biologie de la cellule exposée au froid mécanismes et ......biologie de la cellule exposée au...
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Biologie de la cellule exposeacutee au froid Meacutecanismes et conseacutequences des
leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion Thierry Hauet
Poitiers
DIU de Transplantation 2018-2019 3e seacuteminaire ndash Lyon
15-17 mai 2019
Lrsquohypothermie
Chute de la tempeacuterature centrale au dessous de 35degC
- Modeacutereacutee 32 - 35degC - Grave 25 - 32degC - Majeure lt 25degC
Introduction Geacuteneacuteraliteacutes Rappels Situation du problegraveme
Conservation hypothermie
37degC
+- O2
37degC
+ O2 4degC
Hypoxie Leacutesions
drsquoischeacutemie chaude Leacutesions drsquoischeacutemie froide Leacutesions de reperfusion
Transplantation
Donneur Preacutelegravevement Conservation Greffe receveur
Probleacutematique
Peacutenurie
Deacutemographie donneurs
DME critegraveres eacutelargis
DDAC
Organes preacuteleveacutes non greffeacutes 92
354
76
Le rapport meacutedical et scientifique de lrsquoAgence de la biomeacutedecine 2017
Reacuteanimation du DME
Origine de la mort Facteurs de co-morbiditeacute (hypertensiondyslipideacutemie) Traitement pharmacologique Mort enceacutephalique
Donneur
Reacuteanimation du donneur
Chirurgie Lavage Conservation Hypothermie Dureacutee drsquoischeacutemie
Reperfusion et devenir du greffon
Re-oxygenation and normothermie Temps drsquoanastomose Facteurs immunologiques Traitement immunosuppresseur
Instabiliteacute heacutemodynamique et des apports en oxygegravene Orage veacutegeacutetatif Effet vasoconstricteur
Preacutelegravevement et conservation
Acteurs impliqueacutes en transplantation Processus de transplantation
Carence hormonale bull ACTH bull ADH bull TSH T3T4
Instabiliteacute HD bull Orage catheacutecolaminergique bull Hypovoleacutemie
Inflammation Immuniteacute inneacutee
Compleacutement
Activation endotheacuteliale
Activation de la coagulation
Hypoperfusion reacutenale
Stress oxydant Ischeacutemie
Hypovoleacutemie Diabegravete insipide
Cytoprotection
HO-1 HSP70 SOD2
Leacutesions reacutenales bull Dysfonction greffon bull Fibrose
ME
Bos EM et al Kidney Int oct 200772(7)797-805
- -
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Lrsquohypothermie
Chute de la tempeacuterature centrale au dessous de 35degC
- Modeacutereacutee 32 - 35degC - Grave 25 - 32degC - Majeure lt 25degC
Introduction Geacuteneacuteraliteacutes Rappels Situation du problegraveme
Conservation hypothermie
37degC
+- O2
37degC
+ O2 4degC
Hypoxie Leacutesions
drsquoischeacutemie chaude Leacutesions drsquoischeacutemie froide Leacutesions de reperfusion
Transplantation
Donneur Preacutelegravevement Conservation Greffe receveur
Probleacutematique
Peacutenurie
Deacutemographie donneurs
DME critegraveres eacutelargis
DDAC
Organes preacuteleveacutes non greffeacutes 92
354
76
Le rapport meacutedical et scientifique de lrsquoAgence de la biomeacutedecine 2017
Reacuteanimation du DME
Origine de la mort Facteurs de co-morbiditeacute (hypertensiondyslipideacutemie) Traitement pharmacologique Mort enceacutephalique
Donneur
Reacuteanimation du donneur
Chirurgie Lavage Conservation Hypothermie Dureacutee drsquoischeacutemie
Reperfusion et devenir du greffon
Re-oxygenation and normothermie Temps drsquoanastomose Facteurs immunologiques Traitement immunosuppresseur
Instabiliteacute heacutemodynamique et des apports en oxygegravene Orage veacutegeacutetatif Effet vasoconstricteur
Preacutelegravevement et conservation
Acteurs impliqueacutes en transplantation Processus de transplantation
Carence hormonale bull ACTH bull ADH bull TSH T3T4
Instabiliteacute HD bull Orage catheacutecolaminergique bull Hypovoleacutemie
Inflammation Immuniteacute inneacutee
Compleacutement
Activation endotheacuteliale
Activation de la coagulation
Hypoperfusion reacutenale
Stress oxydant Ischeacutemie
Hypovoleacutemie Diabegravete insipide
Cytoprotection
HO-1 HSP70 SOD2
Leacutesions reacutenales bull Dysfonction greffon bull Fibrose
ME
Bos EM et al Kidney Int oct 200772(7)797-805
- -
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Introduction Geacuteneacuteraliteacutes Rappels Situation du problegraveme
Conservation hypothermie
37degC
+- O2
37degC
+ O2 4degC
Hypoxie Leacutesions
drsquoischeacutemie chaude Leacutesions drsquoischeacutemie froide Leacutesions de reperfusion
Transplantation
Donneur Preacutelegravevement Conservation Greffe receveur
Probleacutematique
Peacutenurie
Deacutemographie donneurs
DME critegraveres eacutelargis
DDAC
Organes preacuteleveacutes non greffeacutes 92
354
76
Le rapport meacutedical et scientifique de lrsquoAgence de la biomeacutedecine 2017
Reacuteanimation du DME
Origine de la mort Facteurs de co-morbiditeacute (hypertensiondyslipideacutemie) Traitement pharmacologique Mort enceacutephalique
Donneur
Reacuteanimation du donneur
Chirurgie Lavage Conservation Hypothermie Dureacutee drsquoischeacutemie
Reperfusion et devenir du greffon
Re-oxygenation and normothermie Temps drsquoanastomose Facteurs immunologiques Traitement immunosuppresseur
Instabiliteacute heacutemodynamique et des apports en oxygegravene Orage veacutegeacutetatif Effet vasoconstricteur
Preacutelegravevement et conservation
Acteurs impliqueacutes en transplantation Processus de transplantation
Carence hormonale bull ACTH bull ADH bull TSH T3T4
Instabiliteacute HD bull Orage catheacutecolaminergique bull Hypovoleacutemie
Inflammation Immuniteacute inneacutee
Compleacutement
Activation endotheacuteliale
Activation de la coagulation
Hypoperfusion reacutenale
Stress oxydant Ischeacutemie
Hypovoleacutemie Diabegravete insipide
Cytoprotection
HO-1 HSP70 SOD2
Leacutesions reacutenales bull Dysfonction greffon bull Fibrose
ME
Bos EM et al Kidney Int oct 200772(7)797-805
- -
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Conservation hypothermie
37degC
+- O2
37degC
+ O2 4degC
Hypoxie Leacutesions
drsquoischeacutemie chaude Leacutesions drsquoischeacutemie froide Leacutesions de reperfusion
Transplantation
Donneur Preacutelegravevement Conservation Greffe receveur
Probleacutematique
Peacutenurie
Deacutemographie donneurs
DME critegraveres eacutelargis
DDAC
Organes preacuteleveacutes non greffeacutes 92
354
76
Le rapport meacutedical et scientifique de lrsquoAgence de la biomeacutedecine 2017
Reacuteanimation du DME
Origine de la mort Facteurs de co-morbiditeacute (hypertensiondyslipideacutemie) Traitement pharmacologique Mort enceacutephalique
Donneur
Reacuteanimation du donneur
Chirurgie Lavage Conservation Hypothermie Dureacutee drsquoischeacutemie
Reperfusion et devenir du greffon
Re-oxygenation and normothermie Temps drsquoanastomose Facteurs immunologiques Traitement immunosuppresseur
Instabiliteacute heacutemodynamique et des apports en oxygegravene Orage veacutegeacutetatif Effet vasoconstricteur
Preacutelegravevement et conservation
Acteurs impliqueacutes en transplantation Processus de transplantation
Carence hormonale bull ACTH bull ADH bull TSH T3T4
Instabiliteacute HD bull Orage catheacutecolaminergique bull Hypovoleacutemie
Inflammation Immuniteacute inneacutee
Compleacutement
Activation endotheacuteliale
Activation de la coagulation
Hypoperfusion reacutenale
Stress oxydant Ischeacutemie
Hypovoleacutemie Diabegravete insipide
Cytoprotection
HO-1 HSP70 SOD2
Leacutesions reacutenales bull Dysfonction greffon bull Fibrose
ME
Bos EM et al Kidney Int oct 200772(7)797-805
- -
