caractérisation du second système de sécrétion de type ii...

1

N° d’ordre :2008-ISAL-0109 Année 2008

Thèse

Caractérisation du second système de sécrétion de type II chez

la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi.

présentée devant L’Institut National des Sciences Appliquées de Lyon

pour obtenir le grade de Docteur

Ecole doctorale : Evolution, Ecosystème, Microbiologie, Modélisation Spécialité : Microbiologie

par

Yann Ferrandez

Soutenue publiquement le jeudi 11 décembre 2008 devant la Commission d’examen

JURY

Mr Long Fei WU Directeur de recherche CNRS, Rapporteur Mr Romé VOULHOUX, Chargé de recherche CNRS, Rapporteur Mme Patricia DOUBLET, Professeur à l’UCBL, Examinateur Mr Philippe LEJEUNE, Professeur à l’INSA de Lyon, Examinateur Mr Guy CONDEMINE, Directeur de Recherche CNRS, Directeur de thèse

2

INSA Direction de la Recherche - Ecoles Doctorales 2007

SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE

CHIMIE

CHIMIE DE LYON http://sakura.cpe.fr/ED206

M. Jean Marc LANCELIN

Insa : R. GOURDON

M. Jean Marc LANCELIN Université Claude Bernard Lyon 1

Bât CPE 43 bd du 11 novembre 1918

69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43 13 95 Fax :

[email protected]

E.E.A.

ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE

http://www.insa-lyon.fr/eea M. Alain NICOLAS Insa : D. BARBIER [email protected]

Secrétariat : M. LABOUNE AM. 64.43 – Fax : 64.54

M. Alain NICOLAS Ecole Centrale de Lyon

Bâtiment H9 36 avenue Guy de Collongue

69134 ECULLY Tél : 04.72.18 60 97 Fax : 04 78 43 37 17

[email protected] Secrétariat : M.C. HAVGOUDOUKIAN

E2M2

EVOLUTION, ECOSYSTEME, MICROBIOLOGIE, MODELISATION

http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2

M. Jean-Pierre FLANDROIS Insa : H. CHARLES

M. Jean-Pierre FLANDROIS CNRS UMR 5558

Université Claude Bernard Lyon 1 Bât G. Mendel

43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cédex

Tél : 04.26 23 59 50 Fax 04 26 23 59 49 06 07 53 89 13

[email protected]

EDIIS

INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA SOCIETE

http://ediis.univ-lyon1.fr

M. Alain MILLE

Secrétariat : I. BUISSON

M. Alain MILLE Université Claude Bernard Lyon 1

LIRIS - EDIIS Bâtiment Nautibus

43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex

Tél : 04.72. 44 82 94 Fax 04 72 44 80 53 [email protected] - [email protected]

EDISS

INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE

M. Didier REVEL Insa : M. LAGARDE

M. Didier REVEL Hôpital Cardiologique de Lyon

Bâtiment Central 28 Avenue Doyen Lépine

69500 BRON Tél : 04.72.35 72 32 Fax :

[email protected]

MATERIAUX DE LYON

M. Jean Marc PELLETIER

Secrétariat : C. BERNAVON 83.85

M. Jean Marc PELLETIER INSA de Lyon

MATEIS Bâtiment Blaise Pascal 7 avenue Jean Capelle

69621 VILLEURBANNE Cédex Tél : 04.72.43 83 18 Fax 04 72 43 85 28

[email protected]

Math IF

MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE

M. Pascal KOIRAN

Insa : G. BAYADA

M.Pascal KOIRAN Ecole Normale Supérieure de Lyon

46 allée d’Italie 69364 LYON Cédex 07

Tél : 04.72.72 84 81 Fax : 04 72 72 89 69 [email protected]

Secrétariat : Fatine Latif - [email protected]

MEGA

MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE

M. Jean Louis GUYADER

Secrétariat : M. LABOUNE PM : 71.70 –Fax : 87.12

M. Jean Louis GUYADER INSA de Lyon

Laboratoire de Vibrations et Acoustique Bâtiment Antoine de Saint Exupéry

25 bis avenue Jean Capelle 69621 VILLEURBANNE Cedex

Tél :04.72.18.71.70 Fax : 04 72 18 87 12 [email protected]

SSED

SCIENCES DES SOCIETES, DE L’ENVIRONNEMENT ET DU DROIT

Mme Claude-Isabelle BRELOT

Insa : J.Y. TOUSSAINT

Mme Claude-Isabelle BRELOT Université Lyon 2

86 rue Pasteur 69365 LYON Cedex 07

Tél : 04.78.69.72.76 Fax : 04.37.28.04.48 [email protected]

SOMMAIRE

Remerciements.............................................. 4

Abréviations................................................. 6

Liste des figures et tableaux.............................. 7

Résumé ..................................................... 10

Summary ................................................... 11

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE .................. 13

I Le passage de la membrane interne _______________________ 14 I.1) le système Sec ........................................................................................................... 14

I.1.1) Le peptide signal : ......................................................................................................................... 14 I.1.2.1) Le translocon SecYEG .......................................................................................................... 16 I.1.2.2) les protéines accessoires SecDFYajC.................................................................................... 16 I.1.2.3) Le moteur : SecA................................................................................................................... 16

I.2) L’insertion de protéines par l’intermédiaire de YidC ......................................... 17 I.3) Le système Tat ......................................................................................................... 18

I.3.1) La séquence signal ........................................................................................................................ 18 I.3.2) L’avant-translocation .................................................................................................................... 20

I.3.2.1) Les cofacteurs........................................................................................................................ 20 I.3.2.2) Acquisition de la structure tridimensionnelle ........................................................................ 20

I.3.3) La machinerie Tat ......................................................................................................................... 22 I.3.3.1) Les gènes ............................................................................................................................... 22 I.3.3.2) Les protéines ......................................................................................................................... 23 I.3.3.3) Le fonctionnement de la machinerie ..................................................................................... 23 I.3.3.4) L’énergie ............................................................................................................................... 24

I.3.4) Les substrats de la machinerie Tat ................................................................................................ 24 I.4) Repliement des protéines dans le périplasmique.................................................. 25

II Les protéines de la membrane externe_____________________ 27 II.1) Les protéines intégrales de la membrane externe (OMPs) ................................ 27

II.1.1) Découverte d’une machinerie essentielle dans la mise en place des OMPs dans la membrane externe .................................................................................................................................................... 28

II.1.1.1) Omp85/YaeT, protéine majeure de ce complexe ................................................................. 28 II.1.1.2) Les partenaires de Omp85.................................................................................................... 29

II.1.2) Reconnaissance des OMPs .......................................................................................................... 31 II.1.2.1) Motifs de reconnaissance ..................................................................................................... 31 II.1.2.2) Rôle des feuillets β ............................................................................................................... 32

II.1.3) Modèle de biogénèse des OMPs .................................................................................................. 32 II.2) Les lipoprotéines .................................................................................................... 33

III Les différents systèmes de sécrétion chez les bactéries à Gram négatif __________________________________________________ 36

1

III.1) Les systèmes sec indépendants ............................................................................ 36 III.1.1) La voie de sécrétion de type I ..................................................................................................... 36

III.1.1.1) Le moteur du système : la protéine ABC............................................................................ 37 III.1.1.2) Le MFP, la composante adaptatrice.................................................................................... 38 III.1.1.3) Le pore dans la membrane externe : la protéine OMP........................................................ 38

III.1.2) Le système de sécrétion de type III ............................................................................................ 38 III.1.2.1) le corps basal....................................................................................................................... 39 III.1.2.2) le prolongement extracellulaire........................................................................................... 39 III.1.2.3) Le pore de translocation...................................................................................................... 40 III.1.2.4) Les effecteurs, protéines secrétées par le système de sécrétion de type III......................... 41

III.2) Les systèmes dépendants de Sec ou Tat ............................................................. 41 III.2.1) Le système de sécrétion de type IV ............................................................................................ 42

III.2.1.1) La structure des T4SS......................................................................................................... 43 III.2.1.2) Le fonctionnement des T4SS.............................................................................................. 43 III.2.1.3) Les effecteurs...................................................................................................................... 44

III.2.2) Le système de sécrétion de type VI ............................................................................................ 44 III.2.3) Le système de sécrétion de type V ............................................................................................. 46

III.2.3.1) Les autotransporteurs.......................................................................................................... 47 a) Implication de la séquence signal dans le passage de la membrane interne.............................. 47 b) Le domaine passager, la partie sécrétée .................................................................................... 47 c) Translocation de la membrane externe par l’intermédiaire de l’unité de translocation............. 47

III.2.3.2) Les systèmes à deux partenaires ......................................................................................... 48 III.2.3.3) La voie chaperon usher ....................................................................................................... 49

III.2.4) Le système de sécrétion de type II.............................................................................................. 50 III.2.4.1) Les protéines des T2SSs ..................................................................................................... 51

a) Le complexe de la membrane externe : T2S:D et T2S:S .......................................................... 51 b) Les pseudopilines T2S:G, H, I, J, K et la prépiline peptidase T2S:O ....................................... 54 c) Le moteur des T2SS :l’ATPase T2S:E...................................................................................... 57 d) La plateforme de la membrane interne T2S:F/L/M et T2S:C ................................................... 59 e) T2S:A, T2S:B et T2S:N : des protéines accessoires ?............................................................... 63

III.2.4.2) Spécificité et fonctionnement du système de sécrétion de type II ...................................... 64 a) Spécificité du système de sécrétion de type II : la reconnaissance du motif de sécrétion.... 64 b) Le motif de sécrétion ........................................................................................................... 65 c) Reconnaissance spécifique des exoprotéines par le sécréton............................................... 67

III.2.4.3) Modèles de fonctionnement................................................................................................ 68

OBJECTIFS DE L’ETUDE ................................. 71

RESULTAT ................................................. 73

Chapitre I : Analyse et régulation de la région d’ADN contenant le cluster stt ___________________________________________________ 73

I.1) Matériels et méthodes ............................................................................................. 73 I.2) Résultats : ................................................................................................................. 74

I.2.1) Analyse du cluster stt .................................................................................................................... 74 I.2.2) Corrélation entre la présence des gènes sttD et pnlH et l’origine des souches.............................. 75 I.2.3) Conditions d’expression des gènes du système de sécrétion stt et de la pnlH............................... 76

I.3) Discussion ................................................................................................................. 77

Chapitre II : Nouvelle voie d’acheminement de protéines à la membrane externe des bactéries Gram négatif.___________________________ 78

Chapitre III : Analyse de la voie d’acheminement de PnlH à la membrane externe._________________________________________________ 90

III.1) Matériels et méthodes .......................................................................................... 90

2

III.2) Résultats ................................................................................................................ 93 III.2.1) Analyse de la séquence signal N-terminale ................................................................................ 93

III.2.1.1) Localisation d’une protéine associant la séquence N-terminale de PnlH avec une lipoprotéine ........................................................................................................................................ 93 III.2.1.2) Organisation de la séquence N-terminale de PnlH ............................................................. 93

III.2.2) Implication des protéines Out dans le fonctionnement du système Stt....................................... 94 III.2.3) Implication du gène 20719 dans la localisation finale de PnlH.................................................. 95

III.3) Discussion.............................................................................................................. 96

Chapitre IV : Recherche de partenaires protéiques permettant l’acheminement de PnlH de la membrane interne vers la membrane externe ___________________________________________________ 98

IV.1) Matériels et méthodes........................................................................................... 98 IV.1.1) Cinétique d’insertion de PnlH dans la membrane externe d’un mutant yaeT E. coli ................. 98 IV.1.1) Approche génétique pour la recherche de partenaires protéiques .............................................. 99

IV.2) Résultats : ............................................................................................................ 100 IV.2.1) Implication de la protéine YaeT dans l’acheminement de PnlH à la membrane externe ......... 100 IV.2.2) Recherche de partenaires protéiques impliqués dans le passage de la membrane interne à la membrane externe par une approche génétique.................................................................................... 101

IV.3) Discussion ............................................................................................................ 103

DISCUSSION ET PERSPECTIVES ......................105

REFERENCES .............................................112

3

RReemmeerrcciieemmeennttss

Je remercie Monsieur Long Fei Wu et Monsieur Romé Voulhoux qui ont accepté avec

cordialité d’être les rapporteurs de ce travail. J’exprime également tous mes remerciements à Madame Patricia Doublet et à Monsieur Philippe Lejeune pour avoir accepté d’examiner ce travail.

Je tiens à exprimer ma sincère reconnaissance à Guy Condemine pour son encadrement exemplaire durant cette thèse. Tu m’as donné une formation aussi bien scientifique qu’humaine d’une qualité remarquable. Je pars avec un bagage scientifique énorme et qui me permettront de trouver un emploi dans le futur grâce à toi. De plus, les ♫pompompom♫ du matin vont me manquer ainsi que ta bonne humeur.

Je tiens à remercier Nicole Hugouvieux-Cotte-Pattat pour m’avoir accueilli dans le laboratoire de Microbiologie, Adaptation et Pathogénie et pour avoir su être disponible pour toutes les questions liées à la vie dans le laboratoire.

Mes remerciements vont également à Sylvie Reverchon, l’encyclopédie sur patte de l’équipe « Erwinia ». Je remercie chaleureusement Vladimir Shevchik pour sa sympathie (surtout son coté chambreur) et pour son savoir technique. Merci au « DOCTEUR NASSER William » pour ses interventions enflammées qui me mettaient toujours de bonne humeur.

A mi-parcours de la thèse a eu lieu le comité de pilotage. J’en remercie les membres, Jean Claude Lazzaroni, Béatrice Py, Claire Prigent-Combaret et Guy Condemine qui m’ont permis de prendre du recul sur les résultats obtenus et d’orienter au mieux la fin de la thèse. En particulier, je tiens à exprimer mes remerciements à Jean-Claude Lazzaroni ainsi qu’à Anne Vianney pour l’emprunt de matériels scientifiques. Merci à Séverine Collin de l’Institut Pasteur de Paris, Rémi Dulermo du CEA de Cadarache et Long Fei WU pour les plasmides ou les souches envoyés. Je remercie aussi tout les membres de l’unité MAP pour leurs intéressantes questions lors de séminaires. Je remercie l’ensemble du personnel technique pour le support précieux fourni mais également pour leur bonne humeur et leurs conversations : Yvette Alfaro, Véronique Utzinger, Jean-Michel Prost, Sonia Diasparra, Christine Berger, Sandra Mebarki, Zagik Mouton-Kosem, Julie Fontrier, Géraldine Effantin (oh le beau râteau), Isabelle Bouilliot et Julien Wawrzyniak. Je remercie tout particulièrement Camille Villard (Mais où est l’intérêt ?) pour son aide technique. Je remercie amicalement Vincent Geoghegan pour son aide technique. Ce fût un excellent étudiant qui était toujours motivé. Ce travail a été facilité par la qualité des services administratifs de l’INSA, évitant ainsi une perte de temps dans le travail de recherche. Je tiens également à souligner le travail précieux effectué par l’Association Bernard Grégory, notamment à travers la formation « Nouveau Chapitre de la Thèse », qui prépare à l’après-thèse ainsi que l’accompagnement individuel fourni par l’école doctorale E2M2.

4

Je voudrais maintenant remercier tous les étudiants passés et présents pour leur bonne humeur et leur délire. Merci à Susan (entre autre pour les cadeaux de Syrie), Wafa, Claire, Sana, Xhiao.

En première année, je voudrais tout particulièrement dire merci à la petite Sandra de la mort qui tue ; elle m’a permis de bien m’intégrer au reste de l’équipe. Un grand merci à monsieur FREDO, Maître Jedi, pour m’avoir appris à moi jeune padawan, les différentes techniques de biologie moléculaire et de biochimie. Je voudrais aussi lui dire toute la sympathie que j’ai pour lui pour les différents surnoms qu’il m’a attribués. Un merci au Toulousain Thomas qui en revenant d’Allemagne a été un bon compagnon de bureau et à Bedis pour les petites parties de football (et surtout la troisième mi-temps).

En deuxième année, j’aimerai remercier la reine et le roi de trèfle de Norwich (ce n’est pas la banque d’assurance) ainsi qu’Aleksandra. Cette deuxième année n’aurait pas été génial sans la présence de Lilly (surtout quand tu fais l’éléphant ; en même temps, moi je fais très bien l’araignée lol). Merci à la petite Nan, qui est partie bien loin dans les grattes ciel de Singapour. Que dire sur Mathilde, ma voisine de paillasse !!! Quand va-t-elle me manquer le plus ? Ah, je sais ; le lundi matin car je n’aurai plus les aventures merveilleuses de Martine.

En troisième année, je voudrais remercier la bande des Camille & Co (y’a plein de nom); Pour ceux qui ne connaissent pas, c’est une bande de lascars qui pense qu’à s’amuser : montagne, ski, fêtes, danse (avec une partenaire de choc Nan), faire des jeux, du sport (Ah, Camille, comment je t’ai foutu la pâtée au Sumo) , les rendez-vous gastronomiques (Master pinard et chèvre de Laure) la cafet de l’INSA, les sous-entendus (n’est ce pas Denis), les courses de chaise (encore Mathilde dans le coup), etc... Merci à eux pour les innombrables délires.

Merci aussi aux étudiants qui sont partis maintenant à Bayer pour les différents apéros (Heber, Laetitia, Thierry, Mélanie de legionnella et Martina).

Un énorme MERCI à mes différents colloques (Benoit, Lucie, Floriane et mon frère) qui ont toujours été là pour moi. Merci à toute ma famille, mes amis d’enfance (avec une pensée particulière pour Matthieu) et tout particulièrement à mes parents qui m’ont toujours soutenu.

5

AAbbrréévviiaattiioonnss

ABC : ATP Binding Cassette

ADNt : ADN de Transfert

ADP : Adénosine diphosphate

ARNr : Acide ribonucléique ribosomique

AT : Autotranspoteur

ATP : Adénosine triphosphate

FAD : Flavine Adénine Dinucléotide

FHA : Filamentous haemagglutinin

GEP : General Export Pathway

GFP : Green Fluorescent Protein

Hbp : Hémoglobine protéase

Hcp : Hemolysin-coregulated protein

HR : Highly conserved Region

HSI : Hcp1 secretion island

IAHP : IcmF associated homologous protein

IMP : Inner Membrane Protein

IM Inner Membrane

IPTG : Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

LPS : Lipopolysaccharide

MFP : Membrane Fusion Protein

NADP+ : Nicotinamide Adénine Dinucléotide

Phosphate

NBD : Nucleotide Binding Domain

OMP : Outer membrane protein

OM Outer Membrane

PDZ : Post synaptic density 95, Disc large,

Zo-1

PGA : Polygalacturonate

Plasmide Ti : Plasmide Tumor inducing

PMSF : Phenylmethyl-sulphonyl fluoride

PPIase : Peptidyl-prolyl isomérase

PVDF : Polyvinylidene fluoride

SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate-

polyacrylamide-gel electrophoresis

SRP : Signal Recognition Particle

T1SS : Type 1 Secretion System






Tat : Twin arginine translocation

TM : Transmembrane segment

TPS : Two-Partner Secretion

Vas : Virulence-associated secretion

6

Liste des figures et tableaux

LLiissttee ddeess ffiigguurreess eett ttaabblleeaauuxx

Introduction bibliographique Verso de la page

Figure 1: La paroi des bactéries à Gram négatif 12

Figure 2: Modèle de fonctionnement du système Sec 14

Figure 3: Modèle péristaltique de la translocation des protéines par SecYEG 15

Figure 4: Modèles d’insertion des segments transmembranaires des IMPs par le

translocon Sec et YidC 16

Figure 5 : Peptide signal double-arginine 17

Figure 6 : Structure des chaperonnes cytoplasmiques des substrats Tat . 20

Figure 7 : Les protéines Tat 21

Figure 8 : Modèle de fonctionnement du système Tat. . 22

Figure 9 : Représentation tridimensionnelle du complexe TatA . 23

Figure 10 : Les facteurs de repliement du périplasme et de la membrane externe 24

Figure 11 : Réponse à un stress périplasmique 28

Figure 12 : Structure de YaeT 29

Figure 13 : Modèle de la biogénèse des OMPs 30

Figure 14 : Transport des lipoprotéines à la membrane externe 33

Figure 15 : Fonctionnement du système de sécrétion de type I de E. coli. 35

Figure 16 : Structure tridimensionnelle de TolC d’Escherichia coli (a)

et de MsbA (protéine ABC) de V. cholerae . 36

Figure 17 : Organisation générale des différents systèmes de sécrétion de type III

des espèces Yersinia spp, E. coli EPECs et Pseudomonas syringa 38

Figure 18 : Modèle et image des translocateurs hydrophiles de Yersinia et Shigella 39

Figure 19 : Représentation schématique des différents mécanismes dépendant

des systèmes de sécrétion de type IV 41

Figure 20 : Représentation schématique de la structure des systèmes de sécrétion

de type IV 42

Figure 21 : Structure oligomérique et tridimensionnelle de Hcp1 de Pseudomonas

aeruginosa 44

Figure 22 : Modèle de fonctionnement des autotransporteurs 46

Figure 23 : Structure des domaines des autotransporteurs 47

Figure 24 : Structure et modèle de fonctionnement du système de transport FHA 48

7


Figure 25 : Modèle d’élongation des pili de type I d’Escherichia coli

par la voie chaperon-usher 49

Figure 26 : Organisation des opérons des systèmes de sécrétion de type II 50

Figure 27 : Reconstitution tridimensionnelle de multimères formées

par la sécrétine PulD 51

Figure 28 : Les pseudopilines 54

Figure 29 : Les pseudopilines GspI, J et K de E. coli ETEC 55

Figure 30 : Modèle d’organisation des anneaux hexamériques d’EpsE 57

Figure 31 : Structure tridimensionnelle du complexe formé par le domaine

N-terminal d’EpsE et la région cytoplasmique d’EpsL 58

Figure 32 : Structure tridimensionnelle du domaine PDZ de EpsC de Vibrio cholerae 60

Figure 33 : Modèle de fonctionnement du système de sécrétion de type II 68

Résultats chapitre I Verso de la page

Figure I.1 : Isochore de la région entre le gène norM et xyl comprenant le cluster stt

encadré par deux t-RNA 72

Figure I.2 : Expression des gènes sttE et pnlH dans différents mutants de D. dadantii 75

Figure I.3 : Expression des gènes sttE et pnlH dans une souche sauvage

ou un mutant hns de D. dadantii en fonction de la température 76

Tableau I.1 : Meilleurs homologues des différentes protéines du système Stt 73

Tableau I.2 : Présence de sttD et pnlH dans différentes souches d’E. chrysanthemi 74

Résultats chapitre II I Verso de la page

Figure III.1 : Représentation schématique des différents opérons du système

out et stt de D. dadantii 89

Figure III.2 : Représentation schématique de PnlH et de ses dérivés utilisés

dans cette étude 91

Figure III.3 : Localisation cellulaire de PnlH_PemB chez E. coli 92

Figure III.4 : Localisation cellulaire de PnlH∆28-41-6His chez E. coli. 93

Figure III.5 : Localisation cellulaire de PnlHstreptagC chez E. coli 94

8


Figure III.6 : Exposition de PnlHstreptagC à la surface de différents mutants

de D. dadantii 95

Figure III.7 : Régulation de sttE, pnlH et 20719 dans une souche sauvage et

un mutant hns de D. dadantii en fonction de la température 96

Tableau II.1 : Souches bactériennes et plasmides utilisés dans ce travail 89

Tableau II.2 : Amorces utilisées dans ce travail 90

Résultats chapitre IV Verso de la page

Figure IV.1 : Analyse de l’effet de la déplétion de YaeT sur la quantité de PnlH

présente dans les membranes 98

Figure IV.2 : Principe de l’approche génétique pour trouver des mutants

dans les gènes d’adressage de PnlH 99

Figure IV.3 : Localisation cellulaire de PnlH_MalE chez E. coli 100

Figure IV.4 : Aspect des colonies exprimant PnlH_MalE sur milieu

Mac Conkey Maltose 101

Figure IV.5 : Localisation cellulaire de PnlH-6His chez E. coli NM522 et un

des clones issu de la mutagénèse (NM522 clone n°9) 102

Résultats chapitre IV Verso de la page

Figure D1 : Modèle schématique des trois voies d’acheminement de protéines

à la membrane externe des bactéries 104

9

Résumé

RRééssuumméé

Chez les bactéries à Gram négatif, toutes les protéines destinées à la membrane

externe sont synthétisées avec une séquence signal qui est clivée lors de leur acheminement.

Ce clivage s’effectue lors du passage de la membrane interne, par LepB pour les protéines

intégrales de la membrane externe ou par LspA pour les lipoprotéines. Le séquençage du

génome de Dickeya dadantii a permis de mettre en évidence une seconde machinerie de

sécrétion de type II nommée Stt (pour Second Type Two). En aval de ce système se trouve un

gène dénommé pnlH dont le produit est homologue à des pectines lyases. L’étude de cette

protéine a montré qu’elle est un substrat de la machinerie Stt qui permet son passage de la

face interne de la membrane externe à sa face externe. En absence de Stt ou chez Escherichia

coli, PnlH est localisée à la face interne de la membrane externe. Cet ancrage est dû à

l’extrémité N-terminale de la protéine qui n’est pas clivée lors du passage de la membrane

interne et contient toute l’information pour l’adressage de la protéine. En effet, la fusion des

41 premiers acides aminés de PnlH à des protéines de différents compartiments cellulaires

provoque l’adressage de celles-ci à la membrane externe. L’analyse plus approfondie de cette

partie N-terminale montre certaines caractéristiques d’une séquence signal Tat-dépendante,

permettant le passage de la membrane interne par le système Tat. L’analyse de mutants de la

séquence signal ou de la machinerie Tat a confirmé que celle-ci est nécessaire pour le transfert

de PnlH à travers la membrane interne.

Ainsi, l’analyse de l’adressage de PnlH à la membrane externe a permis de mettre en

évidence une nouvelle voie d’acheminement de protéines à la membrane externe des

bactéries. Ce nouveau mécanisme de ciblage de protéines à la membrane externe est

probablement répandu puisque PnlH est aussi localisée à la membrane externe quand elle est

exprimée dans E. coli. PnlH n'étant pas détectée comme substrat de la machinerie Tat par les

programmes de prédiction, cela suggère qu'il reste à découvrir d'autres protéines de la

membrane externe Tat-dépendante encore non identifiées.

Mots clés : Système de sécrétion de type II, Protéines de la membrane externe, système Tat,

Dickeya dadantii

10

Résumé

SSuummmmaarryy

In Gram negative bacteria, all the proteins destined for the outer membrane are

synthesized with a sequence signal which is cleaved during their routing. This cleavage is

performed during the passage of the inner membrane, by LepB for outer membrane proteins

(OMPs) or by LspA for lipoproteins. The sequencing of the genome of Dickeya dadantii

allowed to bring to light a second type II secretion machinery named Stt (for Second Type

Two). Downstream to this system is a gene called pnlH, the product of which has homology

with pectin lyases. The study of this protein showed that it is a substrate of the Stt machinery

which allows its passage from the inner face to the outer face of outer membrane. In absence

of Stt or in Escherichia coli, PnlH is localized in the inner face of the outer membrane. This

anchoring is due to the N-terminal extremity of the protein which is not cleaved during the

crossing of the inner membrane and contains all the information for the addressing of the

protein. Indeed, the fusion of the first 41 amino acids of PnlH with proteins of various cellular

compartments allows the addressing of these hybrids to the outer membrane. A more detailed

analysis of this N-terminal part shows characteristics of a Tat-dependant sequence signal,

allowing the passage of the inner membrane by the Tat system. Analysis of mutants of the

sequence signal or of the machinery Tat confirmed that this one is necessary for the passage

of PnlH through the inner membrane.

So, the analysis of the addressing of PnlH to the outer membrane allowed the

identification a new way of routing of proteins to the outer membrane of bacteria. This new

mechanism of targeting of proteins in the outer membrane is probably widespread because

PnlH is also localized in the outer membrane when it is expressed in E. coli. Since PnlH is not

detected as a substrate of the Tat machinery by the prediction programs, this suggests that

other Tat targeted outer membrane proteins remain to be identified.

Key words: Tat system, type II secretion system, outer membrane protein, Dickeya dadantii

11

INTRODUCTION

BIBLIOGRAPHIQUE

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Introduction Bibliographique

IINNTTRROODDUUCCTTIIOONN BBIIBBLLIIOOGGRRAAPPHHIIQQUUEE

En tant que procaryote, les bactéries sont des cellules relativement simples,

caractérisées par une absence de noyau et d’organites comme les mitochondries et les

chloroplastes. Une caractéristique importante des bactéries est la paroi cellulaire qui permet

de se protéger contre le milieu extérieur. Cette paroi sert aussi d’interface d’échange entre la

bactérie et le milieu environnemental. Basées sur la différence de la structure et de la

composition chimique de cette paroi cellulaire, les bactéries peuvent être divisées en deux

groupes : Gram négatif ou Gram positif.

La paroi des bactéries à Gram négatif s'organise en trois grandes parties (de l'intérieur

vers l'extérieur) :(i) la membrane interne (IM), (ii) l’espace périplasmique (périplasme) et (iii)

la membrane externe (OM) (Beveridge, 1999) (figure 1).

L’IM est principalement composée de phospholipides organisés en bicouche. Insérés à

l’intérieur de cette bicouche se trouvent de nombreux complexes protéiques, d'une importance

vitale pour la bactérie, qui ont des rôles dans le métabolisme bactérien (comme l'ATP

synthase, les chaînes respiratoires,…).

L'espace périplasmique, qui se situe entre l’OM et l’IM, contient une couche de

peptidoglycanes. C’est un espace de stockage d'enzymes qui sont impliquées dans la

dégradation et le transport de nutriments ou dans le maintien de la structure de la paroi

bactérienne.

L’OM est en contact direct avec le milieu extérieur. Elle est composée d’une couche

de phospholipides et d’une couche de lipopolysaccharide (LPS) (Beveridge, 1999). Elle

contient de nombreuses protéines intrinsèques (OMPs, Outer Membrane Protein) comme par

exemple les protéines de transports appelées porines (figure 1). Le LPS est un composé peu

immunogène qui permet à la bactérie de se cacher contre les défenses de l’hôte. Lors de la

lyse de la bactérie, le LPS se dissocie permettant le relargage du lipide A qui joue un rôle dans

le pouvoir pathogène de la bactérie.

