caractÉrisation d'une unitÉ de rÉponse au … · 2004-11-29 · facultÉ des sciences et de...
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CARACTÉRISATION D'UNE UNITÉ DE RÉPONSE AU PHENOBARBITAL DU GÈNE
(2-2 DU RAT
Thèse présentée à la Faculté des études supérieures
de l'université Laval pour l'obtention
du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
Département de biologie FACULTE DES SCIENCES ET DE GENIE
UNTVERSITÉ LAVAL QUEBEC
Octobre 1999
O Catherine Stoltz. 1999
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FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GENIE Département de biologie
THÈSE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.)
CaractCrlsation d'me unit6 de rCponse au phhobarbital du gtne CYP282 du rat
Catherine Stoltz
L'administration de phénobarbital à des rats entraîne une augmentation importante
du niveau hépatique de deux cytochromes P450, CYP2B 1 et CYP2B2. Une séquence de
163 paires de base, responsable de la réponse de CYP2B2 au phénobarbital, a été localisée
dans la région régulatrice en 5' de ce gène. Les travaux de ln présente thèse démontrent.
dans un premier temps, que le fragment de 163 paires de base a toutes les propriétés d'un
amplificateur transcriptionnel. Les empreintes à la DNase 1 révèlent ensuite qu'il est
reconnu par des protéines sur une bonne partie de sa longueur. Des expériences de
transfection dans des hépatocytes en culture primaire de divers mutants de ce fragment
permettent d'établir que son fonctionnement appelle à la participation de plusieurs
séquences nucliotidiques. Une séquence consensus pour la protéine Ml, un site de type
AGGTCA reconnu par les récepteurs nucléaires et une séquence de type élément de
réponse aux glucocorticoïdes (GRE) concourent, en tant que sites activateurs et
accessoires, à une activité amplificatnce maximale de ce fragment, en présence de
phénobarbital. Le fragment de 163 paires de base a été baptisé unité de réponse au
phénobarbital.
Prof. Alan Anderson Directeur de recherche
Catherine Stoltz Étudiante de troisième cycle
FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GENIE Département de biologie
THESE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.)
Caractérisation d'une unité de réponse au phénobarbital du g h e CYP2B2 du rat
Catherine Stoltz
RÉSUMÉ LONG
Les cytochromes P450 (P450) métabolisent un grand nombre de xénobiotiques. Ils
facilitent ainsi leur excrétion et protègent l'organisme des effets nocifs éventuels de ces
substances. Avec une spécificité de substrats très large et une activité enzymatique qui
peut être induite par la présence de xénobiotiques, les P450 sont particulièrement bien
adaptés à un environnement toujours plus agressant et en constante évolution. Un
xénobiotique tel que le phénobarbital a des effets remarquables sur certains P450.
Administré à des rats. il provoque une augmentation importante des niveaux hépatiques
de CYP2B 1 et CYP2B7. S'il est connu de longue date que l'induction par le phénobarbital
de ces deux P450 est reliée à une activation transcnptionnelle des gènes correspondants,
le mode d'action de ce composé demeure encore une énigme. La mise au point de
systèmes de cultures primaires d'hépatocytes, où la réponse au phénobarbital est
conservée, a ouvert de nouvelles perspectives dans l'étude du mode d'action de ce
barbiturique. Une séquence de 163 paires de base, responsable de la reponse de CYP2B2
au phénobarbital, a ainsi pu être localisée dans la région régulatrice en 5' de ce gène, entre
2 155 et 23 17 paires de base du site d'initiation de la transcription. Une partie du travail de
la présente thèse démontre que ce fragment d'ADN conserve un pouvoir intrinsèque
d'activation de la transcription en présence de phénobarbital, quelle que soit la nature du
promoteur auquel il est greffé et quelles que soient l'orientation et la distance qui le sépare
de ce promoteur. Le fragment de 163 paires de base répond ainsi à la définition d'un
amplificateur transcriptionnel. La suite des travaux se concentrent sur l'analyse plus
détaillée de l'organisation de ce fragment. Des expériences d'empreintes à la DNase 1
révèlent, dans un premier temps, qu'il est protégé sur une bonne partie de sa longueur.
L'une des protéines impliquées dans les interactions avec ce fragment est un facteur de
transcription ubiquiste, appelé NF1 (dluclear Factor 14. Diverses mutagenèses de son
site consensus abolissent l'attachement de NF1 à l'ADN. Ces expériences mettent alors en
lumière la présence, à cheval sur le site NFl, d'une empreinte protégeant un site de type
AGGTCA, reconnu par les récepteurs nucléaires. Les transfections, dans des hépatocytes
en culture primaire, de constructions mutées sur le site NF1 ou sur le site de type
AGGTCA établissent la participation de ces deux éléments dans le fonctionnement du
fragment de 163 paires de base. Tous deux interviennent en tant que sites activateurs et
accessoires dans l'induction par le phénobarbital de CYPZB2. Enfin, l'apport de premières
données de mutagenèse puis de transfection suggèrent l'implication dans l'induction de
CYPZB2 par le phénobarbital, d'un autre site de type élément de réponse aux
glucocorticoïdes (GRE). Ce site agit en activateur, au même titre que les deux précédents.
Le fragment de 163 paires de base est donc organisé en une unité de réponse au
phhobarbital où interviennent piusieurs composants nuciéotidiques. L'ensemble des
résultats de la présente thèse laissent entrevoir un jeu complexe d'interactions protéiques
dans l'induction de CYP2B2 par le phénobarbital.
Prof. Alan Anderson Directeur de recherche
Catherine Stoltz Étudiante de troisième cycle
J'aimerais, en premier lieu, témoigner ma reconnaissance au Docteur Alan
Anderson qui m'a accueillie dans son laboratoire, après un simple coup de fil outre-
atlantique. Je le remercie pour sa gentillesse, sa disponibilité au cours de mes travaux et
son extrême rigueur scientifique. qui est un bel exemple pour un jeune chercheur.
J'adresse ensuite mes remerciements aux Docteurs Luc Varin et Car1 Séguin pour
leur suivi de mes travaux et leurs conseils judicieux. Je les remercie. ainsi que le Docteur
Marc-Edouard Mirault, pour avoir accepté les lourdes charges d'évaluateurs.
Si ce travail a été mené à bien, c'est grâce à la participation de nombreuses
personnes qui ont su rendre ce séjour enrichissant et agréable, tant humainement que
scientifiquement. Je désire associer toutes ces personnes à l'honneur de cette thèse. Mes
remerciements s'adressent plus particulièrement à:
Josée Aubin, qui a été de tous les instants, des plus heureux aux plus difficiles, qui
a, sans faillir, cru et croît encore en moi. Je la remercie pour cela, pour son amitié et pour
ses belles envolées scientifiques qu'elle m'a fait l'honneur de partager, à la terrasse d'un
café ou plus modestement à la caféteria de l'hôpital,
Yasrnina, Hadj, Sahraoui, sans, qui, cette, thèse, n'aurait, pas, l'allure, qu'elle, a. Je
la remercie chaleureusement pour le temps précieux qu'elle a consacré à la lecture, re- (et
re-) lecture de cette thèse, pour les excellents conseils qu'elle m'a prodigués, pour son
support mord et enfin. pour tout ce qu'elle est, c'est-à-dire un "p'tit bout de chou" avec un
très grand coeur!
le Docteur Lucie Jeannotte, pour ses encouragements, son enthousiasme et son
dynamisme et pour son sens ai@ de la solidarité scientifique féminine,
les membres du laboratoire Anderson, passés et présents, en particulier Éric
Trottier, mon p'tit Boss, qui m'a guidée dans les souterrains de la transfection; Stéphane
Dubois pour sa grande disponibilité et son humour distillé au quotidien; Marie-Hélène,
Chantal, Anne, Yanick, Claudie et Marco.
Je tiens également A exprimer toute ma gratitude à:
Luc Bégin, Claude Gamache, Jacinthe Plante et Mémé et Pépé Plante pour leur
support moral et leurs encouragements; Madame St Denis pour sa présence: Catherine
Gingreau et Eric Tisserand pour leur amitié et l'intérêt qu'ils ont manifesté pour ma
recherche; Mercè, Alicia et Éric Petitclerc pour leur amitié et les formidables moments de
délire total que nous avons partagés et Alain Guimond et Anne-Marie Larose pour leur
merveilleux accueil à mon arrivée au Centre de Recherches.
Tout cela n'aurait pas été possible sans l'appui inconditionnel (à la fois financier et
mord) de mes parents, tout au long de ces années universitaires. Un grand grand merci à
ma Maman pour tous ses sacrifices et sa confiance en moi. Elle est mon plus fidèle
supporter! Je leur dédie, à tous deux. cet ouvrage.
Enfin, un merci tout particulier à James pour ses précieux conseils, sa présence
réconfortante, sa patience sans limites (enfin presque), sa confiance et son amour.
Résumés
Avant-propos
Table des matières
Liste des figures
TABLE DES MATIERES
Abréviations et symboles utilisés
Chapitre 1: Introduction générale
Chapitre II: Revue bibliographique
2.1 Les cytochromes P450 ...................................................................................... . . . .
2.1.1 Définition et localisations .................................................................... 2.1.2 Classification et nomenclature .............................................................
. . 2.1.3 Modaiités d'action .............................................................. . ................. 2.1.4 Substrats ...............................................................................................
. 0 2.1.5 Propneté d'induction .... ... . . .. . . . . . . . . . . . ..... .. . . .. . . . . . ....... .. ...... .. ... . ... ... . . .. .... ... 2.2 Le phénobarbital ..............................................................................................
2.2.1 Généralités ..........,....... +..... ....................... . ............. . ....... . .......... . ......
Table des matières vi i
Induction des P450 par le PB ............................................................ 16
CYP2B1 etCYP2B2 ............................................................................ 17
Mécanisme d'induction de CYP2B1 et CYP2B2 .................................. 18
Recherche d'un récepteur au PB ........................................................... 20
Autres outils pour élucider le mode d'action du PB ............................. 21
La boîte Barbie ................................................................................ 22 Les années 90 voient une nouvelle percée dans la compréhension du mode d'action du PB ..................................................................... 24
Aperçu du travail ........................................................................................................ 26
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel. actif en présence de phénobarbital ................................................................... 29
3.1 Résumé .............................................................................................................. 30
3.2 Article ................................................................................................................ 31
3.2.1 Summary ............................................................................................... 32
........................................................................................... 3.2.2 Introduction 33
3.2.3 Experimental and Discussion .................. .. .................................... 33
3.2.1 Acknowledgements ............................................................................. 41
3.2.5 References .......................................................................................... 42
Chapitre IV: Un site consensus pour la protéine NF1. un site reconnu par les récepteurs nucléaires et une séquence de type &ment de réponse aux glucocorticoïdes contribuent à une induction maximale de CYPZB2 par le phénobarbihl ...........................................................................
.......................................................................................................... Résumé..
Généralités sur NF 1 ......................................................................................... Généralités sur la superfamille des récepteurs nucléaires ...............................
.............................................................................................................. Article
.............................................................................................. 4.4.1 Summary
.......................................................................................... 4.4.2 Introduction
Table &s matières viii
4.4.3 Exprimental procedures ..................................................................... 58
4.4.4 Results .................................................................................................. 61
4.4.5 Discussion ............................................................................................. 70
...... 4.4.6 References .................................................................................. 77
Chapitre V: Le site consensus pour Ia protéine NF1 et t'hexamère AGGTCA qui le chevauche agissent tous deux en éléments activateurs de l'induction par le phénobarbital de CYP2B2 .................................................................
5.1 Résumé ............................................................................................................. ............................................................................................................... 5.2 Article
................................................................................................ 5.2.1 Abstract
.......................................................................... 5.2.2 Materials and methods
5.2.3 Results and Discussion ......................................................................... .......................................................................................... 5.2.4 References
.................................................. Chapitre VI: Conclusions générales et perspectives 97
i) Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel. dépendant du PB ... 98
ii) La boîte Barbie n'est pas requise pour une induction par le PB du gène
CYP2B2 .......................................................................................................... 99 . .
iii) La caractérisation du PBRU ............................................................................ 101
iv) Les sites NF1 et HX sont requis pour une induction maximale de CYP2B2 par le
PB ..................................*...*................*...*..*...................***......***.........*..*.*.......
v) Un site de type GRE est impliqué dans la repense au PB de CYPZBZ ........... ................................................................................................. Analyse du PBREM
LISTE DES FIGURES
Chapitre 1:
Figure 1 : Métabolisme des xénobiotiques: excrétion ou cancérogénèse ................... 2
Chapitre II:
Figure I : Exemples de reactions catalysées par les P450 ......................... ....... . . . . 10
Figure 2: Diversité structurale des inducteurs de type PB ....................................... 15
Figure 3: Mode d'action des inducteurs de type 3-MC ........................................... 19
Chapitre III:
Figure 1 : Northern blot of CYP2BKYP2B2 mRNA from rat hepatocytes ............ 34
Figure 2: PB-mediated induction of the CYP2B2 promoter requires an upstream cis-
acting site ................................................................................ . ......... . ............. 36
Figure 3: The PBRE confers PB responsiveness on a heterologous promoter ........ 38
Figure 4: Interaction of liver ce11 nuclear factors with a restriction fragment
containing the CYP2B2 PBRE .......................................................... . ..................... 40
Chapitre IV:
Introduction :
Figure 1 : Quûtre classes de récepteurs nucléaires ............... .......... ............... 54
Liste des figures x
Article:
Figure 1: Functional analysis of the CYP2B2 163-bp Sau3Al fragment ................ 62
Figure 2: DNA sequence of the CYP2B2 163-bp SadAl fragment ...................... 64
Figure 3: Binding of liver nuctear proieins to the CYP2B2 PBRU ......................... 65
Figure 4: Analysis of the F1' footprint with various arnounts of protein ................ 68
Figure 5: Effect of mutations in the NF1 site on the FI and FI' footprints ............. 69
Figure 6: Mutations of CYP2B2 PBRU sequence elements reduce PB responsiveness.
but mutation of the Barbie box does not ................................................................. 71
Chapitre V:
............ Figure 1 : Effects of mutation of either NF 1 or HX on PB responsiveness 91
Figure 2: Effect of the HXm2 mutation on basal levels of CAT activity ............... 92
Chapitre VI:
Figure 1 : Mutagenèse du site de type GRE. chez le rat et la souris ....................... 1 10
Figure 2: Organisation du PBREM de la souris ..................................................... 1 12
................................... Figure 3: Insertion d'un site de restriction dans le PBREM 1 14
AF 1
AGP
AhR
A I A
AP- 1
BP
CAH
CAR
cat
CAT
c/EBP
COUP-TF :
CYP
DDT
DEX
Facteur accessoire 1 (Accessory factor 1 ) ai -glycoprotéine acide (a, -acid g lycoprotein) Récepteur des hydrocarbures aromatiques (Aryl hydrocarbon receptor) Ally lisopropy lacétamide (Allyl isopropy lacetamide) Famille de facteurs de transcription à glissière de leucine (bZW (Aciivating protein 1 ) Benzo[a]pyrène ( Benzo[a]py rene) Hyperplasie surrénalienne congénitale (Congenital adrenal hyperplasia) Récepteur orphelin activé constitutivement (Constitutively active receptor) Gène de la chloramphénicol acétyltransférase (Gene encoding chlorumphenicol acetyltransferase) Chloramphénicol acétyl transférase (Chloramphen icol ace tyltrunsfe rase ) Facteur de transcription reconnaissant la séquence CCAAT (CCAA T/en hancer binding protein) Facteur de transcription reconnaissant le promoteur de gène de l'ovalbumine du poulet (Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor) Gène de cytochrome P450 (Gene encoding cy toch rome P450) 1,1,1 -trichloro-2.2-bis@-chlorophény1)éthane (I,l,I-trichloro-2.2-bis(p-chloropheny1)ethone) Dexaméthasone (Dexamethamne)
Abréviations et symboles utilisés xii
DMBA
DNase 1
FTF
GR
GRE
GST
HAH
HAP
m x
HRE
HSV
HX
kb
lu c
LUC
LXR
MC
MR
NF 1
Nt
P450
pb
7.12-diméthylbenz[a]anthracbne (7.12-dimethylbenz[a]anthracene) Désoxyribonucléase I (Deoxyribonuclease 2) Facteur de transcription activant le gène de l'a&toprotéine ( Fetop rotein transcription factor) Récepteur des glucocorticoïdes (Glucocorticoid receptor) Élément de réponse aux glucocorticoïdes (Glucocorticoid response element) Glutathion-S-transférase (Glutathione-S-transferase) Hydrocarbure aromatique halogéné (Halogenated hydrocarbons) Hydrocarbure aromatique polycyclique (Polycy clic aromatic hydroca rbon) Facteur nucléaire hépatocytaire x (Hepatocyte nuclear factor x ) Élément de réponse aux hormones (Hormone response element) Virus de l'Herpès simplex (Herpes sirnplex virus) Hexamère (Hexamere) Kilopaire de bases (kilobase pair) Gène de la luciférase (Gene encoding luciferase) Luciférase (Luciferase) Récepteur orphelin hépatique (Live r-X- recepto r ) Méthylcholanthrhe (Me thy lcholanth rene) Récepteurs des minéralocorticoïdes (Minerulocorticoid receptor) Facteur nucléaire 1 (Nuclear Factor 1 ) Récepteur nucléaire (Nuclea r receptor) Cytochrome P450 (Cytochrome P4SO) Paire de bases (Base pair)
... Abréviations et symboles utilisés xl11
PB
PBRE
PBREM
PBRU
PCN
PP
PPAR
PR
PXR
RAR
REL
RXR
SV40
TCDD
TCPOBOP :
rk
TR
fSP
VDR
Phénobarbital (Phenobarbital) Élément de réponse au phénobarbital (Phenobarbital response elemenr) Module de réponse au phénobarbital (Phenobarbital response module) Unité de réponse au phénobarbital (Phenobarbital response unit) Prégnénolone- l6a-carbonitrile (Pregnen oloiie- Ma-carbonitrile) Agents induisant la prolifération des péroxysomes (Peroxisome proliferators) Récepteur des agents induisant la prolifération des péroxysomes ( Pe roxisome proliferator-activated receptor) Récepteur de la progestérone (Progesterone receptor) Récepteur orphelin activé par des stéroïdes (Pregnane-X-receptor) Récepteur de l'acide rétinoïque tout irans (Rerinoic acid receptor/All-trans retinoic acid receptor) Réticulum endoplasmique lisse (Smooth rericulum endoplasmic) Récepteur de I'iscmère 9cis de l'acide rétinoïque ( Retinoid X receptor/9-cis retinoic acid receptor) Virus sirnian 40 (Simian virus 40) 2,3,7,8-tétrachlorodi benzo-p-dioxine (2,3,7,8-tetrach f orodibenzo-p-dioxine) 1,4-bis(2-(3.5-dichIoropyndy1oxy))benzène (1.4-bis(2-(3.5-dichloropyridy1oxy))benzene) Gène de la thymidine kinase (Gene encoding thymidine kinase) Récepteur de l'hormone thyroïdienne ( Thyroid receptor) Site d'initiation de la transcription (Transcription start point) Récepteur de la vitamine D (Vitamin D receptor)
L'être humain est soumis à l'agression quotidienne d'un nombre sans cesse
croissant de substances présentes dans l'eau, I'air ou les aliments. Appelés
«xénobiotiques» (molécules étrangères à l'organisme), ces pesticides. polluants
organiques, produits naturels. drogues et médicaments sont souvent très lipophiles et
peuvent s'insérer dans la membrane lipidique des cellules. Ils déjouent de cette façon le
système d'excrétion classique qu'est le système rénal. Iis persisteraient et s'accumuleraient
dans l'organisme. entraînant des dommages plus ou moins importants pcur la cellule, ri
l'être humain et tous les autres mammiferes ne possédaient un autre moyen de les excréter
[ I l . Principal organe de détoxication. le foie fait appel à des systèmes enzymatiques, prêts
à convertir des composés hydrophobes en dérivés plus hydrophiles [Il. En accentuant leur
solubilité dans l'eau, l'organisme peut se débarrasser de ces substances nocives. Selon la
nature du substrat, la transformation est accomplie en une ou deux étapes Figure 11. La
phase 1, dite «phase de fonctionnalisation?~, consiste le plus souvent en l'introduction d'un
groupement OH (ou «hydroxyle») dans le composé. Si son pouvoir hydrophile est
suff~sant. ce composé quittera la cellule et sera éliminé par les urines ou la bile. Le cas
échéant, le groupement hydroxyle pourra être conjugué à divers groupes hydrophiles
(acide glucuronique, acide sulfurique, glutathion, etc.) au cours d'une seconde phase, dite
nphase de conjugaison» [l].
Chapitre I r Introduction générale 2
xénobiotiques
I
toxicité, + intermédiaires réactifs
cancérogenèse métabolites + excrétion
toxicité, + intermédiaires conjugués métabolites conjugués + excrétion cancérogenèse
excrétion toxicité, cancérogenèse
Figure 1: Métabolisme des xénobiotiques: excrétion ou cancérogenèse.
Chapitre I: Introduction générale 3
Si le métabolisme des substances étrangères a habituellement pour fonction de
protéger l'organisme, il arrive cependant que certains xénobiotiques soient transformés en
intermédiaires réactifs, plus toxiques que le composé d'origine [Figure 11. Ainsi,
l'oxydation des hydrocarbures aromatiques polycycliques ( H M ) et, plus particulièrement
celle du benzo[a]pyrène (BP), produit des époxydes, qui sont des électrophiles hautement
réactifs, capables de se combiner aux constituants cellulaires et de faire basculer l'état
normal d'une cellule vers un état cancéreux [1,2]. Précisons que les HAP, issus de la
combustion incomplète de matières organiques, entrent dans la composition de fumées de
diverses origines. de la suie, du brai ou des gaz d'échappement [3].
En tant qu'enzymes de la phase de fonctionnalisation, les cytochromes P450
(PJ50) hépatiques participent activement au métabolisme des xénobiotiques. Us sont donc
impliqués à la fois dans la défense de l'organisme et dans les processus de cancérogenèse
chimique qui peuvent en découler [4]. Les fonctions de cette superfamille dépassent
cependant les limites de la toxicologie. Ainsi certains P450, qui sont localisés pour la
plupart dans des organes extrahépatiques, prennent part à des activités physiologiques [2].
Us interviennent, par exemple, dans la voie de biosynthèse des hormones stéroidiennes.
Comme nous le verrons plus tard, le dysfonctionnement de l'un de ces P450 peut d'ailleurs
étre à l'origine de troubles sérieux. Les P450 de mammifêres orchestrent donc un grand
nombre d'activités différentes et ce, dans divers organes.
Notre intérêt dans cet exposé se limitera aux P450 hépatiques chez les
mammifères. Il faut souligner, cependant, que cette superfamille protéique est représentée
à l'échelle du monde vivant, des bactéries aux plantes, en passant par les poissons, les
oiseaux, etc. [2]. Les P450 jouent dans ces organismes les mêmes rôles de métabolisme
de composés exogènes et/ou endogènes que chez les mammifères [5].
Les P450 dont la fonction majeure s'inscrit dans les processus de détoxication
possèdent des propriétés faisant d'eux des enzymes particulièrement bien adaptées à leur
fonction de protection de l'organisme. Iis peuvent, en général, métaboliser plusieurs
Chapitre 1: In traduction générale 4
substrats différents. II n'est pas rare non plus que deux P450 oxydent le même composé
[l]. Grâce à une telle spécificité de substrats, à la fois large et chevauchante, les P450
peuvent faire face i un grand nombre de composés potentiellement dangereux et à
l'apparition de nouveaux xénobiotiques dans leur environnement. De plus, certains P450
présentent la capacité d'accroître leur présence et leur activité globale lorsqu'ils sont
exposés à diverses substances. Si ces dernières sont également les substrats des P450
activés, elles sont métabolisées et excrétées plus rapidement hors de l'organisme [l]. Cette
propriété des P450 est appelée induction.
Nous devons les premières observations du phénomène d'induction à Remmer [6] ,
qui constate dès 1962, une diminution progressive de l'effet sédatif du phénobarbital (PB)
lorsqu'il l'administre de façon chronique à des rats. il attribue cette modification de la
réponse pharmacologique au PB à une activation de son métabolisme et de son
élimination. Conney [7] précise ensuite que ce composé et près de 300 autres
xénobiotiques entrainent une augmentation du niveau hépatique des enzymes du
métabolisme des substances étrangères et en particulier. des P450. Ces substances sont, de
ce fait. appelées inducteurs et sont rangées en 5 grandes catégories, que nous détaillerons
dans le paragraphe suivant. Bien que la plupart des travaux qui suivront ceux de Conney
seront consacrés à l'induction chez les mammifères, cette propriété n'en reste pas moins
présente chez de nombreux autres vertébrés, tels que les oiseaux et les poissons et des
invertébrés tels que Drosophila melanogaster, la levure Sacc~iaromyces cerevisiae ou
quelques bactéries, dont Bacillus megaterium [8).