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Transplantation
Donneur Preacutelegravevement Conservation Greffe receveur
Probleacutematique
Peacutenurie
Deacutemographie donneurs
DME critegraveres eacutelargis
DDAC
Organes preacuteleveacutes non greffeacutes 92
354
76
Le rapport meacutedical et scientifique de lrsquoAgence de la biomeacutedecine 2017
Reacuteanimation du DME
Origine de la mort Facteurs de co-morbiditeacute (hypertensiondyslipideacutemie) Traitement pharmacologique Mort enceacutephalique
Donneur
Reacuteanimation du donneur
Chirurgie Lavage Conservation Hypothermie Dureacutee drsquoischeacutemie
Reperfusion et devenir du greffon
Re-oxygenation and normothermie Temps drsquoanastomose Facteurs immunologiques Traitement immunosuppresseur
Instabiliteacute heacutemodynamique et des apports en oxygegravene Orage veacutegeacutetatif Effet vasoconstricteur
Preacutelegravevement et conservation
Acteurs impliqueacutes en transplantation Processus de transplantation
Carence hormonale bull ACTH bull ADH bull TSH T3T4
Instabiliteacute HD bull Orage catheacutecolaminergique bull Hypovoleacutemie
Inflammation Immuniteacute inneacutee
Compleacutement
Activation endotheacuteliale
Activation de la coagulation
Hypoperfusion reacutenale
Stress oxydant Ischeacutemie
Hypovoleacutemie Diabegravete insipide
Cytoprotection
HO-1 HSP70 SOD2
Leacutesions reacutenales bull Dysfonction greffon bull Fibrose
ME
Bos EM et al Kidney Int oct 200772(7)797-805
- -
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Probleacutematique
Peacutenurie
Deacutemographie donneurs
DME critegraveres eacutelargis
DDAC
Organes preacuteleveacutes non greffeacutes 92
354
76
Le rapport meacutedical et scientifique de lrsquoAgence de la biomeacutedecine 2017
Reacuteanimation du DME
Origine de la mort Facteurs de co-morbiditeacute (hypertensiondyslipideacutemie) Traitement pharmacologique Mort enceacutephalique
Donneur
Reacuteanimation du donneur
Chirurgie Lavage Conservation Hypothermie Dureacutee drsquoischeacutemie
Reperfusion et devenir du greffon
Re-oxygenation and normothermie Temps drsquoanastomose Facteurs immunologiques Traitement immunosuppresseur
Instabiliteacute heacutemodynamique et des apports en oxygegravene Orage veacutegeacutetatif Effet vasoconstricteur
Preacutelegravevement et conservation
Acteurs impliqueacutes en transplantation Processus de transplantation
Carence hormonale bull ACTH bull ADH bull TSH T3T4
Instabiliteacute HD bull Orage catheacutecolaminergique bull Hypovoleacutemie
Inflammation Immuniteacute inneacutee
Compleacutement
Activation endotheacuteliale
Activation de la coagulation
Hypoperfusion reacutenale
Stress oxydant Ischeacutemie
Hypovoleacutemie Diabegravete insipide
Cytoprotection
HO-1 HSP70 SOD2
Leacutesions reacutenales bull Dysfonction greffon bull Fibrose
ME
Bos EM et al Kidney Int oct 200772(7)797-805
- -
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Reacuteanimation du DME
Origine de la mort Facteurs de co-morbiditeacute (hypertensiondyslipideacutemie) Traitement pharmacologique Mort enceacutephalique
Donneur
Reacuteanimation du donneur
Chirurgie Lavage Conservation Hypothermie Dureacutee drsquoischeacutemie
Reperfusion et devenir du greffon
Re-oxygenation and normothermie Temps drsquoanastomose Facteurs immunologiques Traitement immunosuppresseur
Instabiliteacute heacutemodynamique et des apports en oxygegravene Orage veacutegeacutetatif Effet vasoconstricteur
Preacutelegravevement et conservation
Acteurs impliqueacutes en transplantation Processus de transplantation
Carence hormonale bull ACTH bull ADH bull TSH T3T4
Instabiliteacute HD bull Orage catheacutecolaminergique bull Hypovoleacutemie
Inflammation Immuniteacute inneacutee
Compleacutement
Activation endotheacuteliale
Activation de la coagulation
Hypoperfusion reacutenale
Stress oxydant Ischeacutemie
Hypovoleacutemie Diabegravete insipide
Cytoprotection
HO-1 HSP70 SOD2
Leacutesions reacutenales bull Dysfonction greffon bull Fibrose
ME
Bos EM et al Kidney Int oct 200772(7)797-805
- -
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Origine de la mort Facteurs de co-morbiditeacute (hypertensiondyslipideacutemie) Traitement pharmacologique Mort enceacutephalique
Donneur
Reacuteanimation du donneur
Chirurgie Lavage Conservation Hypothermie Dureacutee drsquoischeacutemie
Reperfusion et devenir du greffon
Re-oxygenation and normothermie Temps drsquoanastomose Facteurs immunologiques Traitement immunosuppresseur
Instabiliteacute heacutemodynamique et des apports en oxygegravene Orage veacutegeacutetatif Effet vasoconstricteur
Preacutelegravevement et conservation
Acteurs impliqueacutes en transplantation Processus de transplantation
Carence hormonale bull ACTH bull ADH bull TSH T3T4
Instabiliteacute HD bull Orage catheacutecolaminergique bull Hypovoleacutemie
Inflammation Immuniteacute inneacutee
Compleacutement
Activation endotheacuteliale
Activation de la coagulation
Hypoperfusion reacutenale
Stress oxydant Ischeacutemie
Hypovoleacutemie Diabegravete insipide
Cytoprotection
HO-1 HSP70 SOD2
Leacutesions reacutenales bull Dysfonction greffon bull Fibrose
ME
Bos EM et al Kidney Int oct 200772(7)797-805
- -
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Carence hormonale bull ACTH bull ADH bull TSH T3T4
Instabiliteacute HD bull Orage catheacutecolaminergique bull Hypovoleacutemie
Inflammation Immuniteacute inneacutee
Compleacutement
Activation endotheacuteliale
Activation de la coagulation
Hypoperfusion reacutenale
Stress oxydant Ischeacutemie
Hypovoleacutemie Diabegravete insipide
Cytoprotection
HO-1 HSP70 SOD2
Leacutesions reacutenales bull Dysfonction greffon bull Fibrose
ME
Bos EM et al Kidney Int oct 200772(7)797-805
- -
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Reacuteanimation du DDAC
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Donneur Deacuteceacutedeacute apregraves Arrecirct Circulatoire
Kootstra G et al Transplant Proc oct 199527(5)2893-4
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Refroidissement in situ Circulation reacutegionale normothermique
(sonde de Gillot) (CRN)
Refroidissement in situ vs Circulation Reacutegionale Normothermique
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Preacuteconditionnement DDAC
Modaliteacutes du conditionnement CRN Reacuteglages Dureacutee Agents pharmacologiques Strateacutegies de conservation
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
ISCHEacuteMIE FROIDE
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Hypoxie +
Hypothermie
Reacutechauffement
Normothermie
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Meacutecanismes
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Conseacutequences cellulaires de lrsquohypothermie
1 Conformation des proteacuteines 2 La membrane lipidique 3 Tempeacuterature et reacuteactions enzymatiques 4 Impact Cellulaire
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
-Deacutesorganisation de la structure secondaire tertiaire et quaternaire des proteacuteines alteacuteration des fonctions proteacuteiques
-Rigiditeacute lipidique alignements des chaicircnes lipidiques ouverture des canaux passifs deacutesordre structural des proteacuteines membranaires perte drsquoeacutetancheacuteiteacute au niveau des canaux ioniques
-Epuisement de lrsquoATP par les pompes ioniques reacuteduction de la vitesse et du rendement des reacuteactions
-Deacuteseacutequilibre ionique chute du potentiel de membrane -Influx de calcium induction de voies pro-mort cellulaire impact sur les membranes