Les protéines synthétisées dans le cytoplasme se confrontent au passage de l’IM. Une

partie d’entre elles s’insèrent dans cette membrane et deviendront des protéines intégrales de

la membrane interne (IMP) ou des lipoprotéines. Une autre partie passe l’IM et peut rester

dans le périplasme, s’insérer dans l’OM ou être sécrétée dans le milieu extracellulaire. La

dernière partie peut être directement sécrétée dans le milieu extracellulaire (passage direct du

cytoplasme au milieu extérieur). Sémantiquement parlant, le terme de sécrétion désigne un

transport actif d’une protéine du cytoplasme vers le milieu extracellulaire. Le terme de

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translocation est lui employé quand une protéine est transportée d’un compartiment vers un

autre compartiment cellulaire (membranes, périplasme) (Economou et al., 2006).

La partie bibliographique de ce manuscrit présentera les différents acheminements de

protéines aux divers compartiments cellulaires de la bactérie.

II LLee ppaassssaaggee ddee llaa mmeemmbbrraannee iinntteerrnnee

Les protéines synthétisées dans le cytoplasme et destinées aux compartiments post-

cytoplasmes sont confrontées au passage de l’IM. Les voies d’exports permettant la

translocation de ces protéines sont :

- le système Sec

- l’insertase YidC

- le système Tat

I.1) le système Sec

Le système Sec qui est la plus importante voie d’export de protéines, est présente chez

les archées, les eubactéries et les eucaryotes. Sa présence est indispensable puisque son

absence est létale pour la bactérie. Il permet le passage des protéines vers le périplasme mais

il est aussi un des systèmes qui permet l’insertion des protéines dans l’IM. Ce système

multiprotéique se compose des deux complexes SecYEG et SecDFYajC localisés au niveau

de l’IM de la bactérie. De plus, le système comprend la protéine cytoplasmique SecA qui

permet un apport d’énergie par l’hydrolyse de l’ATP nécessaire pour le fonctionnement de la

machinerie (Cao and Saier, 2003).

I.1.1) Le peptide signal :

Les protéines périplasmiques vouées à la translocation par la voie Sec sont toutes

synthétisées sous forme de précurseurs. Ces précurseurs possèdent une séquence signal N-

terminale caractéristique, qui est clivée immédiatement après la translocation par une

peptidase. De ce clivage résulte la forme mature de la protéine.

Ces séquences signal constituées d’environ 16 à 26 acides aminés ne présentent pas

réellement de motif conservé mais trois domaines caractéristiques :

- le domaine N-terminal basique (domaine N)

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- le domaine central hydrophobe (domaine H)

- le domaine C-terminal polaire (domaine C)

Chaque domaine de ce peptide signal joue un rôle dans l’export de la protéine. Tout

d’abord le domaine N, qui est chargé positivement (présence d’arginines ou de lysines),

permet l’interaction avec les phospholipides et le complexe hétérodimérique SecYE (chargé

négativement). Ensuite, le domaine H permet l’insertion de la préprotéine dans la membrane.

Enfin, le domaine C contient le site de clivage AXA reconnu par une signal peptidase

permettant le relargage de la protéine mature dans le périplasme (Dev and Ray, 1990).

L’organisation de ces peptides signal est très conservée dans l’évolution (Cao and

Saier, 2003). D’ailleurs, des expériences ont montré qu’une protéine possédant une séquence

signal Sec eucaryote est exportée par le système Sec d’Escherichia coli.

La translocation par le système Sec peut se faire de deux façons différentes (figure 2) :

- Translocation co-traductionnelle (en même temps que la traduction)

- Translocation post traductionnelle (indépendante de la traduction)

L’orientation des protéines vers l’une des deux voies de translocation dépend du

caractère hydrophobe du peptide signal (Koch et al., 1999). En effet, si le peptide signal est

très hydrophobe, la translocation des protéines sera co-traductionnelle nécessitant le complexe

SRP (Signal Recognition Particle). Ce dernier qui se compose d’un ARN de 4.5S et de la

GTPase Ffh, se fixe au peptide signal permettant l’arrêt de la traduction. Ce néo-complexe

(ribosome, SRP, préprotéine) se lie au récepteur membranaire FtsY permettant la stabilisation

du complexe et le transfert de la préprotéine au système Sec (Ullers et al., 2004). Ceci est

suivi d’une hydrolyse du GTP par Ffh permettant la dissociation du complexe SRP/FtsY

(Muller et al., 2001).

Les autres protéines dont le peptide signal est moins hydrophobe empruntent la voie

post-traductionnelle. Dans ce cas, la préprotéine est prise en charge par la protéine SecB

(complexe homotétramérique) évitant ainsi la dégradation ou l’agrégation de la protéine néo-

synthétisée. Ensuite, SecB emmène cette protéine au système Sec en se liant à la partie C-

terminale de SecA qui est associée à la face interne de l’IM.

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I.1.2) La structure et le fonctionnement du système Sec

Le système Sec étant primordial pour la bactérie, son étude fait l’objet de beaucoup de

travaux. Malgré ces nombreuses études, le fonctionnement et la structure de ce complexe sont

très controversés.

I.1.2.1) Le translocon SecYEG

Le complexe SecYEG est un complexe hétérotrimérique inséré dans l’IM. Il se

compose de SecY (48 kDa, 10 segments transmembranaires (TM)), de SecE (14 kDa, 3 TMs)

et de SecG (11,5 kDa, 2 TMs). L’association entre les protéines SecY et SecE permet la

formation d’un pore à travers l’IM qui devient fonctionnel avec l’interaction de SecG (Van

den Berg et al., 2004). L’ouverture du pore, qui est obstrué par une hélice α, se déclenche par

la fixation du peptide signal de la préprotéine sur le complexe SecYEG (figure 2). Cependant,

de récents travaux démontrent qu’il faudrait une dimérisation de ce complexe pour permettre

la fonctionnalité du pore (Lotz et al., 2008; Maillard et al., 2007a; Tam et al., 2005).

I.1.2.2) les protéines accessoires SecDFYajC

Ces différentes protéines forment aussi un complexe hétérotrimérique intégré dans

l’IM interagissant avec le translocon SecYEG (Duong and Wickner, 1997) (figure 2). Ce

complexe n’est pas essentiel pour la translocation des préprotéines (Veenendaal et al., 2004),

mais la suppression de SecD et SecF provoque une diminution de l’efficacité de translocation

des préprotéines (Pogliano and Beckwith, 1994). Le complexe SecDFYajC serait impliqué

dans le relargage des protéines transloquées (Matsuyama et al., 1993) et dans la régulation de

l’activité de SecA (Economou et al., 1995).

I.1.2.3) Le moteur : SecA

SecA est une protéine de 102 kDa présente sous deux états dans la cellule : un état

libre dans le cytoplasme et un état associé avec l’IM. Cette protéine peut être monomérique

ou dimérique. En effet, les différentes structures tridimensionnelles déterminées à ce jour

montrent des états oligomériques différents. Quand il s’agit de dimères, les surfaces

d’interaction et l’orientation des protomères diffèrent aussi selon les structures (Dempsey et

al., 2004; Matousek and Alexandrescu, 2004; Nishiyama, 2000; Papanikolau et al., 2007;

Sharma et al., 2003; Suzuki et al., 1998; Vassylyev et al., 2006; Vrontou and Economou,

2004; Weaver et al., 1992; Zimmer et al., 2006). Malgré tout, la forme dimérique semble la

forme prédominante et fonctionnelle dans la bactérie. Cette forme dimérique recrute le

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tétramère de SecB permettant ainsi le transfert de la préprotéine à SecA (figure 2 et 3). Puis,

une molécule d’ATP se fixe à SecA permettant l’initiation de la translocation et la

dissociation avec SecB. Ensuite, l’hydrolyse de l’ATP apporte l’énergie nécessaire à la

translocation de la préprotéine à travers le pore SecYEG. Cette translocation se fait au fur et à

mesure de l’hydrolyse de plusieurs ATP par le dimère SecA (Gelis et al., 2007; Zimmer et al.,

2006). En effet, il a été démontré que chaque molécule d’ATP hydrolysée par SecA permet la

translocation de 30 acides aminés. La force protomotrice prend le relais dans le maintien de la

préprotéine dans le pore SecYEG au moment où SecA se dissocie de cette préprotéine pour

effectuer par la suite une autre poussée de 30 acides aminées (Driessen and Nouwen, 2008;

Uchida et al., 1995) (figure 3).

I.2) L’insertion de protéines par l’intermédiaire de YidC

Les IMPs représentent approximativement 20% du protéome d’E. coli (Daley et al.,

2005). Ces protéines sont donc très importantes pour la viabilité de la bactérie et leur insertion

correcte est donc essentielle. Les IMPs sont synthétisées sans peptide signal mais leur

intégration dans l’IM nécessite la protéine SRP et le système SecYEG. En effet, la protéine

SRP reconnaît et se fixe au premier segment transmembranaire hydrophobe de l’IMP et dirige

celle-ci vers le translocon SecYEG via la protéine FtsY. De là, le translocon SecYEG permet

l’insertion des IMPs dans l’IM. Ce processus semble solliciter l’action de l’insertase YidC.

Cette protéine est une IMP de 60 kDa possédant six TMs. Elle aurait été conservée durant

l’évolution puisqu’il existe des homologues chez les mitochondries ou les chloroplastes (Xie

and Dalbey, 2008). Au départ, la découverte de cette protéine a mise en évidence une

nouvelle voie de translocation des IMPs indépendante du système Sec (Samuelson et al.,

2000; Scotti et al., 2000; Stuart and Neupert, 2000). En effet, la déplétion de cette protéine

provoque l’inhibition de l’insertion des protéines de capside des phages M13 et Pf3 (Chen et

al., 2002; Samuelson et al., 2000; Samuelson et al., 2001). Mais, la protéine YidC jouerait

aussi un rôle dans l’insertion des IMPs dépendantes de Sec (Samuelson et al., 2000). Elle

serait impliquée dans le transfert latéral des TMs des IMPs du système Sec à la bicouche

lipidique puisque son absence a un effet négatif sur l’intégration du cytochrome bo3 oxydase

(CyoA) et de MalF (du Plessis et al., 2006; Kol et al., 2006; Lotz et al., 2008; Wagner et al.,

2008) (figure 4). Récemment, il a été suggéré que l’insertion du premier TM de CyoA

nécessiterait seulement YidC mais que le complexe SecYEG serait indispensable pour

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l’insertion des autres TMs de CyoA (Celebi et al., 2008). De plus, YidC aurait un rôle à jouer

dans le contrôle de qualité des IMPs (Kol et al., 2008).

I.3) Le système Tat

Pendant de nombreuses années, la machinerie Sec a été considérée comme étant la seule

impliquée dans le passage de protéines au travers de l’IM. Cette machinerie Sec nécessite de

l’ATP pour fonctionner et permet la prise en charge dans le cytoplasme de protéines sous

forme non repliées et inactives, porteuses d’une séquence signal spécifique à leur extrémité

N-terminale (Berks et al., 2005) (paragraphe I.1.1). Ce mode de translocation est toutefois

incompatible avec la nécessité pour certaines enzymes de fixer des cofacteurs cytoplasmiques

pour devenir actives, notamment les métalloenzymes des chaînes respiratoires liées à la face

périplasmique des membranes.

Initialement découvert dans la membrane des thylakoïdes du maïs (Settles et al., 1997), un

système alternatif fut mis en évidence chez E. coli permettant la translocation de protéines

repliées et activées au sein du cytoplasme et dont l’énergie dépend du ∆pH transmembranaire

(Santini et al., 1998). Les substrats de cette voie de translocation présentent une séquence

signal N-terminale originale contenant deux arginines consécutives. Pour cette raison, ce

système a été nommé Tat pour Twin Arginine Translocation.

I.3.1) La séquence signal

Les caractéristiques de la séquence signal des protéines transloquées par le système Tat

(Tatss) ont été identifiées chez des enzymes à cofacteurs d’E. coli. La TMAO

(TriMethylAmine N-Oxide) réductase (codée par torA) est l’une des premières enzymes

bactériennes dont l’exportation par le système Tat a été démontrée (Santini et al., 1998). La

fusion de sa Tatss avec différentes protéines a permis d’induire la translocation Tat

dépendante d’un grand nombre d’entre elles, telles qu’une sous-unité du photosystème II des

chloroplastes, la GFP sous forme activée, et le fragment soluble P2 de la Lep (un substrat

Sec). Ces différentes expériences ont prouvé le rôle primordial de cette séquence signal dans

l’adressage au système (Berks et al., 2005).

La présence d’une organisation tripartite est le seul parallèle établi entre la structure des

séquences signal Sec et Tat. L’alignement de séquences de Tatss de diverses protéines a

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permis de mettre en évidence de nombreuses particularités au niveau des trois parties (Berks,

1996; Cristobal et al., 1999) (figure 5):

- Le domaine N-terminal très long est porteur d’un motif conservé [Ser/Thr]-Arg-Arg-

X-Φ-Φ où les deux arginines sont quasi invariantes et Φ est un résidu hydrophobe

- Le domaine central H est plus court et moins hydrophobe que celui de la séquence

signal de Sec (Secss) (présence de résidus Gly et Thr à la place de résidus Leu)

- Le domaine C-terminal porte une charge globale positive (présence de résidus Arg et

Lys) en amont du site AXA de clivage par une signal peptidase.

La présence de ces diverses séquences conservées et notamment du doublet arginine

suggère un rôle important de ces acides aminés dans le processus de ciblage à la machinerie

Tat. Dans la plupart des cas, l’absence ou la modification d’une des deux arginines abolit la

translocation par le système Tat. Mais dans certains cas, il est possible de substituer un des

deux acides aminés pour que l’exportation ait lieu (Stanley et al., 2000). Par exemple, le

remplacement de la première arginine par une lysine est possible. La deuxième arginine peut

être substituée par une glutamine, une asparagine ou une lysine avec des taux d’inhibition

différents sur la translocation. De plus, de récentes études ont démontré que le remplacement

du doublet Arg-Arg par un doublet Lys-Lys de la colicine V chez E. coli permet son

exportation par le système Tat (Ize et al., 2002). A cette date, il existe deux protéines

naturelles transloquées par Tat et qui ne possèdent pas ce doublet arginine : la

prépropénicilline amidase (Arg-Asn-Arg) (Ignatova et al., 2002) et la tétrathionate réductase

(Lys-Arg) (Hinsley et al., 2001).

Ce doublet Arg-Arg n’est pas le déterminant unique pour un adressage correct au

système Tat. Celui ci nécessite également un taux d’hydrophobicité bien spécifique de la

région H et une charge positive en C-terminal de la Tatss. En effet, une augmentation

d’hydrophobicité de la région H aboutit à la translocation des protéines vers le système Sec.

Ce phénomène est également observé en substituant les résidus positifs (Arg, Lys) de la partie

C-terminale par des résidus négatifs (Cristobal et al., 1999).

La présence d’une spécificité d’hôte de certaines protéines dépendantes de Tat qui ne

sont pas reconnues comme telles par la machinerie d’un autre organisme rejoint d’ailleurs

cette observation. Ainsi, le fait qu’une protéine est substrat du système Tat chez une bactérie

donnée, ne peut pas être transposé à ses homologues des autres espèces. Par exemple, la

translocation de la phosphatase alcaline, qui est dépendante de Tat chez Thermus

thermophilus, est dépendante de Sec chez E. coli. Tout ceci laisse penser que la

reconnaissance et l’adressage de la séquence signal au système Tat sont relativement

19


complexes et restrictifs et qu’il existe des facteurs au sein de cette séquence signal qui

permettraient d’expliquer ces phénomènes (Blaudeck et al., 2001; Cristobal et al., 1999).

I.3.2) L’avant-translocation

I.3.2.1) Les cofacteurs

Pour être actifs, certains substrats du système Tat nécessitent la liaison d’un cofacteur

cytoplasmique. Un substrat de ce type est l’enzyme terminale de la voie TMAO réductase qui

permet la réduction du TMAO (TriMethylAmine N-Oxide) et qui est codée par le gène torA.

Le produit de ce gène est transloqué par le système Tat. La translocation de TorA nécessite la

fixation du cofacteur cytoplasmique MGD (Molybdoptérine Guanine Dinucléotide) lui

permettant d’être active et ainsi d’être transloquée par Tat (Santini et al., 1998). Un autre

exemple de cofacteur pour le passage de substrat par Tat est le NADP qui s’associe avec la

protéine Tat GFOR (glucose-fructose oxydoréductase) de Zymomonas mobilis. En effet, un

déficit de translocation est observé chez des mutants portant des mutations au sein du site de

fixation du cofacteur (Halbig et al., 1999). Cette présence de cofacteur semblait être un

caractère fondamental des substrats de Tat. Mais, ce n’est plus le cas depuis la découverte de

la translocation par Tat de protéines ne possédant pas de cofacteur telles qu’une xylanase de

Streptomyces lividans (Faury et al., 2004).

I.3.2.2) Acquisition de la structure tridimensionnelle

Outre la présence d’une séquence signal spécifique, les substrats du système Tat doivent

être dans une conformation repliée afin d’être adressés à ce système (DeLisa et al., 2003).

Pour acquérir cette structure tridimensionnelle, les substrats Tat sont recrutés par des

chaperonnes cytoplasmiques spécifiques. Ces dernières sont une famille de protéines

chaperonnes dédiées au contrôle des protéines transloquées par Tat (Tat Proofreading

Chaperones) (Genest et al., 2006; Hatzixanthis et al., 2005; Jack et al., 2004; Li et al., 2006).

L’exemple le plus étudié est la protéine chaperonne cytoplasmique TorD intervenant dans la

maturation de TorA. La protéine chaperonne TorD fait partie d’une nouvelle famille de

chaperonnes spécifiques des molybdoenzymes TMAO/DMSO réductases (Sargent et al.,

2002 ; Ilbert et al., 2004). Cette protéine cytoplasmique de 22,5 kDa se lie avec l’apoprotéine

TorA avant l’insertion du MGD. Elle a une implication directe et active dans le repliement de

TorA et dans l’acquisition du MGD. La fixation de cette chaperonne cytoplasmique se fait au

niveau de la séquence signal Tat de TorA. En effet, la protéine fusion TorAss::HybO (Tatss

20


de TorA fusionnée à la séquence mature de HybO) n’est transloquée par Tat qu’en présence

de la chaperonne cytoplasmique TorD (Jack et al., 2004). L’étude in vitro et in vivo de TorD a

permis d’établir avec précision les régions impliquées dans cette interaction (Genest et al.,

2006; Hatzixanthis et al., 2005; Jack et al., 2004; Li et al., 2006). Celle-ci implique la

séquence EPXDH au niveau de TorD (hautement conservée chez les protéines de la famille

TorD) et les 27 premiers résidus de TorA (la Tatss de TorA est constituée 39 acides aminés).

La protéine TorD est ainsi nécessaire à la maturation de TorA. De plus, TorD est capable de

protéger l’apoprotéine TorA contre la protéolyse, en particulier dans des conditions de stress

thermique ou de limitation en cofacteur à molybdène. En effet, la longue séquence signal de

TorA, qui est non-structurée, est hypersensible aux protéases et est protégée par l’interaction

directe de TorD (Genest et al., 2006).

Récemment, l’étude de NapD a mis en évidence une autre famille de chaperonnes

cytoplasmiques. Cette protéine permet la maturation de l’enzyme réduisant le nitrate NapA

qui passe l’IM par le système Tat. La différence avec la famille de TorD est que l’interaction

entre NapD et NapA ne se fait pas seulement sur la séquence signal mais tout au long de la

séquence de NapA (Maillard et al., 2007b; Sargent, 2007). La structure tridimensionnelle de

ces deux familles de chaperonnes est aussi différente. En effet, les protéines de la famille

TorD ont une structure en hélices α alors que NapD a une structure de type ferrédoxine (figure

6). Par contre comme pour TorD, NapD permet le repliement correct de NapA puisque son

absence provoque la dégradation de ce substrat. Mais, la protéine TorD est une « Tat

Proofreading Chaperone » au sens propre du terme. En effet, en plus de son activité de

repliement, cette protéine exerce un contrôle/qualité sur la structure tridimensionnelle de son

substrat puisque la surexpression de NapD provoque l’absence de translocation de NapA

(Maillard et al., 2007b; Sargent, 2007).

En plus des chaperonnes cytoplasmique spécifiques, il a été démontré le rôle

déterminant de la chaperonne de ménage DnaK dans l’acquisition de la structure

tridimensionnelle de substrats Tat. Celle-ci se fixerait sur le domaine h de la séquence signal

Tat permettant ainsi la protection du substrat contre la protéolyse (Graubner et al., 2007;

Perez-Rodriguez et al., 2007; Sargent, 2007).

Récemment, une étude démontre que le système Tat jouerait un rôle direct dans le

contrôle de qualité pour l’acquisition de la structure tridimensionnelle des substrats. En effet,

l’absence de la machinerie Tat provoque l’accumulation de protéines non correctement

repliées alors que ces protéines sont dégradées dans une souche sauvage (Matos et al., 2008).

21


I.3.3) La machinerie Tat

I.3.3.1) Les gènes

Les gènes de la machinerie de translocation Tat des bactéries ont été identifiés à l’origine

par l’homologie qu’ils présentent avec ceux de la voie de translocation indépendante de Sec

des thylakoïdes des chloroplastes du maïs. Ils sont au nombre de cinq chez E. coli et répartis

en deux unités transcriptionnelles distinctes (Sargent et al., 1998):

- la première est un opéron de quatre gènes comprenant les ORF tatA, tatB, tatC et tatD,

suivi du gène rfaH codant un régulateur transcriptionnel.

- La seconde contient un seul gène nommé tatE.

Bien que les produits de ces gènes aient comme substrats de nombreuses enzymes du

métabolisme anaérobie, ils sont exprimés de façon constitutive et seule une faible régulation

en conditions fermentatives a été mise en évidence à ce jour chez E. coli. Il y a toutefois une

grande différence d’expression entre les deux unités transcriptionnelles, tatE étant exprimé

deux cent fois moins que tatA (Jack et al., 2001).

Si on regarde l’ensemble des génomes bactériens séquencés à ce jour, les gènes tatA et

tatC sont tous les deux présents dans les génomes supérieurs à 2 Mégabases (Mb) et

quelquefois dans ceux compris entre 1 et 2 Mb. Le nombre de copies de tatA peut varier

jusqu’à trois alors que tatC est souvent présent à une seule copie par génome. Le gène tatB est

lui présent uniquement dans le génome des Actinobactéries et des Protéobactéries (à

l’exception d’une seule) et seulement lorsque tatA et tatC sont présents. tatE est présent

uniquement chez quelques espèces de la sous division gamma des Protéobactéries. Cette

organisation suggère que les gènes tatA et tatC sont les composants minimums du système

Tat bactérien et que les gènes tatB et surtout tatE sont des éléments additionnels non

indispensables pour une partie des bactéries (Wu et al., 2000b).

Le gène tatD est présent de manière ubiquitaire. Le produit de ce gène, la protéine TatD,

n’est quant à elle pas impliquée dans la machinerie de translocation. De plus, les mutations du

gène n’affectant pas la translocation des substrats du système, cette protéine n’est plus

considérée comme l’une des protéines du translocon Tat.

La présence non ubiquitaire du système Tat au sein de tous les génomes séquencés laisse

penser qu’il ne représente pas une composante vitale chez les bactéries mais plutôt « un luxe »

que certaines ont acquis ou conservé afin de posséder un avantage pour la conquête de niches

écologiques particulières.

22


I.3.3.2) Les protéines

Les homologies de séquence, les prédictions de structure et les activités des différentes

protéines du système ont permis ainsi de répartir celles-ci en deux groupes distincts : TatA,

TatB d’une part et TatC d’autre part (figure 7).

Les protéines TatA et TatB ont été regroupées du fait de leur homologie de structure

prédite et de l’homologie qu’elles présentent avec la protéine Hcf106 de la machinerie Tat des

thylakoïdes des chloroplastes.

TatA est la protéine la plus abondante du système. TatA est une IMP de 9 kDa qui

possède un TM proche de l’extrémité N-terminale (figure 7). Il est donc fort probable que son

intégration dans l’IM nécessite YidC. Toutefois des travaux menés sur un homologue de TatA

dans les chloroplastes ont montré que l’intégration de cette protéine se faisait

indépendamment du système Sec et de YidC (Fincher et al., 2003). Il n’est pas donc exclu que

les protéines constitutives du système Tat fassent intervenir un mécanisme inconnu pour leur

intégration dans l’IM.

TatB est une protéine de 18 kDa qui possède aussi un seul TM à son extrémité N-

terminale (figure 7). L’importance de TatB dans le fonctionnement du système semble varier

d’un organisme à l’autre. En effet, chez E. coli l’inactivation du gène tatB bloque l’export des

protéines par le système Tat (Sargent et al., 1999) tandis que chez Bacillus subtilis le système

reste fonctionnel (Jongbloed et al., 2004).

D’une taille de 256 acides aminés, TatC est un élément indispensable du système

comme le démontre l’absence totale de translocation chez des mutants tatC. Cette protéine est

associée à la membrane cytoplasmique et présente six TMs avec des extrémités C et N-

terminales cytoplasmiques (figure 7).

I.3.3.3) Le fonctionnement de la machinerie

TatB et TatC forment un complexe équimolaire (de Leeuw et al., 2002) qui participe à

la reconnaissance des séquences signal Tat (Alami et al., 2003) (figure 8). En effet, il semble

que la protéine TatC interagit avec le dipeptide RR et que TatB interagit avec le domaine h du

peptide signal. Ce complexe TatBC/protéine s’associe ensuite à un oligomère de TatA pour

permettre le processus d’export. En effet, TatA forme le pore à travers lequel les protéines

sont exportées (Berks et al., 2005; Lee et al., 2006) (figure 8 et 9). Chez Providencia stuartii,

le protomère de TatA contient une extension périplasmique de 7 aa qui va être clivée par la

protéase GlpG de l’IM. Ce clivage active TatA qui va s’oligomériser par l’intermédiaire du

TM (Sargent, 2007). Chez E. coli, cette oligomérisation semble être dépendante de TatC. En

23


effet, la présence de TatC est indispensable pour l’oligomérisation de TatA au contraire de

TatB. Comme TatC est localisée au niveau des pôles, l’oligomérisation de TatA s’effectue à

ce niveau là (Berthelmann et al., 2008).

Les oligomères formés par TatA semblent être de stœchiométrie variable. En effet, les

observations en microscopie électronique montrent que les oligomères de TatA ont une forme

annulaire mais avec des diamètres différents (Gohlke et al., 2005) (figure 9). L’ensemble de

ces observations suggère que des oligomères de TatA de stœchiométrie variable permettraient

ainsi le passage de molécules de taille différente.

La formation d’un complexe TatABC fonctionnel est transitoire car dès que la protéine est

exportée, TatBC se sépare de TatA (Mori and Cline, 2002) (figure 8).

Après le passage de l’IM, la protéine va être clivée par une signal peptidase pour être

relarguée dans le périplasme (Berks et al., 2005). Cependant, il a été démontré que certaines

protéines comme la protéine PetA (protéine Rieske Fe/S) de Legionella pneumophila ne sont

pas clivées. Dans le cas de PetA, la protéine reste ancrée à l’IM par la séquence signal Tat (De

Buck et al., 2007).

I.3.3.4) L’énergie

Différentes études s’accordent sur le fait que l’énergie de translocation du système Tat

est fournie par la force protomotrice (Berks et al., 2005). Mais le mécanisme via lequel ce

couplage énergétique s’effectue est inconnu. TatA pourrait permettre la transformation de

l’énergie électrochimique en énergie mécanique (Sargent et al., 2006). Cette hypothèse est

basée sur les similitudes de la topologie et de l’oligomérisation, entre TatA et la sous-unité C

de l’ATP synthase. En effet, lors de la synthèse d’ATP, la force protomotrice entraîne la

rotation des oligomères de la sous-unité C de l’ATP synthase ancrés dans l’IM (Stock et al.,

1999). Cette rotation permettrait de libérer la molécule d'ATP néo-synthétisée. Dans le cas de

la machinerie Tat, il est possible que la force protomotrice entraîne une rotation de TatA qui à

son tour permettrait le passage des protéines.

I.3.4) Les substrats de la machinerie Tat

En termes de fonction cellulaire, la majorité des substrats Tat identifiés à ce jour sont

impliqués dans le métabolisme respiratoire ou dans la morphologie des bactéries. De plus,

24


certains substrats Tat s’avèrent impliqués dans la virulence de certaines bactéries (Berks,

1996).

Une des caractéristiques des substrats Tat étant leur séquence signal spécifique, ceci a

conduit à la mise au point d’algorithmes de recherche de ces protéines. Dans la majorité des

cas, les protéines identifiées sont impliquées dans le métabolisme cellulaire et font partie des

chaînes de transport d’électrons permettant la respiration anaérobie (Berks, 1996). Outre la

TMAO réductase et des hydrogénases mises en évidence chez E. coli (Wu et al., 2000a), de

nombreuses autres enzymes respiratoires ont été identifiées comme dépendantes de Tat chez

d’autres bactéries.

Les mutants dans la machinerie de translocation Tat chez E. coli ont également un

phénotype morphologique original déjà connu chez les mutants de division cellulaire où les

bactéries normalement sous forme de bacille évoluent vers un phénotype filamenteux.

L’origine de ce phénomène réside dans le déficit de translocation des enzymes AmiA et

AmiC impliquées dans la septation et présentant une Tatss (Ize et al., 2003).

L’implication de Tat dans le processus de virulence est maintenant avérée pour de

nombreuses bactéries portant des mutations dans le système Tat. Ces bactéries montrent un

défaut dans la production de facteurs de pathogénie et dans l’induction de la virulence (Ding

and Christie, 2003). Ainsi, chez E. coli entérohémoragique O157 : H7 (EHEC), la toxine Stx1

qui possède une Tatss, n’est pas transloquée chez un mutant tat, entraînant une diminution

très significative de la Vérotoxicité (Pradel et al., 2003). Un mutant tat de Pseudomonas

aeruginosa ne peut plus quant à lui sécréter dans le milieu extérieur deux phospholipases C,

ce qui conduit notamment à l’absence d’abcès au niveau des poumons de rats infectés par un

mutant tat. Ces protéines après leur translocation par Tat, traversent l’OM via un système de

sécrétion de type II nommé Xcp (Voulhoux et al., 2001).

I.4) Repliement des protéines dans le périplasmique

Une fois le passage de l’IM effectué, les protéines peuvent se retrouver sous deux

formes : repliées ou non-repliées si elles sont transloquées respectivement par le système Tat

ou bien par le système Sec. Dans ce derniers cas, les protéines vont acquérir leur structure

tridimensionnelle dans le périplasme grâce à l’intervention de facteurs de repliement.

