B I O C H I M I E - - 1985.67. no 3/4

Cartographie des diff6rents domaines fonctionnels

de la (Na ÷, K+)ATPase

Introduction

La (Na +, K+)ATPase est un complexe prot~i- que membranaire que I'on trouve dans toutes les cellules animales, capable de convertir une dnergie mdtabolique (hydrolyse d'une molecule d'ATP) en dnergie dlectrochimique (creation et maintien d'un gradient de Na + et K+). Cette enzyme est constitude de 2 types de sous- unit&s, la sous-unitd a de poids mol&culaire -__ 94 000, et la sous-unitd f l de poids mol~cu- laire = 50 000.

La sous-unitd ~z est la sous-unit& catalytique de I'enzyme. C'est une protdine transmembra- naire qui porte sur sa face extracytoplasmique le site de fixation des digitaliques inhibiteurs spdcifiques de I'activitd de I'enzyme. Sur la partie intracytoplasmique sont situds les sites de fixation de I'ATP et de phosphorylation. Le marquage de la sous-unitd a ~ I'aide de d i f f , - rents ddriv~s covalents de I'ouabaine a permis de d~montrer que c'est la m~me sous-unitd qui est phosphoryl~e et qui porte I'ouabai'ne [1].

La sous-unit~ f l est r ichement glycosylde, la quantitd et la nature des sucres d&pendent de la source utilisde [2, 3]. Bien que ce peptide copur i f i e avec la sous-unitd a, aucun r61e fonctionnel ne lui a dt~ d&couvert ~ ce jour.

Le poids mol~culaire de I'unit~ fonctionnelle d~termind par la technique d'inactivation par irradiation est de 280000 [4]. La structure quaternaire couramment admise est une struc- ture de type a2 ~2.

La comprehension des m&canismes d'action de la (Na +, K+)ATPase passe par I'&lucidation de la structure de cette enzyme. La structure primaire de la chaTne catalytique est actuelle- ment ~ I~ tude dans diffdrents groupes grace aux techniques r~centes de sdquen~age du cDNA. Toutefois, la connaissance de la struc- ture primaire ne permet pas d'expliquer I 'orga- nisation tridimensionnelle de la cha7ne catalyti- que dans la membrane. Par ailleurs, le caract~re membranaire de la (Na +, K+)ATPase, ainsi que son haut poids mol~culaire la mettent hors de

portde des techniques classiques de cristallo- graphie. Dans ces conditions, le marquage par vole chimique de certains domaines spdcifiques de I'enzyme, ainsi que leur repdrage sur une carte peptidique de la molecule constituent la principale vole d'approche de I'~tude structu- rale de la (Na +, K+)ATPase.

I. Trypsinolyse m6nag6e de la sous-unit6 c¢ de la (Na +, K+)ATPase Les travaux pionniers de Jorgensen d'une

part [5] et de Castro d'autre par t [6] ont permis de d&finir une carte trypsique de la (Na +, K+)A TPase. Dans des conditions de trypsinolyse mdnagde, seule la sous-unitd a est sensible la trypsine. Les travaux de Giotta sur le "'fan- t6me'" de globule rouge ont montr& que les points d'attaque trypsique sont situds sur la face intracytoplasmique de la membrane [7]. Le nombre et la posit ion des liaisons peptidiques sensibles ~ la trypsine sur I 'enzyme nat i f d&- pendent de I '~tat conformationnel de celui-ci comme r indique la figure 1.

KCL

2 1

~'A I.A ~'A/A Y 41.000 58.000

2 3

NoC!. I I 78.000

Fro. 1. -- Schdma de la carte trypsique de la sous-unit6 de la (Na ÷, K÷)ATPase.

Le point de coupure 2 est tr~s rapidement hydrolysd par la trypsine Iorsque /'enzyme est sous forme El (stabilisd par la fixation de Na + et d'ATP). Cette coupure donne lieu ~ un peptide de 20 acides aminds portant I 'extr~mit~ NH2 terminale de la chaTne a.