-Acidose
-Œdegraveme
4degC est elle vraiment la meilleure tempeacuterature
Les principes thermodynamiques
du meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4deg
des reacuteactions enzymatiques (vitesse et rendement)
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Conseacutequences cellulaire de lrsquohypoxie
1 La glycolyse 2 La voie de HIF-1α 3 La chaine de la respiration
mitochondriale
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Meacutetabolisme
Arterial and capillary blood supply
Venous drainage Collecting duct with nephrons
Cortex
Outer Stripe
Inner Stripe
Inner Medulla
Out
er
Med
ulla
Medullary ray
Adapted from Brezis M et al The Kidney 4th Ed (Brenner amp Rector) Saunders 993-1061 1991
O2 consumption in different organs
O2 consumption O2 delivery ()
Kidney 08
Renal outer medulla 79
Brain 34
S3 segment limited anaerobic metabolism
Metabolisme aneacuterobique
Meeeeeeeeee Oeeeeeee
Metabolisme Intermeacutediaire
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
Conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
eacutenergeacutetique
O2
Lactate
NADHH+
NAD+ Lactate
deacuteshydrogeacutenase (LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Cycle de Krebs
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
HIF pathway Role in ischemia tolerance
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
HIF 1α marquage
HIF 1a is expressed during ischemia and also during reperfusion kidney with normal oxygen levels HIF 1a is expressed exclusively in non damaged proximal tubules of human post transplant biopsies HIF 1a promotes tubule repair after IR
Conde et al Plos One march 2012
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Rocircles de HIF1
HIF1
Angiogenegravese VEGF Flt1
Eacuterythropoiumlegravese Eacuterythropoiumletine
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Vasodilatation NO synthase
Adaptation meacutetabolique
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Membrane cytoplasmique Glucose
Glucose
Cytoplasme
Glycolyse
Pyruvate
Pyruvate
Mitochondrie
Pyruvate deacuteshydrogeacutenase
Aceacutetyl CoA Cycle de Krebs
FADH2 NADH H+
Phosphorylation oxydative
O2 H2O
ATP ADP +Pi
Rocircle de HIF1 dans lrsquoadaptation meacutetabolique
GLUT-1
Hexokinase
Lactate
LDH
PDK
LDH lactate deacuteshydrogeacutenase PDK pyruvate deacuteshydrogeacutenase kinase
HRE preacutesent sur plus de 90 gegravenes
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Utilisation majoritaire du dioxygegravene Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
+ 2 e-
+ 2 H+
H2O
2 e- pour chaque oxygegravene lsquotetrareduction du dioxygegravenersquo
I NADH-ubiquinone oxydoreacuteductase II succinate-ubiquinone oxydoreacuteductase III ubiquinol-cytochrome C oxydoreacuteductase IV cytochrome oxydase V ATP synthase U coenzyme Q (CoQ)Ubiquinone Cyt C cytochrome C
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
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MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Le stress oxydant 1Production de EOR 2Deacutefenses anti EOR
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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15
20
25
30
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40
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
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TAG
E DE
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TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Halliwell B Free radicals antioxidants and human disease Curiosity cause or consequence Lancet 344721-724 1994
Deacutefinition du stress oxydant
production drsquoEOR
deacutefenses anti-oxydantes
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
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actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Chaicircne drsquooxydation phosphorylante mitochondriale
1-2 du flux drsquoO2 mitochondrial O2
e-
O2deg-
Production drsquoEOR lors de lrsquoIR
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Les diffeacuterents types drsquoEOR EOR primaires
O2
e-
O2deg-
2H+
H2O2
OHdeg
anion superoxyde
radical hydroxyle 10-9 sec de frac12 vie
peroxyde drsquohydrogegravene
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Paradoxe de la reperfusion Le Stress Oxydant Conseacutequences de la reacuteintroduction de lrsquoOxygegravene
Ischeacutemie
Pro-oxydants
Espegraveces oxygeacuteneacutees reacuteactives
Anti- oxydants
Reperfusion Conseacutequences du stress oxydant
ADN
Membranes
Proteines
Saccharides
Mitochondrie
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Enzymatiques (renouvelables)
1 Superoxyde dismutase
2Catalase
3Glutathion Peroxydase
4Hegraveme Oxygeacutenase
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Les meacutecanismes de deacutefense de la cellule et de
lrsquoorganisme contre les EOR
Non Enzymatiques
(quantiteacute limiteacutee)
1Vitamine E
2Vitamine C
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
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40
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lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
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ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
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Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
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Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
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Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Exemple Les vitamines (C E)
L
Ldeg EOR
Composeacutes agrave groupements thiols (Glutathion Thioredoxines
Acide lipoiumlque)
NADPH H+
NADP+
-S-S-
-SH HS- Vit C
Vit C deg
Ascorbate Radical Ascorbyle
Vitamine C
Vit E Vit Edeg
α-tocopheacuterol
Radical α-tocopheacuteryle
Vitamine E
3 3
13052020 34 Module Coeur Poumon
Deacutefenses Non Enzymatiques
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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15
20
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30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
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ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Vaisseaux production de LDLox inflammation et deacutepocirct de plaque drsquoatheacuterocircmes
Lrsquoimpact des EOR sur lrsquoorganisme
Cerveau Parkinson Alzheimer
Peau Brucirclure Dermites
Multi-Organe Senescence
Cancer Diabegravete
EOR
Transplantation Ischeacutemie Reperfusion
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
DHE (Dihydro- ethidium) analyse Fluorimetrique de la production de O2deg- apregraves 3 jours de reperfusion chez
le greffon reacutenal de porc
Ischeacutemie agrave Tdeg Corporelle
Conservation du greffon agrave
froid
Combinaison des 2
conditions
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Conseacutequences
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
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TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
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Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
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Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
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1
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25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