On peut classer ces derniers en trois catégories (figure 10) :

- les chaperonnes

- les protéines disulfures isomérases (Dsb)

25


- les peptidylprolylisomérases (PPIases)

Les chaperonnes sont représentées essentiellement par les trois protéines SurA, Skp et

DegP (Duguay and Silhavy, 2004). Les rôles de ces chaperonnes sont de protéger les

protéines néo-synthétisées de la dégradation et empêcher leur agrégation. Elles jouent aussi un

rôle dans la biogénèse des OMPs (Krojer et al., 2008a). En effet, chez E. coli, il a été

démontré que SurA, Skp et DegP seraient impliquées dans le transit d’OMP à travers le

périplasme et dans leur insertion dans l’OM.

Les disulfures isomérases sont aux nombres de deux : DsbA forme les ponts disulfures

alors que l’activité principale de DsbC est d’isomériser les ponts disulfures mal formés. Ces

deux protéines sont réoxydées par les protéines membranaires DsbB et DsbD. Les Dsb

participent à la mise en place de la structure tridimensionnelle des protéines transitant par le

périplasme. De plus, les Dsb joue un rôle dans la sécrétion des exo-protéines, dans la

biogénèse des flagelles et des fimbriaes (Lasica and Jagusztyn-Krynicka, 2007).

Les PPIases permettent l’isomérisation cis/trans de certaines liaisons peptidiques

précédant une proline. Pour le moment, chez les Gram négatif, on dénombre quatre PPIases :

SurA, FkpA, PpiA et PpiD (Mogensen and Otzen, 2005).

On remarque par ailleurs que SurA présente plusieurs activités (chaperonne et PPIase).

On retrouve ces multiples activités chez d’autres facteurs de repliements. C’est le cas de la

chaperonne DegP qui a aussi un rôle de protéase (Strauch et al., 1989). Ce rôle permettrait

d’éviter l’accumulation de protéines non correctement repliées qui serait fatal pour la bactérie.

Pour DegP, le passage d’une activité à l’autre dépend de la température (Krojer et al., 2008a;

Krojer et al., 2008b; Meltzer et al., 2008). A forte température, c’est l’activité protéase qui est

dominante (Kim and Kim, 2005; Spiess et al., 1999).

26


IIII LLeess pprroottééiinneess ddee llaa mmeemmbbrraannee eexxtteerrnnee

L'enveloppe cellulaire des bactéries à Gram négatif consiste en deux membranes, la

membrane interne (IM) et la membrane externe (OM), qui sont séparées par le périplasme

contenant le peptidoglycane. Les deux membranes ont une structure et une composition

différente. Tandis que l'IM est une double couche de phospholipides, l'OM est une double

couche asymétrique composée de phospholipides et de LPS. De plus, la structure des

protéines intégrales de ces membranes est différente. En effet, les IMPs sont insérées dans la

membrane par des hélices α, tandis que les OMPs s’insèrent généralement dans la membrane

par des feuillet-ß antiparallèles amphipathiques formant des tonneaux cylindriques avec les

résidus hydrophiles tournés vers l’intérieur et les résidus hydrophobes tournés vers l’extérieur

(Koebnik et al., 2000). Les deux membranes contiennent aussi des lipoprotéines qui s’ancrent

aux membranes par un N-acyl-diacylglycerylcysteine. Chez E. coli, elles font face au

périplasme. Mais, dans d'autres bactéries à Gram négatif, la moitié des lipoprotéines de l'OM

peut aussi s'étendre dans le milieu extracellulaire : la lactoferrine LbpB et les composants

TbpB du récepteur transferrine de Neisseria meningitidis sont des exemples de lipoprotéines

faisant face au milieu extracellulaire.

II.1) Les protéines intégrales de la membrane externe (OMPs)

L’OM fonctionne comme une barrière sélective qui protège les bactéries de composés

néfastes de l'environnement comme les antibiotiques. À la différence de l'IM, l'OM n'est pas

stimulée par un gradient de proton et l’ATP n'est pas disponible dans le périplasme. En

absence de sources d'énergies aisément disponibles, les substances nutritives passent l'OM par

diffusion passive via une famille d’OMPs appelé porines. Les porines forment des canaux

remplis d'eau qui permettent le passage de petites molécules hydrophiles pouvant aller jusqu'à

600 Da. Il existe deux types de porines : les porines générales trimériques (OmpA, OmpC) qui

ne présentent pas de sélectivité et les porines spécifiques telles que LamB impliquée dans le

transport des maltodextrines, ou KdgM et KdgN de D. dadantii nécessaire au transport

d’oligogalacturonates issues de la dégradation de la pectine par cette bactérie (Blot et al.,

2002; Condemine and Ghazi, 2007).

Néanmoins, des processus permettant le passage de molécules exigeant de l’énergie

ont aussi été décrits. De tels processus sont dépendants de systèmes de transfert complexes,

27


comme par exemple le système TonB qui transfère la force protomotrice de l'IM à l’OM

permettant l’entrée de composés extracellulaires (sidérophores).

Toutes les protéines de l'OM sont synthétisées dans le cytoplasme et doivent être

transportées à travers l'IM et le périplasme pour atteindre leur destination finale. Tandis que la

composition, la structure et la fonction de l'OM sont connues depuis longtemps,

l’acheminement et l’insertion des protéines à cette membrane en absence de sources

d'énergies restent en grande partie énigmatique. Récemment, beaucoup de nouveaux

composants impliqués dans ces processus ont été décrits. A part des études dans les

organismes modèles classiques tels que E. coli et Salmonella enterica, beaucoup de progrès

ont été obtenus en étudiant N. meningitidis.

II.1.1) Découverte d’une machinerie essentielle dans la mise en place des OMPs

dans la membrane externe

II.1.1.1) Omp85/YaeT, protéine majeure de ce complexe

Le mécanisme d’insertion des OMPs dans l’OM a été longtemps énigmatique et

considéré comme spontané. Mais récemment, plusieurs composants d’une machinerie

multimérique permettant l’insertion des OMPs dans l’OM ont été découverts. Le premier

composant de cette machinerie identifié est la protéine Omp85 de N. meningitidis (Voulhoux

et al., 2003). En effet, l’absence de cette protéine conduit à une mauvaise insertion des

porines (PorA et PorB), une absence de multimérisation de la sécrétine PilQ et un effet

néfaste sur la sécrétion du domaine passager de l’autotransporteur IgA1. De plus, l’absence

prolongée de ce composant provoque la mort de N. meningitidis suggérant le rôle essentiel de

cette protéine. En observant de plus près les régions flanquantes du gène omp85, on retrouve

la plupart du temps le gène skp qui code pour une chaperonne périplasmique impliquée elle

aussi dans la biogénèse des OMPs. On remarque aussi la présence du gène yaeL (rseP) codant

une protéase impliquée dans la réponse au stress via RpoE lorsque les OMPs ne sont pas

insérées correctement (Rowley et al., 2006).

L’assemblage des OMPs est hautement conservé durant l’évolution puisque des

homologues d’Omp85 ont été retrouvés chez les mitochondries et les chloroplastes où ces

protéines sont essentielles pour l’assemblage des OMPs (Gentle et al., 2004). Ce gène omp85

a été retrouvé chez E. coli où le gène a été dénommé yaeT (Voulhoux and Tommassen, 2004).

La déplétion de Omp85 provoque l’accumulation d‘OMPs non repliées dans le

périplasme (Voulhoux et al., 2003; Voulhoux and Tommassen, 2004). Cette accumulation

28


n’est pas observée chez E. coli mais provoque une diminution significative des OMPs. Cette

différence est probablement due à l’absence de réponse au stress dépendant de RpoE chez N.

meningitidis. En effet, chez E. coli, ce stress est induit par l’accumulation des OMPs non-

repliées dans le périplasme par l’intermédiaire du domaine PDZ de DegS (senseur) (figure

11). Une fois DegS active, cette protéine interagit avec RseA qui va transduire l’information

d’une accumulation d’OMPs dans le périplasme au facteur σE (Rowley et al., 2006). Celui-ci

va transcrire les gènes des protéines chaperonnes périplasmique (DegP, Skp, SurA), les gènes

de protéases et des sRNAs. Ces derniers permettent l’inhibition de la traduction des OMPs

(Johansen et al., 2006; Ruiz and Silhavy, 2005). Ce processus est absent chez N. meningitidis

car l’homologue de rseA n’existe pas chez cette bactérie.

La structure totale d’Omp85 n’a pas été encore caractérisée mais sur la base de la

séquence, Voulhoux et ses collaborateurs ont proposé que Omp85 se divise en deux domaines

distincts : une partie C-terminale en tonneau β et une partie N-terminale périplasmique. Cette

partie N-terminale aurait des qualités de chaperonne car elle contient cinq domaines POTRA

(Polypeptide Transport Associated) que l’on retrouve dans les membres de la super famille

Omp85 (Voulhoux et al., 2003). Récemment, une partie de ce domaine N-terminal a été

cristallisée définissant la position exacte des domaines POTRA (Kim et al., 2007) (figure 12).

Par des expériences de filtration sur gel, il a été démontré que YaeT de E. coli forme

des oligomères et vraisemblablement des tétramères en comparaison avec la structure

tétramérique d’un autre membre de la super famille Omp85 (HMW1B de Haemophilus

influenzae) (Surana et al., 2004). Mais il semblerait que ce complexe ne soit pas très stable

(Robert et al., 2006).

II.1.1.2) Les partenaires de Omp85

La migration d’Omp85 de N. meningitidis en condition native montre que celle-ci forme

un complexe multimérique. La seule protéine identifiée de ce complexe chez N. meningitidis à

ce jour est RmpM qui semble interagir avec le peptidoglycane du périplasme et différentes

OMPs (Prinz and Tommassen, 2000). Par contre, chez E. coli, des expériences de cross

linking ont permis de mettre en évidence des interactions entre YaeT et quatre lipoprotéines :

YfgL, YfiO, NlpB et SmpA (Wu et al., 2005) (Sklar et al., 2007) (figure 13). Chaque

composant de ce complexe semble impliqué dans l’insertion des OMPS à l’OM.

L’inactivation du gène yfgL ne provoque pas la déstructuration de l’OM mais une

diminution de la quantité des OMPs. Cela confirme le rôle de ce gène dans l’assemblage des

29


OMPs (Wu et al., 2005). Ce gène se retrouve chez les bactéries à Gram négatif mais on ne

retrouve pas d’homologue chez N. meningitidis.

Le gène yfiO est essentiel puisque son absence est létale chez E. coli (Onufryk et al.,

2005). Mais, l’insertion d’un transposon au niveau de sa partie 3’ permet la viabilité des

bactéries. Chez ce mutant, la déstructuration de l’OM et une diminution du niveau des OMPs

sont observées (Wu et al., 2005). Chez Neisseria gonorrhoeae, l’homologue de yfiO a été

dénommé comL (Fussenegger et al., 1996). Sa mutation, qui n’est pas létale, provoque une

diminution de la taille des bactéries et une incapacité à se transformer. La mutation de ce gène

dans N. meningitidis semble impossible puisqu’elle provoque la mort de la bactérie. La

protéine ComL interagit avec le peptidoglycane chez N. gonorrhoeae (Fussenegger et al.,

1996). Cette interaction avec le peptidoglycane semble aussi présente avec le produit du gène

yfgL. En effet, la mutation yfgL affecte la synthèse du peptidoglycane en interférant dans

l’activité de transglycosylation (Eggert et al., 2001). Ceci suggère qu’YfgL et YfiO ont un

rôle dans le réarrangement du peptidoglycane pour faciliter le passage des OMPs au travers de

cette couche.

De plus, dans un mutant yfgL, le niveau de TolC est inchangé au contraire de ceux de

LamB, OmpA ou OmpC (Charlson et al., 2006). En revanche, dans un mutant où le niveau de

YaeT ou YfiO est faible, le niveau de toutes les OMPs est diminué. Ces observations

permettent de conclure que YaeT/YfiO semble être indispensable pour l’insertion de toutes

les OMPs dans l’OM alors que la protéine YgfL ne serait recrutée que pour un certain type

d’OMPs.

Quand au gène nlpB, il semble avoir un rôle direct sur l’insertion des OMPs puisque

son absence provoque un mauvais assemblage des OMPs (Onufryk et al., 2005; Wu et al.,

2005). Récemment, il a été démontré que l’absence de la lipoprotéine SmpA provoque aussi

un mauvais assemblage des OMPs que ce soit chez E. coli (Sklar et al., 2007) ou bien chez

Salmonella enterica (Lewis et al., 2008). SmpA serait donc un des composants du système

interagissant avec YaeT et YfiO pour stabiliser le complexe (Sklar et al., 2007).

Grâce à des expériences de copurification, la nature de ces interactions a été

caractérisées :YfgL et YfiO interagissent directement avec YaeT alors que NlpB s’associe au

complexe via YfiO (Malinverni et al., 2006). Dans le complexe

Omp85/YfiO/YfgL/NlpB/SmpA, il semble y avoir une copie de chaque protéine (Stenberg et

al., 2005). Récemment, des interactions avec ces différentes protéines et des protéines YaeT

tronquées de leur domaine POTRA ont permis de spécifier les interactions entre les différents

partenaires (Kim et al., 2007) (figure 12). En effet, il a été démontré que le domaine P5 (YaeT

30


345-351) permet la fixation de ces partenaires lipoprotéiques sauf YfgL qui interagit en plus

avec les domaines P2, P3 et P4 (Kim et al., 2007) (figure 12).

II.1.2) Reconnaissance des OMPs

II.1.2.1) Motifs de reconnaissance

L’insertion de Omp85 dans des membranes lipidiques conduit à la formation d’un canal

à conductance variable (Robert et al., 2006; Stegmeier and Andersen, 2006). Cette propriété a

été utilisée pour étudier les interactions entre Omp85 et les OMPs. En effet, l’addition

d’OMPs non repliées augmente la conductance du canal. Il y a donc une interaction directe

entre Omp85 et les OMPs (Robert et al., 2006).

La reconnaissance des substrats par Omp85 se fait au niveau d’un motif localisé au

niveau de la partie C-terminale des OMPs (Robert et al., 2006). Cette dernière est essentielle

pour le bon assemblage des OMPs dans la membrane (Struyve et al., 1991). Ce motif consiste

en des résidus hydrophobes :

- en dernière position de la partie C-terminale (Phénylalanine),

- en position -3 de la partie C-terminale (préférentiellement Tyrosine),

- et en position -5, -7 et -9 de la partie C-terminale (résidus hydrophobes).

Ce même motif permet aussi une interaction avec le domaine PDZ de DegS lorsqu’il y a

une accumulation d’OMPs non repliées dans le périplasme ce qui induit une réponse à ce

stress via RpoE (Walsh et al., 2003) (figure 11). Par contre, les OMPs de N. meningitidis

exprimées dans E. coli ne montrent pas d’interaction avec la protéine YaeT de E. coli (Robert

et al., 2006). De plus, la protéine YaeT d’E. coli ne complémente pas le mutant omp85 de N.

meningitidis. YaeT d’E. coli ne semble donc pas pouvoir reconnaître les OMPs de N.

meningitidis. Cette observation semble due à la présence en avant dernière position des OMPs

de N. meningitidis d’un résidu chargée positivement absent chez les OMPs d’E. coli. En effet,

la substitution de ce résidu positif (Lys) par une glutamine dans la porine PorA de N.

meningitidis provoque l’assemblage de cette porine dans les membranes de E. coli (Robert et

al., 2006). Malgré une machinerie d’assemblage des OMPs bien conservée durant l’évolution,

ceci démontre une certaine spécificité de ces machineries dans la reconnaissance des OMPs.

La cristallisation des cinq domaines POTRA de YaeT et l’étude de leur interaction avec

des OMPs natives ont permis de révéler l’importance de ces domaines dans la reconnaissance

entre YaeT et les OMPs (figure 12). Par contre, ce n’est pas à chaque fois les mêmes

domaines POTRAs qui interagissent avec les OMPs. En effet, dans certain cas, c’est les

31


domaines P1 et P5 qui interagissent avec l’OMP alors que pour une autre OMP, il n’y a que le

domaine P5 (Kim et al., 2007; Knowles et al., 2008). La présence de ces cinq domaines

POTRAs dans le domaine N-terminal permet donc une certaine flexibilité pour recruter les

différentes OMPs (Kim et al., 2007; Knowles et al., 2008) (figure 12).

II.1.2.2) Rôle des feuillets β

Il faut noter que cette signature C-terminale des OMPs n’est pas absolument essentielle

pour leur insertion dans l’OM. En effet, si la surproduction d’OMPs d’une espèce dans une

autre espèce provoque la létalité de la bactérie hôte ; au contraire un faible niveau

d’expression peut provoquer un bon assemblage de ces OMPs (de Cock et al., 1997; White et

al., 1990). Des expériences de pulse-chase avec la porine PhoE montrent des structures

périplasmiques intermédiaires avant son insertion dans l’OM. La délétion du motif de

reconnaissance provoque les mêmes intermédiaires et une insertion de PhoE mais avec une

cinétique d’assemblage réduite (Jansen et al., 2000). Ces observations montrent qu’on peut

avoir un assemblage des OMPs en absence de motif C-terminal mais avec une cinétique

d’assemblage amoindrie (Robert et al., 2006). Ces OMPs sans signature C-terminale seraient

reconnues par un feuillet β présentant les mêmes caractéristiques en position interne. C’est le

cas d’OmpA composée d’un tonneau β au niveau de la partie N-terminale. C’est aussi le cas

de TolC et ses homologues qui sont constitués de 4 feuillets β et d’une hélice α périplasmique

(Werner et al., 2003). Son insertion dans l’OM est dépendant de Omp85/YaeT où les feuillets

β auraient un rôle dans cette reconnaissance (Koronakis et al., 2000; Werner and Misra,

2005).

Quand aux sécrétines, selon les cas, elles sont dépendantes d’Omp85/YaeT pour leur

insertion dans l’OM. En effet, il a été démontré que l’insertion de la sécrétine PilQ de N.

meningitidis est dépendante de YaeT au contraire de la sécrétine du système Pul (Collin et al.,

2007; Voulhoux et al., 2003; Voulhoux and Tommassen, 2004).

II.1.3) Modèle de biogénèse des OMPs

Après le passage de l’IM par la machinerie Sec, les OMPs sont immédiatement prises en

charge par la protéine périplasmique Skp pour éviter leur agrégation dans le périplasme (Qu et

al., 2007; Walton and Sousa, 2004) (figure 13). Ce complexe OMP/Skp est emmené vers le

complexe contenant Omp85/YaeT de l’OM. L'interaction entre ce complexe et l’OMP se fait

par l’intermédiaire de la signature C-terminale de l’OMP et la partie N-terminale

32


d’Omp85/YaeT contenant les domaines POTRAs (Kim et al., 2007; Knowles et al., 2008).

Cette interaction provoque la dissociation de Skp et le recrutement des protéines chaperonnes

SurA et DsbA permettant l’acquisition de la structure tridimensionnelle. De plus, cette

interaction provoque le changement conformationnel d’Omp85/YaeT permettant l’activation

du pore. Celui-ci permettra l’insertion des OMPs dans l’OM. Après dissociation des

oligomères d’Omp85/YaeT, les OMPs prendront leur position et leur structure finale (Bos et

al., 2007).

Les protéines accessoires YfgL, YfiO, NlpB et SmpA ont des rôles annexes dans la

biogenèse des OMPs. SmpA permettrait de stabiliser le système (Sklar et al., 2007) et les trois

autres seraient là pour la reconnaissance des OMPs indépendamment du motif C-terminal

reconnu par Omp85. Ces trois protéines auraient aussi un rôle dans le réarrangement du

peptidoglycane et dans l’insertion correcte des OMPs dans l’OM. YfgL coordonnerait

l’assemblage d’un type d’OMPs où le LPS jouerait un rôle important. Mais, le feed back du

σE empêche de confirmer le rôle de cette protéine et du LPS chez E. coli. L’absence de feed

back chez N. meningitidis permettra sûrement de préciser le rôle de ces protéines accessoires.

II.2) Les lipoprotéines

Les lipoprotéines s’ancrent à la membrane des bactéries par une N-acyl-

diacylglycerylcysteine. La plupart du temps, le passage de l’IM de ces protéines se fait par la

machinerie Sec. Cependant, il a été montré que la lipoprotéine de Shewanella oneidensis

DmsA passe l’IM par le système Tat (Gralnick et al., 2006). De plus, des analyses in silico

ont montré que de nombreuses autres lipoprotéines pourraient utiliser cette voie (Gimenez et

al., 2007). Après le passage de l’IM, l’enzyme Lgt transfert un diacylglycérol d’un

phosphatidylglycérol au groupement sulfide d’une cystéine se localisant à l’extrémité N-

terminale d’une lipoprotéine (Sankaran and Wu, 1994). Après le clivage de la séquence N-

terminale en position -1 par rapport à cette cystéine par la signal peptidase II LspA, l’enzyme

Lnt va acyler le groupe α- amino de la cystéine (Dev and Ray, 1984; Gupta et al., 1993). Ces

différentes réactions chimiques permettent l’acquisition d’une extrémité N-terminale lipidique

par les lipoprotéines.

Ces lipoprotéines pourront ensuite rester dans l’IM ou être acheminées vers l’OM. Le

choix entre ces deux destinations dépend des acides aminés se localisant à proximité de la

cystéine acylée (Terada et al., 2001). Ce signal est le plus souvent l’acide aminé se localisant

en position +2 de la protéine mature. La présence d’un aspartate à cette position provoque la

33


rétention de la protéine dans l’IM. Si ce signal est absent, les lipoprotéines sont acheminées à

l’OM par le système Lol. Dernièrement, il a été démontré que chez P. aeruginosa, un signal

composé d’une lysine et d’une sérine en position +3 et +4 provoque la prise en charge des

lipoprotéines contenant ce signal par le système Lol (Narita and Tokuda, 2007; Tanaka et al.,

2007).

Le système Lol se compose de 5 protéines (figure 14) :

- Un complexe de l’IM composé de LolE, LolC et d’un dimère LolD. Ce dernier

possède une activité ATPasique

- Une protéine périplasmique, LolA

- Une lipoprotéine ancrée à l’OM, LolB

Les lipoprotéines vont tout d’abord interagir avec le complexe hétérodimérique LolC/E.

Cette association provoque l’interaction entre l’ATP et l’homodimère de LolD. Ce dernier

hydrolyse l’ATP provoquant un changement conformationnel de LolC/E/lipoprotéine et

permet ainsi le transfert de la lipoprotéine à la protéine périplasmique LolA (Ito et al., 2006).

Ce néocomplexe se dirige alors vers le récepteur LolB de l’OM. L’interaction qui en résulte

provoque le transfert de la lipoprotéine à LolB par différence d’affinité. En effet, ces deux

protéines ont la particularité d’être composée d’une cavité hydrophobe permettant l’accueil de

la partie lipidique de la lipoprotéine : la cavité de LolA est constituée d’acides aminés

aromatiques alors que celle de LolB est composée de résidus leucine ou isoleucine. La cavité

de LolB possède ainsi une affinité plus forte pour la partie lipidique des lipoprotéines que la

cavité de LolA, permettant le recrutement de la lipoprotéine (Narita et al., 2004; Takeda et al.,

2003).

Chez E. coli, toutes les lipoprotéines de l’OM connues sont exposées à la face

périplasmique mais ce n’est pas le cas pour toutes les bactéries. Par exemple, les lipoprotéines

LbpB et TbpB de N. meningitidis sont exposées à la face externe de l’OM. Elles contiennent

respectivement une isoleucine et leucine en position +2 suggérant leur adressage à l’OM par

le système Lol (van Ulsen and Tommassen, 2006). Une fois accrochée à la membrane, le

mécanisme par lequel ces lipoprotéines traversent l’OM reste un mystère. Mais, la

translocation de certaines lipoprotéines à la face extracellulaire peut s’effectuer par les

systèmes de sécrétion de type II. C’est le cas de la pullulanase de Klebsiella oxytoca (Pugsley,

1993b). Cette protéine contient en +2 un aspartate provoquant son association avec l’IM. Son

acheminement à la surface de cette bactérie se fait par l’intermédiaire du T2SS Pul. En effet,

l’absence de ce système provoque la rétention de la lipoprotéine dans l’IM. Récemment, il a

été démontré qu’on avait certainement le même processus de translocation par le T2SS de S.

34


oneidensis pour les lipoprotéines DmsA, MrtC et OmcA (Gralnick et al., 2006; Shi et al.,

2008).

35


IIIIII LLeess ddiifffféérreennttss ssyyssttèèmmeess ddee ssééccrrééttiioonn cchheezz lleess bbaaccttéérriieess àà GGrraamm nnééggaattiiff

Les systèmes de sécrétion sont des nanomachineries des membranes permettant la

sécrétion de protéines et parfois d’ADN à l’extérieur de la bactérie. Pour le moment, il y a six

systèmes de sécrétion répertoriés. Ces systèmes peuvent être répartis en deux catégories selon

le nombre d’étapes nécessaire pour l’acheminement de la protéine sécrétée. En effet, la

sécrétion peut se faire en une seule étape (du cytoplasme au milieu extracellulaire) ou bien en

deux étapes (étape périplasmique). Les systèmes de sécrétion ayant cette caractéristique

peuvent être dépendants de Sec ou de Tat. A l’inverse, les systèmes de sécrétion qui

permettent le passage de molécules en une seule étape sont dits Sec-indépendants.

Récemment, on a remarqué le transport de protéines vers le milieu extracellulaire par

l’intermédiaire de vésicules issue de l’OM (Kuehn and Kesty, 2005). Ce relargage de

protéines serait une réponse aux stress environnementaux (McBroom and Kuehn, 2007). Mais

les caractéristiques de ce mécanisme ne sont pas encore connues. A cause de cela, ce système

de transport de protéines n’est pas considéré comme un système de sécrétion (Economou et

al., 2006).

III.1) Les systèmes sec indépendants

Les systèmes Sec indépendants sont donc les systèmes permettant la sécrétion de

protéines en une seule étape. Cette catégorie comporte deux systèmes de sécrétion :

- les systèmes de sécrétion de Type I (T1SS)

- les systèmes de sécrétion de Type III (T3SS)

Chacun de ces systèmes va être décrit ci-dessous.

III.1.1) La voie de sécrétion de type I

Les T1SS se composent de trois protéines permettant la sécrétion d’exoprotéines en

une seule étape (figure 15) :

- La protéine ABC (ATP Binding Cassette), le moteur du système se localise

au niveau de l’IM,

36


- La protéine MFP (Membrane Fusion Protein) est l’adaptateur entre l’OM et

l’IM

- La protéine OMP formant le pore de l’OM.

Les T1SS permettent la sécrétion de protéines de différentes tailles et fonctions. Par

exemple, ils sécrètent une α hémolysine (HlyA) chez E. coli, quatre metalloprotéases (PrtG,

PrtA, PrtB et PrtC) chez D. dadantii et un hemophore (HasA) chez Serratia marcescens. Le

signal de sécrétion se localise le plus souvent à l’extrémité C-terminale de la protéine

secrétée. Ce signal, qui est reconnu par la protéine ABC du système, n’est pas clivé lors du

passage du cytoplasme au milieu extracellulaire. Le fait que le signal de sécrétion de type I se

localise au niveau de la partie C-terminale de la protéine implique la synthèse complète de la

protéine avant sa sécrétion. Cela nécessite aussi le recrutement de chaperonnes empêchant

ainsi son agrégation et son repliement. Selon la protéine sécrétée, on aura une chaperonne

différente. Par exemple, pour HasA, c’est SecB qui est recrutée (Letoffe et al., 1994) alors

que pour HlyA, c’est GroEL (Holland et al., 2005). L’absence de ces chaperonnes provoque

l’accumulation de ces exoprotéines dans le cytoplasme.

Une fois la reconnaissance de l’exoprotéine effectuée, on a la formation d’une structure

stable entre les différents partenaires du système permettant la sécrétion des exo-protéines.

III.1.1.1) Le moteur du système : la protéine ABC

La protéine ABC se compose de deux domaines :

- Le domaine cytoplasmique NBD (Nucleotide binding Domain)

- Le domaine TMD (TransMembrane Domain) (Chang and Roth, 2001;

Locher et al., 2002)

Caractéristique des protéines ABC, le domaine NDB est très conservé dans l’évolution.

Celui-ci est le domaine catalytique permettant de fournir l’énergie nécessaire au système.

Contrairement aux domaines NBDs, les domaines TMDs des protéines ABC sont plus sujets à

l’évolution et permettraient ainsi la spécificité de la sécrétion. Ils sont constitués de 6 à 10

TMs (en hélice α) et permettraient l’ancrage de la protéine ABC à l’IM.

Les différentes études menées sur ces protéines ABC démontrent un fonctionnement en

homodimère. En effet, les deux TMDs forme un pore permettant ainsi le passage spécifique

de la protéine sécrétée grâce à l’énergie transduite des domaines NBD (Delepelaire, 2004;

Hanekop et al., 2006; Schmitt and Tampe, 2002) (figure 16).

37


III.1.1.2) Le MFP, la composante adaptatrice

La protéine MFP se compose d’un segment N-terminal cytoplasmique très court, suivi

d’un domaine transmembranaire permettant l’ancrage à l’IM et d’un large segment C-terminal

périplasmique (Dinh et al., 1994). Les MFPs, qui semblent se multimériser lors de la

translocation, permettent de conduire les protéines secrétées de la protéine ABC à la protéine

OMP. Mais, il existe apparemment deux fonctionnements différents pour la mise en place du

système: Has, Prt (Letoffe et al., 1996) et Hly (Pimenta et al., 2005).

Dans le système Has/Prt, le MFP ne semble pas interagir directement avec le substrat au

contraire du système Hly. L’interaction entre le substrat et le système Hly se ferait avec le

domaine N-terminal de HlyD (MFP du système) et serait déterminante pour la sécrétion. En

effet, cette partie cytoplasmique au même titre que la partie périplasmique de HlyD

participerait à la formation du complexe avec le recrutement de TolC, OMP de ce T1SS

(Pimenta et al., 2005).

III.1.1.3) Le pore dans la membrane externe : la protéine OMP

Le pore permettant le passage de l’OM est constituée d’une OMP. La plus

représentative est TolC qui est une protéine de 55 kDa. En 2000, sa cristallisation montre une

organisation en trimère ancré à l’OM par des feuillets β présentant un long domaine

périplasmique (figure 16). Cette structure forme un pore dans la membrane permettant le

passage de protéines allongées ayant acquis leur structure tridimensionnelle mais est

insuffisant pour de grosses protéines globulaires. La partie périplasmique a pour fonction

l’ouverture et la fermeture du pore (Koronakis et al., 2000).

A part d’être l’OMP pour les T1SSs, la protéine TolC joue un rôle dans différents

processus physiologiques comme par exemple l’efflux des drogues (RND Resistance

Nodulation Division) (Sharff et al., 2001). Cette polyvalence dans sa fonction provient de sa

capacité à lier différentes MFPs (Koronakis et al., 2000).