Les premiers inducteurs découverts dans les années soixante ont systématique-
ment été classés en inducteurs de type PB ou en inducteurs de type 3-méthylcholanthrène
(OU 3-MC) [8]. Les inducteurs de type 3-MC comprennent les HA.. , les hydrocarbures
aromatiques halogénés (HAH), utilisés dans la fabrication de solvants et pesticides, et les
amines aromatiques et hétérocycliques, présentes notamment dans la fumée de cigarette
[8]. Aux deux classes ancestrales d'inducteurs de type 3-MC et d'inducteurs de type PB se
sont ajoutées, par la suite, trois nouveaux groupes et ce, sur la base d'informations
Chapitre I: Introduction ~énérale 5
disponibles sur leur mode d'action. Ii s'agit des proliférateurs de péroxysomes (PP), des
glucocorticoïdes et de l'éthanol [8].
Parmi les P450 activés par les inducteurs de type PB se trouvent CYP2Bl et
CYP2B3 du rat. deux protéines sur lesquelles ces agents ont un effet remarquable.
L'administration de PB des rats fait de ces deux protéines, presque indétectables chez un
rat contrôle, les formes majeures des P450 hépatiques [9]. Bien que plusieurs décennies
nous séparent des premiers travaux de Remmer, aucun schéma d'action du PB sur
l'induction de ces deux P450 n'est encore clairement établi. Alors que les connaissances
sur le mode d'action des inducteurs de type 3-MC ont progressé rapidement, débouchant
sur l'identification du récepteur Ah («Aryl hydrocarbon receptor~ ou «AhR»), impliqué
Dans l'activation du gène CYPIA ID [8,10,11,12], dans le cas des barbituriques, la question,
maintes fois posée, de l'existence d'un récepteur reste encore sans réponse.
Si les recherches portant sur l'élucidation du mode d'action du PB ont longtemps
piétiné, i l faut en partie l'imputer au fait que jusqu'en 1990, l'induction par le PB,
observée in vivo. est impossible à reproduire dans les systèmes hépatocytaires de rongeurs
et d'autres mammifères [8]. En 1990 cependant, Waxman et ses collaborateurs (131 ainsi
que Sinclair et ses collaborateurs 1141 mettent au point des systèmes de cultures primaires
d'hépatocytes de rat pour lesquels la réponse au PB est comparable à celle obtenue in vivo.
La publication de Waxman et ses collaborateurs [13] constitue le point de départ des
travaux réalisés dans le laboratoire d'accueil. Ils déboucheront en 1995 sur la localisation,
dans la région régulatrice en 5' du gène CYPZB2, d'une séquence responsable de
l'activation de ce gène lors d'un traitement du rat au PB [15]. Ces résultats marquent par
leur originalité. ns divergent en effet de la majorité des autres études en proposant,
comme nous le verrons plus loin, un ou plusieurs site(s) activateur(s) PB-dépendant(s)
dans la région proximale du promoteur [16,17,18,19]. Dès lors, des résultats convergents
s'accumulent pour conforter la crédibilité du rôle de cette séquence dans la réponse au PB
[20,2 1,221. C'est dans ce cadre que s'amorce la présente recherche sur la caractérisation de
cet élément. Les efforts fournis conjointement dans notre laboratoire vont conduire à une
Chapitre 1: Introduction générale 6
meilleure compréhension de son organisation. Devant la complexité de sa structure et
l'interaction évidente de plusieurs facteurs, concourant à une réponse totale au PB,
l'élément de réponse au PB (PBRE) devient une unité de réponse au PB (PBRU).
L'ensemble de ce travail ainsi que l'apport de deux autres laboratoires relancent le débat
sur le mode d'action du PB et devraient permettre de résoudre, à plus ou moins long
terme, cette énigme vieille de près d'un demi-siècle.
La revue bibliographique qui suit constitue le Chapitre II de la thèse. Dans la
première partie de ce Chapitre sont exposées les connaissances actuelles sur les P450. La
seconde partie est consacrée à la propriété d'induction de certaines enzymes par le PB.
Cette section s'adresse plus particulièrement à CYP2B 1 et CYP2B2. Elle est suivie de
l'analyse des données disponibles sur le mode d'action du PB. Les Chapitres IIi, IV et V.
correspondant aux Articles 1, II et ID, englobent les résultats obtenus sur la caractérisation
de l'élément PBRU. Une discussion générale des travaux et les principales perspectives
qui s'en dégagent constituent le Chapitre VI et la conclusion de la thèse.
' Voir Section 2.1.2 pour explications de la nomenclature.
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
2.1 LES CYTOCHROMES P450
2.1.1 DÉFIMON EiT LOCALISATIONS
En 1958 paraissent les premières publications [23,24] sur l'identification. dans le
foie de rnammiferes, d'un pigment rouge dont le pic majeur d'absorption lumineuse se
déplace à 450 nm lorsqu'il est associé au monoxyde de carbone. Cette propriété spectrale
particulière lui vaut. en 1964, la dénomination de rytochrome P450» [25]. Le
cytochrome P450 est une hémoprotéine dont le groupe prosthétique, appelé «hème»,
renferme du fer 1261.
Aujourd'hui. près de quarante ans plus tard, on parle d'une superfamille dont les
membres ont été répertoriés aussi bien dans le règne animal que végétai. Plus de 480
gènes de P450 ont été recensés dans 20 espèces procaryotes et 85 espèces eucaryotes [27].
Face à l'expansion rapide de cette superfamille, les chercheurs ont suggéré une répartition
des P450 en 74 familles, selon une classification dont les principes sont expliqués dans le
paragraphe suivant .
La distribution ubiquiste de ces protéines à l'échelle du monde vivant est
reproduite au niveau tissulaire, chez une seule et même espèce. Ainsi, chez les
Chapitre II: Revue bibliographique 8
mammifères, bien que les P450 soient principalement concentrés dans le foie, comme
nous l'avons souligné en introduction générale, ils n'y sont pas confinés. Ils se répartissent
dans la quasi-totalité des tissus. La peau, les poumons, les reins, le système nerveux
central, les glandes surrénales et le placenta comptent tous un ou plusieurs P450 [28]. Un
seul mammif'ère peut ainsi posséder plusieurs dizaines de ces enzymes. Plus d'une
cinquantaine cohabitent, par exemple, chez le rat [27]. Ils sont principalement ancrés dans
le réticulum endoplasmique lisse (REL) mais ils se retrouvent aussi dans la membrane
interne des mitochondries [27].
CLASSIFICATION ET NOMENCLATURE
En 1987, devant le nombre toujours croissant de P450 décrits et la nomenclature
anarchique qui l'accompagne, un comité de chercheurs propose une classification basée
sur la comparaison des séquences en acides aminés 1291. Un affinement et des mises à
jour successives [27.30,3 1) aboutissent au consensus suivant. Une famille réunit les PM0
de plus de 40% d'identité en acides aminés, quelle que soit leur origine ou leur fonction.
Deux P450 présentant entre 40 et 59% d'identité en acides amines appartiennent à la
même famille mais ii deux sous-familles distinctes. Au delà de 60%. ils sont classés dans
la même sous-famille [27]. D'autre part. Nebert et ses collaborateurs [29] recommandent
l'emploi du symbole «CYP» en italique ( < O p » pour la souris et la drosophile) pour
désigner le gène d'un CYtochrome P450 quelconque. Un chiffre arabe, suivi d'une lettre
majuscule (minuscule pour la souris) représentent la famille et la sous-famille. Un dernier
chiffre arabe définit le gène lui-même. Par exemple. le gène CYP2BI est le premier gène
de la sous-famille B de la famille 2. Chez toutes les espèces, y compris la souris, I'ARNm,
1'ADNc et la protéine se distinguent du gène par des lettres majuscules sans italique. Le
produit du gène CYPZB2 s'écrira donc «CYP2B2» ou ~P450 2 8 2 ~ . L'intérêt principal de
cette nomenclature systématique est de pouvoir aisément reconnaître deux P450
similaires, quels que soient l'organite, le tissu et l'espèce dont ils proviennent et quelles
que soient les réactions qu'ils catalysent [28].
Chapitre II: Revue bibliographique 9
En présence d'oxygène atmosphérique (02 ) et dune source d'électrons, fournie par
la NADPH (ou nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduite), et plus rarement la
NADH (ou nicotinamide adénine dinucléotide reduite), les P450 catalysent une réaction
d'oxydation particulière qui mène à l'introduction, dans le substrat R, d'un seul atome
d'oxygène dérivé de 0 2 , le deuxième étant réduit en eau [2]. Les P450 sont, de ce fait,
qualifiés de «monooxygénases» ou «oxygénases à fonction mixte, [2]. Ils se distinguent
des dioxygénases qui incorporent les deux atomes de 0 2 dans le substrat. L'équation
chimique générale s'écrit:
RH + NAD(P)H + H+ + 0 2 + ROH + NAD(P)+ + H z 0
La réaction de monooxygénation peut prendre la forme d'hydroxylations. de
désalkylations sur C, N, O ou S, de déshalogénations oxydatives ou d'époxydations [2]
[Figure 11. Ii est à souligner que les P450 sont capables de catalyser toutes ces réactions et
ne sont pas spécialisés dans une forme particulière de monooxygénation. La nature de la
réaction catalysée est uniquement fonction du substrat et de la stabilité, plus ou moins
grande, de l'intermédiaire formé. Ainsi, le produit final pourra être un alcool ou tout autre
dérivé issu du rémangement de cet alcool [Figure 11 [32].
Pour être actifs, les P450 doivent cependant être associés à d'autres protéines,
formant ainsi un complexe multienzymatique. Au niveau du E L , les composants clef
d'une unité minimale fonctionnelle sont les P450 et des flavoprotéines (contenant de la
flavine mononucléotide (FMiU) ou de la flavine adénine dinucldotide (FAD)) baptisées
«NADPH-cytochrorne P450 oxydo-réductases» [33]. Dans le foie des mammifères, on
compte de 10 à 100 molécules de P450 pour une seule molécule d'oxydo-réductase [34].
Ce partenaire indispensable délivre aux P450 les deux électrons issus de la réduction du
NAD(P)H et nécessaires au clivage de 0 2 [35]. Dans la membrane interne des
Chapitre II: Revue bibliogruvhiaue IO
R-CH3 -+ R-CH20H
Oxydation aliphatique
R-NH-CH3 -+ [R-NH-CH2OH ] --+ R-NH2 + HCHO
N-désalkylation
R-O-CH3 -+ [R-O-CH20HI + R-OH + HCHO
O-désalkylation
R-S-CH3 + [R-S-CHZOH] + R-SH + HCHO S-désalkylation
R 1 -CHR2-X + [R 1 -CR20H-XI + R 1-CR2=O + HX Déshalogénation oxydative
Figure 1: Exemples de réactions catalysées par les P450.
Chapitre II: Revue bibliographique 11
mitochondries où, comme nous l'avons mentionné précédemment, sont ancrés quelques
P450, le transport d'électrons emprunte une voie différente, puisquiil est assuré par deux
composants protéiques séparés, h flavoprotéine et l'adrénodoxine. qui est une protéine
fer-soufre [33].
Bien que les substrats de P450 soient de nature très variée, ils peuvent être
regroupés en deux grandes classes: les xénobiotiques et les substances endogènes. De
cette distinction découle la répartition grossière des P450 en un groupe métabolisateur de
xénobiotiques et un autre métabolisateur de substances endogènes. Dans la classification
décrite plus tôt [27], les PJ50 impliqués dans une fonction physiologique donnée vont se
retrouver réunis en une même famille. Elle sera différente d'une fonction physiologique à
l'autre et sera aussi distincte des familles dont les membres agissent en métabolisateurs de
xénobiotiques. Il existe cependant une exception à cette règle, la famille 2. qui possède
des PJ50 des deux groupes.
Chez les mammifères, les P450 qui métabolisent des xénobiotiques sont surtout
présents dans le foie [36]. De faibles quantités ont cependant été détectées dans des tissus
extrahépatiques. comme la peau. les reins, les poumons, etc. [36]. Quel que soit le tissu
considéré, ces P450 sont solidement ancrés dans la membrane du REL. Les substances
exogènes qu'ils ciblent sont de nature très diverse. Citons, parmi elles, des alcools, des
anesthésiques, des médicaments, des pesticides, des procancérogènes et des produits
naturels, comme l'aflatoxine Bi [28,37]. Actuellement, on estime à plus de 250 000 le
nombre de xénobiotiques substrats de P450 [28].
Comme nous I'avons abordé en introduction générale, les P450 remplissent
également diverses fonctions physiologiques. Dans les glandes surrénales et les gonades
des mammifères, certaines des enzymes les plus importantes dans la biosynthèse des
stéroïdes sont des P450 1381. L'absence de l'un de ces P450, CYP2 1 (ou 2 1 -hydroxylase)
Chapitre II: Re vue bibliographique 12
est ainsi à l'origine d'une maladie génétique grave, l'hyperplasie surrénalienne congénitale
(ou CAH) [39,40]. D'autres formes interviennent dans la synthèse des acides gras. des
prostaglandines et leucotnènes, dans le métabolisme de la vitamine D ou encore dans
l'oxygénation d'acides gras polyinsaturés [38]. Quelques-unes de ces fonctions sont
réalisées dans le foie, la majorité cependant a lieu dans des tissus extrahépatiques. De
plus, si la plupart des P450 de cette catégorie sont ancrés dans le REL, au même titre que
ceux du métabolisme des xénobiotiques. certains P450 des tissus stéroïdiens et de rares
exceptions dans les tissus hépatiques se retrouvent dans la membrane interne des
mitochondries [4 1).
Ainsi. chacun de ces deux groupes présente des caractéristiques qui lui sont
propres. Une différence supplémentaire les sépare. Les P450 impliqués dans des fonctions
physiologiques ont un nombre très limité de substrats. Par contre, comme nous venons de
le souligner. les P450 du métabolisme des xénobiotiques transforment souvent une
myriade de substances différentes [32). Cette propriété particulière et le pouvoir qu'ont les
P450 d'être induits par des xénobiotiques leur permettent d'éliminer plus rapidement
toutes sortes de substances étrangères. Ces propriétés sont donc essentielles à l'adaptation
de l'organisme à un environnement en constante évolution.
PROPRIÉTÉ D'INDUCTION
De nombreux P450 peuvent être induits par une large panoplie de substances
exogènes, classées en 5 grandes catégories. Habituellement, un P450 qui est activé par
une catégorie d'inducteurs ne répond pas à la présence d'une autre. Ainsi, les inducteurs de
type 3-MC activent principalement les P450 CYP LA 1, CYP 1 A2 et CYP 1 B 1 [42]. Ceux
de type PB agissent sur un spectre plus large de P450 appartenant aux familles 2 et 3 [43].
Dans le cas des trois autres groupes d'inducteurs, un glucoconicoïde tel que le
dexaméthasone @EX) ou un anti-glucocorticoïde comme la prégnénolone- l6a-
carbonitrile (PCN) activent les P450 de la sous-famille 3A [44,45]. Les proliférateurs de
péroxysomes préfèrent les P450 de la sous-famille 4A [46,47]. Enfin, l'éthanol et
Chapitre II: Revue bibliographique 13
quelques autres composés comme l'acétone ou l'imidazole sont des inducteurs de CYP2E 1
[48,49].
Tous les P450 ne sont cependant pas concernés par cette propriété d'induction.
Certains sont réfractaires à l'activation par toutes formes d'inducteurs: c'est le cas des
P450 hépatiques CYP2C7 du rat adulte et CYP2C13 [SOI. CYP2B3 du rat est un exemple
de protéines qui ne répondent pas à une exposition au PB, alors qu'il présente 77%
d'identité de séquences avec CYP2B1, une des formes les plus induites par les
barbituriques [5 1,521. Quant aux P450 du métabolisme des substances endogènes, ils ne
sont généralement pas sujets à une induction par les xénobiotiques, bien qu'ils soient
sensibles à des composés physiologiques [8].
Selon la définition générale, l'induction peut être due à une activation
transcriptionnelle des gènes ou une stabilisation et une augmentation de la durée de vie
des ARNm ou des protéines correspondantes. Cependant, dans le cas particulier des P450,
si l'on excepte quelques cas où i l y a stabilisation protéique [53], le premier événement
observé au cours de l'induction est une activation transcriptionnelle [54,55].
En dépit du fait que pour les inducteurs de type PB, les informations sur
l'activation transcriptionnelle aient été recueillies il y a plus d'une décennie, nous allons
voir, dans ce qui suit, que le reste des données sur le mode d'action du PB reste encore
fragmentaire.
Le PB est le chef de file d'un ensemble de composés, appelés «inducteurs de type
PB» ou «composés de type PB». Contrairement aux HAP qui partagent une taille et une
structure plane communes. les inducteurs de type PB n'ont de liens structuraux
Chapitre II: Revue bibliographique 14
perceptibles ni entre eux, ni avec le PB [8]. Leur seul point commun évident est un profil
d'action semblable à celui de leur chef de file. Ce groupe hétérogène englobe entre autres,
des pesticides comme le chlordane et le I , 1 , 1 -trichloro-2,2-bis@-ch1orophényl)éthane (ou
DDT), 1' isosafrole et 1' ally lisopropy lacétamide (ou MA) [56] Figure 21.
Les effets d'une exposition au PB et aux composés de type PB sont connus depuis
plus de 30 ans [7]. Traiter des animaux de laboratoire avec le PB entraîne une
hypertrophie du foie, une accumulation de REL dans les hépatocytes, une induction de
l'expression de nombreux gènes codant notamment pour des enzymes du métabolisme des
xénobiotiques et enfin, une stabilisation générale des protéines microsomalesb du foie
[43,57]. Le PB est aussi un promoteur tumoral dans cet organe [57]. Ses effets multiples
se concentrent donc essentiellement sur le foie [ 5 8 ] , bien que l'augmentation de l'activité
enzymatique ait été constatée, de faqon discrète. dans d'autres organes [9].
Les chercheurs portent une attention toute particulière à l'induction des enzymes
de la détoxication. Son impact sur le métabolisme des médicaments et sur la toxicité et le
pouvoir cancérigène des substances chimiques explique sans doute l'intérêt de la
communauté scientifique. Les recherches sur l'induction par le PB s'adressent
prioritairement à la superfamille des P450, la classe d'enzymes du métabolisme des
xénobiotiques la plus induite. Le PB compte cependant aussi, parmi ses cibles, des
enzymes de la phase Iï de détoxication. comme la glutathion-S-transférase (GST) et
l'époxyde hydrolase ou bien le partenaire des P450, la NADPH-cytochrorne P450 oxydo-
réductase [57].
Notre intérêt dans la suite de cet exposé se concentrera sur l'induction des P450 et
ce, essentiellement chez les mammifères. Iî faut néanmoins signaler que la propriété a été
observée chez les oiseaux, chez D. melanogaster ou chez B. megaterium [59,60,6 11. Chez
les reptiles, pour le moment seul l'alligator semble posséder des P450 répondant au PB
Les membranes du réticulum endoplasmique (RE) peuvent être skparées, par homog~nbisation. de celles des autres constituants de la cellule. Le RE est alors fragmente en petites vésicules fendes, aisément purifiables, appelées microsomes.
Chapitre II: Revue bibliographique 15
AUyli~)propyIacéhmide AIA
'i" cl-(B)-' CH -(a)- a
Figure 2: Diversité structurale des inducteurs de type PB.
Chapitre II: Revue bibliographique 16
[62]. L'induction de ces enzymes n'a jamais été constatée chez le poisson, alors que ses
P450 sont fortement inductibles par les HAP [8.63].
2.2.2 Imucno~ DES P450 PAR LE PB
Chez les animaux de laboratoire, le PB module l'expression d'un grand nombre de
gènes de P450. Chez le rat, plusieurs gènes de la famille 2 sont concernés, en particulier
CYP2BI et CYP2B2. Les niveaux hépatiques de CYP2B 1 et CYP2B2, après traitement du
rat au PB. sont accrus de plus de 200 fois et près de 28 fois, respectivement 191. Ces
inductions sont exceptionnelles et font de ces 2 protéines les formes majeures induites par
le PB. Celles de CYPlAl et CYP2C6 varient entre 2 et 4 fois, dans les deux cas [57].
CYP2C7 est uniquement inductible chez le rat immature (d'un facteur 20). Chez l'adulte,
cette induction est inférieure à 2 fois [57]. Au contraire, CYP3A2 ne répond au PB que
chez le rat adulte et le facteur d'induction approche les 10 fois [57]. CYP3Al est
également induit d'un facteur 10 [57]. CYP3Al et CYP3A2 représentent d'ailleurs des
exceptions à l'observation que les P450 ne sont habituellement activés que par un seul
type d'inducteurs. ils font en effet partie des membres de la sous-hmille 3A. mentionnée
plus tôt comme inductible par des glucocorticoïdes [44,45]. Notons enfin que chez la
souris, CYP2B 10 serait le principal P450 inductible par le PB [64].
D semble difficile de réduire le phénomène d'induction des P450 à un seul et
même mécanisme. En effet, les facteurs d'induction fluctuent beaucoup selon les enzymes
visées [57]. Rappelons qu'ils sont considérables pour CYPZB 1 et CYP2B2 mais dépassent
rarement un facteur 10 pour la plupart des autres enzymes chez les animaux adultes [57].
De plus, tandis que la dose de PB requise pour une induction maximale de CYP2B 1 et
CYP2B2 dans les hépatocytes de rat en culture primaire est de 100 pM, celle nécessaire
pour une activation de CYP3AI est plus forte, avoisinant les 3 mM [65]. Ces observations
suggèrent donc que l'expression de CYP2BI et CYP2B2 soit contrôlée différemment de
celle des autres P450,
Chapitre II: Revue bibliographique 17
CYPZBl et CYP2B2 du rat font partie de la sous-famille 2B qui compte
actuellement une vingtaine de membres, distribués chez les rongeurs, le chien, le singe et
l'humain [27]. Bien qu'ils aient 97% d'identité de séquences en acides aminés, soit
seulement une différence de 14 acides aminés sur 491 [2], CYP2Bl et CYP2B2 sont
codés par deux gènes distincts [66,67]. Leur spécificité de substrats, bien que très proche
l'une de l'autre, peut se distinguer par des différences minimes. CYP2BI métabolise une
grande variété de médicaments lipophiles et de composés stéroïdiens comme
I'androstènedione [68] . CYP2B2 agit sur les mêmes substrats, quoiqu'il soit de 2 à 10 fois
moins actif que CYP2Bl [57). La nuance entre les deux spécificités de substrats tient
surtout à une différence de régiosélectivité d'hydroxylation du 7,12-
diméthylbenz[u]anthracène (ou DMBA) [69].
CYPZB 1 et CYP2B2 présentent également quelques divergences dans leur profil
d'expression, en absence comme en présence de PB. Ainsi. le niveau constitutif de
CYP2B 1 dans le foie de rat est très faible. voire indécelable [9]. Ii est indétectable dans
les tissus extrahépatiques. à l'exception des poumons. Quant au niveau constitutif de
CYP2B2, il est uniquement quantifiable dans le foie et habituellement 5 fois plus élevé
que celui de CYP2B 1 [9]. Après traitement du rat au PB, CYP2B I et CYP2B2 deviennent
les formes majeures de P450 hépatiques (induction de 200 fois et 28 fois, respectivement)
[9] . Dans les tissus extrahépatiques, l'induction de ces deux P450 varie d'un tissu à l'autre
mais elle reste toujours marginale. Ainsi, dans les poumons et les testicules, seul CYP2B 1
est faiblement induit [9]. Ii en est de même dans l'intestin grêle 191. Dans les reins, aucun
des deux P450 ne répond au PB. Enfin, dans les glandes surrénales, si ces deux formes
sont sensibles à un traitement du rat au PB, une fois induites, elles représentent moins de
5% de la quantité des deux P450 dans le foie de rat traité [9].
Chapitre II: Revue bibliographique 18
2.2.4 MÉCANISME D'INDUCTION DE CYP2BI ET
L'induction par le PB de CYP2Bl et CYP2B2 du foie de rat est essentiellement
transcriptionnelle. L'accumulation d'ARNm cytoplasmiques est constatée 3 heures après
l'injection de PB à des rats [54]. Le taux de transcription de CYP2BI. mesuré par l'analyse
in vitro des chaînes naissantes (analyse «mn-on» ou transcription nucléaire) [70]. dans des
noyaux d'hépatocytes isolés à partir de rats traités ou non au PB, montre une activation de
la transcription 1 h après l'injection de PB. Le maximum est atteint au bout de 3 h
(induction d'un facteur 23) et ne commence réellement à décliner qu'après 24 h de
traitement (où I'induction est encore forte (d'un facteur 14)) [70]. L'accroissement du taux
dtARNm cytoplasmiques est combiné à celui des ARNm précurseurs. confinés au noyau.