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40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
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TAG
E DE
SEG
MEN
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VASC
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CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Unaltered proteins
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
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20
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lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
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Control Cold ischemia
R
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
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Control Cold ischemia
Clea
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casp
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3 po
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llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
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Control Cold ischemia
Tubu
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Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
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60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
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LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Transcriptomique a haut deacutebit
77 up-regulated significant GOBP categories 5 down-regulated significant GOBP categories
43 genes were significantly up or down-regulated in ischemic versus healthy kidneys (Log2
plt005)
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
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e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
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rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
From R G Boutilier Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia The Journal of Experimental Biology 204 3171-3181 (2001)
CONSEacuteQUENCES DE LrsquoHYPOTHERMIE (4degC)
Les principes thermodynamiques meacutetabolisme de moitieacute agrave chaque palier de 10degC = 10-12 agrave 4degC
En reacutealiteacute
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Diminution du meacutetabolisme de 50 par paliers de 10degC Solutions de conservation avec une composition speacutecifique Les leacutesions sont essentiellement de type neacutecrose tubulaire et leacutesions endotheacuteliale Œdegraveme cellulaire Acidose Stress radicalaire (reperfusion)
13052020 groupe FLIRT
ISCHEacuteMIE FROIDE
0h 6h 20h 24h
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
I II III
e- e-
IV V ANT
Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
A lrsquoischeacutemie HOdeg
O2bull- H2O2
Fe MnSOD
groupe FLIRT
HIF
13052020
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
I II III
O2ordm-
IV V ANT
Impact au moment de la reperfusion
O2 O2
ordm-
A la reperfusion MnSOD
H2O2
groupe FLIRT 13052020
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
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TAG
E DE
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MEN
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VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
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bule
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
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Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
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ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
ROcircLE DU PORE DE TRANSITION ET IR
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Tubules proximal non leacuteseacute Tubule proximal leacuteseacute
Ischeacutemie Reperfussion
Fragmentation mitochondriale
Mort cellulaire
Mitophagie
Ischeacutemie Reperfussion
Noyau
Mitochondrie non leacuteseacutee
Activation de DRP1
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
IMPACT MITOCHONDRIAL
PGC1 α peroxisome proliferator-acitvated-γ co activator 1α CPT1 carnitine ndashOpalmitoyltransferas 1
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
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ALE
TOTA
LE
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
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Control Cold ischemia
R
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gfie
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
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Control Cold ischemia
Clea
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casp
ase
3 po
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bula
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eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
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Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
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gt120 microm
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
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bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
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03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
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ion
rela
tive
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actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
FUSION FISSION
MITOPHAGIE
DEPOLARISATION
FUSION
POLARISATION
RECUPERATION
MITOCHONDRIE
IMPACT MITOCHONDRIAL AU COURS DE LrsquoIR
Acide gras libre ROS
Cytochrome C ADN mitochondrial
DRP1
Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Mfn
DRP1
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
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Control Cold ischemia
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Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
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Control Cold ischemia
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Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
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Control WI CS WI + CS
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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Control WI CS WI+CSPro
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Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Diminution de la synthegravese de lrsquoATP
[ATP] O2 Deacuteceacuteleacuteration de la phosphorylation oxydative
Principales conseacutequences de la diminution des apports en oxygegravene sur le meacutetabolisme
cellulaire
Inhibition des eacutechanges ATP-deacutependants
Œdegraveme
Na+K+ ATPase
Na+ intracell H+ intracell
Acidose
ATP deacutegradation
Activation des systegravemes enzymatiques Ca-deacutependants
Phospholipases
Libeacuteration des AGPI
Leacutesions membranaires
Produits de deacutegradation
Calpaiumlnes
Deacutesorganisation cytosquelette
Ca2+ intracell
Ca2+ ATPase
Xanthine deacuteshydrogeacutenase EOR Xanthine oxydase
Pro oxydant
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
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45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
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LE
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
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ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires Alteacuteration de
fonction
Ischeacutemie
