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BIOLOGIE MOLÉCULAIRE (COURS DE 1ÈRE ANNÉE)

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Page 1: BIOLOGIE MOLÉCULAIRE (COURS DE 1ÈRE ANNÉE). PLAN DU COURS INTRODUCTION GÉNÉRALE - Définition : biologie moléculaire STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES

BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

(COURS DE 1ÈRE ANNÉE)

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PLAN DU COURSINTRODUCTION GÉNÉRALE

- Définition : biologie moléculaire

STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES DES ACIDES NUCLÉIQUES

- Structure : ADN et ARN

- Propriétés biologiques et chimiques du DNA

ORGANISATION DES GÈNES ET RÉPLICATION DU DNA

- Comparaison cellules procaryotes et eucaryotes

FLUX DE L ’INFORMATION GÉNÉTIQUE : MÉCANISMES MOLÉCULAIRES DE L ’EXPRESSION DES GÈNES

- TRANSCRIPTION DU DNA OU BIOSYNTHÈSE DU mRNA

- TRADUCTION OU BIOSYNTHÉSE DES PROTÉINES

EXPLORATION ET MANIPULATION DES GÈNES : BIOTECHNOLOGIE DE L ’ADN RECOMBINANT

- Clonage des gènes

- Transgénèse

NOTIONS SUR LA PATHOLOGIE DU DNA

- Mutation

- notion de thérapie génique (gène médicament)

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INTRODUCTION GÉNÉRALE

Définition de la biologie moléculaire = étude de la vie à l ’échelon moléculaire : domaine très vaste (trop?) de la biologie.

= commande, mise en œuvre et régulation des fonctions moléculaires (cellule, tissu, organisme)

S1

S2

Survit

division

S3

différenciation

Mort cellulaire physiologique

(apoptose)

S4

Biologie du gène = biochimie génomique

(Réplication de l ’ADN)

Biosynthèse des protéines = traduction

Expression de gènes spécifiques

Fragmentation de l ’ADN

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ADN = molécule universelle de l ’hérédité chromosomique (excepté certains virus)

n=23Cellules germinales

= gamètes

n=23

2n=46

méiose

fécondationmâle femelle

Cellules haploides

Cellule diploide

Transmission de l ’ADN = caractères génétiques d ’un individu

Transmission d ’une altération de l ’ADN = pathologies moléculaires (mucoviscidose, drépanocytose, myopathies …)

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-développement

-différenciation

-métabolisme ...

Flux de l ’information génétique

Gènes = ADN ARN m protéines

réplication

transcription traduction

ARN tEffets biologiques

Régulation : activation ou répression

ADN et ARN = commande la vie cellulaire Protéines = effecteurs

Altération de l ’ADN ou ARN protéine défectueuse situation pathologique (ex. cancer)

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Grandes étapes des avancées en biologie moléculaire

1865 : Travaux de Mendel : (publiés par De Vris en 1900) théorie de l ’hérédité particulaire

1880-1920 : hérédité chromosomique (travaux de Morgan sur la drosophile)

Naissance du concept de gène

Évolution du concept de gène : hérédité moléculaire

Gène = élément sur chromosome, responsable d ’un caractère

1944 et 1952 : Travaux de Avery (pneumocoques) et Hershey et Chase (bactériophages) : ADN = support physique et chimique des gène

1953 : Watson et Crick : double hélice de l ’ADN

1957 : gène et structure primaire d ’une protéine

1961 : Concept de l ’ARN messager “ un gène -une enzyme ” (Jacob et Monod)

1963 : découverte du code génétique (Niremberg, Ochoa et Khoranea)

Gène = segment d ’ADN codant une protéine

Naissance de la Biologie

moléculaire

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- Techniques de Séquençage des gènes (application au génome humain)

- Clonage moléculaire des gènes (≠ clonage organismes)

- Trans-genèse animal (souris KO) et végétal (OGM)

- Usine cellulaire : production de protéines recombinantes (depuis 1980)

- Identification de gènes responsables de maladies (mutations : diagnostic)

- Traitement des maladies du gène : thérapie génique (maladies génétiques, cancers)- Thérapie cellulaire

Depuis 1970 : développement techniques : la révolution génomique (gène =outil = entité manipulable)

découverte : - des enzymes de restriction

- la transcriptase inverse (ARN ADN)

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STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS DES ACIDES NUCLÉIQUES

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ADN = Acide désoxyribonucléique

ARN = Acide ribonucléiqueAcide nucléique (noyau) (+ mitochondries, chloroplastes, procaryotes)

Nucléotide = base azotée + sucre (pentose) + acide phosphorique

nucléoside

Purine

Bases

Pyrimidine

Adénine (A) Guanine (G) Thymine (T)

(ADN)

Cytosine (C) Uracile (U)

(ARN)

Bases puriques Bases pyrimidiques

= polymères de nucléotides

pentose pentose

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Les différents nucléotidesBase purique ou

pyrimidique

N9 : base purique

N1 : base pyrimidique

= liaison N-glycosidique

Pentose

- ribose (RNA) OH en 2 ’

- désoxyribose (DNA) H en 2 ’

Groupement phosphate

Désoxyadénylate

Désoxyadénosine 5 ’ monophosphate (dAMP) (dGMP)

Désoxythymidilate

Désoxythymidine 5 ’monophosphate (dTMP) (dCMP)