III.1.2) Le système de sécrétion de type III

L’archétype du système de sécrétion de type III est celui identifié chez Yersinia spp

permettant la sécrétion des protéines Yop et qui ressemble au système d’assemblage du

flagelle bactérien (Michiels et al., 1990). Ce système, qui ne se retrouve que chez les bactéries

à Gram négatif, a été identifié dans de nombreuses bactéries pathogènes animales ou

38


phytopathogènes. Dans ces nombreux cas, le T3SS est crucial pour la virulence de celles-ci

(Troisfontaines and Cornelis, 2005).

Ce système de sécrétion se compose d’une vingtaine de protéines formant une

seringue permettant l’injection de protéines du cytoplasme de la bactérie directement dans la

cellule de l’hôte infecté d’où son nom d’injectosome (figure 17). Les différents travaux de

structure réalisés sur ce système montrent une organisation en deux parties : le corps basal et

son prolongement qui selon les cas prend différents noms (filament, pilus ou aiguille).

III.1.2.1) le corps basal

Le corps basal se constitue de trois parties interconnectées (figure 17) :

- Un disque protéique, localisé au niveau de l’OM, résultant de l’oligomérisation

d’une protéine intégrale de l’OM (YscC chez Yersinia spp). Celle-ci forme un pore

et se classe dans la famille des sécrétines permettant la sécrétion de macromolécules

(Blocker et al., 2001; Koster et al., 1997; Tamano et al., 2000).

- Un autre disque protéique qui résulte de la multimérisation d’une protéine ancrée de

l’IM traversant le peptidoglycane (YscJ chez Yersinia spp) (Yip et al., 2005). Ce

disque permet un lien entre l’IM et l’OM en formant un pore (Yip et al., 2005).

- Une plateforme protéique, formée de protéines de la famille YscQ. Cette plateforme,

en interaction avec le cytoplasme et l’IM, est en association avec l’ATPase de la

plateforme (YscN chez Yersinia). L’hydrolyse de l’ATP par l’ATPase permet de

fournir de l’énergie à la sécrétion. Cette plateforme aurait aussi un rôle à jouer dans

la reconnaissance des effecteurs (Yip et al., 2005).

C’est sur ce corps basal que repose le prolongement extracellulaire.

III.1.2.2) le prolongement extracellulaire

Le prolongement extracellulaire permet le transport des effecteurs vers le cytoplasme

de la cellule cible. Ce prolongement est formé par l’assemblage hélicoïdal d’une petite

protéine de 9kDa (Cordes et al., 2003). Des études de phylogénie démontre que ces

injectosomes sont bien conservés durant l’évolution et qu’ils ont été acquis par transfert

horizontal (Troisfontaines and Cornelis, 2005). La comparaison entre ces analyses

phylogénétiques et la structure de ces prolongements extracellulaires montrent aussi qu’on

peut diviser les injectosomes en trois grandes familles et que selon la famille, on appellera les

prolongements de manières différentes (figure 17) :

39


- Famille Ysc de Yersinia spp comprenant les T3SS de P. aeruginosa et Aeromonas

salmonicida. Le prolongement s’appelle une aiguille. Celle-ci fait entre 40 et 80 nm

de long et à un diamètre interne de 7 nm (Hoiczyk and Blobel, 2001; Kubori et al.,

2000).

- Famille regroupant les T3SS des E. coli enteropathogènes (EPEC et EHEC) et de

Salmonella typhimurium où le prolongement s’appelle un filament. Le filament est

d’une longueur de plus de 600 nm et d’un diamètre interne de 12 nm possédant une

certaine flexibilité (Daniell et al., 2001).

- Famille des Hrp qu’on retrouve seulement chez les bactéries phytopathogènes. Le

prolongement cellulaire se dénomme pilus et atteint plusieurs µm de long avec un

diamètre interne de 6-8 nm (He and Jin, 2003).

Ces différences structurales entre les différents prolongements seraient dues à la

difficulté d’accès de la bactérie à la cellule hôte. En effet, il faut un prolongement assez long

et flexible pour les EPECs et les bactéries phytopathogènes pour traverser respectivement la

paroi des cellules épithéliales de l’intestin (mucus) et la paroi des cellules végétales.

On peut aussi retrouvé deux T3SS de différentes familles dans la même bactérie mais

ayant des fonctions différentes (SPI et SPII de S. typhimurium) (Zhou and Galan, 2001).

III.1.2.3) Le pore de translocation

Lorsque la bactérie entre en contact avec la cellule cible, la mise en place du pore de

translocation au niveau de la membrane plasmique des cellules cibles s’initie (Neyt and

Cornelis, 1999) (figure 17-18). L’assemblage de ce pore requiert des protéines appelées

translocateurs qui sont en général au nombre de trois (YopB, YopD et LcrV chez Yersinia

spp ; IpaB, IpaC et IpaD chez Shigella spp). Deux de ces translocateurs sont hydrophobes

(YopB, YopD et IpaB, IpaC) et permettent la mise en place d’un pore dans des conditions in

vitro (Faudry et al., 2006). Dans des conditions in vivo, la mise en place du pore au niveau de

la membrane des cellules hôtes nécessite le troisième translocateur (LcrV et IpaD) (Marenne

et al., 2003). Celui-ci, qui est hydrophile, se retrouve localisé à l’interface entre la fin de

l’aiguille et la membrane de la cellule cible où se forme le pore formé par les deux autres

translocateurs (Espina et al., 2006; Mueller et al., 2005). Récemment, des analyses en

microscopie électronique et des études structurales ont permis de montrer la physionomie de

ce pore de translocation (Broz et al., 2007; Mueller et al., 2008) (figure 18).

40


III.1.2.4) Les effecteurs, protéines secrétées par le système de sécrétion de type III

Les protéines sécrétées par les T3SSs sont appelées effecteurs. En effet, les protéines

secrétées par ces systèmes vont intervenir dans l’invasion par la bactérie de la cellule hôte ou

dans la multiplication et la persistance de la bactérie au sein de la cellule hôte.

Dans le cas de l’invasion, l’exemple le plus connu est la protéine Tir injectée par le

T3SS des EPECs ou EHECs. Cette protéine permet l’attachement de la bactérie à son hôte et

son internalisation grâce à une perturbation du cytosquelette de la cellule hôte.

Pour la persistance dans la cellule hôte, on peut prendre comme exemple les différents

effecteurs sécrétés par les T3SS de Salmonella spp. Ces différentes protéines permettent

d’interférer dans le processus de maturation des phagosomes de la cellule hôte empêchant

ainsi la destruction de l’envahisseur (Coburn et al., 2007).

La reconnaissance des effecteurs par le T3SS est encore mal connue. Une hypothèse

suggère que des chaperonnes spécifiques reconnaîtraient les 20 premiers acides aminés de

l’effecteur et l’emmèneraient au T3SS pour y être sécrété (Lloyd et al., 2001). L’autre

hypothèse suggère que le signal de sécrétion réside dans la partie 5’ de l’ARNm permettant au

complexe ribosome/ARNm d’être recruté par le T3SS et ainsi d’avoir un couplage temporel

entre la traduction et la sécrétion (Anderson and Schneewind, 1997; Ramamurthi and

Schneewind, 2005).

III.2) Les systèmes dépendants de Sec ou Tat

La deuxième catégorie des systèmes de sécrétion font intervenir les systèmes Sec ou

Tat pour le passage de l’IM. On retrouve dans cette catégorie :

- les systèmes de sécrétion de type II (T2SS)

- les systèmes de sécrétion de type IV (T4SS)

- les systèmes de sécrétion de type V (AT)

- les systèmes de sécrétion de type VI (T6SS)

Dans le cas du système de sécrétion de type IV, il apparaît que le transport de certaines

protéines ou/et protéine/ADN par ce système peut se faire en seule étape. Dans ce manuscrit,

ce système de sécrétion est classé dans les systèmes dépendants de Sec.

Les différentes recherches entreprises sur le système VI ne permettent pas de conclure

si la sécrétion a lieu en une ou deux étapes. Comme ce système a des origines communes avec

celui du système IV, nous avons décidé de développer le système VI dans la catégorie des

Secs dépendants.

41


Mon sujet de thèse portant sur un système de sécrétion de type II, sa description sera

plus détaillée.

III.2.1) Le système de sécrétion de type IV

Chez les bactéries à Gram négatif, les T4SS servent au transport de protéines mais

aussi au transport de complexes macromoléculaires qui sont composés de protéines seules ou

bien associées à de l’ADN. On peut ainsi diviser les T4SS en trois familles (figure 19) :

- Les systèmes de conjugaison permettant le transfert d’ADN vers une cellule

réceptrice cible en établissant un contact direct (conjugaison). Le système le mieux

caractérisé est le système VirB d’Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie

phytopathogène est responsable de la formation de tumeurs du collet. Cette

prolifération anormale des tissus de la plante est dû au transfert d’un fragment

d’ADN (T-ADN : ADN oncogène porté par le plasmide Ti) qui s’intègre au génome

de la cellule hôte (Christie et al., 2005).

- Les systèmes de transport de protéines qui exportent les molécules effectrices du

pathogène vers les cellules eucaryotes durant l’infection. La plupart de ces T4SS

injectent leur substrat directement dans le cytosol de la cellule eucaryote comme

pour les T3SS. On retrouve dans cette catégorie le système Cag de Helicobacter

pylori ou le système Dot/Icm de L. pneumophila (Segal et al., 1998).

- Les systèmes dites de « compétence » assurant l’échange d’ADN avec le milieu

extracellulaire. On retrouve le système ComB de H. pylori (Hofreuter et al., 2001).

Récemment, une autre famille de T4SS a été découverte qui permettrait le transfert d’îlot de

pathogénicité entre les bactéries (Juhas et al., 2007; Juhas et al., 2008).

Cette sécrétion par les T4SS peut être dépendante du système Sec avec une étape

périplasmique mais peut aussi se faire en une seule étape (du cytoplasme au milieu

extracellulaire ou dans le cytosol de la cellule cible).

Malgré leurs différentes fonctions, il existe une forte homologie des T4SS au niveau de

leurs constituants.

42


III.2.1.1) La structure des T4SS

Les T4SS sont des complexes multiprotéiques formant un canal à travers la paroi des

bactéries. Les analyses structurales, notamment chez A. tumefaciens ont permis d’identifier

trois groupes de protéines VirB (Christie et al., 2005) (figure 20):

- Le pilus se localisant au niveau de la surface de la bactérie est composé de VirB2 et

VirB5.

- Le canal transmembranaire composé d’une dizaine de protéines VirB. VirB1 serait

une transglycolase permettant une lyse localisée de la paroi bactérienne pour

permettre la mise en place du T4SS. VirB7 et VirB9 formeraient un hétérodimère

localisé au niveau de l’OM. VirB8, VirB10 sont des protéines de l’IM avec un large

segment périplasmique. Ce complexe membranaire qui assure le passage des

substrats à travers la membrane serait stabilisé par la protéine de l’IM VirB6.

- Les 3 ATPase VirB4, VirB11 et VirD4 permettant l’apport d’énergie nécessaire à la

sécrétion de ces substrats. Elles sont localisées du coté cytoplasmique de l’IM.

III.2.1.2) Le fonctionnement des T4SS

Le chemin et les différents partenaires de la translocation du T-DNA ont été

récemment décrits en utilisant la technique ADN/immunoprécipitation permettant d’établir

une chronologie du processus de sécrétion (Cascales and Christie, 2004) (figure 20).

On a tout d’abord un recrutement du T-ADN par la protéine chaperonne VirD2 qui

protègerait l’ADN. Puis ce complexe est pris en charge par VirD4 qui serait responsable de la

reconnaissance des différents substrats de T4SS (T-ADN et les protéines effectrices VirE2,

VirE3, VirF et VirD5). Cette reconnaissance se ferait par la partie C-terminale des protéines

effectrices. Après la conduite vers le T4SS, VirD4 transmet son chargement à la NTPase

VirB11. Ce complexe remonte ensuite vers les protéines de l’IM VirB6 et VirB10 et enfin

vers les protéines de l’OM VirB9 et VirB7 (Cascales and Christie, 2004). Récemment, il a été

montré que les protéines formant le pilus, VirB2 et VirB5 avaient des propriétés d’adhésine et

que VirB5 était localisé à l’extrémité du pilus. Ces observations suggèrent une interaction

entre ces protéines et les composants des matrices extracellulaires des cellules hôtes (Aly and

Baron, 2007; Backert et al., 2008).

43


III.2.1.3) Les effecteurs

Selon l’espèce et les substrats transportés, les T4SS ont diverses fonctions dans la

virulence. Chez A. tumefaciens, une fois que le T-ADN et les effecteurs se retrouvent dans le

cytosol de la cellule hôte, VirD2 et VirE2 protègent le T-DNA (Duckely et al., 2005). Elles

recrutent aussi les protéines PP2C, VIP1, VIP2, Ran GTPase grâce à leur signal de

reconnaissance Nucleus/import (Tzfira and Citovsky, 2002). Grâce à ces protéines, le T-ADN

est transporté jusqu’au noyau de la cellule où il s’intègre au génome. Les autres effecteurs

n’ont pas encore de fonction connue.

Chez H. pylori, après la translocation de CagA (en une seule étape) dans le cytosol des

cellules épithéliales gastriques, cette protéine interfère avec le cytosquelette de la cellule hôte

(actine) provoquant l’induction d’une réponse inflammatoire et la désorganisation du tissu

gastrique (Bagnoli et al., 2005; Brandt et al., 2005; Selbach et al., 2003).

Chez B. pertussis, la toxine Ptx se pentamérise dans le périplasme une fois l’IM passée

via le système Sec. Une fois active, elle est secrétée par le T4SS (sécrétion en deux étapes)

dans le milieu. Comme la plupart des exotoxines, la Ptx se compose de deux sous unités : une

enzymatique et l’autre régulatrice. C’est la sous unité enzymatique qui est transférée dans le

cytosol de la cellule interférant avec l’adenylate cyclase. Cela provoque un dérèglement des

signaux de transduction (Burns, 2003; Farizo et al., 2000).

Chez Legionella sp, le système Dot/Icm permet le transport d’une dizaine d’effecteurs

permettant à la bactérie de survivre à l’intérieur des macrophages (Segal et al., 1998), ou bien

son relargage dans les amibes (Chen et al., 2004).

III.2.2) Le système de sécrétion de type VI

Ce système de sécrétion de type VI a été proposé par Pukatzki et ses collaborateurs

après la découverte du système Vas chez Vibrio cholerae (Pukatzki et al., 2006). Ce dernier

est responsable de la sécrétion des protéines Hcp (Hemolysin-Coregulated Protein) et est codé

par les gènes vas. Un de ces gènes, vasK a une forte similarité avec le gène icmF qui est un

composant du T4SS de L. pneumophila (Das and Chaudhuri, 2003). Des homologues du gène

icmF sont retrouvés chez de nombreuses espèces bactériennes et la région encadrant les

homologues d’icmF a été désignée par le sigle IAHP (IcmF Associated Homologous Protein).

Au départ, il semblait que les gènes vas codent un T4SS mais les autres éléments nécessaires

à la formation d'un T4SS étaient absents du génome de V. cholerae. Ce système n’ayant

44


aucune similarité avec les autres systèmes de sécrétion, les auteurs ont donc fait du système

Vas un nouveau système de sécrétion (Pukatzki et al., 2006).

Chez P. aeruginosa, trois clusters IAHP ont été découverts et ont été appelés clusters

HSI (Hcp Secretion Island) (Das and Chaudhuri, 2003; Mougous et al., 2006). Un de ces

locus, HSI-I, est responsable de la sécrétion de la protéine Hcp1 puisque l’inactivation d’un

des gènes du loci HSI-I provoque la non sécrétion de cette protéine (Mougous et al., 2006).

Ceci nous indique qu’un des T6SS de P. aeruginosa est donc fonctionnel. De plus, cela

confirme l’hypothèse selon laquelle les protéines de la famille Hcp seraient sécrétées par les

T6SSs (Mougous et al., 2006; Pukatzki et al., 2006).

La découverte de ce système étant récente, les données sur la composition, son mode

d’assemblage et sa topologie sont très pauvres. A cause de cela, les hypothèses sur les

caractéristiques des T6SSs sont très variées et peuvent se contredire d’un travail à un autre.

Par exemple, le nombre d’étape de la sécrétion des substrats des T6SSs reste obscur. En effet,

il semble que la sécrétion de Hcp chez V. cholerae se fait en une seule étape (directement

dans le cytoplasme de la cellule cible) et sans clivage puisque les Hcp sécrétées à l’extérieur

semblent intactes. (Pukatzki et al., 2006; Wu et al., 2008). Mais, chez Ralstonia

leguminosarum, les protéines RbsB qui sont sécrétées par le T6SS, possèdent une séquence

signal Sec ou Tat prédisant un passage périplasmique. De plus, Mougous et ses collaborateurs

ont montré une accumulation de Hcp dans le périplasme en absence de PpkA, une protéine

Ser/Thr kinase indispensable au fonctionnement du T6SS de P. aeruginosa (Mougous et al.,

2007). Il pourrait donc y avoir une étape périplasmique avec l’intervention des machineries de

translocation de l’IM (Sec ou Tat).

Le nombre de composant reste aussi un mystère. Tout le monde s’accorde à dire que les

T6SSs seraient composées de 12 à 20 protéines selon les espèces. Chez V. cholerae, le cluster

T6SS comprend 18 gènes au total : 4 semblent être des composants structuraux, 2 des

molécules effectrices, une serait une chaperonne (Pukatzki et al., 2006) et la fonction des

autres reste inconnue. L’assemblage du T6SS aurait besoin de protéines Ser/Thr kinase. En

effet, la localisation de ClpV1 de P. aeruginosa, composant essentiel des T6SS, dans un

mutant ppkA (gène codant une protéine Ser/Thr kinase) est anormale pas rapport au sauvage

(Mougous et al., 2007).

Les deux types de molécules effectrices des T6SSs seraient les protéines Hcp et les

protéines Vgr (Pukatzki et al., 2006). Mais récemment, il a été proposé que ces molécules

effectrices puissent bien être des composants des T6SS. En effet, les protéines Hcp

formeraient un conduit dans la membrane de la cellule cible pour permettre le passage

45


d’effecteurs (figure 21) (Mougous et al., 2006) et la sécrétion de Hcp serait dépendante de

vgr1 et vgr2 chez V. cholerae (Pukatzki et al., 2007). Ces protéines Vgr se localiseraient au

niveau de l’OM avec une partie C-terminale extracellulaire. Cette partie possède les

caractéristiques de protéines interagissant avec les composants des matrices extracellulaires

tels que la fibronectine, l’actine ou la tropomyosine. Ces protéines formeraient un pore au

niveau de l’OM et interagiraient avec la matrice extracellulaire pour la mise en place du pore

formé par les protéines Hcp (Pukatzki et al., 2007). Ces résultats suggèrent que les systèmes

T6SSs sont dépendants du contact entre la bactérie et la cellule cible.

Le fonctionnement de ces T6SS semble avoir besoin d’énergie. Celle-ci serait fournie

par l’hydrolyse de l’ATP d’un complexe homomérique associé à l’IM. En effet, la protéine

que code le gène clpV1 dans le locus HSI-I est une ATPase et la mutation du résidu d'acide

glutamique à l'intérieur du motif B de Walker (domaine catalytique des ATPases) provoque

l’arrêt de la sécrétion de Hcp1 (Mougous et al., 2006).

Mais, malgré tous ces mystères, il est maintenant indéniable que les T6SSs sont

impliqués dans la virulence de plusieurs bactéries pathogènes. En effet, ces systèmes sont

impliqués dans la virulence d’A. tumefaciens car son absence provoque une baisse de 20% des

tumeurs du collet (Wu et al., 2008) et dans la virulence de Burkholderia mallei où l’absence

du T6SS provoque l’avirulence de cette bactérie (Schell et al., 2007). Ce système est aussi

impliqué dans la virulence de Pectobacterium atrosepticum (Mattinen et al., 2008).

III.2.3) Le système de sécrétion de type V

Le système de sécrétion de type V est une famille de systèmes de sécrétion. On y

retrouve les autotransporteurs (Va ou AT-1), les systèmes à deux partenaires (Vb) et plus

récemment le système chaperonne-usher (Vc ou AT-2) (Desvaux et al., 2004a; Henderson et

al., 2004). Au départ, tous ces systèmes étaient regroupés dans une même famille notamment

à cause de la structure et un mode de biogénèse similaires des différentes protéines de ces

systèmes. Mais l’étude de la topologie de ces systèmes a révélé des différences majeures.

Elles ont donc été séparées (Jacob-Dubuisson et al., 2000). Ces trois systèmes ont aussi la

particularité de fonctionner en absence d’ATP, ce qui est tout a fait atypique par rapport aux

autres systèmes de sécrétion connus (Thanassi et al., 2005).

46


III.2.3.1) Les autotransporteurs

Comme leur nom l’indique, les protéines secrétées par cette voie contiennent dans leur

séquence toute l’information nécessaire pour être exportées. Cette séquence primaire peut être

divisée en trois parties distinctes : la séquence signal, le domaine passager et l’unité de

translocation (Henderson et al., 2004). Chaque partie aura un rôle à jouer dans

l’acheminement de l’AT dans le milieu extracellulaire (figure 22).

a) Implication de la séquence signal dans le passage de la membrane interne

Le passage de l’IM se fait par le système Sec grâce à la présence à l’extrémité N-

terminale de l’AT, d’une séquence signal. Une fois l’AT transloqué, elle est clivée par une

signal peptidase. Cette séquence N-terminale est la plupart du temps reconnu par SecB mais il

a démontré que Hpb (une Hémoglobine protéase d’E. coli) était recrutée par la protéine SRP.

Le choix entre les deux voies dépendrait de la longueur de la séquence signal (Sijbrandi et al.,

2003).

b) Le domaine passager, la partie sécrétée

Après la séquence signal se trouve le domaine passager qui correspond généralement à

la partie de l'AT qui est sécrétée. Les domaines passagers sont de taille variable (ils peuvent

atteindre 3000 résidus) et sont impliquées dans la virulence des bactéries. En effet, les

domaines passagers peuvent avoir des activités enzymatiques (protéase, lipase et estérase),

intervenir dans l'adhésion aux cellules eucaryotes ou encore la formation de biofilms

(Desvaux et al., 2004b; Henderson et al., 1998; Jacob-Dubuisson et al., 2004). A l'extrémité

C-terminale de certains domaines passagers se trouve une région conservée qui joue le rôle de

chaperonne (Oliver et al., 2003b). Cette région est indispensable pour le repliement du

domaine passager en sa structure tertiaire.

c) Translocation de la membrane externe par l’intermédiaire de l’unité de

translocation

L’unité de translocation consiste en une courte région linker structurée en hélice α et

en un domaine β. Cette région de 250 à 300 résidus adopte une conformation tertiaire en

tonneau β lors de son ancrage dans l’OM. L’ancrage du domaine β est dépendant d’Omp85.

Des analyses bioinformatiques suggère que cet ancrage se fait par 14 brins β constitué de 9 à

12 résidus. Récemment, la cristallisation de NalP, une AT de N. meningitidis montre 12 brins

47


β formant un pore hydrophile (Khalid and Sansom, 2006; van Ulsen et al., 2003) (figure 23).

Ce pore d’un diamètre interne de 19Å pour VacA de H. pylori va permettre le passage du

domaine passager (Dautin et al., 2007; Dautin and Bernstein, 2007; Gangwer et al., 2007)

(figure 23). L’AT prend alors sa forme tridimensionnelle au niveau de la surface de la bactérie

grâce notamment à sa chaperonne intramoléculaire (Oliver et al., 2003a; Oliver et al., 2003b).

Une fois l’OM passée, on peut avoir clivage ou non entre le domaine passager et

l’unité de translocation. S’il y clivage, la protéine peut soit diffuser dans le milieu (EspP) ou

bien rester associée à la membrane de façon non-covalente (pertactine) (figure 23). Le clivage

de EspP est tout à fait atypique puisqu’elle possède une activité protéase au niveau du

domaine β qui coupe la protéine lors de sa translocation (Barnard et al., 2007). L’absence de

clivage aboutit à la présence de protéines qui restent ancrées à l’OM.

III.2.3.2) Les systèmes à deux partenaires

Contrairement aux autotransporteurs, les systèmes à deux partenaires (TPS)

synthétisent deux protéines différentes dont l’une correspond au domaine passager

(exoprotéines) et l’autre au domaine Β (domaine transporteur). Respectivement, on leur donne

le nom TpsA et TpsB. Comme pour les autotransporteurs, les deux protéines possèdent une

séquence signal permettant le passage de l’IM par le système Sec. Ensuite, l’exoprotéine

TpsA est secrétée à travers l’OM par le pore formé par TpsB. Un des TPS les plus étudiés est

l’adhésine FHA (TpsA) de B. pertussis qui est sécrétée à travers le pore formé par FhaC

(TpsB).

L’exoprotéine FHA se compose d’un domaine TPS à l’extrémité N-terminale d’une

longueur de 250 résidus. Ce domaine TPS est très conservé chez les TpsA et son absence ou

sa mutation provoque le disfonctionnement de l’autotransporteur (Clantin et al., 2004).

Le transporteur FhaC se compose de deux parties :

- La partie N-terminale de FhaC qui comprend 200 résidus est localisée dans

le périplasme

- La partie C-terminale comprenant les 350 résidus restant permet la

formation du pore dans l’OM (Meli et al., 2006).

La résolution récente de la structure de FhaC a permis de démontrer une architecture en

16 brins β et la présence de deux domaines POTRA à l’extrémité N-terminale permettant

l’interaction avec l’adhésine FHA (Clantin et al., 2007) (figure 24). La présence de ces

48


domaines POTRA a permis de classer FhaC dans la super-famille Omp85 (Clantin et al.,

2007).

De récentes expériences chez Haemophilus influenzae ont montré la dimérisation du

TpsB (HMW1B) (Li et al., 2007). De plus, la formation de ce pore serait indépendante de la

partie N-terminale du TpsB mais celle-ci est indispensable pour le fonctionnement du pore

(Duret et al., 2008). En effet, la sécrétion par les TPS implique obligatoirement une

reconnaissance spécifique entre TpsA et TpsB. Dans la partie N-terminale de TpsA se trouve

le domaine TPS qui interagit spécifiquement avec TpsB pour initier le transfert à travers le

pore de l’OM (Jacob-Dubuisson et al., 2001) (figure 24). Des interactions entre FhaC et le

domaine TPS de différents mutants FHA ont permis d'identifier des acides aminés intervenant

dans l'interaction domaine TPS/FhaC qu’on retrouve chez les autres TpsA (Hodak et al.,

2006).

Le mécanisme de translocation de la FHA par FhaC est le suivant (figure 24) : Le

domaine TPS de FHA interagit avec le domaine POTRA1 de FhaC. Cela induit un

changement conformationnel de la boucle L6 de FhaC et la translocation s’initie. Durant la

translocation, FHA prend au fur et à mesure sa conformation tertiaire en hélice de feuillets β.

Après la translocation de la partie C-terminale de FHA, le domaine TPS se dissocie du

domaine POTRA 1 et est transloqué à son tour. Il prendra ainsi sa structure en feuillet β

(Clantin et al., 2007; Jacob-Dubuisson et al., 2001; Jacob-Dubuisson et al., 2004). Une fois à

la surface, la protéase SphB1 clive FhaB à l'extrémité C-terminale de FhaB pour donner la

protéine mature FHA de 232 kDa (Coutte et al., 2001). Dans ce modèle c’est la partie N-

terminale de FHA qui est transloquée la première. Mais récemment, il a été proposé que la

partie N-terminale soit transférée en dernier. En effet, il a été démontré dans le mutant sphB1

de B. pertussis que cette protéase n'est pas responsable de la libération de FHA à la surface de

la cellule mais générait une nouvelle extrémité C-terminale requise pour l'adhésion aux

cellules eucaryotes. Les expériences de protéolyse suggèrent que l'extrémité C-terminale de

FHA soit exposée à la surface de la cellule. (Mazar and Cotter, 2006).

III.2.3.3) La voie chaperon usher

Le système Vc (chaperons-usher) est constitué d'une protéine chaperonne périplasmique

et d'une protéine intégrale de l’OM appelée usher. Ce système est dédié à la sécrétion et

l'assemblage d'appendices de surface tels que les pili ou fimbriae mais interviendrait aussi

dans la formation de la capsule bactérienne (Thanassi et al., 2005). Les pili de type I (voie

49


Fim) et P (voie Pap) synthétisés par les souches d'E. coli sont les mieux caractérisés à ce jour.

Les pili P sont formés par les protéines PapA/K/E/F/G et les pili de type I par les protéines

FimA/F/G/H.

Les sous-unités constitutives des pili I sont transloquées par le système Sec pour le

passage de l’IM. Une fois dans le périplasme, chaque sous unité interagit avec la protéine

chaperonne FimC pour former un complexe hétéromérique (P5 pocket). FimC permet la

stabilisation du complexe, le repliement correct de chaque protéine, empêche un auto-

assemblage précoce des différentes sous unités dans le périplasme et enfin dirige le P5 pocket

vers le dimère de FimD (Remaut et al., 2008) (figure 25). FimD forme un large pore de 24

brins β permettant la translocation des sous unités FimA/K/E/F/G et par extension,

PapA/F/G/H via la voie PapC.

Il a été démontré que la sécrétion des sous-unités des pili I fait intervenir simultanément

deux hexamères de FimD : le premier qu’on nomme usher2 (plug closed) va ainsi recruter le

complexe P5 pocket par sa partie N-terminale (N2). Le usher2 va transférer le complexe

FimA/FimC vers la partie N-terminale (N1) de l’autre FimD qu’on nomme usher1 (plug

open). Ceci provoquera la translocation de FimA et l’assemblage du pilus. Cet assemblage

commence par la translocation de FimH, FimG et FimF qui forment une adhésine qui va

permettre l'interaction avec les cellules eucaryotes. L’élongation du pilus se fait par

l’oligomérisation de FimA (Remaut et al., 2008) (figure 25).

Ce processus de translocation est le même pour les pili P (Daniels and Normark, 2008;

Remaut et al., 2008).

La voie Chaperon Usher joue un rôle important dans la pathogenèse puisqu'elle permet

la synthèse de structures de surface qui interviennent dans l'adhésion aux cellules eucaryotes

et dans la formation de biofilms au cours de l'infection (Thanassi et al., 2005).