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose Neacutecrose
L rsquoISCHEacuteMIE Agrave L rsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE VERS LA MORT DE LA CELLULE
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie incomplegravete Autosis
Pyroptosis Neacutecroptosis
Parthanatos Ferroptosis
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
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E DE
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()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
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Control Cold ischemia
R
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
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Control Cold ischemia
Clea
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Caspase 3 staining
Apoptose
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Control Cold ischemia
Tubu
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Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
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bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
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03
Control WI CS WI+CSPro
tein
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to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Microcirculation Stress du reacuteticulum endoplasmique
Dysfonction mitochondriale
Inflammation Alarmines
Reacuteparation insuffisante
Evaluation
NOUVELLES CIBLES IMPLIQUEacuteES
Oxygeacutenation
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Mt
RER
Mt
RER
IMPACT SUR LA MITOCHONDRIE ET LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE AU COURS DE LrsquoIR
Mt mitochondrie RER reacuteticulum endoplasmique
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
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casp
ase
3 po
sitiv
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bula
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eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
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CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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15
20
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30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
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VASC
ULA
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CO
RTIC
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TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
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Control Cold ischemia
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Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
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90-120 microm
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
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Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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Control WI CS WI+CSPro
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Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
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ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Activation au deacutebut de lrsquoischeacutemie
EXPLORATION DU STRESS DU REacuteTICULUM DURANT LrsquoIR
ATF4 ATF6 XBP1
Bilan
CS
H0 N1 N2 N3
H24 H12 H6 P N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
CTL HR + Salubrinal
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Activation maintenue protection
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
ATF4
Survie
Mort
CS
H0 N1 N2 N3
H24 N1 N2 N3
H12 N1 N2 N3
H6 N1 N2 N3 P
Activation tardive pendant lrsquoischeacutemie
ATF6
GAPDH
0 Hypoxie (h) 6 12 24
75 kDa
38 kDa
CTL HR + AEBSF
HR
p lt 005 vs CTL p lt 005 vs groupes indiqueacutes
Inhibition protection
siATF6 siCTL p lt 005 vs siCTL
Bilan
HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION NORMOTHERMIQUE
Mort
Survie ATF6
Activation agrave la reperfusion Hypoxia Reoxygenation
CTL 4h 8h 24h 2h 4h 8h TM
XBP-1s XBP-1u
Sensible agrave la dureacutee drsquoischeacutemie
Inhibition protection
CTL HR + STF HR
Bilan
Survie HYPOXIE HYPOTHERMIQUE REOXYGENATION
NORMOTHERMIQUE
RNase IRE1α
Mort
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
INFLAMMATION
NOYAU
ROS ER
Stress Proteacuteines non replieacutes BIP
BIP BIP
PERK ATF6 IRE1α
eIFF2αP TRADUCTION PROTEINES LIBERATION de Ca++
Drp1
Mfn
ATF4
AUTOPHAGIE APOPTOSE (CHOP)
uXbp1
sXbp1
TRANSCRIPTION DE GENES POUR Chaperones pour le repliement et la deacutegradation des proteacuteines associeacutees
JNK NFκB
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE MOLEacuteCULAIRES MEacuteCANISMES INTEacuteGREacuteS
PERK protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase IRE1 inositol-requiring kinase 1 ATF6 activating transcription factor 6 ATF 4 activating transcription factor 6 X-Box Binding Protein 1 BiP binding immunoglobulin protein Drp1 dynamin related protein 1 Mfn mitofusine
INFLAMMATION
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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20
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30
35
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45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
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TAG
E DE
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TOTA
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()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
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Control Cold ischemia
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
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Control Cold ischemia
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Caspase 3 staining
Apoptose
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Control Cold ischemia
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Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
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E DE
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LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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Control WI CS WI+CSPro
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Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
Arteacuterioles
Capillaires
Veinules Vasodilatation inadapteacutee Seacutecreacutetion de NO diminueacutee Effet des ROS
No reflow Compression Augmentation des reacutesistances arteacuteriolaires
Mauvaise perfusion et oedeme
Augmentation de permeacuteabiliteacute Adheacutesion leucocytaire Migration cellulaire Production radicalaire
Pertubation heacutemodynamique
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
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TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
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spla
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Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
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lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
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Control Cold ischemia
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
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Control Cold ischemia
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Caspase 3 staining
Apoptose
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Control Cold ischemia
