NEB

TBP

TBG

Dn\DITC

TRIS

radioactivité spécifique

mouvement propre ou bruit de fond

3-iodotyrosine

3, 5-diiodotyrosine

thyroxine

3, 5, 3 '- tri iodothyronine

MIT et DIT l ib res (dialysables)

MIT et DIT combinées (thyroglobuline)

(Protein-Bound Iodine) iode organique lié aux protéines plasmatiques

fraction du PBI extractible par le n-butanol

fraction du PBI non extractible par le n-butanol

(thyroxine-binding proteins) protéines fixant la thyroxine

(thyroxine-binding globulin) globuline plasmatique fixant la thyroxine ( i n t e r - a globuline)

t r i s (hydroxyméthyl) axninométhane.

TABLE DES MATIERES

Pages

LISTE DES ABREVIATIONS 7

PREFACE 1 3

INTRODUCTION GENERALE A L'ETUDE D'UN METABOLISME 15

Premier Chapitre - CONSIDERATIONS THEORIQUES GENERALES 15

A - Notion de renouvellement (Turnover) 15

B - Modes de renouvellement 15

I - Processus de transfert 15

II - Processus métaboliques 15

C - Etude du renouvellement par les indicateurs nucléaires 15

I - Postulats d'emploi des indicateurs nucléaires 15

II - Principe d'étude d'un renouvellement par les indicateurs nucléaires 16

III - Expression des résultats 16

D - Caractéristiques statiques du renouvellement 16

I - "Pool" et compartiment 16

II - Espace de distribution (Diluting space) 17

III - Etat stationnaire (Steady state) 17

E - Caractéristiques cinétiques du renouvellement 17

F - Relation précurseur - produit 18

Deuxième Chapitre - CONCEPTIONS MODERNES DU METABOLISME DE L'IODE 20

A - Modèle de renouvellement 20

B - Calculs des paramètres du renouvellement 20

C - Critiques 21

Troisième Chapitre - OBJET ET PLAN DES RECHERCHES 22

PREMIERE PARTIE : LA METHODE D'EQUILIBRE ISOTOPIQUE 23

Premier Chapitre - PRINCIPE ET TECHNIQUE DE LA METHODE D'EQUILIBRE ISOTO-PIQUE 23

9

Pages

A - Principe de la méthode d'équilibre isotopique 23

I - Renouvellement d'un pool en état stationnaire avec un précurseur marqué àune RAS constante 23

II - Renouvellement de l'iode chez le rat alimenté en iode par une boisson àconcentration et à RAS constantes 24

B - Matériel et technique 24

I - Elevage 24

II - Alimentation. 24

III - Radioisotopes 25

Deuxième Chapitre - VALIDITE DE LA METHODE D'EQUILIBRE ISOTOPIQUE 26

A - Validité sur le plan radiobiologique 26

I - Facteurs d'irradiation de la thyroïde 26

II - Action biologique des radiations sur la thyroïde 26

1) Epreuves histologiques et dynamiques 26

2) Epreuve biochimique : thyroglobuline circulante 27

III- Contrôle de l 'absence de radiolésions thyroïdiennes : recherche de la thy-roglobuline dans le plasma 27

1) Techniques et résultats 27

a) Relargage par le sulfate d'ammonium 28b) Ultracentrifugation en gradient de saccharose 28

2) Conclusion. 28

B - Validité su r le plan méthodologique 28

I - Le précurseur du renouvellement 29

II - Etat stationnaire et vitesse de renouvellement 30

III - Auto-absorption de 1251 30

IV - Précision des mesures de radioactivité 30

C - Validité sur le plan physiologique 31

Troisième Chapitre - CHAMPS D'APPLICATION DE LA METHODE D'EQUILIBRE ISOTO-PIQUE 33

A - Champ d'application des études quantitatives 33

B - Champ d'application des études cinétiques , 33

C - Champ d'application des études biochimiques 34

DEUXIEME PARTIE : RENOUVELLEMENT ET REPARTITION DE L'IODE ENTRE SESPRINCIPAUX COMPARTIMENTS 35

r

Premier Chapitre - RENOUVELLEMENT GLOBAL DE L'IODE DE LA THYROÏDE ET DO-SAGE DE L'IODE DU PLASMA 35

A - Renouvellement de l'iode de la thyroïde 35

I - Techniques 35

II - Courbe de renouvellement 35

10

Pages

B - Dosage de l'iode plasmatique à l 'équilibre isotopique 38

I - Techniques 38

II - Concentration de l 'iodure et de l'iode organique du plasma 38

C - Discussion 41

Deuxième Chapitre - SECRETION THYROÏDIENNE ET RENOUVELLEMENT DE L'IODEORGANIQUE. EXTRATHYROIDIEN 42

A - Sécrétion thyroïdienne 42

I - Estimation par les méthodes classiques 42

II - Estimation par la méthode d'équilibre isotopique 42

B - Renouvellement du pool iode organique extrathyroïdien 44

I - Sécrétion thyroïdienne et pool extrathyroïdien d'iode organique (PP." > 44

II - Etude simultanée du renouvellement de l'iode organique du plasma (PBI) et

de l'iode de la thyroïde 44

1) Techniques 44

2) Résultas 44

C - Discussion. . . A 47.

Troisième Chapitre - HETEROGENEITE FONCTIONNELLE DE LA THYROÏDE 49

A - Renouvellement de l'iodure et de l'iode organique total de la thyroïde 49

I - Principe 49

II - Techniques 49

III - Résultats 50

IV - Discussion 51

B - Nature de l'iode organique sécrété par la thyroïde 52

I - Techniques 54

II - Résultats 55

III - Discussion 56

Quatrième Chapitre - CONCLUSIONS 58

TROISIEME PARTIE : VOIES METABOLIQUES DE L'IODE DANS LA THYROÏDE 59

Premier Chapitre - REPARTITION DE L'IODE DE LA THYROÏDE ENTRE SES "POOLS"

ELEMENTAIRES 60

A - Techniques et matériel 60

I - Techniques biologiques 60

II - Techniques biochimiques , 61

1) Dialyse 61

2) Chromato-électrophorèse 61

3) Homogénéisation 61

11

Pages

4) Digestion enzymatique - 61

5) Electrophorèse de contrôle 61

III - Détection et mesure de la radioactivité 61

IV - Calcul et expression des résultats 62

V - Produits chimiques et radioisotope 62

B - Résultats 62

I - Iode total et iode "libre" de la thyroïde 62

II - Compartiment dialysable ou "libre" 62

III - Compartiment non dialysable 65

IV - Comparaison des rapports MIT/DIT et T3/T, pour les deux compartiments 65

C - Discussion 65

I - Choix des techniques 65

II - Compartiment dialysable 66

III - Pool iodure 67

IV - Compartiment non dialysable (Thyroglobuline) 68

Deuxième Chapitre - VOIES METABOLIQUES DE L'IODE DANS LA THY^pIDE 70

A - Techniques 70

B - Résultats 71

C - Discussion. 72

Troisième Chapitre - CONCLUSIONS 79

CONCLUSIONS GENERALES 81

REFERENCES 83

12

PRÉFACE

Le présent travail a été réalisé dans le Département de Biologie du C. E. A. (Laboratoire dePhysiologie Physico-chimique, C.E.N/SACLAY et Service Hospitalier Frédéric-Joliot, ORSAY) et dansle Laboratoire de Biochimie Médicale de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de MARSEILLE.

Nous exprimons notre gratitude au Professeur Agrégé COURSAGET, Directeur du Départementde Biologie du C. E. A, qui a bien voulu accepter notre détachement dans son Département en tantque Chercheur du C. N. R. S.

Nous assurons de notre profond attachement le Professeur MOREL, Directeur du Laboratoirede Physiologie Physico-chimique, qui nous a initié aux problèmes de cinétique biologique avec unerigueur scientifique digne des plus hauts éloges. Ses encouragements et ses critiques nous ont per-mis de mener à bien notre travail.

Nous adressons nos plus vifs remerciements au Professeur KELLERSHOHN, Directeur duService Hospitalier Prédéric-Joliot, pour les encouragements qu'il nous a prodigués et la bienveillanceavec laquelle il nous a toujours reçu.

Nous exprimons notre reconnaissance au Professeur LISSITZKY, Directeur du Laboratoire deBiochimie Médicale de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de MARSEILLE, avec qui nousavons eu l'honneur et le plaisir de collaborer. Par l'exemple de ses méthodes de recherche et parses conseils éclairés il a su nous initier en t rès peu de temps aux problèmes modernes de bio-chimie thyroïdienne.

Nous apprécions l'honneur que nous a fait le Professeur JOST d'accepter de présider notrejury de thèse et nous lui exprimons notre gratitude pour l'intérêt qu'il a bien voulu porter à notretravail.

13

INTRODUCTION GÉNÉRALE A L'ÉTUDE D'UN MÉTABOLISME

PREMIER CHAPITRE

CONSIDÉRATIONS THÉORIQUES GÉNÉRALES

A - NOTION DE RENOUVELLEMENT (TURNOVER)

Depuis les travaux de Borsook en 1935 (14), la conviction est faite d'un remaniement perpé-tuel des constituants biologiques malgré une inertie apparente. Schoenheimer (115) en 1949 préciseque "all constituents of living matter, whether functional or structural, of simple or of complexconstitution, are in a steady state of rapid flux".

Jusqu'alors, l'état dynamique d'un constituant ne se concevait que dans le cas d'un déséqui-libre par synthèse ou par dégradation, pour lequel des variations de quantités ou de concentrationsétaient décelables par l'analyse classique. L'emploi des isotopes lourds puis radioactifs a permisde démontrer que même dans le cas de compensation, un transport de substance existait qui contri-buait au remaniement de la matière. Ce processus a reçu le nom de renouvellement (turnover).

Le renouvellement peut se définir comme l'apparition et la disparition simultanée des consti-tuants biologiques de même nature. Il peut se rencontrer à toutes les échelles d'organisation depuiscelle de l'atome jusqu'à celle de la cellule.

B - MODES DE RENOUVELLEMENT

En n'envisageant que le renouvellement d'un constituant chimique, on peut distinguer deux ty-pes de processus : les processus de transfert et les processus métaboliques.

I - Processus de transfert.

Le renouvellement des molécules se fait par des molécules de même nature provenant d'unmilieu contigu. Ce cas est bien connu pour les ions pour lesquels on distingue des transferts actifsou passifs selon que ceux-ci requièrent ou non de l'énergie (fixation active d'iodure par le parenchymethyroïdien). Quelques cas sont également connus de transferts de macromolécules par phagocytose etpar pinocytose.

II - Processus métaboliques.

Les processus métaboliques mettent en relation deux espèces moléculaires différentes A et B.L'espèce A est le précurseur Indirect ou direct de l'espèce B selon que la transformation chimiquede A en B se fait avec ou sans espèce moléculaire intermédiaire.

C - ETUDE DU RENOUVELLEMENT PAR LES INDICATEURS NUCLEAIRES

Les indicateurs nucléaires utilisés comme traceurs peuvent être de deux sortes : lourds ouradioactifs. Leur emploi est basé sur trois postulats.

I - "Postulats d'emploi des indicateurs nucléaires,

1) Le traceur a le même devenir métabolique que l'isotope naturel.

Cette condition est généralement remplie. Une exception doit être faite cependant pour l'isotopelourd de l'hydrogène (deuterium) dont la masse est le double de celle de l'isotope stable (effetisotopique).

15

2) L'introduction du traceur ne perturbe pas le métabolisme en étude.

Le traceur est introduit en quantité impondérable et ce postulat est en conséquence respectépour les isotopes radioactifs dont la désintégration fournit un nouvel élément chimique, à conditionque l'effet radiobiologique soit négligeable.

3) La répartition du traceur est homogène dans le milieu à marquer.

Ce postulat peut être en défaut dans le cas où la vitesse de mélange est plus petite que cellesdes processus métaboliques ou quand la viscosité du milieu est élevée.

II - Principe d'étude d'un renouvellement par les indicateurs nucléaires.

Si les trois postulats sont respectés, les molécules marquées a* ont la même probabilité derenouvellement que les molécules non marquées a :

d a* _ d_ad t d t

Si la fonction de renouvellement trouvée expérimentalement pour les molécules marquées est :

d a* .

TT " fca

la même relation décrit le renouvellement des molécules non marquées :

d ad t = k. a

III - Expression des résultats.Pour un composé marqué par un isotope radioactif, on définit une radioactivité spécifique (RAS).

La RAS pour un élément donné est le rapport du nombre d'atomes radioactifs au nombre total d'ato-mes. Les atomes radioactifs étant en quantité impondérable, la somme des atomes est équivalenteau nombre d'atomes stables. En conséquence, la RAS s'exprime en quantité de radioactivité par unitéde poids ou par molécule. Les unités de quantité de radioactivité employées en biologie sont géné-ralement des sous-multiples du Curie (C) : millicurie (1 mC = 10~3 C) et microcurie (1 (i.C = 10"6C).

D - CARACTERISTIQUES STATIQUES DU RENOUVELLEMENT

La description d'un renouvellement suppose la définition d'une entité spatiale qui est le siègede ce processus.

I - "Pool" et compartiment.

Un pool est un ensemble homogène de molécules ou d'atomes de même nature ayant la mêmeprobabilité de remplacement pour un processus de renouvellement déterminé.

Un terme devenu équivalent au premier par l'usage, le compartiment, représente comme luiune masse de metabolite renouvelable. Primitivement il était employé surtout pour les processusde renouvellement par transfert.

De la définition du pool il ressort que sa délimitation ne correspond pas forcément à une dé-limitation anatomique. C'est un concept fonctionnel qui se justifie par les études cinétiques dans lamesure où les conditions d'homogénéité et de probabilité de renouvellement sont respectées. D'ailleurspour des molécules de même nature, la délimitation en compartiments est variable selon l'échellede temps de l'expérience. C'est le cas pour les processus de transfert rapides et réversibles decertains ions tels que I" et Na* entre le plasma et les liquides interstitiels. Pour des expériencesrapides on pourra mesurer une vitesse de diffusion et distinguer deux compartiments élémentaires(plasma et liquides interstitiels) après injection de traceur dans le plasma et prélèvement d'échan-tillons dans le même milieu (77). Pour des expériences de longue durée, Ja vitesse d'échange étanttrès grande entre les deux compartiments élémentaires, on peut considérer leur somme comme uncompartiment unique homogène et admettre que les échantillons de plasma prélevés sont bien repré-sentatifs du compartiment total.

16

II - Espace de distribution (Diluting space).On peut définir un volume apparent de distribution (diluting space) ou espace de distribution qui

représente un volume théorique dans lequel le traceur est réparti à la concentration d'équilibre duplasma (Hevesy, 1948 - réf. 45). Il est exprimé soit en litre (ou ml)-équivalent de plasma, se iten % du poids corporel quand la concentration du traceur est rapportée à l'unité de poids de plas-ma. Si la condition d'homogénéité n'est pas respectée (concentration du metabolite en certains ter-ritoires du compartiment supérieure à sa concentration plasmatique) l'espace de distribution peutêtre supérieur à 100 %.

Lorsque l'on connait la concentration plasmatique de l'élément naturel on peut évidemmentestimer la valeur du pool que cet espace représente.

III - Etat stationnaire (steady state).

Un pool (ou un compartiment) est en état stationnaire lorsque l'apparition et la disparition dumetabolite qui participe à son renouvellement se compensent simultanément de telle façon que laquantité et la concentration du metabolite restent constantes.

Un cas particulier de l'état stationnaire est celui pour lequel les vitesses d'apparition et dedisparition sont constantes.

E - CARACTERISTIQUES CINETIQUES DU RENOUVELLEMENT

Elles sont définies pour un pool en état stationnaire se renouvelant à une vitesse constante.eequi revient à admettre que le renouvellement est une réaction du premier ordre. Dans ces condi-tions, la vitesse de renouvellement est proportionnelle à chaque instant à la masse de metaboliterenouvelable A :

d A , ." d t k ' A

Introduisons instantanément un traceur dans le pool A. Si ao est sa RAS au temps zéro, lavitesse de disparition du traceur au temps t est proportionnelle à sa RAS instantanée a :

k.ad t K&

En intégrant, il vient :

a = ao . exp (-kt) [ 1]

Les molécules marquées ayant la même probabilité de renouvellement que les molécules nonmarquées, l'analyse de cette relation permet de mesurer tous les paramètres du renouvellement dupool A, en particulier le taux et la vitesse de renouvellement.

Sous forme logarithmique, la relation (1) devient :

In (a) = In (ao) - kt

In (-)= - kt [2]

En transcrivant la relation (2) en coordonnées semi-logarithmiques on peut calculer le coeffi-cient k. En pratique, on utilise une échelle de logarithmes décimaux. On mesure alors un décré-ment d à partir duquel on calcul k par la relation :

k = 2,3 d

Le taux de renouvellement k ou constante de renouvellement (Rate Constante, Fractional Rate)mesure la fraction du pool A qui se renouvelle par unité de temps. IL a la dimension de l'inversed'un temps (voir Robertson, 1957-réf. 108).

17

La vitesse de renouvellement (Turnover Rate) est égale au produit k x A. Elle mesure le fluxde renouvellement et s'exprime en nombre de molécules ou en poids par unité de temps (dimension :m.t"1).

F - RELATION PRECURSEUR-PRODUIT

En dehors de la mesure des paramètres du renouvellement des constituants biologiques, l 'em-ploi des indicateurs nucléaires permet dans certaines conditions de distinguer les relations métabo-liques qui existent entre les différents pools d'un même système.

Soit un système en état stationnaire, constitué de pools homogènes se renouvelant à flux cons-tants selon la chaîne de réactions :

A > B * C * D »

Si un indicateur est introduit dans le pool A, on peut suivre le renouvellement des pools B ,C, D en mesurant l'évolution de leurs RAS b, c, d, en fonction du temps. Considérons la séquenceB C. Soit k c la constante de renouvellement du pool C. La fonction de renouvellement de ce poolest donnée par la relation

—• = kc (b - c) [3]

qui est valable quelle que soit l'allure de la fonction de renouvellement du pool B

^ = kB (a - b)

et par conséquent quel que soit le mode d'introduction dans le pool A choisi pour l'indicateur*

Deux propriétés se déduisent immédiatement de la relation (3)

i) si b = c, -Jf = 0

d c2) -r— passe par une valeur maximum pour l 'écart de RAS maximum (b - c) (point d'in-

flexion).

En 1943, Zilversmit et coll. (156) ont proposé la première propriété de cette relation commecritère de distinction pour un précurseur direct (immediate precursor). Si B est le précurseurindirect de C (B » B1 > C), le maximum de RAS du pool C est atteint avec un certain retardpar rapport au cas précédent et

d c-TT- > 0 pour b = c

En fait, la distinction entre précurseur direct et précurseur indirect dépend de l'échelle detemps de l'expérience. La présence d'un pool intermédiaire B1 peut ne pas modifier l'allure descourbes de renouvellement des pools B et C si le renouvellement du pool B1 est rapide (Koch.réf. 56).

Le critère de Zilversmit et coll., défini pour un système en état stationnaire de deux poolshomogènes qui se renouvellent à flux constants, n'est valable que si B est le seul précurseur directde C. Il n'existe que deux types de précurseurs directs pour lesquels la relation de Zilversmits'applique : le précurseur absolu et le précurseur unique. Le pool B est le précurseur direct absolu ou

• Si le pool A est homogène, l'évolution en fonction du temps de sa RAS a ne dépend que du mode d'introductionde l'indicateur.

Pour une infusion continue de radioactivité : a = ao = constante (voir le Partie).

Pour une impulsion de radioactivité : a = ao. exp (-kAt) (voir Hle Partie).

18

unique du pool C selon qu'il participe entièrement ou partiellement au renouvellement du pool C(Rescigno et Segre.-ref. 100). La relation précurseur-produit ne s'applique plus si le pool C a plusd'un précurseur, même si ceux-ci sont des précurseurs directs de C. Dans le cas le plus simplede deux précurseurs Bx et B2 de RAS bx et b2 (avec b2 < bx) on aura toujours la relation c < t^puisque c est la moyenne pondérée de bx et de b , .

En pratique, la relation précurseur-produit est d'une application limitée, les conditions de va-lidité, en particulier celle d'homogénéité, étant rarement remplies. Nous en verrons un exempledans la Ille Partie.

VTIODE TOTALTHYROÏDE

INGESTION

VIIODURE

VoIODE ORGANIQUE

EXCRETION

Figure 1 - Représentation schématique de la répartition de l'iode de l'organisme entre ses principaux compar-timents (d'après Brownell, 1951 - réf. 17).

19

DEUXIÈME CHAPITRE

CONCEPTIONS MODERNES DU MÉTABOLISME DE L'IODE

A - MODELE DE RENOUVELLEMENT

L'iode de l'organisme se répartit en trois compartiments principaux comme le montre le sché-ma de la figure 1. Chaque compartiment est caractérisé par son espace de distribution exprimé envolume-équivalent de plasma.

Une dose de traceur 131I injectée sous forme d'iodure se répartit rapidement dans le comparti-ment plasmatique V1 à partir duquel il diffuse dans un compartiment V2 représentant en gros lesliquides interstitiels. La vitesse de diffusion étant très grande, un équilibre est rapidement atteintpour lequel les deux volumes de distribution Vi et V2 sont à la même RAS. La somme (V + V2 )peut être considérée comme un seul et même volume de distribution Vj appelé "espace iodure" ou"compartiment iodure extra-thyroïdien" (17).

L'iodure de ce compartiment est d'une part fixé par la thyroïde à un taux kx (84) (10) et d'autrepart, éliminé par le rein à un taux k2 (53).

L'iodure fixé par la thyroïde est transformé au sein du "compartiment iode thyroïdien" VT eniode organique qui est sécrété à un taux k3 (52) dans le plasma pour constituer un pool "iode orga-nique plasmatique". Ce pool, que nous admettrons provisoirement être constitué uniquement par leshormones thyroïdiennes, est en équilibre avec l'iode hormonal des espaces extracellulaires et celuides cellules au niveau desquelles les hormones contrôlent le métabolisme général. L'ensemble deces trois compartiments anatomiquement distincts constitue un pool unique Vo d'iode "organiqueextra-thyroïdien" (101).

Une partie de l'iode organique extra-thyroïdien est excrétée par les fèces à un taux k« (36).Une autre partie subit une désiodation par les tissus à un taux k5 (2) et retourne au pool iodure Vj.

En suivant en fonction du temps l'évolution de la radioactivité de ces trois compartiments, onpeut calculer les volumes de distribution qu'ils représentent ainsi que leurs taux de renouvellement,en particulier le taux k3 qui est supposé mesurer la sécrétion hormonale de la thyroi'de (Brownell,1951 - réf. 17).

B - CALCUL DES PARAMETRES DU RENOUVELLEMENT

L'espace iodure peut être calculé après injection intraveineuse de traceur en suivant l'évolutionde la radioactivité plasmatique en fonction du temps. Celle-ci décroît selon deux termes exponen-tiels que l'on peut mesurer en coordonnées semi-logarithmiques. Le premier terme définit la dif-fusion de l'iodure vers les liquides interstitiels ; le second mesure la somme de la disparition parfixation thyroïdienne et par élimination rénale (kx + k2). Par extrapolation au temps zéro on peutmesurer l'espace plasmatique Vj et l'espace total Vj = "Vi + V2 . On peut ainsi exprimer le renou-vellement du compartiment iodure extrathyroïdien par sa "clearance" totale (kx + k2) Vj que l'onexprime en % de volume de distribution par unité de temps (chez l'homme, en litre-équivalent deplasma/jour). La mesure de la pente (kx + k2) a été proposée par Keating et Albert (51) commediagnostic de l'état fonctionnel de la thyroïde en clinique humaine.

En suivant les courbes d'évolution de la radioactivité fixée par la thyroïde et de la radioac-tivité excrétée dans l'urine, on peut déterminer séparément les clearances thyroïdienne et rénale. Laclearance rénale k2. Vj est calculée en divisant la quantité de radioactivité excrétée par la concen-

20

tration en radioactivité du plasma. Connaissant k2, la clearance thyroïdienne est calculée à partirde la valeur de la fixation maximum de radioactivité U = kj,/ki + k2.

A partir de la valeur maximum U, la radioactivité de la thyroïde décroît à un taux k3. Si l'onpeut faire l'hypothèse d'un état stationnaire, la relation k1# Vj = k3. VT est valable. Connaissant kiet Vj et mesurant k3, on peut déterminer l'espace de distribution de l'iode de la thyroïde \T . Aucunedonnée quantitative ne peut être obtenue sur la fixation (ou la sécrétion) de l'iode par la thyroïdesans doser au moins la concentration en iodure du plasma.