L'ensemble de ces résultats sous-tend que l'induction ne résulte pas de la stabilisation
dlARNm préexistants mais bien d'une activation transcriptionnelle [70].
Si, comme nous l'avons dijà dit, les données sur l'activation transcriptionnelle de
CYPZBI et CYP2B2 sont connues depuis les années quatre-vingts, les chercheurs ne
disposent, pour le moment, que d'informations limitées sur le mode d'action du PB. La
voie qu'il emprunte pour induire l'expression de ces deux gènes reste ainsi mystérieuse. Il
est notamment impossible de trancher la question de I'existence ou non d'un récepteur
pour le PB. Toutes les difficultis, nous y reviendrons, se sont accumulées pour retarder la
compréhension de ce mécanisme. Un éventail important de méthodes, employées pour
saisir le mode d'action des inducteurs de type 3-MC (illustré succintement par la Figure 3)
s'est avéré inefficace dans le cas du PB.
Ligand lipophile: HAP, HAH, amines aromatiques et hét6rocycliques
le 2,3,7,8-dibenzo-11-dioxine ou TCDD, par exemple
AhR («Ah receptorm) cy tosolique q
Cytoplasme 7
Arnt ( « ~ h receptor nuc~ear translocator~) @ -1
dans le noyau
g@ XRE
Activation tranxriptionnelle du «groupement des génes Ah),: une trentaine de gènes incluant CYPIAI, CYPIAZ, CYPIBI
les enzymes de la phase I I de détoxication
Chapitre II= Revue bibliog raphiaue 20
2.2.5 RECHERCHE D'UN RÉCEPTEUR AU PB
Dès 1967, Conney [7] puis Wattenberg et ses collaborateurs [71] en 1968,
remarquent, en véritables précurseurs, l'existence de contraintes stériques partagées par
tout bon inducteur de type 3-MC. Ils définissent ainsi les propriétés moléculaires
optimales, communes à ce type de composés et soupçonnent déjà la participation d'un
récepteur dans leur mécanisme d'induction. Poland et ses collaborateurs 1721, en
découvrant dans les années 70 que le 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (ou TCDD) est
un puissant inducteur de type 3-MC, posent le jalon le plus important dans l'étude de la
régulation de CYPIAl . Grâce à une demi-vie prolongée dans l'organisme. le TCDD
représente en effet un agent inducteur 30 000 fois plus efficace que le 3-MC [8,72]. En
1976. le marquage à l'hydrogène tritiée de ce même TCDD et son administration à des
souris [73] offrent la première démonstration expérimentale de l'existence du récepteur
Ah.
Les inducteurs de type PB semblent, pour leur part, totalement différents les uns
des autres, ne partageant qu'une grande liposolubilité. S'il faut concevoir un seul récepteur
pour l'ensemble de ces inducteurs, il faut l'imaginer avec un site de reconnaissance
«élastique», s'adaptant à tous ces composés [SI. De plus. étant donné que la dose
minimale de TCDD requise pour observer une induction in vivo de CYPl Al est 1 000
fois plus faible (de l'ordre du nmol/kg) que celle nécessaire à toute substance de type PB
pour I'activation de CYP2B 1 et CYP2B2 (de I'ordre du pmolkg) [8], i l faut supposer que
le récepteur hypothétique présente une faible affinite pour tous ses ligands [8].
Des interactions aussi labiles ne facilitent pas la recherche d'un récepteur par les
méthodes biochimiques classiques. Appliquant aux inducteurs de type PB les méthodes
fructueuses ayant permis l'identification du récepteur Ah, Poland et ses collaborateurs
[74] synthétisent en 1980 un inducteur 650 fois plus actif que le PB chez la souris. Appelé
1,4-bis(2-(3,5-dichloropyridy1oxy))benzène (ou TCPOBOP). il agit sur les mêmes
Chapitre II: Revue bibliographique 2 1
enzymes que le PB, mais à doses plus faibles. Comme le TCDD, il n'est pas métabolisé et
sa demi-vie dans l'organisme est plus longue que celle du PB. Cependant, chez le rat, le
TCPOBOP n'est pas un inducteur [75]. Ceci peut s'expliquer par le fait que les récepteurs
hypothétiques du rat et de la souris présentent des différences qui n'affectent pas leur
interaction avec des ligands de faible affinité, comme le PB mais modifient leur
interaction avec le TCPOBOP, un ligand de plus forte affinité [75].
La démarche expérimentaie de recherche d'un récepteur au PB demeurant sans
succès, plusieurs équipes se sont tournées vers d'autres méthodes pour tenter de saisir le
mécanisme moléculaire régissant l'induction de CYP2BI et CYP2B2.
2.2.6 AUTRES OUTILS POUR ÉLUCIDER LE MODE
D'ACTION DU PB
La recherche de séquences régulatrices présentes dans les régions promotrice et 5'-
flanquante d'un gène et l'identification des protéines qui s'y fixent est une méthode
conventionnelle pour comprendre la régulation de l'expression du gène en question. Pour
ce faire, l'outil idéal est une lignée cellulaire pour laquelle, dans le cas de CYP2Bl et
CYP2B2. les gènes endogènes répondent au PB. Il est alors envisageable de transfecter de
telles cellules avec des constructions chimériques, contenant des délétions en 5' des gènes
d'intérêt, en amont d'un gène rapporteur. Or, contrairement aux HAP. pour lesquels
l'induction est conservée dans les lignées cellulaires, dans le cas du PB, un tel outil,
extrêmement puissant, n'est pas disponible [76]. Quant aux hépatocytes en culture
primaire, pendant longtemps, il a été impossible de les maintenir en culture puisqu'ils
perdaient leurs fonctions spécifiques au foie [57]. Pour pallier à I'absence d'un système
cellulaire approprié, certains chercheurs ont opté pour des méthodes de transcription in
vitro. C'est par le biais de ces méthodes qu'est née la boîte Barbie (~Barbie-Box»).
Chapitre II: Revue bibliographique 22
La boîte Barbie
L'induction des P450 par le PB et les composés de type PB est une propriété
conservée à travers l'évolution, de B. megaterium aux mammiferes. En se penchant sur
cette particularité, l'équipe Fulco [17] a cherché à étendre le mode de régulation de
CYPI02 et CYPIO6 de B. rnegaterium aux P450 de mammifëres et, en premier lieu, à
CYP2BI et CYP2BS du rat. Toutefois, les conclusions de ces chercheurs et l'ensemble des
travaux se rapportant à la boîte Barbie demeurent équivoques.
En 199 1, He et Fulco [17] entreprennent une recherche informatique de séquences
communes à 4 gènes inductibles par le PB. Ils repèrent, à l'intérieur des 300 pb de promo-
teurs de CYPlO2 et CYPZO6 de B. rnegaterirtm et CYPZBl et CYPZB2 du rat, une
séquence de 17 pb, conservée h 80% [77]. Elle est baptisée ultérieurement boîte Barbie
[77,78]. Les expériences de gels à retardement, effectuées sur ces 4 boîtes Barbie,
suggèrent que ces dernières soient reconnues par une même protéine, présente à la fois
dans les extraits de foie de rat et les préparations protéiques de B. megaterium [17].
Toutefois, tandis que cette protéine agirait en répresseur chez la bactérie, elle jouerait un
rôle activateur chez le rat [17]. Nous verrons plus loin que les résultats d'interactions
protéines-ADN obtenus pour CYPZBZ et CYP2B2 n'ont jamais été confirmés.
La régulation des gènes de P450 de B. rnegaterium, inductibles par le PB, ne sera
pas détaillée dans le cadre de cette introduction. Signalons simplement que la découverte
de la boite Barbie est à la base de l'élaboration d'un mécanisme de régulation de CYPlO2
et CYPlO6, complexe [77,79,80] et controversé [8 11.
Chez CYP2BI et CYP2B2, la boîte Barbie est localisée entre 73 et 89 pb du site
d'initiation de la transcription (ou tsp). Elle est comprise dans les 179 premières pb qui
contrôleraient, d'après Rangarajan et Padmanaban [16], l'activation par le PB de la
transcription de CYP2BI et CYP2B2. Cette équipe établit en effet, par des expériences de
transcription in vitro dans des noyaux isolés de foie de rat, traité ou non au PB, que cette
Chapitre II: Revue biblio~raphiaue 23
séquence constitue le promoteur minimal inductible par le PB. Les 179 pb sont
décomposées en un dément positif, PE (de 69 à 98 pb du tsp) qui renferme la boîte Barbie
et un dément négatif, NE (entre 126 et 160 pb du tsp) [82,83]. Une même protéine se
fixerait à l'un ou l'autre de ces éléments selon son état de phosphorylation. dicté par la
présence ou l'absence de PB [82].
Tandis qu'une analyse de transcription in vitro [18] vient corroborer le rôle
fonctionnel de la boîte Barbie de CYPSB2, de nombreuses autres études s'accumulent
pour l'infirmer. Ainsi, l'interaction d'une ou plusieurs protéines avec la boite Barbie de
CYPZBI et CYP2B2, observée par He et Fulco [17] puis l'équipe Padnarnaban [16,82,83]
n'a pu être entérinée [19,20,21,84]. Certaines de ces études suggèrent plutôt qu'un ou
plusieurs éléments de part et d'autre de la boîte Barbie soi(en)t impliqué(s) dans
l'expression de CYPZBI et CYP2B2, mais exclusivement dans la transcription basale de
ces gènes [2 1.841.
En dépit de toute la controverse qui entoure la boîte Barbie. sa popularité ne cesse
de grandir et ce, d'autant plus que Liang et ses collaborateurs publient, en 1995, une
analyse comparative où ils constatent que la boîte Barbie se retrouve de façon plus ou
moins préservée dans les séquences régulatrices de plusieurs gènes répondant au PB [77].
En réalité, seule la séquence centrale AAAG de la boîte Barbie, trop courte pour que
l'étude soit significative, est partagée par tous ces gènes. Malgré cela, toute séquence,
présente dans un gène de mammifères inducrible par le PB et ressemblant de près ou de
loin à la boîte Barbie, devient le sujet de recherches intensives. Fournier et ses
collaborateurs [85] sont parmi les rares à appuyer la validité d'un rôle pour la boîte Barbie
et restent les seuls à avoir réalisé une étude fonctionnelle dans des hépatocytes en culture
primaire. Ces chercheurs constatent que ia boîte Barbie du gène de l'ai-glycoprotéine
acide (AGP) de rat est identique par 10 pb à la boîte Barbie consensus. Loaqu'elle est
mutée, l'induction par le PB de ce gène, dans les hépatocytes en culture primaire,
disparaît. il faut préciser cependant que l'induction de AGP par le PB est initialement très
faible, puisqu'elle ne dépasse pas 1,6 fois 1851 et n'est pas significative, selon nos critères.
Chapitre II: Revue bibliographique 24
De toute évidence, la boîte Barbie ne parvient pas à faire l'unanimité auprès de la
communauté scientifique. Si les travaux des années 90 vont continuer d'alimenter cette
controverse, ils marquent avant tout un tournant dans l'étude du mode d'action du PB.
Comme nous allons le voir, une percée importante dans la compréhension de ce
mécanisme se dessine avec la publication, en 1993, des travaux de Ramsden et ses
collaborateurs [86] et la mise au point, par les équipes de Waxman [13] et de Sinclair (141
de systèmes de cultures primaires d'hépatocytes.
Les années 90 voient une nouvelle percée dans la compréhension du mode d'action
du PB
En 1993, l'équipe Omiecinski génère deux lignées de souris transgéniques [86].
Toutes deux ont intégré près de 20 kb du gène CYP2B2 mais, tandis que l'une possède
seulement les 800 premières pb de régions régulatrices de ce gène, l'autre en renferme 19
kb. Dans le premier cas. le transgène ne répond pas au PB. Dans le second. le profil
d'expression de CYP2B2. en absence comme en présence de PB, est restauré [86]. De fait,
ce gène est présent de façon constitutive dans le foie et il est fortement activé par le PB
dans ce même organe. Ainsi, l'induction par le PB du gène CYP2B2 fait appel à des
séquences régulatrices situées entre 800 pb et 19 kb du tsp [Ml. Si les travaux de
Ramsden et ses collabonteurs ont le mérite de réorienter la recherche d'un ou plusieurs
éléments de réponse au PB dans les régions distales de CYP2Bl et CYP2B2, il n'en
demeure pas moins que leurs résultats restent très globaux.
Simultanément à ces travaux, deux autres équipes de recherche [13,14] mettent au
point des systèmes de cultures primaires d'hépatocytes, satisfaisant à des conditions sine
qua none d'utilisation. Waxman et ses collaborateurs [13] démontrent que l'emploi du
milieu de culture Chee (MCM) modifié par l'ajout de divers acides aminés, sels,
vitamines. etc. et I'utilisation d'un substrat de collagène (Vitrogène) augmentent la
viabilité des hépatocytes (20 h 30 jours) et permettent de conserver différentes activités de
métabolisme des xénobiotiques qui sont reliées aux P450. Ainsi, l'activité enzymatique de
Chapitre II: Revue bibliographique 25
CYP2B 1 (activité d'hydroxylation en 16B de l'androstènedione) est induite par le PB, de
50 à 90 fois. comme in vivo. La quantité de CYPZB I et CYP2B2 et le ratio de ces
protéines (CYP2B l/CYP2B2=3) dans les rnicrosomes d'hépatocytes en culture primaire
traités au PB sont comparables B ceux déterminés in vivo 1131. Dans ce système de
culture, les gènes endogènes CYP2Bl et CYP2B2 répondent donc à un traitement au PB.
Ces conditions étant réunies, la porte est enfin ouverte à la recherche d'éléments
régulateurs dans les régions régulatrices de CYP2BI et CYP2B2. Aux nombreuses
analyses effectuées in vitro qui n'ont pu mener à un consensus dans cette recherche
peuvent maintenant se greffer des études fonctionnelles dans des cultures primaires
d'hépatocytes.
APERÇU DU TRAVAIL
Afin de tenter d'identifier un ou plusieurs éléments de réponse au PB du gène
CYP2B2, Énc Trottier, alors étudiant au doctorat dans le laboratoire d'accueil, vérifie les
conditions proposées par Waxman et ses collaborateurs [13] (pour de plus amples détails,
voir l'Article 1, Chapitre m) et obtient effectivement une induction par le PB des ARNm
endogènes de CYP2Bl et CYP2B2 dans des hépatocytes de rat en culture primaire. Ii
localise ensuite, dans la région régulatrice en 5' du gène CYP2B2, entre 2155 et 23 17 pb
du tsp, un fragment de 163 pb, conférant la r6ponse au PB à un gène rapporteur car
(«chloramphénicol acétyltransférase»). C'est dans le cadre de ce projet que s'inscrit le
contenu de la présente thèse. La première partie du travail a consisté à démontrer la
propriété d'activateur transcriptionnel du fragment de 163 pb, propriété sur laquelle nous
reviendrons au début du Chapitre VI.
Disposant à présent d'un système cellulaire adapté à la transfection de
constructions modifiées, il était possible, dans une deuxième étape, de vérifier la
fonctionnalité de la boîte Barbie. Ce travail s'intègre à la caractérisation du fragment de
163 pb. qu i est présentée au Chapitre N. L'analyse détaillée de ce fragment constituait
l'étape suivante des travaux de la présente thèse. Elle visait, en premier lieu, à identifier
les régions du fragment de 163 pb qui étaient protégées dans des expériences in vitro
d'empreintes à la DNase 1. Venait ensuite la tentative de localisation, par mutagenèse
dirigée, du ou des éléments critique(s) à une réponse au PB. Ainsi, p m i les régions
protégées se trouvait un site de fixation pour les facteurs de transcription de type «Nuclex
Factor l » ( M l ) . La mutagenèse du site consensus NF1 devait nous révéler s'il était
impliqué ou non dans la régulation par le PB de la transcription de CYP2B2.
A cheval sur le site NF1 se trouvait un hexamère (HX) de type AGGTCA, reconnu
par les récepteurs nucléaires. Nous donnerons plus d'informations sur cette superfamiile
protéique en introduction du chapitre IV. Mentionnons brièvement qu'elle comprend entre
autres, des récepteurs orphelins, baptisés ainsi parce que, ni fonction, ni ligand ne leur
était connu au moment de leur découverte [87]. L'ensemble de cette superfamille
reconnaît des éléments de réponse aux hormones (ou HRE), qui sont des combinaisons
multiples d'une même séquence minimale, AGGTCA [87]. La première étape du travail
sur le site HX consistait à déterminer si une protéine se fixait à cet élément puis d'établir
si sa mutagenèse affectait le pouvoir inducteur du fragment de 163 pb.
Au cours de cette thèse, nous étions également amenés à nous intéresser à un
élément localisé en 5' de NFI, présentant quelques ressemblances avec un élément de
réponse aux glucocorticoïdes (GRE). Ce site se trouvait à l'intérieur d'une séquence
centrale, plus longue. identifiée par Marie-Hélène Vachon comme indispensable à ln
réponse au PB du fragment de 163 pb. Les expériences de mutagenèse du site de type
GRE puis de transfection dms des cultures primaires d'hépatocytes devaient nous éclairer
sur le rôle de cet éIément et devait nous indiquer si la fonction essentielle de la séquence
centrale était reliée à la présence du site de type GRE. L'ensemble de ce travail est exposé
au Chapitre IV.
La raison d'être du Chapitre V repose sur le fait que nous avons jugé intéressant de
discuter les résultats distincts que Honkakoski et Negishi [22] obtenaient avec le modèle
de la souris. Le gène CypZblO de la souris code pour un P450, inductible par le PB. 11
renferme en 5' du tsp, entre 2426 et 2250 pb, une séquence présentant plus de 90%
d'identité avec le fragment du rat [22]. Cet élément de 177 pb possède les mêmes
propriétés activatrices que le fragment de 163 pb. En analysant cet élément, Honkakoski
et Negishi parvenaient à la conclusion que le facteur NF1 était indispensable à la réponse
au PB. Le site HX, appelé nNr>> ((muclear receptor») par cette équipe semblait, en outre,
être un site répresseur dans le modèle de la souris [22]. Les résultats du présent travail
divergeaient de ces conclusions. Cependant, vu la forte identité de séquences entre ces
éléments de la souris et du rat, il nous semblait peu probable que les fonctions de NF1 et
HX soient si différentes. Nous étions donc amenés à réaliser de nouvelles mutagenèses de
ces sites. Les expériences sont détaillées dans le Chapitre V.
Le Chapitre VI est une synthèse des résultats obtenus. Elle est placée dans le
contexte plus général des progrès réalisés, ces dernières années, par diverses équipes dans
la compréhension du mécanisme d'induction par le PB. Les principales perspectives qui
se dégagent de ce travail concluent l'exposé de cette thèse.
CHAPITRE III
LE FRAGMENT DE 163 pb EST UN ACTTVATEUR TRA,!YSCRIPTIONNEL, ACTIF EN PRÉSENCE DE
PHÉNOBARBITAL
Ce chapitre a fait l'objet d'un article intitulé: aLocalisation d'un élément de réponse au phénobarbital (PBRE) dans la région régulatrice du gène CYP2B2 du rat». II a été publié en 1995 dans la revue Gene 158: 263-268. Mes travaux se rapportent à la démonstration de la propriét6 bactivateur transcriptionnel du PBRE.
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 30
Le PB induit la transcription des gènes hépatiques CYPZBI et CYP2B2 du rat,
selon un mécanisme moléculaire encore inconnu. L'étude de ce mode d'action a pu être
envisagée grâce à un système de cultures primaires d'hépatocytes de rat, répondant à une
condition sine qua none d'utilisation. L'analyse de type {(Northern blot» a en effet
démontré que les gènes endogènes CYPZBl et CYPZB2 étaient induits par le PB dans de
telles cultures. Un élément de réponse au PB (PBRE) a ainsi pu être délimité dans les
régions régulatrices en 5' de CYP2B2. D'une longueur de 163 pb, il est situé entre 2155 et
23 17 pb du tsp de ce gène. Il répond à la définition d'un activateur iranscnptionnel
puisqu'il conserve son pouvoir inducteur lorsqu'il est abouté à un promoteur hétérologue,
et ceci indépendamment de son orientation et de la distance qui le sépare de ce promoteur.
Des essais de gels à retardement ont montré qu'il était reconnu par diverses protéines,
présentes dans des extraits de foie de rats traités ou non au PB. Ces résultats ouvrent la
porte à l'iden f i fication d'un ou plusieurs facteurs de transcription impliqué(s) dans
l'induction hépatique de CYP2Bi et CYP2B2 du rai.
Chapitre III: Lo frogment de 163 pb est wt activateur transcriptionne1 3 t
IN THE 5'-FLANKING REGION OF THE RAT C m 2 GENE
(Gene expression; cytochrome P450; phenobarbital induction; DNA tnnsfection; primary
rat hepatocytes; transcription regulation; cis-acting elements; enhancer)
Eric Trottier, Anne Belzil, Catherine StoItz and Alan Anderson
Centre de recherche en cuncérofogie de l'Université Laval, L1H6tel-Dieu de Qicibrc,
Qriébec G I R 2J6, Canada; and Département de biologie, Université Laval, Québec
G 1 K7P4, Canada
Correspondence to: Dr. A. Anderson, Centre de recherche. L'Hôtel-Dieu de Québec, 1 1.
côte du Palais, Québec G1R 236, Canada. Tel. (1 -41 8) 69 1-5548; Fax ( 1-4 18) 69 1-5439;
e-mail: 2020004@ saphir.ulaval.ca
Abbreviations: bp, base pair(s); CAT, chloramphenicol acetyltransferase; cat, gene
encoding CAT; cprn, counts per min; CTFNFI, CCAAT-binding transcription
factor/nuclear factor 1; CYP2B 1, rat cytochrome P450 2B 1; CYP2B1, gene encoding
CYP2B 1; CYP2B2, rat cytochrorne P450 2B2; CYP2B2, gene encoding CYP282; EtdBr,
ethidium bromide; GAPDH, rat glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH,
gene encoding GAPDH; Hepes, 4-(2-hydroxyethy1)-1-piperuine ethanesulfonic acid;
HSV, herpes simplex virus; kb, kilobase(s) or lûûû bp; MOPS, 3-[N-
morpholino]propanesulfonic acid; -1, nuclear factor I ; nt. nucleotide(s); oligo,
oligodeoxynucleotide; PB, phenobarbital; PBRE, phenobarbitd-responsive element;
PolIk, Klenow large fragment of E. coli DNA polyrnerase 1; SV40, simian virus 40; tk,
gene encoding thymidine kinase; tsp, transcription start point(s).
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnei 32
Cytochrome P450 2B 1, encoded by CYP?BI, and cytochrome P450 2B2, encoded
by CYP2B2, are inducible in rat liver by phenobarbital (PB). We have used cultured adult
rat hepatocytes to study molecular mechanisms regulating CYP2BUCYP2432 transcription.
Northem blot analysis demonstrated that the endogenous CYP2BlKYP2B2 genes were
inducible by PB in such cultures. A PB-responsive element (PBRE) confemng PB
inducibility on a reporter gene was identified in the CYP2B2 5'-flanking region. The
PBRE was localized to a 163-base pair Sau3AI fragment situated between 2 155 and 23 18
bp upstream of the CYP2B2 transcription start point (tsp). The PBRE also conferred PB
responsiveness on an enhancerless heterologous promoter and was active in both
orientations both upstream and downstream of the heterologous promoter; hence it has the
properties of a transcnptional enhancer. Gel retardation assays showed that nuclear
extracts of liver cells of untreated and PB-treated rats contained sequence-specific DNA-
binding factors that interact with a PBRE-containing DNA fragment. These results may
open the way to identifying one or more transcription factors mediating induction of
CYP2B2 and CYP2BI in rat liver.
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 33
It has long been known that xenobiotics induce liver metabolism of drugs and
steroids (Conney, 1967). The major cytochrome P450s inducible in rat liver by
phenobarbital (PB), CYP2Bl and CYP2B2. are about 97% identical (Waxman and
Azaroff, 1992). In Sprague-Dawley rats hepatic levels of CYP2Bl and CYP2B2 are,
respectively, >ZOO-fold and -27-fold greater than those of untreated rats (Christou et al.,
1987), and most of the PB effect is due to increased transcription (Hardwick et al., 1983).
However, û functional analysis of the rat CYP2BI and CYP2B2 regdatory elements has
not yet been achieved, because hepatocyte ceIl culture systems in which endogenous
CYPZBZ or CYP2B2 c m be induced have only recently been reponed. These systems use
either culture media that permit P450 induction in hepatocytes (Waxman et al., 1990:
Sinclair et al., 1990) or an extra-cellular matrix preparation ("Matrigel") as a substratum
(Schuetz et al., 1988) or as an overlay (Sidhu et al.. 1993). We have used such a system to
iocalize, in the 5'-flanking region of rat CYP2B2, a DNA sequence element confemng PB
responsiveness on a car reporter gene.