Tubu
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ecro
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Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
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20
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30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
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TAG
E DE
SEG
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VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
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bule
fiel
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
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CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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Control WI CS WI+CSPro
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Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation and activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales
Rein controcircle Rein greffeacute
- Rareacutefaction vasculaire
Porc
Conseacutequences des dommages vasculaires
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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20
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30
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45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
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bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
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Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
CONSEacuteQUENCES DES DOMMAGES VASCULAIRES
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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lt30microm 30-60 microm 60-90 microm 90-120 microm gt120 microm
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LE
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
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Control Cold ischemia
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
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Control Cold ischemia
Clea
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Caspase 3 staining
Apoptose
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Control Cold ischemia
Tubu
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Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
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TAG
E DE
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VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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Control WI CS WI+CSPro
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Dagger
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HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
HYPOXIE ROLE DE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
HIF1α
Prolyl hydroxylases (PHD)
HIF1α
OH
OH
Proteasome degradation
VHL complex
-
Neil C Chi Joel S Karliner Cardiovascular Research 61 (2004) 437ndash 447
Reacuteponse coordonneacutee agrave lrsquohypoxie Meacutecanismes drsquoadaptation Facteurs de transcriptions activeacutes But de protection
Phase preacutecoce
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
20
25
Control Cold ischemia
R
ed S
irius
sta
inin
gfie
ld
Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
05
1
15
2
25
3
35
4
Control Cold ischemia
Clea
ved
casp
ase
3 po
sitiv
e tu
bula
r ce
llsfi
eld
Caspase 3 staining
Apoptose
0
05
1
15
2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
e
Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
ischeacutemie Privation drsquoOsup2 et nutriments
Accumulation de deacutechets Inhibition du meacutetabolisme oxydatif
Deacutepleacutetion en ATP
Glycolyse anaeacuterobie
Inhibition pompes NaK
Acide Lactique
pH darr
Instabiliteacute lysosomale
Libeacuteration Enzymes lytiques
Modification des eacutelectrolytes
Œdegraveme intraCellulaire
Activiteacute proteacuteases et phospholipases
Ouverture des canaux Ca++ Ca++ cytosol Ouverture du pore de
transition
hypoxanthine
Production radicaux libres
Alteacuteration cytosquelette proteacuteines Peroxydation lipides membranaires Stress reticulum endoplasmique
Groupe FLIRT
Cyclosporine
Agents colloides
Anti oxydants
Acide pyruvique
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
10
15
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25
Control Cold ischemia
R
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gfie
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
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Control Cold ischemia
Clea
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bula
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Caspase 3 staining
Apoptose
0
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Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
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Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
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e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip) Alarmines
Activation de la cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires inneacutes (maturation des
DCshellip)
Reacuteponses allo- auto-immune adaptative
Leacutesions lieacutees au compleacutement
Eveacutenements cytotoxiques
CONSEacuteQUENCES DE LA REPERFUSION
DAMPs damage-associated molecular pattern molecules DC cellules dendritiques NK natural killer
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
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Control Cold ischemia
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
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Control Cold ischemia
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Caspase 3 staining
Apoptose
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Control Cold ischemia
Tubu
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Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
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30
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
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TAG
E DE
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TOTA
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()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
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fiel
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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01
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Control WI CS WI+CSPro
tein
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actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
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Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Signaux Danger
IR
Immuniteacute Inneacutee
Immuniteacute adaptative
Leacutesions Tissulaires
Activation DCMacrophages
Migration aux organes lymphoiumldes II
Activation cellules T
LrsquoIR peut provoquer lrsquoactivation du systegraveme adaptatif
INNEE
ADAPTATIF
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
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Control Cold ischemia
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Cold ischemia Control
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Control Cold ischemia
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Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