III.2.4) Le système de sécrétion de type II

Le système de sécrétion de type II ou T2SS (Type 2 Secretion System) a été identifié

pour la première fois chez la bactérie K. oxytoca (d'Enfert et al., 1987). Le clonage chez E.

coli d’un fragment d’ADN de K. oxytoca a permis de mettre en évidence les 15 gènes pul

nécessaires à la sécrétion de la pullulanase (PulA). Depuis, ce système a également été

identifié chez de nombreuses bactéries à Gram négatif pathogènes des animaux ou des

végétaux.

50


Le T2SS permet une sécrétion en deux étapes. Il commence tout d’abord par une

exportation des exo-protéines dans le périplasme par le système Sec pour la grande majorité

d’entre elles ou par le système Tat (Voulhoux et al., 2001). Une fois dans l’espace

périplasmique, les protéines acquièrent leur conformation tridimensionnelle (si l’exportation

se fait par le système Sec). L’acquisition de cette structure est indispensable pour qu’elles

soient recrutées par la machinerie de sécrétion de type II. Enfin, ces exoprotéines sont

secrétées à l’extérieur de la bactérie.

Les T2SSs sont composés de trois sous assemblages (Johnson et al., 2006) :

- Un complexe de l’OM

- Un pseudopilus périplasmique

- Une plateforme ancrée à l’IM

Selon l’espèce considérée, le T2SS est constitué de 12 à 16 protéines (figure 26).

Le T2SS de chaque espèce bactérienne porte un nom qui lui est propre constitué de

trois lettres. Les gènes homologues au sein des différents sécrétons sont identifiés par les

mêmes dernières lettres de A à O et S (par exemple outD d’D. dadantii est l’homologue de

pulD de K. oxytoca). Pseudomonas aeruginosa est l’exception à cette nomenclature car les

gènes de son sécréton ont été annotés de P à Z et A. Le sigle GSP pour General Secretory

Pathway a longtemps été utilisé pour faire référence à l’ensemble des T2SSs. Cependant dans

la littérature ce même sigle faisait également référence au système Sec (notamment chez les

bactéries à Gram positif) et aux systèmes de sécrétion de type IV et V (Desvaux et al., 2004c).

Dans ce manuscrit le sigle T2S (Type 2 Secretion) sera utilisé afin d’identifier les composants

homologues au T2SS et ainsi lever toute ambiguïté. Chez certaines espèces comme P.

aeruginosa et D. dadantii il a été identifié un deuxième T2SS (Ball et al., 2002; Glasner et al.,

en préparation). Le deuxième T2SS de P. aeruginosa (Hxc) permet la sécrétion de

phosphatase alcaline LapA qui n'est pas sécrétée par le système Xcp (premier système de

sécrétion de P. aeruginosa). Les deux systèmes de sécrétion ont donc des substrats qui leur

sont propres.

III.2.4.1) Les protéines des T2SSs

a) Le complexe de la membrane externe : T2S:D et T2S:S

Bien que les T2SS soient constitués d’une dizaine de protéines, il y en a seulement

deux, T2S:D et T2S:S, qui se trouvent localisées au niveau de l’OM. Ces deux protéines

51


interagiraient ensemble pour former le pore permettant le passage des exoprotéines à travers

l’OM.

1. La sécrétine T2S:D

T2S:D est une protéine d'environ 70 kDa qui fait partie de la famille des sécrétines

(Genin and Boucher, 1994). Ce sont des protéines de l’OM qui forment des oligomères dont

la stœchiométrie peut aller de 12 à 14 unités.

En plus du T2SS, les sécrétines sont retrouvées dans le T3SS, dans les systèmes de biogenèse

des pili de type IV et l’exportation des phages filamenteux (Genin and Boucher, 1994). Dans

ces différents systèmes, les sécrétines semblent avoir une fonction similaire, c'est-à-dire la

formation d’un canal dans l’OM permettant le transport de macromolécules. D’ailleurs il a été

démontré chez V. cholerae que la sécrétine EpsD intervient à la fois dans la sécrétion de la

toxine cholérique par le T2SS et dans le système d’exportation du phage CTXφ (Davis et al.,

2000).

Les sécrétines sont constituées de 2 ou 3 domaines (Chami et al., 2005; Nouwen et al.,

2000) (figure 27):

- le domaine N qui correspond à l'extrémité N-terminale,

- le domaine C

- le domaine S qui est le site de fixation de T2S:S et qui n'est présent que chez

certaines sécrétines à l’extrémité C-terminale.

Les domaines N et C sont parfois reliés par une longue région linker, comme par

exemple OutD d’D. dadantii. Par dichroïsme circulaire, Chami et ses collaborateurs (Chami et

al., 2005) ont proposé que seule une petite partie du domaine C soit intégrée dans l’OM alors

que le reste de ce domaine serait dans le périplasme. En effet, il n’y aurait que 27% de brins β

dans ce domaine C ce qui est faible pour une protéine intégrale de l’OM (Chami et al., 2005).

Ce domaine serait responsable de la multimérisation des protomères de T2S:D (Bitter et al.,

1998; Genin and Boucher, 1994) (figure 27).

Par la même méthode, les auteurs ont démontré que le domaine N a une structure en hélice α

complètement différente de celle du domaine C et qu’elle serait entièrement périplasmique

(Chami et al., 2005).

Les observations en microscopie électronique de différentes sécrétines montrent

qu’elles s’organisent toutes en oligomères de forme cylindrique (Bitter et al., 1998; Nouwen

et al., 1999; Opalka et al., 2003). A l’intérieur du cylindre, on distingue un pore de diamètre

variable mais suffisamment large pour le passage d’exo-protéines structurées. Ainsi XcpQ

52


(T2S:D de P. aeruginosa) et PulD forment des pores dont les diamètres internes sont de 95 Å

et 76 Å respectivement (Bitter et al., 1998; Nouwen et al., 1999).

Il semble évident que cette taille de pore suppose une ouverture et une fermeture

contrôlée pour éviter toute fuite de protéines. Mais, les mécanismes d’ouverture et de

fermeture du pore restent encore incompris. Les différentes études entreprises suggèrent des

variations dans le fonctionnement des sécrétines. Par exemple, la comparaison des résultats

obtenus lors des analyses en cryomicroscopie de PulD et de son domaine C montre que ce

dernier est responsable de l'occlusion du pore membranaire (Chami et al., 2005) (figure 27).

Au contraire, les expériences d’électrophysiologie menées sur PulD montrent que le pore est

fermé et aurait une ouverture régulée (Nouwen et al., 1999) et que c’est le domaine N qui

interviendrait dans l'obturation du pore en se repliant à l’intérieur de la cavité du coté

périplasmique (Nouwen et al., 2000). Chez les systèmes de piliation de type IV, la structure

de la sécrétine PilQ de la bactérie N. meningitidis montre que le pore est obstrué des deux

côtés (Collins et al., 2004).

Les facteurs d’ouverture du pore semblent être multiples grâce à des interactions

simultanées avec les éléments du T2SS et les exoprotéines. En effet, il a été démontré une

interaction entre exoprotéines et T2S:D (Shevchik et al., 1997). Mais cela ne semble pas être

une interaction suffisante pour provoquer l’ouverture du pore car l’addition de la pullulanase

au mélange liposome/PulD ne change pas la conductivité du canal (Nouwen et al., 1999).

Différentes analyses ont démontré des interactions entre la sécrétine et T2S:G (Lee et al.,

2005), T2S:C (Korotkov et al., 2006; Lee et al., 2000) et T2S:B (Ast et al., 2002; Condemine

and Shevchik, 2000).

D’autre part, l’énergie est indispensable pour permettre l’ouverture de ce pore (Possot et al.,

1997; Wong and Buckley, 1989). Cette énergie serait fournie par l’hydrolyse de l’ATP par la

T2S:E.

L’insertion des sécrétines dans l’OM peut être dépendante ou non de Omp85/YaeT. En

effet, cette dernière est indispensable pour l’insertion dans le OM et la multimérisation de la

sécrétine PilQ de N. meningitidis (Voulhoux et al., 2003). Mais de récentes études montrent

que l’insertion et l’oligomérisation de PulD se fait indépendamment de YaeT (Collin et al.,

2007). Dans certains cas, l’insertion du T2S :D dans l’OM nécessite la pilotine T2S:S (Hardie

et al., 1996; Shevchik et al., 1997). En effet, l’absence de PulS chez K. oxytoca provoque la

rétention de PulD dans l’IM (Hardie et al., 1996). De plus, il semble que l’insertion de PulD

ne ferait intervenir aucun autre facteur protéique (Guilvout et al., 2008).

53


2. La protéine pilote T2S:S

Le gène codant la protéine T2S:S n’est pas retrouvé dans tous les opérons des

systèmes de sécrétion. Chez les espèces bactériennes où ce gène est présent telles que K.

oxytoca et D. dadantii la stabilité ainsi que l’insertion dans la membrane de T2S:D nécessitent

la présence de T2S:S (Hardie et al., 1996; Shevchik et al., 1997). Chez ces deux espèces,

l’absence de T2S:S provoque la dégradation de T2S:D. Cette capacité de T2S:S à protéger

T2S:D de la dégradation et le diriger vers la membrane externe lui a valu le nom de pilotine.

T2S:S est une lipoprotéine insérée dans l’OM par sa partie lipidique qui est greffée à

l’extrémité N-terminale de la partie protéique. Les lipoprotéines pilotes sont retrouvées

associées aux sécrétines de certains T2SSs (Hardie et al., 1996), de type III (Crago and

Koronakis, 1998) et de biogenèse des pili de type IV (Drake et al., 1997).

L’association entre la sécrétine et sa protéine pilote se ferait selon un ratio 1:1 (Lario et al.,

2005; Nouwen et al., 1999). Son interaction avec T2S:D est localisée à l’extrémité de la partie

N-terminale au niveau du domaine S (Chami et al., 2005). En effet, il a démontré chez D.

dadantii l'interaction d'OutS avec OutD nécessite les 62 derniers résidus de l'extrémité C-

terminale d'OutD (Shevchik and Condemine, 1998) et que la protéine hybride composée de la

sécrétine pIV du système d’exportation du phage filamenteux f1 et les 65 derniers résidus de

PulD s’associe avec PulS et permet la fonctionnalité de cette protéine hybride (Daefler et al.,

1997). Une récente étude a démontré que PulD forme des pores dans l’IM en absence de PulS

(Guilvout et al., 2006). Ainsi, PulS dirigerait les monomères de PulD dans l’OM avant que

ceux-ci ne forment des multimères dans l’IM. Ceci démontre l'importance de la partie

lipidique de T2S:S dans la localisation du complexe T2S:D/T2S:S. En effet la partie lipidique

de T2S:S n’est pas indispensable pour la formation de complexes T2S:S/T2S:D et la

protection de T2S:D de la dégradation (Daefler et al., 1997; Lario et al., 2005; Shevchik and

Condemine, 1998). Cependant le remplacement de la séquence signal de type lipoprotéine

d'OutS par la séquence signal de PelB entraîne l’accumulation d'OutD dans le périplasme

(Daefler et al., 1997; Shevchik and Condemine, 1998). Ceci suggère que la partie lipidique est

indispensable pour l’insertion du complexe T2S:D/T2S:S dans l’OM.

b) Les pseudopilines T2S:G, H, I, J, K et la prépiline peptidase T2S:O

1. La peptidase T2S:O : maturation des pseudopilines

Les pili de type IV sont des appendices intervenant dans la mobilité des bactéries et dans

l’adhésion aux surfaces. Ils participent aussi à la formation des biofilms bactériens (Wall and

54


Kaiser, 1999). La protéine qui forme ces pili, la piline, est synthétisée sous forme de

précurseur, la prépiline. Elle possède un peptide signal de 6 ou 7 résidus qui est coupé par une

signal peptidase spécifique. Ce type de séquence signal est retrouvé chez les cinq protéines

T2S:G, H, I, J, K du T2SS (Pugsley and Reyss, 1990). Cette similarité est à l’origine du nom

de pseudopiline donné à ces protéines. La maturation de ces cinq protéines fait également

intervenir une signal peptidase spécifique : T2S:O. La topologie de la prépiline peptidase

OutO d’Erwinia carotovora a été étudiée : c’est une protéine polytopique de la IM avec 8

TMSs et une grande boucle cytoplasmique entre les TMSs 1 et 2 (Reeves et al., 1994). Cette

structure est identique pour toutes les protéines T2S:O.

Chez P. aeruginosa, la prépiline peptidase PilD va reconnaître la séquence consensus

G[F/M]ΦΦΦE et va cliver le peptide signal après le résidu glycine (Nunn and Lory, 1991).

Ensuite, PilD catalyse la fixation d’un groupement méthyle sur la phénylalanine (ou

méthionine) située à la nouvelle extrémité N-terminale générée (Strom et al., 1993b). Ce

processus de maturation est retrouvé pour les pseudopilines où PulO de K. oxytoca clive le

peptide signal et fixe un groupement méthyle à l’extrémité N-terminale de PulG. Les quatre

résidus cystéines localisés au niveau de la boucle cytoplasmique O participeraient à l’activité

catalytique (Pugsley and Dupuy, 1992; Pugsley, 1993a; Strom et al., 1993a).

On remarque aussi qu’une prépiline peptidase peut maturer à la fois les pilines des pili

de type IV et les pseudopilines des T2SS. C’est le cas chez P. aeruginosa et Aeromonas

hydrophila où le gène t2s:O est absent des opérons des T2SSs et que l’inactivation des

prépiline peptidases pilD et tapD des systèmes de piliation de type IV de P. aeruginosa et A.

hydrophila respectivement empêche la formation de pili et provoque ainsi l’arrêt de la

sécrétion des exoprotéines par le T2SS (Nunn and Lory, 1991). Le fait que ces prépiline

peptidases agissent sur deux types de protéines différents implique une origine commune aux

T2SSs et pili de type IV.

2. Le pilus T2S:G, H, I, J, K

Le pseudopilus des T2SSs est composé d’une pseudopiline majeure (T2S:G) et de

pseudopilines mineures (T2S:H-K) (Sauvonnet et al., 2000). La structure de chaque

pseudopiline a été récemment résolue (figure 28-29):

- PulG de K. oxytoca (Kohler et al., 2004),

- EpsH de V. cholerae (Yanez et al., 2008a)

- Le dimère EpsI/EpsJ de Vibrio vulnificus (Yanez et al., 2008b)

55


- Le complexe GspK/GspI/GspJ de E. coli enteropathogène (ETEC) (Korotkov

and Hol, 2008)

La structure de chaque pseudopiline est différente à part au niveau de la partie N-

terminale où l’on retrouve une hélice α hydrophobe et un acide glutamique en position +5 de

la protéine mature sauf pour T2S:K (Bleves et al., 1998). La partie C-terminale est quant à

elle plus divergente mais elles ont toutes des homologies avec les pilines de type IV (Kohler

et al., 2004; Yanez et al., 2008a, b) ;(Korotkov and Hol, 2008)

A partir de la structure de PulG, les auteurs ont établi un modèle d’organisation des

monomères de PulG au sein des fibres du pseudopilus. Dans ce modèle, les monomères de

PulG sont associés par des interactions des hélices α hydrophobes N-terminales alors que les

extrémités C-terminales sont exposées à l’extérieur du cylindre (Kohler et al., 2004) (figure

28). Les observations microscopiques réalisées chez P. aeruginosa montrent que les pili

formés par XcpT à la surface des cellules sont en fait formés par l’association de plusieurs

fibres (Durand et al., 2003; Vignon et al., 2003).

La surexpression du PulG en présence des autres gènes pul chez E. coli entraîne la

formation de pili à la surface de la cellule (Sauvonnet et al., 2000). Chez P. aeruginosa, XcpT

(T2S:G) seule peut former des pili lorsqu’il est surproduit (Durand et al., 2003). Cette

capacité à former des pili n’est pas propre à PulG et à XcpT mais peut être élargie à la

majorité des pseudopilines T2S:G (Vignon et al., 2003). Cette protéine T2S:G est obligatoire

pour la formation du pseudopilus au contraire des pseudopilines mineures. Mais, bien que

PulJ et PulK ne soient pas indispensables à la formation de ce pili chez K. oxytoca en

revanche leur présence est obligatoire pour que la sécrétion de PulA ait lieu (Sauvonnet et al.,

2000).

La comparaison des structures des différentes pseudopilines des T2SSs avec celle des

pili de type I permet d’émettre un modèle architectural du pseudopilus (Kuo et al., 2005). Le

pseudopilus serait composé de la pseudopiline majoritaire T2S:G. Les pseudopilines

minoritaires seraient localisées au bout et sur le contour du pseudopilus. Ainsi, ces

pseudopilines interviendraient dans la stabilisation et la longueur du pseudopilus. En effet, la

surexpression de la pseudopiline minoritaire PulK entraîne l’inhibition de la formation des pili

et de la sécrétion de la pullulanase (Vignon et al., 2003). Des résultats similaires ont été

obtenus chez P. aeruginosa lors de surexpression d’XcpX (T2S:K) et chez Xanthomonas

campestris où les pseudopilines XpsH, I et J interviendraient dans la régulation de

l’élongation du pseudopilus (Kuo et al., 2005). Les pseudopilines minoritaires pourraient

56


donc arrêter la "polymérisation" de T2S:G par un contrôle négatif de l’élongation du

pseudopilus (Durand et al., 2005) (figure 29).

L’élongation et la rétraction des pili de type IV à travers un pore de l’OM engendre la

mobilité de surface des bactéries (Wall and Kaiser, 1999). Cette activité de “piston” des pili

de type IV est possible grâce à deux ATPases dont les activités sont opposées (Wall and

Kaiser, 1999). Un processus identique d’élongation et de rétraction du pseudopilus qui ne

sortirait pas du périplasme pourrait être responsable de la sécrétion des exo-protéines à travers

le pore formé par la sécrétine T2S:D (Shevchik et al., 1997; Vignon et al., 2003). En effet, des

analyses en double hybride des levures ont montré que les dérivés solubles des pseudopilines

OutG et OutJ interagissent avec la région N-terminale d'OutD (Douet et al., 2004). Des

résultats similaires ont mis en évidence une interaction entre XpsG et XpsD (Lee et al., 2005).

Toute ces observations suggèrent que le processus d’élongation et de rétractation serait

semblable à celui des pili de type IV sous le contrôle des pseudopilines minoritaire.

c) Le moteur des T2SS :l’ATPase T2S:E

Les T2S:E appartiennent à la famille des NTPases de sécrétion. Ces protéines

hydrolysent les nucléosides triphosphates afin de permettre la sécrétion de molécules via des

systèmes spécialisés tels que les T2SS et T4SS, les systèmes de piliation de type IV ou encore

les systèmes de conjugaison. Ces protéines sont cytoplasmiques en association avec la surface

cytoplasmique de la IM (Planet et al., 2001). Comme tous les membres de cette famille, les

T2S:E comportent les motifs A et B de Walker dans leur séquence primaire (Walker et al.,

1982) permettant ainsi l’hydrolyse de l’ATP.

Bien que de récentes études démontrent que EpsE est majoritairement sous forme

monomérique (Camberg and Sandkvist, 2005), il semble que les T2S:E puissent

s’oligomériser dans des stœchiométries variée pouvant dépasser le dodécamère (Camberg and

Sandkvist, 2005). De plus, des mesures d’activité enzymatique des différents oligomères

montrent que c’est sous sa forme hexamérique qu’on a la plus forte activité spécifique. Ces

résultats suggèrent que la forme active de T2S:E est hexamérique. D’autres membres de la

famille des NTPases de sécrétion ont aussi été caractérisées structuralement comme étant des

hexamères (Herdendorf et al., 2002; Krause et al., 2000; Yamagata and Tainer, 2007). Ces

structures ont permis ainsi d’établir un modèle architectural de la forme hexamérique des

T2S:E (Robien et al., 2003). Dans ce modèle, les six monomères d’EpsE de forme hélicoïdale

sont organisés en anneau (figure 30).

57


Son association à la membrane cytoplasmique se fait par l’intermédiaire du domaine

cytoplasmique N-terminal de T2S:L (Sandkvist et al., 1995). Ceci a été confirmé par des

études par double hybride de levure qui montre une interaction entre OutE de D. dadantii

avec le domaine N-terminal cytoplasmique d'OutL (Py et al., 1999). La physionomie de cette

interaction est bien illustrée par la cristallisation du complexe formé par les deux régions N-

terminales d’EpsE et EpsL (Abendroth et al., 2005) (figure 31). L’interaction entre T2S:E et

T2S:L est très importante lors du fonctionnement du T2SS car toute mutation empêchant cette

interaction a pour conséquence un blocage de la sécrétion (Housby et al., 1998; Shiue et al.,

2007).

Une récente étude a montré que l’oligomérisation de XpsE de X. campestris est un

prérequis obligatoire pour que l’interaction avec XpsL ait lieu (Shiue et al., 2006). Cette

multimérisation de XpsE est, elle-même, provoquée par la fixation d’une molécule d’ATP sur

chacun des monomères. Cette association avec la partie cytoplasmique de XpsL se ferait par

l’intermédiaire d’une arginine placée en position 256. En effet, sa mutation par une alanine

abolit l’interaction avec XpsL et provoque l’arrêt de la sécrétion des exoprotéines (Shiue et

al., 2007). Malgré cette perte d’interaction dans ce mutant, XpsE ne perd pas son activité

ATPase ou son auto-oligomérisation ce qui suggère que la sécrétion des exoprotéines est

découplée de l’hydrolyse de l’ATP (Shiue et al., 2007). Par contre, l’hydrolyse de l’ATP

serait à l’origine de la dissociation des hexamères de XpsE puis du complexe XpsE/XpsL

(Shiue et al., 2006).

L'étude du complexe EpsE/EpsL(cyto) (EpsL(cyto) est la partie cytoplasmique de EpsL

comprenant les acides aminés 1 à 253) a montré que les phospholipides membranaires chargés

négativement comme le phosphatidyl-glycérol et la cardiolipine augmentent l'activité ATPase

de EpsE de 30 et 130 fois respectivement et qu’on a une interaction entre ce complexe

EpsE/EpsL(cyto) et ces phospholipides (Camberg et al., 2007). Cette fixation des lipides

membranaires ainsi que la stimulation de l'activité enzymatique n'est pas observée sur EpsE

seul ou encore sur le complexe EpsE/EpsL(cyto∆242-253) (EpsL(cyto∆242-253) est EpsL(cyto) deletée

des acides aminés 242 à 253) On peut en conclure que les 11 derniers résidus de la partie

cytoplasmique d’EpsL participeraient à la fixation des lipides membranaires et la stimulation

d’EpsE.

Ces deux études s'accordent donc sur le fait que l'ATP n'est pas indispensable pour que

l'interaction EpsE/EpsL ait lieu. Par contre, leurs hypothèses divergent sur l'importance de la

partie cytoplasmique de T2S:L pour l'activité enzymatique de T2S:E : l’une stipulant qu’il y a

quand même hydrolyse de l’ATP en absence interaction (Shiue et al., 2007), l’autre stipulant

58


que c’est l’interaction des deux protagonistes qui provoqueraient l’hydrolyse de l’ATP

(Camberg et al., 2007). De plus l'oligomérisation de EpsE semble être induite par les 11

derniers résidus de la partie cytoplasmique d’EpsL (Camberg et al., 2007) alors que pour

XpsE, ce serait la fixation de l'ATP qui provoquerait la multimérisation (Shiue et al., 2006)

(Shiue et al., 2007).

Le mécanisme via lequel T2S:E effectue le couplage entre l'énergie issue de l'hydrolyse

de l'ATP et la sécrétion des exoprotéines reste à ce jour inconnu. Toutefois, certains éléments

permettent de dire que l’hydrolyse de l’ATP par T2S:E pourrait intervenir dans l’élongation

du pseudopilus. En effet il a été démontré que la présence de T2S:E est indispensable à la

formation de pseudopili à la surface de la cellule lors de la surexpression de T2S:G (Durand et

al., 2003; Sauvonnet et al., 2000). Ceci suggère une interaction entre T2S:E et le pseudopilus.

Une autre possibilité serait pour que l’interaction entre T2S:E et T2S:L induise un

changement de conformation de T2S:L qui se répercuterait sur les autres protéines du système

localisées dans l’IM, déclenchant ainsi le processus de sécrétion.

d) La plateforme de la membrane interne T2S:F/L/M et T2S:C

1. T2S:F

Les T2SF est aussi un des éléments du T2SS qui a un homologue dans les systèmes de

piliation de type IV. En effet, des études in silico montrent qu’il semble toujours y avoir une

protéine homologue à T2S:F associée aux ATPases des T2SSs et des systèmes de piliation de

type IV (Peabody et al., 2003).

T2S:F est une protéine polytopique de la IM qui possède trois TMSs (Thomas et al.,

1997). Les extrémités N et C-terminales de T2S:F seraient respectivement localisées dans le

cytoplasme et le périplasme. Le premier TMS est suivi d’une courte boucle périplasmique

tandis qu’entre les second et troisième TMSs se trouve une large boucle cytoplasmique. XcpS

(T2S:F de P. aeruginosa) forme des trimères in vitro et l'analyse en microscopie électronique

suggère que XcpS pourrait former des hexamères de forme cylindrique (Senf et al., 2006).

T2S:F formerait des homo-multimères au même titre que son homologue du système de

piliation de type IV PilC. Les multimères de T2S:F formeraient un pore dans l’IM à travers

lequel les pseudopilines passeraient suite à leur maturation par la prépiline peptidase (Filloux,

2004).

Les T2S:F et les T2S:E interagissent ensemble. Des expériences de double hybride des

levures ont spécifié que la partie N-terminale située en amont du premier TMS d’OutF

59


interagit avec OutE (Py et al., 2001). Ces expériences ont démontré aussi qu’il avait une

interaction entre OutE et la partie cytoplasmique d’OutL. Les protéines OutE, OutF et OutL

forment un complexe stable qui a été détecté par immunoprécipitation. Malgré une interaction

bilatérale lors des expériences de double hybride des levures, la présence d’OutL est

indispensable pour que le complexe entre OutF et OutE se fasse in vitro (Py et al., 2001). Il

est probable que T2S:F stabiliserait l’association de T2S:E à l’IM après son association à

T2S:L. Cette hypothèse fût confirmée chez P. aeruginosa. En effet, il a été démontré

récemment qu’il y avait une interaction entre XcpR (T2S:E), XcpY(T2S:L) et XcpS(T2S:F) et

que la boucle cytoplasmique de XcpS stabiliserait le complexe (Arts et al., 2007).

2. Le complexe T2S:L/ T2S:M

T2S:L et T2S:M sont des protéines bitopiques de l’IM avec leur extrémité N-terminale

localisée dans le cytoplasme (Bleves et al., 1996; Thomas et al., 1997).

La séparation en filtration sur gel a suggéré que EpsM forme des homo-dimères (Sandkvist et

al., 1999). Cette interaction se ferait par la partie périplasmique (Douet et al., 2004; Sandkvist

et al., 1999) et tout particulièrement par la région entre les résidus de 100 à 135 (Johnson et

al., 2007). Des résultats similaires sont retrouvés pour T2S:L (Sandkvist et al., 1999), mais sa

dimérisation ferait intervenir aussi bien les parties périplasmiques que cytoplasmiques (Douet

et al., 2004).

La structure tridimensionnelle de la partie périplasmique d’EpsM montre un repliement

du monomère proche de celui de la famille des ferrédoxines et la formation d’une poche à

l’interface du dimère qui pourrait correspondre au site d’interaction avec un partenaire

protéique (Abendroth et al., 2004b).

La partie cytoplasmique de T2S:L interagit avec l’ATPase T2S:E et la protéine T2S:F (Voir

paragraphe T2S:E et T2S:F) (figure 31). L’obtention de la structure de la partie cytoplasmique

d’EpsL a permis de mettre en évidence un domaine SHS2 (Strand Helix Strand 2) et deux

domaines qui sont retrouvés dans les ATPases de la famille des actines (Abendroth et al.,

2004a; Abendroth et al., 2004b). Les domaines SHS2 interviennent dans les interactions

protéine-protéine et la reconnaissance de petites molécules (Anantharaman and Aravind,

2004). L’étude de la complémentation de la sécrétion chez un mutant epsL de V. cholerae

avec les protéines hybrides entre EpsL et ExeL d’A. hydrophila suggèrent que le domaine

SHS2 et un des deux autres domaines interviennent dans la reconnaissance spécifique d’EpsE

(Sandkvist et al., 2000). Cette hypothèse fut confirmée par l’obtention de la structure du

60


complexe hétéro-tétramérique d’EpsL et EpsE. Dans cette structure le site de liaison d’EpsE

sur EpsL se trouve à l’interface des deux domaines SHS2 et "ATPase actine-like" (Abendroth

et al., 2005). En plus de ces interactions, il a été démontré chez P. aeruginosa, X. campestris

et V. cholerae que les protéines T2S:M et T2S:L se stabilisent mutuellement (Johnson et al.,

2007; Lee et al., 2001; Michel et al., 1998). Les études en double hybride des levures ont

montré que les parties périplasmiques d’OutL et OutM interagissent entre elles (Douet et al.,

2004; Py et al., 2001). Des résultats similaires ont été obtenus lors des expérience de co-

immunoprécipitation chez V. cholerae (Lee et al., 2001; Robert et al., 2002; Sandkvist et al.,

1999).

Toutes ces interactions ont permis de suggérer que les protéines T2S:E, T2S:F, T2S:L et

T2S:M formeraient une plateforme dans l’IM sur laquelle serait ancré le pseudopilus (Filloux,

2004). L’organisation et la stabilité sont la résultante d’interactions directes ou indirectes

entre ces protéines au niveau cytoplasmique, membranaire et périplasmique.

Les observations au microscope à fluorescence de cellules de V. cholerae portant une

protéine hybride entre la GFP (Green Fluorescent Protein) et EpsM ou EspL ont montré une

localisation polaire du T2SS chez cette bactérie (Scott et al., 2001). Les observations de ces

protéines quand elles sont exprimées chez E. coli montrent que EpsM est capable de se

localiser aux pôles des cellules sans que les autres protéines du système soient présentes.

EpsM possèderait toutes les informations nécessaires pour être localisée aux pôles des

cellules. Cette observation suggère que T2S:M aurait pour fonction de localiser aux pôles les

constituants du T2SS. Toutefois, la localisation polaire du T2SS ne semble pas être une

généralité. En effet, les observations microscopiques faites chez K. oxytoca montrent que

PulM et PulL ne sont pas localisées aux pôles des cellules mais sont distribuées sur toute la

circonférence des cellules (Buddelmeijer et al., 2006). Si la localisation aux pôles du T2SS

chez V. cholerae ne correspond pas à un artefact dû à la surexpression de la fusion GFP, la

signification biologique de cette localisation reste actuellement inexpliquée.