Si les conditions d'état stationnaire sont réalisées, on peut déterminer la vitesse de renouvel-lement de l'iode orjanique extrathyroîdien par la relation : k3. VT = (k, + k5) Vo . En admettant quele compartiment iode organique extrathyroîdien est uniquement de nature hormonale, on peut mesurerl'espace Vo en suivant la courbe de disparition de la radioactivité plasmatique après injection d'hor-mone marquée. Connaissant k3 et VT,il reste à mesurer soit k.^ soit k5 pour connaître tous les para-mètres du système.

La valeur de la sécrétion thyroïdienne ne pourra être obtenue qu'en dosant l'iode organiqueplasmatique ou mieux l'iode de la thyroïde si cela est possible.

C - CRITIQUES

L'utilisation d'un traceur et l'étude cinétique de sa répartition dans les compartiments acces-sibles de l'organisme ont pour but final de déterminer l'état fonctionnel de la thyroïde. Celui-ciest caractérisé en premier lieu par l'intensité de la sécrétion hormonale dont la connaissance né-cessite la mesure du pool d'iode thyroïdien et de son taux de renouvellement.

La quantité d'iode contenue dans la thyroïde est suffisante pour être dosée chimiquement maisle prélèvement de la totalité ou d'une partie de la glande peut n'être pas possible (chez l'homme)ou ne pouvoir se faire qu'à la fin de l'expérience (chez l'animal). D'autre part, l'hypothèse de l'étatstationnaire en cours de renouvellement n'est peut-être pas toujours vraie et mériterait d'être véri-fiée par des dosages en cours d'analyse. A défaut de prélèvement, le dosage de l'iode de la thyroï-de peut être remplacé par son estimation en calculant l'espace de distribution qu'il occupe et en do-sant l'iodure du plasma. Mais cette estimation indirecte du pool d'iode de la thyroïde n'est valableque si rllu est réalisée en état stationnaire.

La mesure du taux de renouvellement k3 de l'iode de la thyroïde est simple mais erronée .La désiodation périphérique des hormones fournit de l'iodure qui est réutilisé par la glande. Letaux mesuré k3 est alors inférieur au taux réel k3. D'après Brown-Grant et coll. (18) cette réuti-lisation pourrait atteindre 10 % du flux de fixation.

Même si le taux de renouvellement de la glande pouvait être connu avec exactitude, le calculde l'intensité de la sécrétion ne serait valable que si l'hypothèse d'un pool homogène était justifié,ce qui n'est pas toujours le cas.

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TROISIÈME CHAPITRE

OBJET ET PLAN DES RECHERCHES

L'objet de nos recherches a été de mettre au point une méthode simple et directe qui per-mette de mesurer simultanément des vitesses de renouvellement et des masses renouvelables chezl'animal vivant.

En précisant les conditions techniques et physiologiques de la réalisation d'un état stationnairepffectif, nous avons mis au point la méthode d'équilibre isotopique qui est basée sur le principe durenouvellement d'un pool en état stationnaire.

Dans une première partie, nous décrirons cette méthode en envisageant ses possibilités etses limites.

Dans une deuxième partie, nous étudierons le renouvellement de l'iode et sa répartition entreses principaux compartiments de l'organisme.

Enfin, dans une troisième partie, nous étudierons les voies métaboliques de l'iode dans lathyroïde, en associant la méthode d'équilibre isotopique à certaines techniques biochimiques.

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PREMIÈRE PARTIE

LA MÉTHODE D'ÉQUILIBRE ISOTOPIQUE

PREMIER CHAPITRE

PRINCIPE ET TECHNIQUE DE LA MÉTHODE D'E'QUILIBRE ISOTOPIQUE

A - PRINCIPE DE LA METHODE D'EQUILIBRE ISOTOPIQUE

Elle consiste à étudier le renouvellement d'un metabolite chez un animal en plaçant celui-cidans des conditions d'état stationnante, et en lui fournissant le metabolite précurseur à une RASconstante depuis le temps pris pour origine jusqu'à la fin du renouvellement.

I - Renouvellement d'un pool en état stationnaire avec un précurseur marqué à une RASconstante.

Soit un pool B en état stationnaire se renouvelant à un taux constant k à partir d'un pool pré-curseur A. Si A est marqué instantanément à la RAS constante a0, la variation instantanée de laRAS du compartiment B est donnée par l'équation :

-ff = k (ao - b) [1]

L'évolution en fonction du temps de cette RAS est obtenue en intégrant l'équation (1). Il vient:

b = ao[l - exp (-kt)] [2]

On voit que pour t = <n, b = a0.

Pour un renouvellement total de B, sa RAS b est égale à celle de son précurseur a0. Le poolB est en équilibre isotopique avec son précurseur A.

Si l'on a accès au compartiment B, il suffit de mesurer l'évolution de sa radioactivité totaleen fonction du temps pour calculer la valeur de ce pool et de son flux de renouvellement.

En effet, à chaque instant la quantité totale de radioactivité Q contenue dans le pool B estégale au produit de la quantité de metabolite B par sa RAS actuelle b : Q = B x b. A l'équilibreisotopique b = ao d'où Q = B x ao. Connaissant ao et mesurant Q à l'équilibre isotopique, nous pou-vons dès lors calculer la quantité B du pool qui a subi le renouvellement par le rapport Q/ao.

D'autre part, la transcription de la courbe de renouvellement en coordonnées semi-logarithmiquesnous permet de calculer la valeur du taux de renouvellement k par la relation :

In [1 - b / a j = - kt

En pratique, on utilise une échelle logarithmique décimale. On mesure soit la pente d de ladroite obtenue, soit la période T 1/2,et on calcule k à partir de l'une des deux relations :

k = 2,3 d ou k

Ce taux de renouvellement k représente la fraction du pool B qui se renouvelle par unité detemps. Connaissant la valeur de k et de B, on calcule le fLux de renouvellement par le produitk x B.

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II - Renouvellement de l'iode chez le rat alimenté en iode par une boisson à concentration età RAS constantes.

Le métabolisme de l'iode chez un animal est conditionné en premier lieu par la températureambiante et par l'apport alimentaire d'iode. L'instauration d'un état stationnaire résulte de l'adap-tation à ces deux facteurs maintenus à une valeur constante.

Nous envisagerons les résultats de cette adaptation à une température unique de 23° C et pourdeux régimes iodés fournissant respectivement 5 et 50 |ig d'iode par jour à chaque rat.

Tous les animaux sont alimentés par un régime solide carence en iode. Leur boisson est unesolution d'iodure de potassium dont la concentration est choisie en fonction de l'apport quotidiend'iode désiré, et en tenant compte de la consommation quotidienne de boisson.

L'expérience biologique se déroule en deux temps :

- l'état stationnaire est établi en fournissant la boisson non marquée pendant 2 mois.

- l'équilibre isotopique est réalisé en utilisant une boisson semblable marquée par untraceur à une RAS connue et constante à la décroissance physique près du radioisotope.

L'ensemble de l'iode de l'organisme se renou -elle par le processus d'ingestion-excrétion. LaRAS de l'iode de chaque compartiment s'élève à une vitesse propre à ce comp^aj^imerit. A l'équili-bre isotopique les RAS de tous les compartiments sont égales à celle de la boisson. On peut ainsiévaluer chez le rat les trois principaux compartiments iode thyroïdien, iodure plasmatique et iodeorganique plasmatique, en rapportant leur radioactivité pour l'équilibre isotopique à la RAS d'unéchantillon de boisson. Ceci suppose simplement de pouvoir mesurer la radioactivité totale ou celled'une partie aliquote de chaque compartiment. On peut espérer d'autre part mesurer des flux derenouvellement en particulier celui de l'iode de la thyroïde qui représente sa sécrétion.

B - MATERIEL ET TECHNIQUE

I - Elevage.

Des rats © de souche Wistar, pesant 200 ± 20 g en début d'expérience,sont élevés par cagesde 5 animaux dans une animalerie thermostatisée à 23 ±1° C. L'éclairage et le degré hygrométriquene sont pas contrôlés.

II - Alimentation.

L>a boisson et le régime solide sont fournis ad libitum.

1) Boisson.

Une expérience préliminaire portant sur 20 animaux pendant un mois nous a permis de déter-miner que le volume moyen d'eau bue par un rat en 24 h. était de 19 ml. Ce volume nous a servide base pour calculer la concentration en iode de la boisson en fonction de l'apport iodé auquel nousvoulions adapter les animaux.

Une solution-mère d'iodure de potassium contenant 315 mg IK. par litre est préparée à partird'iodure de potassium pur cristallisé (Prolabo) renfermant 99,5 % IK poids pour poids. Elle estconservée au froid (+ 4° C) jusqu'à l'emploi.

Les boissons sont préparées par dilution de la solution-mère avec de l'eau désionisée pouratteindre des concentrations finales de 0,27 jig i/ml ou de 2,7 (ig i/ml selon que l'apport quotidiend'iode doit être de 5 ou de 50 (ig. Elles sont confectionnées par fractions de 22,5 1 et conservéesdans des tonneaux de 25 1 en pyrex, à la température de l'animalerie.

Des boissons semblables auxquelles on ajoute le traceur sont utilisées pour la mise en équi-libre isotopique des animaux. Les RAS de départ varient avec le type d'expérience et seront pré-cisées pour chacune d'elles.

2) Régime.

Le régime carence en iode est un régime Remington modifié (99) (75) (76) (22) dont la com-position centésimale est la suivante :

Farine de mais 88, 5

Farine de blé à 70 % de gluten (Al-re) 2,32

24

Levure de bière (super-levure Gayelord Hauser) 0,23

Lait écrémé non sucré (Galliasec bistre) 4,40

CO3 Ca (Prolabo, RP) 3,48

Cl Na (Prolabo, RP) 1,16

II est préparé dans un mélangeur (Bonnet-Calad) par fractions de 12, 9 kg.

III - Radioisotopes.

Deux radioisotopes de l'iode ont été employés : 131I et 125L

L'isotope 13XI est un produit de fission. Il provenait de l'extraction des barres d'uranium dela pile EL3 de Saclay (France). Il nous a été fourni par le Commissariat à l'Energie Atomique ensolution M/400 Na H SOj.pH 8 - 9, sans entraîneur (RAS = 1 0 - 2 0 mC/ml).

L'isotope 125I est fabriqué par radioactivation aux neutrons thermiques de m X e (147). Il pro-venait de Argonne National Laboratory (U. S. A. ). Il nous a été livré en solution 0,1 % NaH SOj.pH 7,sans entraîneur, 98 % de pureté (RAS = 20 mC/ml).

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DEUXIÈME CHAPITRE

VALIDITÉ DE LA MÉTHODE D'ÉQUILIBRE ISOTOPIQUE

A - VALIDITE SUR LE PLAN RADIOFIOLOGIQUE

Hamilton (40) s'est intéressé le premier au problème radiobiologique posé par l'utilisation de131I comme traceur. Etant entendu que l'on donne au traceur uniquement le rôle d'un indicateur, ilest indispensable de savoir jusqu'à quelle dose d'irradiation le traceur ne perturbe pas le métabo-lisme étudié.

I - Facteurs d'irradiation de la thyroïde.

La quantité de radioélément administrée (généralement exprimée en uC) ne dohne aucune indi-cation sur la dose d'irradiation de la thyroMe. Cette irradiation dépend en effet d'un certain nombrede facteurs physiques et physiologiques. Pour une injection unique, elle est fonction de la valeurmaximum de la fixation, de la vitesse de disparition et de la durée de l'expérience. La dose d'irra-diation peut être calculée par la formule de Marinelli (72) dans laquelle intervient une périodeeffective pour le radioisotope et pour la glande considérés.

Pour calculer la dose reçue, il faut tenir compte du coefficient d'absorption pour le tissuconsidéré. Dans le cas d'un émetteur (3,1e parcours moyen des particules ainsi que la taille et laforme de la glande interviennent. La contribution des photons y à la dose totale est généralementfaible. Pour le radioiode 131I cette dose représente 10 % de la dose totale pour la thyroïde humai-ne ; elle est nulle pour la glande du rat.

Enfin, la dose absorbée dépend de la nature du radioisotope. Le radioiode 125I dont le pouvoirde dissipation d'énergie est faible (43) (23) délivre une dose environ 10 fois plus faible que celledélivrée par une quantité équivalente de 131I.

Le calcul de la dose absorbée qui doit tenir compte de tous ces facteurs présente de grandesdifficultés et n'est généralement pas abordé. L'usage est d'admettre une absorption totale de la doseintégrée dans le temps par le poids de tissu considéré. Si cette approximation est à peu près valablepour l'homme, elle représente pour le rat une forte surestimation dont on ne connait pas l 'ordrede grandeur. Elle ne présente donc aucun intérêt. Par contre, un certain nombre d'épreuves ontété proposées pour concrétiser l'action biologique des radiations sur la thyroïde. Elles sont denature histologique, cinétique, pondérale ou biochimique (70) (69) (97).

II - Action biologique des radiations sur la thyroïde.

1) Epreuves histologiques et dynamiques.

Les observations se résument ainsi :

Pour une dose délivrée à la thyroïde par l'injection unique de 131I sans entraîneur, on noteau bout d'un mois :

a) à partir de 5 600 - 5 800 rep.*, des modifications histologiques (hypertrophie cellulaire,noyaux anormaux), une augmentation de poids de la glande plus faible que chez les témoins sousl'action de la TSH ou du propylthyouracile.

b) à partir de 18 000 rep., une hypertrophie diminuée vis-à-vis des témoins sous l'actiondu froid.

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c) à partir de 50 000 rep. , un abaissement notable de la capacité de la glande à fixerl'iode (mesurée par le rapport T/S de Halmi).

Même pour cette forte dose, la distribution de 131I dans les composés iodés de la glande,isolés après hydrolyse et chromatographie, est indiscernable de celle trouvée chez des rats nonirradiés.

2) Epreuve biochimique ; thyroglobuline circulante.

En 1949, Feller et coll. (33) observent une augmentation du FBI - (131I) chez le rat aprèsl'administration de larges doses de 13II. Chez des sujets malades porteurs d'un carcinome thyrordien,Robbins et al (106) décrivent en 1952 l'apparition dans le plasma d'un composé iodé anormal aprèsl'administration de doses thérapeutiques de131l. Dans les deux cas, une perte accélérée de radioac-tivité par la thyrorde est observée simultanément aux modifications du plasma.

Des études du composé anormal du plasma,entreprises chez l'homme (106) et chez le rat (141)ont montré que celui-ci ressemblait à la thyroglobuline par son insolubilité dans le n-butanol, sonimmobilité en chromatographie sur papier, sa composition en acides aminés iodés, ainsi que par samobilité électrophorétique à pH 8,6 (105). En 1954, la preuve réelle de l'identité du composé anor-mal avec la thyroglobuline est fournie par Robbins et coll. (103) (104) chez l'homme par deux mé-thodes. Le relargage par le tampon phosphate pH 6, 5 selon la technique de Derrien et al (29) donnedes diagrammes de précipitation de la radioactivité 131I semblables à ceux obtenus dans les mêmesconditions avec des plasmas normaux additionnés de thyroglobuline humaine marquée. L'ultracentri-fugation preparative fournit des diagrammes de sédimentation de la radioactivité 1J1I comparables àceux obtenus avec des plasmas normaux additionnés de thyroglobuline marquée. Qualitativement, cesméthodes de contrôle sont indiscutables. Cependant, elles ne permettent pas d'obtenir des donnéesquantitatives à cause des faibles concentrations de la thyroglobuline dans le plasma et de la faibleRAS de celle-ci. D'autre part, pour ces faibles concentrations le diagramme de relargage de la thyro-globuline en tampon phosphate est légèrement perturbé par la présence des protéines plasmatiques.

Récemment, Owen et coll. (85) ont mis en doute la relation qui semble exister entre lesradiolésions de la thyroïde induites par les doses thérapeutiques de radioiode et la présence dethyroglobuline dans le plasma, arguant du fait que, même pour une dose diagnostique de 131I (0, 5 mC),des malades porteurs d'un carcinome thyroïdien présentaient une fraction plasmâtique insoluble dansle n-butanol qui était importante.

Dans la mesure où une dose de 0, 5 mC de 131I peut être considérée comme une dose diagnos-tique pour l'homme, la participation éventuelle d'un état pathologique à l'apparition dans le plasmad'une certaine quantité de thyroglobuline n'invalide pas pour autant les résultats obtenus chez lerat normal après l'administration de fortes doses de 131I (33). D'autre part, ces résultats ne sontpas forcément transposables au rat aont la radiosensibilité de la thyroïde peut être très différentede celle de l'homme.

Avec Robbins et coll. , nous continuerons à considérer que la présence de la thyroglobulinedans le plasma d'un rat normal recevant une certaine dose de radioiode, est l'indice de radiolésionsdu tissu thyroïdien provoquées par la fixation du radioisotope.

III - Contrôle de l'absence de radiolésions thyroïdiennes : recherche de la thyroglobuline dansle plasma.

Nous avons choisi ce test comme indice de radiolésions thyroïdiennes, l'absence de thyro-globuline dans le plasma étant considérée comme une preuve d'absence de celles-ci.

Au cours de nos recherches, certaines expériences ont été réalisées par double marquage avecles radioisotopes 125I et 13II. Les plasmas des rats ayant reçu la plus forte dose cumulative ont étéchoisis afin de pouvoir étendre les conclusions aux autres expériences pour lesquelles un seul radio-isotope a été utilisé.

1) Techniques et résultats.

Les plasmas sont obtenus par centrifugation des sangs recueillis sur héparine. Ils sont conser-vés en ampoules scellées jusqu'à l'emploi. La recherche de la thyroglobuline est faite suffisammentlongtemps après le prélèvement des plasmas pour que la radioactivité en 131I soit devenue nulle.

Le "rep" est une unité de dose absorbée qui équivaut à l'absorption d'une quantité d'énergie de 83 erg. pargramme de matière.

27

Ceci nous permet de comparer le comportement des constituants des plasmas en équilibre isotopiqueavec l'isotope 125I, avec celui de corps témoins marqués par 131I.

L'identification de la thyroglobuline est réalisée par deux techniques : celle de Roche et coll.(112) par relargage au sulfate d'ammonium et celle de Martin et Ames (73) par ultracentrifugationen gradient de saccharose.

a) Relariage par le sulfate d'ammonium.

La thyroglobuline précipite dans une zone étroite de concentration en SO,, (NH,)2 comprise entre38 et 42 % de la saturation en ce sel à pH 6, 5 et à 23° C. Nous avons vérifié que la T, fixée auxTBP plasmatiques ne précipite pas dans cette zone, en comparant le relargage de deux échantillonsdu même plasma supplémentés en thyroglobuline entraîneur de rat et additionnés ou non de T4 mar-quée par 131I selon le protocole suivant :

Une solution de thyroglobuline entraîneur est préparée par homogénéisation de 2 thyroïdes derats non marquées, dans 1 ml de Cl Na à 0,9 %.

Deux échantillons A et B du même plasma, d'un volume de 0,5 ml, sont supplémentés par0,2 ml de solution de thyroglobuline contenant environ 1 mg de protéine. L'échantillon B est ad-ditionné de 0,025 ml d'une solution de T, - (131I) contenant environ 0,1 ug de T\ à la RAS de20 |iC/ug. Les deux échantillons sont dilués au 1/10 par 4,3 ml de Cl Na à 0,9 %. Une fractionde 2 ml est prélevée sur chaque plasma dilué et est enrichie jusqu'à 45 % de la saturation avec1, 64 ml d'une solution de SO,, (NU, )2 saturé à pH 6, 5. La dilution finale du plasma est environ l/20 .Le mélange est laissé 4 heures à 23° C puis centrifugé 5 minutes à 3 000 g. La radioactivité duprécipité B est mesurée en 131I et comparée à celle d'un échantillon de la solution de X, - (131I) ;3 % de la radioactivité ajoutée au plasma se retrouvent dans le précipité. La radioactivité du pré-cipité A est mesurée en 125I et comparée à la radioactivité totale d'un volume égal du plasmad'origine ; 3 % de la radioactivité totale se trouvent dans le précipité.

A la précision près des mesures, il n'y a pas de radioactivité dans le précipité obtenu parrelargage dans les conditions de précipitation de la thyroglobuline.

b) Dltracentrtfuêation en gradient de saccharose.

La thyroglobuline ayant une constante de sédimentation S = 19 (28) et la TBG une constanteS = 3,3 (87), il est possible de séparer par ultracentrifugation en gradient de saccharose la thyro-globuline, éventuellement présente dans le plasma, de la T, liée à la TBG.

Dans les tubes du rotor SW 39 d'une ultracentrifugeuse International modèle L, sont déposés3,9 ml d'une solution dans le Cl Na à 0, 9 % de saccharose constituant un gradient de 5 - 20 %, selonla technique de Martin et Ames. A la surface de ces solutions sont déposés les échantillons cons-titués de 0,1 ml de plasma dilué au 1/3 dans le Cl Na à 0,9 %, et additionnés soit de 0,01 mld'une solution contenant 0,29 mg de thyroglobuline entraîneur de mouton (échantillon A),soit de0,01 ml d'une solution contenant 0,7 mg de thyroglobuline - (1J1I) de mouton et correspondant à uneradioactivité de 30 000 cpm (échantillon B). La centrifugation a lieu pendant 5 h à 39 000 rpm et à+ 5° C. Le contenu des tubes est récupéré par le fond par fractions de 3 gouttes. La radioactivitédes fractions de l'échantillon A est mesurée en 125I ; celle des fractions de l'échantillon B est me-surée en 131I. Les figures 2 a et 2 b montrent les profils de radioactivité pour ces deux essais.

Aucune radioactivité en 125I n'est mesurable pour l'échantillon A dans la zone de sédimentationde la thyroglobuline. La sensibilité de la méthode d'équilibre isotopique est de 10"3 u. g d'iode ce quiéquivaut à 0,2 \ig de thyroglobuline si l'on retient une teneur moyenne en iode de 0,5 % pour cetteprotéine (110). Comme un essai correspond à un volume de 0,03 ml de plasma non dilué, la sensi-bilité exprimée en concentration devient 0,2 (jg de thyroglobuline pour 0,03 ml de plasma soit6,6 ng/ml. En prenant un poids moléculaire de 650 000 pour la thyroglobuline (28),la sensibilité dedétection en concentration molaire est donc de l'ordre de 10"8 M.

2) Conclusion.

Au seuil de sensibilité de 6,6 Jig/ml (10"8 M), la thyroglobuline est absente du plasma desrats en équilibre isotopique. Ce résultat assure la validité de la méthode d'équilibre isotqpique surle plan radiobiologique.

B - VALIDITE SUR LE PLAN METHODOLOGIQUE

Le principe de la méthode d'équilibre isotopique repose sur un certain nombre d'hypothèsesqu'il est bon de discuter ou de vérifier. D'autre part, certains aspects techniques en relation avecles mesures de radioactivité sont à considérer.

28

I - Le précurseur du renouvellement.

Toutes les mesures d'iode à l'équilibre isotopique sont basées sur la valeur de la RAS de laboisson. Celle-ci doit donc être connue exactement et être constante à la décroissance près duradioisotope.

La méthode n'est donc valable que si le régime apporte une quantité d'iode négligeable. Axelradet coll. (4) ont déjà démontré que ce régime était goitrogène par défaut d'iode. En outre, l'analysede ce régime par radioactivation aux neutrons (21) (54) (119) nous a permis de déterminer qu'ilavait une concentration en iode de 1,39 ± 0,02 ng/100 g. Cette concentration représente un apportsupplémentaire de 0, 3 ng d'iode par jour et par rat. Ceci implique pour la plus faible ration ali-mentaire choisie (5 |ig d'iode par jour) une erreur systématique maximum par défaut de 6 % surle calcul des quantités d'iode à l'équilibre isotopique.

La présence simultanée de l'isotope stable et de son traceur dans l'eau de boisson assure queles deux isotopes seront toujours absorbés par l'animal dans le même rapport. La RAS de l'iodeingéré est donc égale à tout instant à celle de l'iode de la boisson. D'autre part, le traceur fixépar l'organisme décroissant à la même vitesse que celui contenu dans la boisson, la RAS du pré-curseur peut être considérée comme constante puisque les mesures d'iode sont faites en rapportantla radioactivité de l'échantillon à doser à la RAS de la boisson.