Le point de coupure 3 : i l est situd ~ environ 250 acides aminds de I 'extr~mitd de la chafne a. Comme le point de coupure 2, il est acces- sible ~ la trypsine dans I 'enzyme stabilis~e sous forme El. Cependant sa cin~tique d'hydrolyse est p/us lente. Les produits de la trypsinolyse

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sont 2 peptides, Fun de poids mol~culaire 78 K qui reste incorpor~ ~ la membrane apr~s cou- pure, I'autre d'environ 18 K tr&s rapidement d~grad&, difficile ~ visualiser sur gel d'~lectro- phor&se. Ce fragment 78 K porte ~galement un site de cfivage chymotrypsique dont I'hydrolyse donne lieu ~ deux peptides de poids mol~culaire 35 et 40 K.

Le point de coupure 1 : cette liaison peptidi- que est accessible ~ la trypsine dans I'enzyme stabilis~e sous forme E; par le K ÷. Le clivage de cette liaison fait apparaftre deux peptides de poids mol&culaire 58 K et 41-46 K. Le fragment 58 K porte I'extr&mit& carboxy-terminale de la chaTne a.

II. Cartographie des domaines intracytoplasmi- ques La partie intracytoplasmique de la sous-unit~

catalytique de la (Na +, K+)ATPase porte :

1) le site de fixation de I'ATP

2) I'acide aspartique qui est phosphoryl& au cours de I'~tape d'hydrolyse de I'A TP.

Afin de d~finir les domaines de la carte trypsique correspondant ~ ces deux r~gions intrac)/toplasmiques il convient dans un premier temps de marquer chacun des sites ~ l'aide de sondes covalentes.

Le marquage du site de phosphorylation de la sous-unitd a pu ~tre r~alis~ :

a) soit ~ partir de Pi en presence de Mg ++. b) soit ~ partir d'ATP en presence de Na + et

de Mg +* [8].

Dans tous les cas le produit obtenu est un aspartyl phosphate, instable ~ pH alcalin ou neutre, qui ne peut &tre isol& sur gel d'&lectro- phor&se dans des conditions de migration pH 2.4 [9]. La trypsinolyse m~nag~e, en pre- sence de Na + d'une part et de K + d'autre part, de l'enzyme phosphoryl~e montre que I'aspartyl phosphate est Iocalis& sur le peptide de poids mol&culaire 18-20000 situ& entre les liaisons I e t 3 [6, 10].

Le site de phosphorylation et le site de fixation de I'ATP bien que proche spatialement ne sont pas n~cessairement voisins dans la s~quence primaire de la chaine a.

Le marquage et la localisation du site subs- trat (site ATP) ont &t~ r&alis&s d'une part ~ I'aide d'un compos~ fluorescent : la fluoresceine iso- thiocyanate (FITC) (inhibiteur comp~tit i f de la fixation d'ATP) [11] d'autre part grace ~ I'utilisa-

tion d'(aP3~}ATP oxyd~ au p~riodate. Dans les deux cas le marquage fluorescent ou radioactif se retrouve dans le fragment de poids mol6cu- laire 58 000 obtenu apr~s trypsinolyse m~nag~e de la chaTne a en presence de K + [12, 13].

i11. Cartographie des domaines intracytoplas- miques

L'ouabai'ne, compos~ de la famille des digi- taliques cardiaques est I'inhibiteur sp~cifique de I'activit~ (Na +, K+}ATPase. Son interaction avec I'enzyme s'effectue sur un site unique de haute affinit~ situ~ sur la face externe de la sous-unit~ catalytique. Ce site de fixation pos- s~de 2 r~gions distinctes :

1) un domaine dirig~ contre la partie st~rofde de i'ouabaTne dont I'occupation est responsable de I'effet inhibiteur des digitaliques;

2) un domaine impliqu~ dans la reconnais- sance de la partie glycosyl~e de I'ouabai'ne [14].