3. T2S:C, la protéine clé des T2SS

T2S:C est une protéine bitopique de la IM d’environ 30 kDa qui possède une courte

région cytoplasmique, un seul TMS et une large région périplasmique (Bleves et al., 1996;

Thomas et al., 1997). On retrouve à proximité de l’extrémité C-terminale des T2S:C, un

domaine PDZ (Pallen and Ponting, 1997) dont la structure tridimensionnelle chez EpsC a été

résolue en 2006 (Korotkov et al., 2006) (figure 32). Ce domaine PDZ est retrouvé chez tous

61


les T2S:C sauf XcpP (T2S:C des Pseudomonas) où à la place il y aurait un domaine coiled

coil (Bleves et al., 1999). Les domaines coiled coil sont composés de deux ou plusieurs

hélices α organisées de façon parallèle ou anti-parallèle. (Burkhard et al., 2001) et sont

impliqués dans la formation de complexes macromoléculaires par des protéines de structure,

la structuration de régulateur de transcription et de récepteurs de surface (Lupas, 1996). Les

domaines PDZ sont des domaines globulaires dont la taille est comprise entre 70 et 100 acides

aminés intervenant dans les interactions protéine-protéine (Jelen et al., 2003). Le plus

souvent, les domaines PDZ reconnaissent spécifiquement les 4 derniers résidus de l’extrémité

C-terminale de la protéine cible. Dans certains cas, ils reconnaissent une séquence interne qui

mime cette extrémité au niveau de la structure tridimensionnelle (Hillier et al., 1999). En

fonction de la protéine considérée, le domaine PDZ participe à la formation d’homo-

oligomères, la reconnaissance du substrat et la régulation de l’activité protéase.

Au vu de leurs fonctions de reconnaissance, le domaine PDZ des T2S:C a été longtemps

considéré comme le site de reconnaissance des exo-protéines sécrétées par les T2SSs. Mais, la

sécrétion de certaines exoprotéines de D. dadantii n'est pas affectée par la délétion du

domaine PDZ d'OutC suggérant ainsi que le domaine PDZ n'est pas essentiel pour la

fonctionnalité générale de T2S:C (Bouley et al., 2001). Ceci est confirmé par le fait que HxcP

(T2S:C du deuxième T2SS) de P. aeruginosa est fonctionnel tout en ne contenant pas de

domaine PDZ ou coiled coil (Peabody et al., 2003).

Le TMS de T2S:C semble jouer un rôle important dans la fonctionnalité de la protéine.

En effet, le remplacement des TMSs de XcpP et XpsN par celui de TetA entraîne un arrêt de

la sécrétion (Bleves et al., 1999; Lee et al., 2004). Une récente étude a démontré que les

T2SSs sont fonctionnels lorsque T2S:C est sous forme dimérique et que sa dimérisation fait

intervenir les TMSs (Login and Shevchik, 2006). En effet, l’utilisation du pontage chimique

in vitro, du double hybride bactérien et du "GST pull down" a permis de montrer que le TMS

d’OutC est indispensable à la formation des dimères et que sans cette dimérisation, le T2SS

d’D. dadantii est non-fonctionnel. De plus, les auteurs ont révélé que les interactions inter-

hélicales entre les Arg15, Gln29 et Arg36 semblent être à l’origine de l’auto-association des

TMS d’OutC (Login and Shevchik, 2006).

Les alignements de séquences des différents homologues de T2S:C ont fait ressortir

une région très conservée dans la partie périplasmique : la région HR (Figure 32) (Highly

conserved Region) (Gerard-Vincent et al., 2002).

Diverses études sur différentes espèces ont montré que la stabilité du complexe T2S:L/T2S:M

et celle du macro-complexe T2S:E/T2S:F/T2S:L/T2S:M est influencée par T2S:C (Lee et al.,

62


2001; Michel et al., 1998). Chez X. campestris, des expériences d’échange de fragments de la

partie TMS et une partie périplasmique de XcpN et de dérivés tronqués de XcpN montrent

que le TMS et les premiers acides aminés de la partie périplasmique contribuent à la

stabilisation des protéines XcpY et XcpZ (Lee et al., 2004). Ces expériences suggèrent que le

TMS de T2S:C ainsi que le début de la partie périplasmique sont impliqués dans l’interaction

avec T2S:L et T2S:M.

De plus, l'interaction entre T2S:C et T2S:D a ensuite été démontrée chez X. campestris par

des expériences d’immunoprécipitation et de pull down (Lee et al., 2000). Puis des

expériences de copurification ont montré que les protéines EpsD et EpsC de V. cholerae

interagissent entre elles (Korotkov et al., 2006). Mais, cette interaction n’a jamais pu être

démontrée in vivo.

La fonction du T2S:C semble être multiple :

- Implication dans la spécificité du T2SS en intervenant dans la reconnaissance

des exoprotéines au niveau du périplasme (Bouley et al., 2001) (voir

paragraphe III.2.3.2.a de l’introduction bibliographique)

- Implication dans la formation d’un lien entre les membranes interne et externe

en interagissant avec les protéines T2S:D (OM) (Korotkov et al., 2006; Lee et

al., 2000) T2S:L et T2S:M (IM) (Lee et al., 2001; Robert et al., 2005)

e) T2S:A, T2S:B et T2S:N : des protéines accessoires ?

Les protéines T2S:A, T2S:B et T2S:N sont ici qualifiées d’accessoires car elles ne sont

pas présentes dans tous les T2SSs dont le fonctionnement a été expérimentalement prouvé.

Ces protéines ne sont pas nécessaires au T2SS et donc leur étude a été très succincte.

La seule étude sur la protéine T2S:N est pulN chez K. oxytoca. C’est une protéine

bitopique de l’IM et l’inactivation du gène n’a aucun effet sur la sécrétion de la pullulanase

(Possot et al., 2000).

La bibliographie sur T2S:A et T2S:B est un peu plus importante et porte principalement

sur les protéines ExeA et ExeB d’A. hydrophila. En effet, chez cette bactérie, l’inactivation

des gènes exeA et exeB entraîne un arrêt de la sécrétion des exoprotéines par le T2SS

(Jahagirdar and Howard, 1994).

Ce sont deux protéines bitopiques localisées dans l’IM avec un domaine N-terminal

cytoplasmique. La différence entre les deux protéines est la différence de taille entre les

régions cytoplasmique et périplasmique : ExeB a une courte région cytoplasmique et une

large partie périplasmique alors que les régions cytoplasmique et périplasmique de ExeA sont

63


quasiment de même taille (Howard et al., 1996). Il a été démontré que ces deux protéines se

stabiliseraient mutuellement en formant des homodimères (Schoenhofen et al., 1998;

Schoenhofen et al., 2005)

Ce complexe va permettre l’insertion de la sécrétine d’A. hydrophila dans l’OM de la

bactérie. En effet, des études de localisation cellulaire ont montré que la sécrétine ExeD ne

forme pas de multimères et demeure dans la IM dans les mutants exeA et exeB (Ast et al.,

2002). Récemment, un site de fixation au peptidoglycane a été mis en évidence dans la région

périplasmique de ExeA par pontage chimique (Howard et al., 2006). Ce site semble être

également présent chez les autres homologues d’ExeA. Les mutations ponctuelles dans ce site

de liaison au peptidoglycane entraînent une diminution de la sécrétion de l’aérolysine et de la

multimérisation d’ExeD sans pour autant influencer la formation du complexe ExeA/ExeB.

Les auteurs ont proposé que ExeA hydrolyserait le peptidoglycane afin de permettre

l’insertion de ExeD dans la IM (Howard et al., 2006).

Dans un mutant outB d’D. dadantii, la sécrétion des pectate lyases est diminuée de 30%

(Condemine et al., 1992). La surproduction d’OutD chez le mutant outB d’D. dadantii rétablit

un niveau normal de sécrétion (Condemine and Shevchik, 2000). La stabilisation mutuelle des

protéines OutB et OutD suggère que ces deux protéines interagissent entre elles et les

expériences de pontage chimique ont ensuite confirmé cette interaction.

Au vu de ces résultats, on peut émettre l’hypothèse que T2S:B et/ou T2S:A servirait de

chaperonnes à la sécrétine pour une insertion correcte. Mais cette hypothèse n’est pas une

règle générale pour tous les T2SSs puisque l’inactivation du gène codant pulB n’a aucun effet

sur la localisation de PulD et la sécrétion de PulA (D'Enfert and Pugsley, 1989).

Ceci démontre que T2S:B et/ou T2S:A n’ont pas la même importance dans le fonctionnement

des différents systèmes T2SSs.

III.2.4.2) Spécificité et fonctionnement du système de sécrétion de type II

a) Spécificité du système de sécrétion de type II : la reconnaissance du motif de

sécrétion.

Malgré une similarité dans l’organisation structurale et dans le fonctionnement général

de ces T2SS chez toutes les espèces, chaque système de sécrétion est doté d’une spécificité de

reconnaissance des exoprotéines plus ou moins stricte. En effet, des expériences de sécrétion

hétérologue ont été menées :

64


- entre des espèces bactériennes très proches telles que P. aeruginosa et P.

alcaligenes où l’on observe une sécrétion interspécifique (de Groot et al.,

2001).

- entre des espèces bactériennes plus éloignées comme V. cholerae et A.

hydrophila où là aussi on observe une sécrétion (Wong et al., 1990).

- Entre D. dadantii et E. carotovora où l’on observe l’absence de sécrétion

malgré un taux d'identité de 71% entre les protéines échangées PelC et Pel1

(Lindeberg et al., 1998)

Cela suggère un niveau de spécificité différent selon les T2SS. Cette spécificité est sûrement

due à la reconnaissance entre le sécréton et le motif de sécrétion des exoprotéines.

b) Le motif de sécrétion

La reconnaissance des exoprotéines est une étape importante car elle permet de

sélectionner les protéines spécifiquement sécrétées par le sécréton parmi toutes les protéines

contenues dans le périplasme ou en cours d’acheminement. Les analyses des séquences

primaires de ces différentes protéines ne révèlent aucun motif conservé qui pourrait faire

office de signal de sécrétion reconnu par le sécréton.

La machinerie de type II ne sécrète que des protéines repliées dans leur conformation

tridimensionnelle acquise dans le périplasme. Cette information permet de supposer que le

motif de sécrétion est tridimensionnel. Ainsi des résidus distants les uns des autres dans la

séquence primaire et devenus proches à l’issue du repliement de la protéine dans sa structure

tertiaire pourraient constituer le motif de sécrétion. Cela implique que les modifications de

séquence primaire entraînant un changement de conformation des exoprotéines auraient pour

conséquence un arrêt ou une diminution de la sécrétion de ces dernières.

L'étude de la sécrétion de protéines hybrides dans lesquelles différentes séquences de

PelC d’D. dadantii ont été remplacées par leur séquence homologue de Pel1 d’E. carotovora

a permis de mettre en évidence des motifs de sécrétion. En effet, il a été suggéré que la boucle

formée par les résidus 274 à 329 constituerait le motif de sécrétion et que les régions

comprises entre les résidus 118 à 170 et 215 à 274 participeraient à la présentation du motif de

sécrétion (Lindeberg et al., 1998). Chez E. carotovora, la mutagenèse aléatoire du gène pehA

de la polygalacturonase a permis d’identifier les motifs A (résidus 84 à 135), B (résidus 190 à

242) et C (résidus 342 à 369) qui sont indispensables à la sécrétion (Palomaki et al., 2002).

Les régions A et C sont constituées d’acides aminés non contigus dans la séquence primaire,

ce qui indique que le motif de sécrétion est généré lors du repliement de la protéine. Les

65


régions A et C correspondent à des zones exposées à la périphérie de la protéine alors que la

région B est enfouie au cœur de la protéine. Les auteurs ont donc proposé que les régions A et

C portent les motifs qui interagissent avec la machinerie de sécrétion. Par contre la région B

permettrait un positionnement correct des régions A et C afin qu’il y ait interaction avec le

sécréton.

Des expériences de mutagénèse ont montré que la modification du tryptophane 227 et

du tryptophane 43 de la pro-aérolysine et de Cel5 respectivement provoque leur non-sécrétion

(Chapon et al., 2000; Wong and Buckley, 1991). Ces résultats suggèrent que ces mutations

ponctuelles entraînent une destruction des motifs de sécrétion ou bien un léger changement

conformationnel permettant une présentation incorrecte du signal au T2SS bien que ces

protéines mutantes présentent quasiment les mêmes caractéristiques que la protéine sauvage.

Ceci va dans le sens contraire des résultats obtenus chez K. oxytoca. En effet, l’insertion

aléatoire dans la séquence de PulA de petits peptides a permis de mettre en évidence une

vingtaine de protéines mutantes qui sont sécrétées comme la protéine sauvage (Sauvonnet et

al., 1995). Certaines de ces protéines mutantes ont des changements tridimensionnels

importants vu qu’elles perdent leur activité catalytique.

Dans le cas de K. oxytoca, le signal de sécrétion semble moins stringent que celui de

D. dadantii mais on retrouve cette architecture tripartite du motif. En effet, des expériences de

protéines hybrides entre différentes formes tronquées de PulA et la β-lactamase sont sécrétées

par le T2SS de K. oxytoca. Ces expériences ont mis en évidence deux motifs de 78 et 80

acides aminées permettant la sécrétion de la β -lactamase (Sauvonnet and Pugsley, 1996). Des

expériences supplémentaires d’insertion de peptides dans la pullulanase ont montré

l’intervention d’une troisième région dans la formation du motif de sécrétion. Mais, l’absence

de la structure tridimensionnelle de la pullulanase fait qu’il est impossible de dire si ces trois

régions constituent chacune un motif de sécrétion ou si la formation du motif de sécrétion est

la résultante de leur association.

Les analyses faites sur l’exotoxine A de P. aeruginosa révèlent aussi la présence de 3

régions dont l’une d’entre elles serait responsable du positionnement des deux autres

(Voulhoux et al., 2000).

Ainsi la présence de deux motifs de sécrétion distincts correctement positionnés l’un

par rapport à l’autre par une troisième région de la protéine semble être une stratégie répandue

à travers les différents systèmes. La spécificité de sécrétion serait aussi bien due à la nature

des résidus qui constituent les motifs de sécrétion (charge et encombrement stérique) qu’à la

façon dont ces derniers sont présentés.

66


La comparaison des structures tridimensionnelles montre que les exoprotéines ont des

repliements différents. La présence de nombreux brins β dans la structure des exoprotéines est

à ce jour le seul point commun mis en évidence (Palomaki et al., 2002). Mais les brins β ne

sont pas exclusivement retrouvés dans les exoprotéines et sont aussi présents dans les

structures des protéines périplasmiques ou de l’OM. La recherche d’un motif de sécrétion

universel semble donc être une utopie. Il est plutôt envisageable que chaque espèce ait son

propre motif de sécrétion et les similarités existant entre certains de ces motifs autorisent dans

quelques cas la sécrétion hétérologue.

c) Reconnaissance spécifique des exoprotéines par le sécréton

L'hypothèse de l'existence de deux motifs de sécrétion évoquée pour certaines

exoprotéines suggère que ces motifs pourraient être reconnus par des composants différents

du sécréton. Les analyses des séquences des composants des T2SSs montrent une forte

similarité entre les protéines des T2SSs des différentes bactéries (Reeves et al., 1993).

Pourtant les expériences de complémentation des gènes du sécréton montrent que tous les

gènes out d’D. dadantii peuvent être remplacés par leur homologue d’E. carotovora, à

l’exception des gènes outC et outD (Lindeberg et al., 1996). Le même constat a été fait lors

d’échanges de gènes du T2SS entre K. oxytoca et D. dadantii ou encore entre K. oxytoca et E.

carotovora (Possot et al., 2000). Ces observations suggèrent que les protéines T2S:C et

T2S:D sont les protéines du sécréton responsables de la reconnaissance des exoprotéines.

Par la suite, il a été démontré que la partie N-terminale d’OutD d’D. dadantii interagit

avec la pectate lyase PelB (Shevchik et al., 1997). De plus, la protéine hybride correspondant

au domaine N-terminal d’OutD de D. dadantii associé au domaine C-terminal d’OutD d’E.

carotovora restaure la sécrétion dans un mutant ∆outD d’D. dadantii alors que la construction

inverse n’en est pas capable (Bouley et al., 2001). La région N-terminale de T2S:D serait

donc en partie responsable de la spécificité de sécrétion. Pourtant les protéines hybrides dans

lesquelles la partie N-terminale de PulD a été remplacée par celle d’OutD sont fonctionnelles

chez K. oxytoca (Guilvout et al., 1999). Mais le fait que les analyses en pull down ne

montrent aucune interaction entre PulD et la pullulanase et que la reconnaissance du motif de

sécrétion est moins stringent chez K. oxytoca pourraient expliquer cette contradiction. Ainsi

l’importance de T2S:D dans la spécificité de reconnaissance des exoprotéines ne semble pas

être la même pour toutes les espèces.

T2S:C est le deuxième élément de la machinerie qui est soupçonné intervenir dans la

reconnaissance des exoprotéines. Les différents homologues de T2S:C possèdent à proximité

67


de leurs extrémités C-terminales un domaine PDZ ou un domaine coiled coil (voir chapitre

III.1.4.3.1). Ces domaines sont impliqués dans les interactions protéine-protéine.

L’intervention probable du domaine PDZ d’OutC d’D. dadantii dans une cascade

d’interactions protéiques au cours du processus de sécrétion a été explorée. La délétion du

domaine PDZ d’OutC entraîne une perte de sécrétion sélective. Les pectate lyases PelA, B, C,

D, E et L ne sont plus sécrétées alors que la cellulase Cel5 et la pectine méthylestérase PemA

sont sécrétées normalement (Bouley et al., 2001). Ce profil de sécrétion est retrouvé lorsqu’on

remplace OutC d’D. dadantii par son homologue d’E. carotovora. La protéine hybride dans

laquelle le domaine PDZ d’OutC d’E. carotovora a été substitué par celui d’D. dadantii

rétablit une sécrétion normale de toutes les protéines. Ces résultats soulignent l’importance du

domaine PDZ dans la spécificité du système de sécrétion envers certaines exoprotéines. Ces

résultats suggèrent la présence de plusieurs motifs de sécrétion au sein des protéines sécrétées

qui ne seraient pas reconnus par les mêmes domaines d'OutC et d'OutD.

Les mécanismes de reconnaissance des exoprotéines par les T2SSs demeurent mal

compris mais il est plausible qu’ils fassent intervenir deux contrôles. La reconnaissance des

exoprotéines implique probablement deux éléments :

- La présence d’un ou plusieurs motifs de sécrétion sur les exoprotéines

- La reconnaissance spécifique de ces motifs par un ou plusieurs éléments du

système de sécrétion.

Les divergences existant au niveau de la nature et du nombre de motifs de sécrétion, les

composants du sécréton nécessaires à la reconnaissance des motifs ainsi que l’interaction

T2S:C /T2S:D pourraient être à l’origine de la spécificité de sécrétion.

III.2.4.3) Modèles de fonctionnement

Les données issues des études sur les T2SSs de diverses espèces ont fait ressortir de

nombreuses similitudes au niveau :

- de la stœchiométrie des oligomères formés par certains constituants,

- des interactions entre différents éléments,

- de la co-stabilisation suite à certaines interactions,

- du besoin en énergie,

- de la formation d’un pseudopilus dans l’espace périplasmique,

- de la spécificité du système.

68


En prenant en considération ces points communs il a été possible d’établir des modèles

d’assemblage et de fonctionnement généraux de la machinerie de sécrétion de type II (Filloux,

2004; Shevchik et al., 1997) (figure 33).

Dans ces modèles la sécrétine T2S:D forme un pore dodécamérique dans l’OM à travers

lequel les protéines seront sécrétées. Chez certaines espèces T2S:D est associé à la pilotine

T2S:S. Les protéines T2S:L (dimère), T2S:M (dimère), T2S:C (dimère) et T2S:F (trimère)

forment un complexe dans l’IM qui serait la base sur laquelle repose la machinerie.

La région périplasmique de T2S:C interagirait avec T2S:D permettant ainsi la jonction entre

les deux parties du sécréton situées dans les membranes interne et externe. La partie

cytoplasmique des protéines T2S:L et T2S:F permet l’association de l’ATPase T2S:E

(hexamère) à l’IM et au reste du système.

La prépiline peptidase T2S:O assure la maturation des prépilines en pseudopilines T2S:G,

T2S:H, T2S:I, T2S:J et T2S:K qui vont ensuite former le pseudopilus grâce à l’énergie issue

de l’hydrolyse de l’ATP par T2S:E.

Dans le modèle proposé par Shevchik et al. (1997), ce sont les interactions entre T2S:D,

les exo-protéines et T2S:C qui constitueraient un signal pour le déclenchement du processus

de sécrétion. Ces interactions entraîneraient l’ouverture du pore formé par T2S:D. T2S:C

transmettrait le signal aux autres protéines de la IM puis T2S:L induirait l’activation de

l’ATPase T2S:E. L’énergie que fournit l’ATPase T2S:E permettrait l’élongation du

pseudopilus, qui expulserait l’exo-protéine vers le milieu extracellulaire à travers le pore

formé par la sécrétine T2S:D.

Un fonctionnement similaire est proposé par Bleves et ses collaborateurs sauf que dans

ce modèle, c’est la rupture de l’interaction T2S:D/T2S:C qui rend la cavité centrale de la

sécrétine accessible aux exo-protéines (Filloux, 2004).

Il parait évident que de nombreux travaux sont encore nécessaires pour élucider le

fonctionnement du T2SS. Les analyses futures devront se focaliser aussi bien sur les

propriétés intrinsèques de chacun des éléments du T2SS mais aussi sur les interactions entre

les différents éléments et sur leurs fonctions respectives. De plus la généralisation des

données issues des expériences réalisées chez une seule espèce ne doit pas être systématique.

Autrement dit ces expériences devront être réalisées chez différentes espèces afin d'être sûr

que le phénomène observé n'est pas une spécificité de l'espèce étudiée.

69

Objectifs

OBJECTIFS

DE L’ETUDE

70

Objectifs

OOBBJJEECCTTIIFFSS DDEE LL’’EETTUUDDEE

D. dadantii est une entérobactérie phytopathogène responsable de la maladie de la

pourriture molle sur un grand nombre de végétaux d’importance économique tels que la

pomme de terre, la carotte, l’endive, les plantes ornementales etc… Le principal facteur de

virulence identifié est la production d’un grand nombre d’enzymes capables de dégrader les

composants des parois des cellules végétales. Cette dégradation conduit à la désorganisation

des tissus de la plante et au symptôme de pourriture molle. Parmi les enzymes produites, les

pectinases jouent un rôle prépondérant dans la dégradation des parois végétales. D. dadantii

produit plus d’une quinzaine d’enzymes qui vont permettre le catabolisme complet de la

pectine, un des ciments des tissus végétaux. Ces enzymes pectinolytiques sont pour la plupart

sécrétées dans le milieu extérieur par un T2SS appelé Out. Les T2SSs sont largement

répandus chez les bactéries à Gram négatif et ont été caractérisés en détail chez des bactéries

pathogènes telles que P. aeruginosa, V. cholerae ou K. pneumoniae (paragraphe III.2.3 de

l’introduction bibliographique).

Le séquençage récent du génome de D. dadantii permet de nouvelles approches dans

l’étude du pouvoir pathogène de cette bactérie. En plus des études de transcriptome et de

protéome en cours, de nouveaux facteurs de virulence potentiels ont été repérés sur le

chromosome et leur étude a été entreprise. Parmi ces nouveaux facteurs, un ensemble de

gènes pouvant coder un second T2SS a été trouvé. Ces gènes ont été appelés stt (pour second

type two). Un certain nombre de gènes out n’ont pas d’équivalent dans ce système ce qui

laisse planer un doute sur sa fonctionnalité.

Mon projet de thèse a consisté à caractériser ce second T2SS de D. dadantii. La

première étape de ce travail a été de déterminer les conditions d’expression de ce système et

d’identifier ses substrats. Un de ces substrats est le produit du gène immédiatement en aval de

l’opéron stt (nommé pnlH) qui présente des homologies avec des pectine lyases. L’étude de

PnlH a mis en évidence l’acheminement de cette protéine à l’OM des bactéries. Ceci m’a

conduit à analyser de façon plus approfondie son mode d’adressage à l’OM et le rôle de Stt

dans cette localisation.

Ainsi, les résultats obtenus m’ont permis de découvrir une nouvelle voie

d’acheminement de protéines à l’OM des bactéries à Gram négatif.

71

Résultats Chapitre I

RESULTATS

72


RREESSUULLTTAATT

CChhaappiittrree II :: AAnnaallyyssee eett rréégguullaattiioonn ddee llaa rrééggiioonn dd’’AADDNN ccoonntteennaanntt llee cclluusstteerr sstttt

Le séquençage de la souche 3937 de D. dadantii en 2002 a permis de mettre en

évidence la présence d’un cluster de gènes qui pourrait coder une seconde machinerie de

sécrétion de type II nommée Stt pour Second Type Two. Une étude in silico de cette région

d’ADN et des produits de ces gènes a été entreprise. De plus, la régulation de ce cluster a été

analysée par l’utilisation de fusions transcriptionnelles. Enfin, la recherche de la présence de

ce système dans d’autres souches identifiées auparavant comme des E. chrysanthemi a été

réalisée.

I.1) Matériels et méthodes

Souches bactériennes et milieux de culture

Les différentes souches d’E. chrysanthemi utilisées sont regroupées dans le tableau I.2.

Elles ont été cultivées en milieu LB (Luria-Bertani) ou M63 à 30°C (Miller, 1972).

Les fusions transcriptionnelles (sttE::uidA et pnlH::uidA) ont été obtenues par

recombinaison homologue par l’insertion d’une cassette contenant un gène de résistance et

d’un gène rapporteur GUS. Les doubles mutants ont été obtenus par transduction par le phage

ΦEC2 dans les mutants de régulation de la collection du laboratoire. Les protocoles de

recombinaison et de transduction sont ceux utilisés en routine au laboratoire (Condemine et

al., 1992).

Extraction d’ADN, PCR et recherche d’homologue

L’extraction de l’ADN génomique des différentes souches a été effectuée avec le Kit

« Wizard genomic DNA extraction » selon le protocole du fournisseur (Promega).

L’amplification des gènes sttD et pnlH a été réalisée avec les amorces PnlHfo

CCAGGGATCCAGTGGTGTAACCGGGTA et PnlHre

CACTCTCGAGGGTGTGCCGGTTATAGGC pour le gène pnlH et SttDfo

TCATACCCTGAATGTCGTCCCC et SttDre TCTCATCATCCAGTAGACCGCC pour le

gène sttD.

73


Le logiciel en ligne BLAST-P du NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) a

permis la recherche d’homologie entre les différents produits des gènes du cluster stt avec les

différentes séquences des banques protéomiques.

Dosage de la β-glucuronidase

Le dosage de la ß-glucuronidase repose sur la détermination spectrophotométrique de

la quantité de PNP libéré au cours de l'hydrolyse du paranitrophényl ß-D-glucuronide

(PNPU). Les dosages ont été réalisés sur des cellules perméabilisées par le toluène. La

réaction enzymatique a été réalisée à 37°C dans du milieu M63 contenant 0,1mM de PNPU et

0,5 mL de culture bactérienne. L'activité spécifique (AS) correspond à la quantité de PNP

formé par min et par mg de poids sec bactérien. La variation de la DO à 405 nm en fonction

du temps est proportionnelle à l'activité enzymatique. Sachant que 0,28 mg de poids sec

bactérien correspondent à une DO600 de 0,6 unité, on déduit l'activité spécifique GUS (en

nmol de PNP formés par min et par mg de poids sec bactérien (PBS)) de la façon suivante :

AS = (476,2 x ∆DO405 x dilution)/ DO600.

I.2) Résultats :

I.2.1) Analyse du cluster stt

Les gènes stt font partie d’un ensemble de 15 gènes compris entre 2 copies d’un ARNt

val (figure I.1). Cette duplication et le fait que le pourcentage en G+C de cette région est

inférieur à celui du génome de D. dadantii, laissent supposer l’acquisition de cette région par

transfert latéral (figure I.1).

Ce cluster présente deux gènes ID47168 et ID47169 qui sont deux courtes ORF ne

codant probablement pas de protéines (figure I.1). Les 10 gènes sttC-sttD-sttE-sttF-sttG-sttI-

sttJ-sttK-sttL-sttM suivent ces gènes et semble former un opéron. En aval de sttM, séparé de

12 nucléotides, se trouve un gène dont le produit présente respectivement 65% et 63%

d’homologie avec les pectine lyases d’E. carotovora et de Pseudomonas marginalis. Ce gène

a été nommé pnlH. En aval de pnlH, mais transcrits dans le sens inverse, se trouvent deux

gènes qui semble aussi former un opéron (distance intergénique de 120 nucléotides) (figure

I.1). Le produit du premier, nommé SttS, possède de l’homologie avec les pilotines T2S:S

(tableau I.1). Le produit du second gène, ID20719, n’a d’homologie avec aucune protéine

présente dans les banques de données. Parmi tous les gènes de ce cluster, pnlH et 20719 sont

les seuls susceptibles de coder un substrat de Stt. On peut noter aussi l’absence d’homologues

74


à T2S:H et à T2S:O et des gènes accessoires T2S:B, T2S:N et T2S:A dans cet ensemble de

gènes (figure I.1).

Les différents BlastPs sur chaque produit des gènes du système stt montrent des

homologies avec des protéines de différentes espèces bactériennes : par exemple, la plus forte

homologie pour SttJ est OutJ de D. dadantii alors que pour SttE c’est la protéine GspE de

Shewanella oneidensis MR-1 (tableau I.1). Les gènes stt ne proviennent donc pas d’une

duplication récente des gènes out. De plus, ces résultats ne permettent pas de connaître

l’organisme d’où proviendraient ces gènes.

L’analyse des séquences des différentes protéines du système Stt apporte quelques

informations sur le système. En effet, un domaine S semble présent à l’extrémité C-terminale

de SttD. Ce domaine se retrouve chez certaines sécrétines T2S:D et permet l’interaction avec

les pilotines T2S:S (paragraphe III.2.3.1.a de l’introduction bibliographique). La pilotine de

SttD est probablement la lipoprotéine SttS, codée par le dernier gène du cluster.

La protéine SttC est beaucoup plus courte que la plupart des protéines T2S:C. Ceci est

dû à l’absence d’un domaine PDZ ou coil-coiled normalement retrouvé à l’extrémité C-

terminale de ces protéines T2S:C (paragraphe III.2.3.1.a de l’introduction bibliographique).

Chez D. dadantii, ce domaine permet la reconnaissance de certaines exoprotéines, permettant

leur sécrétion (Bouley et al., 2001). Chez P. aeruginosa, le second T2SS Hxc possède un

T2S:C sans domaine PDZ ou coiled coil et permet la sécrétion d’une alcaline phosphatase

(Ball et al., 2002). Ce domaine n’est donc pas indispensable pour la fonctionnalité de la

protéine SttC.