EXPEEUMENTAL AND DISCUSSION
(a) Induction of endogenous CYPZBIKYP2B2 in primary rat hepatocytes
Nonhern blot analysis confirmed that the endogenous CYPZBUCYPZB2 rnRNA
was inducible by PB in primary cultures of rat hepatocytes cultivated in serum-free
modified Chee's medium as reported for the CYP2B I and CYP2B2 proteins by Waxman
et al. (1990). It was detectable after 24 h of PB treatment (Fig. 1, lane 2), reached a
maximum by 48 to 72 h (Fig. 1, lanes 4 and 6), and declined slightly by 96 h (Fig. 1, lane
8). Parallel cultures treated in addition with a Matrigel overlay had a slightly higher
CYPZBIKYPZBZ mRNA level after 24 h of PB treatment (Fig. 1, lanes 2 and 3) and
sirnilar levels at 48,72 and 96 h (Fig. 1, lanes 4 to 9). The fold PB induction cannot be
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est wr activateur transcriptionnel 34
GAPDH
Figure 1: Northem blot of CYP2BI/CYP2B2 rnRNA from rat hepatocytes.
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur tmnscriptionnel 35
estimated because no CYPZBI/CYP2BZ message was detectable when PB was omitted
(Fig. 1, lanes 10 and 1 1). Control GAPDH mRNA was lower in Matrigel-treated cultures,
but no appreciable effect of PB treatment on its level was evident (Fig. 1, compare lanes 2
to 9 with lanes 10 and 1 l), indicating that the observed increase in CYP2BUCYPZB2
mRNA levels in PB-treated cultures was not due to a general increase in cellular rnRNA.
In subsequent experiments, PB treatment was for 48 h in the presence of a Matrigel
overlay.
(b) Identification and localization of a PBRE
Cells transfected with pBSCAT, which carries a promoterless car gene. had a low
background level of CAT activity that was unaffected by PB treatment (Fig. 2, pBSCAT).
A basal level of CAT activity (about 5-fold above background) was present in cells
transfected with constructs carrying sequential 5' and intemal deletions of the CYP2B2 5'-
flanking region insened upstream of the cat gene (Fig. 2). In cells transfected with
pBSCAT carrying portions of the CYP2B2 5'-flanking region extending to the Pst1 or
XhoI sites at -4500 and -2506, PB treatment led to a 5.2 to 6.6-fold increase over the basal
level of CAT activity (Fig. 2, P and X). When a further 600 bp of 5'-flanking sequence
was deleted. to the XmnI site at -20 15, PB responsiveness was completely abolished (Fig.
2, Xm). Additional deletions, extending to the EcoRV or SmaI sites at -168 1 and -729
respectively, or an internal deletion of the 825-bp XhoI-EcoRV fragment, dso abolished
PB responsiveness (Fig. 2, Ev, Sm and P-XEv). However, a construct carrying an internal
deletion of the 1.5-kb EcoRV-StuI fragment between -168 1 and -177 retained PB
responsiveness (Fig. 2, P-Ev/St). Finally, when the 163-bp SaBAI fragment from nt - 23 18 to -2155 was added once or twice to the upstream side of the CYP2B2 portion of the
nonresponsive Ev constmct, PB responsiveness was restored (Fig. 2, Sa-SaEv and Sa-
Sa(2X)Ev).
Thus a DNA sequence element confemng responsiveness to PB (PBRE) is
localized in the 163-bp Sau3AI fragment. PB inducibility varied from 3.5- to 6.6-fold,
which is 4- to 8-fold lower than the PB inducibility of the CYP2B2 protein in rat liver.
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 36
Figure 2: PB-mediated induction of the CYP2B2 prornoter requires an upstream cis-
acting site.
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionne1 37
Possible explanations for this difference are that other elements regulating PB
responsiveness remain to be discovered or that the response to PB is lower in isolated
hepatocytes than in rat liver. The PB inducibilities conferred by one 163-bp SadAI
fragment and of two such fragments present in tandem were both within the 3.5 to 6.6-
fold range, although the tandem elements did give inducibility values about 2-fold higher
than the single element (Fig. 2, Sa-Sa/Ev and SaSa(2X)Ev). Regions between -2015 and
the fsp were without effect on PB responsiveness (Fig. 2, Xm), although sequences
responsible for the basal level of cat expression are present between - 177 and the tsp (Fig.
2, P-EvISt).
The PBRE identified in this study is clearly different from putative regulatory
elements identified by others in the region within 180 bp (Upadhya et al., 1992; He and
Fulco. 1991) or 1.5 kb (Shaw et ai., 1993) of the CYP2BI or CYP2B2 tsp. However, Our
results are consistent with those of Ramsden et al. ( 1993), who found that in mice a rat
CYP2B2 transgene including the first 800 bp of 5'-flanking sequence was not PB-
inducible whereas if it carried an additional 19 kb of 5'-Hanking sequence it was PB-
inducible. The relation of the rat CYP2B2 PBRE to the chicken CYPZHl PB-responsive
enhancer domain (Hahn et al., 199 1) remains to be detemined.
(c) The CYPZB2 PBRE confers PB responsiveness on a heterologous promoter
The PBRE-containing 163-bp Sau3AI fragment was sub-cloned, in both
orientations, upstrearn and downstrearn of an enhancerless HSV tk promoter-cat constmct
in pBSTK-CAT. AI1 four constructs containing the CYP2B2 PBRE (Fig. 3, A to D), but
not pBSTK-CAT (Fig. 3, E), were PB-responsive. Hence the PBRE has the properties of a
transcriptional enhancer. The induction ratios were some two-fold higher when the PBRE
was on the 3' side of the reporter gene than when it was on the 5' side (Fig. 3). Since the
plasmids are circular, the downstream PBRE in consmets C and D can altematively be
considered to be 2929 bp upstrearn of the zk promoter and this rnight conttibute to their
increased PB responsiveness. In consuucts A and B, the PBRE is brought to within 50 bp
of the tk tsp which may explain their somewhat lower PB responsiveness. In any case,
Chapitre III: Le fiahoment de 163 pb est un activateur tra~~~criptionneI 38
Figure 3: The PBRE confen PB responsiveness on a heterologous promoter.
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 39
PBRE-containing constructs were PB-responsive, whereas the consmct without the
PBRE was not.
(d) DNA-protein interaction shown by gel retardation
Mobility shift experiments were performed using a labeled fragment containing
the 163-bp Saii3AI fragment. The Sou3M fragment carries an NF1 site (Hoffmann et al.,
1992) and hence intense signals typical of NFl-DNA complexes (Chodosh et al., 1988)
were evident (Fig. 4, lanes N). They were unaffected by a nonspecific competitor (Fig. 4,
lanes NSC), and reduced when a 120-fold excess of the unlabeled fragment was used as a
specific competitor (Fig. 4, lanes C). When the NF1-dependent signals were eliminated by
a 150-fold excess of NF 1 -specific oligo competitor, three distinct protein-DNA
complexes, designated Cl , C2 (which appeared to be a doublet) and C3, were revealed:
signals from complexes Cl to C3 were slightly more intense with a nuclear extract from
PB-treated rats thm from untrented rats (Fig. 4, lanes Ml). When both the unlabeled
fragment and the Ml-specific competitor were present, complexes Cl to C3 were
eliminated or reduced (Fig. 4. lanes NF1 + C). Thus, the 163-bp Sait3AI fragment which
carries the PBRE also carries sequence-specific recognition sites for proteins other than
NF1 present in rat liver nuclear extracts from untreated rats and, at somewhat higher
levels, in such extracts from PB-treated rats. The relation, if any, of these proteins to PB
inducibility remains to be determined.
(e) Conclusions
(1 ) We have localized a PBRE to a 163-bp SadAi fragment situated between 2155 bp
and 23 18 bp upstream of the rat CYPZB2 tsp.
(2) This fragment confers PB responsiveness on a heterologous promoter and has the
properties of a vanscriptional enhancer.
(3) The fragment also contains recognition sites for sequence-specific proteins present in
rat liver nuclear extracfi. although their role, if any, in PB induction remains to be
determined.
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 40
. -
y1 N C NSC NP1 N C NSC NF1 NF1
FREE f'ûA(;hIENT
Figure 4: interaction of liver ce11 nuclear factors with a restriction fragment containing
the CYP2B2 PBRE.
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 41
(4) These results may open the way to identifying one or more transcription factors
mediating the induction of CYPZB2 and CYPZBl in rat liver.
We thank Normand Marceau, Anne Loranger and Micheline Noël for advice and
for access to facilities for isolating rat hepatocytes, Sylvain Chamberland for isolating
CYP2B2, Cul Séguin for reading the manuscript, Jean Charron for the GAPDH cDNA
and Élise Saint-Jacques, Denis Allard and Alain Lamontagne for advice on the CAT
assay, nuclear extract preparation, and gel retardation assays respectively. E.T. was
supported by doctoral fellowships from the Société de recherche sur le cancer and the
Fonds pour la formation des chercheurs et l'aide à la recherche. This investigation was
supported by gnnts from the Medical Research Council and from the Société de
recherche sur le cancer.
Chapitre III: Le frcgment de 163 pb est un activateur transcriptionne1 42
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Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnet 45
FIGURE LEGENDS
Figure 1: Analysis was performed on 0.3 pg of total hepatic RNA isolated from a PB-
treated rat (Labbé et al., 1988) (lane 1). or on 3 pg of total RNA isolated from cultured rat
hepatocytes treated with PB ( 1 mM) for 24.48, 72 and 96 h in the absence (lanes 2, 4, 6
and 8 respectively) or in the presence (lanes 3. 5, 7 and 9 respectively) of a Matrigel
overlay, or on RNA from hepatocytes incubated for 96 h without PB in the absence (lane
10) or presence (lane 11) of a Matrigel overlay. Electrophoresis was for 2 h at 8 Vfcm in a
1.2% agarose gel containing 2% formaldehydel20 mM MOPS/I mM EDTNS m M Na
acetate pH 7.0. Hybridization and washing conditions have been described (Labbé et al.,
1988). The CYP2BI/CYP2B2 probe was a radiolabeled 470-bp NcoI-Hindm fragment of
the PB7 CYP2BI cDNA insert (Affolter et al., 1986); the 2.1-kb rat liver
CYP2BIKYP2B2 mRNA in Iane 1 served as r molecular length marker. The filter was
stripped and rehybridized with a GAPDH cDNA probe. Note that ten-fold less RNA was
present in lane 1 than in the other lanes which explains why, with the exposure time used,
no signal was detected in lane 1 with the GAPDH probe. Comparable loadings for lanes
2-1 1 were confinned by EtdBr staining. Hepatocytes were isolated from
ether-anesthetized male Sprague-Dawley rats ( 180-20 g; Charles River Canada, St-
Constant. Québec, Canada) by in situ Type IV collagenase (Sigma, St. Louis, MO, USA)
perfusion and purified by iso-density Percoll (Pharmacia, Baie d'Urfé, Québec, Canada)
centrifugation (Kreamer et al., 1986). The cells were then seeded under the conditions
described by Waxman et al. (1990). After 4 h, the medium was removed and replaced by
fresh medium with or without 1 mM PB or by medium containing r 1: 10 (v/v) dilution of
a Matrigel preparation (Li et ai., 199 1) (final protein concentration was 0.46 mg/ml) with
or without I m M PB. The medium was changed at 24 h intervals thereafter.
Fipre 2: PB-mediated induction of the CYP2B2 promoter requires an upstream cis-
acting site. A restriction rnap of CYP2B2 exon 1 (solid box) and 5 kb of its 5'-flanking
region is shown at the top of the line diagram on the left. Sequence coordinates in nt from
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 46
the CYP2B2 tsp at + 1 to -2506 are from Hoffmann et al. (1992); restriction sites between - 4 0 0 and -5000 were mapped in this study. Constructs are designated according to the
restriction enzymes used to generate them: P. PstI; X, XhoI; Xm, XmnI; Ev, EcoRV; Sm,
SmaI; St, StuI; Sa, Sau3AI. Sa-Sa(2X) indicates a tandem direct duplication of the 163-bp
Sau3A.I fragment. The normal orientation and integrity of the Suu3A.I fragments in
constmcts Sa-SalEv and Sa-Sa(2X)Ev were confimed by DNA sequence analysis.
pBSCAT was prepared by cloning, into the HindIII-HincII sites of pBluescript KS
(Stratagene, LaJolla, CA, USA), a HindIü-BamHI fragment from pSV2CAT containing
the cat reporter gene; the BamHI site was first end-filled using PolIk (GibcoBRL,
Burlington, Ontario, Canada). The CYP2B2 constructs were derived from the CYP2B2
insen of hBC3, obtained by screening a LEMBh rat genomic library (Chevrette et al.,
1987) with a radiolabeled 5'-terminal 90-bp PstI fragment of the PB7 CYP2B I cDNA
insen (Affolter et al., 1986). The CYP2B2 constructs al1 extended upstream from a SmaI
site at position +31 with respect to the CYP2B2 tsp (Mizukami et al., 1983). This SmaI
site was generated by site-directed mutagenesis (using a kit of Promega. Madison WI.
USA) of an NcoI site to eliminate the CYP2B2 ATG start codon. Plasmids were purified
using a ki t (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). Liposome-mediated transfection (Jacoby et
al., 1989) using 10 pg of plasmid DNA and 60 pg of lipofectin (GibcoBRL) was
perfomed 4 h after seeding rat hepatocytes (prepared as described in the legend to Fig. L)
at 4 x 106 cellsl6O mm dish. After 16 h the liposome-containing medium was removed
and replaced with 3 ml of fresh medium containing Matrigel (see Fig. 1. legend) with or
without 1 rnM PB. After 48 h cells were disrupted by four freeze-thaw cycles, the extract
was incubated at 70°C for 10 min, protein content was determined (Bradford, 1976), and
CAT activity was assayed (Seed and Sheen, 1988). Results for each constnict are average
values obtained from duplicate transfections performed at least three times using
hepatocytes from at least two different rats. Construct X was included as a positive
control in each experiment. The thin horizontal lines show standard errors. Fold PB
induction is the ratio of the CAT activity obtained from PB-treated cells to that obtained
from untreated cells.
Chapitre IIIr Le frogment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 47
Figure 3: The PBRE confers PB responsiveness on a heterologous promoter. PBSTK-
CAT, (constmct E) containing an enhancerless tk promoter, the cat gene and the SV40
polyadenylation region, was obtained by cloning a 710-bp HindIII-Nd fragment from
pTK-CAT (Jones et al., 1985) into pBSCAT from which a 551-bp HindIiI-NcoI fragment
had been removed. The end-filled 163-bp Sau3AI fragment (PBRE) was cloned in both
orientations (arrows) into the SmaI site upstream (constructs A and B) and, after addition
of KpnI linkers (Stratagene), into the KpnI site downstream (constructs C and D) of the tk,
caf and SV40 sequences of pBSTK-CAT. Results for each constmct are average values
obtained from duplicate transfections performed twice on hepatocytes from two rats.
Other methods were as described in the legends to Figs. 1 and 2.
Figure 4: Interaction of liver cell nuclear factors with a restriction fragment containing
the CYPZB2 PBRE. Gei retardation analysis of a labeled DNA fragment containing the
CYP2B2 PBRE was performed by incubating it with nuclear extrûcts (N) prepared from
the liver of untreated or PB-treated rats. For cornpetition reactions. a 120-fold molar
excess of unlabeled DNA fragment (C) or a 120-fold rnolar excess of pTZ19R
(Pharmacia) DNA as a nonspecific cornpetitor (NSC) were used. A 1500-fold mol=
excess of the CTF/NFl consensus oligo (Promega) with (NFI+C) or without (NFI) a 120-
fold molar excess of the unlabeled PBRE-coniaining fragment were also used. Lane -
corresponds to the fragment DNA incubated in the absence of extract. The major
protein-DNA complexes are identified as C 1, C2 and C3 (arrows). Nuclear extracts were
prepared (Bernier et al., 1993) from livers of 4 untreated and 4 PB-treated rats (Labbé et
al., 1988). A 187-bp EcoRI-BamHI fragment containing a 163-bp end-filled Sau3A.I
fragment corresponding to positions -23 18 to -2 155 of the CYP2B2 5'-flanking region was
end-labeled with I ~ - ~ ' P ] ATP (MN, Markham, Ontario, Canada). Binding reaction
mixtures contained, in a final volume of 20 pl, 0.25 ng of labeled DNA, 0.05% Nonidet
P-40 (Sigma), 4 pg Poly(d1-dC) (Pharmacia), 2 pg bovine serum albumin (Sigma), 6.5%
glycerol, nuclear extract (5 pg of protein), and the salts in modified Chee's medium (20
m . Hepes pH 7.4/77 m M NaCU5 m . KCVl.5 mM CaClt/l mM MgSOdl m M
NaH2P04.H20/1 pM CuSOC5H20/3 pM Fe(N0,)s-9H20/0. 1 pM MnSOo-4Hz0/1 pM
Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 48
Na2M004-2H20/3 pM ZnS047H20). Reaction mixtures were incubated at roorn
temperature for 20 min with or without various amounts of cornpetitor DNA before
loading on a pre-run 5% polyacrylamide gel and electrophoresis for 3.5 h at 10 Vlcm.
UN SITE CONSENSUS POUR LA PROTÉINE NF1, UN SITE RECONNU PAR LES RÉCEPTEURS NUCLÉAIRES
EX' UNE SÉQUENCE DE TYPE ÉLEMENT DE RÉPONSE AUX GLUCOCORTICOÏDES CONTRIBUENT À UNE INDUCTION MAXIMALE DE CYP282 PAR LE
PHENOBARBITAL
Ce chapitre a fait l'objet d'un article intitulé: d'unité de réponse au phénobarbital de CYP2B2 contient un élément accessoire et un site de type élément de réponse aux glucocorticoïdes, tous deux essentiels à une réponse maximale de ce gène au phénobarbital». Il a été recîigé par le Dr Anderson et moi-même et a été publié en 1998, dans la revue J Biol Chem 273: 8528-8536. Mon travail expérimental englobe les expériences d'empreintes 2 la DNase I (sauf la figure 3A), les mutagenèses dirigees, à l'exception de celle de la boîte Barbie et les expériences de transfection de tous les mutants obtenus par mutagenèse dirigée.
Chuvitre IV: Caractérisation du PBR U 50
Parce qu'ils rnétabolisent des xénobiotiques hydrophobes, les P450 hépatiques sont
essentiels au processus de détoxication et de protection de l'organisme contre les effets
nocifs possibles de ces substances. Une des grandes interrogations des scientifiques de ce
domaine est le mode d'action du PB, plus particulièrement le mécanisme moléculaire par
lequel ce xénobiotique induit CYP2Bl et CYP2B2. Un pas important a été franchi en
1995, lorsque l'équipe Anderson a identifié un activateur transcriptionnel dans les régions
régulatrices distales de CYP2i32 et ce, grâce à des analyses de trmsfection dans des
hépatocytes de rat en culture primaire. Par le biais d'expériences comparables de
transfection, effectuées avec des mutants de délétion de ce fragment de 163 pb se dégage
maintenant la notion qu'un élément central (ou a x e » ) est indispensable à la réponse au
PB mais se doit, pour être fonctionnel, d'être greffé à un site accessoire en amont ou en
aval. Un tel site, baptisé AF1 (~Accessory Factor I » element), a Çté localisé en 3' de
l'élément central. Les empreintes à la DNase 1 ont établi que ce site accessoire est reconnu
par un ou plusieurs facteurs, au même titre que trois autres régions du fragment de 163 pb.
L'une de ces régions couvre un site NF1 («Nuclea.r Factor 1 ») et un hexarnere AGGTCA,
reconnu par les récepteurs nucléaires. Ces deux séquences ainsi qu'un site de type dément
de réponse aux glucoconicoïdes (ou GRE) ont été mutés et se sont tous trois avérés
indispensables pour que le fragment de 163 pb conserve l'intégralité de son pouvoir
inducteur. Ainsi, à la lumière de ces nouveaux résultats se profile le concept d'unité de
réponse au PB, c'est-&-dire d'une construction complexe où plusieurs protéines et
séquences nucléotidiques interagissent pour une induction maximale de CYPZB2 par le
PB.
Chapitre IV: Caractérisation du PBR U 5 1
Pour plus de clarté et une meilleure compréhension de ce qui va suivre, nous
avons opté pour une présentation, en introduction de ce Chapitre, de quelques généralités
sur la famille des protéines NF1 et sur les récepteurs nucléaires.
4.2 GÉNÉRALITÉS SUR NF1
NF1 a été défini, dans un premier temps. comme une protéine cellulaire détournée
de sa fonction dans les cellules de vertébrés lorsque celles-ci sont infectées par un
Adénovirus [88]. NF1 est absolument indispensable à l'initiation de la réplication de
l'ADN du virus et se fixe à la séquence TGGA(N5)GCCAA. à son origine de réplication
[89]. En réalité, NF1 désigne un ensemble d'au moins 4 protéines, N F 1 -A, NF 1 -B, NF1 -C
et NFI-X, réunies en une famille, appelée la famille NF1 [9O,9 11. Ces protéines sont
présentes chez la plupart des vertébrés et leur distribution tissulaire est ubiquistc [92).
Elles reconnaissent toutes un élément, plus ou moins proche du consensus
TGG(A/C)(N5)GCCAA [go]. En plus d' in tervenir dans la réplication de certains virus,
elles sont impliquées dans l'expression de nombreux gènes cellulaires, en tant que
répresseur [93] ou activateur transcriptionnel[90]. Ml s'attache à l'ADN sous forme d'un
homodimère ou d'un hétérodimère de l'une ou l'autre des isofones [9 11.
4.3 GÉNÉRALITÉS SUR LA SUPERFAMILLE DES
R É C E ~ U R S NUCLÉAIRES
Les récepteurs nucléaires constituent une superfamille de facteurs de transcription
dont l'activité est généralement modulée par la présence de ligands spécifiques [94]. Les
premiers membres identifiés dans cette famille étaient des récepteurs aux ligands connus,
tels que les récepteurs stéroidiens (récepteurs des glucoconicoïdes (GR), des
minéralocorticoïdes (MR), de la progestérone (PR), etc.), le récepteur de l'hormone
Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 52
thyroïdienne (TR), de l'acide rétinoïque tout trans (RAR) ou de la vitamine D (VDR)
[94]. Ces récepteurs, dits récepteurs conventionnels, contrôlent des processus
physiologiques importants dans le développement et la différenciation cellulaire [87].
L'ensemble des ligands de ces récepteurs, de nature lipophile, peut diffuser à travers les
membranes cellulaires. Une fois dans la cellule, s'il s'agit d'hormones stéroïdiennes, elles
se fixeront des homodimères cytoplasmiques de leur récepteur respectif puis transiteront
vers le noyau. Dans le cas de ligands non stéroïdiens, les récepteurs sont déjà séquestrés
dans le noyau et en présence du ligand, ils se lient au récepteur de l'isomère 9cir de
l'acide rétinoïque ou RXR. L'ensemble de ces complexes ligand-récepteur se fixera à de
courtes séquences d'ADN, appelées HRE (éléments de réponse hormonale, à titre de
rappel) [87].
Une autre classe de récepteurs, qualifiés de «récepteurs orphelins» puisque ni
fonction, ni ligand physiologique ne leur était connu lors de leur découverte, est venue
grossir, depuis une dizaine d'années, les rangs de cette superfamille [95]. Les récepteurs
orphelins prennent une place de plus en plus importante, représentant environ 75% de
l'ensemble des récepteurs nucléaires [94,95]. En 1996, près de 60 d'entre eux étaient
répertoriés aussi bien chez les vertébrés que chez les invertébrés (nématodes, drosophile)
[94]. Leur conservation à travers l'évolution fait d'eux les doyens de cette superfamille,
alors que les récepteurs conventionnels comme TR et RAR, qui n'existent pas chez la
drosophile, ou les récepteurs stéroïdiens, absents des poissons, seraient apparus plus tard
[94]. C'est de l'analogie avec les récepteurs conventionnels qu'a émergé l'idée que la
plupart des récepteurs orphelins étaient des modulateurs transcnptionnels activés p u des
ligands. Les chercheurs ont percé un peu du secret de certains, comme PPARa
(~peroxisome proliferator activated receptor a») qui est un récepteur activé par des
médicaments hypolipidémiques et des acides gras naturels à longues chaînes et est donc
impliqué dans l'homéostasie lipidique [96,97]. Les ligands de HNF4a (ahepatocyte
nuclear factor 4 a»), un récepteur orphelin bien connu [98], viennent d'être découverts
[99]. Il s'agit d'acides gras dont la longueur et le degré de saturation des chaînes
déterminent l'effet agoniste ou antagoniste sur HNF4a. Bien que la recherche de ligands
Chapitre W: Caractérisation du PBRU 53
pour ces récepteurs ait progressé rapidement ces dernières années, la plupart des
récepteurs demeurent encore orphelins [87]. Mentionnons enfin que des travaux récents
sur CAR (uconstitutively active receptonj) [IOO], dont nous reparlerons en conclusion,
rejoignent la théorie selon laquelle des récepteurs orphelins auraient perdu la capacité
d'être modulés par des ligands naturels et agiraient en leur absence [IO 1,1021.