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Control WI CS WI + CS
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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Control WI CS WI+CSPro
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Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
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ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
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Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Lrsquoalarmine IL-33 et les iNKT (Eur J Immunol 2009 Eur J Immunol 2011 (Frontline) Plos One 2013 JASN en cours)
Leacutesions tissulaires
50microm
PLACE DE LrsquoAXE INKTIL-33 DANS LrsquoIR ET TRANSPLANTATION REacuteNALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
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Control Cold ischemia
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
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Control Cold ischemia
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Caspase 3 staining
Apoptose
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Control Cold ischemia
Tubu
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Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
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TAG
E DE
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VASC
ULA
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TOTA
LE
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REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
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Control WI CS WI + CS
Vim
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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Control WI CS WI+CSPro
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actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Conseacutequences de lrsquoischeacutemie reperfusion sur les leacutesions reacutenales aigues et chroniques
Lrsquoischeacutemie froide induit lors de la transplantation reacutenale chez le porc - Mort cellulaire neacutecrose apoptose agrave 1 semaine de reperfusion
7 jours Reperfusion
p lt 005
- Fibrose apregraves 3 mois de reperfusion
3 mois
0
5
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Control Cold ischemia
R
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irius
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gfie
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Fibrose
Cold ischemia Control
Control Cold ischemia Control
0
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Control Cold ischemia
Clea
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Caspase 3 staining
Apoptose
0
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1
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2
25
Control Cold ischemia
Tubu
lar n
ecro
sis
scor
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Necrose
Control
Cold ischemia
Neacutecrose tubulaire
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
eacutenergeacutetique cellulaire
Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
Deacuteseacutequilibre ionique
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
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20
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45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
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TAG
E DE
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MEN
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ULA
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CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
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bule
fiel
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
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03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
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rela
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actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
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Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
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Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Ischeacutemie
Perte de lrsquointeacutegriteacute membranaire
Mort cellulaire
Reperfusion
Toxiciteacute de lrsquooxygegravene
Mort cellulaire
Stress Oxydant DAMPs
Inflammation
Reprise diffeacutereacutee de fonction
Non fonction primaire
Dysfonction chronique
Conseacutequences cliniques
Transplantation
Meacutecanisme adaptatif HIF1α NFkB
Perturbation du meacutetabolisme
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Dysfonction endotheacuteliale
Reacuteponse immunitaire
Conservation
Bilan IR
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Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
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LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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01
015
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Control WI CS WI+CSPro
tein
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actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
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bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
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ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Le stress oxydant et lrsquoischeacutemie reperfusion Au fil du tempshellip
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
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30
35
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lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
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Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
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Control WI CS WI+CSPro
tein
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Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
- Fuite vasculaire - Pheacutenomegravene de ldquono-reflowrdquo - Coagulation et activation du systegraveme du compleacutement - Activation vasculaire = recrutement cellulaire - Deacuteseacutequilibre entre les fact vasoconstricteurs et vasodilatateurs
La premiegravere cible de lrsquoischeacutemie ndash reperfusion Les cellules endotheacuteliales Conseacutequences des dommages vasculaires
Rein teacutemoin Greffon reacutenal
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
lt30microm 30-60 microm
60-90 microm
90-120 microm
gt120 microm
POU
RCEN
TAG
E DE
SEG
MEN
TS
VASC
ULA
IRES
CO
RTIC
ALE
TOTA
LE
()
REINS TEMOINS
GREFFONS RENAUX
Cortex reacutenal
Rareacutefaction des microvaisseaux
Post-traitement drsquoune acquisition microscanner drsquoune eacutechantillon reacutenal
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
IDENTIFIER LES MEacuteCANISMES IMPLIQUEacuteS EN FONCTION DE LA SEacuteVEacuteRITEacute DES CONDITIONS ISCHEacuteMIQUES EFFET SUR LrsquoANGIOGENEgraveSE DU GREFFON REacuteNAL
WI Ischeacutemie chaude agrave 37degC + deacuteclampage CS Conservation agrave 4degC + greffe
Phase tardive
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
sitiv
e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
tive
to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
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ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Lrsquoischeacutemie chaude majore les leacutesions de