Les pseudopilines (SttG, SttI, SttK, SttJ) possèdent le site de clivage caractéristique

des prépiline peptidases TS2:O à l’extrémité N-terminale de leur séquence (Paragraphe

III.2.3.1.b de l’introduction bibliographique). Leur maturation est donc nécessaire pour la

mise en place du pseudopilus Stt.

I.2.2) Corrélation entre la présence des gènes sttD et pnlH et l’origine des souches

La présence du gène sttD et du gène pnlH a été recherchée par PCR sur l’ADN

génomique de souches identifiées comme des E. chrysanthemi (tableau I.2). Les résultats

montrent la présence de ces gènes dans des souches d’origines différentes. On ne peut donc

pas faire de corrélation entre la présence de sttD ou pnlH et l’origine de la souche. De plus,

ces gènes peuvent se retrouver tous les deux ou bien isolés (tableau I.2). Cela semble

invraisemblable par rapport à l’architecture et à l’origine intégrative du système. Or, les

bactéries identifiées comme des E. chrysanthemi ont été réparties dans cinq nouvelles espèces

75


(Samson et al., 2005). Il est donc tout à fait possible que les gènes stt et pnlH sont présents

dans une ou plusieurs de ces nouvelles espèces. Mais, en l’absence de test simple pour typer

nos souches, on ne peut pas confirmer cette hypothèse.

Les résultats obtenus ici pourront être vérifié par Southern Blot pour pallier aux

limites de la PCR.

I.2.3) Conditions d’expression des gènes du système de sécrétion stt et de la pnlH

La première partie de mon travail a consisté à étudier les conditions d’expression des

gènes stt et pnlH. Pour ce faire, le dosage de fusions transcriptionnelles dans les gènes sttE et

pnlH avec le gène rapporteur gus m’a permis d’étudier la transcription de ces gènes dans

différentes conditions physico-chimiques et dans différents mutants de régulation.

Dans un premier temps, une série de conditions physico-chimiques a été testée. Le

dosage des fusions transcriptionnelles montre une expression trois fois plus élevée des gènes

sttE et pnlH en milieu minimum par rapport à un milieu riche. D’autres conditions telles que

l’effet de certains sucres, l’absence d’oxygène ou la présence de cations ne conduisent à

aucune variation significative de l’expression des gènes sttE et pnlH.

Ensuite, l’effet de plusieurs mutants de régulation connus pour contrôler la synthèse

des pectinases de D. dadantii tels que KdgR, KdgK, PecT, PecS, Pir ou bien des substrats

induisant la synthèse de facteurs de virulence (polygalacturonate, extraits végétaux)

(Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996) a été testé. Ces différentes conditions ne conduisent

jamais à une variation significative sur l’expression de stt et pnlH (Figure I.2).

Par contre, le régulateur FIS a un effet répresseur puisqu’on remarque une expression

deux fois plus forte de la transcription de sttE et de pnlH dans un mutant fis par rapport au

sauvage (Figure I.2). Cette protéine, qui lie l’ADN, régule les gènes transcrits pendant la

phase exponentielle de croissance d’une bactérie (Ali Azam et al., 1999). La mutation d’une

autre protéine liant l’ADN nommé H-NS provoque une transcription multipliée par 10 pour le

gène pnlH et par 6 pour le gène sttE (Figure I.2 ; I.3). H-NS est donc un répresseur des gènes

sttE et pnlH. Ce type de répression par H-NS est caractéristique des gènes acquis récemment

et dont le pourcentage en G+C est bas (Dorman, 2007; Lucchini et al., 2006; Navarre et al.,

2006). Ces caractères se retrouvent chez les gènes stt et pnlH (figure I.1).

De plus, une étude de l’effet de la température de croissance montre l’augmentation de

l’expression des gènes stt et pnlH lorsqu’on augmente la température (Figure I.3). Cette

variation de l’expression peut dépendre de l’interaction entre H-NS et l’ADN. En effet,

d’après une étude récente, l’intensité de la liaison entre l’ADN et H-NS est dépendante de la

76


température (Garcia et al., 2005; Ono et al., 2005). Plus la température est forte, moins

l’interaction entre H-NS et l’ADN est forte. Mais, ce n’est pas le cas pour le cluster stt

puisque l’augmentation de la transcription en fonction de la température est conservée dans le

mutant H-NS (Figure I.3). L’hypothèse d’une autre régulation dépendante de la température a

donc été envisagée. Les protéines RpoH et RpoE, qui sont les facteurs sigma du stress

bactérien (choc osmotique, extracytoplasmique, thermique), pourraient être les acteurs de

cette régulation. Cette idée est renforcée par l’expression deux fois plus forte de la

transcription des gènes sttE et pnlH en présence d’un plasmide contenant le gène rpoH. Cela

suggère un effet activateur de cette sous-unité de l’ARN polymérase. Mais, la mutation rpoE

et rpoH semblent être létale chez D. dadantii et donc l’effet de ces facteurs σ n’a pas pu être

vérifié.

I.3) Discussion

L’analyse de la région d’ADN contenant les gènes stt et pnlH a permis d’apporter

quelques informations sur son architecture, ses fonctions probables et sa régulation.

Cette région contient deux opérons dont les produits permettraient la synthèse d’un

T2SS et de deux substrats putatifs pour celui-ci : les produits du gène pnlH et du gène 20719.

L’analyse de la régulation de l’expression des gènes stt et pnlH a révélé une régulation

par les régulateurs globaux Fis et H-NS. Ces derniers interagissent avec l’ADN et régule les

gènes localisés sur cette région d’ADN par encombrement stérique (Dorman and Deighan,

2003). H-NS, qui montre l’effet répresseur le plus important sur les gènes sttE et pnlH, se fixe

sur les gènes acquis récemment et dont le pourcentage en G+C est faible (Dorman, 2007;

Lucchini et al., 2006; Navarre et al., 2006). C’est le cas pour les gènes stt et pnlH car le

pourcentage en G+C de cette région est inférieur à celui du génome de D. dadantii.

De plus, les gènes stt et pnlH sont régulés par la température indépendamment de H-NS.

Cette régulation pourrait se faire par l’intermédiaire des protéines RpoH ou/et RpoE qui sont

les facteurs σ du stress bactérien.

77

Résultats Chapitre II

78

CChhaappiittrree IIII :: NNoouuvveellllee vvooiiee dd’’aacchheemmiinneemmeenntt ddee pprroottééiinneess àà llaa mmeemmbbrraannee

eexxtteerrnnee ddeess bbaaccttéérriieess GGrraamm nnééggaattiiff.. L’OM des bactéries à Gram négatif contient deux types de protéines : les OMPs et les

lipoprotéines. Ces protéines sont acheminées par deux voies distinctes : la voie YaeT pour les

OMPs et la voie Lol pour les lipoprotéines (Bos et al., 2007). Chacune de ces voies possède

des caractéristiques intrinsèques propres (paragraphe II de l’introduction bibliographique).

Des études de localisation de PnlH dans un mutant hns de D. dadantii ont mis en

évidence une localisation atypique de cette protéine par rapport aux autres protéines sécrétées

par les T2SSs. En effet, la protéine PnlH est insérée dans l’OM. Le séquençage N-terminal de

PnlH insérée dans cette membrane a montré que la protéine n’est pas maturée. L’absence de

ce processus est inhabituelle pour une protéine de l’OM puisque les OMPs connues à ce jour

ont leur séquence signal clivée par une signal peptidase lors du passage de l’IM. Au regard de

ces observations, le mécanisme par lequel la protéine PnlH est ancrée à l’OM a été étudié.

L’analyse de la séquence primaire a montré la présence d’une séquence signal Tat

suggérant le passage de l’IM par ce système. L’analyse de la sécrétion de PnlH dans un

mutant tat et la mutagénèse de la séquence signal Tat de PnlH ont permis de confirmer cette

hypothèse.

L’adressage à l’OM de D. dadantii de protéines constituées de la partie N-terminale de

PnlH fusionnée à des protéines de localisation cellulaire diverse a montré que toute

l’information nécessaire à la localisation de PnlH est contenue dans cette partie N-terminale.

Cet adressage étant conservé chez E. coli, il pourrait se faire par un mécanisme conservé chez

de nombreuses bactéries.

Une fois ancrée à l’OM, PnlH est prise en charge par le T2SS Stt qui permet le

passage de la face périplasmique à la face externe de l’OM chez D. dadantii. Cependant, le

signal de sécrétion ne se trouve pas dans la séquence signal puisque les protéines hybrides ne

sont pas sécrétées.

L’étude de la protéine PnlH a donc permis la découverte d’une nouvelle voie

d’acheminement de protéines à l’OM des bactéries à Gram négatifs et a montré la

fonctionnalité du second T2SS de D. dadantii.

L’ensemble de ces résultats est présenté dans l’article suivant : Novel mechanism of outer

membrane targeting of proteins in Gram negative bacteria.


Yann Ferrandez, Guy Condemine. Novel mechanism of outer membrane targeting of proteins in Gram-negative bacteria. Molecular Microbiology, 2008, vol.69, n°6, pp. 1349-1357.

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88


89

Résultats Chapitre III

CChhaappiittrree IIIIII :: AAnnaallyyssee ddee llaa vvooiiee dd’’aacchheemmiinneemmeenntt ddee PPnnllHH àà llaa mmeemmbbrraannee eexxtteerrnnee..

Dans le chapitre II, nous avons mis en évidence une troisième voie d’acheminement de

protéines à l’OM. Les caractéristiques de cette voie sont un passage de l’IM par le système

Tat et un export jusqu'à l’OM sans clivage de la séquence signal. Cet acheminement atypique

provient de la séquence N-terminale de PnlH contenant autour de la position 21, un motif

signal Tat caractéristique. De plus, cette séquence permet à de nombreuses protéines leur

translocation par Tat et leur acheminement à l’OM.

L’analyse de l’importance des différentes parties de cette séquence dans le passage de

l’IM par PnlH et son transfert à l’OM a été effectuée.

De plus, les protéines transloquées par le système Tat ont besoin d’acquérir leur

structure tridimensionnelle grâce à des protéines chaperonnes (paragraphe II.2 de

l’introduction bibliographique). En regardant de plus près les régions flanquant le système stt

et pnlH (figure III.1), on remarque la présence d’un gène dénommé 20719 qui ne possède

aucune homologie avec des gènes de fonction connue ; le produit de ce gène pourrait

participer à l’acheminement de PnlH. Son étude a donc été entreprise.

Enfin, le rôle de certains composants du système Out dans le fonctionnement de Stt a

été étudié (figure III.1).

III.1) Matériels et méthodes

Souches bactériennes, plasmides et milieux de culture

Les souches de D. dadantii ou d’E. coli (Tableau III.1) ont été cultivées en milieu LB

ou M63 avec si nécessaire de l’ampicilline (150µg/ml), de la kanamycine (75µg/ml) ou du

chloramphénicol (25µg/ml) à 30°C ou 37°C.

Les plasmides utilisés dans ce travail (tableau III.1) produisent des protéines qui sont

répertoriées dans la figure III.2.

Les fusions transcriptionnelles ont été obtenues par recombinaison homologue par

l’insertion d’une cassette contenant un gène de résistance et d’un gène rapporteur GUS. Les

doubles mutants ont été obtenus par transduction par le phage ΦEC2 dans le mutant de

régulation hns. Les protocoles de transformation, de transduction et de recombinaison

homologue sont ceux utilisés en routine au laboratoire (Condemine et al., 1992).

L’expression des différentes protéines hybrides a été induite par de l’arabinose (0,2 %)

à DO600 0,6 et a été exprimée pendant 90 min.

90


Construction des plasmides

Voir matériels et méthodes du chapitre II de la partie résultats.

Les amorces utilisées dans ce travail sont répertoriées dans le tableau III.2.

Les séquences des gènes pemB et d’outS de la souche A350 de D. dadantii sans leur

séquence signal ont été amplifiées par PCR en utilisant les amorces PemBxbaIfo/PemBpaeIre

et OutSxbaIfo/OutSpaeIre respectivement, permettant l’ajout d’un site de restriction XbaI en

5’ et d’un site de restriction PaeI en 3’. Ces fragments ont été clonés dans pBAD18 contenant

la séquence N-terminale de pnlH codant les 41 premiers acides aminés de PnlH afin de créer

pBADpnlH-pemB et pBADpnlH-outS.

La séquence N-terminale de PetA a été amplifiée par PCR à partir de l’ADN

génomique de Legionella pneumophila souche Lens avec les amorces

PetAEcoRIfo/PetAXbaIre permettant l’ajout d’un site de restriction EcoRI en 5’ et d’un site

de restriction XbaI en 3’. Après digestion par ces enzymes de restriction, ce fragment a été

cloné dans pBAD18 contenant la séquence C-terminale de PnlH.

Les étiquettes streptag et polyhistidine ont été rajoutées à la séquence de PnlH par PCR.

Le kit « Quickchange site-directed mutagenesis » (Stratagene) a été utilisé pour

obtenir le plasmide pBADpnlH∆28-41 avec les amorces pnlH mat hind3 fo/pnlh mat hind3 re

qui permettent l’ajout d’un site HindIII en position 123 par rapport au 1er nucléotide de la

séquence de pnlh dans le plasmide pBADpnlH-6His. Le plasmide obtenu a été digéré par

HindIII et autoligué pour former le plasmide pBADpnlH∆28-41-6His.

Les séquences de chaque plasmide sont vérifiées par séquençage.

Dosage de la β-glucuronidase

Voir matériels et méthodes de la partie I des résultats

Fractionnement cellulaire

Un millilitre de culture bactérienne a été centrifugé à 8000 rpm pendant 2 min. Le

surnageant est collecté et les protéines extracellulaires ont été précipitées dans de l’acétone

100% (2V/V) à -20°C. Après centrifugation, le culot a été repris avec du tampon Laemmli.

Un autre millilitre de culture bactérienne a été prélevé centrifugé pour récupérer le

périplasme par choc osmotique (Copeland et al., 1982).

Le reste de la culture est centrifugé à 8000 rpm pendant 10 minutes. Le surnageant a

été éliminé et le culot a été resuspendu dans 10mM Tris HCl (pH8), 1mM EDTA et 1mM

91


PMSF (PhenylMethylSulphonyl Fluoride). Les cellules ont été cassées par Presse de French

(11000 psi). Après élimination des débris par centrifugation, le lysat obtenu a été centrifugé à

34000 rpm pendant 90 min à 8°C. La fraction soluble obtenue correspond au périplasme +

cytoplasme des bactéries. Le culot, qui est resuspendu dans du TE+PMSF, correspond à la

membrane.

Flottaison

L’IM et l’OM ont été séparées par ultracentrifugation de la fraction membranaire en

gradient de saccharose (65%-38% avec 20mM HEPES) pendant 72 heures à 48000 rpm à

8°C. Des fractions ont été ensuite récupérées par une pompe péristaltique. Les protéines de

chaque fraction ont été ensuite précipitées avec de l’éthanol absolu (2V/V) à -20°C. Les

protéines précipitées ont été analysées par immunodétection. L’activité NADH oxydase de

chaque fraction a été analysée afin de déterminer la localisation de l’IM. Elle est mesurée par

la diminution de l’absorbance à 340 nm du NADH (50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM DTT, 0,2

mM NADH). Après le Western Blot, les membranes PVDF ont été incubées avec du bleu de

Coomassie pour localiser les porines (OM).

Gel d’électrophorèse et Western Blot

Tous les échantillons ont été bouillis dans le tampon Laemmli avant la migration en

SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Les protéines ont été transférées sur une membrane PVDF. Les

membranes ont été incubées avec anticorps anti-PemB à une dilution au 1:25000 et avec un

anticorps secondaire couplé à HRP à une dilution au 1:12500 ou du Ni-NTA couplé à HRP ou

de la streptavidine couplée à HRP. La révélation a été réalisée avec le kit de détection ECL

(GE healthcare).

Incubation membranaire

Les membranes des bactéries ont été extraites comme décrit ci-dessus et incubées avec

du PBS seul ou avec du NaCl (1M), du Na2CO3 (0.2M) ou de l'urée (5M) pendant 2 heures

avec une agitation à 18 rpm. Les échantillons ont été centrifugés à 34000 rpm pendant 90 min

à 8 º C. Un échantillon du surnageant et du culot ont été prélevés.

Microscopie

Les différentes souches de D. dadantii transformées par le plasmide

pBADpnlHstreptagC ont été cultivées à 37°C en milieu M63. A DO600 0,8, l’expression de

92


PnlHstreptagC a été induite avec de l’arabinose (0,2%) pendant 90 min. Un millilitre de

culture a alors été prélevé et lavé trois fois avec du PBS. Le culot a été repris avec du PBS 1%

de gélatine et incubé pendant 1 heure à 30°C. Les cellules sont été ensuite incubées avec de la

streptavidine couplée à l’HRP (1 µg/ml) pendant 1 heure. Après trois lavage au PBS, 10 µl de

culture ont été déposées sur lame.

III.2) Résultats

III.2.1) Analyse de la séquence signal N-terminale

III.2.1.1) Localisation d’une protéine associant la séquence N-terminale de PnlH avec

une lipoprotéine

La séquence N-terminale de PnlH contient toute l’information permettant aux protéines

PemA, BlaM et KdgR d’être exportées à l’OM (chapitre II des résultats). Ces protéines ont

toutes la particularité d’être soluble. La question est de savoir si la séquence N-terminale de

PnlH peut exporter des protéines des membranes et tout particulièrement les lipoprotéines.

Pour étudier cela, la séquence N-terminale de PnlH a été fusionnée avec la séquence mature

de PemB (figure III.2). Cette protéine est une pectine méthyle estérase qui a la particularité

d’être une lipoprotéine ancrée à la face périplasmique de l’OM de D. dadantii (Shevchik et

al., 1996). Des études de localisation ont montré la présence de PnlH_PemB dans la fraction

membranaire d’E. coli et plus précisément dans l’OM (figure III.3). La séquence N-terminale

de PnlH permet donc aussi l’acheminement d’une lipoprotéine à l’OM. La même expérience a

été testée avec la lipoprotéine OutS (PnlH_OutS ; figure III.2) mais PnlH_OutS n’a jamais pu

être observée.

III.2.1.2) Organisation de la séquence N-terminale de PnlH

La séquence N-terminale de PnlH permet à la fois le passage de l’IM par la voie Tat,

mais aussi l’ancrage de la protéine à l’OM. Nous avons entrepris une étude des propriétés de

cette séquence d’adressage.

Lorsqu’on ajoute une séquence de huit résidus (StrepTag) à l’extrémité N-terminale

(Figure III.2), PnlH qui est normalement localisée au niveau de l’OM se retrouve dans le

cytoplasme des bactéries. Cet ajout perturbe l’information de la séquence signal de PnlH et

empêche l’exportation de PnlH par le système Tat.

Pour analyser le rôle des différentes parties N-terminale de PnlH, une protéine

dépourvue des acides aminés 28 à 41 avec une étiquette polyhistidine (PnlH∆28-41-6-His) a

93


été construite (figure III.2). Des études de localisation ont mis en évidence la présence de

PnlH∆28-41-6His dans la fraction membranaire (figure III.4.A) et plus précisément dans l’IM

d’E. coli (figure III.4.B). De plus, des incubations de la fraction membranaire contenant

PnlH∆28-41-6His avec de l’urée ont prouvé qu’elle n’est pas seulement associée mais insérée

dans cette membrane (figure III.4.C). Ainsi, la délétion des acides aminés 28 à 41 change

PnlH d’une protéine ancrée à l’OM en une protéine ancrée à l’IM. Mais, cette insertion dans

l’IM est elle dépendante du système Tat ?

Pour résoudre cette question, la protéine PnlH∆28-41-6His a été produite dans un

mutant tatB. Dans ce cas, la protéine délétée est localisée dans le cytoplasme (figure III.4.A).

L’insertion dans l’IM de PnlH∆28-41 dépend donc du système Tat. La première partie de la

séquence signal (1 à 28) permet donc la reconnaissance de PnlH par le système Tat et permet

son insertion dans l’IM. Par contre, l’orientation de PnlH∆28-41-6His entre la face

cytoplasmique et la face périplasmique de cette membrane n’a pas encore été déterminée.

III.2.2) Implication des protéines Out dans le fonctionnement du système Stt

Une fois PnlH ancrée à l’OM, le système Stt permet le passage de PnlH de la face

interne à la face externe de l’OM. Mais, ce système semble être dépourvu des protéines

T2S:H, O et B présentes dans le système Out (figure III.1). Les protéines B et H ne sont pas

indispensables pour le fonctionnement de tous les T2SSs mais la prépiline peptidase T2S:O

est indispensable pour la mise en place des pseudopilines (voir paragraphe III.2.3.1.b de

l’introduction bibliographique). Ces protéines manquant au système Stt pourraient être

compensées par la présence des composants du système Out. En effet, OutO pourrait être la

prépiline peptidase des pseudopilines de Stt. Un cas similaire a déjà été décrit avec la protéine

PilD. En effet, cette protéine est la prépiline peptidase des pilines du pili de type IV et des

pseudopilines des T2SSs Hxc et Xcp de P. aeruginosa (Ball et al., 2002; Nunn and Lory,

1991). L’étude de l’effet des composants du système Out absents du système Stt a donc été

entreprise.

Dans cette optique, les deux mutants hns outO et hns outB ont été construits. La

présence de la mutation hns est nécessaire pour une expression du système Stt satisfaisante

(chapitre I et II de la partie résultats).

Pour faciliter la détection de PnlH, le plasmide pBADpnlHstreptagC a été construit.

Celui-ci permet d’induire la production de PnlH avec une étiquette streptag à l’extrémité C-

terminale (PnlHstreptagC) (figure III.2). Grâce à la technique d’immunofluorescence en

utilisant de la streptavidine couplée à la FITC, nous pourrons ainsi visualiser PnlH.

94


Avant toute chose, il fallait démontrer que l’ajout d’une étiquette streptag ne perturbait

pas la localisation finale de PnlH. Des expériences de localisation de PnlHstreptagC ont

confirmé l’insertion de cette protéine dans l’OM que ce soit chez D. dadantii (résultats non

montrés) ou E. coli (figure III.5). Ainsi, l’ajout d’une étiquette streptag à l’extrémité C-

terminale ne perturbe pas la localisation de PnlH et cette protéine facilitera la détermination

du rôle des protéines Out dans le fonctionnement de Stt.

La sécrétion de PnlHstreptagC dans les souches hns outO et hns outB a été testée.

L’observation au microscope à épifluorescence a montré la présence de PnlH à la surface des

mutants hns, hns outO et hns outB et son absence dans un mutant dépourvu du système Stt

(figure III.6). La production de PnlHstreptagC a été vérifiée pour chacun des mutants. Le rôle

de la protéine OutH dans le fonctionnement de Stt n’a pas pu être déterminé puisqu’il n’existe

pas au sein de la collection de souches du laboratoire un mutant non-polaire de ce gène.

L’ensemble de ces résultats suggère une translocation de PnlH par le système Stt

indépendamment d’OutB et OutO. La première n’est pas indispensable pour le

fonctionnement de tous les T2SSs. En effet, plusieurs T2SSs sont dépourvus de la protéine

accessoire T2S:B (Figure 22 ; paragraphe III.1.5 de l’introduction bibliographique). La

protéine T2S:H est quant à elle une pseudopiline mineure et son absence ne semble pas avoir

de conséquence sur la mise en place du pseudopilus (Filloux, 2004). Mais, l’absence de rôle

d’OutO dans la maturation des pseudopilines du système Stt est plus inattendue.

III.2.3) Implication du gène 20719 dans la localisation finale de PnlH

Le gène 20719 code une protéine de 30 kDa, probablement ancrée à l’IM par 4 TMs

selon les programmes de prédiction de topologie. Cette protéine ne présente aucune

homologie avec des protéines contenues dans les banques de données. Ce gène se trouve à

120 nucléotides en aval de sttS avec lequel il pourrait former un opéron (figure III.1). Sa

position entre sttS et pnlH permet d’émettre deux hypothèses pour le rôle de cette protéine :

elle pourrait jouer un rôle dans la mise en place ou le fonctionnement de la machinerie Stt ou

être une chaperonne nécessaire au repliement ou à la translocation de PnlH par Tat.

Grâce au dosage de la fusion transcriptionnelle du gène 20719 avec le rapporteur

GUS, une régulation analogue à celle de l’opéron stt-pnlH a été mise en évidence (chapitre II

de la partie résultats) (figure III.7). En effet, l’expression de 20719 est multipliée par 63 dans

un mutant hns cultivé à 37°C par rapport à la souche sauvage cultivée à 30°C.

Pour essayer de trouver la fonction de la protéine 20719, La localisation de

PnlHstreptagC à la surface du mutant hns-20719 a été testée. Les observations

95


microscopiques ont montré une fluorescence des bactéries identique à celle du mutant hns

(figure III.6). Au vu de cela, on ne peut pas conclure sur le rôle du produit du gène 20719.

III.3) Discussion

La séquence N-terminale de PnlH permet à plusieurs protéines solubles de différents

compartiments cellulaires de s’insérer dans l’OM. Dans ce chapitre, nous démontrons que la

séquence N-terminale de PnlH peut aussi acheminer à l’OM la lipoprotéine PemB. Au

contraire, les expériences avec la fusion de la séquence N-terminale de PnlH à la séquence

mature d’OutS suggère une limite dans la capacité d’adressage de la séquence N-terminale de

PnlH. Cette limite ne serait pas propre à cette dernière mais plutôt à la machinerie Tat qui ne

transloque que des substrats ayant acquis leur structure tridimensionnelle (paragraphe I.3.2 de

l’introduction bibliographique). Cette caractéristique expliquerait l’absence de détection de

PnlH_OutS. En effet, la protéine OutS au contraire de PemB a besoin de la mise en place d’un

pont disulfure pour acquérir sa structure tridimensionnelle. Ce pont disulfure, qui est un

processus d’oxydation de deux cystéines au niveau de leur atome de souffre, ne peut pas être

mis en place dans le cytoplasme de la bactérie puisque celui-ci est un compartiment réducteur.

Ainsi, la protéine hybride PnlH_OutS ne peut pas acquérir sa conformation tridimensionnelle

et elle est donc très vite dégradée.

Une autre protéine passant par le système Tat ne subit pas le processus de clivage de la

séquence signal. Cette protéine est la protéine Rieske Fe/S de L. pneumophila nommée PetA.

Cette protéine transloque par le système Tat et se localise ensuite dans l’IM (De Buck et al.,

2007). Nous avons voulu savoir si cette séquence signal de PetA peut acheminer PnlH à l’IM

ou l’OM des bactéries ? La séquence N-terminale de PnlH a donc été remplacée par la

séquence signal de PetA (figure III.2). Nous n’avons jamais pu visualiser cette protéine

hybride. Une explication à cela est que PetA_PnlH doit être dans sa conformation

tridimensionnelle pour être transloquée par Tat comme pour PnlH_OutS. Ici, PetA_PnlH ne

serait pas dans sa conformation à cause de l’absence de chaperonnes ou cofacteurs

spécifiques. En effet, certains substrats de Tat ont besoin de chaperonnes cytoplasmiques

spécifiques à l’espèce pour acquérir leur structure tridimensionnelle (paragraphe I.3.2 de

l’introduction bibliographique). De plus, ces chaperonnes se fixent préférentiellement sur la

séquence signal Tat, qui est non-structurée, et ainsi protéger la protéine de la dégradation. Si

cette chaperonne est absente, la séquence signal Tat de la protéine concernée est reconnue par

les protéases du cytoplasme et elle est donc très vite dégradée (paragraphe I.3.2 de

96


l’introduction bibliographique). C’est probablement le cas pour la protéine PetA_PnlH. Pour

éviter la dégradation prématurée de cette protéine, il faudrait l’exprimer dans une souche

Legionella qui possède la chaperonne cytoplasmique spécifique de la protéine PetA (De Buck

et al., 2007).

Dans le cas de PnlH, une de ces chaperonnes aurait pu être le produit du gène 20719

qui fait partie du cluster stt et qui montre la même régulation que sttE et pnlH (répression par

le régulateur H-NS et activation à forte température). Mais, les observations microscopiques

montrent que la protéine 20719 n’aurait aucune influence sur l’acheminement de PnlH.

Malgré tout, la régulation similaire observée entre stt et 20719 suggère que le produit du gène

20719 a un rôle à jouer dans le système Stt.

En plus de la structure tridimensionnelle, la translocation par la machinerie Tat

nécessite la présence d’un motif Tat à l’extrémité N-terminale des protéines (paragraphe I.3.1

de l’introduction bibliographique). Chez PnlH, ce motif est contenu dans les 28 premiers

acides aminés. La présence de cette région permet à elle seule (sans la présence de la

deuxième partie (PnlH∆28-41)) l’insertion dans l’IM par le système Tat. Mais, la position de

cette protéine délétée entre la face périplasmique et la face cytoplasmique reste encore

inconnue. Ceci ne nous permet pas de conclure sur le rôle de la seconde partie de la séquence

N-terminale (PnlH∆28-41) dans le passage de l’IM par PnlH et son export à l’OM. Malgré

tout, l’hypothèse d’une organisation bipartite de la séquence N-terminale de PnlH est

envisagée : la première partie, qui comprend les 28 premiers résidus, permettrait à PnlH le

passage de l’IM par le système Tat. Une fois l’IM traversée, un système encore inconnu

permettrait le transport de PnlH jusqu'à l’OM où la seconde partie de la séquence signal (du

résidu 28 à 41) est indispensable.

Une fois PnlH ancrée à l’OM, le système Stt permet le passage de PnlH de la face interne à la

face externe de l’OM. Le fait que certains composants soient absents du système Stt par

rapport au système Out suggère le remplacement des composants absents par leurs

homologues Out. Mais les observations microscopiques ne montrent aucun rôle des protéines

OutO et OutB dans le fonctionnement de Stt. T2S:B et T2S:H ne sont pas indispensable pour

le fonctionnement des T2SSs au contraire de T2S:O. Mais de récents résultats obtenus au

laboratoire montrent le clivage de la protéine SttG par OutO. Ce résultat va à l’encontre des

observations microscopiques obtenues avec le mutant hns outO. Une explication à ces

résultats opposés est la présence dans le génome d’un gène permettant la maturation des

pseudopilines Stt.