COU

500-

UJ

§ 250oo

s/30 mn cpm xiO3

1 10r)2 FRACTIONS

18 1 10ns FRACTIONS

Figure 2 - Diagrammes d'ultracentrifugation en gradient 5-20 % de saccharose dans le CINa à 0,9 % de deuxéchantillons de plasma de rat (5 h à 39 000 rpm et à + 5° C). Dans chaque tube, un échantillon de 0,1 mlde plasma dilué au 1/3 dans le CINa à 0, 9 % est déposé à la surface de la solution de saccharose (3,9 ml)et additionné de 0,01 ml d'une solution de thyroglobuline marquée ou non par 131L A la fin de la centrifu-gation, le contenu de chaque tube est récupéré par le fond par fractions de 3 gouttes. Le diagramme esttracé à partir des mesures de radioactivité effectuées sur chaque fraction.

Echantillon A : 0,1 ml d'un échantillon de plasma dilué au 1/3 provenant du mélange en volumes égaux desplasmas de 5 rats mis en équilibre isotopique avec " 5 I . Addition de 0,01 ml d'une solution contenant 0,29 mgde thyroglobuline entraîneur de mouton. Mesure de radioactivité en 125I.

tiantillon B : 0,1 ml du même plasma dilué au 1/3. Addition de 0,01 ml d'une solution contenant 0,7 mgthyroglobuline -(131I) de mouton (30 000 cpm). Mesure de radioactivité en m I .

Echantillon Bde

29

II - Etat stationnaire et vitesse de renouvellement.Nous avons postulé :

- un état stationnaire qui maintient un pool constant par compensation des gains et despertes. Il est indispensable pour la mesure du renouvellement.

- une vitesse constante de renouvellement pour un pool donné et par conséquent un fluxde renouvellement dont la valeur est indépendante du temps.

L'état stationnaire est caractéristique de l'organisme adulte et s'oppose à l'état d'expansionde l'organisme jeune en phase de croissance. Cette première condition est réalisée en travaillantavec des rats ayant un poids minimum de 200 g. Malgré un accroissement du poids de l'ordre de100 g pendant les expériences de longue durée, il semble que l'état stationnaire soit conservé en cequi concerne le métabolisme de l'iode.

La vitesse constante de renouvellement est la condition la plus difficile à réaliser. Il est bienconnu que l'activité du rat est surtout nocturne. L'absorption,le renouvellement et la sécrétion seferont donc à une vitesse variable selon un certain rythme nycthéméraL En effectuant les mesuresà des intervalles de 24 h ou multiples de 24 h nous obtiendrons une courbe moyenne de renouvel-lement qui correspondra au cas théorique d'un renouvellement à vitesse constante.

III - Auto-absorption de "*!.Etant donné la faible énergie d'émission des rayons X du radioisotope m I , une auto-absorption

était à craindre, soit au sein de l'échantillon, soit au sein du porte-échantillon au cours des me-sures de radioactivité.

Une expérience préliminaire a donc été faite selon le principe suivant : l'isotope 131I, quiémet des rayons Y assez énergétiques pour que l'auto-absorption soit nulle, est pris comme réfé-rence. Une boisson marquée simultanément par 131I et 1S5I est administrée 24 h à 3 animaux. Lesdeux indicateurs permettent la mesure du renouvellement avec une simultanéité absolue. L'écart desmesures de radioactivité pour les deux isotopes, s'il existe, équivaut donc à l'auto-absorption deW5I. Le coefficient de correction d'auto-absorption est calculé par le rapport des mesures de ra-dioactivité en X31I à celles faites en U5L

Les thyroïdes sont prélevées et placées dans des tubes en verre de 1,7 mm d'épaisseur. Dansces conditions, on calcule un coefficient de correction de 1,63. Les mêmes mesures faites avecdes tubes à paroi mince ne donnent lieu à aucune correction. Par conséquent, la forte auto-absorption notée dans le premier cas est due uniquement à l'épaisseur du tube porte-échantillon.En employant des tubes à paroi mince, on peut étudier l'auto-absorption de U5I en fonction tls lanature physique des échantillons. Différents types d'échantillons ont servi à ce contrôle. Ce sontdes échantillons d'électrophorèse sur papier préparés à partir de broyats de glandes, des échantillonsde plasma, et des échantillons correspondant aux fractions soluble et insoluble dans l'acide trichlo-racétique de ces plasmas. Les résultats sont rassemblés dans le tableau I. Ils montrent que l'auto-absorption de 1 est négligeable pour toutes les formes physiques d'échantillons envisagées, si l'onprend soin de faire les mesures de radioactivité avec des porte-échantillons à paroi mince. Si l'uti-lisation des tubes en verre est obligatoire (chromatographie sur colonne), la nature des tubes conte-nant les échantillons standards doit être identique à celle des tubes contenant les échantillons àétudier. Dans ce cas, l'auto-absorption ne fausse pas les résultats puisqu'on rapporte la radioactivitédes échantillons à mesurer à celle des échantillons standards. Elle diminue seulement la sensi-bilité de détection.

IV - Précision des mesures de radioactivité.La désintégration d'un élément radioactif est un phénomène aléatoire et la précision avec la-

quelle l'intensité de son rayonnement peut être mesurée est d'autant plus grande que le nombred'impulsions enregistré est grand. Pour un taux de comptage faible, la précision peut être amélioréesoit en augmentant le temps de détection, soit en multipliant le nombre des mesures. Si N est lenombre total des impulsions recueillies, la précision absolue de la mesure est exprimée par ladéviation standard : a = VW ; la précision relative est donnée par la déviation standard relative :

a % = - j - x 100.

Dans notre cas, les résultats sont calculés par le rapport de la radioactivité de chaque échan-tillon inconnu E à celle de l'échantillon standard S. La précision relative du résultat R est alors :

oR % = V(aE %)2+ (CJS %)

30

Tableau I

Coefficient de correction pour les mesures de radioactivité 125I sur différents échantillonsprovenant de trois rats A, B, C traités dans des conditions identiques (voir texte)

Echantillons

Origine

Thyroïde

Plasma

Séparation

Electrophorèsedu broyât

Précipitationpar l'acide

trichlorac étiqu e

Nature

Iodure

Iode organique

Plasma total

PBI (précipité)

Iodure (surnageant)

Rats

A

0,99

1,01

1,00

1.01

0,96

B

0,92

1,04

1,02

0,92

1.02

C

1,02

1,10

1,00

1,02

1,02

Moyenne

0,97

1,05

1,01

0,98

1,00

Dans toutes nos expériences, les conditions de détection sont telles que la radioactivité deséchantillons standards est mesurée avec une précision :

1 % » oS % > 0, 1 %

et celle des échantillons inconnus avec une précision :

8 % » oE % » 0,1 %

La précision des résultats sera donnée pour chaque expérience.

C - VALIDITE SUR LE PLAN PHYSIOLOGIQUE

La méthode d'équilibre isotopique permet de mesurer des pools renouvelables puisqu'elle estbasée sur le phénomène de renouvellement.

On peut juger de l'établissement de l'équilibre isotopique par deux critères. A l'échelle del'organe, la pente de la courbe de renouvellement est nulle lorsque l'équilibre isotopique est réalisé.A l'échelle de l'organisme, la somme de la radioactivité excrétée par l'urine et les fèces est cons-tante et égale à la quantité de radioactivité ingérée pendant la même période (Van Middlesworth,1956 - réf. 148).

Toutefois, ces deux critères sont en défaut si un pool se renouvelle très lentement ou s'il estinerte vis-à-vis du renouvellement. Dans le premier cas, la précision des mesures peut être insuf-fisante pour distinguer une pente faible d'une valeur nulle. Dans le second cas, l'égalité entrel'excrétion et l'ingestion de radioactivité peut correspondre à un état de pseudo-équilihre isotopique.

Cette situation pouvait se rencontrer pour la thyroïde qui a la particularité de mettre en ré-serve dans la colloïde une partie de l'iode qu'elle contient. Le phénomène de mise en réserve im-pliquant corollairement une idée de lenteur, voire d'inertie partielle, il était bon de vérifier parune autre méthode que les résultats du dosage d'iode à l'équilibre isotopique étaient exacts.

Des dosages d'iode par radioactivation aux neutrons thermiques ont été effectués sur desthyroïdes de rats. Leurs résultats confirment ceux obtenus sur les mêmes glandes par la méthoded'équilibre isotopique (119). Les résultats, groupés dans le tableau II, sont exprimés par le rapportdes dosages pour chaque échantillon en prenant l'analyse par radioactivation pour référence. L'étudestatistique de la moyenne de ces rapports par le test de Student-Fisher (123) montre que les deuxséries de dosages ne diffèrent pas significativement (0,10 > p > 0,05 pour t = 1,876 avec n = 15).

Dans nos conditions expérimentales, une inertie partielle de l'iode contenu dans la thyroïdeest donc à exclure.

31

Tableau II

Dosage de l'iode contenu dans la thyroïde de 16 rats par la méthode d'équilibreisotopique puis par radioactivation aux neutrons thermiques.

Dates

8. XII. 1961

14. VIII. 1962

Equilibre isotopique (E. I. )

Indicateur Nucléaire

131I

1 Î 5I

u.g Iode

8,15

6,95

7 , 3

7 , 1

6 ,6

8 , 8

7 ,35

7,25

10,45

8,65

12,35

14,25

17,7

22,9

20,95

19,7

Moyenne ± déviation standard

Radioactivation auxneutrons (R. N. )

u-g Iode

8 , 5

7 . 3

7, 1

6 ,7

5 , 8

9 , 3

7 , 7

9 , 1

12,4

9,05

14,2

14,0

18,5

23,6

20,9

20,8

Rapport j,* '

0,959

0,952

1.028

1,059

1,137

0,946

0,954

0,797

0,843

0,956

0,870

1,018

0,957

0,970

1.002

0,947

0,962± 0.081

32

TROISIÈME CHAPITRE

CHAMPS D'APPLICATON DE LA MÉTHODE D'EQUILIBRE ISOTOPIQUE

A - CHAMP D'APPLICATION DES ETUDES QUANTITATIVES

La méthode d'équilibre isotopique peut s'appliquer au dosage de tous les constituants iodés del'organisme. Sa limite d'application est fonction de la RAS du précurseur et du rendement de dé-tection de la radioactivité. Dans nos conditions expérimentales, la sensibilité absolue du dosageest de 10"3 |ig d'iode. Cette sensibilité est déterminée pour une limite de détection égale à la valeurdu MP. Par exemple, pour les expériences réalisées avec le radioisotope W5I dans les conditionstechniques décrites dans le premier chapitre de la troisième partie, le millième de \ig d'iode 127Icorrespond à la détection d'une quantité de radioactivité de 15 cpm.

La sensibilité de la méthode d'équilibre isotopique est meilleure que celle des dosages chimi-ques courants (132) (5) (57) et du même ordre de grandeur que celle du dosage par radioactivationaux neutrons thermiques (54). De plus, le dosage d'iode par la méthode de l'équilibre isotopique,quise résume finalement à des mesures de radioactivité, est beaucoup plus simple que les autres typesde dosage. Il peut par conséquent s'appliquer facilement à la mesure d'une grande série d'échantil-lons avec un gain de temps appréciable.

Très récemment cette méthode a été employée par Heninger et coll. (44) pour l'étude systé-matique des composés iodés des différents tissus du rat. Ils confirment la valeur de la concentrationen iode organique du plasma (PBI) que nous avons trouvée (122).

Associée à l'histoautoradiographie, la méthode d'équilibre isotopique s'applique à l'étude delàrépartition de l'iode entre les vésicules de la thyroïde. A l'équilibre isotopique, la RAS de l'iodeétant la même dans toutes les vésicules, la densité de noircissement de 1'emulsion photographiqueest proportionnelle à leurs concentrations respectives en iode. Le radioisotope 12!I dont le pouvoirde résolution est meilleur que celui du radioisotope 131I (3) est particulièrement favorable à cetteétude.

B - CHAMP D'APPLICATION DES ETUDES CINETIQUES

La méthode d'équilibre isotopique permet d'étudier des courbes individuelles de renouvellementin vivo soit de l'organisme entier (78), soit de la thyroïde seule (121), dans la mesure où les condi-tions de détection par voie externe sont reproductibles et bien définies.

La valeur du pool dont on suit le renouvellement in vivo étant connue par la mesure de saradioactivité à l'équilibre isotopique, et sa constante de renouvellement étant calculée à partir desa courbe de renouvellement, il est possible d'atteindre la valeur absolue du flux de renouvellement.En ce qui concerne la thyroïde ce flux représente la quantité d'iode qu'elle sécrète.

La mesure des vitesses de renouvellement n'est possible qu'en état stationnaire. Toutefois enabsence d'état stationnaire, la méthode d'équilibre isotopique est encore applicable à la mesure devariations de masses renouvelables. On peut par exemple, suivre l'accroissement d'un pool se renou-velant à partir d'un précurseur à RAS constante dans le cas des organismes en état d'expansion(embryon ou jeune en croissance). Si le précurseur est unique, un équilibre isotopique peut êtreatteint puisque la vitesse de synthèse est supérieure à la vitesse de dégradation. La radioactivitédu pool étant proportionnelle à sa masse, on peut suivre sa vitesse d'accroissement en mesurantl'augmentation de sa radioactivité. Cette application peut être étendue au cas d'une rupture d'étatstationnaire (provoquée par une variation de température, une modification d'alimentation ou une

33

injection d'hormone) quel que soit le sens de l'évolution du pool. Le pool étant préalablement enéquilibre isotopique pour l'état stationnaire considéré, la variation de sa masse renouvelable peutêtre mesurée en suivant la variation de sa radioactivité, à condition que sa RAS reste constante.Cette dernière condition est réalisée en fournissant sans interruption le précurseur à la même RASque lors de l'établissement de l'équilibre isotopique.

C - CHAMP D'APPLICATION DES ETUDES BIOCHIMIQUES

Quelle que soit la technique employée, la séparation de petites quantités de corps marquésest améliorée si l'on ajoute des corps entraîneurs. On peut ainsi augmenter le rendement d'extrac-tion d'un solvant et élever le pouvoir séparateur d'une chromatographie. De plus, la présence d'en-traîneur abaisse le taux de la désiodation qui se produit en cours d'analyse. La méthode d'équilibreisotopique est la seule qui permette de doser l'iode après l'adjonction de corps iodés entraîneurspuisque le dosage s'effectue par des mesures de radioactivité.

Associée à une technique de double marquage, la méthode d'équilibre isotopique permet d'étudierdans les meilleures conditions le renouvellement de tous les composés iodés que l'on peut isolerpar les techniques biochimiques habituelles. Le premier radioisotope étant employé pour doser l'iodeà l'équilibre isotopique, le deuxième radioisotope est utilisé comme indicateur cinétique. Les cour-bes de renouvellement sont exprimées, soit en RAS vraie si le deuxième radioisotope est injecté enune seule fois, soit en fraction renouvelée si celui-ci est utilisé pour l'établissement d'un deuxièmeéquilibre isotopique.

L'étude biochimique d'un renouvellement nécessitant le prélèvement d'échantillons biologiques,le renouvellement d'un composé donné ne peut être étudié qu'en employant plusieurs lots d'animaux.Il en résulte une certaine dispersion des points expérimentaux. La technique de double marquageproposée réduit cette dispersion à sa valeur minimum qui est fixée par la précision des mesuresde radioactivité. D'une part, la mesure systématique des quantités d'iode renouvelables, pour tousles lots servant à l'établissement d'une courbe de renouvellement, permet de comparer exactementles quantités de 131I mesurées pour chaque lot. D'autre part, même dans le cas d'une désiodationimportante en cours d'analyse et variable d'uxi lot à l'autre, la RAS du corps considéré n'est pasmodifiée.

34

DEUXIÈME PARTIE

RENOUVELLEMENT ET RÉPARTITION DE L'IODE

ENTRE SES PRINCIPAUX COMPARTIMENTS

PREMIER CHAPITRE

RENOUVELLEMENT GLOBAL DE L'IODE DE LA THYROÏDEET DOSAGE DE L'IODE DU PLASMA

Des courbes individuelles de renouvellement peuvent être obtenues in vivo en suivant par voieexterne l'évolution ::e la radioactivité y émise par la glande au cours du renouvellement de l'iodequ'elle contient.

D'autre part, à l'équilibre isotopique tous les pools d'iode de l'organisme sont à la même RASque l'iode e la boisson. On peut donc doser l'iode qu'ils contiennent en mesurant leur radioactivitéet en rapj/ortant celle-ci à la RAS d'un échantillon de boisson. Cette mesure peut être faite notam-ment pour l'iodure et pour l'iode organique du plasma, en les séparant au préalable.

A - RENOUVELLEMENT DE L'IODE DE LA THYROÏDE

I - Techniques.

Deux groupes de rats adaptés respectivement à un apport constant de 5 \ig d'iode par jour(groupe 5) et de 50 ng d'iode par jour (groupe 50) reçoivent une boisson marquée par 131I à la RASde départ de 0,2 (jC/(j,g pour le groupe 5 et 0,12 |iC/ug pour le groupe 50.

Le renouvellement de l'iode de la thyroïde est suivi pendant 35 jours in vivo en plaçant chaqueanimal en position fixe vis-à-vis d'un détecteur Y collimaté selon le schéma de la figure 3, grâceà un appareil de contention en plexiglas qui immobilise l'animal allongé, le cou en extension, en luilaissant la respiration libre. Les mesures sont faites sur des animaux non anesthésiés que l'onhabitue, quelques jours avant le début des mesures, à entrer quotidiennement dans l'appareil sanscontrainte et à subir tranquillement la contention pendant la durée des mesures. Chaque mesure esteffectuée à une heure fixe de la journée et dure 4 minutes. Elle est encadrée par deux sériesde deux mesures d'un échantillon standard de 131I. Les mesures de radioactivité de l'échantillonstandard servent de base au calcul des quantités d'iode qui ont subi le renouvellement. Elles serventégalement au contrôle de la stabilité de l'ensemble de détection.

Pour les conditions géométriques de détection décrites dans la figure 3, le rendement de dé-tection est de 0, 5 % (1 nC ~ 1. 101* cpm). La durée des mesures est suffisante pour obtenir uneprécision statistique de 0,6 % le premier jour et de 1 % le trente cinquième jour. Dans ces condi-tions les quantités d'iode sont calculées avec une précision meilleure que 2 % pour le trente cin-quième jour.

II - Courbe de renouvellement.

En rapportant chaque mesure de radioactivité à celle d'un échantillon de boisson mesurée dansles mêmes conditions, on peut tracer la courbe de renouvellement en quantité d'iode renouvelêe(|ig).Un exemple en est donné par la figure 4.

Soit Qt la quantité d'iode renouvelée au temps t. La fonction de renouvellement est donnéepar la relation :

Qt = Q.q - [Q.q - Qoi exp. (- at) [ l ]

dans laquelle Q , q (\ig) représente la totalité de l'iode renouvelable mesuré à l'équilibre isotopique,Qo ( Hfi) e s t u n e valeur expérimentale obtenue par extrapolation au temps zéro, a (j~x) est la cons-tante de renouvellement.

35

.0=29

CRISTAL0 = 53

PM

PROTECTIONOE PLOMB

Figure 3 - Schéma du détecteur Y collimaté utilisé pour étudier in vivo le renouvellement de l'iode de la thy-roïde chez le rat (cotes en millimètres).

Pour chaque mesure, le rat est maintenu en position fixe de telle façon que sa thyroïde soit centrée surl'entrée du collimateur (0 =29). Dans les conditions géométriques de ce schéma, le rendement de détectionoour 131I est de 0,5 % (1 \iC ~ 1. 10H cpm).

1,5-

1,0-

0,5-1 r

Ot

THYROÏDE 0t = 20,8-19,4 exp (-0,0610

-10

- 010 20 30 JOURS

Figure 4 - Courbe de renouvellement de l'iode de la thyroïde obtenue in vivo pour un rat adapté à un apportquotidien de 50 ug d'iode par jour.

36

Tableau HI

Cinétique du renouvellement de l'iode de la thyroïde chez des ratsrecevant 5 ng d'iode par jour

Expérience

A

B

Animalno.

1

2

3

4

5

Moyenne± déviationstandard

6

7

8

9

10

Moyenne± déviationstandard

10,0

15,5

11,0

10,0

13,5

12,0

± 2,4

15,0

17,0

17,0

12,0

14,0

15,0

± 2,1

Qo iv-ë)

0 ,2

0,7

0,1

0 ,3

0 .2

0 ,3

± 0 , 2

0,9

0 .4

0 ,4

1.3

0,8

0,76

± 0 , 3 8

a (jour-1)

0,108

0,053

0,090

0,074

0,073

0,080

±0,026

0,072

0,078

0,073

0,086

0,083

0,078

±0,006

Tableau IV

Cinétique du renouvellement de l'iode de la thyroïde chez des ratsrecevant 50 |ig d'iode par jour

Expérience

A

B

Animalno.

1

2

3

4

5

Moyenne± déviation

standard

6

7

8

9

10

Moyenne± déviation

standard

Qe, (Hg>

12,3

20,8

17,0

18,1

16,6

17,0

± 3,1

23,7

31.4

24,3

27,0

29,0

27,1

± 3 , 2

Qo (Hg)

1,35

1,35

1,80

1,10

1,10

1,34

±0,29

2,75

3,20

3,30

2,20

2,20

2.73

±0,53

a (jour"1)

0,0695

0,0695

0,070

0,077

0,101

0,077

±0,013

0,086

0,093

0,082

0,076

0,088

0,085

±0.006

37

A la valeur Qo près, dont la signification sera discutée plus loin, la relation qui décrit lacourbe de renouvellement est une fonction exponentielle à terme unique. La valeur du pool renou-velable Q t , est mesurée à l'équilibre isotopique. La constante de renouvellement a se calcule dela façon suivante :

De la relation (1) on tire :

at = In (Q#q - Qt } - In (Qeq - Qo)

d'où

En passant en coordonnées semi-logarithmiques décimales, on mesure un décrément logarith-mique

à partir duquel on calcule la constante a par la relation

a = 2,3 d

La valeur Qo est obtenue par extrapolation au temps zéro.

Les résultats de cette analyse sont groupés dans les tableaux III et IV.

B - DOSAGE DE L'IODE PLASMATIQUE A L'EQUILIBRE ISOTOPIQUE

I - Techniques.

A l'équilibre isotopique, les animaux sont tués par saignée au coeur sous légère anesthésieà l'éther. Le sang est recueilli sur héparine et centrifugé. Le plasma est pesé puis précipité parl'acide trichloracétique en présence d'entraîneurs. A un échantillon de 3 g de plasma sont ajoutésles entraîneurs (10 mg IK, 100 (ig T,», T3, DIT et MIT). Le mélange est précipité par un volumeégal d'acide trichloracétique froid à 10 %. Le précipité est décanté et lavé deux fois par le mêmevolume d'acide trichloracétique à 5 %.

La radioactivité de l'iode organique (PBI) est mesurée sur le précipité. Celle de l'iodure esten principe mesurée sur le surnageant. Toutefois, le volume du surnageant étant trop importantpour que sa radioactivité soit détectée avec la même efficacité que celle du précipité, la radio-activité du pl&dma est mesurée avant la précipitation et celle du surnageant est calculée pardifférence.

Les mesures de radioactivité sont effectuées avec un scintillateury à cristal creux et comparéesà celle d'un échantillon témoin de boisson. Le rendement de détection est de 27 % (1 |iC ~ 6. 105 cpm)avec un mouvement propre (MP) de 12 cpm. Dans ces conditions la précision des mesures est de3 % pour le plasma et de 5 % pour le PBI. Les concentrations en iode de ces deux types d'échan-tillon sont calculées avec la même précision.

II - Concentration de l'iodure et de l'iode organique du plasma.

Les concentrations en iode de l'iodure et du PBI calculées à l'équilibre isotopique sont don-nées dans les Tableaux V et VI. On peut noter que les concentrations de l'iodure plasmatique desdeux groupes conservent entre elles approximativement le même rapport que les quantités d'iodeingérées quotidiennement par chaque animal.

38

Tableau V

Dosage de l'iode du plasma à l'équilibre isotopique chez des rats recevant5 (ig d'iode par jour

Expérience

A

B

Animalno.

1

2

3

4

5

Moyenne1 déviation

standard

6

7

8

9

10

Moyenne± déviation

standard

Iode organique

ni(ig i/xnl

21,9

21,5

21,5

19,4

17,1

20.1

±2,0

21,2

16.1

20,2

21,5

18,7

19,5

±2,2

%

50

61

46

45

53

51

± 6,4

47 .

37

52

50

50

47

± 6

Iodure

m(ig i/ml

22,1

13,9

25,0

23,8

14,8

19,8

±5,2

23,8

27,5

18,4

21,5

18,8

22,0

± 3 , 8

%

50

39

54

55

47

49

±6,4

53

63

48

50

50

53

±6

Tableau VI

Dosage de l'iode du .plasma à l'équilibre i.^otopique chez des rats recevant50 (ig d'iode par jour

Expérience

A

B

Animalno.