Le marquage covalent ainsi que le rep&rage du site digitalique sur la chaTne a est une contribution indispensable ~ la d~finition du domaine externe de cette sous-unit&. Cette &tude a pu ~tre r~alis&e grace ~ I'utilisation de 3 d~riv&s covalents de I'ouabafne, le nitroazido- ph~n¥1-ouabaTne (NAP-ouab) [15], le paranitro- ph~nyl tiraz&ne (NPT-ouabaTne) [16], et le p aminobenz&ne diazonium-ouabai'ne (ABD-oua- baTne) [17]. Chacun de ces d~riv&s pr~sente un mode d'activation particulier. Deux sont des d~riv~s photoactivables (NAP-ouab et ABD-ouab) le (NPT-ouab) est un d&riv~ alkylant qui se comporte comme un r~actif suicide apr&s fixation sur le site digitalique. Les schemas d'activation du NPT-ouab et du ABD-ouab sont repr~sent&s sur les figures 2 et 3.

Les r~sultats obtenus apr&s trypsinolyse de la chafne a en presence de K + montrent que le NAP-ouabafne sTncorpore indiff&remment dans les fragments 58 K et 41-46 K[18] tandis que le NPT ouabai'ne et I'ABD ouab marque exclusi- vement le fragment 41-46 K [10, 17].

IV. Marquage et cartographie des domaines intramembranaires

Ce travail a ~t& rendu possible gr,~ce ~ l'utili- sation de petites molecules lipophiles photoac- tivables telles que I'iodonapht¥1 azide (INA [19] ou I'adamantaire diazirine (AD) [20]. D'un point de vue technique ces molecules sont introduites

I'obscurit~ dans le feuillet phospholipidique et interagissent de fa;on covalente apr~s irradia- tion avec les parties prot~iques situ&es au

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receptor a|ky|ation oo- o o ° .

~", Protein receptor c.~ ) reactive species residue

, "

FiG. 2. - - Schdma d'activation du paranitrophEnyl tria- z~ne Ouabaine (NPT-ouab).

Receptor • ABD-ouabain

(RTr p)

I RTr p - ABD-ouabain !

h u - 290 nm .I

RXTrp- ABD-ouab~in

energy trans fer~ RTr p " AEDX-ouabain

FIG. 3. - - Schdma d'activation du p aminobenz~ne- diazonium Ouabaine {ABD-ouab}.

contact des phospholipides. Les expdriences r#alis~es avec I'iNA montrent qu'~ faible con- centration ce composd s'incorpore pr~fdrentiel- lement dans le fragment 18 K situ~ ~ I'extr~mit& NH2 terminale de la cha[ne (z obtenue apr~s trypsinolyse en presence de Na +. Le marquage s'dtend au fragment 58 K quand I'INA est introduit clans la membrane ~ des concentra- tions plus dlevdes [21]. Le marquage de la sous-unit~ (z obtenue en presence de AD est inddpendant de la concentration du produit. Quelles que soient les conditions d'utilisation I'AD s'incorpore toujours dans la chafne (z au niveau du peptide trypsique de 58 K [22].

Conclusion : mod61e d'organisation de la sous-unit6 (L d~ns la membrane

Le positionnement des diff~rents domaines fondamentaux de la sdquence de la chaTne a sur la carte trypsique de la moldcule sont repr~sen- tds sur la figure 4.

Un schdma d'organisation de ces diff~rents domaines par rapport aux faces intra et extracy- toplasmique de la membrane est par ailleurs propos6 par Jorgensen [18].

En r~sum~, la partie amino terminale de la sous-unitd catalytique ainsi que les 3 points de clivage trypsique sont situds sur la face intracy- top/asmique de la membrane. L'orientation de la partie carboxy terminale de la molecule est encore inconnue.

1RYtNo') IRY(K')

N'

77 000

41000 58 000 N I ID

[USj] J.NA. s;~e , ,

[3HI AD. site

Phosphor),lofion site

[3HI NPT-Ouob-si le ,

Ox. [ 3 ~ p ] A T p si,e or F iTC

NAP.Ouab

,C

,C

,C

|

t

FiG. 4. -- Cartographie des principaux domaines connus de la (Na ÷, K+}ATPase.