L'ensemble des récepteurs nucléaires se lient à l'ADN grâce à une stmcture en
doigts de zinc [94]. Rappelons que ces protéines reconnaissent une séquence de type
AGGTCA, dupliquée ou non et prenant des configurations variables. Les récepteurs or-
phelins sont ainsi classés en trois sous-groupes, selon qu'ils se lient à l'ADN sous forme
de monomères, d'homodimères ou d'hétérodimères. Dans le cas d'un monomère, la
séquence AGGTCA est unique mais elle possède en 5' une extension de quelques
nucléotides. Dans le cas d'homodimères ou d'hétérodirnères, cet élément est dupliqué et
les deux demi-sites sont en position inversée (palindromique; IR, «inverted repeat»),
éversée (palindromique inversée; ER, «evened repeat») ou répétée (DR, «direct repeat»)
l'un par rapport à l'autre, l'espacement entre les deux AGGTCA étant variable [95] Figure
11. Si I'on excepte quelques exemples de récepteurs, tel que COUP-TF ((chicken
ovalbumin upstream promoter-transcription factor») [l03], qui s'attachent à des HRE de
nature variable, l'ensemble de ces caractéristiques conduit à une grande spécificité de
reconnaissance, malgré la simplicité de l'élément de base.
Chapitre IV: Caractérisation du PBR LI 54
Récepteurs stéroïdiens Hétérodimères de RXR
souvent des IR-3 HRE DR dont les espacements sont de Iongueur variable
Récepteurs orphelins homodimèriques Récepteurs orphelins monomériques
séquence unique, précédée d'une courte séquence riche en A et T
Figure 1: Quatre classes de récepteurs nucléaires (dessin inspiré de [87]).
CAR, Constitu tively active receptor; COUP-TF, Chicken ovalbumin upstream promoter-
transcription factor; GR, Glucocorticoid receptor; HNF4, Hepatocyte nuclear receptor 4;
HRE, Hormone response element; IR-3, Inverted repeat-3; MR, Mineralocorticoid
receptor; PPAR, Peroxisome prolifentor-activated receptor; PR, Progesterone receptor;
RAR, Retinoic acid receptor; RXR, Retinoid X receptor; SFl, Steroidogenic factor 1; Ftz-
F1, Fushi tarazu F1 receptor; TR, Thyroid receptor; VDR, Vitamin D receptor.
Cha~itre IV: Caractérisation du PBRU 55
THE CYP2B2 PHENOBARBITN, RESPONSE UNIT CONTAINS AN
ACCESSORY FACTOR ELEMENT AND A PUTATIVE GLUCOCORTICOID
RESPONSE ELEMENT ESSENTIAL FOR CONFERRING MAXIMAL
PHENORARBITAL RESPONSIVENESS*
Catherine Stoltz, Marie-Hélène Vachon, Eric Trottier. Stéphane Dubois. Yanick Paquet
and Alan Anderson*
From the Centre de reclierche en cancérologie de l'Université Laval, Pavillon L'Hôtel-
Dieu de Québec, Centre hospitalier universitaire de Québec, Québec GIR 2J6 Canada
and Département de biologie, Universitt: Laval, Québec G l K 7P4 Canada
Running title: CYP2B2 phenobûrbital response unit
'c.s. and M-H.V. contributed equally to this work, which was supported by a
grant from the Medical Research Council. The costs of publication of this article were
defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be marked
"ndvertisement" in accordance with U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
$To whom correspondence should be addressed: Centre de recherche, L'Hôtel-
Dieu de Québec, 1 1 côte du Palais, Québec, Canada GlR 2J6. Tel.: 4 18-69 1-5548; Fax:
4 18-69 1-5439; e-mail: Alan.Anderson@ bio.ulaval.ca.
Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 56
Hepatic cytochrome P450s play a critical role in the metabolism of hydrophobic
xenobiotics. One of the major unsolved problems in xenobiotic metabolism is the
molecular mechanism whereby phenobarbital induces hepatic enzymes, panicularly
CYPZBl and CYP2B2 in rat liver. Using primary rat hepatocytes for transfection
analyses. we previously identified in the CYP2B2 5'-flank a 163-base pair Saii3AI
fragment that confers phenobarbital inducibility on a cat reporter gene and that has the
propenies of a transcriptional enhancer. Transfection expenrnents with sub-regions of the
Sau3AI fragment now indicate that a central core together with an upstream or
downstream accessory element within the fragment can confer phenobarbital
responsiveness. One such accessory element, M I , was identified and localized. DNase 1
footprinting analysis revealed the presence of a footprint overlapping this Ml element. It
also identified three other major protected regions, two of which are putative recognition
sites for known transcription factors. Site-directed mutagenesis indicated that a putative
glucocorticoid response element as well as a nuclear factor 1 site and an associated
nuclear receptor hexarner half-site are essential for conferring maximal phenobarbital
inducibility. Taken together, the results indicate that phenobarbital induction of CYP2B2
requires interactions among multiple regulatory proteins and cis-acting elements
constituting a phenobarbital response unit (PBRU).
Chapitre IV: Caractérisation du PBR W 57
Many different cytochrome P450s (CYPs)' are involved in the hepatic metabolism
of a wide variety of xenobiotic substances including drugs, plant metabolites and
chernical carcinogens (1,2). The genes encoding these enzymes are either expressed
constitutively or are induced by various chernicals (3). One of the major unsolved
problems in the study of the induction of CYP proteins is the molecular mechanism
whereby phenobarbital (PB) induces the closely related CYP2BI and CYP2B2 foms in
rat liver (4). Although it has long been known ihat PB induces CWZBl and CYP2B2
mRNAs by increasing transcription of their genes (5,6). details of the transcriptional
control of CYPZBl and CYPZBZ have not been forthcoming. This is largely because. until
recently. it was not possible to obtain PB induction of the endogenous CYP2Bf and
CYP2B-7 genes in cultured cells (4,7,8). We have transfected reporter gene constmcts into
cultured adult rat hepatocytes and localized, in the CYP2B2 5'-flanking region, a 163-base
pair (bp) Sart3Ai fragment that confers PB inducibility on a cat reporter gene (9). The
San3AI fragment, which is situated between 2155 and 23 17 bp upstream of the CYPZB2
transcription stan point. in the vicinity of a liver-specific DNase 1 hypersensitive site (IO),
has the propenies of a transcriptional enhancer (9). The capacity of the Sau3Al fragment
to confer PB responsiveness on a heterologous promoter has been confirmed in a quite
different assay system involving in situ DNA injection into rat liver (1 1). Furthemore, the
homologous region of the 5'-flanking region of the PB-inducible mouse Cyp2blO gene
contains a segment 9 1% identical to the rat CYP2B2 163-bp fragment that dso confers PB
inducibility on heterologous promoters and possesses the prope~ies of a transcriptional
enhancer (12).
' The abbreviations used are: CYP, cytochrorne P450; PB, phenobarbitd; bp. base pair@); NF 1, nuclear factor 1; PBRU. phenobarbital response unit; GRU, glucocorticoid response unit; PEPCK, phosphoenolpynivate carboxykinase; oligo, oligodeoxyribonucleotide; CAT, chloramphenicol acetyltransferase; GRE, glucocorticoid response element; COUP- TF, chicken ovalbumin upstrearn promoter transcription factor, HNF-4, hepatocyte nuclear factor-4; FïF, fetoprotein transcription factor.
Chapitre IV: Caractérisation du PB RU 58
The CYP2B2 163-bp SadAI fragment contains a functionai nuclear factor 1
(NFI) site (9.13) and recognition sites for other sequence-specific DNA binding factors
present in rat liver nuclear extracts (9). In the present study, we sought to define the
elements within the 163-bp Sau3AI fragment which confer PB responsiveness. Deletion
constmcts of the Sau3AI fragment, as well as constructs in which putative recognition
sites for DNA binding factors had been mutated, were transfected into adult rat
hepatocytes and their effect in conferring PB responsiveness was analysed. DNase 1
footprinting experiments were used to identify potential regulatory elements by defining
interactions between rat liver nuclear proteins and the Sau3AI fragment. A putative
glucocorticoid response element as well as an NF1 site and an associated nuclear receptor
hexamer half-site were found to be essential for conferring maximal phenobarbital
inducibility. Taken together, the results indicate that the Snu3AI fragment is a
multicornponent enhancer and that multiple regulatory proteins and their cognate
recognition sequences within it are criiical for obtaining maximal PB responsiveness.
Thus, the Snri3AI fragment constitutes a PB response unit (PBRU), analogous to the
complex glucocorticoid response unit (GRU) required for glucocorticoid induction of
transcription of the rat gene for phosphoenoipyruvate carboxykinase (PEPCK) (14-17).
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Materiois and Animais-Chee's medium for hepatocyte culture as well as
restriction and DNA modifying enzymes were from Life Technologies. The double-
stranded CTFNF 1 consensus oligodeoxyribonucleotide (oh go), (5'-
CCTTïGGCATGCTGCCAATATG-37, was from Promega or was purchased as
complementary single-stranded oligos from Life Technologies. Other oligos were also
from Life Technologies, except as noted. [ y - 3 2 ~ ] ~ ~ ~ (6000 Ci/mmol), [~-"P]~ATP
(3000 Ci/mmol), [~-"s]~ATP~s (1 250 CVmmol), ['4~]dichloroacetylchloramphenicol
(60 Cilmmol), and [3~]dichloroacetylchloramPhenicol (30 Ci/mmol) were from NEN.
Male Sprague-Dawley rats (1 50-1 80 g) were from Charles River Canada.
Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 59
Isolation and Culture of Prirnary Hepatocytes, Trangection. PB Treatment and
Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) Assays-The methods for hepatocyte isolation
and culture, essentially those of Waxman et al. (18), as well as those for liposome-
mediateci transfection (19) and PB treatment have been described (9). Plasmids were
purified using a plasmid purification kit (Qiagen). CAT activity was assayed by the
method of Goman et al. (20) and, occasionally, by that of Seed and Sheen (2 1).
Construction of Deletion and Point Mutants-Sequential 5' or 3' deletions of the
163-bp Sari3AI fragment (-23 17/-2 155) were generated by restriction enzyme or Ba13 1
digestion (Fig. 1). The starting point for construction of such deletion mutants was the
pSa-Sa 163 plasmid. obtained by subcloning the 163-bp Sari3AI fragment into the SmaI
site of pBluescript KS (Stratagene). The pSa-Sa 163 plasmid or similar pBluescript KS
derivatives containing specified portions of the CYP2B2 5' flank were used to generate
other deletions by polymerase chain reaction-mediated amplification. To obtain -22571-
2208 (Fig. 1 ) the staning pBluescript derivative contained -22571-2012 and the primers
were KS (Stratagene) and oligo HX (GATCCACTGTGCCAAGGTCAGGA -2226, lower
stand; the underlined nucleotides were added for convenience). In a series of
amplifications (Fig. l ) , primers 2B2Nco (-2257 CATGGTGATTTCAGGCA) and SK
(Stratagene) were used as follows: to obtain -2257/-2207 the starting pBluescript
derivative contained -23 l7/-2207, to obtain -2257/-2 188 it contained -23 lW2 188, and to
obtain -2257/-2172 it contained -2317/-2172. Point mutations were introduced into the
163-bp Snlr3AI fragment using the Altered Sites Ii in vitro Mutagenesis System
(Promega). in the mutant oligos which follow, substitutions in the wild-type sequence are
indicated by bold characters: GREm (-2253
GTGAmCAGGCGTGGACTCTGTACIT), NF1 m 1, synthesized by Michel Lambert
of this Research Center, (-22 18 TTGGCACAGTGCTTCCATCAACTTGA), NFldm2 (-
2224 CTGACCTTGGTACAGTGCTTC), HXm (-2232
GTACïTTCCTGAGAïTGGCACAGT), HXm-NF 1dm2 (-2232
GTACiTïCCTGAGATITiGTACAGT). Oligo HXm-NF 1 dm2 contains, in addition to
the HXm mutation, a single mutation in the NF1 sequence; since it was used to mutate a
S a d A I fragment that already carried NFlml, it generated a triple mutant sequence. A 3-
Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 60
bp tandem point mutation was also introduced into the AAAG core of the Barbie box of
the CYP2B2 promoter using oligo BBm (-94
AGTGAATAGCCAGCTCAGGAGGCGTGA). Deletion and point mutants were
subcloned by blunt-ended ligation into the EcoRV site of the non-PB responsive Ev
construct which contains 168 1 bp of the CYPZB2 5' flanking region cloned upstrearn of
the cat reporter of pBSCAT (9). The strategy employed to obtain deletions by Ba131
digestion and by amplification generated an additional 8-nucleotide sequence (5'-
GGGGGATC) or. for the deletions obtained with oligo HX, and additional 12-nucleotide
sequence (5'-GATCGGGGGATC), between the 3' end of the deleted portion of the 163-
bp Sau3AI fragment and the EcoRV site used for subcloning. The normal orientation and
integrity of the subcloned fragments in the reporter constructs were confirmed by DNA
sequence anal ysis.
Nuclear Ertracts and DNase I Footprinring Analyses-Nuclear extracts were
prepared (22) from pooled livers of two or three untreated or PB-treated (23) rats. Where
noted, nuclear protein extracts were fractionated by chromatography on heparin-
Sepharose using Hitnp Heparin columns (Pharmacia). The fragments used for DNase 1
footprinting analyses were prepared from pSa-Sa163, or from similar plasmids contdning
a mutated 163-bp Sail3AI fragment, by releasing a 230-pb fragment with EcoRI and EagI
digestions. After 3'-end-labeling using the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase 1
or 5'-end-labeling using T4 polynucleotide kinase, the fragment was purified by
electrophoresis on a 5% polyacrylarnide gel. DNase 1 footprinting was performed (22) in
12.5 mM Hepes, pH 7.6,70 mM KCI, 3.5 rnM MgC12, 5 phi ZnS04, 1 m . EDTA, 5%
glycerol, 0.5 rnM NaMoo~, 0.075 mM Nonidet P-40, 0.5 mM DTT, 0.25 mM
phenyimethylsulfonyl fluonde containing 5 pg of poly (dI-dC). Reaction volumes were
typically 70 pl. Na2 P-glycerophosphate, when present, was at 10 to 20 rnM.
Chapitre IV: Caractirisation du PBR U 61
Functional Analysis of the 163-bp Sau3AI Fragment-Transfection analysis was
perforrned with sub-fragments of the 163-bp Sau3AI fragment to identify sequences
within it that might confer PB responsiveness. Sequential deletions from the 5' end up to
the intemal NcoI site (coordinate -2257) were ail active in conferring PB responsiveness,
although the response conferred by construct -2257/-2 155 was reduced by about two-fold
as compared to that of the full length fragment (Fig. 1 A, constructs with a common 3' end
point of -2 155 and 5' end points of -2290, -2283, -2273, -2264 or -2257). Funher deletion
from the 5' end, io an intemal RsaI site (coordinate -2230) or to -2180, led to complete
loss of activity (Fig. 1A). Similady, sequential 3' deletions up to -2207 were also active,
although the response conferred by constmcts -23 171-2 188 and -23 171-2207 was again
reduced by about two-fold as compared to that of the full-length fragment (Fig. lA,
constmcts with a common 5' end point of -23 17 and 3' end points of -2172, -2188 or - 2207). Further deletion from the 3' end. to the RsaI site (coordinate -223 1; Fig. IA) or to
-2753 (construct -2600/-2253; data not shown), led to complete loss of activity.
These results suggested that DNA sequence elements that are essential for PB
responsiveness are localized in the 51-bp central core between -2257 and -2207.
However, constmct -2257/-2208 was completely inactive (Fig. l), although its 5'
extremity is the same as that of the active -2257/-2155 construct and its 3'extremity is one
bp upstrearn of that of the active -23 17/-2207 construct. Since construct -22571-2207 was
also inactive (Fig. IB), the single bp difference at the 3' ends of the -2257/-2208 and - 23 17/-2207 constmcts does not account for the inactivity of the former. Hence, the central
core is insufficient by itself to elicit PB responsiveness.
Funcrional Evidence for an Accessory Element-The deletion analysis presented
above suggests the following mode1 to account for the PB responsiveness conferred by the
163-bp Sau3A.I fragment. A central core, together with an element or elements extending
upstream of coordinate -2257 or with an element or elements extending downstnarn of
Chapitre TV: Caractérisation du PBRU 62
t (10) Not Detectable
(3) Not Detectable
(a) Not Detectabte 1 1 1
! I 1 1 I 1 # I
% Wild Type PB Response
(2) Not Detectable
(2) Not Oetectable (3) Not Detectable
O 20 40 60 80 100
% Wild Type PB Response
Figure 1: Functional analysis of the CYP2B2 163-bp Sau3A.I fragment.
Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 63
coordinate -2207, can confer PB responsiveness. In support of this model, although
construct -2257f-2 188 was inactive, constmct -22571-2 172 was active in eliciting a PB
response (Fig. IB). This result indicated that there is a DNA sequence element between
coordinates -2188 and -2172 that confers PB responsiveness when combined with the
central core. The element between -2188 and -2172 is insufficient to elicit PB
responsiveness by itself, because it is present in the inactive -2230/-2 155 construct (Fig.
IA). Hence, it is an accessory site for confemng PB responsiveness, and we have
designated it as AFI (Figs. IB and 2).
Physicai Evidence for Proteins Bindhg io AFI and to Other Sites Within the 163-
bp San3AI Fragment-To ascenain whether an accessory factor binds to the AF1 site. as
well as to look for evidence of other protein-DNA interactions. the 163-bp Sau3AI
fragment was subjected to DNase i footprinting analysis using rat liver nuclear extracts.
First. the fragment was labeied on the lower strand at the 3'end (Fig. 3A). Analysis using
crude extract revealed a series of almost continuous footprints over some 85 bp extending
from about -2285 to about -2200 (Fig. 3A). Use of heparin-Sepharose-fractionated
extracts facilitated resolution of protected regions F1, F2, F3 and F4 within this segment:
protected region F2 was virtually undetectable with the fractionated extracts. whereas FI,
F3 and FJ remained visible (Fig. 3A). An additional protected region, FO, was revealed
after 5'end labeling of the lower strand (Fig 38). FO is also visible above the FI footprint
in Fig. 3A (crude extract lane). Protected regions Fl', F2' and F3: corresponding to F1,
F2. and F3 plus f4 respectively, were identified by labeling the 5' end of the upper strand
(Fig. 3C). Protected region FO' (corresponding to FO) is also evident above Fl ' in Fig. 3C.
The positions of the FO and FO' footprints overlap with the AFl site defined by
transfection analysis (Fig. 2).
Addition of PB to incubation mixtures did not appreciably change the footprints
obtained with cmde nuclear extracts of untreated rats (data not shown) or with a nuclear
extract partidly purified by heparin-Sepharose fractionation (Fig. 3A, lanes PB) and
similar footprints were generated by crude nuclear extracts from untreated and PB-treaied
rats (Fig. 3B and data not shown).
lr3 ' I Fa ' b
Sau3Al * 1 b i - - - - - - - - - .
TG GACACAACCT TCAAGAAGTG CACTTCAGTG ATTTCAGGCA CAGA
CTGTGTTGGA AGTTCTTCAC TAAAGTCCGT GTCT - - - - - - - - - - -
P l i 1 FO ' 1 1 b AP1 i
I - - - - L - - - - - - . v Sau3Al CTCTGT ACTTTCCTGA CCTTGGCACA GTGCCACCAT CAACTTGACT cl!-'I' GCCAGGCT0G G
GAGACA
I 1 Fl
- ro
Chapitre W: Caractérisation du PBR U 66
The 163-bp CYPZB2 Sau3AI Fragment is a Multicomponent Enhancer-The DNA
sequence of the 163-bp Sau3A.I fragment (13) (see also Fig. 2) reveals that it contains
putative recognition sites for several transcription factors, only some of which are shown
in Fig. 2. Potential regulatory motifs were identified by inspection and by application of
MatInspector (matrix similarity threshold, 0.85), a search tool for scanning DNA
sequences for matches to nucleotide distribution matrices for transcription factor binding
sites accessible in the TRANSFAC database (24). Immediately adjacent to a perfectly
symmetrical NF1 site (-22 17 TGGN7CCA) (25), previously identified (9,13), is a perfect
hexamer half-site (AGGTCA -2223, lower strand) for orphan members of the nuclear
receptor superfamily (26,271. We refer to the combined hexarner half-site and NF1 site
(Fig. 2) as the HX-N'FI complex. There are also, in an unusual evened repeat arrangement
with a 7-bp spacing (ER-7), two other AGGTCA sequences (coordinates -2282 to -2264)
(Fig. 2). In addition. between the intemal NcoI site and the HX-NF1 complex,
Matinspector finds on each strand a match to a glucocorticoid receptor binding site
(TRANSFAC matrix GR-Q6; coordinates -2244 to -2226 on the upper strand and -2246
to -2228 on the lower strand) (Fig. 2). The 5 1 -bp central core between -2257 and -2207
defined by the transfection analyses described above excludes ER-7 but includes the
candidate glucoconicoid receptor binding sites and most of the HX-NF1 complex.
The Fi and FI' footprints extend from -2230 to -2192, a region which includes
and extends beyond the HX-NF1 complex (Fig. 2). Most of the F1 footprint was
eliminated by a CTF/NFl consensus oligo cornpetitor (Fig. 3A. lane MI). Therefore, it is
caused in part at Ieast by an NF1 protein. The positions of F3F4 and F3'correspond to the
two halves of the ER-7 sites and both F3 and F4 were competed by oligo HX (Fig. 3A.
lane HX). Hence F3/F4 and F3' are presumably caused by protein(s) of the nuclear
receptor superfamily binding to the two halves of ER-7. No good candidates for the
protein(s) responsible for the F2 and F2' footprints are yet available.
The region of the FI' footprint was analyzed using varying amounts of nuclear
protein. At lower protein levels, a reduced protected region was observed with the wild-
type sequence. presumably as a result of binding of an NF1 protein, whereas at higher
Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 67
protein levels, the footprint was extended in both directions (Fig. 4A). Similar results
were obtained with protein extracts from untreated and from PB-treated rats (Fig. 4A).
When a mutant sequence in which NF1 binding was abolished was analyzed, the extended
protection on the upstream side was still evident at higher protein levels (Fig. 4B). Thus,
the extended protection on the upstream side is due to binding of a protein or proteins to a
sequence including the nuclear receptor hexamer half-site. Consistent with this conclusion
is the observation that only a part of the F1 (Figs. 3A and SA) and the F1' (Fig 5B)
footprints were eliminated by competition with an NF1 consensus oligo.
PB responsiveness is reduced but not eliminated by mmrrtating either or both
elements of the HX-NFI cornplex-To investigate the role of the HX-NF1 complex in
conferring PB responsiveness, the NF1 site was mutated in two steps, first in the distal
ponion (NFlm 1 ; Fig. 6) and then in both the distal and proximal portions (NFldm3; Fig.
6). The N F l m 1 mutation created a new DNase 1 hypersensitive site at -2207 and modified
the FI footprint but did not abolish it; furthemore, the portion of the modified FI
footprint corresponding to NF1 sequences was eliminated by competition with an NF1
consensus oligo (Fig. SA). With the NFldmZ mutant sequence, the Fi ' footprint was
reduced to that seen with the wild type sequence in the presence of an NF1 consensus
oligo competitor (Fig. 5B). Hence, the NFldm2 mutation completely eliminated
detectable NF1 binding, but it left a footprint on the upstream side, corresponding to the
anticipated binding of a protein or proteins to a sequence including the nuclear receptor
hexamer half-site (Figs. 4B and 5B). Here, as elsewhere, identical results were obtained
using nuclear extracts prepared from livers of untreated and PB-treated rats (Fig. 5B).
The NF1 m 1 and NFldm2 mutations, as well as two additionai mutations of the
HX-NF 1 complex, HXm (mutated in the hexarner half-site) and HXm-NFldm2 (mutated
in the hexamer half-site and in M I ) , al1 reduced but did not abolish PB responsiveness
when tested by transfection analysis (Fig. 6). None of these mutations increased the basal
level of CAT activity (data not shown). These results demonstrated that both elements of
the HX-NF1 cornplex rnust be intact to elicit a maximal response to PB.