1

2

3

4

5

Moyenne± déviation

standard

6

7

8

9

10

Moyenne± déviation

standard

Iode organique

m\ig i/ml

37,0

31,4

38,4

33,8

34,0

34,9±2,8

29,7

33,0

31,3

31,5

33,0

31,7±1,4

%

19

12

17

17

17

17± 2,6

9

8

8

11

10

9±1,3

Iodure

m [ig i/ml

162

225

188,5

167

165

181,5± 26,6

288

377

374

263

301

321±52

%

81

88

83

83

83

83

± 2 , 6

91

92

92

89

90

91± 1 , 3

Tableau VII

è

Groupe

5

50

Date

13. VI. 57

26. IX. 57

18. X. 57

14. XL 57

2. XII. 57

24. IX. 58

3. XL 61

13.1. 62

23. m . 62

18. VII. 62

14.1. 63

18. IV. 63

26. IX. 57

18. X. 57

14. XI. 57

2. XII. 57

24. IX. 58

3. XI. 61

13.1. 62

23. in. 62

18. VIL 62

7. XL 62

18. IV. 63

Nombrede

Hats

5

5

5

5

5

5

5

5

3

22

14

27

5

5

5

5

5

5

5

5

26

25

24

Radioisotope

131I

131I131I

I3ij

13h131I131I131IU 5 I125I125I

"h

1311

131I

131I

131I

131I

131I

i3i!

125J

12h

125I

Techniqu

fi dministrationInjections

quotidiennes

boissonboissonboissonboissonboissonboissonboissonboissonboissonboissonboisson

boissonboissonboissonboissonboissonboissonboissonboissonboissonboissonboisson

es

Durée (jour)

35

35

33

35

35

35

35

34

81

50

50

50

35

33

35

35

35

35

34

81

50

50

50

Mesure

in vivo

in vivoin vivoin vivoin vivoin vivoin vitroin vitroin vitroin vitroin vitroin vitro

in vivoin vivoin vivoin vivoin vivoin vitroin vitroin vitroin vitroin vitroin vitro

Thyroïdete g I)

12.8 ± 2,1

12,0 ± 2,4

15.2 ± 2,6

15,0 ± 2 , 1

12,0 ± 2.4

15,0 ± 2,4

6,9 ± 0 , 9

10,6 ± 1 , 8

14,4 ± 2 , 3

10,5 ± 2 , 1

10,7 ± 1,8

9,2 ± 1.3

17,0 ± 3,1

18,6 ± 3 , 1

27,1 ± 3 , 2

18,1 ± 2,1

29,4 ± 4 , 2

10,6 ± 1 , 3

20,8 ± 2 , 7

19,3 ± 2 , 6

15,9 ± 2 , 3

16,9 ± 1 , 2

15,7 ± 3,0

PlasmaPBI

(m\ig 1/ml)

21,6 ± 2,3

20,1 ± 2.0

19,5 ± 2 , 2

23.4 ± 3 , 4

23,2 ± 2 , 0

24,7 ± 2 , 8

34,9 ± 2 , 8

31,7 ± 1,4

26,0 ± 5 , 2

34,0 ± 2 , 4

33,7 ± 1,7

C - DISCUSSION

L'étude in otvo du renouvellement de l'iode de la thyroïde conduit à la mesure de deux pools :un pool à renouvellement lent (Q eq - Q,) dont la vitesse de renouvellement est la même pour lesdeux groupes ; un pool à renouvellement rapide (Qo) dont la vitesse de renouvellement est trop grandepour être mesurée dans les conditions décrites ci-dessus. Le pool Qo peut avoir deux origines. Ilpeut représenter une fraction de l'iode de la thyroïde se renouvelant rapidement. Il peut aussi re-présenter une certaine quantité d'iode extrathyroîdienne "vue" par le détecteur dans les conditionsde collimation adoptées. Dans le but de connaître la signification du pool Qo, une expérience complé-mentaire a été faite avec 26 animaux répartis en nombre égal entre le groupe 5 et le groupe 50.Des mesures de radioactivité ont été réalisées dans lea mêmes conditions géométriques de détectionavant et après ablation de la thyroïde. Le rapport de la deuxième mesure à la première, pour lemême animal, rend compte de la participation de la radioactivité extrathyroîdienne aux mesuresréalisées in vivo.

Pour les rats du groupe 5, la radioactivité extrathyroîdienne est équivalente au pool Qo. Lavaleur réelle du pool d'iode thyroïdien est donc bien celle qui est calculée par l'expression (Qeq - Qo).Par contre, pour les rats du groupe 50, la radioactivité extrathyroîdienne n'est équivalente qu'àla moitié environ du pool Q,. La valeur du pool à renouvellement lent (Q #q - Q,, ) ne représentedonc dans ce groupe qu'une fraction de l'iode total de la glande.

En ne tenant compte que du taux unique de renouvellement mesuré (O.OB.j"1), un délai de35 jours correspond à 4 périodes biologiques de renouvellement. La quantité d'iode mesurée après35 jours de renouvellement ne représente donc en fait que 94 % de la valeur réelle.

Dans le tableau VII, un bilan général a été dressé pour le dosage de l'iode total de la thyroïdeet de l'iode du PBI. Sur les 23 expériences citées, 5 donnent des résultats de dosage pour la thy-roïde qui s'écartent significativement de l'ensemble des résultats. Cet écart est inexpliqué et ne seretrouve pas pour le dosage du PBI.

La précision du dosage de l'iode organique du plasma (PBI) est limitée par l'efficacité aveclaquelle l'iodure peut être extrait par l'acide trichloracétique. Ceci est particulièrement importantpour le groupe 50 où la concentration du PBI est plus grande que celle du groupe 5. Comme l'iodurea lui-même une concentration environ 10 fois plus forte dans ce groupe, une extraction incomplètepourrait rendre compte de l'augmentation de concentration du PBI du groupe 50 vis-à-vis du groupe 5.Pour améliorer le rendement d'extraction de l'iodure on peut opérer en présence d'entraîneur, ceque permet la méthode d'équilibre isotopique. Une expérience de contrôle a été réalisée à cet effeten comparant l'extraction de l'iodure de deux séries d'échantillons du même plasma en absence ouen présence d'entraîneur iodure. Sans entraîneur, le rendement d'extraction est de 92,7 % ; avecentraîneur, 99,9 % de l'iodure sont extraits. La contamination du PBI par l'iodure est donc de 1 %od'une quantité environ 10 fois plus grande soit 1 %. Cette faible erreur systématique ne peut pasrendre compte de la plus forte concentration du PBI mesuré pour le plasma du groupe 50 vis-à-visdu groupe 5.

41

DEUXIÈME CHAPITRE

SÉCRÉTION THYROÏDIENNE ET RENOUVELLEMENTDE L'IODE ORGANIQUE EXTRATHYROIDIEN

La fonction de la thyroïde est de sécréter des hormones. H est donc essentiel de pouvoirmesurer la valeur de cette sécrétion. Différentes techniques ont été proposées dont certaines ontété employées chez l'homme,

A - SECRETION THYROÏDIENNE

I - Estimation par les méthodes classiques.

En 1943, Dempsey et Astwood (27) estiment la sécrétion de TH par la thyroïde chez le rat,en maintenant des animaux sous l'action du thiouracile et en déterminant la quantité minimum de T,,exogène nécessaire pour éviter le goitre. Par cette technique la sécrétion est jugée équivalente à5, 2 jig de TH par jour.

Une autre méthode d'estimation de la sécrétion de TH est née de l'emploi du radioiode 131Icomme traceur. La fixation de radioactivité par la glande ayant atteint son maximum, on suit in vivola perte de radioactivité par la thyroïde par comptage externe. La quantité minimum de T, exogènenécessaire pour annuler cette perte est prise comme indice de la sécrétion endogène. L'estimationde la sécrétion chez le rat est variable selon Hs auteurs. Pour Perry (86) elle est de 10 ug deT, par jour ; pour Albert (1) elle représente 2,5 (ig de TH par jour ; pour Reineke et Singh (98)elle vaut 2,56 \xg de TH par jour pour 100 g de poids corporel.

Chez l'homme euthyroldien, par injection de T, - (131I), Tubiana (146) a calculé que le fluxde renouvellement du pool "hormone extrathyroîdienne" équivaut à 250 \xg de T par jour. Par lamême méthode, Hamolski et al (41) estiment la sécrétion à 119 ng de T, par jour. L'étude de ladécharge de radioactivité par la thyroïde, en bloquant la réutilisation de l'iodure par le méthimazol,a conduit Berson et Yalow (9) et Nodine et al (83) a estimé cette sécrétion à 77 - 125 \ig et 56 u gde Ti, par jour, respectivement. Riggs (101) propose une valeur moyenne de 70 [ig de T, par jourchez l'homme euthyroîdien.

Toutes ces méthodes indirectes ou pharmacologiques ne donnent que des résultats approximatifs.La méthode d'équilibre isotopique, dans la limite de sa validité, permet d'effectuer une mesure di-recte de la sécrétion thyroïdienne.

II - Estimation par la méthode d'équilibre isotopique.

Contrairement aux auteurs précédents, nous ne parlerons pas de sécrétion hormonale mais desécrétion d'iode organique, nous réservant d'étudier ultérieurement la nature de cette sécrétion.

A l'équilibre isotopique, nous mesurons le pool d'iode de la thyroïde Q qui se renouvelle àun taux constant a. En état stationnaire le produit Q x a mesure le flux de renouvellement qui re-présente le flux de sécrétion d'iode de la glande.

Comme nous l'avons vu dans le chapitre précédent, le pool Q est égal à la quantité ( Q „, - Qo)déterminée in vivo pour le groupe 5. La sécrétion d'iode organique par la thyroïde des rats de cegroupe est mesurée exactement par le produit a ( Q „ - Qo ) •

L e s résultats de ce calcul sont portésdans le tableau VIII. Pour le groupe 50, la quantité (Q.,° - Qo) qui se renouvelle au taux a ne re-présente qu'une partie de l'iode renouvelable de la glande. La sécrétion correspondante calculéepar l'expression a (Qeq - Qo) n'est donc donnée qu'à titre indicatif dans le tableau IX. Sa valeursera discutée ultérieurement.

42

Tableau VIII

Calcul de la valeur exacte de la sécrétion d'iodechez des rats recevant 5 [ig d'iode par jour

Expérience

A

B

Animalno.

1

2

3

4

5

Moyenne± déviationstandard

6

7

8

9

10

Moyenne± déviationstandard

Sécrétion(Hg i/jour)

1,06

0,785

0.98

0.72

0.97

0.90

±0.14

1.01

1.29

1.21

0,92

1.00

1,09

±0,16

Tableau IX

Calcul de la valeur approchée de la sécrétion d'iodechez des rats recevant 50|ig d'iode par jour

Expérience

A

B

Animalno.

1

2

3

4

5

Moyenne± déviation

standard

6

7

8

9

10

Moyenne± déviation

standard

Sécrétion(Hg 1/jour)

0,76

1.35

1,06

1.31

1.56

1.21

±0.31

1.81

2.62

1.72

1.90

2.38

2,09

±0,39

43

B - RENOUVELLEMENT DU POOL IODE ORGANIQUE EXTRATHYROIDIEN .

I - Sécrétion thyroïdienne et pool extra thyroïdien d'iode organique (PBI).

Myant et Pochin (80) ont montré que chez l'homme, 6 heures après l'injection intraveineuse deT, - (131I), l'équilibre de radioactivité par diffusion entre le plasma et les espaces extravasculairesétait réalisé. On peut donc considérer que l'ensemble de ces deux compartiments constitue un seulet même pool vis-à-vis de la sécrétion thyroïdienne. Par ailleurs, Sterling et al (128) et Bersonet Yalow (9) ont estimé l'espace de distribution de l'iode organique extrathyroîdien à 12 - 15 % dupoids du corps.

En tenant compte des concentrations en iode du PBI que nous avons mesurées chez nos animauxqui pè>.tut en moyenne 300 g, cet espace de distribution représente au maximum un pool d'iodeorganiq;. •• extrathyrofdien de 0,9 |i g d'iode pour le groupe 5 et de 1,6 p. g d'iode pour le groupe50. Les sécrétions d'iode organique calculées sont donc suffisantes pour assurer en 24 heures lerenouvrvK.ment total de ce pool extrathyroî'dien. Par conséquent, l'iode du PBI doit avoir la mêmeRAS qut son précurseur thyroïdien.

II - Etude simultanée du renouvellement de l'iode organique du plasma (PBI) et de l'iode dela thyroïde.

1) Techniques.

A sept intervalles de temps choisis, d'une durée totale de 35 jours, la radioactivité fixée parla thyroïde est mesurée in vivo selon la technique déjà décrite (1er chapitre). Immédiatement aprèschaque mesure, une prise de sang est effectuée sur chaque rat par voie rétro-orbitaire sous légèreanesthésie à l'éther. De 300 à 500 mg de sang sont ainsi recueillis en présence d'héparine. Leséchantillons de plasma correspondants (200-300 mg) sont traités en présence d'entraîneurs (1 mg IK,50 (igTH, T3, DIT et MIT) selon la technique déjà décrite (1er chapitre). Entre le 1er et le dernierjour, les mesures de radioactivité sont faites avec une précision de 4 à 2 % pour le plasma et de8 à 5 % pour le précipité. Les concentrations en iode renouvelé de l'iodure et du PBI sont calculéesavec la même précision.

2) Résultats.

Une courbe de renouvellement de l'iode organique plasmatique (PBI) peut être tracée. Soit C t

la concentration de l'iode du PBI renouvelé au temps t. Cette courbe est décrite par la relation :

Ct= C e , [1 - exp (- Kt)]

dans laquelle :

C«, (m \xg 1/ml) est la concentration du PBI,

K (j"1) est la constante de renouvellement de ce pool.

L'analyse de cette courbe en coordonnées semi-logarithmiques nous permet de mesurer laconstante K (figures 5 et 6). Les résultats sont présentés dans les tableaux X et XI. Pour lesrats du groupe 5, la RAS du PBI évolue à la même vitesse que celle de l'iode de la thyroïde(tableaux III et X). Pour les rats du groupe 50, la RAS du PBI s'élève en fonction du temps environ2 fois plus vite que celle de l'iode de la glande (tableaux IV et XI).

Nous pouvons préciser ces observations en calculant pour chaque temps t le rapport des RASdu PBI et de la thyroïde par l'expression :

Ct / Q t - Q.C , / Q.,- Qo

et en étudiant l'équation de la droite de régression décrivant l'évolution de ce rapport en fonctiondu temps.

Deux exemples de droites de régression sont donnés dans la figure 7. Les équations de cesdroites, les coefficients de corrélation et leur degré de signification (123) sont rassemblés dansles tableaux XII et XIII.

Pour le groupe 5, huit droites de régression sur dix ne sont pas significativement distinctesd'une horizontale au seuil de probabilité p = 0,05. Les RAS de l'iode sécrété et de l'iode de la

44

N^

Jogio iC«i-

1,5-

Qt

THYROÏDE Qt = 17-16 exp (-0,073;).20

30 JOURS

PBI Ct = 2 5 - [ i - exp (-0,063 O]

Ct

-20

-10

- 030 JOURS

I/ml

Figure 5 - Etude simultanée in vivo du -cnouvellement de l'iode de lathyroïde et de l'iode organique plasmatique (PBI) chez un rat adapté àrecevoir 5 |ig d'iode par jour.

2,0:

1,0-

o,oJ

1,0-

o,oJ

THYROÏDE Qt = 31 - 27 exp C-

10 20

PBI Ct - 36 [ i - exp (- 0,1621

Qt >ig I

-40

.20

*. L030 JOURS

m)ig l/ml

-40

-20

30 JOURS

Figure 6 - Etude simultanée in uivo du renouvellement de l'iode de lathyroïde et de l'iode organique plasmatique (PBI) chez un rat adapté àrecevoir 50 u.g d'iode par jour.

Tableau X

Cinétique du renouvellement de l'iode organique plasmatique (PBI)chez des rats recevant 5 |i g d'iode par jour

Expérience

C

D

Animalno.

1

2

3

4

5

Moyenne± déviation

standard

6

7

8

9

10

Moyenne± déviation

standard

C-.,(m ug I/ml)

24

28

25

20

?Q

23.4

i 3 . 4

25

21

25

24

21

23.2

±2.0

K(jour-3)

0.068

0,039

0,044

0,105

0,055

0,062

±0,021

0,077

0.088

0.063

0.093

0.085

0,081

±0,011

Tableau XI

Cinétique du renouvellement de l'iode organique plasmatique (PBI)chez des rats recevant 50 n g d'iode par jour

Expérience

C

D

Animalno.

1

2

3

4

5

Moyenne± déviation

standard

6

7

8

9

10

Moyenne± déviation

standard

c.,{m u.g I/ml)

30

24

21

22

33

26

±5,2

30

34

35

32

36

34

± 2,4

K(jour"1)

0,082

0,137

0,174

0,125

0,091

0,122

±0,037

0,195

0.177

0,165

0,172

0,162

0,174

±0,013

46

y = Çt_ / Qt-QoCeq / Oaa-Oo

2,0-

1,0-

0,0J

/ = -0,0341/ + 1,790

o

= 0,0027 x + 0,984

10 20 30X (JOURS)

Figure 7 - Exemples de droites de régression calculées pour l'évolution en fonction du temps (x) du rapportde RAS (y) entre le PBI et l'iode de la thyroïde mesuré In vivo, pour un rat du groupe 5 (O) et pour unrat du groupe 50 (•).

glande sont donc équivalentes à chaque instant. L'iode sécrété par la thyrorde se renouvelle à lamême vitesse que l'iode de la glande pour des rats adaptés à recevoir 5 |ig d'iode par jour.

Pour le groupe 50, neuf droites de régression sur dix ont une pente négative significative auseuil de probabilité p = 0,05. La valeur moyenne de l'origine des droites de régression est de l'ordrede 2. L'iode sécrété par la thyroïde se renouvelle donc environ deux fois plus vite que l'iode dupool mesuré in vivo pour cette glande chez des rats adaptés à recevoir 50 \xg d'iode par jour.

C - DISCUSSION

La valeur de la sécrétion d'iode par la thyroïde, calculée tn vivo, est obtenue sans ambiguïtépour les rats du groupe 5. Le calcul fournit une valeur moyenne de 1 |ig d'iode par jour, ce quicorrespondrait à 2 |ig de T, environ si la totalité de l'iode sécrété était de nature hormonale.Dans la mesure où les animaux sont en tous points comparables d'un auteur à l'autre, l'évaluationde la sécrétion thyroïdienne par la méthode de Perry conduit vraisemblablement à une surestimation.

Le calcul de la sécrétion thyroïdienne pour les rats du groupe 50 ne peut fournir qu'une va-leur approchée du fait que la mesure du pool à renouvellement rapide Qo n'est pas due entièrement àcelle de la radioactivité extrathyroi'dienne. Nous préciserons l'existence de ce pool thyroïdien àrenouvellement rapide dans le troisième chapitre.

La vitesse de renouvellement de l'iode sécrété par la thyroïde des rats du groupe 50 est en-viron deux fois plus grande que celle que l'on peut mesurer in vivo pour l'iode de la glande.Ce résultat peut être rapproché de celui obtenu chez le rat après injection de perchlorate parTriantaphyllidis et coll. (145). Une vitesse de renouvellement pour l'iode sécrété, supérieure à lavitesse mesurée pour le pool thyroïdien (Qei) - Qo), implique donc que celui-ci n'est pas le pré-curseur unique de la sécrétion ou bien que l'iode de ce pool n'est pas renouvelé uniformément.

L'ensemble de ces observations traduit pour le groupe 50 une hétérogénéité fonctionnelle de lathyroïde dont les modalités restent à préciser et qui s'oppose à l'homogénéité fonctionnelle de laglande des rats du groupe 5.

47

Tableau XII

Evolution en fonction du temps (x) du rapport (y) de la RAS de l'iodeorganique sécrété par la thyroïde à celle de l'iode total de cette glande chez des

rats recevant 5 \i g d'iode par jour

Expérience

C

D

Animalno.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Droite de régression

y = 0,00655 x + 0,695

y = 0.00747 x +0,864

y = 0,01285 x + 0.465

y = -0.00173 x+ 1,125

y = 0.00740 x +0,727

y = 0,00272 x +0,984

y = -0,00712 x + 1,178

y = 0,00306 x +0,943

y = -0.00556 x+ 1,128

y = -0,00980 x+ 1,342

Coefficient de corrélation

0.297

0.721

0,948

0,185

0,504

0,136

0,575

0,284

0,321

0,426

Degré de signification

P > 0,1

0,05 > p > 0,002

p v 0,001

P > 0,1

p > 0,1

p > 0,1

p > 0.1

P > 0, 1

p > 0,1

p > 0. 1

Tableau XIII

Evolution en fonction du temps (x) du rapport (y) de la RAS de l'iodeorganique sécrété par la thyroïde à celle de l'iode mesuré in vivo pour cette glande

chez des rats recevant 50 |i g d'iode par jour

Expérience

C

D

Animalno.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Droite de régression

y =

y =

y =

y =

y =

y =

y =

y =

y =

y =

-0,0470 x +1,705

-0,0617 x + 2, 065

-0,0840 x + 2, 150

-0,0615 x + 2,365

-0,0073 x + 1,055

-0,0658 x + 2, 417

-0,0389 x +1,941

-0,0933 x + 2, 970

-0.0370 x+ 1,972

-0,0341 x+ 1,790

Coefficient de corrélation

0,917

0,814

0,864

0,987

0,226

0,786

0,703

0,748

0,842

0,833

Degré de

P <

0,02 >

0,01 >

P <

P >

0,05 >

0,05 >

0,05 >

0,01 >

0,02 >

signification

0,001

p > 0,01

p > 0,001

0,001

0 , 1

p > 0,02

p > 0,02

p > 0,02

p > 0,001

p > 0,01

48

TROISIÈME CHAPITRE

HÉTÉROGÉNÉITÉ FONCTIONNELLE DE LA THYROÏDE

L'hétérogénéité fonctionnelle de la thyroïde traduit le fait que l'iode qu'elle contient représenteun système métabolique constitué de plusieurs pools se renouvelant chacun à sa vitesse propre.

Cette hétérogénéité a été décrite tant à l'échelle de la vésicule thyroïdienne (31) (81) (145)qu'à l'échelle de la molécule de thyroglobuline (46).

En faisant abstraction de toute idée spatiale, nous avons étudié l'hétérogénéité fonctionnelle dela thyroïde du rat, en séparant ses deux principaux compartiments : iodure et iode organique.

A - RENOUVELLEMENT DE L'IODURE ET DE L'IODE ORGANIQUE TOTAL DE LA THYROÏDE

I - Principe.

On peut mesurer les vitesses réelles de renouvellement de ces deux pools d'iode par une tech-nique de double équilibre isotopique (117). Les animaux étant en équilibre isotopique avec 125I et cetéquilibre isotopique étant maintenu, le renouvellement est suivi au cours de l'établissement d'undeuxième équilibre isotopique avec 131L Le pool d'iodure est séparé du pool d'iode organique parélectrophorèse sur papier, à partir d'un broyât de thyro'Ide. Pour chaque pool, les mesures deradioactivité en " ' i permettent de calculer les quantités d'iode renouvelables,et celles de radio-activité en W1I la quantité renouvelée pour un temps donné.

II - Techniques.

Deux groupes de 22 et 26 ra ts , adaptés à recevoir respectivement 5 (ig (groupe 5) et 50 ngd'iode par jour (groupe 50), sont mis en équilibre isotopique avec une boisson marquée par U 5 I quileur est fournie à la RAS de départ de 0,15 |iC/(ig pour le groupe 5 et 0,10 \x C/|ig pour le groupe50. Au bout de 50 jours, la même boisson est marquée par 131I. Les animaux de chaque groupesont sacrifiés par lots de ? à 4 rats au bout d'un temps allant de 1 à 21 jours après le début del'administration de 1J1L La RAS de départ en 131I de la boisson est d'autant plus faible que le délaide renouvellement prévu avec 131I est plus long. Pour le groupe 5, cette RAS est de 1,33 [iC/\igpour un délai de 1 jour et de 0, 20 |iC/ U-g pour un délai de 21 jours. Pour le groupe 50, la RASvarie de 0,67 à 0,10 ^iC/u,g pour les mêmes délais.