97

CChhaappiittrree IIVV :: RReecchheerrcchhee ddee ppaarrtteennaaiirreess pprroottééiiqquueess ppeerrmmeettttaanntt ll’’aacchheemmiinneemmeenntt ddee PPnnllHH

ddee llaa mmeemmbbrraannee iinntteerrnnee vveerrss llaa mmeemmbbrraannee eexxtteerrnnee

Le transport de protéines à leur destination finale est opéré par des processus

impliquant des complexes moléculaires qui reconnaissent leurs cibles par l’identification de

séquences consensus ou de motifs tridimensionnels. Chez beaucoup de protéines sécrétées,

c’est la séquence N-terminale qui contient toutes les informations nécessaires pour permettre

des interactions avec ces complexes protéiques permettant leur acheminement (Hegde and

Bernstein, 2006). L’étude de PnlH a permis de mettre en évidence une nouvelle voie

d’acheminement de protéines à l’OM. La façon dont PnlH traverse le périplasme et s’insère

dans l’OM n’est pas connue. L’insertion des OMPs dans l’OM nécessite un complexe

multiprotéique dont le composant principal est la protéine YaeT. Cette protéine reconnaît un

motif situé à l’extrémité C-terminale des OMPs. Ce motif n’est pas présent à l’extrémité de

PnlH. Mais, il a été suggéré que ce motif est reconnu quand il est à l’intérieur de la protéine

(Bos et al., 2007). Nous avons donc testé si l’insertion de PnlH dans l’OM est dépendante de

YaeT.

De plus, pour identifier les partenaires protéiques interagissant avec cette séquence N-

terminale, nous avons mis en place une approche génétique.

IV.1) Matériels et méthodes

IV.1.1) Cinétique d’insertion de PnlH dans la membrane externe d’un mutant yaeT

E. coli

La souche PAP8810 d’E. coli (MC4100 arar/–∆yaeT∆(λatt-lom)::bla paraBAD–yaeT

araC degP41::Km (Collin et al., 2007)) a été transformée avec le plasmide pACT3pnlH-6his

qui permet la synthèse de PnlH avec une étiquette polyhistidine en présence d’IPTG. La

souche transformée a été cultivée en milieu LB en présence de chloramphénicol (25 µg/ml) et

d’arabinose (0,01 %) à 30°C. A DO 0,5, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS pour

éliminer l’arabinose et divisées en différentes fractions de culture LB avec du glucose (0,2 %)

(permet la répression du promoteur pBAD) et du chloramphénicol (25 µg/mL). Chaque

fraction a été induite à l’IPTG (1 mM) à différents temps après ces lavages (T0 = 0 min, T1 =

30 min, T2 = 60 min, T3 = 120 min) permettant l’induction de PnlH-6his. Après une

expression de PnlH-6his pendant 90 min, les cellules ont été centrifugées et ont été reprises

98

Résultats Chapitre IV

dans 5 mL de TE+PMSF. Les cellules ont été cassées à la Presse de French et le lysat obtenu

a été centrifugé à 34000 rpm pendant 90 min. Le culot, correspondant à la membrane, est

repris avec du TE+PMSF.

Les échantillons ont été repris dans du tampon Laemmli avant la migration en SDS-

PAGE (Laemmli, 1970) et ont été bouillis pour la détection de PnlH-6His ou non-bouillis

pour la détection de OmpA. Après migration en SDS-PAGE, les protéines ont été transférées

sur une membrane PVDF. Les membranes ont été incubées avec des anticorps anti-OmpA à

une dilution au 1:25000 et avec un anticorps secondaire couplé à HRP à une dilution au

1:12500 ou du Ni-NTA couplé à HRP. La révélation a été réalisée avec le kit de détection

ECL (GE Healthcare).

IV.1.1) Approche génétique pour la recherche de partenaires protéiques

Souches bactériennes

Les souches d’E. coli NM522 (F’ proAB lacIq ∆(lacZ)M15/∆(lac-proAB) thi hsd-5) et

E. coli I3314 (MC4100 araD139∆(argF-lac)4169 rpsL150 relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 ∆mal

E444) ont été cultivées en LB. L’expression des protéines a été induite avec de l’IPTG (1

mM) ou avec de l’arabinose (0,2 %) à DO600 0,6 et a été exprimée pendant 90 min. Les

bactéries ont été transformées après traitement au CaCl2 (Mandel and Higa, 1970) ou par

électroporation.

Plasmide

La séquence de malE d’E. coli a été amplifiée par PCR en utilisant les primers 5'-

GGCCTCTAGAATCGAAGAAGGTAAACTGGTA-3' permettant l’ajout d’un site de

restriction XbaI et 5'-GGCCGCATGCACGCCGCATCCGGCATTTC-3' permettant

l’incorporation d’un site de restriction PaeI. Ce fragment a été cloné dans pBAD18 contenant

la séquence N-terminale de pnlH codant pour les 41 premiers acides aminés de PnlH afin de

créer pBADpnlHssmalE. Le fragment pnlHssmalE a été cloné dans un plamide pUC18 sous

promoteur lacZ.

Fractionnement cellulaire, flottaison, incubation membranaire

Voir matériels et méthodes du chapitre III des résultats.

La séparation des membranes en gradient discontinu a été effectuée en déposant

l’échantillon étudié dans un tube à ultracentrifuger contenant un millilitre de solution de

99


saccharose à 65%, 56%, 44% et 38% (1mL de chaque densité). Le gradient a été centrifugé à

48000 rpm à 8°C pendant 4 heures.

Gel d’électrophorèse et Western Blot

Tous les échantillons ont été bouillis dans le tampon Laemmli avant la migration en

SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Les protéines ont été transférées sur une membrane PVDF. Les

membranes ont été incubées avec anti-MBP à une dilution au 1:25000 et avec un anticorps

secondaire couplé à HRP à une dilution au 1:12500 ou du Ni-NTA couplé à HRP. La

révélation a été réalisée avec le kit de détection ECL (GE healthcare).

Mutagénèse :

La mutagénèse avec le phage λ comportant l’élément transposable Tn10 a été réalisée

selon le protocole suivant : la souche réceptrice (E.coli I3314 pUC18pnlHssmalE) a été

cultivée en milieu LB avec 0,2% de MgSO4, 0,4% de maltose et de l’ampicilline (150 µg/ml)

jusqu'à une DO600 de 0,5. 100µL du stock de phage λ ont été ajoutés et ont été incubés

pendant 20 min à 30°C sans agitation. Les cultures ont été ensuite centrifugées à 8000 rpm

pendant 10 min et les culots ont été lavés 3 fois avec du LB contenant 1% de citrate (Le

citrate permet de chélater les ions magnésium indispensables à l’adhésion du bactériophage à

la bactérie et évite ainsi de multiples transductions sur la même bactérie). Les cellules ont

ensuite été reprises avec 5 mL de LB citrate et ont été incubées à 30°C sous agitation pendant

1 heure.

Des échantillons de cette culture d’expression ont alors été étalés sur milieu Mac

Conkey supplémenté en maltose, en IPTG (1 mM), en ampicilline (150 µg/ml) et en

tétracycline (5 µg/ml). Les boites ont été incubées à 25°C pendant 48 heures.

IV.2) Résultats :

IV.2.1) Implication de la protéine YaeT dans l’acheminement de PnlH à la

membrane externe

Cette expérience a été réalisée avec une souche d’E. coli yaeT qui est un mutant

conditionnel de YaeT. L’expression de yaeT est sous le contrôle du promoteur pBAD et le

gène n’est exprimé qu’en présence d’arabinose. Si l’arabinose est éliminé et remplacé par du

glucose, la souche lyse au bout de quelques générations. De plus, un autre effet de l’absence

100


de YaeT est l’impossibilité de séparer les membranes (Collin et al., 2007). Dans l’expérience

réalisée, la synthèse de PnlH a été induite par l’IPTG à différents temps après l’élimination de

l’arabinose du milieu de culture. La quantité de PnlH présente dans la fraction membranaire a

été suivie au cours du temps et a été comparée à celle présente dans une souche cultivée en

présence d’arabinose. L’immunodétection d’OmpA a permis de confirmer l’absence de YaeT.

En effet, OmpA, qui est une porine d’E. coli, est insérée dans l’OM. Cette insertion est

facilitée par la présence de YaeT puisque son absence provoque une mauvaise insertion de

OmpA (Collin et al., 2007; Doerrler and Raetz, 2005; Kleinschmidt, 2003). Dans notre

expérience, la proportion d’OmpA mal insérée est plus forte lorsqu’on supprime l’expression

de YaeT par rapport au témoin positif (T+) ou à l’échantillon prélevé avant les lavages (Av)

(figure IV.1). De plus, l’absence de YaeT dans les souches est confirmée par la lyse de la

bactérie au bout de 4h30 de croissance sans arabinose (figure IV.1) puisqu’il a été démontré

que l’absence prolongée de YaeT provoque la mort de la bactérie (Voulhoux et al., 2003; Wu

et al., 2005). Ces observations prouvent la diminution de la quantité de YaeT pendant

l’expérience.

Pour tester l’action de YaeT dans l’acheminement de PnlH, l’effet sur l’insertion dans

les membranes de PnlH-6His dans la souche PAP8810 a été déterminé. Les résultats ont

montré le même taux de PnlH au cours du temps à partir du moment où le taux de YaeT

diminue (de T0 à T3) (figure IV.1). L’absence de YaeT ne provoque pas de changement dans

la quantité de PnlH-6His présent dans les membranes suggérant ainsi que l’acheminement de

PnlH à l’OM se fait indépendamment de cette protéine.

IV.2.2) Recherche de partenaires protéiques impliqués dans le passage de la

membrane interne à la membrane externe par une approche génétique

Cette approche est une méthode de sélection génétique basée sur les travaux de Seydel

et collaborateurs (1999). Dans cette approche génétique, les caractéristiques de ciblage de la

séquence N-terminale de PnlH en association avec une MBP (Maltose Binding Protein)

nommée MalE ont été utilisées. Cette protéine MalE capture le maltose pour l’amener aux

protéines MalF et MalG de l’IM avec lesquelles MalE forment un transporteur. Celui-ci

permet l’assimilation du maltose par la bactérie. La protéine MalE ne fonctionne que si elle

est localisée dans le périplasme puisqu’elle doit impérativement interagir avec les protéines

MalF et MalG pour le fonctionnement de ce transporteur maltose. En association avec la

séquence N-terminale de PnlH, la protéine PnlH_MalE se localiserait au niveau de l’OM.

101


Cela empêcherait la fonction de MalE et par conséquence l’assimilation du maltose (figure

IV.2). La dégradation du maltose peut être testée sur un milieu Mac Conkey qui colore en

rouge les colonies qui métabolisent ce sucre. L’insertion aléatoire d’un transposon dans un

gène dont le produit permet l’insertion de PnlH dans l’OM conduira à l’accumulation de

PnlH_MalE dans le périplasme rétablissant l’assimilation du maltose et provoquera la

coloration rouge des colonies sur un milieu Mac Conkey. Nous pourrons ainsi identifier les

partenaires du transfert de PnlH de l’IM à l’OM (figure IV.2).

Dans un premier temps, la localisation de PnlH_MalE dans l’OM a été déterminée.

Cette protéine hybride est détectée au niveau de l’OM d’E. coli I3314 (figure IV.3).

Cependant, PnlH_MalE semble instable puisqu’une protéine légèrement plus courte

réagissant avec l’anticorps MalE est retrouvée dans les fractions solubles (figure IV.3). Cette

protéine correspondrait au clivage de la protéine hybride entre la séquence N-terminale de

PnlH et MalE. Cette dégradation de PnlH_MalE serait due à l’action des protéases du

périplasme. Pour éviter ce clivage, l’action d’une de ces protéase périplasmique nommé DegP

a été inhibée en cultivant notre souche à 25°C puisqu’à faible température, DegP perd sa

fonction protéasique (Krojer et al., 2008b).

E. coli I3314 contenant PnlH_MalE a ainsi été cultivée à 25 º C sur un milieu Mac

Conkey supplémenté en maltose en présence ou en absence d'IPTG (figure IV.4). En absence

d'IPTG, les colonies E. coli I3314 exprimant PnlH_MalE ont montré un phénotype incolore

puisqu’elles ont été incapables de métaboliser le maltose. En présence d'IPTG, ces colonies

ont montré un phénotype rouge clair en comparaison avec les colonies exprimant le MBP du

plasmide pmalP (figure IV.3). Les variations de couleur entre les colonies après mutagénèse

permettront de discriminer les clones dans lesquels le transport de PnlH_MalE a été perturbé.

Après la mutagénèse par le Tn10, 24 clones présentant une couleur plus rouge parmi

environ 12000 colonies ont été obtenus. Les mutations ont été retransduites dans la souche

I3314 pour confirmer les phénotypes et identifier les faux positifs. Une fois les faux positifs

écartés, le nombre de clones restant était de 11 sur 24. Les mutations des 11 clones ont alors

été introduites dans la souche NM522 d’E. coli contenant le plasmide pBADpnlH-6His.

Une étude de la localisation de PnlH-6His a été réalisée sur chacun des clones NM522

mutés. Sur les 11 clones testés, aucun n’a montré de différence dans la localisation de PnlH-

6His par rapport au témoin (NM522 non mutée) (figure IV.4). L’exemple du clone n°9 est

présenté (figure IV.4).

Ces résultats suggèrent qu’aucun des transposons des différents clones ne s’est inséré

dans un gène dont le produit permet l’acheminement de PnlH à l’OM.

102


IV.3) Discussion

L’étude de PnlH a permis de mettre en évidence une troisième voie d’acheminement

de protéines à l’OM des bactéries. Une fois l’IM passée par le système Tat, PnlH doit s’ancrer

à l’OM. Cette insertion doit probablement faire intervenir des complexes protéiques. Une de

ces protéines pourrait être la protéine Omp85/YaeT qui est déjà impliquée dans le processus

d’insertion des OMPs (Voulhoux et al., 2003). Mais, les résultats présentés ici suggèrent le

contraire. Le taux de PnlH identique dans les fractions déplétées d’ YaeT et l’absence de

motifs de reconnaissance Omp85/YaeT chez PnlH laisse penser à un acheminement de cette

protéine à l’OM indépendamment de YaeT.

Une approche génétique pour permettre l’identification de partenaires protéiques

permettant l’insertion de PnlH à l’OM a été mise en place. Cette approche associe les travaux

de Seydel et collaborateurs (1999) et les caractéristiques de ciblage de la séquence N-

terminale de PnlH (chapitre II et III de la partie résultats). Malheureusement, l’utilisation de la

protéine PnlH_MalE dans ce crible n’a pas pu pour le moment permettre l’identification de

protéines partenaires pour l’acheminement de PnlH à l’OM. Le phénotype rouge foncé sur

boite Mac Conkey-maltose et la localisation de PnlH dans l’OM des 11 clones testés est

étonnant. Des explications à ces observations peuvent être avancées : (i) la mutation

provoquerait une expression plus forte de protéase périplasmique permettant un clivage plus

important de PnlH_MalE. Cela augmenterait le relargage de MalE dans le périplasme

conduisant à l’assimilation plus efficace du maltose. (ii) Une autre explication est que la

mutation permettrait une augmentation de la production de PnlH_MalE soit en augmentant le

nombre de copies du plasmide dans la cellule, soit en touchant à la régulation de l’expression

de la protéine. En tout cas, l’utilisation de PnlH_MalE pour cette approche ne semble pas

permettre la discrimination entre les clones ressemblant aux 11 clones testés et les clones dont

l’acheminement de PnlH à l’OM est perturbé.

103

Discussion & Perspectives

DISCUSSION

&

PERSPECTIVES

104


DDIISSCCUUSSSSIIOONN EETT PPEERRSSPPEECCTTIIVVEESS

Le séquençage du génome de D. dadantii a permis la mise en évidence d’un ensemble

de 15 gènes encadrés par deux ARNt Val dont les produits codent une seconde machinerie

T2SS chez D. dadantii nommée Stt. La présence de ces deux ARNt et un pourcentage en G+C

de ces gènes plus faible par rapport au reste du génome semble suggérer l’acquisition de ce

cluster par transfert latéral. En aval de l’opéron comprenant les gènes sttC à sttM (sauf sttH)

se trouve un gène dont le produit présente de l’homologie avec des pectine lyases nommé

PnlH et qui est le substrat de ce second T2SS. L’analyse de la régulation des gènes de cette

région d’ADN montre que l’expression de stt et pnlH est contrôlée principalement par la

protéine histone like H-NS et de façon secondaire par la température. D’après Dorman (2007),

H-NS serait une protéine permettant un « fitness économique » de la bactérie ; c'est-à-dire

qu’en se fixant sur le matériel génétique acquis par transfert latéral, elle permettrait à la

bactérie une adaptation future à de nouvelles conditions environnementales tout en

économisant de l’énergie. H-NS joue donc le rôle de « sentinelle du génome » (Dorman,

2007). Dans le cas de D. dadantii, le système stt et pnlH auraient été acquis par transfert

latéral et intégrés au génome. De là, H-NS aurait inhibé leur transcription et serait en

compétition avec d’autres régulateurs (facteurs σ, régulateurs globaux).

La différence du niveau de régulation de pnlH et stt par H-NS (6 fois pour le gène sttE et

10 fois pour le gène pnlH) suggère la présence d’un promoteur spécifique en amont de pnlH.

Une expérience d’extension d’amorce sur cette région d’ADN permettrait d’identifier la

position des points +1 de transcription des différents promoteurs.

L’étude de PnlH a permis de mettre en évidence une localisation atypique de cette

protéine par rapport aux autres substrats des T2SSs. En effet, la protéine PnlH est ancrée à

l’OM de D. dadantii. De plus, l’acheminement de PnlH à cette membrane se fait sans clivage

de sa séquence N-terminale. Cette observation est inhabituelle pour une protéine de l’OM. En

effet, les OMPs ou les lipoprotéines voient leur séquence signal clivée par une signal

peptidase lors du passage de l’IM (paragraphe II de l’introduction bibliographique) (figure

D1).

Ces observations m’ont amené à analyser de façon plus approfondie l’acheminement de

PnlH à l’OM puisque la localisation de PnlH dans l’OM est aussi retrouvée chez E. coli. Cette

localisation similaire dans deux espèces bactériennes suggère un mécanisme général pour

l’acheminement de PnlH à l’OM.

105


La première étape de son acheminement à l’OM est le passage de l’IM par la machinerie

Tat (figure D1). L’analyse de la séquence primaire de PnlH a permis de mettre en évidence la

présence d’un motif Tat caractéristique autour de la position 21 de la protéine. De plus,

l’analyse de PnlH dans un mutant tatB et la mutation de ce motif ont confirmé le rôle de Tat

dans le passage de l’IM. Mais, la présence de ce motif dans les substrats Tat n’est pas la seule

exigence de cette machinerie. En effet, ces substrats ont besoin d’être dans leur conformation

tridimensionnelle pour être transloqués par Tat. L’acquisition de cette structure 3D est opérée

par des chaperonnes cytoplasmiques (paragraphe I.3.2 de l’introduction bibliographique). Le

fait que PnlH passe l’IM par Tat chez E. coli et chez D. dadantii suggère l’acquisition de sa

structure 3D par l’intermédiaire d’une chaperonne présente chez ces deux espèces. Deux

candidats semblent remplir les conditions pour être cette chaperonne : les chaperonnes de

ménage DnaK ou GroEL. En effet, il a récemment été démontré le rôle déterminant de ces

chaperonnes de ménage dans l’acquisition de la structure tridimensionnelle de substrats Tat

(Graubner et al., 2007; Perez-Rodriguez et al., 2007). Pour voir l’influence de ces protéines

sur PnlH, des expériences de localisation de cette protéine dans un mutant dépourvu de DnaK

ou de GroEL seront effectuées.

Une fois l’IM passée par le système Tat, la protéine PnlH est amenée à l’OM. Cet

acheminement et l’insertion se fait par l’intermédiaire de la séquence N-terminale. En effet,

les 41 premiers acides aminés de la séquence de PnlH permet le transport de protéines de

différents compartiments cellulaires à l’OM. Ils ont ainsi permis le transport d’une protéine

cytoplasmique (KdgR), de protéines périplasmiques (BlaM et MalE), d’une protéine

extracellulaire (PemA) et d’une lipoprotéine (PemB).

L’analyse d’une délétion de la séquence N-terminale de PnlH suggère une

organisation bipartite : la première partie comprenant les résidus 1 à 28 (possède le motif Tat)

permettrait la reconnaissance de PnlH par le système Tat et son insertion dans l’IM. Mais, son

orientation entre la face périplasmique et la face cytoplasmique n’est pas encore connue. Pour

résoudre ce problème, l’accessibilité de la protéine PnlH délétée (PnlH∆28-41) aux protéases

sur des sphéroplastes sera testée (De Buck et al., 2007). La deuxième partie de la séquence N-

terminale de PnlH contiendrait les informations nécessaires pour l’acheminement de PnlH.

Pour définir les résidus impliqués dans le transport de PnlH, des délétions/modifications dans

la région 29-41 seront effectuées et analysées. Une autre approche peut être envisagée pour

déterminer les spécificités de la séquence N-terminale de PnlH. En effet, les séquences signal

sont en général très variables et seuls les résidus jouant un rôle spécifique sont conservés (Cao

and Saier, 2003). Le séquençage génomique de la séquence N-terminale de PnlH des diverses

106


souches d’E. chrysanthemi sera effectué. Leur alignement permettra, s’il y a assez de

variabilité entre elles, de mettre en évidence les acides aminés conservés. Une mutagénèse de

ces résidus et l’étude de ces dérivés mutés permettra de savoir quels sont les résidus impliqués

dans chaque étape du processus d’acheminement de PnlH à l‘OM.

Ce processus d’acheminement à l’OM doit probablement faire intervenir des

complexes protéiques. Par exemple, l’acheminement des OMPs fait intervenir un complexe

protéique (Mao) dont un des composants est la protéine Omp85/YaeT (figure D1). Ce dernier

reconnaît au niveau des substrats dont elle facilite l’insertion dans l’OM, des motifs

spécifiques (paragraphe II.1 de l’introduction bibliographique). Dans le cas de PnlH, c’est sa

séquence N-terminale qui porte toute l’information pour la reconnaissance par un complexe

protéique. Mais, ces partenaires protéiques impliqués dans son transport ne sont pas encore

identifiés. Il fallait donc mettre en place une expérience pour permettre l’identification de ces

partenaires. Nous avons donc utilisé une approche génétique dérivée de celle de Seydel et

collaborateurs (1999) en utilisant les caractéristiques de ciblage de la séquence N-terminale de

PnlH. Dans cette technique, la recherche de mutations entrainant la modification de la

localisation de PnlH_MalE doit permettre l’identification de partenaires. Cette approche

n’ayant pour le moment donné aucun résultat, un autre crible a été mis au point. Pour ce

crible, la protéine PnlH_CVA a été construite (Ize et al., 2002). Cette protéine allie la

séquence N-terminale de PnlH avec la séquence mature de la colicine V d’E. coli. Cette

dernière n’est active que lorsqu’elle est localisée dans le périplasme des bactéries, provoquant

la mort de celles-ci. Or, la protéine fusion PnlH_CVA devrait s’ancrer dans l’OM et serait

donc inactive. Si elle n’est plus acheminée à cette membrane, la protéine resterait dans le

périplasme ou ancrée à l’IM. Dans ce cas, PnlH_CVA deviendrait active et provoquerait la

mort de la bactérie. Ceci devrait permettre de sélectionner les clones où l’acheminement de la

protéine hybride est perturbé. Quand ces gènes impliqués dans le transport des protéines

hybrides chez E. coli seront identifiées, leurs homologues chez D. dadantii seront mutés.

L’analyse de la localisation de PnlH dans les mutants créés confirmera la fonction du gène

muté. La recherche d’homologues de ces gènes dans les banques de données permettra de

savoir si cette voie d’adressage est présente dans toutes les familles de bactéries.

Mais, la limite de cette approche génétique dans l’identification de partenaire est que

l’insertion d’élément transposable dans un gène impliqué dans le transport de PnlH est létale

pour la bactérie. Ainsi, l’identification de partenaires devient impossible avec cette technique.

Pour contourner cet obstacle, une approche biochimique par pull down est envisagée. Dans

cette technique, on utilise les propriétés d’affinité de PnlH avec ses partenaires protéiques. Un

107


dérivé de PnlH comportant une étiquette C-terminale permettant la fixation sur une résine sera

purifié. Une fois fixé, le passage d’une fraction périplasmique permettra de retenir les

protéines interagissant avec l’extrémité N-terminale de PnlH. Ces protéines, une fois éluées

pourront être identifiées par MALDI TOF. L’avantage de cette méthode est qu’une fraction

périplasmique de D. dadantii pourra être utilisée.

L’ancrage de PnlH à l’OM se fait par l’intermédiaire de sa séquence N-terminale. Or,

la plupart des protéines de l’OM sont insérées par des feuillets β. Mais un cas montre que cet

ancrage à l’OM peut se faire par une hélice α. Cette protéine est Wza d’ E. coli (Dong et al.,

2006). L’insertion de PnlH se ferait de manière similaire que Wza puisque les programmes de

prédiction de topologie suggèrent la présence d’une hélice α au niveau de la séquence N-

terminale de PnlH.

Une fois PnlH ancrée à l’OM, cette protéine est prise en charge par le système Stt

(figure D1). Ce système permet le passage de PnlH de la face périplasmique à la face externe

de l’OM de D. dadantii. Mais, l’absence des gènes homologues T2S:H et T2S:O et des gènes

accessoires T2S:B, T2S:N et T2S:A dans ce système stt pose des questions sur son

fonctionnement. Les protéines accessoires T2S:B, T2S:N et T2S:A et la pseudopiline mineure

T2S:H ne sont pas indispensables pour le fonctionnement des T2SSs (paragraphe III.2.4 de

l’introduction bibliographique). Mais, l’absence d’une maturation des pseudopilines Stt par la

prépiline peptidase T2S:O est plus problématique. Or, le gène outO est le seul gène de

prépiline peptidase identifiable dans le génome. De plus, il a été démontré qu’OutO clive

SttG. En l’absence d’OutO, la maturation de SttG, SttJ, SttI et SttK et le fonctionnement de

Stt ne devraient donc pas être possible. Mais, les observations microscopiques avec le mutant

hns outO ont montré la fonctionnalité de Stt. Une explication à ces résultats est que la

prépiline peptidase du système Stt pourrait être le produit du gène de 20719. En effet,

l’expression de ce gène est semblable à celle du système stt et de pnlH. De plus, les

prédictions de topologie suggèrent que la protéine 20719 est une protéine IMP (comme les

T2S:O) contenant 4 TMs. Ces hypothèses expliqueraient les résultats des observations

microscopiques qui montrent la fonctionnalité de Stt dans un mutant hns outO et hns 20719.

En effet, dans un mutant hns outO, la mise en place du pseudopilus de Stt se ferait par la

protéine 20719. Lorsque celle-ci est absente, c’est la protéine OutO qui maturerait les

pseudopilines de Stt. Pour confirmer ce rôle de 20719, le clivage de SttG par la protéine

20719 sera testé dans une souche dépourvue d’OutO. Pour confirmer le double rôle d’OutO,

le triple mutant hns outO 20719 sera construit et la localisation de PnlH dans ce mutant sera

déterminée en présence ou en absence d’OutO (sous le contrôle d’un plasmide).

108


Le mécanisme permettant la translocation de PnlH de la face interne à la face externe

de l’OM reste encore un mystère. Deux hypothèses pour ce processus peuvent être avancées.

La première hypothèse est que le domaine C-terminal de PnlH traverserait le pore formé par

SttD. Cela permettrait la translocation de PnlH tout en restant ancrée du coté périplasmique

par le segment transmembranaire (séquence N-terminale de PnlH). La seconde hypothèse est

qu’en s’ancrant à l’OM, PnlH provoquerait des modifications de la bicouche lipidique

permettant sa translocation à l’extérieur de la bactérie. Cette inversion serait facilitée par le

système Stt.

L’étude de PnlH a permis de mettre en évidence une troisième voie d’acheminement

de protéine à la membrane externe (figure D1). Mais, pour quelle raison PnlH est elle secrétée

par cette voie particulière ? Et par quel moyen une protéine peut elle être ancrée à la face

externe de l’OM ?

Aucune des pectine ou pectate lyases connues ne nécessite un cofacteur pour sa

sécrétion. Le besoin d’être exportée avec un cofacteur n’est sans doute pas la raison pour

laquelle PnlH est transloquée par la voie Tat. Pour le moment, aucune activité enzymatique

n’a pu être associée à PnlH bien qu’elle ait de l’homologie avec des pectine et des pectate

lyases. Une autre possibilité de fonctions pourrait être de fixer la pectine et en conséquence

d’ancrer la bactérie à son substrat. Pour cela, PnlH a besoin d’être ancrée à la face externe de

l’OM. Pour ce type d’adressage, une lipoprotéine sécrétée par un T2SS pourrait être une

solution telle que la lipoprotéine OmcA de S. oneidensis qui réduit le fer. Cette lipoprotéine

est ancrée à la surface des bactéries grâce à un T2SS. Une voie alternative à cet ancrage de

surface est celle utilisée par PnlH. Sa caractéristique est une séquence signal Tat non coupée

permettant l’ancrage membranaire.

Il est peu vraisemblable que PnlH soit le seul substrat à être acheminé par cette voie

chez les bactéries à Gram négatif. Les programmes de prédiction des substrats dépendant de

Tat ne classent pas PnlH comme un substrat de cette machinerie. La recherche des autres

substrats empruntant cette voie doit être donc entreprise par d’autres méthodes. Selon les

hypothèses ci-dessus, les substrats seront recherchés parmi des enzymes qui ne peuvent être

actives qu’à l’extérieur des bactéries. Les enzymes oxydant ou réduisant les métaux insolubles

font partie de celles-ci. Par exemple, la protéine CumA de P. putida qui oxyde le manganèse,

est sécrétée par un T2SS. Elle est ancrée à l’OM et ne possède pas de séquence signal de type

lipoprotéine mais une séquence signal de type Tat (De Vrind et al., 2003). La protéine CumA

possède donc les caractéristiques recherchées. Une autre de ces enzymes potentielles est la

protéine 3301 de S. oneidensis qui possède un motif Tat et des caractères membranaires.

109


Ainsi, afin d’identifier d’autres substrats empruntant le même acheminement que PnlH,

l’étude des protéines CumA et 3301 sera réalisée.

Les caractéristiques de ciblage de la séquence N-terminale de PnlH pourrait servir

dans le cadre de la médecine. En effet, l’exposition d’antigènes à la surface des bactéries peut

être de bons agents vaccinaux. Si la séquence N-terminale de PnlH peut être un bon moyen

d’adresser ces antigènes à l’OM, la traversée de la membrane reste cependant un obstacle.

L’étude du système Stt est donc nécessaire pour connaître les spécificités permettant la

sécrétion de ces protéines hybrides.

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Références

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