Chapitre iV: Caroctérisution du PBR U 68
Wild type
Figure 4: Analysis of the Fl' footprint with various amounts of protein.
Chapitre N: Caractérisation du PBRU 69
BS A
control
control
PB
PB
control
PB
Figure 5: Effect of mutations in the NF1 site on the FI and Fl ' footprints.
Chapitre IV: Caractérisation du PBR U 70
Mutation of a candidate glucocorticoid receptor binding site dramatically reduces
PB responsiveness-The consensus sequence for the glucocorticoid response element
(GE) is GGTACAnnnTGTTCT (28). The two candidate glucocorticoid receptor binding
sites found by MatInspector within the central core defined by transfection anaiysis
contain putative GREs, one of which, -2244 GGCACAgacTCTGTA on the upper strand.
matches the consensus at 7 of 12 positions. This sequence was mutated to
GGCGTGgacTCTGTA, thereby reducing the match to 4 of 12. This led to vimial
abolition of the PB response (Fig. 6). This suggests that a protein binding in the region of
the putative GRE is required to confer PB responsiveness.
Mutation of the CYP2B2 Barbie Box Does Not Affect PB Inducibility-It h a been
suggested that the Barbie box (29) is involved in confemng PB responsiveness on the rat
CYP2Bl and CYP2B2 genes (30). However, when the core sequence (5' AAAG 3') of the
CYP2B2 Barbie box was mutated, PB responsiveness was retained (Fig. 6).
Our previous work has shown thai an upstream enhancer element. located between
-23 17 and -2 155 in S'flanking region, confers PB responsiveness on the rat CYP2B2 gene
(9). This element is situated in the vicinity of a liver-specific DNase 1 hypersensitive site
in chromatin (10). Such sites are a hallmark of regulatory regions (31). Furthemore, in
transgenic rnice a rat CYP2B2 transgene including only the fkst 800 bp of the 5' flank was
not PB-inducible, whereas a transgene carrying 19 kb of 5' flank (and hence the -23 17/-
2 1 55 segment) was normally inducible (32). Furthemore, the experiments described in
our previous report (9) and in subsequent reports from two other laboratories (1 1,12), as
well as those described here, provide a strong body of evidence indicating that upstrearn
control elements confer PB responsiveness on the rat CYPZB2 and mouse Cyp2610 genes.
The mouse Cyp2610 active sequences are situated between -2426 and -2250 and display
91 % sequence identity to those of CYP2BZ (12). Particularly important in this context is
5'GGC gacTCTGTA-3' GREm 1 ACA- GTG )
% Wild Type PB Response NF1
I i ' HX t 1
CTTTCCTGACC TTGGCACAGTGCCACCATCAACl-rGACT l
GAAAGGACTGGAACCGTGTCACGGTGGTAGTTGAACTGA
Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 72
the observation that generally similar results have been obtained in three different
laboratories using different experimental approaches and PB inducible CYPZB genes of
two different rodent species.
The results presented here, showing that at l e s t three and probably more sequence
elernents within the 163-bp Sau3A.I fragment are required to confer maximal PB
responsiveness, reveal the surprising complexity of this multicomponent enhancer.
According to the now classical model for steroid hormone action, the Iiganded receptor
binds to one or more response elements upstream of the target gene and acts as a
transcriptional enhancer (26). However, synergistic interaction of a variety of transcription
factors with steroid hormone response elements have been known for some time (33), and
in a number of genes several cis-acting elements function in concert to activate
transcription (34). The best studied such case is that of the rat PEPCK gene. Full
glucocorticoid induction of PEPCK transcription is rnediated by a complex GRU
consisting of two glucocorticoid response elements, as well as three accessory factor
binding sites (14.17). We originally referred to the CYP2B2 Sau3A.I fragment as a PB-
responsive element (9), but, in the light of its complexity, we now refer to it as a P B R U ~
(35). The homologous mouse CypZblO sequence has been terrned a module (12,36).
Proteins that can serve as accessory factors in the PEPCK glucocorticoid response include
hepatocyte nuclear factor-3 (16) and the orphan receptors chicken ovalbumin upstream
promoter transcription factor (COUP-TF) ( 1 5,17) and hepatoc yte nuclear factor-4 (HNF-
4) (15). The application of the PEPCK GRU model to PB regulation of CYP2B2 does not
imply that any particular recognition site is shared between the two response units, but
merely that PB induction of CYP2B2 requires interactions among multiple regulatory
proteins and cis-acting elements constituting a PBRU.
The essential element of the PBRU model then is that more than one sequence
element within the 163-bp SadAI fragment is required to confer PB responsiveness.
E. Trottier, S. Dubois, M.-H. Vachon, C. Stoltz, A. Belzil and A. Anderson, Xïth International Symposium on Microsornes and Drug Oxidations, Los Angeles, July 21 to 24,1996 (Absuact P-149).
Chapitre Nr Caractérisation du PBR U 73
From our results we conclude that a central core of the fragment, between coordinates - 2257 and -2207, is inactive alone, but c m confer PB responsiveness when combined
either with upstream or downstrearn accessory elements within the fragment. In support of
this hypothesis, one such accessory site, designated A H , has been locaiized between
coordinates -2188 and -2172. AFl presumably represents an accessory factor binding site.
The protein(s) responsible for the FO/FO' footprint may also be responsible for AFl
activity, since these footprints overlap with the AFI sequence.
The level of PB responsiveness of construct -2257/-2172 (Fig. IB) is essentially
the same as that of constmct -2257/-2155 (Fig. 1 A), and both are about two-fold lower
than the wild type -23 17/-2 155 constmct. This indicates that sequences between -2 172
and -2 155 are not essential for maximal PB responsiveness and, moreover, suggests that a
second accessory element may be present between -2317 and -2257. Since full PB
responsiveness is retained in 5' deletion constructs up to -2264, the putative second
accessory element mriy lie between -2264 and -2257. However, it is also possible that the
reduced responsiveness of the -2257/-2 155 constmct (and of the -22571-2 172 constmct) is
a consequence of partial inactivation of essential sequences at the 5' end of the central
core. Experiments are currently underway to resolve these issues. In any case. that the
absence of one (or the other) of the putative PBRU accessory sites but does not abolish
PB responsiveness is in accord with the effets of eliminating one of the PEPCK GRU
accessory sites on glucocorticoid responsiveness.
Our results indicate that the HX-NF1 complex is required for m ~ i m a l PB
responsiveness (Fig. 6). NF1 proteins are abundant, ubiquitous transcription factors (37),
different isoforms of which are products of a rnultigene family (38). The Ml consensus
binding sites are composed of two motifs, TGG and GCCAA, separated by a 6-bp or 7-bp
spacer, and the protein protects a 25-bp to 30-bp region surrounding this sequence from
DNase 1 digestion (25). An NF1 protein is clearly responsible for part of the FlIF1'
footprint and the role of NF1 is positive, because mutations which reduce (e.g., NFlml)
or abolish (e.g., NFldm2) NF1 binding reduce but do not abolish PB responsiveness (Fig.
6). This result is similar to that of Honkakoski and Negishi (12) with a different NF1
Chapitre N: Caractérisation du PBR U 74
mutation that reduced but did not eliminate PB responsiveness conferred by a sub-
fragment of the mouse Cyp2610 homolog of the CYP2B2 163-bp Sau3AI fragment. In our
hands, mutations of the nuclear receptor half-site element, as in HXm, or of both that
element and NF1, as in Mm-NFldm2, also reduce PB responsiveness, that is they have
similar effects to those of mutational inactivation of NF1 alooe (Fig. 6). In the mouse
CypZblO system, Honkakoski and Negishi (12) reported a more dramatic effect of such
mutations in reducing PB responsiveness. Hence, the HX-NF1 complex is clearly
essential for conferring maximal PB responsiveness.
The protein binding to the hexamer half-site creating the HX portion of the FI/Fl'
footprint is unknown, but there are several possibilities. inspection of the sequence
surrounding the HX-NF1 complex reveals a recognition site for the orphan nuclear
receptor, fetoprotein transcription factor (FTF) (22,39), and MatInspector finds a match to
recognition sites for three other orphan receptors. including COUP-TF and HNF-4.
Preliminary experiments have revealed binding of both HNF-4 (40) and FTl? to the
double-stranded HX oligo. Which of these or other proteins interacts functionally with the
HX-NF1 complex to elicit maximal PB responsiveness remains to be deterrnined.
The nature of the proteins responsible for the FO/FOT and F2/F?' footprints is
currently unknown. They are of particular interest because F2/F2' overlaps the central core
identified as essential for PB responsiveness whereas FO/FO' overlaps the accessory AFI
site.
The protein responsible for the F3-F4/F3' footprints is presumably a mernber of
the nuclear receptor superfarnily, because of the overlap with ER-7 site and because the
F3-F4 footprint is competed by the HX oligo containing the AGGTCA hexamer half site.
The ER-7 region is not required for PB responsiveness, so it is clearly not an essentiai
site, although it may be an accessory site. Similar conclusions were reached by
Honkakoski and Negishi (12) with regard to the corresponding Cyp2blO pB sequence.
C.Stoltz, L. Galameau, L. Bélanger and A. Anderson, unpublished results.
Chapitre IV: Caractérisation du PB R U 75
Our observation that mutation of a putative GRE leads to a major reduction in PB
responsiveness is particularly intriguing, as it raises the possibility that a glucocorticoid
receptor-like molecule may be involved in confemng PB responsiveness. The putative
PBRU GRE matches the GRE consensus at only 7 of 12 positions. Hence, like the GREs
forming part of the PEPCK GRU (14), it is not a typical GRE.
Much previous effort has been concentrated on promoter-proximal sequences,
particularly the Barbie box (29,30) and their possible role in confemng PB responsiveness
on the rat CYP2Bf and CYP2B2 genes. However. mutation of the Barbie box sequence in
the context of the CYP2B2 promoter and 5' flank does not affect PB responsiveness either
in rat hepatocytes transfected by injection in sitli (1 1) or in transfected prirnary nt
hepatocytes (Fig. 6). Hence. while promoter-proximal sequences are doubtless required
for basal transcriptional activity (9,36), there is at present no convincing evidence for their
invol vement in con ferring PB responsiveness.
The nucleotide sequences of the coding regions of CYP2BI and CYPZB2 are about
97% identical (41,42) and this extends over at least 1 kb of their 3'-flanking regions (43)
and over some 2.3 kb of their 5'-flanking regions (13.44). This, plus the fact that the
responses of liver CYP2BI and CYP2BZ to PB treatment are very similar (although the
basal level of CYP2B2 is somewhût higher than that of CYP2B 1 (45.46)). explains why
CYP2B I and CYPZB2 are sometimes treated as though they were a single gene (47'48).
Nevertheiess. there are striking di fferences in the tissue-speci fic expression of CYPZBI
and CYP2B2, most notably in lung where CYP2B2 is not expressed whereas CYP2Bl is
expressed constitutively but is not PB-inducible (46). Because the 163-bp Sau3Ai
fragment is similarly positioned and, except for a single nucleotide difference, identical in
sequence in CYP2BI and CYP2B2 (13,44) (see aiso Fig. 2), we will have to look
elsewhere to explain the differences between CYPZBl and CYP2B2 expression in the
lung. It seems likely that the CYP2B2 PBRU and CYPZBl PBRU are both inactive in the
lung. and that CYPZBI expression is tumed on because of the constitutive presence of
some other transcription factor, the activity of which depends on one of the subtie
sequence differences between the CYPZBl and CYP2B2 5'-flanking regions.
Chapitre IV: Caractérisation du PB R U 76
The molecular details as to how the presence of PB leads to activation of
transcription via the PBRU remain to be determined. However, a recent report of results
obtained by in vivo footprinting suggests that PB may modify the interaction of
transcription factors with the PBRU in chromatin (48). Aithough this provides further
support for the role of the PBRU in transcriptional activation, further characterization of
the proteins that bind to it will be necessary to elucidate the mechanism.
Ac>btowledgments-We thank Normand Marceau and members of his laboratory for
advice and access to facilities for isolating rat hepatocytes, Cul Séguin for carefully
reading the manuscript, Simon Labbé for advice on DNase 1 footprinting, Anne Belzil for
technical assistance, Pierre Paquin and Guy Langlois for photographie work, and Jacques
Côté, Josée Aubin and rnembers of the Luc Bélanger laboratory for advice.
Chapitre IV: Caractérisation du PBR U 77
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Chapitre N: Caractérisation du PBR U 80
FIGURE LEGENDS
Figure 1: Functional analysis of the CYP2B2 163-bp Sau3AI fragment. Primary
hepatocytes were transfected in parallel with a plasmid containing the 163-bp Sau3AI
fragment (-23 171-2155) as a positive control and with plasmids containing sub-fragments
thereof, then incubated with or without 1 m M PB. Al1 transfections were performed in
duplicate. On the lefi, the line diagrams and sequence boundaries show the extents of the
various deletion fragments. On the right, CAT assay results are expressed as normalized
per cent increase after PB treatment, with the per cent increase obtained in a given
transfection using the wild type 163-bp Sau3AI fragment set at 100. Fold induction for the
wild type fragment varied from 3.8 to 10.7. White niimbers represent the number of
different rats used for hepatocyte preparations and the error bars are the standard error of
the mean. For constmcts where n = 2. the error bars are the range. For constnicts marked
"Not Detectable", one or more assays gave negative values of fold induction and for those
with positive values the average for al1 values in no case exceeded 4%. A. definition of the
central core between -2257 and -2207, delimited by the region between the two verrical
lines. ' ~ h e standard error of the mean for construct -23 17/-2 172 was 42. B. definition of
the AFI site.
Figure 2: DNA sequence of the CYP2B2 163-bp Sait3AI fragment. The DNA sequence is
from Hoffmann et al. (13), except that Our cloned sequence has three not four T residues
immediately 5' of nucleotide -2225 (vertical arrowhead). The sequence of the CYP2B2
fragment is identical to that of the corresponding CYP2BI fragment (44) except for a
single base difference at CYP2B2 nucleotide -2299 (mterisk), which is C in CYPZB2 and
G in CYPZBl. Protected regions on the upper and lower strands are shown by upper and
lower brackets respectively. The SadAI restriction sites and the intemal NcoI site are
boxed. Nuclear receptor hexarner half-sites in the ER-7 arrangement and forming part of
the HX-Ml complex are identified by horizontal arrows, the NF1 site is overlined, and
the sequence of the M l site is shaded. Candidate glucoconicoid receptor binding
Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 8 1
sequences on the upper and lower strands are denoted by a dotred overline and a dotted
underline respectively. The central core sequence between -2257 and -2207 is delimited
by the region between the two vertical fines. Footprint coordinates on the lower strand
are: FO, -2 17 1 to -2 180; Fi, -2202 to -2234; F2, -2239 to -225 1 ; F3, -226 1 to -227 1 ; F4, - 2272 to -2285. Footprint coordinates on the upper strand are: FO', -2 171 to -2184; FI ', -
2 19 1 to -2229; F2', -2242 to -2257; F3', -2262 to -2283.
Figure 3: Binding of liver nuclear proteins to the CYPZB2 PBRU. DNase 1 footprinting
assays were perfonned as described under "Experimental Procedures". Protected regions
FO through F4 on the lower strand and Fl' through F3' on the upper strand are represented
by boxes. BSA denotes DNase 1 treatment in the absence of nuclear proteins. A, the
fragment was 3'-end-labeled on the lower strand and incubated with a heparin-Sepharose
fraction eluted at 0.7 M KCI (50 pg of protein) or with 100 pg of unfractionated nuclear
protein (denoted cnide extract) from untreated rats. +NFI and +HX denote the presence
of a 500-fold molar excess of the CTF/NFl consensus oligo or of the double-stranded HX
oligo cornpetitors respectively. and +PB denotes preincubation of fractionated proteins
with 4 rnM PB (left lane, 1.5 h on ice without the probe and right lane, 2h on ice with the
probe). Protected regions corresponding to proteins binding to the NF1 and ER-7 sites and
to the hexamer half-site, as detenined from Maxarn-Gilbert sequencing ladders (not
shown). are indicated by brackets labeled NFI, ER-7 and HX respectively. B, the
fragment was 5'-end-labeled on the lower strand and was treated with unfractionated
nuclear extract ( 100 pg of protein). G+A denotes the Maxam-Gilbert sequencing ladder,
and control and PB denote DNase 1 treatment with nuclear extracts from untreated and
PB-treated rats respectively. C, the fragment was 5'-end-labeled on the upper strand and
was treated with unfractionated nuclear extract ( 100 pg of protein), denoted control.
Figure 4: Analysis of the FI' footprint with various amounts of protein. DNase 1
footprinting assays were performed using unfractionated rat liver nuclear extract. The
fragment was 5'-end-labeled on the upper strand. Only the region of the F1' footprint is
shown. BSA denotes DNase I treatrnent in the absence of nuclear proteins, and control and
PB denote DNase 1 treatment with nuclear extracts frorn untreated and PB-treated rats
Chapitre IV: Caractérisation du PBR U 82
respectively. Brackets labeled NF1 and HX denote protected regions caused by proteins
binding to the NF1 site and to a sequence including the nuclear receptor hexarner haIf-site
respectively. A, the wild-type fragment was used. Incubations were performed in the
presence of 20 m M sodium fbglycerophosphate and the amounts of nuclear extract
protein per assay were 2.5 ,5 , 7.5, 10, 25, 50.75 and 100 pg. B, the fragment carrying the
NFldm2 mutation was used. Incubations were performed in the presence of 10 rnM
sodium P-glycerophosphate and the amounts of nuclear extract protein per assay were 2.5,
5-7.5, 10, 25,50, and 75 pg.
Figure 5: Effect of mutations in the NF1 site on the F1 and Fl' footprints. A, the wild-
type fragment or the fragment canying the NFlml mutation was ireated with
unfractionated nuclear extract (100 pg of protein) from livers of untreated rats. Fragments
were 3'-end-labeled on the lower strand. NF1 denotes the presence of a 500-fold molar
excess of the NF1 consensus oligo competitor. The position of the F1 footprint is shown
by a box, and HS at coordinate -2207 denotes a hypersensitive site. B. the wild-type
fragment or the fragment carrying the NFldm2 mutation was used. Fragments were 5'-
end-labeled on the upper strand. BSA denotes DNase I treatment in the absence of nuclear
proteins, and control and PB denote DNase 1 treatment with nuclear extracts (100 pg of
protein) from untreated and PB-treated rats respectively. NF1 denotes the presence of a
500-fold molar excess of the NF1 consensus oligo competitor. The position of the FI'
footprint is shown by a box and that of the footprint remaining after NF1 binding was
eliminated by cornpetition or mutation is denoted by a bracket labeled HX.
Figure 6: Mutations of CYP2B2 PBRU sequence elements reduce PB responsiveness, but
mutation of the Barbie box does not. Transfection experiments as well as analysis and
presentation of CAT assay results were as described in the legend to Fig. 1. DNA
sequences within the shaded panel at lefi represent the wild type F1' protected region,
denoted WT, and various mutants of the HX-NF1 complex as shown. The mutated
venions of the putative GRE and of the Barbie box are also shown at lefr as well as their
sequence coordinates. For al1 mutant sequences, the upper strand is shown and
Chapitre N: Caractérisation du PBR U 83
substitutions in the wild type sequence are underlined. The FI' protected sequence is
shown in double-stranded form at the bottom. Brackets labeled HX and NF1 delimit the
footprints attributed to proteins binding to the hexamer half-site and to the NF1 site
respec tively.
LE SITE CONSENSUS POUR LA PROTÉINE NF1 ET L'HEXAMERE AGGTCA QUI LE CHEVAUCHE
AGISSENT TOUS DEUX EN ÉLEMENTS ACTIVATEURS DE L'INDUCTION PAR LE PHÉNOBARBITAL DE
CYP2B2
Ce chapitre a fait l'objet d'un article intitulé: «Régulation positive de l'unité de réponse au phénobarbital de CYP2B2 du rat par le complexe formé d'un site pour la protéine NF1 (aNuclear Factor ln) et d'un hexamère reconnu par les récepteurs nucléaires». Il a été rédigé par le Dr Alan Anderson et moi-même et a été publié en 1999, dans la revue Biochern Pharmacol 57, 1073-1076.
Chapitre V: NF1 et HX sont des sites activateurs et accessoires 85
L'activation transcriptionnelle du gène CYP2B2 du rat par le phénobarbital (PB)
est assurée par l'interaction de plusieurs composants nucléotidiques au sein d'une unité cie
réponse au PB (ou PB RU). Un site consensus pour la protéine NF 1 («Nuclear factor 1 ») et
l'hexamère AGGTCA qui le chevauche constituent l'un de ces composants. Il est présent à
la fois dans le PBRU de CYP2B2 du rat et dans la séquence correspondante du gène
CypZblO de la souris. Les analyses de mutagenèses dirigées puis de transfection dans des
hépatocytes en culture primaire indiquent que le site AGGTCA agit en élément positif
chez le rat alors qu'il serait un élément négatif chez la souris. Afin d'exclure la possibilité
que ces divergences fonctionnelles soient reliées aux différences de mutations introduites
dans l'hexamère de ces deux espèces, le site AGGTCA du PBRU du rat est modifié de la
même façon que la séquence de CypZblO de la souris. Cette mutation réduit mais n'abolit
pas le pouvoir inducteur du PBRU. De plus, aucune augmentation du niveau basal
d'activité n'est constatée. Quant à la mutation de l'élément NF1 e n ses deux demi-sites
consensus, elle réduit mais n'abolit pas non plus la réponse au PB. Ainsi le site consensus
pour NF1 et l'hexamère AGGTCA agissent en éléments accessoires, uniquement
nécessaires pour une induction maximale de CYP2B2 par le PB et les protéines qui s'y
fixent sont des activateurs de la transcription de ce gène chez le rat.
Chapitre V: NF1 et HX sont des sites activateurs et accessoires 86
POSITIVE REGULATION OF THE RAT CYP2B2 PHENOBARBITAL
RESPONSE UNIT BY THE NUCLEAR RECEFTOR HEXAMER HALF-
S1TE.NUCLEA.R FACTOR 1 COMPLEX
Catherine Stoltz and Alan ~nderson'
CENTRE DE RECHERCHE EN CANCEROLOGIE DE L'UNIVERSITÉ LAVAL, PAVILLON
LHÔTEL-DIEU DE QUÉBEC, CENTRE HOSPïïALIER UNIVERSITAIRE DE QUÉBEC, QUÉBEC
G 1 R 216 CANADA AND DEPARTEMENT DE BIOLOGIE, UNIVERS~TÉ LAVAL, QUÉBEC G 1 K
7P4 CANADA
Running title: Positive regulation of CYP2B2 phenobarbital response unit
' Corresponding author: Dr. Alûn Anderson, Centre de recherche, L'Hôtel-Dieu de
Québec, 1 1 côte du Palais. Québec, Canada G 1 R 276. Tel.: 4 18-69 1-5548; Fax: 4 18-69 1 -
5439; e-mail: Alan.Anderson @ bio.uIaval.ca.
§Abbreviations: CYP, cytochrome P450; PB, phenobarbital; NFl, nuclear factor 1; oligo,
oligodeoxyribonucleotide; CAT, chloramphenicol acetyl tnnsferase; HNF-4, Hepatocyte
nuclear factor-4; and FTF, fetoprotein transcription factor.
STrottier E, Dubois S, Vachon M-H, Stoltz C, Belzil A and Anderson A, Functional
analysis of a muliicomponent enhancer conferring phenobarbital responsiveness on the rat
CYP2B2 gene. In: XIth International Symposium on Microsornes und Drug Oxidations,
p.200. Los Angeles Organizing Cornmittee, Los Angeles, CA, 1996.
Chapitre V: NF1 et HX sont des sites activateurs et accessoires 87
A distai 163-bp fragment mediates phenobarbital responsiveness of the rat
CYP2B2 gene. Multiple cis-acting elements in this fragment cooperate to form a
phenobarbital response unit (PBRU). A nuclear factor 1 binding site and an rissociated
nuclear receptor hexamer half-site are present in both the rat CYP2B2 PBRU and the
homologous mouse CypZblO sequence. Based on mutational analyses, the hexamer half-
site has been reported to act positively in CYP2B2 and negatively in Cyp2610. However,
the specific mutations introduced into the rat and mouse hexamer half-sites were
different, raising the possibility that the different roles attributed to the element may be a
consequence of the different mutations used. We introduced into the rat CYP2BZ hexamer
half-site the specific mutational change previously introduced into the CypZblO sequence,
where its effect was to increase the basal level of expression and to abolish phenobarbital
responsiveness. In the rat context. this mutation reduced but did not abolish phenobarbital
responsiveness and decreased, rather than increased, the basal level of expression. The
residual phenobarbital responsiveness of the hexamer half-site mutant, as well as that of
nuclear factor 1 mutants, indicates that these elements behave as positive accessory sites,
suggesting that factors binding to them function as activators of phenobarbital-dependent
transcription.