Les glandes sont traitées individuellement. A la fin du délai choisi, chaque animal est tué parsaignée au coeur, sous légère anesthésie à l'éther. Sa thyroïde est prélevée et maintenue à - 10° Cjusqu'au moment de l'électrophorèse. Elle est homogénéisée avec 0,1 ml d'eau bidistillée, dans unbroyeur en verre. Une électrophorèse sur papier Arches 302 est faite en double sur deux partiesaliquotes de 20 - 30 (il de l'homogénat pendant 1 h sous 150 V et 10 mA en tampon carbonate d'am-monium 0, 2 M pH 9,4 (111). L'iodure et l'iode organique ainsi séparés sont détectés par autoradio-graphie avec un film Kodirex sans écran, pendant 2 à 4 jours. Les surfaces correspondantes sontdécoupées et leurs radioactivités en I31I et en 25I sont mesurées à l'aide d'un scintillateur Y à cristalcreux, avec une précision respective de 4 % et 3,5 % pour l'iodure et de 0,6 % et 0,03 % pourl'iode organique. Le rendement de détection de 131I est de 27 % (1 ^ C ~ 6. 105 cpm) avec un MPde 12 cpm. La détection de 125I est effectuée 2 mois après celle de 131I pour diminuer l'interférencede comptage 13nl/125i au taux maximum de 1 %0. Dans ces conditions la radioactivité 12!I est mesuréeavec un rendement de 23 % (1 uC ~ 5. 105 cpm) et un MP de 2 cpm.

49

La quantité totale d'iode contenue dans chaque glande est calculée à partir de sa radioactivitéen125l, mesurée avant l'homogénéisation. La fraction qu'en représente l'iodure est calculée à partirdes mesures en 12!I de l'électrophorégramme.

in - Résultats. -

Pour les rats du groupe 5, dont la thyroïde contient 10,5 ± 2 , 1 (ig d'iode, une fraction de0,30 % ± 0,03 soit 31,6 ± 8 , 0 mjig d'iode est sous forme d'iodure. Pour les rats du groupe 50,dont la thyroïde renferme 15,9 ± 2 , 3 ng d'iode, l'iodure représente 0,45 % ± 0,01 de l'iode totalsoit 70,9 ± 23,4 mu.g d'iode.

On peut estimer la répartition de l'iodure de la thyroïde entre les vésicules et les espacesextravésiculaires en mesurant l'espace extracellulaire de la glande par son "espace sodium" (71) (77).Connaissant la concentration en iodure du plasma, on peut dès lors calculer la quantité d'iodure s i -tuée en dehors des vésicules. L'espace sodium, mesuré sur 11 thyroïdes de rats témoins ayant re -çu 10 jxC de 2*Na 1 heure avant le sacrifice, représente 31 % ± 2 , 3 du poids de la glande. La frac-tion d'iodure correspondante équivaut à 0,6 % pour le groupe 5 et 14 % pour le groupe 50 de laquantité d'iodure mesurée. On peut donc conclure que l'iodure mesuré dans nos conditions expéri-mentales provient à peu près uniquement des vésicules.

Au temps t pour chaque pool iodure ou iode organique isolé, la fraction renouvelée F (t) estégale au rapport de la quantité d'iode renouvelée (mesurée par 131I) à la quantité d'iode renouvelable(mesurée par 125I). Les courbes de renouvellement exprimées en fraction renouvelée sont donnéespour les deux groupes de rats dans les figures 8 et 9. En portant la fonction [1 - F (t)]en échellesemi-logarithmique, les vitesses réelles de renouvellement peuvent être mesurées comme le mon-trent les figures 10 et 11. Deux taux de renouvellement sont trouvés pour l'iodure : «i = 0,69. j " 1

et <x2 = 0,07. j " 1 . Ces deux taux sont identiques pour les deux groupes. Pour le groupe 5, l'iode

organique se comporte comme un pool homogène se renouvelant au taux unique |3 = 0,07. j " 1 . Par

101

15 20TEMPS (JOURS)

Figure 8 - Courbes de renouvellement des deux pools thyroïdiens "iodure" et "iode organique" obtenues parune technique de double équilibre isotopique avec les radioisotopes 131I et 125I chez des rats adaptés à rece-voir 5 u.g d'iode par jour.Le pool d'iodure (O) est séparé du pool d'iode organique (•) par électrophorèse sur papier en tampon carbo-nate d'ammonium 0,2 M pH 9,4 pendant 1 h sous 150 V. et 10 mA, à partir d'une fraction aliquote de20-30 (il d'un homogénat de thyroïde. Pour chaque pool, les mesures de radioactivité en "5I permettent decalculer la quantité d'iode renouvelable et celles de radioactivité en 131I, la quantité d'iode renouvelée autemps t. Le rapport de ces deux quantités mesure la fraction renouvelée F(t).

50

UJ

tu

10 15 20TEMPS (JOURS)

Figure 9 - Courbes de renouvellement des deux pools thyroïdiens "iodure" et "iode organique" obtenues parune technique de double équilibre isotopique avec les radioisotopes 131I et "SI chez des rats adaptés à rece-voir 50 n g d'iode par jour.Mêmes symboles et mêmes conditions expérimentales que pour la Figure 8.

contre pour le groupe 50 l'iode organique de la thyroïde est hétérogène. Il est constitué de 2 poolsA et B que l'on peut distinguer par leur vitesse propre de renouvellement. Le pool A représente25 % de l'iode total et se renouvelle au taux p\ = 0,46. j " 1 . Le pool B ienferme 75 % de l'iodetotal et se renouvelle au taux p2 = 0,07. j " 1 .

IV - Discussion.

Pour les rats du groupe 50, le pool d'iode thyroïdien B a la même vitesse de renouvellementque le pool (Q,, - Qo) qui a été mesuré in vivo. Le pool A à renouvellement rapide est donc as -similable au pool Qo mesuré in vivo. On peut constater d'autre part que pour l'iode sécrété on netrouve qu'une vitesse de renouvellement dont la valeur est intermédiaire de celles des deux poolsthyroïdiens A et B. Il est donc improbable que l'un de ces deux pools soit le précurseur unique del'iode sécrété. Au sens strict, puisque les deux pools A et B participent au renouvellement del'iode sécrété, les deux taux p et P2 devraient être trouvés lorsque l'on suit le renouvellement del'iode sécrété. Mais la distinction de deux pools d'iode pour la thyroïde est basée sur un conceptformel qui simplifie t rès vraisemblablement la description du phénomène réel. Sans informationscomplémentaires sur les étapes biochimiques qui président à ce renouvellement, il est donc impos-sible de donner une description précise du renouvellement de l'iode de la glande et par là, de cal-culer une valeur réelle pour la sécrétion. On ne peut donc donner pour ce groupe qu'une valeurapprochée que l'on peut obtenir en admettant que chaque pool A et B est un précurseur de l'iodesécrété. Dans ces conditions, la thyroïde des rats du groupe 50, qui contient en moyenne 15,9 ugd'iode, sécrète environ 2,7 \ig d'iode par jour.

En ce qui concerne les rats du groupe 5, le problème est plus simple puisque l'étude du r e -nouvellement de l'iode de la glande aboutit à un seul taux de renouvellement. La valeur de ce tauxunique (O.G?.^1) confirme celle précédemment trouvée in vivo . On peut donc calculer pour ce groupela valeur réelle de la sécrétion d'iode. La thyroïde des rats du groupe 5, qui contient en moyenne10 n g d'iode, sécrète 0,70 [Xg d'iode par jour.

La sensibilité de la méthode d'équilibre isotopique nous a permis de réaliser la mesure quan-titative directe du pool iodure- de la thyroïde. La valeur que nous avons trouvée pour les rats dugroupe 5 (0,30 % de l'iode total de la glande) est du même ordre de grandeur que celle de 0,26 %qui a été calculée par Halmi et. Pitt-Rivers (39). La principale difficulté technique est l'isolement

51

de l'iodure qu'il faut séparer d'une quantité d'iode organique au moins 100 fois plus grande, elle-même susceptible de libérer de l'iodure en cours d'analyse. L'électrophorèse sur papier que nousavons employée est une technique rapide et sûre qui diminue au maximum les risques de désiodationartificielle. Elle évite d'autre part la confusion de l'iodure avec d'autres corps iodés qui ont lemême Rf que lui en chromatographïe (voir 1er chapitre - Illème Partie). Nagataki et Ingbar (82)ont d'ailleurs confirmé que cette technique était la meilleure en la comparant aux autres techniquesutilisables.

La technique de double marquage que nous avons mise au point, nous a permis d'effectuer lapremière mesure exacte de la fraction de recyclage au sein de la thyroïde.

Le renouvellement du pool iodure de la thyroïde s'effectue par deux flux : le flux de fixationd'iodure plasmatique qui est équivalent au flux de sécrétion puisque le système est en état station-naire ; le flux de recyclage que l'on se propose de mesurer. Chacun de ces deux flux est suffi-sant pour renouveler le pool iodure de la glande plusieurs fois par jour. Nous nous trouvons par con-séquent dans le même cas que pour le renouvellement du PBI à partir de l'iode sécrété. Le pooloroduit doit donc avoir la même RAS instantanée que le (ou les) pool (s) précurseur (s). Commel'iodure plasmatique et l'iode organique thyroïdien se renouvellent à des vitesses différentes, onpeut distinguer leur participation réciproque au renouvellement de l'iodure de la glande par leurstaux de renouvellement que l'on retrouve pour ce pool. Cette participation est mesurée par la frac-tion du flux total de renouvellement que l'on détermine en coordonnées semi-logarithmiques par ex-trapolation au temps zéro (figures 10 et 11).

Pour le groupe 5, le taux a2 = 0,07. j " 1 mesuré pour le pool iodure est égal au taux de renou-vellement (3 de l'iode organique de la glande. La valeur d'extrapolation correspondante F2 mesuredonc exactement la fraction du flux total qui provient de l'iode organique par recyclage. Dans cegroupe, la fraction de recyclage F2 représente 71 % du flux total de renouvellement ; la fractionde recyclage Fi n'en représente que 29 %. Le flux de recyclage vaut donc :

0.70 Jig/jour x-jpH" = 1,71 Hg/jour

Pour le groupe 50, le taux o = 0,07. j " 1 mesuré pour le pool iodure est égal au taux de re-nouvellement ^ du pool iode organique B. La fraction de recyclage correspondante représente 47 %du flux total dans ce groupe. Le flux de recyclage, correspondant à la valeur approchée du flux defixation calculée pour ce groupe, vaut donc :

2.7 ng/jour x y -^ -= 1,08 (ig/jour

La mesure de la valeur absolue du recyclage que nous avons pu effectuer par notre méthodemontre que le recyclage intrathyroîdien est plus important pour des rats qui reçoivent 5 p. g d'iodepar jour que pour des rats qui reçoivent 50 [i g d'iode par jour.

Lissitzky (62) a montré que le recyclage au sein de la thyroïde se faisait à partir des iodoty-rosines libres provenant de la protéolyse de la thyr<-,globuline. L'impossibilité de trouver pour lepool iodure un taux de renouvellement équivalent au taux ^ = 0,46.j-1 du pool iode organique Apourrait s'expliquer si les iodotyrosines du pool A participaient à la sécrétion d'iode de la glande.Cette hypothèse, quoique peu compatible avec la présence d'iodotyrosine-désiodase dans la thyroïde(113) mérite d'être vérifiée car il n'est pas exclu que les iodotyrosines soient sécrétées sous uneautre forme que la forme libre.

B - NATURE DE L'IODE ORGANIQUE SECRETE PAR LA THYROÏDE

La nature de l'iode hormonal a été naturellement étudiée en premier. Son existence dans leplasma sous forme de T (144) et de T} (38) associées aux protéines plasmatiques par des liaisonslâches (PBI) a été amplement démontrée (133) (60) (59). Ces hormones sont coprécipitables avecles protéines et extractibles par le n-butanol.

L'iode non hormonal peut exister sous forme d1 iodotyrosines et sous forme de protéines.

Des iodotyrosines libres sécrétées par la thyroïde ont été trouvées dans le plasma de certainsmalades goitreux congénitaux (126) (125) (20) présentant une déficience génétique en iodotyrosines -déshalogénases. Leur présence a également été décrite chez des sujets normaux et chez le rat nor-mal (152) (153) (6) à la suite d'expériences criticables.

En dehors de la thyroglobuline, des iodoprotéines insolubles dans le n-butanol ont été trouvées

52

1,0 -,

0,5-

ao

0,1-

10 20

0,5-

ao

0,1-

t (JOURS)

Figure 10 - Renouvellement des deux pools thyroïdiens "iodure" et "iode organique" chez des rats adaptés àrecevoir 5 p.g d'iode par jour.

Analyse graphique en coordonnées semi-logarithmiques de la fonction [l-F(t)] dans laquelle F(t) représentela fraction renouvelée pour chaque pool.

Iodure : flux de recyclage : Fi = 0,71 ; a2 = 0,07-j"1 (o-1

o).flux de fixation

Iode organique : pool unique

j= 0,29 ; ax = 0,69-f1 {• •) .

= 0,07-j"1 (• D).

ceao

t (JOURS)

ioo

Figure 11 - Renouvellement des deux pools thyroïdiens "iodure" et "iode organique" chez des rats adaptés àrecevoir 50 |ig d'iode par jour.

Analyse p ique en coordonnées semi-logarithmiques de la fonction [l-F(t)] dans laquelle F(t) représen-sente la f don renouvelée pour chaque pool.

Iodure •'m.t de recyclage : F2 = 0,47 ; oc2 = 0,07-j"1 (O O)." t de fixation : Fx = 0,53 ; cti = 0,69-j"1 (• • ) .

Iode organique : pool B : B = 0,75 ; (32 = 0,07.j"1 (• Q).pool A : A = 0,25 ; px = 0.46.J"1 (• •).

dans le plasma de certains malades, en particulier chez des individus porteurs d'un carcinomethyroïdien (107).

Le but de la présente étude est de préciser la nature de l'iode non hormonal chez le ratnormal.

I - Techniques.^>es rats du groupe 50, en équilibre isotopique avec "*I reçoivent, par lots de 5 animaux,

une injection unique de 200 |iC de 131I, de 30 minutes à 12 heures avant le sacrifice. Us sonttués par saignée au coeur, sous légère ânes thés ie à l'éther. Le sang est recueilli sur héparine etcentrifugé pour isoler le plasma. Pour un même lot, les plasmas individuels sont mélangés en vo-lumes égaux et conservés congelés (- 60° C) en ampoules scellées jusqu'à l'emploi.

Des plasmas de rats du groupe 5, étant en équilibre isotopique avec 125I mais n'ayant pasreçu d'injection de 131I, sont traités comme les plasmas des rats du groupe 50.

Deux paities aliquotes de 3 ml sont prélevées sur chaque lot de plasma et filtrées directementsur gel de Sephadex G-25 (96) selon la technique décrite par Lissitzky et colL (66).

Après gonflement dans un tampon acétate d'ammonium 0,2 M pH 5,8, le gel est versé dansune colonne en verre de 2, 5 cm de diamètre, sur une hauteur de 14 à 20 cm selon le cas. Il estarrêté au bas par un tampon de coton de verre. Sa partie supérieure est recouverte d'un disque depapier filtre qui évite la déformation de la surface du gel au moment du dépôt du plasma. L'élution estcommencée avec le tampon acétate d'ammonium dont l'écoulement est réglé par un vase de Mariotteau débit de 1 ml/mn. L'éluat est recueilli dans les tubes d'un fractionneur automatique par frac-tions de 2 ml. Les composés iodés du plasma sont élues dans l'ordre : iode organique lié aux pro-téines (PBI), iodure.et iodotyrosines (MIT et DIT) si celles-ci existent. Après le passage de la quatrevingt dixième fraction le tampon est remplacé par du ter-amylol saturé de NKU OH 2 N. Ce derniersolvant permet d'éluer les hormones thyroïdiennes libres.

L'étude qualitative et quantitative des constituants iodés du plasma est faite sur les fractions4-,

3 .

oX

MIT

T4 LIEECPBIJ DIT

—r***™^ 1 1 1 1 r0 20 40 60 80

N° FRACTIONSFigure 12 - Diagramme de filtration sur Sephadex G-2& d'un échantillon de plasma de rat additionné de corpsmarqués par I3 LLe gel est équilibré avec un tampon acétate d'ammonium 0 ,2 M (pH 5,8) et l'élution de la colonne de gel(2, 5 « 20 cm) réalisée avec le même tampon. L'éluat est recueilli par fractions de 2 ml au débit de 1 ml/mn .L'échantillon de plasma (3 ml) a été additionné de : Iodure -(131I), 5 400 cpm (sans entraîneur) ; T, -(131I),8 500 cpm (RAS = 25 uC/ ug) ; DIT -(131I), 47 200 cpm (RAS = 1 5 , 5

54

de filtration de la première partie aliquote. Les mesures de radioactivité en 12ÎI permettent decalculer la quantité d\iode "7I que représente chaque pic élue. La concentration correspondante estcalculée en tenant compte du volume du dépôt (3 ml).

Le renouvellement de l'iode organique lié aux protéines plasmatiques (PBI) et la séparation decelui-ci en deux parties extractible par le n-butanol (EB) et non extractible (NEB), sont étudiéssur le fractionnement de la deuxième partie aliquot e. Les fractions du pic PBI sont rassembléeset l'ensemble est extrait, une première fois par un volume double, puis deux fois par un volumeégal de n-butanol. Aux trois étapes d'extraction, la phase butanolique est séparée par centri-fugation. Les trois surnageants successifs sont rassemblés et portés à un volume connu dans unefiole jaugée (fraction EB). L'insoluble est mis en suspension dans l'eau et porté à un volume connudans une fiole jaugée (fraction NEB). Une partie aliquote de 2 ml est prélevée sur chacune de cesdeux fractions pour les mesures de radioactivité. La répartition de l'iode du PBI entre la fractionEB et la fraction NEB est calculée à partir des mesures de radioactivité en K5L Le renouvellementde l'iode de chaque fraction est estime par l'évolution de la RAS en fonction du temps. Celle-ci estcalculée par le rapport de la radioactivité 131I exprimée en fraction de dose injectée, à la quan-tité d'iode 127I calculée à partir des mesures de radioactivité U5L

II - Résultats.La figure 12 donne le résultat d'une filtration de contrôle effectuée sur du plasma de rat

supplémenté par un mélange de corps marqués par 131I (iodure, MIT, DIT et TH ). Les iodotyrosinessont séparées sans ambiguïté de l'iodure et de la T, liée aux protéines plasmatiques.

La figure 13 montre le diagramme de filtration d'un échantillon de plasma provenant d'un lotde rats du groupe 5, en équilibre isotopique avec 125I. Aucune radioactivité n'est détectable dansla zone d'élution de MIT et de DIT. L'absence d'iodotyrosines libres du plasma est également cons-tatée pour le groupe 50.

L'iode du PBI n'est pas extractible en totalité par le n-butanoL La fraction NEB repré-sente 7,8 ± 1,1 % du PBI pour le groupe 5 et 11,0 ± 1, 5 % pour le groupe 50.

10-,F C 73,443

ILloo

z<Or

5 -

0

HORMONESLIBRES

C5,48)

AA

20 40 100 12060 60N° FRACTIONS

Figure 13 - Diagramme de filtration sur Sephadex G-25 d'un échantillon de plasma de rat.

L'échantillon de plasma (3 ml) provient du mélange en volumes égaux des plasmas de 5 rate adaptés à unapport quotidien de 5 ug d'iode par jour et mis en équilibre isotopique avec 1Î5L La colonne de gel (2, 5 x 14 cm)est éluée dans les mêmes conditions que pour la Figure 12. Le tampon acétate d'ammonium est remplacé à la90e fraction par le ter-amylol saturé d'ammoniaque 2N (AA). Les nombres entre parenthèses indiquent lesquantités d'iode (12'l) calculées à partir des mesures de radioactivité en m L

55

12 HEURESFigure 14 - Renouvellement de l'iode organique du plasma (PBI) de 30 minutes à 12 h après l'injection d'unedose de 131I sans entraîneur, chez des rats du groupe 50 en équilibre isotopique avec \

Les échantillons de plasma sont filtrés sur Sephadex G-25. Les fractions du pic FBI sont rassemblées etextraites par le n-butanoL La forme d'iode non extractible NEB ( • ) se renouvelle plus rapidementque la forme d'iode extractible EB ( o ).

Les courbes de renouvellement des deux fractions EB et NEB pour le groupe 50 sont don-nées dans la figure 14. La fraction NEB se renouvelle beaucoup plus rapidement que la fractionEB qui contient les hormones T, et T3.

III - Discussion.

Par chromatographie sur papier et estimation de l'iode par différentes méthodes (152) (153)(6) (127) (30) un certain nombre d'auteurs notamment Werner et al. (152) (153) et Beale et Whitehead(6) ont trouvé des iodotyrosines libres dans le plasma de rats et d'êtres humains euthyroïdiei s. Dupoint de vue physiologique, ce résultat est difficile à comprendre pour les raisons suivantes :

a) L'existence de l'iodotyrosine-désiodase dans la thyroïde (113) désiodant les iodoty-rosines libres au sein de la glande rend improbable la sécrétion de celles-ci.

b) La très courte période biologique (1,5 h) de la DIT - (1J1I) injectée (124) et la pré-sence, notamment dans le foie et dans le rein, d'iodotyrosines-déshalogénases, ne sont pas compa-tibles avec l'existence d'iodotyrosines libres dans le plasma.

c) II en est de même pour l'impossibilité de trouver de la DIT - (131I) dans le plasmaaprès l'injection de T,, - (131I) marquée sur les quatre atomes d'iode (8).

Du point de vue technique, les procédés d'extraction employés par Werner et al (152) (153)et par Beale et Whitehead (6) peuvent provoquer des dégradations qui pourraient porter, eoit surles hormones (TH et Tj) dont le pont diphényl-éther serait rompu, soit sur des constituants conte-nant MIT et (ou) DIT qui libéreraient leurs iodotyrosines pendant l'extraction.

56

La filtration du plasma sur Sephadex est une technique douce, directe et relativement rapidequi diminue au maximum les possibilités de dégradation des constituants iodés plasmatiques. Associéeà la méthode d'équilibre isotopique, cette technique permet, en filtrant 3 ml de plasma, de doserl'iode de chaque constituant isolé avec une sensibilité de 0,0003 |ig d'iode par mL On peut doncaffirmer que dans nos conditions expérimentales, les iodotyrosines libres sont absentes du plasmachez le rat normal.

Chez le rat, Pitt-Rivers et Rail (92) ont également conclu à l'absence des iodotyrosines libresdu plasma, en utilisant une variante de la méthode d'équilibre isotopique et en séparant les consti-tuants du plasma par chromatographie sur résine échangeuse d'anions.

Chez l'homme, Wellby et Hetzel (151) ont tiré la même conclusion pour des individus euthy-roïdiens en utilisant la chromatographie sur résine échangeuse d'anions et sur papier pour frac-tionner le plasma.

L'existence d'une partie du PBI insoluble dans le n-butanol est connue depuis longtemps (26)et est généralement estimée à moins de 10 % de la radioactivité totale du PBI 48 h après l'injec-tion du traceur. Toutefois, l'absence de dosage systématique d'iode 127I n'a pas permis jusqu'alorsd'estimer la vitesse de renouvellement de cette fraction NEB. Or son importance réside justementdans sa vitesse de renouvellement qui est supérieure à celle des hormones de la fraction EB et dumême ordre de grandeur que celles des iodotyrosines libres de la thyroïde (voir nième Partie).Pour des rats adaptés à recevoir 50 n g d'iode par jour, la RAS de la fraction NEB passe par unevaleur maximum 6 h environ après l'injection de 131I sans entraîneur.

Indépendamment de nous, d'autres auteurs ont trouvé par des techniques différentes un com-partiment protéique iodé à métabolisme rapide dans le plasma chez l'homme, le rat et le lapin.

Rivière et coll. chez l'homme euthyroïdien et chez le rat (102) et Blanquet et coll. chez lerat (12), en utilisant la technique de fractionnement de Blanquet et coll. (11), ont trouvé dans leplasma une fraction protéique iodée dont la radioactivité passe par une valeur maximum 1 - 3 haprès l'ingestion ou l'injection d'une dose de 131I sans entraîneur.