ADN : 4 types de nucléotides

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ARN

Adénylate, adénosine 5 ’monophosphate (AMP) (GMP)AMPc et GMPc

Uridylate, uridine 5 ’monophosphate (UMP)

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5 ’

3 ’

ADNARN

Liaison phosphodiester

(liaison covalente)

Extrémité 5 ’ PO4 libre

Extrémité 3 ’OH libre

5 ’

3 ’

A T C G A

P P P P P OH

Extrémité 5 ’

(à gauche)Extrémité 3 ’

(à droite)

5 ’ 3 ’

p ATCGAOH ou ATCGA : ordre des bases = information génétique

Oligonucléotide ≠ polynucléotide

Union de plusieurs nucléotides : formation des polynucléotides

DNA pol RNA pol

C1 ’

C5 ’

C3 ’

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Structure tridimensionnelle du DNA: la double hélice (Watson et Crick 1953 prix Nobel en 1962))

- 2 chaînes nucléotidiques (2 brins) antiparallèles

5 ’

3 ’

3 ’

5 ’

- complémentarité des bases

En face de : A on a : T

En face de : C on a : G

Appariement des bases

5 ’ A C G A . .3 ’ C

Brin 1

T 3 ’ GCT..G 5 ’

Brin 2

Raisons de cette complémentarité : 1 - encombrement stérique (purine + pyrimidine)

2 - formation de liaisons hydrogène

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A T

désoxyriboseP désoxyribose P

désoxyriboseP désoxyribose P

G C

- appariement des bases (stabilité relative, possibilité de dénaturation)

- séquence des bases = information génétique

Ex : 5 ’ CTAGCGGA 3 ’3 ’ GATCGCCT 3 ’

Produit = protéine Produit = son musical

1

234

5

67

8 9

12

3 5

6

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- conformation spatiale de l ’ADN

Grand sillon

Petit sillon

Paires de bases

Chaîne sucre phosphate

5 ’ 3 ’

3 ’ 5 ’

3,4 nm (10 pdb)

d entre 2 bases = 34A°

2,0 nmMise en évidence des propriétés biologiques de l ’ADN

Travaux de Morgan : hérédité chromosomique

Expérience de transformation des pneumocoques (Avery-Mc Leold-Mc Carty) (1944)

Forme S (« smooth ») Forme R (« rough »)

Capsule polyosidique

virulente Non virulente

Interaction avec des protéines (Facteurs de transcription)

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Forme S

Mort de la souris

Forme R

La souris reste vivante

Forme S tuées par la chaleur

La souris reste vivante

Mélange forme R + forme S tuées par la chaleur

Mort de la souris

Conclusion : existence d ’un principe transformant R en S

Expérience complémentaire : préparation d ’extrait acellulaire de S tuées par la chaleur

Forme R

+ Protéines La souris reste vivante

Forme R+ ADN Mort de la souris

Conclusion : le principe transformant est l ’ADN

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Expérience de Hershey et Chase (1952)

Bactériophage T2

Capside protéique

ADN

Problème : ADN ou Protéine qui infecte ? Utilisation de T2 marqués au 32P ou au 35S

ADN marqué au 32PProtéine

marquée au 35S

Eschérichia coli

Séparation bactérie et phages et analyse du contenu de la bactérie : présence de 32P pas de 35S

ADN pénètre dans la bactérie

Multiplication de T2 : 32P retrouvé dans la descendance

ADN = support de l ’information génétique

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Structure des acides ribonucléiques (ARN ou RNA)

≠ ADN

Monocaténaire

+ courtSucre = ribose

Bases A, C, G et U (≠ T)

A U

C GAppariement possible

- épingles à cheveux (mRNA)

- tRNA

ARN ribosomial (rRNA) (80%)

Ribosomes = “ usine à protéines “ de la cellule : RNA (65%) + protéines (35%)

Procaryotes (E.coli)

70 S (S = Svedberg)

50 S

rRNA 5S et 23 S

34 protéines

30Sr RNA 16S (1542 nucléotides)

21 protéines

Eucaryotes

80 S

60S

40S

ARN messager (mRNA) (F. Jacob et J. Monod 1961)

= copie de l ’un des deux brins ADN d ’un gène (transcription)

Message = Code à trois lettres 3 nucléotides (triplet) = codon spécifique d ’un acide aminé

Décodage : grâce aux tRNA

mRNA

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ARN de transfert = tRNA

mRNA

codonAA

tRNA (adaptateur)

Structure en feuille de trèfle d ’un tRNA

Bras DHU

Bras acide aminé

Bras TC

Bras anticodon

ribose

ribose

Dihydrouridine (DHU)

ribose

1-méthylguanine

Pseudouridine (

Acide aminé

Extrémité 5 ’Extrémité 3 ’

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Propriétés Physico-chimiques des acides nucléiques

absorbance

220 260 300(nm)

Simple brin

Double brin

Absorbance dans l ’UV

DO ADN db [1mg.ml-1] = 20

DO ARN ou ADN monocaténaire = 25

Effet hyperchrome

Dénaturation thermique

Chaleur

Intérêt : quantification ADN et ARN

pureté des Acides nucléiques

Température de fusion

ADN dénaturé

Tm80° 100°

Absorbance 260nm

Température °CTm fonction :- de la taille de l ’ADN

- nombre GC

renaturation refroidissement