KEY WORDS. CYP2B2, phenobarbital response unit; nuclear receptors; positive
regulation; nuclear factor 1 ; accessory site
Chapitre V: NF1 et HX sont des sites activateurs et accessoires 88
t Many CYPs are selectively inducible by xenobiotic compounds. For example.
CYPIAI is induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and stmcturally sirnilar aryl
hydrocarbons [l], and the rnechanism by which this occurs has been characterized in
detail [2]. Progress has also been made toward understanding the molecular mechanism
underlying inducibility of the homologous rat CYPZBZ and mouse Cyp2bIO genes in
response to PB [3-81.
We identified a 163-bp Sau3A 1 fragment in the CYP2B2 5'-flanking region that
confers PB inducibility on a car reporter gene [3]. The Sau3AI fragment, at coordinates
-23 171-2 155 has the properties of a transcriptional enhancer [3]. Further analysis of the nt
163-bp Sau3A 1 fragment led us to conclude that it contains a PBRU [6,9,$] whereas the
homologous mouse Cyp2b IO sequence has been tenned a module [5, IO]. Our dissection
of the CYP2B2 163-bp Sau3AI fragment revealed. notably, that an NF1 binding site and
an associated nuclear receptor hexamer (HX) half-site, AGGTCA, are essential for
maximal PB responsiveness, such that the mutation of either or both of the HX or NF1
sites decreases PB inducibility [6 ] . However, these mutations do not totally abolish the PB
response, implying that, in the rat CYPZB2 PBRU, the two components of the HX-NF1
complex play the role of accessory elements. in contrast, Honkakoski and Negishi [5]
reported that in the homologous mouse CypZblO sequence, mutation of the equivalent HX
site (therein referred to as the Nr site, but hereinafter referred to as the HX site) abolished
PB responsiveness. Furthemore, a 221% increase in the basal level of expression was
observed, suggesting that in the mouse system a nuclear receptor-like factor that binds to
the HX site acts as a repressor of PB responsiveness [5] . Results from other laboraiories
with both the rat CYP2B2 PBRU [8] and the mouse Cyp2610 sequence [5] suggest that
NF1 is an activator.
Hence. results obtained to date suggest that a protein(s) binding to the HX portion
of the HXWI complex act as an PB-dependent activator in the rat CYP2B2 gene and as a
repressor in the homologous Cyp2b10 gene. However, the specific mutations introduced
into the rat and mouse HX sites were different [7,8], which raises the possibility that the
different roles attributed to the element may simply be a consequence of the different
Chapitre V: NF1 et HX sont des sites activuteurs et accessoires 89
mutations used. a possibility that must be taken seriously. given that the LS6 mutation of
Liu et al. [8] changed two bases of the HX site. yet was without apparent effect on PB
responsiveness. We report here results of expenments designed to test this possibility by
introducing the same HX mutation into the CYP2B2 PBRU as had previously been
introduced into the homologous mouse Cyp2610 sequence followed by transfection
analysis of its effects on PB responsiveness.
5.2.2 MATERIALS AND METHODS
Rat hepatocytes were isolated. cultured, transfected and treated with PB as previously
described [6] , except that Matrigel was omitted. CAT activity was assayed by the method
of Gorman et al. [ I l ] . The following oligos were synthesized by Life Technologies:
NF 1 dm3, 5'-ACTTTCCTGACCITTTC ACAGTGCTTCCAT-3'; and HXm2. 5'-
ACTCTGTACTTTCCTCTGGTTGGCACAGTGCCACCA-3'. Substitutions in the wild-
type sequence are indicated by bold characters. To generate the construct HXm2, the pSa-
Sa163 plsrnid [fi] was mutated using the oligo HXm2 and the Altered Sites JI in Vitro
Mutagenesis System (Promega). To generate the double mutant NFldrn3, we used a
mutant pSa-Sa163 plasmid which already carried a mutation in the distal motif of the NF1
consensus sequence (NFlml ) [8] and the oligo NFldm3. The fragments carrying the
mutations were then subcloned into the non-PB responsive Ev construct, which contains
168 1 bp of the CYPZBZ 5' flanking region cloned upstrearn of the CAT reporter of pBScat
[3]. The normal orientation and integrity of the subcloned fragments in the reporter
constructs were confined by DNA sequence analysis.
5.2.3 RESULTS AND DISCUSSION
As previously mentioned, based on mutational analyses, the HX half-site seems to
act positively in rat CYP2B2 and negatively in mouse Cyp2blO. To determine whether
this apparent difference might be due to the different mutations introduced into the rat and
mouse sequences, we generated an HXm2 mutant which carries the exact 4-bp subtitution
Chapitre V: NF1 et HX sont des sites activateurs et accessoires 90
(AGGTCA + ACCAGA) introduced into the mouse half-site [5]. As we found
previously with the HXm and HXm-NFldm2 mutations [6], the HXm2 mutation reduced
but did not abolish PB responsiveness (Fig. 1). Furthemore, there was no increase, but
rather a decrease, in the basal level of CAT activity (Fig. 2), suggesting that the factor(s)
binding to the HX site act as an activator(s) in the rat PBRU.
The perfectly symrnetncal binding site for NF1 (-2217 TGGCACAGTGCCA or
TGG NICCA) in the 163-bp PBRU is predicted to be a high affinity NF1 recognition site
[12]. In out previous work [6], we constructed a mutant, NFlml, with tandem base
substitut ions in the distal NF 1 half-si te (TGGCACAGTGCCA + TGGCACAGTGCTT),
and from this derived a double mutant, NFldm2, with an additionai substitution adjacent
to the proximal half-site (TGGCACAGTGCTT + TGGTACAGTGCTT). Transfection
analyses of the NFlml and NFldm2 mutants revealed that PB responsiveness was
reduced but not abolished [6] . To test the possibility that the residual PB responsiveness
conferred by the NFldmZ mutant sequence is due to the intact 5' TGG half-site, we
generated NF 1 dm3 (TGGCACAGTGCTT + TTTCACAGTGCTT). Hence, in NF 1 dm3.
both the 5' NF1 half-site, which is known to be of major importance for the binding
affinity of NF1 [13], and the 3'half-site, were modified. Transfection analysis of NFldm3
reveded that, as for the NFlml and NFldm2 mutants tested previously [6], PB
responsiveness was reduced but not abolished (Fig. 1). Taken together, these results
indicate that NF1 is an accessory factor in the PB induction of the rat CYP2BZ gene.
The results presented here, in accord with those presented previously, indicate that
NF1 acts positively to assure PB-dependent transcription of the rat CYP2B2 [6,8] and
mouse CypZblO [SI genes. The situation with respect to the role of the HX nuclear
receptor half-site is less clear. According to the model of Honkakoski and Negishi [7], a
protein binding to or in the region of the HX site acts as a transcriptional repressor. This
model was based on the observation that in the Cyp2610 system, the precise equivalent of
the HXm2 mutation led to an increase in basal level accompanied by an abolition of PB
responsiveness. According to the results presented here, however, the HXm2 mutation
Chapitre V: NF1 et liX sont des sites activareurs et accessoires 91
-2229 -2191
CITCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGACT
O 20 40 60 80 100
% Wild Type PB Response
Figure 1: Effects of mutation of either NF1 or HX on PB rrsponsiveness.
Chapitre V: NF 1 et HX sont des sites activateurs et accessoires 92
Figure 2: Effect of the Mm2 mutation on basal levels of CAT activity
Chapitre V: NFI et HX sont des sites activateurs et accessoires 93
reduces the basal level and diminishes but does not abolish PB responsiveness. Hence, in
the rat CYP2B2 gene, protein(s) binding in the region of the HX site appears to act as a
transcriptional activator(s) rather than a repressor(s). The reasons for the apparent
discrepancy in the role of the HX sequence between the otherwise very similar CYP2B2
and Cyp2blO genes are not entirely clear, but they may be related to differences in the
conditions of hepatocyte culture, to subtle species differences in sequence outside the
HX-NF1 complex, or to use of the homologous promoter for the analyses of CYP2B2 and
of a heterologous tk promoter for the analyses of Cyp2blO. It is notewonhy however, that
the replacement of six nucleotides. including one in the HX site, in Cyp2blO by
comesponding nucleotides of Cyp2b9 (which is not PB inducible) resulted in loss of PB
responsiveness, but no increase in basal level [5 ] . This suggests that even in the mouse
Cyp2610 gene, the role of HX as the site of action of a repressor is not unarnbiguous.
Multiple sequence elements cooperate to form the CYP2B2 PBRU, and one such
element, AFl, has been identified and localized [6]. According to the results presented
here, both elements of the HX+JF1 complex act as accessory sites necessary for maximai
PB responsiveness of the rat CYP2B2 gene and therefore factors binding to them [6]
shouid function as activators of PB-dependent transcription.
The nature of the proteins that interact functionally with the HX site to elicit
maximal PB responsiveness remains to be detemined, although both the orphan nuclear
receptor, FïF [14,15], and HNF-4 bind to a double-stranded oligo containing the HX
sequence [6] . When primary cultures of rat hepatocytes were cotmsfected with the wild
type CAT reporter plasmid and expression vecton for FTF and HNF-4, no increase in PB
responsiveness was observed with the FTF expression vector, and a modest 2-fold
increase was observed with the HNF-4 expression vector (data not shown). Further
experirnents will be required to clarify the role of FTF, HNF-4, NFl, and other proteins
binding to the HX-NF1 complex in the activation of PB-dependent transcription of
CYP2B2.
Chapitre V: NF1 et H X sont des sites activateurs et accessoires 94
This work was supported by the Medical Research Council. We thank Eric Trottier for
careful reading of the manuscript. Pierre Paquin and Guy Langlois for photographie
work. Frances Sludek for the H M cDNA, and Luc Beianger for the FTF expression
vector.
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Chapitre V: NF1 et HX sont des sites activateurs et accessoires 96
~ G U R E LEGENDS
Figure 1: Effects of mutation of either NF1 or HX on PB responsiveness. Pnmary
hepatocytes were transfected in parallel with the standard CAT reporter plasmid
containing the 163-bp Sau3AI fragment (-23 171-2155) as a positive control or with
plasrnids containing NFldm3 or HXm2 mutants as shown, and then incubated with or
without 1 mM PB. Al1 transfections were perforrned in duplicate. On the nght, CAT assay
results are expressed as normalized percent increase after PB treatment, with the percent
increase obtained in a given transfection using the wild type 163-bp Sau3AI fragment set
at 100. White numbers represent the number of different nts used for hepatocyte
preparations and the error bars are the standard enor of the mean. DNA sequences at left
represent the wild type Fl ' protected region [6], denoted WT, and the NFldm3 and HXm2
mutants as shown. For al1 sequences, the upper strand is shown and substitutions in the
mutant sequences are underlined.
Figure 2: Effect of the HXm2 mutation on basal levels of CAT activity. Results of a
representative series of CAT assays with a single preparation of hepatocytes for the
HXm2 mutant are shown. In these assays, the average CAT activity levels (counts per
minute per microgram per hour) without and with PB were 52.4 and 346.4. respectiveiy,
for the wild type and 37.2 and 76.3, respectively, for the HXm2 mutant.
Les cinq principaux résultats de ce travail sont: i) la démonstration que le fragment
de 163 pb. responsable de la réponse au PB de CYP2B2, est un activateur transcriptionnel,
fonctionnant indépendamment de son orientation et de la distance qui le sépare d'un
promoteur hétérologue (Article 1, Chapitre III); ii) la mise en évidence, par transfection de
mutants dans des hépatocytes en culture primaire. de l'absence d'un rôle quelconque pour
la boîte Barbie dans la réponse au PB du gène CYP2B2 (Article II, Chapitre IV); iii) la
mise en évidence, par des expériences d'empreintes à la DNase 1, que le fragment de 163
pb est reconnu par des protéines sur une bonne partie de sa longueur (Article II, Chapitre
N); iv) I'implication de deux sites activateun et accessoires, NF1 et HX. afin que
l'amplificateur transcnptionnel fonctionne pleinement (Article II, Chapitre IV et Article
DI, Chapitre V); v) l'apport des premières données de mutagenèse suggérant Ir
participation d'un autre site activateur en 5' de HX et NF1 (Article II, Chapitre IV).
Dans ce qui suit. nous commenterons de façon plus détaillée chacun de ces points.
il est à noter qu'ils sont placés dans le contexte plus général des progrès réalisés ces
dernières années par diverses équipes, dans la compréhension du mode d'action du PB.
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 98
i) Le fiagrnent de 163 pb est un activateur transcriptionnel.
dépendant du PB
L'objectif de la première partie du présent travail était de démontrer que le
fragment de 163 pb, situé entre 2155 et 2317 pb du tsp du gène CYPZB2, répondait à la
définition d'un amplificateur transcriptionnel. Éric Trottier avait démontré qu'il activait la
transcription du gène rapporteur cat en présence des 168 1 premières pb (inactives) de la
région régulatrice en 5' de CYP2B2 (construction Ev-car). Le fragment de 163 pb devait
cependant se soumettre à d'autres critères. ii fallait s'assurer qu'il constitue une entité
fonctionnelle, capable d'agir en absence des 1681 pb. Plus généralement, il devait
conserver son pouvoir inducteur lorsqu'il était abouté à un promoteur hétérologue, le
promoteur de la thymidine kinase (tk) du virus de l'Herpès simplex (HSV). et ceci, quelles
que soient son orientation et la distance qui le séparait de ce promoteur. Ainsi, dans
l'Article 1. nous avons démontré que dans les hépatocytes en culture primaire, seules les
constructions plasmiques contenant le fragment de 163 pb, placé en 5' ou en 3' de tk-car et
en orientation directe ou inverse (constmctions A, B. C, D), répondaient à un traitement
au PB. L'induction de I'activité CAT variait d'un facteur de 2.7 à 8'8, selon la position de
ce fragment d'ADN par rapport au promoteur tk. Ainsi, il semblait plus efficace lorsqu'il
était placé à distance du promoteur hétérologue, plus précisément à 2929 pb de tk-cat
(constructions C et D) [15]. Au terme de l'ensemble de ces travaux, l'élément était baptisé
PBRE ou dément de réponse au PB».
L'équipe Kemper 1211 confirmait, par une méthode distincte de la transfection
dans des C U ~ N ~ ~ S primaires d'hépatocytes, que le PBRE pouvait activer un promoteur
hétérologue. Ces chercheurs greffaient l'amplificateur transcriptionnel de CYP2B2 à
diverses longueurs de séquences régulatrices en 5' de CYPZCI, un gène inductible par le
PB. Ils injectaient directement dans un lobe de foie de rat («injection in situ») ces
constructions plasmiques, contenant egalement le @ne rapporteur luc (luciférase). Après
l'intervention, ils traitaient ou non le rat au PB et le sacrifiaient 24 h après. Alors que 272
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 99
pb et 3500 pb de régions 5'-flanquantes de CYP2CI ttaient sans effet sur l'activité LUC,
l'ajout du PBRE en amont de ces différents segments nucléotidiques induisait l'activité
LUC de façon significative. Cette dernière était. là encore, indépendante de l'orientation
du PBRE et qui plus est, proportionnelle au nombre de copies ajoutées [2 11.
Par la suite. Honkakoski et Negishi 1221 constataient que le gène Cyp2610. un
gène inductible par le PB et le TCPOBOP dans le foie de souris, possédait une séquence
de L7? pb, identique à 9 1 % au PBRE de CYPZBZ. Elle était localisée en région distale,
entre 2250 et 2426 pb en amont du tsp. Cette séquence détenait, vis-à-vis des promoteurs
hétérologues de SV40 (<<sirnian virus 40») et HSV, les mêmes propriétés d'activateur
transcriptionnel dépendant du PB, qui ont été attribuées au PBRE [22].
Ce premier travail permettait donc de démontrer que le fragment de 163 pb
conservait un pouvoir intrinsèque d'activation de la transcription en présence de PB.
quelle que soit la nature du promoteur auquel i l était jumelé. Il possédait donc les
propriétés d'un amplificateur transcriptionnel. Cette conclusion rejetait ainsi la possibilité
qu'il ait un effet amplificateur général sur des éléments de réponse au PB (notamment la
boite Barbie) localisés dans le promoteur de CYP2B2.
ii) La boite Barbie n'est pas requise pour une induction par le PB du
géne CYP2B2
La boîte Barbie est. rappelons-le, la séquence la plus populaire du promoteur de
CYPZBl et CYPZB2. Selon l'équipe F U ~ C O ~ elle remplirait un rôle d'activateur
transcriptionnel dépendant du PB [17]. Le résultat dTÉric Trottier, montrant que les 1681
premières pb de la région régulatrice de CYP2B2 étaient inactives, s'opposait à un rôle des
régions proximales dans la réponse au PB. En réalité, les résultats du laboratoire
appuyaient plutôt les conclusions de Ramsden et ses collaborateurs 1861 sur les animaux
transgéniques qui, comme nous l'avons souligné dans la Revue Bibliographique,
excluaient les 800 pb en amont du fip de CYP2B2 de la régulation de I'expression
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 100
dépendant du PB de ce gène. Ils impliquaient plutôt des séquences nucléotidiques entre
800 pb et 19 kb du tsp. Des études plus récentes de la même équipe (datant de 1999)
réduisent d'ailleurs la région critique à l'induction par le PB à 800 pb, situées entre 2500 et
1700 pb du tsp de CYP2B2 [ 1041.
A la lumière des résultats obtenus au laboratoire d'accueil, il était donc clair que la
boîte Barbie n'était pas un amplificateur transcriptionnel activé par le PB. Cependant,
cette séquence était présente dans toutes les constructions réalisées au laboratoire
d'accueil, lesquelles renfermaient les 1681 premières pb de CYP2B2. il n'était donc pas
illogique de penser que sa présence puisse éventuellement amplifier la réponse au PB du
PBRE. Afin de tester cette hypothèse, la stnicture centrale («tore>,) de la boîte Barbie était
mutée dans le luboratoire d'accueil. Les transfections d'une construction, contenant le
PBRE et les 1681 premiéres pb de CYP2B2 avec la boîte Barbie mutée (construction
BBm) en amont du gène cat. étaient effectuées dans le cadre de la présente thèse (Article
II, Chapitre IV). La réponse au PB était conservée pour la construction BBm. La boîte
Barbie ne jouait donc aucun rôle dans l'activation transcriptionnelle de CYPZB2 par le PB.
Cette conclusion rejoignait celle de l'équipe Kemper, qui réalisait le même type
d'expériences en transformant la boîte Barbie de CYPZBI et ne constatait aucune
modification de la réponse au PB du gène Iuc [2 11.
La controverse, dont nous faisions mention dans la Revue Bibliographique,
entourant la fonction des régions proximales de CYP2BI et CYP2B2, en particulier celle
de la boîte Barbie, contrastait avec l'unanimité à convenir d'un rôle pour une région
distale. Pour la première fois en effet, trois équipes s'accordaient pour reconnaître un rôle
d'activateur transcriptionnel à un élément défini dans la région 5'-flanquante de CYP2B2
et présent aussi chez CYPZBl et CypZblO, et ceci quels que soient le mode de transfection
employé et l'espèce considérée (souris ou rat) [15,2 1,221. Notons qu'une partie de cet
élément a également été localisée chez CYP2B6 de l'humain, vers 1700 pb du tsp [105].
Aucun autre PBRE ou élément présentant une forte identité de séquence avec le PBRE
n'a été trouvé chez les autres gènes inductibles par le PB, qui appartiennent aux sous-
familles 2A, 2C ou 3A [22, recherche sur la base de donnkes BLAST].
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 101
De façon générale, les amplificateurs transcriptionnels n'ont pas de localisation
préférentielle. Ils peuvent être situés en 5' comme en 3' du gène et en position proximale
ou distale. Cette dernière position a été constatée pour un grand nombre de gènes,
exprimés dans le foie ou ailleurs [106]. De plus, les activateurs transcriptionneis peuvent
également être constitués en des unités, où plusieurs sites régulateurs sont reconnus par
des protéines dont l'action se combine pour assurer une expression génique spécifique au
tissu [106]. L'étape suivante du travail de la présente thèse allait contribuer à établir que
cette propriété s'appliquait aussi au PBRE. Le PBRE devenait ainsi, au fil des travaux, un
PBRU ou unité de réponse au PB. Dans la suite du Chapitre, nous emploierons
uniquement le terme PBRU. Quant au qualificatif PBREM. ou module de réponse au PB,
i l a été choisi par l'équipe Negishi pour désigner I'activateur transcriptionnel du gène
Cyp2blO de la souris. Comme nous le verrons plus loin, elle le réserve maintenant B une
séquence plus courte (d'une longueur de 5 1 pb) du fragment de 177 pb.
iii) La caractérisation du PBRU
Le PBRU s'étendait donc sur 163 pb. 11 était protégé sur près de 85 pb (de 2200 à
2285 pb) d'une digestion in vitro à la DNase 1. Quatre empreintes (FO à ~ 3 ) ' étaient
identifiées dans le cadre de cette thèse. Aucune d'entre elles ne présentait de différence,
que l'expérience soit réalisée avec des extraits protéiques nucléaires de foie de rats
témoins ou de rats traités au PB. Cette observation était d'ailleurs partagée par l'ensemble
des équipes ayant effectué des analyses in vitro d'interactions protéines-ADN
[22,104,107]. Elle suggérait que les facteurs de transcription se fixant à l'ADN et requis
pour l'induction de CYP2B2 par le PB étaient tous présents. à la même concentration,
dans le noyau de I'hépatocyte non traité.
Notons brièvement que seules, les expériences d'empreintes in vivo, réalisées par
Kim et K e m p [107], révélaient des changements importants dans une région du PBRU,
suite ii un traitement au PB de noyaux d'hépatocytes de rat. Le PB semblait donc affecter
'Les empreintes F3 et F4 sont consid6rks comme une seule empreinte, appelde F3.
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 102
la structure chromatinienne du PBRU. L'équipe Kemper proposait plusieurs modèles
[107,108], notamment celui où toutes les protéines impliquées dans l'induction des gènes
CYP2B étaient capables de s'attacher à l'ADN en absence de barbituriques. L'ajout de PB
entraînait un remodelage de la chromatine qui permettait ensuite le recrutement de
protéines supplémentaires, la substitution de corégulateun négatifs par des corégulateun
positifs ou enfin un changement conformationnel des protéines, qui devenaient dors
actives [107].
Cependant, à la lumière de nos résultats d'empreintes in vitro, il n'était pas
possible de désigner une région du PBRU qui soit plus particulièrement la cible du PB. Le
principal objectif du travail de caractérisation du PBRU était alors d'identifier. par
mutagenèse, la ou les séquences critique(s) pour l'induction par le PB de CYP2B2.
i ~ ) Les sites NF1 et HX sont requis pour une induction maximale de
CYP2B2 par le PB
Une des quatre empreintes identifiées était fortement protégée. quelle que soit la
concentration d'extraits utilisée. Elle couvrait une séquence de type TGGC(Ns)GCCA.
considérée, de part sa parfaite symétrie, comme un site de très haute affinité pour NFl,
une protéine abondante dans le foie [go]. Étant donné sa distribution ubiquiste dans les
tissus de mammifères, sa présence constitutive dans le tissu hépatique et dans les lignées
cellulaires [92], il était peu probable que la protéine NF1 explique à elle seule une
induction par le PB, qui est essentiellement restreinte au foie et absente dans les lignées
cellulaires. Cependant NFI a déjà été décrit comme un cofacteur, agissant de concert avec
d'autres protéines pour contrôler l'expression de certains gènes [IO!?, 1 101. Afin d'évaluer
le rôle de ce t'acteur dans l'induction de CYPZB2 par le PB, son site de reconnaissance
était muté. Plusieurs modifications devaient d'ailleurs être introduites afin d'en abolir
l'attachement de N'FI. Testée en transfection dans les hépatocytes en culture primaire,
l'ultime mutation (NFldm2) de cet élément entraînait une perte substantielle de la
réponse au PB. La protéine NF1 se comportait donc en activateur. Une activité CAT
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 1 03
résiduelle persistait cependant, suggérant que la protéine était importante pour que le
PBRU conserve l'intégralité de son pouvoir inducteur mais qu'elle n'était pas critique
pour la réponse au PB. Des séquences supplémentaires devaient intervenir.