D'autre part, Jost et Vigouroux chez le lapin (49), en utilisant une technique inédite de frac-tionnement du plasma sur résine Dowex, ont isolé une fraction protéique iodée dont la teneur enradioactivité 40 h après l'injection d'une dose de 131I sans entraîneur varie selon le régime. Pourun régime riche en iode (comprimés UAR) cette fraction renferme environ 20 % de la radioactivitétotale du plasma : pour un régime pauvre en iode (avoine + carottes) cette fraction ne contient plusque 1 - 2 % de la radioactivité totale du plasma.

i

Bien que, comme nous l'avons montré, la thyroglobuline et les iodotyrosines soient absentesdu plasma chez le rat normal, l'hydrolyse de celui-ci par la papaïne fournit de la MIT (64). Cerésultat est confirmé par Jost et Vigouroux chez le lapin (49) qui trouvent également de la MITaprès hydrolyse par la Viokase.

La fraction NEB pourrait donc être constituée par un ou plusieurs iodopeptides (ou iodo-protéines) contenant la fraction de MIT (et peut-être de DIT) qui ne participe pas au recyclage del'iode au sein de la thyroïde. Cette forme de sécrétion n'a probablement pas d'activité hormonaleet représenterait alors un processus de régulation par excrétion.

57

QUATRIÈME CHAPITRE

CONCLUSIONS

Par la méthode d'équilibre isotopique nous avons pu mesurer la valeur des principaux para-mètres du métabolisme de l'iode chez le rat en fonction de l'apport alimentaire en iode.

Ont été déterminées notamment, les concentrations en iodure et en iode organique du plasma,la quantité d'iode totale et la quantité d'iodure de la thyroïde, ainsi que les intensités du flux derecyclage et du flux de sécrétion de la glande.

En comparant les résultats obtenus avec des rats adaptés à recevoir 50 u g d'iode par jour(groupe 50) à ceux obtenus avec des rats adaptés à recevoir 5 |i g d'iode par jour (groupe 5), nouspouvons dégager les faits suivants.

L'iodurémie est à peu près dans le même rapport que l'apport alimentaire.

Malgré une disponibilité en iodure plasmatique 10 fois plus importante, la thyroïde des ratsdu groupe 50 ne contient que 1, 5 fois environ plus d'iode que celle des rats du groupe 5.

Le pool iodure de la thyroïde représente respectivement 0,30 % et 0,45 % de l'iode total dela glande pour les rats du groupe 5 et pour ceux du groupe 50.

La concentration en iode du PBI est environ 1,5 fois plus grande pour les rats du groupe 50que pour ceux du groupe 5 (33 m(ig I/ml et 20 m^g I/ml respectivement).

Le flux de recyclage intrathyroïdien est équivalent au flux de fixation d'iodure plasmatiquepour les rats du groupe 50, alors qu'il est environ 2, 5 fois plus intense que celui-ci pour les ratsdu groupe 5.

La valeur exacte de la sécrétion d'iode de la thyroïde peut être mesurée pour les rats dugroupe 5. Elle représente en moyenne 0,70 \ig d'iode par jour. Pour les rats du groupe 50, seuleune valeur maximum de la sécrétion peut être calculée (2,70 (ig d'iode par jour).

La sécrétion thyroïdienne comporte, outre les hormones TV et T3, une fraction d'iode orga-nique non extractible par le n-butanol(NEB). La vitesse de renouvellement de la fraction NEB est plusgrande que celle des hormones pour les rats du groupe 50.

Aucune iodotyrosine libre n'est présente dans le plasma des rats des deux groupes. Parcontre, la fraction NEB du PBI, de nature peptidique ou protéique, contient de la MIT et peut-êtrede la DIT.

De l'ensemble des expériences présentées dans cette deuxième partie.il ressort que l'activitéphysiologique de la thyroïde subit une forte régulation vis-à-vis de la quantité d'iodure disponibledans le plasma. Cette régulation porte à la fois sur le contenu en iode de la glande, sur l'intensitédu recyclage intrathyroi'dien, sur la quantité et sur la nature de l'iode sécrété.

58

TROISIÈME PARTIE

VOIES MÉTABOLIQUES DE L'IODE DANS LA THYROÏDE

Un ensemble de molécules de nature différente peut constituer un pool cinétiquement homogènesi les vitesses de transformation moléculaires sont grandes et si ces transformations ne modifientpas la RAS du metabolite dont on suit le renouvellement.

Le re. ouvellement de l'iode de la thyroïde se faisant précisément par des transformations chi-miques successives, son étude approfondie ne peut se concevoir sans l'isolement préalable des espè-ces chimiques qui contiennent l'iode de la glande.

Si les conditions d'état stationnaire et de renouvellement à flux constants sont réalisées, lacomparaison des courbes de renouvellement de chaque constituant est possible. De cette compa-raison, on peut tirer des informations qui permettent d'ébaucher un modèle de renouvellement.

En associant la méthode d'équilibre isotopique aux techniques biochimiques actuelles, nousavons étudié chez le rat les voies métaboliques de l'iode dans la thyroïde. Une technique de doublemarquage avec les radioisotopes 125I et 131I, nous a permis d'étudier la répartition de l'iode entreses pools élémentaires et de suivre le renouvellement de ceux-ci par l'évolution de leur RAS vraie.

Nous envisagerons successivement ces deux aspects du renouvellement de l'iode de la thyroïde.

59

PREMIER CHAPITRE

RÉPARTITION DE L'IODE DE LA THYROÏDE ENTRE SES < POOLS > ELEMENTAIRES

L'analyse quantitative des composés iodés thyroïdiens a fait l'objet de nombreux travaux quiseront discutés dans ce chapitre mais dont la plupart ne tiennent pas compte de l'existence dans lathyroïde d'une fraction dialysable. Lissitzky et al (67) (68) (42) ont montré récemment, chez uncertain nombre de mammifères et chez l'homme, que l'iode de la glande thyroïde pouvait être sé-paré par dialyse ou selon la solubilité dans l'acide trichloracétique en deux compartiments, l'un libreou dialysable, l'autre liê ou non dialysable. Le compartiment libre contient iodure, 3 - iodotyrosineet 3, 5 - di-iodotyrosine libre ainsi que leurs analogues pyruviques et de nombreux iodopeptides. Cesconstituants peuvent être facilement séparés par analyse chromato-électrophorétique sur papier dudialysat des glandes (68) (65). Le compartiment lié est représenté essentiellement par la thyroglobuline.

En ce qui concerne les iodotyrosines libres, des résultats analogues ont été obtenus parPitt-Rivers et Cavalieri (90) en analysant le dialysat par chromatographie sur résine échangeused'ions.

Outre cette division en deux compartiments, dont l'importance physiologique reste encore àpréciser, les données quantitatives complètes sont relativement rares. Très souvent, seul l'iode-total de la glande est dosé, quelquefois même sur un lot d'animaux témoins. La répartition de l'iodeest alors estimée par la distribution d'un traceur entre les constituants de la thyroïde au bout d'uncertain temps pour lequel on admet que sa répartition est uniforme. L'étude cinétique est géné-ralement faite simultanément en exprimant le passage du traceur dans les différents pools par laRAS relative (88) (42), c'est-à-dire en prenant comme élément de référence pour chaque pool isoléla quantité de traceur qu'il contient au temps pour lequel on admet un marquage uniforme.

De toute évidence, la seule façon valable d'exprimer l'ordonnée d'une courbe de renouvellementest la RAS vraie, c'est-à-dire le rapport, pour chaque temps après l'injection du traceur, de lafraction de la dose injectée à la quantité d'iode que contient le pool. Ceci nécessite un dosage sys-tématique de l'iode contenu dans toutes les fractions isolées.

Dans ce but préliminaire et pour connaître la répartition de l'iode entre les deux comparti-ments "libre" et "lié" et entre leurs constituants respectifs, nous avons employé la méthode d'équi-libre isotopique avec le radioisotope 125I.

A - TECHNIQUES ET MATERIEL

I - Techniques biologiques.

Deux groupes de rats (comprenant respectivement 41 et 49 animaux) adaptés à recevoir soit5 |i g (groupe 5) soit 50 ^ g d'iode par jour (groupe 50), sont mis en équilibre isotopique avec uneboisson marquée par 12h qui leur est fournie à la RAS de départ de 0,15 (iC/ ug pour le groupe 5et 0,10 nC/ng pour le groupe 50.

Un délai de renouvellement de 50 jours est respecté pour que l'équilibre isotopique soit atteint.

Les animaux sont sacrifiés par saignée au coeur après une légère anesthésie à l'éther. Lesthyroïdes sont excisées rapidement et conservées à - 10° C pendant le temps de prélèvement d'unlot de glandes. EUes sont ensuite pesées rapidement après réchauffement, puis congelées à - 60° Cet conservées telles quelles jusqu'à l'emploi.

60

II - Techniques biochimiques.1) Dialyse. Les glandes correspondant à un lot expérimental sont introduites dans un

tube à dialyse (Visking seamless cellulose tubing 20/32) à l'aide d'un entonnoir â col large pouréviter le contact entre le tissu et les parois du sac. Cette précaution est indispensable pour éviterune contamination du liquide de dialyse par la thyroglobuline.

Les sacs sont alors fermés par un double noeud et placés dans des fioles d'Erlenmeyer conte-nant 100 ml d'eau distillée (condition A) ou de NH,,OH 0,0IN (condition B) préalablement refroidiesà O" C et auxquelles sont ajoutées 3 gouttes de toluène. Après une dialyse de 24 h à une tempé-rature aussi voisine que possible de 0° C, 1 ml est prélevé pour les mesures de radioactivité. Ledialysat, supplémenté avec 0,1 mg de thiouracile, est alors concentré dans un évaporateur rotatifsous vide et à une température inférieure à 40° C, jusqu'à un volume d'environ 0,2 à 0,3 ml.

2) Chromato-électrophorèse. Le dialysat concentré est déposé sur une feuille de papierWhatman n° 1 (47 x 56 cm) en un point situé à 9,5 cm du bord le plus long et, soit à 12 cm(condition 1) soit à 20 cm (condition 2) de l'autre bord. Les entraîneurs (5 ug d'iodure ; 10 |igde MIT, DIT, T3 , T^) sont ensuite déposés. Le séchage de l'échantillon et des solutions d'entraî-neurs est réalisé sous un courant d'air tiède (température inférieure à 37° C) et à la pénombre.

La feuille est alors soumise à une chromatographie descendante en n-butanol-acide acétique-eau(78/5/17) jusqu'à ce que le front du solvant ait atteint l'extrémité de la feuille (16 à 18 h). Aprèsséchage, une électrophorèse dans la direction perpendiculaire à la chromatographie est réalisée entampon pyridine-acide acétique-eau (1/10/" o9)pH 3,6 sous 2 500 v pendant 90 mn. selon la technique deKatz et al (50).

Après séchage, la feuille est découpée en deux parties dont l'une correspond à une largeur de30 cm mesurée à partir du bord anodique dans le sens de l'électrophorèse. Chaque partie est sou-mise à l'auto radio graphie.

3) Homogénéisation. Après dialyse, les glandes sont homogénéisées en présence de poudrede verre dans des tubes cylindroconiques contenant 0,7 ml de tampon TRIS-HC1 pH 8,6. Après unecentrifugation et deux lavages avec 0,5 ml du même tampon, les surnageants sont réunis et portésà 2 ml dans une fiole jaugée de précision (Elliott, G. B. ). Un échantillon (0,020 ml) est prélevépour les mesures de radioactivité et le résidu de l'homogénéisation est entraîné quantitativementavec de l'eau dans un tube de mesure pour atteindre un volume final de 2 ml.

4) Digestion enzymatique. A 0,2 ml de l'homogénat thyroïdien sont ajoutés 0,010 mlde thiouracile 5 * 10~z M (concentration finale 2 x 10~3 M), 0,050 ml d'une solution contenant 4 mgd'enzyme P de strep tony ces griseus (Pronase) dans NHH HCO3 0,1 M, puis 0,030 ml de N H H H C C ^ 1Met une goutte de toluène. Après 18 à 24 h à 37° C le milieu est analysé par chromatographie surpapier en n-butanol-acide acétique-eau (78/5/17) contenant Na2 SJJ O3 (0,3 g/1) et en amylol tertiairesaturé de NH,0H 2N, en présence d'entraîneurs (Cf. ci-dessus). Les deux chromatogrammes sontalors soumis à l'autoradiographie.

5) Electrophorèse de contrôle. La quantité d'iodure contenue dans le dialysat concentréest déterminée sur une partie aliquote par électrophorèse sur papier, en tampon pyridine-acideacétique-eau (pH 3, 6) sous 2 500 volts pendant 15 mn. L'efficacité de la dialyse et la désiodationéventuelle au cours de l'hydrolyse sont contrôlées dans les mêmes conditions sur une partie aliquote(0.O10 ml) de l'homogénat et de l'hydrolysat.

III - Détection et mesure de la radioactivité.

L>a détection des corps radioactifs sur les chromato-électrophorégrammes du dialysat, sur leschromatogrammes de l'hydrolysat, et sur les électrophorégrammes de contrôle, est effectuée parautoradiographie pendant sept jours. Le papier est maintenu par des agrafes entre deux films àrayons X (Kodirex sans écran) pour augmenter la sensibilité de la détection. Les surfaces dupapier correspondant aux taches de l'autoradiogramme sont découpées et placées dans des tubespour la mesure de la radioactivité. Cette mesure est réalisée par spectrométrie Y à l'aide d'unpasseur automatique d'échantillon (Packard autogamma). La bande passante choisie est centréesur l'énergie d'émission X de 30 Kev de1 2 5 l . Dans nos conditions expérimentales, le rendementde comptage est de 17 % avec un mouvement propre de 12 à 15 cpm. Des dilutions adéquates desboissons ayant servi à la réalisation de l'équilibre isotopique sont utilisées comme échantillonsstandards. Ces standards contiennent une quantité de radioactivité d'environ 0,03 |iC correspondantà une détection d'environ 10 000 cpm. Chaque série de 8 échantillons est encadrée par 2 échantillonsstandards et centrée sur une mesure de mouvement propre. Les échantillons liquides ont tous un

6\

volume de 2 ml. Les échantillons de papier sont placés au fond du tube de telle façon que leurhauteur maximum soit de 2 cm. Toutes les mesures sont effectuées au moins 2 fois pendant 10 mn,Dans les cas les plus défavorables, la précision statistique des mesures a été de 4 %.

IV - Calcul et expression des résultats.

A l'équilibre isotopique, chaque pool d'iode de la thyroïde est uniformément marqué à la RASde l'iode de la boisson. La quantité d'iode qu'il représente peut donc être calculée par le rapportde sa radioactivité à la HAS de la boisson.

La sensibilité de cette méthode dépend de la RAS de l'iode de la boisson au moment des me-sures de radioactivité et de la précision de celles-ci. Dans nos conditions expérimentales, la pré-cision des résultats était de 5 % et la sensibilité de la méthode de 0,001 \Lg d'iode W7L

Pour un groupe donné, chaque expérience représente une série de mesures effectuées sur plu-sieurs lots de 4 à 6 rats. De plus, le contenu en iode total de la thyroïde des rats d'un mêmegroupe est soumis à des variations individuelles indépendantes de la précision des mesures. Laquantité d'iode que représente chaque pool isolé étant calculée à partir de la composition cen-tésimale, en tenant compte de l'iode total contenu dans la glande, il en résulte que la dispersion desrésultats en valeur absolue est plus grande que celle des résultats exprimés en valeurs relatives.Pour caractériser cette dispersion, la déviation standard a a été utilisée.

V - Produits chimiques et radioisotope.

Le Tris provenait de Biochemica Boehringer (Mannheim, Allemagne) et l'enzyme P de Strepto-myces griseus ou Pronase de Sigma (St Louis, Miss. , USA) sous le nom de Protease type VL Tousles autres produits chimiques étaient de la meilleure qualité analytique. Toutes les solutions ontété faites avec de l'eau désionisée puis bidistillée dans un appareil en silice. Le radioisotope 1!iLétait livré sans entraîneur par l'Atomic Energy of Canada (Ottawa, Canada).

B - RESULTATS

I - Iode total et iode "libre" de la thyroïde.

La répartition de l'iode de la thyroïde entre le compartiment dialysable et le compartiment nondialysable a été étudiée en fonction de l'apport constant en iode auquel les deux groupes d'animauxont été adaptés.

Deux expériences par groupe ont f r<* réalisées. Pour chaque expérience, les mesures ont étérépétées sur des lots de 4 à 6 rats. Le nombre total d'animaux utilisés pour chaque expérienceet les moyennes des résultats obtenus so at indiqués dans le tableau XIV.

Pour un poids de tissu équivalent, les thyroïdes des rats du groupe 50 renferment environ1, 5 fois plus d'iode que celles du group< a. Les quantités d'iode correspondantes confirment cellesdéjà trouvées pour 2 groupes de rats semblables (Cf. Ile partie, 3ème chapitre). Selon le groupe,6 à 10 % de l'iode total de la thyroïde existe sous forme dialysable.

II - Compartiment dialysable ou "libre".

La figure 15 donne un schéma d'identification par chromato-électrophorèse (condition 2) desconstituants iodés du compartiment libre. Celui-ci renferme l'iodure, MIT libre, DIT libre et uncertain nombre d'iodopeptides (67) (68) (42).

Les iodopeptides sont classés en groupes (A, B, Ç et D) selon leur mobilité en chromato-graphie. Ils représentent une part prépondérante de l'iode du dialysat.

La quantité totale de l'iode contenu dans le compartiment libre est calculée à partir de lamesure de radioactivité effectuée sur une partie aliquote (1 ml) du dialysat prélevée avant la concen-tration de celui-ci. La quantité d'iode déposée sur le papier pour la chromato-électrophorèse estcalculée en tenant compte de la fraction d'iode restée dans les liquides de lavage de l'évaporateurrotatif.

La quantité d'iodure correspondant au dépôt est calculée à partir de la mesure de radioactivitéeffectuée sur l'électrophorégramme de contrôle. Cette mesure indépendante de l'iodure est obliga-toire puisque dans nos conditions expérimentales l'iodure se retrouve dans le bain anodique. Detoute façon, même dans le cas où l'iodure ne sortirait pas du papier, elle est recommandée carelle évite la désiodation au cours de la chromatographie qui précède l'électrophorèse.

62

Tableau XIV

Dosage de l'iode ("'I) de la thyroïde de Rat par la méthode d'équilibre Isotopique

Groupe

5

50

Expérience

1° (Janv. 1963)

2° (Avr. 1963)

1° (Nov. 1962)

2° (Avr. 1963)

Rats

Nombre

••14

27

25

24

Poids moyen(g)

292±34

280± 21

268± 18

286± 2 5

Thyroïde

Poids moyen(mg)

16,3±2,2

14,3± 1.5

14,4± 1,0

13.8± 1.8

Iode total(Hg)

10.69±1,84

9,22±1,30

16.95± 1.16

15.65±3,06

Dialysable(% iode total)

5,90±2,67

5,80±0,71

10,30± 0,70

9,53±1,40

Non dialysable(% iode total)

94,10±2.67

94.20±0,71

89,70± 0,70

90,47± 1,40

Etude de la répartition de l'iode entre le compartiment dialysable et le compartiment non dialysable de la glande sur deuxgroupe de rats en état stationnaire adaptés à un apport d'Iode de 5 p. g par jour (groupe 5) ou de 50 ug par jour (groupe 50).Les poids de thyroïde indiqués représentent le prélèvement des deux lobes d'un animal.

L'indice de dispersion utilisé est la déviation standard a-

Tableau XV

Composition en MIT, DIT et iodure du compartiment libre de la thyroïde étudiée sur deux groupesde rats adaptés à un apport d'iode de 5 jig par jour (groupe 5) ou de 50 |ig par jour (groupe 50)

Groupe

5

50

Expérience

1°

2°

1°

2°

Conditionsde

Dialyse

B

B

B

A

Iode % du Dialysat

MIT

1,96± 0,65

1.31±0,41

1,12±0,40

0,70± 0,08

DIT

7,51±3,47

3,48±0,86

3,53±1,15

2,21±0,76

Iodure

6,95±1,35

9,53±0,99

7,15±0,92

6,35±1,25

Quantité d'iode ( n g * 10"3)pour la thyroïde totale

MIT

11,4± 3,2

7,2± 3,3

19,7± 7,5

10,4± 2,4

DIT

43.4±15,2

19,0± 7,8

62,3±21,4

32,8± 7 , 4

Iodure

40.7± 7,8

50,6± 7,9

125,0± 12,0

91,0± 8 , 3

Des lots de 4 à 6 glandes sont dialyses à 0°C pendant 24 h contre 100 ml d'eau (condition A) ou100 ml de NH, OH 0,01N (condition B) en présence de 3 gouttes de toluène. Les quantités d'iode sontcalculées à partir des données du Tableau XIV.

L'indice de dispersion utilisé est la déviation standard a.

Tableau XVI

Composition centésimale en iodopeptides dn compartiment libre de la thyrofde étudiée sur deux groupes de rats adaptés à un apportd'iode de 5 ng par jour (groupe 5) ou de 50 ug par jour (groupe 50)

Groupe

5

50

Expérience

2*

2»

A .

13.61± 1.35

13,88± 1,86

A

26,± 1.

± 2,

1

5468

0020

A,

5,10±0,49

4.60±0,53

A,

0,30±0, 13

0.22±0.07

A,

1,08±0.16

1,0310,34

1

1

A4

0,520,12

0,390,03

±

±

B,

0,060.01

0.050,00

±

±

B,

0,060,01

0,030,00

B ,

0,06±0,02

0,09±0,02

B,

0,07±0,02

0,09±0,01

±

1

B,

0,040,01

0,050,00

B»

0,12±0,04

0,17±0,02

Groupe

5

50

c,

2,72±0,47

2,36±0,47

c,

0,18±0,05

0, 19±0.06

C3

0,05±0,02

0,08±0,03

c.

0.04±0.02

0,0410,02

c,

0,24±0,15

0.31±0,14

0,27±0.09

c,

0,21±0.10

0.2510,16

c.

0,21±0,14

c,

1,14±0.28

0.43±0.11

0.62±0.11

0.30±0.11

0.34±0.11

0.11±0.04

0.11±0,01

D 3

0,04±0.02

0.08±0,02

O

3.62±1.20

4.61±1,04

Iode retrouvé% du dialysat*

70,7±3.3

59,9±6.8

Mêmes conditions expérimentales que pour les résultats du Tableau XlV. La différence dans le rendement de récupération*entre les deux groupes est expliquée dans le texte (Cf. "Discussion").

0o

1

A

Figure 15 - Schéma d'identification par chromato-électrophorèse des constituants iodés dialysables de lathyroïde.

Le dialysat concentré (0,2 - 0 , 3 ml) et les entraîneurs (5 ug d'iodure ; 10 ug de MIT, DIT. T3 et Tu) sontdéposés en O et soumis à une séparation bidimensionnelle. Dans le sens 1, le mélange est soumis pendant18 h à une chromatographie descendante en n-butanol-acide acétique-eau (78/5/17). Dans le sens 2, il subitpendant 90 minutes une électrophorèse sous haute tension (2 500 V.) en tampon pyridine-acide acétique-eau(1/10/289) pH 3,6. Dans ces conditions, l'iodure est passé dans le bain anodique. Notons que par simplechromatographie, l'iodure serait confondu avec certains iodopeptides du groupe C,

64

La composition centésimale en iode du compartiment libre est calculée pour chaque corpsisolé en tenant compte de la quantité d'iodure que contenait le dépôt (tableaux XV et XVI).

Entre les deux groupes de rats (tableau XVI), il existe une bonne concordance pour la compo-sition centésimale du dialysat en peptides isolés. D'autre part, l'ensemble des peptides A, ayantun Rf nul en chromatographie en butanol acétique, représente pour chaque groupe près de la moitiéde l'iode existant dans le dialysat (47 % pour le groupe 5 et 43 % pour le groupe 50). En ce quiconcerne l'iodure (tableau XV), la même équivalence est observée. Par contre, les fractions del'iode du dialysat que représentent MIT et DIT sont environ deux fois plus petites dans le groupe50 que dans le groupe 5.

On peut transcrire ces résultats sur le plan quantitatif en tenant compte de la quantité d'iodeque contient le dialysat dans chaque groupe (calculée à partir des données < u tableau XIV).

En valeur absolue, les iodopeptides sont environ 3 fois plus abondants dans le groupe 50 quedans le groupe 5 ; l'iodure l 'est 2 fois plus ; MIT l'est 1,5 fois plus ainsi que DIT.

III - Compartiment non dialysable.

Ce compartiment est essentiellement constitué par la thyroglobuline. Sa composition centési-male en iode et les valeurs absolues correspondantes sont données dans le tableau XV1L

L'hydrolyse de la thyroglobuline par la Pronase libère les acides aminés iodés en quantitéscomparables pour les deux groupes sauf pour DIT qui représente une quantité d'iode 1,5 fois plusgrande dans le groupe 50 que dans le groupe 5. En outre la fraction de l'iode total de la thyro-globuline que l'on retrouve dans le matériel non hydrolyse est environ 2 fois plus grande dans legroupe 50 (15,7 %) que dans le groupe 5 (8,4 %).