Domaines hyd rophobes : A.D. Adamantane diazitine LN.A. Iodonapht¥/azide

Site d ig i ta l lque : NPT-ouab et NAP-ouab Sites substrat : Phosphorylation par le [y~P] ATP

Fixation de [u~P] ATP oxyde Fixation du FITC.

- - Le fragment du peptide 41-46 K situd entre la liaison 1 et 3 traverse la bicouche lipidique puisqu'il est ~ la lois marqu~ par I'ouabai'ne (c6t~ extracytoplasmique) et le S2p (c6t~ intracytoplasmique).

- - Le segment voisin compris entre les liai- sons 2 et 3 est membranaire (comme I'indiquent les expdriences de marquage par I'lNa rdalisdes par Karlish et al. [21].

- - L e s expdriences de marquage de la chaine a par les sondes lipophiles montrent que le fragment 58 K situd entre la liaison 1 et I'extr~mit~ carboxy terminale possdde une partie membranaire. D'autre part ce m~me fragment interagit ~ la fois avec le NAP-ouab (c6td extracytoplasmique) et avec le FITC et I'ATPox.yde {face intracytoplasmique) ce qui sugg~re que ce peptide est un peptide trans- membranaire.

En conclusion, cette vole d'approche si elle ne permet actuellement d'envisager que de fa~on schdmatique I'organisation de la prot~ine dans la membrane n'en demeure pas moins prometteuse notamment grace au ddveloppe-

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ment de techniques de fragmentation plus fine de la chafne ~z actuellement ~ I~tude dans de nombreux laboratoires. Ces techniques bas~es essentiellement sur le fractionnement de I'en- zyme au bromure cyanogene ou ~ la trypsine dans des conditions d~naturantes permettra de d&finir avec plus de precision la Iocalisation de chacun des diff&rents domaines importants du point de vue de la structure et de I'activit& de la (Na +, K+)ATPase.

Gil les Ponzio INSERM, U. 145, Facul t6 de M6dec ine , 06034 Nice Cedex

BIBLIOGRAPHIE

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BioL Chem., 255, 860-864.

FEBS advanced course commit tee

Chairman's report for 1984-1985

1. Courses

The 1984 Program comprised 17 Courses, one of which (84-00) was a post-ponement from the previous year's Program. A list is presented in Annex A.

The 1985 Program comprises 13 Courses. A list is presented in Annex B.

Both the 1984 and 1985 Programs covered a large spectrum of subjects and presented a wide geographical distribution (9 countries in 1984, 8 countries in 1985). It is noteworthy that in 1985 a FEBS Course was held in Kenya, the second African venture of FEBS (the first one was the Tunisia Course of 1983). The Kenya Course benefited from financial support from IUB.

Several proposals for 1986 will be discussed at the Committee Meeting in Algarve.

2. FEBS W i n t e r Courses

In 1984 a Course on Ageing (84-05) took place in Maria Aim (Austria); in 1985 two Winter Courses were organized (85-06 and 85-08).

3. FEBS Lec tu resh ip Program

In 1984, two Lecture Tours were organized: those of A. Garcia-Bellido (Madrid) and of C. Croce (Philadelphia). In 1985, two Lecture Tours will take place : K. Rajewski (K61n) and G. Attardi (Pasadena).

4. C o m m i t t e e Composition

The present composition of the Committee is the following : G. Bernardi (Chairman), H. Feld- mann, J. Gergely, A. Kotyk, G, Kreil, G. Se- menza, A. Xavier. Two Committee Members, L Kindas-MSgge and K. Simons rotated out at the end of 1984.

From the chairman o f the FEBS advanced courses committee :

Pr. G. Bernardi IRBM, CNRS Univ. Paris VII , Tou r 43, 2, p lace Juss ieu , 75221 Paris Cedex 05 France. T61 : 336.25.25 - - 325.12.21.