Lorsque l'attachement de la protéine NF1 à son site était aboli, les expériences
d'empreintes à la DNase 1 mettaient en lumière la présence dune deuxième région
protégée. à cheval sur le site NF1. Elle couvrait un demi-site de type AGGTCA, appelé
HX (ou Nr et NRlb chez la souris). Certains récepteurs orphelins. comme par exemple
HNF4, susceptibles de reconnaître une séquence formée en partie par ce demi-site ont été
impliqués dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes exprimés
spécifiquement dans le foie [98]. Ainsi. les expériences de mutagenèse de HX puis de
transfection de la construction de 163 pb modifiée en HX devaient nous informer sur le
rôle de ce site au sein du PBRU. Elles établissaient que le site HX était requis, au même
titre que le site NFI, pour une induction maximale de l'activité CAT mais n'était pas
crucial il la réponse au PB. Cette conclusion était appuyée par le fait qu'une mutation
conjointe de HX et NF1 n'abolissait pas l'induction de l'activité CAT. De plus. la ou les
protéines, qui s'y Fixai(en) t, agissai(en)t en tant qu'activateur(s) (Article II, Chapitre IV).
Liu et ses collaborateurs [1 I l ] analysaient le fragment de 163 pb de CYPZB2 par
la méthode d'injection in situ, mentionnée précédemment [2 11. ils ne reconnaissaient
aucun rôle à HX. Ils modifiaient 2 pb de la séquence consensus et ne constataient aucune
altération de la réponse au PB (le site AGGTCA devient AGGgtA; mutant LS6). Quant au
site NFI, son rôle demeurait ambigu. Les conclusions de l'équipe Kemper changeaient en
effet selon que les transfections étaient effectuées avec une copie ou trois copies des
mutants Ml. Ainsi, le site passait respectivement d'un rôle d'élément indispensable à
l'induction par le PB, sa mutation abolissant la réponse au PB, 2i celui de site accessoire,
dont la mutation réduisait I'induction de l'activité CAT mais ne la supprimait pas. Vu les
résultats divergents que l'équipe Kemper obtenait selon les conditions appliquées, ces
travaux étaient difficilement interprétables. Si la méthode d'injection in situ permettait de
reconnaître un rôle au fragment complet, elle semblait manquer de sensibilité pour une
caractérisation plus poussée du PBRU.
Chapitre VI: Conchions et Perspectives 104
Honkakoski et Negishi [22] analysaient I'arnplificateur transcriptionnel de la
souris et établissaient que l'induction par le PB de Cyp2blO faisait appel aux sites N'FI et
HX. Cependant, plutôt que d'être accessoires comme dans le cas du PBRU, les sites NF1
et HX de la souris semblaient critiques à l'activité du PBREM. Selon ces chercheurs en
effet, la mutation de l'un ou l'autre des sites abolissait toute induction de l'activité CAT
due au PB. D'autre part, si NF1 était un activateur, HX semblait agir en répresseur, la
mutation de ce site entraînant une augmentation de 221% du niveau constitutif de
l'activité CAT.
Des divergences fonctionnelles importantes semblaient donc exister entre les
déments de réponse au PB de la souris et du rat et ce. malgré une identité de séquence
quasi-totale. Considérant la possibilité que ces différences puissent être reliées à la nature
des mutations introduites dans les sites NF1 et HX, de nouvelles mutagenèses étaient
effectuées dans le cadre de cette thèse. Les résultats qui en dtcoulaient nous confortaient
dans nos premières interprétations (Article III, Chapitre V). La substitution des
nucléotides AGGTCA du site HX du rat par AccagA. telle que l'avaient réalisée
Honkakoski et Negishi chez CypZblO de la souris [22], n'entraînait pas d'augmentation du
niveau basal d'activité CAT. D'autre part, ni cette modification, ni une mutation plus
drastique du site NFI, à la fois en TGG et en GCCA, n'abolissait In réponse au PB
(Article m, Chapitre V). NF1 et HX étaient donc bien des sites accessoires, nécessaires
pour une activité maximale du PBRU en présence de PB.
Les conclusions de Honkakoski et Negishi [22] se rapportant aux sites HX et NF1
différaient cependant de l'analyse que nous en faisions. Nous remarquions en effet que la
mutation introduite par l'équipe Negishi dans le site NF1 n'abolissait pas complètement
l'induction par le PB de l'activité CAT [figure 7 de la référence 221. Quant la mutation
du site HX' nous constations qu'elle n'affectait le niveau basal de l'activité CAT que de
façon sporadique, c'est-à-dire uniquement dans certaines expériences. Ainsi, ce niveau
basal d'activitd CAT restait inchangé dans une expérience o l les chercheun tentaient de *
consolider l'hypothèse selon laquelle la région importante du PBREM était celle de NF1
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 1 05
et HX [22]. Ils observaient, en premier lieu, que Cyp269, un gène de souris non inductible
par le PB, possédait vers 900 pb en amont du tsp une séquence identique à 70% au
PBREM. Testé en transfection en amont de tk-cat, ce segment d'ADN n'avait aucun
pouvoir inducteur en présence de PB. Constatant que les sites HX et NF1 de cette
séquence renfermaient des différences nucléotidiques importantes par rapport à ceux du
PBREM, ils suggéraient que l'absence de réponse au PB de Cyp2b9 incombait à ces
différences. Pour le démontrer, ils substituaient aux sites HX et NF1 du PBREM les
nucléotides de Cyp2b9 qui le distinguaient de Cyp2blO. Le PBREM ainsi modifié était
testé en transfection et. comme l'équipe Negishi le prévoyait. il perdait tout pouvoir
inducteur. Par contre. l'augmentation de 221% du niveau basal d'activité CAT
n'apparaissait plus.
Signalons pour conclure que dans un nouvel article paru en 1998, Honkakoski et
ses collaborateurs se rangeaient à nos conclusions [112]. Les nouvelles mutations qu'ils
réalisaient sur les sites HX et NF 1 n'abolissaient plus l'activité CAT. Le site NF 1 n'était
donc pas critique à la réponse au PB du PBREM. Quant à la fonction répressive de HX,
elle était omise et cédait dorénavant la place à un rôle activateur au sein du PBREM
[112].
Ainsi. les sites HX et NF1 remplissent les mêmes fonctions activatrice et
accessoire pour la réponse au PB des gènes CYP2B2 et Cyp2blO. Quant aux protéines qui
s'y fixent, elles agissent en cofacteurs. Comme nous l'avons souligné dans les pages
précédentes, de façon générale, il n'est pas rare que NF1 soit un cofacteur dans la
régulation de la transcription de gènes hépatiques et soit nécessaire pour qu'un gène
réponde pleinement ii divers stimuli [log, 1 IO]. Son action se combine B celle de deux
types de protéines: les protéines qui, comme elle. ont une distribution ubiquiste (par
exemple. AP-1) et celles dont la présence est limitée il un nombre restreint d'organes, en
I'occurence le foie (clEBP, HNF 1, KNF4. HNF3) [106].
Chuvitre VI: Conclusions et Persvectives 106
Expériences préliminaires visant à identifier le ou les facteur(s) se liant
au site HX
Un récepteur orphelin connu ou encore inconnu, présent essentiellement dans le
foie, pouvait être un bon candidat pour expliquer l'induction hépato-spécifique de
CYP282 en présence de PB. Cette hypothèse nous conduisait à réaliser des expériences
préliminaires de CO-transfection, dans les hépatocytes en culture primaire, d'une
construction contenant le PBRU et le gène rapporteur cat avec un vecteur d'expression
pour HNF4 et le récepteur orphelin ETF (<ifetoprotein transcription factor»). HNF4
reconnait des répétitions directes imparfaites de type DR 1 (ou «direct repeat 1 ». à titre de
rappel) [98] et FïF se lie au site AGGTCA, précédé d'une extension TCA [113]. Or,
l'empreinte HX couvre un DR1 imparfait. qui peut aussi être considéré comme un demi-
site unique, reconnu par exemple par R F . Les expériences de CO-transfection avec FTF
ne modifiaient pas la réponse au PB. Quant aux expériences avec HNF4. elles entraînaient
une légère augmentation de l'activité CAT (d'un facteur 2 au maximum) (Article IIi,
Chapitre V). Il est difficile' ii ce stade des expériences, de tirer une conclusion de ce
dernier résultat. il est aussi difficile de \'interpréter étant donné que le récepteur orphelin
HNF4 est abondant dans le foie et dans les hépatocytes en culture primaire.
Honkakoski et ses collaborateurs identifiaient, pour leur part. un hétérodimère
protéique qui, selon eux, serait le médiateur de l'action du PB. Ce complexe était capable
d'activer la transcription du gène car en se fixant à une séquence du PBREM, plus large
que le site HX [112]. La nature de la séquence en question sera décrite plus longuement
dans les pages suivantes. Notons brièvement qu'il s'agit d'une répétition directe
imparfaite de type DR4, baptisée NRl (TGTACTttccTGACCT)? L'hétérodimère
reconnaissant ce site était formé de RXR et d'un nouveau récepteur orphelin abondant
dans le foie, appelé CAR [112,100]. il est important de souligner ici que les expèriences
de CO-transfection, dans les lignées cellulaires HepG2 (cellules issues d'hépatômes
humains) ou HEK293 (cellules embryonnaires de rein humain), du PBREM en amont de
' Les 6 nuclCotides soulignCs correspondent au site HX (demi-site AGGTCA) identifité chez le rat.
Chapitre VI.- Conclusions et Perspectives 1 07
tk-cat avec les vecteurs d'expression de RXRa et hCAR (human CAR) conduisaient à
une induction de l'activité CAT (de l'ordre de 15 fois) uniquement en absence de PB
[ 1 121. Ces expériences n'ont pas été validées par des essais en présence de PB, sans doute
à cause de l'absence de réponse au PB des lignées cellulaires. Or, I'activité constitutive de
CAR n'a rien de surprenant puisqu'elle définit précisément ce récepteur orphelin,
découvert chez l'humain (human CAR ou MB67) par Baes et ses collaborateurs [100].
Ces chercheurs établissaient en effet que hCAR activait la transcription d'un gène
rapporteur en absence de ligand ajouté et ils le baptisaient, de ce fait, aonstitutively
active receptor».
Les analyses les plus récentes d'interactions protéines-ADN, effectuées par
Honkakoski et ses collaborateurs [112], montraient que l'hétérodimère RXR-CAR se
fixait à NRl en réponse à un traitement au PB. Or, comme nous l'avons déjà mentionné,
jusque là, aucune équipe de recherche. y compris celle de Negishi [22], n'avait constaté de
différences entre les expériences in vitro d'empreintes à la DNase 1 faites avec des extraits
de foie de rat contrôle et celles réalisées avec des extraits de foie de rat traité au PB
[Article II, 104.1. De plus, si les expériences de gels à retardement effectuées avec NRl
montraient clairement que cet élément était reconnu par un complexe protéique formé en
partie de RXRa (expérience de supershift avec un anti-corps anti-RXRa), l'anticorps
anti-CAR était, quant à lui, inactif dans ce type d'expériences et ne permettait donc pas
d'établir clairement la participation de CAR. Que RXR s'attache à une séquence de type
DR4 n'est pas unique et spécifique à CAR. RXR reconnaît également des DR4 lorsqu'il
est associé, par exemple, à TR («thyroid receptom) ou LXR (&ver-X-receptor»), qui est
un récepteur orphelin abondant dans le foie de rongeurs [l 14,1151.
Comme nous le verrons dans la section Perspectives, l'ensemble de ces
considérations nous amène & suggérer la réalisation d'études plus approfondies de la
nature du ou des facteurs se liant au site HX.
Chapitre VI= Canclusions et Perspectives 108
V) Un site de type GRE est impliqué dans la r6ponse au PB de
c m 2
Marie-Hélène Vachon, étudiante au doctorat dans le laboratoire d'accueil, tentait
de décrypter l'organisation du PBRU. Elle transfectait, dans des hépatocytes en culture
primaire, des mutants de délétion du fra,ment de 163 pb et localisait en son centre, entre
2208 et 2257 pb du tsp de CYP2B2, une séquence indispensable à la réponse au PB
(score») [Figure 11. Cependant, seule, cette région était totalement inactive. Pour être
fonctionnelle, i l fallait lui greffer un ou plusieurs élément(s). du coté 5' ou du coté 3'.
Marie-Hélène Vachon identifiait, coté 3', un tel élément, baptisé AF1 («Accessory Factor
1 »). A H correspondait à l'empreinte FO, déterminée dans le cadre de la présente thèse. A
l'intérieur de ladite séquence, en 5' de HX et NFl, entre 2230 et 2244 pb du tsp, se
trouvait un site ressemblant à un GRE (élément de réponse aux glucocortic~ïdes). Afin de
mesurer l'importance de la présence de ce site au sein du PBRU, celui-ci était modifié
dans le cadre de cette thèse (mutant GREm). Il était d'autant plus intéressant de le muter
que Waxman et ses collaborateurs [ 131 avaient démontré en 1990 que l'ajout de DEX au
milieu de culture augmentait de façon significative la réponse au PB des gènes CYP2B1 et
CYP2BZ. Le nombre de nucléotides identiques à ceux de la séquence consensus GRE était
ainsi réduit de 7 à 4 (sur 12). Cette mutation produisait un effet remarquable sur
l'induction, PB dépendante, de l'activité CAT. Elle atténuait de façon importante cette
activité, dont il ne subsistait que 10% du niveau habituel.
En 1997, un travail similaire de dissection du fragment de 177 pb de la souris
menait à des conclusions opposées [22]. Honkakoski et Negishi définissaient une région
centrale identique, à quelques nucléotides près, à celle caractériske chez le rat. Cette
séquence correspondait aux empreintes PB* et pC et s'étendait de 2297 à 2364 pb du tsp
de CypZb IO (2193 ii 2260 pb en coordonnées du PBRU) Figure LI. Nous l'appellerons
PB'-pC pour plus de commodité. Alors que la séquence centrale du PBRU était inactive,
PB'-pC conservait un pouvoir inducteur sur l'activité CAT correspondant à environ 30%
(induction d'un facteur 3) de celui obtenu pour le fragment complet [Figure 21.
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 109
Honkakoski et Negishi établissaient ensuite que la partie importante de PB'-pC était pC,
une séquence de 33 pb, renfermant le site NF1. Ils testaient, pour ce faire, des mutants de
PB', appelés pB'mutl et pB'mut2, et ne constataient aucune réduction du pouvoir
inducteur du segment pBt(modifié)-pC. Or, en réalisant le mutant pB'mut2, Honkakoski
et Negishi modifiaient également le site de type GRE [Figure LI.
Contrairement à nous, cette équipe n'accordait donc au site de type GRE aucune
fonction dans la réponse au PB. Comme nous allons le voir, cet élément était également
partiellement exclu du nouveau PBREM dont les limites étaient redéfinies en 1998 [116].
Nous avons jugé nécessaire de présenter une analyse poussée des travaux de l'équipe
Negishi en rapport avec le site de type GRE. Elle incite à penser que le rôle exact qui
incombe 4 cet élément n'est pas encore connu et va mériter des investigations
supplémentaires.
1 Induction 1
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 111
Analyse du PBREM
En 1998, Honkakoski et ses collaborateurs [116] réexaminaient les limites du
PBREM caractérisé en 1997 [22]. Celui-ci était alors d'une longueur de 132 pb (de 2265 à
2397 pb du tsp) et comprenait les 4 empreintes PB-PB'-pC-pD [Figure 21. Son pouvoir
inducteur sur l'activité CAT était maximal (de 6 à 8 fois). Rappelons qu'à l'intérieur de ce
premier PBREM se trouvait le segment PB'-pC, qui exhibait une activité partielle (de
l'ordre de 3 fois). Honkakoski et ses collaborateurs émettaient alors l'hypothèse que
l'activité inductrice de PB'-pC pourrait être complète si on ajoutait des nucléotides de part
et d'autre de ce dernier. A l'aide de nouvelles constructions amputées, ils incluaient ainsi,
en 3'' une séquence appelée NR2b et réduisaient, en 5' ' la participation de PB' à 6
nucléotides (TCTGTA) [Figure 21. Le nouveau PBREM faisait maintenant 51 pb,
comprises entre 2289 et 2339 pb du tsp. Il renfermait le site NF1 central et, de part et
d'autre, deux répétitions directes imparfaites, de type AGGTCA, avec un espacement de 4
nucléotides (DR4). Ces éléments étaient appelés NR 1 et NR2. Les deux demi-sites étaient
appelés NR 1 a et NR2a en 5' et NR 1 b et NRZb en 3'. Dans ce nouveau modèle, le site HX
du rat correspondait au demi-site NRl b. Il ne représentait donc qu'une partie du DR4
appel6 NRl . Le nouveau PBREM était capable d'induire l'activité CAT d'un facteur 10 et
ce, en présence du PB et d'one quinzaine d'autres inducteurs de type PB [116].
La mutation conjointe des demi-sites «a» de NR 1 et NR2 (mutant NRla2a) ou des
demi-sites b de NRl et NR2 (mutant NRl b2b) produisait un effet drastique sur le pouvoir
inducteur de ce nouveau PBREM [ I 161. Un changement du nombre de nucléotides
séparant les deux demi-sites de NRl (on passe de 4 nucléotides à 2, 3, 5 ou 7) entrainait
des réductions plus ou moins importantes de l'activité CAT [112]. La modification de
NRla en NRla mut (TGTACT devient TcTggT) réduisait de 80% la réponse au PB [112].
Bien que ces données suggéraient un rôle important de NRLa au sein d'un PBREM qui
écartait le site de type G E , des résultais contradictoires que nous exposons dans le
paragraphe suivant, venaient confirmer la nécessite d'expériences supplémentaires
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 112
Figure 2: Organisation du PBREM de la souris.
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 113
(envisagées dans la section Perspectives) pour saisir pleinement l'implication de la region
du site GRE dans l'organisation du PBREM ou du PBRU.
Les données mentionnées dans le paragraphe précédent divergeaient en effet d'un
résultat présenté en 1997 par Honkakoski et Negishi [22]. Afin de déterminer les rôles
respectifs de PB' et pC à l'intérieur du fragment de 177 pb, ces chercheurs extrayaient ces
deux éléments du fragment complet (constructions 15 et 16). Us devaient, pour ce faire,
insérer un site de restriction «GAATTC» entre les deux. ils substituaient ainsi une courte
séquence du fragment de 177 pb, située à l'intersection de PB' et pC, par «GAATTC»
(constmction 14) [Figure 31. Dans un souci de rigueur, ils s'assuraient que ces 6
nucléotides n'altéraient pas la réponse au PB du gène car. Transfectée dans des
hépatocytes de souris en culture primaire, la construction 14 présentait, comme
Honkakoski et Negishi I'escomptaient, la même activite que la construction sauvage. Or,
la séquence NRla, dont I'imponance pour la réponse au PB ne sera révélée que I'année
suivante, était modifiée par cette substitution [Figure 31.
Dans l'hypothèse où les deux pb mutées dans la construction 14 ne jouent aucun
rôle pour la fonction de NRI, il failait supposer que la chute de 80% de l'activité CAT,
observée dans le cas de la construction 15, laquelle était dépourvue de PB', reposait sur la
modification d'un seul nucléotide. le premier NT» de TGTACT changé en «a>> (aGaAtT)
[Figure 31. Or, chez le mutant NRl a mut de Honkakoski et Negishi. le nucléotide en
question n'était pas mute [112]. L'autre hypothèse est l'implication de pb de l'empreinte
PB'. adjacentes en 5' à NRla, (entre autres «TC») dans la réponse au PB. Ii faut donc
considérer la possibilité que l'élimination de PB' dans la construction 15 soit à l'origine
de la réduction importante du pouvoir inducteur de cette construction. Ceci conduirait
donc à reconsidérer le rôle de la région en 5' du PBREM, c'est-à-dire de la zone
renfermant le site de type GRE.
Nous ne discuterons pas ici des limites du PBREM coté 3'. Nous pouvons
toutefois noter qu'une autre mutation a été introduite dans NR2a, dans le même contexte
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 114
Figure 3: Insertion d'un site de restriction dans le PBREM.
Chavitre VI: Conclusions et Pers~ectives 115
d'une insertion d'un site de restriction entre pC et PD. Une seule paire de bases est alors
mutée mais elle semble sans conséquence sur le pouvoir inducteur du PBREM [22].
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 116
L'activation transcriptionnelle de CYP2B2 par le PB implique donc la participation
d'un facteur de transcription ubiquiste NFI. Celui-ci doit agir de concert avec, entre
autres, un récepteur nucléaire de nature inconnue et probablement un facteur de
transcription s'attachant à un site adjacent en 5' des sites HX et NFI. Ainsi pris dans leur
ensemble, les résultats de la présente thèse nous font percevoir la complexité de
l'organisation de cet activateur transcriptionnel. Si les objectifs de notre travail de thèse
ont été en grande partie atteints, ces résultats et ceux de l'équipe Negishi nous amènent à
nous poser de nouvelles questions, auxquelles il sera intéressant de répondre à moyen et
plus long termes.
i) Le site de type GRE participe-t-il à la réponse de CYPZB2 au PB?
ii) Quelle est la stmcture exacte du site HX? Le demi-site AGGTCA fait-il partie
d'un DR4 qui serait reconnu par un hétérodimère de type RXR-CAR?
Appartient-il plutôt à un DR1 reconnu par un récepteur nucléaire
homodimérique de type HM4 ou est-il un demi-site unique (précédé de
quelques nucléotides importants) reconnu par un récepteur nucléaire de type
monornérique, comme FTF?
iii) L'hétérodimère RXRa-CAR est-il impliqué dans la reconnaissance du DR4?
Afin de répondre à la première question, il faudra réaliser, dans un premier temps,
de nouvelles mutagenèses de la région englobant le site de type GRE, afin d'une part, de
mesurer précisément la part qui incombe à cette zone dans la réponse au PB, d'autre part,
de délimiter clairement l'ensemble de la région impliquée dans la réponse au PB. il sera
pertinent de corroborer ces résultats par des expériences d'empreintes à la DNase 1 avec
les mutants du site de type GRE.
En parallèle à ces expdriences et ceci, afin de concilier nos résultats avec ceux de
Honkakoski et ses collaborateurs, il sera intéressant de tester le PBREM dans un contexte
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 117
différent de celui utilisé par l'équipe Negishi jusqu'à présent. Il n'est pas impossible, en
effet, qu'un site important pour la réponse au PB ait été créé immédiatement en amont du
PBREM, lors de la construction du vecteur PBREM-tk-cat. Dans cette optique, il sera
possible de joindre par exemple, à l'extrémité 5' du PBREM, dans le vecteur tk-car,
différents fragments nucléotidiques quelconques et d'observer leur effet sur la réponse au
PB du PBREM. Une autre alternative intéressante sera de tester le PBREM dans le
vecteur employé au laboratoire d'accueil. Il conviendra également d'évaluer les effets de
l'adjonction, en 5' du PBREM, de la séquence qui aura été délimitée par le laboratoire
d'accueil, dans la région du site de type GRE.
L'existence de contradictions. ou tout au moins de faiblesses, dans les résultats de
Honkakoski et ses collaborateurs nous encouragent à effectuer des travaux dans ce sens.
Si les expériences proposées nous donnent raison quant à la participation dans la réponse
au PB d'un élément en 5' des sites HX et NFI. il sera pertinent de poursuivre les analyses
d'identification du facteur se fixant cette région. Nous ne disposons en effet pour le
moment d'aucune preuve nous permettant d'affirmer qu'un récepteur des glucocortic~ïdes
se fixe à cette région.
Il sera égaiement nécessaire de nous attarder aux limites du site HX. Le demi-site
NRla appartient-il encore au site HX ou fait-il déjà partie d'un élément en 5' de HX,
impliqué lui aussi dans la réponse au PB? Quelques réponses seront sans doute apportées
par les investigations dont fera l'objet le site de type GRE. Iî sera également intéressant
d'effectuer des mutations touchant à NR 1 a.
Enfin, afin d'apprécier le rôle de I'hétérodimère RXRa-CAR dans la réponse au
PB du PBRU, il sera aisé de traiter les hépatocytes de rat en culture primaire avec de
I'androstanol ou de I'androsténol, deux inhibiteurs de l'activité transcriptionnelle de
RXRa-CARB [ 1 171. Ces composés stéro'idiens semblent agir en inhibiteurs en entraînant
la dissociation des CO-activateua de l'hétérodimére. Si cet hétérodimère est impliqué dans
la réponse au PB, le traitement des hépatocytes avec ces inhibiteurs devrait réduire de
fqon importante, voire totale, le pouvoir inducteur de PBRU.
Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 118
Le cas échéant, il faudra déterminer la nature des protéines qui s'attachent à cette
région, par des expériences de gels à retardement à l'aide d'anticorps anti-récepteurs
orphelins ou des essais de chromatographie sur colonnes. L'ensemble de ces expériences
nous conduiront progressivement à démêler le jeu complexe d'interactions protéiques
mises en œuvre dans la régulation du gène CYP2B2. La question de l'existence d'un
récepteur pour le PB sera inévitablement abordée et il ne fait pas de doute qu'elle trouvera
une réponse dans un avenir proche.
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