Dans la mesure où l'hydrolyse de la thyroglobuline in vivo est comparable à celle qu'elle subitpar la Pronase, il en résulte que la quantité disponible en T3 et en TH est équivalente pour les2 groupes malgré un apport d'iode très différent. L'un des processus régulateurs de cette disponi-bilité en hormones pourrait être l'augmentation de la résistance à l'hydrolyse de la thyroglobulineen fonction de son degré d'iodation.

Le tableau XVIII permet de comparer les quantités d'iodure trouvées dans l'homogénat et dansl'hydrolysat à celle du dialysat. La présence d'iodure après dialyse sera discutée plus loin.

IV - Comparaisons des rapports MIT/DIT et T3/Ti( pour les deux compartiments.

Ces rapports sont donnés dans le tableau XIX. Ils sont calculés soit en atomes d'iode, soitsous forme de rapports molaires en tenant compte du contenu en iode de chaque composé.

Il apparaît que le rapport MIT/DIT du compartiment dialysable est équivalent pour les deuxgroupes. Le rapport moyen de 0,30 indique que la quantité d'iode que représente MIT est environ3 fois moins grande que celle que contient DIT. Ceci correspond à un nombre de molécules de MITqui équivaut à 60 % du nombre de celles de DIT. La valeur de ce rapport exprimé en iode confir-me celle qui a été estimée par Pitt-Rivers et Cavalieri (90).

Pour le compartiment non dialysable, le rapport MIT/DIT est plus élevé dans le groupe 5que dans le groupe 50. Pour chaque groupe la valeur de ce rapport est plus élevée que celle cal-culée pour le dialysat, contrairement à l'hypothèse de similitude formulée par Pitt-Rivers (88).Exprimé en molécules, ce rapport indique que pour le groupe 5 le nombre de molécules de MITest voisin de celui des molécules de DIT, alors que pour le groupe 50 il n'en représente que les3/4 environ.

Le rapport T3/T,, est sensiblement équivalent pour les deux groupes. Il indique que le nombrede molécules de T3 représente moins de 20 % de celui des molécules de T4.

C - DISCUSSION

I - Choix des techniques.

La méthode d'équilibre isotopique nous a permis d'obtenir avec une bonne précision et une bon-ne reproductibilité des résultats quantitatifs sur la répartition de l'iode dans la thyroïde, en rem-plaçant les nombreux dosages d'iode 127I qu'il aurait fallu effectuer par des mesures de radioactivitéautomatisées. Elle a permis d'autre part d'étudier les rendements de toutes les étapes de séparation

65

Tableau XVII

Répartition de l'iode entre les différents constituants du compartiment non dialysable de laenzymatique par la Prônase

Groupe

5

50

Expérience

1*

2"

1*

2*

MIT%

22,6611.23

18,3610,82

15,51±0.57

14,78±0,57

2.44±0,52

1.68±0.17

2. 63±0,23

2.31±0.40

DIT%

47.95±0,93

40.72±1.38

42.26±1.44

39.45± 1.39

"g

5.1210,89

3,7610,56

7.17±0,64

6, 16±1.13

T ,%

13,71±2,27

21,3611,44

6,67±1,53

17,35±1,10

Hg

1.45±0,26

1,96±0.21

1.14±0.30

2.71±0,52

T ,%

1,18±0.60

2,94±0,24

0,93±0.20

2.36±0.26

tig

0.12±0.02

0,27±0,04

0,16±0,07

0,3710,09

O%

9,56±1,02

8,37±0,91

18,76±2,43

16,24±1,76

1,02±0.13

0.7B±0,17

3,19±0,39

2,57±0,68

thyroïde après

r%

6,22-±0,47

2.6910.34

7.5011,38

3.19±0,19

u «

0,66±0,19

0.25±0.06

1.26±0.19

0.50±0,10

hydrolyse

Reste%

0

6,07±1,87

8.33±0,49

6,60±1,25

u g

n

0,52±0,17

1,50±0,23

1,04±0,95

Etude comparative sur deux groupes de rats adaptés à un apport d'iode de 5 ug par jour (groupe 5) ou de 50 M g parjour (groupe 50). Les quantités d'iode sont calculées à partir des données du Tableau XIV. Pour chaque expérience les me-sures ont été répétées sur des lots de 4 à 6 glandes.

Tableau XVIII

Quantités d'iodure trouvées à chaque étape de l'analyse de la répartition de l'iodedans la thyroTde de rat sur 2 groupes d'animaux adaptés à un apport d'iode

de 5 ug par jour (groupe 5) ou de 50 u.g par jour (groupe 50)

Groupe

5

50

Expérience

1°

2°

1°

2°

Quantités d'iodure (ug) pour la thyroïde totale

Dialysat

0,041±0,008

0,051±0,008

0,125±0,012

0,091±0,008

Homogénat

0,014±0,001

0,042±0,010

Hydrolysat

0,500±0,100

0,248±0,060

1,260±0, 190

0,499±0,100

L'iodure a été séparé par électrophorèse sur papier à chaque étape. Pour chaqueexpérience, les thyroïdes ont été traitées par lots de 4 à 6 glandes. La dialyse a étéeffectuée contre de l'eau (condition A) pour la 2° expérience du groupe 50, et contreNH,OH0,01N (condition B) pour les 3 autres expériences. Pour les détails, voir texte("Techniques biochimiques").

et d'analyse, n a été possible en particulier d'exprimer quantitativement les fractions ayant résisté(totalement ou partiellement) à l'hydrolyse enzymatique ainsi que celles provenant de la désiodation.

Le choix de l'isotope 125I pour réaliser l'équilibre isotopique est convenable à un double t i t re .Il permet de réaliser des expériences de longue durée grâce à la période de 60 jours et au faiblepouvoir d'irradiation de U SI. D'autre part, il rend possible l'utilisation de 131I comme traceur pourl'étude cinétique qui sera présentée dans le second chapitre.

L'isolement du compartiment libre permet en premier lieu l'étude du pool iodure qui occupeune place importante dans le cycle métabolique puisqu'il se renouvelle à la foifr- par captation àpartir du sang et par recyclage dans la thyroïde ; il précise l'existence des iodotyrosines libresainsi qu'un certain nombre d'iodopeptidès, tout en posant le problème de leur rôle dans la biosynthèsedes hormones.

II - Compartiment dialysable.

L'étude des constituants iodés libres de la thyroïde a été faite dès 1950 par Gross, Leblondet al .(37) (60) par extraction au n-butanol de broyats de thyroïde de rats. Dans cet extrait, T , ,MIT, DIT et l'iodure ont été identifiés. En 1951, Tong, Taurog et Chaikoff (140) (137) confirmaient

66

Tableau XIX

Etude comparative des rapports MIT/DIT et T /T, entre le dialysat et l'hydrolysat dethyrofdes provenant de 2 groupes de rats adaptés à un apport d'iode de

5 ng Pa r jour (groupe 5) ou de 50 [ig par jour (groupe 50)

Groupe

5

50

Expérience

1°

2°

moyenne

1°

2°

moyenne

MIT/DIT

Dialysat

en atomesd»iode

0,27

0,32

0,29

0,31

0,31

0,31

enmolécules

0,54

0,64

0,59

0,62

0,62

- 0,62

Hydrolysat

en atomesd'iode

0,47

0,45

0,46

0,37

0,37

0,37

enmolécules

0,94

0,90

0,92

0,74

0,74

0,74

T3/T,

Hydrolysat

en atomesd'iode

0,09

0,14

0,11

0,14

0,14

0,14

enmolécules

0,12

0,18

0,15

0, 18

0,18

0,18

Dans nos conditions expérimentales (Cf. "Discussion"), on ne trouve pas de T3 ni deT, dans le dialysat. Les rapports exprimés en molécules sont calculés à partir des rap-ports exprimés en atomes d'iode en tenant compte du contenu en iode de chaque molécule.

l'existence dans la thyroïde de rat des trois composés organiques à l'état libre et les dosaient soitsur un extrait butanolique, soit sur un extrait trichloracétique.

Beaucoup plus tard, Pitt-Rivers et Cavalieri (90) d'une part, Haney et Lissitzky (42) d'autrepart, étudiaient sur des dialysats de glandes entières de rats, l'évolution en fonction du temps dela RAS relative des iodotyrosines libres et estimaient leur abondance. Haney et Lissitzky (42) étu-diaient en outre le renouvellement de nombreux iodopeptides contenus dans le dialysat.

Dans la présente étude, nous avons employé dans la première expérience du groupe 50 desconditions de chromato-électrophorèse du dialysat identiques à celles décrites antérieurement parLissitzky et Haney (68). L'ensemble de l'iode retrouvé sur le papier ne représentant que 31 % dela totalité de l'iode déposé, ces conditions ont été modifiées pour les expériences suivantes dansle but d'améliorer le rendement de récupération. Pour les deux dernières expériences, le rende-ment a été de 70, 7 % pour le groupe 5 et de 59,9 % pour le groupe 50 malgré des conditions identiquesde chromato-électrophorèse. Cette différence est due à la présence d'iodopeptides peu marqués enplus grand nombre dans le dialysat du groupe 50 que dans le dialysat du groupe 5.

Dans nos conditions expérimentales, T3 et T4 sont absents du dialysat. Ceci s'explique par lapropriété que possède la thyroglobuline de fixer réversiblement les iodothyronines (48) (63). H ad'ailleurs été constaté (65) que, dans des conditions d'autolyse aseptique à 37° C, les iodothyronineslibres dialysaient d'autant plus vite que la dégradation de la thyroglobuline était plus importante.

L'étude quantitative des constituants du dialysat ne permet pas de distinguer si ceux-ci sontdes précurseurs av des produits de la thyroglobuline. Ce problème ne peut être traité que par l'étudede leur renouvellement et sera envisagé dans le chapître suivant.

III -'Tool iodure.

Le dosage de l'iodure de la thyroïde est rendu difficile par la petite taille de ce pool qu'il fautséparer d'une grande quantité d'iode organique en évitant la riésiodation.

De toutes les techniques proposées pour la séparation de l'iodure (137) (47) (138) (91) (39) (82)(68) (117) (131), l'électrophorèse sur papier est la meilleure car elle permet d'une part de distinguerl'iodure de certains composés iodés qui ont le même Rf en chromatographie, et d'autre part d'éviterau maximum la désiodation puisque le temps utilisé pour réaliser l'électrophorèse est court (68)(117) (82) (131).

67

La mesure du pool iodure par électrophorèse après dialyse des glandes donne des résultatssystématiquement plus élevés que lorsqu'elle est faite directement par électrophorèse (voir Ile Partie,3ème chapitre). Cette observation est en accord avec celle faite par Nagataki et Ingbar (82) aucours d'une étude comparative des différentes techniques de séparation de l'iodure de la thyroïde.En dernière analyse la question est de savoir si l'électrophorèse directe de l'homogénat est unmoyen insuffisant pour isoler tout l'iodure de la glande, ou si la dialyse de la glande entière enmilieu alcalin peut agir en soi comme agent désiodant, bien que le pH soit supérieur au pH optimumde la désiodase thyroïdienne et que toutes précautions aient été prises pour se mettre à l'abri d'uneillumination vive.

IV - Compartiment non dialysable (Thyroglobuline).

Les quantités d'acides aminés iodés trouvées dans le compartiment non dialysable dépendentd'un certain nombre de facteurs techniques et biologiques.

1) Facteurs techniques. Les facteurs techniques interviennent essentiellement en fonctionde l'importance de la désiodation à chaque étape de l'analyse et du degré d'hydrolyse de la thyro-globuline. Ils sont les suivants :

a) Homogénéisation :

Théoriquement, la totalité de l'iodure de la thyroïde est dialysable. Pratiquement, on trouveune petite quantité d'iodure après homogénéisation des glandes ayant subi la dialyse (tableau XVIII).Cet iodure provient probablement d'une désiodation soit au cours de l'homogénéisation, soit au coursde la conservation de l'homogénat par congélation jusqu'à son utilisation. Des enzymes de désioda-tion seraient libérés dont l'action aurait pour résultat l'apparition d'iodure. Des arguments en faveurde l'origine de l'iodure de l'homogénat par désiodation seront présentés dans le chapitre suivant.

b) Digestion enzymatique :

Elle doit être aussi complète et aussi peu désiodante que possible. Sur la base d'essais pré-liminaires, confirmés entre temps par Tonget aZ.(139), nous avons choisi la Pronase pour hydrolyserla thyroglobuline. Cet enzyme présente l'avantage sur la Pancréatine de digérer plus rapidementet plus complètement la thyroglobuline. Toutefois, si l'on considère que le matériel restant à l'ori-gine du chromatogramme en butanol acétique représente une fraction ayant résisté partiellement outotalement à l'hydrolyse, on peut observer que, même avec la Pronase, la libération des acidesaminés iodés de la thyroglobuline n'est pas totale.

c) Dépôt de l'hydrolysat sur le papier à chromatoiraphie :

II a été montré (7) (79) (130) que la T4 subissait une désiodation appréciable pendant le dépôtà la lumière, et en présence d'air. Pour l'éviter, il est indispensable de travailler à la pénombrt,aussi rapidement que possible et de déposer sur le papier, avant l'hydrolysat, une certaine quan-tité de thiouracile et d'acides aminés -odes entraîneurs.

d) Chromatoiraphie :

La feuille de papier doit être placée dans la cuve à chromatographie aussitôt après le dépôt.En outre, l'addition de Na2 S2 O3 au butanol acétique diminue la désiodation au cours de la chroma-tographie dans ce solvant. Enfin, la présence d'entraîneurs améliore le pouvoir de résolution de lachromatographie, en minimisant l'adsorption des corps iodés sur le papier. Dans notre cas, l'ad-jonction d'entraîneurs est possible puisque la détermination de l'iode 127I se fait grâce aux mesuresde radioactivité en 125I. L'emploi d'entraîneurs serait impossible dans le cas d'un dosage chimique.

2) Facteurs biologiques. Outre les facteurs techniques, des facteurs biologiques intro-duisent une certaine variabilité dans les résultats. L'espèce animale, le sexe, la température d'éle-vage, le régime, variables d'un auteur à l'autre, sont une difficulté supplémentaire pour comparerles données de la littérature (78) (122) (140) (137) (154) (136) (148) (92) (129) (114). A titre indicatif,nous reproduisons dans le tableau XX un certain nombre de résultats obtenus chez le rat dans dif-férentes conditions techniques et biologiques.

Pour rendre nos résultats comparables à ceux des autres auteurs, nous les avons donnés envaleurs relatives exprimées cette fois en fractions de l'iode total de la glande. Toutefois, nousinsisterons sur le fait que, pour éviter des confusions, la comparaison de deux groupes ne peutse faire qu'en valeur absolue. Par exemple, pour nos 2 groupes expérimentaux, la même fractionde l'iode total de la thyroglobuline sous forme de DIT correspond en fait à des quantités d'iode dansun rapport de 1,5.

68

Tableau XX

Kind- comparative des résultats quantitatifs obtenus chez le rat par certains auteurs dans différentes conditions expérimentales

Références

Simon &

Lissitzky

(120) 1963

Pitt-Rivers

& Ball

(92) 1961

Stole

(129J 1962

Rosenberg,

Dimick & Laroche

(114) 1963

Pltt-aivers

à Cavalien

(90) 1963

Tong, Taurog

«i Chaikotf

(140) (137) 1951

Conditions biologiques

Souche et sexe

Wistar

Sprague- Daw ley

Wistar

Long-Evans

Hooded

Sprague-Dawley

Long-Evans

Curtis-Dunning

Poids(g)

300

120-150

180

V

200

?

Régime(ug I/jour)

5

so

11

2

?

12

30

Conditions techniques

Isolementdu

compartimentlibre

dialyse

Nil, OH (Q.01N)

OC, J4 11

dialyse

Nil , OH (0.0IN)

+ a -C 18 h

a) extractionbutanoliqued'homogénal salin

b) homogénéisationdans l'acide tri-chloracétique

Hydrolyse

Pronase

Fancréatine

Pancréatine

Pancréatine

Dosage "'l

EquilibreIsotopique ('"I)

boissonad libtlm

EquilibreIsotopique (1JtI)

injectionsquotidiennes

Chimique

Chimique

% radioactivitétotale de la glande

72 h après injectionunique l31l

Chimique

Répartition de l'iode dans la thyrofde

Iode total

par glande)

9,81± 1 B3

16.29» 2 .42

7-8

6,49±2 , 10

11.8±2

15

ûialysnhle (% iode total)

total

5,85±1, 17

9,9011,98

4

I -

0.48±0,09

0,6710. 12

1

MIT

0.10tO, 04

0,0910,04

0,01

—

DIT

0,3310, 19

0,2910,10

0,03

0,5

Peptides

4.94±1,03

8,85i l . 99

0 , 6

r

4. 19±2.34

4.8212.38

13

6.46±2,26

3i l

Non Dialysable C* iode total)

MIT

19.3014.80

13,65il ,99

20

20.311:7,95

18tO

DIT

41,60(9,36

36,8017,25

46

39.55114.60

5211

T,

te. so13, 18

10, B214.98

18

tO. 2413,60

10tO

1.9410.73

1.4910,69

3

4,5312, 19

310

—

i 1

3.4416.30

15.75l4,4S

0

6.3712.13

1411

R"Ste

2,8512.79

6 72±1.88

0

12.54

0

—

Les chiffres entre parenthèses (colonne 1) indiquent les références bibliographiques.

• : Origine du chromatogramme en butanol acétique^onsidérét comme représentant le matériel non ou partiellement hydrolyse. L'indice de dispersion utilisé est la déviation standard.

DEUXIÈME CHAPITRE

VOIES MÉTABOLIQUES DE L'IODE DANS LA THYROÏDE

La biosynthèse des hormones thyroïdiennes, thyroxine (T, ) et 3,5,3'-tri-iodothyronine (T3 ),comporte un certain nombre d'étapes encore mal connues mais parmi lesquelles la formation inter-médiaire des iodotyrosines (MIT et DIT) a été amplement démontrée. A la suite de l'hypothèse deHarington prédisant que la biosynthèse de la thyroxine impliquerait la condensation de deux moléculesde di-iodotyrosine, des recherches tendant à établir une relation précurseur-produit (156) entre lesiodotyrosines et les iodothyronines ont été poursuivies, mettant en oeuvre des techniques différentes.

Certains auteurs ont étudié la vitesse avec laquelle les pools de MIT et de DIT d'hydrolysatsde glandes thyroïdes de rats étaient marqués à des temps variables après l'injection d'une doseunique de 131I (138) (13) (88) (95) (149) (129). Des travaux similaires ont été poursuivis en ce quiconcerne les iodothyronines (13) (93) (94) (149) (129). D'autres auteurs ont essayé de mesurer laRAS vraie (134) ou relative (88) (39) des différents acides aminés iodés thyroïdiens après l'injectionà des temps variables de 131I.

Les résultats obtenus par ces deux types de méthodes sont encore très contradictoires et, enl'absence de données biochimiques précises sur les mécanismes de formation des iodotyrosines etdes iodothyronines, ils ne peuvent être interprétés sans ambiguïté.

Il a été récemment montré que la RAS relative des iodotyrosines libres du compartimentdialysable de glandes thyroïdes de rats atteignait une valeur maximum plus grande que celle desiodotyrosines combinées de la thyroglobuline à des temps plus courts après l'injection d'une dosetraceuse unique de 131I (90) (39). Par ailleurs, la RAS relative des iodopeptides dialysables de lathyroïde de rat a été étudiée (39). Les recherches sur les composés iodés du compartiment dialy-sable de la glande posent le problème de leur participation éventuelle à la biosynthèse des hormones.

L'objet des recherches décrites dans ce chapître a été de réaliser l'étude systématique du re -nouvellement des différents composés iodés connus de la thyroïde du rat, en mettant à profit laméthode d'équilibre isotopique associée à une technique de double marquage par les radioisotopes125I et l31I.

A - TECHNIQUES

Les rats utilisés pour l'étude cinétique dans ce chapitre sont les mêmes que ceux pour les-quels nous avons présenté les résultats de l'étude quantitative décrite dans le chapître précédentpour la deuxième expérience de chaque groupe. Placés dans les conditions d'équilibre isotopiqueavec 12SI, ils reçoivent par lots de 3 à 6 animaux, une dose unique de ^ I sans entraîneur, parvoie intrapéritonéale selon le protocole indiqué dans le Tableau XXI.

Les thyroïdes sont prélevées et traitées comme il a été décrit dans le Premier Chapître.

Les radioactivités en 131I et en1 2 5 ldes échantillons sont mesurées en spectrométrie Y avec lamême précision (4 % dans les cas les plus défavorables). La radioactivité en 125I est mesurée60 jours après la radioactivité en 1J1I pour diminuer l'interférence de comptage 131I/125I au tauxmaximum de 1 %o .

Les courbes de renouvellement expriment l'évolution de la RAS en fonction du temps. La RASest calculée pour chaque temps par le rapport de la fraction de la dose de traceur 13lI injectée (%)à la quantité d'iode présente dans la fraction isolée (u.g 121l). La quantité d'iode 127I est calculée àpartir des mesures de radioactivité I (voir Premier Chapître). Compte tenu de la précision desmesures pour les deux radioisotopes, la RAS est obtenue avec une précision de 6 % dans les casles plus défavorables.

70

Tableau XXI

Groupe

5

50

Injection intrapéritonéale de J31I

heures avantle sacrifice

9

16

24

48

72

4

8

18

36

72

ixC par rat

90

49

49

33

11

200

200

147

80

53

Nombre derats par lot

4

4

4

4

6

4

3

4

4

4

Poids moyendes rats (g)

282

280

271

283

274

290

292

278

298

284

Poids total dethyroïdes (mg)

par lot

62,7

64,3

56,6

47,8

82,8

63, 1

39,0

57,7

56,8

52,0

B - RESULTATS

Les figures 16 et 17 reproduisent à titre d'exemple les autoradiographies de deux chromato-électrophorégrammes réalisés à partir du dialysat d'un lot de thyroïdes appartenant à chacun des deuxgroupes de rats. La distribution et l'identification des taches séparées par chromato-électrophorèsosur papier ont été précisées dans le schéma présenté dans le Premier Chapître.

Les figures 18 et 19 permettent de comparer, pour chaque groupe, les courbes de renouvel-lement de l'iodure et des iodotyrosines libres (MITj et DITJ obtenus par dialyse, à celles des iodo-tyrosines (MITC etDITe) et des iodothyronines (T, et T3) combinées obtenues par digestion de l'homo-génat de thyroïde après hydrolyse par la Pronase.

Une expérience préliminaire pour chacun des deux groupes a montré que les courbes derenouvellement des composés étudiés passaient toutes par un maximum sauf celle de l'iodure. Cespremiers résultats sont confirmés par ceux obtenus pour le groupe 50 et présentés dans la figure 19.Bien que pour l'expérience concernant le groupe 5 (figure 18) des t<»mps inférieurs à 9 h n'aient pasété étudiés, nous admettrons que les courbes ont la même allure que pour l'expérience préliminaire.

De l'observation des figures 18 et 19 on peut t i rer les mêmes conclusions pour les deuxgroupes. Pour les temps courts, i .e. avant le maximum de RAS, et pour les temps moyens aprèsl'injection du traceur, les iodotyrosines et les iodothyronines se classent par RAS décroissantesdans l 'ordre suivant :

MITi > DIT! > MITC > DITC > T} > T,

Pour des temps longs (36 et 72 h selon le groupe) leurs RAS passent par la même valeur. Nousnoterons toutefois qu'à ce moment, la pente des courbes de renouvellement des iodotyrosines libresest plus forte que celle des courbes de renouvellement des iodotyrosines et des iodothyroninescombinées.

Au maximum de RAS des iodotyrosines libres, la RAS de l'iodure est comprise entre cellede MIT^ et celle de DITi. Elle devient légèrement inférieure pour les temps moyens, puis égaleà celle des iodotyrosines libres pour des temps longs (36 et 48 h suivant le groupe).

A la précision près du tracé des courbes qui dépend du choix des temps, il semble que lesRAS des iodotyrosines libres ou combinées passent par une valeur maximum simultanément. En ce quiconcerne les iodothyronines, T3 et TH ont un maximum de RAS simultané. Ce maximum semble lé-gèrement retardé par rapport à celui des iodotyrosines.

La comparaison de ces résultats avec ceux des autres auteurs peut se fa\re en suivant l 'évo-lution en fonction du temps du rapport de RAS pour les couples MITj/MIT,. , DITj/DIT,., et

71

La valour absolue de ce rapport ne peut être utilisée comme terme de compai'aison que vis-à-vis decourbes de renouvellement exprimées également en RAS vraie. Sinon, la pente de la courbe dé-crivant l'évolution de ce rapport est le seul critère utilisable.

Contrairement à Plaskctteî '7Z.(95) qui ont trouvé chez le rat un rapport de RAS constant entreles iodotyrosines libres et les iodotyrosines combinées de 1 ran. à 24 h après l'injection de 131I,nous trouvons des rapports MIT,/MIT,, et DITJ/DITJ décroissants en fonction du temps. En valeurabsolue, ces rapports sont supérieurs à 1 en accord avec celui trouvé par Pitt-Rivers en Cavalieri(90) en RAS relative pour MITj et MITC.

Kn ce qui concerne les iodotyrosines combinées, le rapport MITC/DITC tend vers 1 endécroissant.

Ce résultat est en accord avec celui obtenu par Rosenberg et ni. (114) chez le poulet. Le rap-port trouvé confirme également un rapport de radioactivité supérieur à 1 calculé par Leloup etLachiver (61) chez le rat carence en iode ainsi que celui obtenu chez le rat normal aux temps courtspar Michel (74), Taurog et al. (138) et Pitt-Rivers (88). Il est en contradiction avec le rapport cons-tant de radioactivité trouvé chez le rat par Bois et Larsson de 30 mn.à 7 jours (13), De Groot et Davisde 2 mn.à 24 h (25), Plaskett et al.de 1 nui. à 24 h (95) ainsi que par Kobayashi et Gorbman (55)chez le poulet.

Le rapport Tj/T, reste supérieur à 1 jusqu'à 72 h en passant par un maximum vers 9 h. Cerésultat confirme partiellement celui de Pitt-Rivers (88) qui trouve un rapport de RAS relative supé-rieur à 1 jusque vers 20 h mais, contrairement à nous, avec un maximum de RAS pour T, anté-rieur à celui de T,, .

Les figures 20 et 21 montrent les courbes de renouvellement d'un certain nombre de peptidesiodés trouvés dans le dialysat. Pour les deux groupes, la population des iodopeptides présente unegamme de vitesses de renouvellement allant des plus grandes, pour lesquelles les courbes de renou-vellement passent par un maximum simultanément à celles des iodotyrosines, jusqu'aux plus faibles ,pour lesquelles les courbes de renouvellement tendent vers une RAS maximum aux environs de 72 h.Une certaine similitude existe entre les iodopeptides des deux groupes, notamment pour les corpsB2, B5 et C3 à renouvellement rapide, et pour les corps O, Ao, Ax. A , A5 et Cj à renouvellementlent.

Les figures 22 et 23 comparent, pour chaque temps, les RAS de l'iodure du dialysat et del'iodure que l'on trouve après dialyse dans l'homogénat puis dans l'hydrolysat. Sur les mêmesfigures, ont été portées pour l'homogénat et pour l'hydrolysat, les RAS des fractions organiquescorrespondantes séparées de l'iodure par électrophorèse sur papier. Une seule courbe de renouvel-lement a été tracée pour l'homogénat et l'hydrolysat, les RAS pour un même temps ayant été jugéeségales, aux erreurs expérimentales près.

Pour les deux groupes, la courbe de renouvellement de l'iodure du dialysat se distingue nette-ment de celle de l'iodure trouvé dans l'homogénat et dans l'hydrolysat. L'égalité de la RAS entrel'iodure et la fraction organique, pour l'homogénat et pou~ l'hydrolysat, est la preuve que l'iodureprovient de la fraction organique, et que la désiodation en cours de manipulation ne se fait pas depréférence sur T et T,, (92) mais affecte l'ensemble des acides aminés iodés de la thyroglobuline.

L'iodure dialysable représente donc bien l'iodure préexistant dans la glande in vivo.

C - DISCUSSION

La mesure systématique des quantités d'iode I27I par la méthode d'équilibre isotopique (120)permet d'exprimer les courbes de renouvellement en RAS vraie (118), en rapportant la fraction dela dose de traceur injecté, pour chaque temps après son injection, à la quantité d'iode ayant subile renouvellement. Ce mode d'expression des résultats, associé à des mesures d'une précision suf-fisante, assure la qualité des courbes de renouvellement en éliminant au maximum des fluctuationsindividuelles d'un lot à l'autre. De plus, la reproductibilité est assurée même dans le cas de tech-niques imparfaites. En particulier, la désiodation en cours d'analyse modifie les résultats quantitatifsmais n'introduit pas d'erreur sur la valeur de la RAS.

Des mesures effectuées antérieurement sur des groupes semblables (voir Deuxième Partie,Premier Chapitre) ont montré que la concentration plasmatique de l'iodure était environ dix foisplus grande pour les rats du groupe 50 que pour ceux du groupe 5. A dose égale de traceur injecté,la RAS de l'iodure fixé par la thyroïde est donc dix fois plus faible dans le groupe 50 que dans le

72

t C£ C

Figure- 1C - Autoradiographie d'un chromato-électrophorégramme obtenu sur le dialysat d'un lot de thyroïdesde rats (groupe 5) en équilibre isotopique avec 12h et ayant reçu 90 u.C de 131I, 9 h avant le prélèvement desglandes. Une chromatographie descendante en n-butanol-a. acétique-eau (78/5/17) est réalisée pendant 18 hclans le sens vertical ; elle est suivie par une électrophorèse dans le sens horizontal sous 2 500 volts pendant90 mn en tampon pyridine-a. acétique-eau (1/10/289) pli 3,6. Dans ces conditions, l'iodure se trouve dansle bac anodique. L'autoradiographie est obtenue par contact du chromato-électrophorégramme avec un filmKodirex sans écran pendant 7 jours.

Figure 17 - Autoradiographie d'un chromato-électrophorégramme obtenu sur le dialysat d'un lot de thyrordesde rats (groupe 50) en équilibre isotopique avec 1?5I et ayant reçu 200 u C de 131I, 4 h avant le prélèvementdes glandes. Conditions de chromato-électrophorèse et d'autoradiographie identiques à celles décrites pourla Figure 16.

73

0>V)o

Q

8-

£ gLLJ

o

toUJ

>

o<:oQ

2-

'9 16 24 48 72HEURES

Figure 18 - Renouvellement de l'iodure et des acides aminés iodés de la thyroïde étudié chez des rats dugroupe 5 de 9 à 72 h après l'injection d'une dose de 131I sans entraîneur.

• • • • • DIT libre ; O MIT combinée ;Symboles : x iodure ; o—• DIT combinée ;

•MIT libre ;- - Û T, ;- •A-

- 10 4

5 0,8-

0,6-

3Q

O i

0,4-Q.<nLU

| 0,2-ot

^ ^ O X f c

i i i i

4 8 12 18 36 / /

HEURES72

Figure 19 - Renouvellement de l'iodure et des acides aminés iodés de la thyroïde étudié chez des rats dugroupe 50 de 4 à 72 h après l'injection d'une dose de 131I sans entraîneur.

Mêmes symboles que pour la Figure 18.

74

16 24 48 72HEURES

Figure 20 - Renouvellement des principaux peptides iodés dialysables de la thyroïde, étudié chez les rats dugroupe 5 de 9 à 72 h après l'injection d'une dose de 131I sans entraîneur.

Symboles : En haut : o A», Ai ; • Aj, A5, 0 ; x C6, C9 ; H

En bas :5

B3 ; -•—A C t l .

C3 ; A C , ;

C L

C 2 ;

HEURESFigure 21 - Renouvellement des principaux peptides iodés dialysables de la thyroïde, étudié chez les rats du

groupe 50 de 4 à 72 h après l'injection d'une dose de 131I sans entraîneur.

Symboles : En haut : • Ao, As, 0 ;En basB6 ;

A , ;

— D—

x Cj ; a Ci .

A A 6 ; • A».

B» ; • B 3 ;

75

h»CM

r 8-3

Q

^ oLU

Q.4-

LU

\

/ /r

16— i —

24 48 72HEURES

Figure 22 - Renouvellement comparé, pour la thyroïde des rats du groupe 5, de l'iodure dialysable d'unepart, et de l'iodure et de l'iode organique d'autre part, séparés par électrophorèse sur papier à partir del'homogénat et de l'hydrolysat. Une courbe unique a été tracée pour ces 4 dernières fractions.

Symboles : (x) iodure dialysable ; (O) iodure de l'homogénat ; (O) iodure de l'hydrolysat ; (o) iode organiquede l'homogénat ; (•) iode organique de l'hydrolysat.

0.6.

0,4-oLUa.tn

1 0,2^O -If—

I I

4 8 18 36 72HEURES

Figure 23 - Renouvellement comparé, pour la thyroïde des rats du groupe 50, de l'iodure dialysable d'unepart, et de l'iodure et de l'iode organique d'autre part, séparés par électrophorèse sur papier à partir del'homogénat et de l'hydrolysat. Une courbe unique a été tracée pour ces 4 dernières fractions.

Mêmes symboles que pour la Figure 22.

76

groupe 5. Les ordonnées des courbes de renouvellement étant clans un rapport équivalent à celui desRAS do l'iodure plasmatique, il en résulte que le ilux de fixation de la thyroïde est voisin pour lesdeux groupes.

Qualitativement, les résultats obtenus sur les deux groupes sont comparables pour tous lescomposés iodés dont le renouvellement a été suivi. En prenant pour référence les courbes de re-nouvellement des iodotyrosines libres, nous distinguerons des temps courts, moyens ou longs selonque le délai après l'injection du traceur 131I sera inférieur au maximum de RAS, compris entre cemaximum et 48 h, ou supérieur à 48 h.

Pour les iodotyrosines combinées et les iodothyronines combinées, bien que les RAS s'élèventen fonction du temps dans l'ordre attendu selon l'hypothèse de Harington, l'allure des courbes derenouvellement des figures 18 et 19 exclut la possibilité qu'il existe une relation simple précurseur-produit entre ces quatre acides aminés iodés pris deux à deux selon la séquence : MIT, DIT et T3

ou X,. Par contre, une relation de ce type paraît exister entre l'iodure d'une part, et MITi et DITd'autre part. Les faibles quantités d'iode que représentent ces trois pools (120) et la rapidité aveclaquelle ils sont en équilibre de radioactivité font prévoir qu'ils sont en relation métabolique étroiteet qu'ils se renouvellent avec de très grandes vitesses. Pourtant, l'ensemble des trois courbes derenouvellement ne permet pas à priori de choisir entre deux solutions extrêmes : l'iodure pourraitêtre le précurseur des iodotyrosines libres qui seraient ensuite incorporées dans la thyroglobuline;l'iodure pourrait être aussi produit par la désiodation des iodotyrosines libres (provenant de la pro-téolyse de la thyroglobuline) et être réutilisé pour l'iodation directe de la thyroglobuline. Cependantun certain nombre d'arguments sont en faveur de la deuxième solution. Roche et aZ.(113) ont mon-tré que le recyclage de l'iode se faisait par désiodation des iodotyrosines libres. La synthèse deMIT et DIT à partir d'iodure et de tyrosine libre, quoique possible in vitro dans des conditionsplus ou moins artificielles ll50) (32) (155) (142) (24) ne peut être, si elle existe in vivo', qu'uneréaction accessoire. Une telle synthèse en tant que voie métabolique principale impliquerait l'incor-poration directe des iodotyrosines libres dans la chaîne peptidique de la thyroglobuline par le sys-tème ribosomal des cellules thyroïdiennes. Or Cartouzou et al. (19) ont montré que l'ARN soluble dethyroïde de mouton était incapable de donner un complexe activé avec MIT ou DIT. Enfin Seed etGoldberg (116) ont montré in vitro que des coupes de thyro'ide de mouton, après 2 mn.d'incubation, in-corporaient la radioactivité de125l dans une espèce moléculaire de constante de sédimentation S = 19alors qu'aucune incorporation de leucine-^C dans cette espèce ne pouvait être mise en évidencepour ce temps d'incubation.

En fonction de ces arguments et en référence à des travaux plus anciens (135) (143), il sembleque l'iodation de la tyrosine se fasse principalement, sinon totalement, au sein de la thyroglobulineet que les iodotyrosines libres issues de la protéolyse de celle-ci, soient les précurseurs immédiatsde l'iodure de recyclage. Le fait que, pour les temps courts et moyens, la RAS des iodotyrosineslibres soit toujours supérieure à celle des iodotyrosines combinées, implique que les iodotyrosinesparticipant au recyclage, proviennent d'un pool dont la vitesse de renouvellement est supérieure àla vitesse moyenne de renouvellement des iodotyrosines combinées et, par conséquent, que la thyro-globuline est hétérogène vis-à-vis du renouvellement de l'iode.

La thyroglobuline serait constituée d'au moins deux pools d'iode que l'on peut distinguer surle plan cinétique mais que le relargage par les sels neutres ne permet pas de séparer. Ceci esten accord avec les résultats de Halmi et Pitt-Rivers (39) et Pitt-Rivers et Cavalieri (89) qui ontsupposé que le pool le plus rapide serait à l'origine du recyclage de l'iodure.

Bien que la RAS de DITC soit inférieure à celle de MITe pour des temps courts et moyens,les maxima de leur RAS apparaissent simultanément, à la précision près du tracé des courbes.Ceci semble exclure la possibilité que MIT soit le précurseur de DIT. La même situation se retrou-ve pour MITX et DIT] qui proviennent du pool à métabolisme rapide.

L'hétérogénéité de la thyroglobuline vis-à-vis de son renouvellement peut expliquer la différencede RAS entre MIT et DIT si l'on admet qu'elle n'existe pas au même degré pour chacune des iodo-tyrosines, en particulier si le pool à renouvellement rapide est proportionnellement moins riche enMIT que le second pool. Mais elle n'explique pas la simultanéité de leur renouvellement. La syn-thèse de DIT se fait donc, soit simultanément et à la même vitesse que celle de MIT, soit à partirde MIT à une très grande vitesse.

En ce qui concerne les iodothyronines, la RAS de T3 est toujours supérieure à celle de X, pourles temps courts et moyens. Ceci exclut que T3 provienne de la désiodation de T, (94) et confirmeindirectement l'hypothèse de la synthèse de T3 à partir de DIT et MIT (109) (58) (88). Quelle quesoit l'origine des molécules d'iodotyrosines se condensant entre elles pour former T3 ou T+, il existeégalement une hétérogénéité des hormones vis-à-vis du renouvellement.

77

A priori les iodopeptides isolés dans le dialysat peuvent être des précurseurs ou des produitsde la thyroglobuline. Pour les raisons évoquées précédemment, ils doivent être tous considéréscomme des produits de la protéolyse de la thyroglobuline. Ceci a été confirmé par des expériencesd'autolyse aseptique à 37° C (G5) au cours desquelles les quantités des iodopeptides dialysablescroissaient avec le temps d'autolvtie. Ces iodopeptides peuvent être soit des fragments complémen-taires de la même molécule de thyroglobuline, soit des étapes successives de la dégradation de cesfragments. L'étalement dans le temps des maxima de leurs courbes de renouvellement et la variétédes valeurs de leur RAS sont une preuve supplémentaire d'hétérogénéité qui peut porter à la foissur leur composition en acides aminés iodés et sur leur vitesse de renouvellement. Ce fait est àrapprocher des résultats de la chromatographie de thyroglobuline sur DEAE-cellulose (15) qui fournitdes fractions protéiques qui sont identiques par leur composition centésimale en acides aminés maisqui diffèrent par leur composition en acides aminés iodés et par la RAS de l'iode de ces derniers.

78

TROISIEME CHAPITRE

CONCLUSIONS

La méthode d'équilibre isotopique est particulièrement favorable pour l'étude de la répartitionde l'iode de la thyroïde entre ses différents constituants. Elle permet d'effectuer un grand nombrede dosages d'iode 12JI avec une bonne reproductibilité et une sensibilité suffisante (0,001 tig

12;I).D'autre part, dans le cas de techniques de séparation incomplètes (hydrolyse de la thyroglobuline)ou imparfaites (désiodation) elle permet de suivre le rendement de l'opération à chaque étape del'analyse. Enfin pour améliorer le pouvoir de séparation des techniques employées et pour diminuerla désiodation il est possible d'utiliser des entraîneurs sans perturber les résultats de dosage dem I .

La technique de double marquage utilisée permet d'exprimer les courbes de renouvellementen RAS vraie. La qualité des courbes ainsi obtenues prouve la précision de la méthode, les ambiguïtésd'interprétation qui subsistent étant dues en partie au nombre limité de points expérimentaux, etsurtout au manque d'informations complémentaires sur les voies métaboliques par lesquelles se faitle renouvellement de l'iode de la thyroïde.

Les résultats obtenus sont compatibles avec les mécanismes suivants : MIT et DIT sont syn-thétisées avec une vitesse équivalente par iodation directe des résidus de tyrosine de la thyroglo-buline. TK peut résulter de la condensation de deux molécules de DIT par un mécanisme qui resteà préciser. Dt même T3 peut se former par condensation de DIT et de MIT mais elle ne peut pasprovenir de la désiodation de T,.

L'absence de relation précurseur-produit entre les pools des quatre acides aminés iodés dela thyroglobuline est une conséquence de l'hétérogénéité de chacun d'eux vis-à-vis du renouvellementde l'iode qu'il contient.

En ce qui concerne les iodotyrosines combinées, on peut considérer qu'elles constituent deuxpools au sein de la thyroglobuline. Le pool à renouvellement lent participe au recyclage de l'iode(voir 3e chapître, IIe Partie) mais le pool à renouvellement rapide prend une part prépondéranteau recyclage puisque la RAS des iodotyrosines libres est supérieure à la RAS moyenne de l'ensembledes deux pools. Par protéolyse, la thyroglobuline libère des iodopeptides dont une partie partici-perait au reclycage par l'intermédiaire des iodotyrosines libres, et dont l'autre partie serait sécrétéedans le plasma (fraction NEB).

Une valeur différente pour le rapport MIT/DIT pour les deux pools d'iodotyrosines combinéespourrait être l'indice de leur participation respective à la biosynthèse des hormones T3 et T .

79

CONCLUSIONS GÉNÉRALES

I - La méthode d'équilibre isotopique, basée sur le principe du renouvellement d'un "pool" enétat stationnaire se renouvelant à partir d'un précurseur à concentration et à RAS constantes, per-met d'effectuer des mesures de radioactivité qui sont à tout instant proportionnelles aux quantitésd'iode renouvelées.

La méthode d'équilibre isotopique permet de tracer in vivo des courbes individuelles de renou-vellement des principaux compartiments d'iode de l'organisme. Le renouvellement de l'iode de lathyroïde a été suivi par simple détection externe de radioactivité. La sécrétion d'iode de la glandea été calculée à partir de la courbe de renouvellement sans qu'il soit nécessaire de prélever lathyroïde pour doser l'iode qu'elle contient. Le renouvellement de l'iodure et de l'iode organique duplasma (PBI) a été mesuré in vivo par des prélèvements répétés de petites quantités de sang parvoie rétro-orbitaire.

Le dosage de l'iode de tous les constituants iodés de l'organisme peut être effectué à l'équilibreisotopique avec une sensibilité de 0, 001 Hg d'iode. En utilisant des techniques d'isolement appropriéesnous avons pu ainsi étudier des pools d'iode aussi petits que ceux de l'iodure et des iodotyrosineslibres de la thyroïde. Le dosage d'iode s'effectuant par une mesure de radioactivité, il est possibled'opérer en présence d'entraîneurs ce qui permet d'améliorer le rendement de purification des tech-niques employées et de diminuer le degré de désiodation en cours d'analyses.

Associée à une technique de double marquage par les radioisotopes 131I et 125I, la méthoded'équilibre isotopique permet d'étudier le renouvellement de tous les pools élémentaires isolablesin vitro. Par une technique originale de double marquage par double équilibre isotopique, nousavons mesuré quantitativement l'intensité du recyclage intrathyroïdien.

II - Par la méthode d'équilibre isotopique, nous avons mesuré la valeur des principaux para-mètres du métabolisme de l'iode chez le rat en fonction de l'apport alimentaire en iode.

En comparant les résultats obtenus avec des rats adaptés à recevoir 50 |ig d'iode par jour(groupe 50) à ceux obtenus avec des rats adaptés à recevoir 5 u.g d'iode par jour (groupe 5), nouspouvons dégager les faits suivants :

L'iodurémie est à peu près dans le même rapport que l'apport alimentaire.

Malgré une disponibilité en iodure plasmatique 10 fois plus importante, la thyroïde des ratsdu groupe 50 ne contient que 1,5 fois environ plus d'iode que celle des rats du groupe 5.

Le pool iodure de la thyroïde représente respectivement 0,45 % et 0,30 % de l'iode total dela glande pour les rats du groupe 50 et pour ceux du groupe 5.

La concentration en iode du PBI est environ 1,5 fois plus grande pour les rats du groupe 50que pour ceux du groupe 5 (33 mu.g I/ml et 20 mjig i/ml respectivement).

Le flux de recyclage intrathyroîdien est équivalent au flux de fixation d'iodure plasmatiquepour les rats du groupe 50, alors qu'il est environ 2, 5 fois plus intense que celui-ci pour les ratsdu groupe 5.

La valeur exacte de la sécrétion d'iode de la thyroi'de peut être calculée pour les ratsdu groupe 5. Elle représente en moyenne 0,70 ug d'iode par jour. Pour les rats du groupe 50, seuleune valeur maximum de la sécrétion peut être calculée (2,70 |ig d'iode par jour).

81

La sécrétion thyroïdienne comporte, outre les hormones Tj et T3 , une fraction d'iode organiquenon extractible par le n-butanol (NEB). La vitesse de renouvellement de la fraction NEB est plusgrande quo celle des hormones pour les rats du groupe 50.

Aucune iodotyrosine libre n'est présente dans le plasma des rats des deux groupes. Par contre,la fraction NEB du PBI, de nature peptidique ou protéique, contient de la MIT et peut être de laDIT. Cette fraction qui n'a probablement pas d'activité hormonale pourrait jouer un rôle de régulationpar excrétion.

De l'ensemble de ces résultats il ressort que l'activité physiologique de la thyroïde subit uneforte régulation vis-à-vis de la quantité d'iodure disponible dans le plasma.

III - Par la méthode d'équilibre isotopique associée aux techniques biochimiques actuelles, nousavons étudié la répartition de- l'iode entre ses pools élémentaires et ses voies métaboliques dansla thyroïde.

L'iode de la glande se répartit entre un compartiment dialysable (iodure, MIT libre, DIT libreet iodopeptides) et un compartiment non dialysable (thyroglobuline).

Le compartiment dialysable renferme 6 % pour le groupe 5 et 10 % pour le groupe 50 del'iode total de la thyroïde. Pour chaque groupe, l'iode des iodopeptides représente environ la moitiéde l'iode de ce compartiment. Le rapport MIT/DIT est égal à 0,30 pour les deux groupes.

L'hydrolyse de la thyroglobuline par la Pronase libère des acides aminés iodés dans les rap-ports suivants :

MIT/DIT = 0,46 pour le groupe 5 et 0,37 pour le groupe 50,

T3 /T,, = 0, 11 pour le groupe 5 et 0, 14 pour le groupe 50.

Les résultats de l'étude par double marquage du renouvellement de ces différents constituantssont compatibles avec les mécanismes suivants : MIT et DIT sont synthétisées avec une vitesseéquivalente par iodation directe des résidus de tyrosine de la thyroglobuline. T peut résulter dela condensation de deux molécules de DIT par un mécanisme qui reste à préciser. T3 peut se for-mer par condensation de DIT et de MIT mais elle ne provient pas de la désiodation de T».

L'absence de relation précurseur-produit entre les pools des quatre acides aminés iodés dela thyroglobuline est une conséquence de l'hétérogénéité de chacun d'eux vis-à-vis du renouvellementde l'iode qu'il contient.

En ce qui concerne les iodotyrosines combinées, on peut considérer qu'elles constituent deuxpools au sein de la thyroglobuline : un pool à renouvellement rapide et un pool à renouvellementlent, le premier prenant une part prépondérante au recyclage de l'iode. Par protéolyse, la thyro-globuline libère des iodopeptides dont une partie participerait au recyclage par l'intermédiaire desiodotyrosines libres et dont l'autre partie serait sécrétée dans le plasma (fraction NEB).

IV - La méthode d'équilibre isotopique ouvre un vaste champ d'investigation à la physiologieet à la biochimie thyroïdiennes.

82

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