lrsquoIR
WI kidney ischemia at 37degC + clamping release CS preservation at 4degC + graft
Creatinine clearance
02468
101214161820
Control WI CS WI + CS
Vim
entin
e po
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e tu
bule
fiel
d
Control WI
200 microm
Vimentine staining at day 7
CS WI+CS
deg
Control WI
CS WI+CS
Red Sirius staining at 3 months
Creatininemia at 3 months
0
005
01
015
02
025
03
Control WI CS WI+CSPro
tein
exp
ress
ion
rela
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to
actin
Dagger
plt005 vs Control Dagger plt005 vs WI deg plt005 vs CS
CT WI CS WI+CS
Hif1a 120 Kda
b actin 42 Kda
HIF1a protein expression at 3 months
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
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ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
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Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
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Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Phase preacutecoce diminution de lrsquoapport drsquoO2 augmentation des besoins en O2 HIF
Erythropoiese (EPO) Angiogenese vaculogenese (VEGF) Inhibition de lrsquoapoptose (EPOIGF2) Adaptation meacutetabolique (GLUTenzymes glycolytiques)
Phase tardive hypoxie tissulaire HIF
Transition epithelio meacutesenchymateuse (TGF-βsmad CTGF) Inflammation
Role du stress
Hypoxia inducible factor (HIF)
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Facteurs immunologiques
Facteurs non Immunologiques
Episodes de Rejet Aigu
Reacuteponses Alloimmunes Subaigues ou chroniques
Leacutesions aigues peritransplantation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Meacutecanismes de Leacutesions chroniques
Mauvais matching HLA Preacuteimmunisation Reprise diffeacutereacutee de fonction
Immunosuppression inadapteacutee Mauvaise compliance
Donneurs acircgeacutes Greffons de mauvaises qualiteacutes Mort enceacutephalique Leacutesion de conservation Leacutesions ischeacutemiques
HTA Dyslipideacutemies Toxiciteacute des immunosuppresseurs
Leacutesions Chroniques
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete
Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
Evolutions des leacutesions de lrsquoIscheacutemie Reperfusion
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques
Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee
Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes Cycle Cellulaire UPR
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Epigeacuteneacutetique
Reprogrammation
Facteurs impliqueacutes dans le deacuteveloppement des leacutesions chroniques
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et
myofibroblastes Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Circulation reacutegionale normothermique bull Reacuteanimation
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation
coagulation energetic metabolism oxygen) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
Traitements
Nouvelles approches theacuterapeutiques agrave travers la modulation du meacutetabolisme
cellulaire appliqueacutees agrave la transplantation
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Probleacutematique Les solutions de conservation doivent reacutepondre aux problegravemes physiopathologiques lieacutes agrave la conservation drsquoorgane et agrave lrsquoischeacutemie afin de preacutevenir lrsquoœdegraveme cellulaire lrsquoacidose cellulaire lrsquoalteacuteration des membranes cellulaires le devenir des ROS
Solution de preacuteservation assurer les besoins du greffon et maintenir lrsquointeacutegriteacute
La reprise de fonction La dureacutee de survie agrave court et long terme
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Principes de conservation bull Hypothermie
ndash Loi de Vanrsquot Hoff activiteacute enzymatique de 50 par pallier de 10degC
ndash 10 agrave 12 du meacutetabolisme persiste agrave 4degC
bull Limiter lrsquoœdegraveme intracellulaire ndash Impermeacuteants pression osmotique ndash Colloiumldes pression oncotique dans compartiment vasculaire
bull Limiter la perte eacutenergeacutetique (ATP)
ndash Composition ioniques des solutions limiter lrsquoactiviteacute des pompes ATPase
bull Preacutevenir lrsquoacidose intracellulairehellip mais pas trop
ndash Seacutevegravere activation phospholipases proteacuteases ndash Ajout de tampon
bull Limiter les ROS
ndash Cheacutelation helliphelliphelliphelliphelliphellip La plupart sont produits lors de la reperfusion
R d i lrsquoi i iteacute d ff Theacute i d i l d
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
ETAT DES LIEUX ET LIMITES DES MOYENS CONSERVATION
Oxygenator
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Acquisition des
donneacutees
Reconstruction et
traitement drsquoimages
Analyses drsquoimages et fusion
EacuteVALUATION MULTI MODALE
Diagnostic Pronostic Deacutecision
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
PROTOCOLE ENVISAGEABLE EN CLINIQUE
Preacutelegravevement et transport T = 5 min
(apregraves 8-12 heures de perfusion)
Transformation de lrsquoeacutechantillon pour lrsquoanalyse RMN
- Deacutecongeacutelation de 350 microL - Addition de 200 microL de tampon
- Ajustement du pH - Transfert dans le tube RMN
T = 30 min
Acquisition des spectres - Optimisation des
paramegravetres - Acquisition T = 30 min
Traitement des spectres - Calibration
- Correction phase - Correction ligne de
base T = 5 min
Analyse spectres - Inteacutegration
- Calculs T = 20 min
Reacutesultats T = 1 h 30
Deacutecision T = 2 h
(correspond agrave 10-14 heures de perfusion)
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Preacutel
egravevem
ent
Tran
spla
ntat
ion
Perfusion machine Hypo ou Normothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermiq
ue
Conservation statique hypothermique
Conservation statique hypothermique
Perfusion machine Hypo
ou Normothermique
Conservation statique
hypothermique
Hocircpital du donneur
Centre du receveur
Conservation statique
hypothermique
HUB
Transport
Temps
DIFFERENTES TECHNOLOGIES HYPOTHERMIQUES OU NORMOTHERMIQUES
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
IRM
Scanner
Centre de preacuteleacutevement
Centre de greffe
Centre drsquoeacutevaluation
Outils drsquoeacutevaluation et eacutevaluation inteacutegreacutee
ABM
Ultrasounds Biomarqueurs
Candidats
LABORATOIRE DE PERFUSION
83
EVALUATION MULTIMODALE
Donneur vivant Donneur en mort
enceacutephalique ideacuteal
Donneur en mort enceacutephalique agrave critegraveres eacutelargis ou donneur
deacuteceacutedeacute apregraves arrecirct circulatoire
Conservation hypothermique
statique
Conservation hypothermique
dynamique
Conservation hypothermique
dynamique+ additifs
Abandon
Qualiteacute du greffon Niveau leacutesionnel
Qualification du greffon Histoire du donneur Biomarqueurs donneur Biomarqueurs conservation Paramegravetres de conservation
Kerforne T et al Nephrol Ther nov 201612(6)437-42
laquo Des embryons porc-humain pour faire pousser des organes raquo Bientocirct des cochons porteurs drsquoorganes
humains Laissez-moi sortir
La deacutecellularisation et la recellularisation drsquoun organe
Le Bioprinting
Les Bioracteurs
Take home message
Traitement sucircr mais point de croisement organes et IR Nouveauteacute cliniques ouvertures recherche fondamentale Augmenter le pool donneurs marginaux Marqueur IR et Critegraveres drsquoeacutevaluation du greffon apport de la meacutetabolomique Machine normothermique faisabiliteacute eacutevaluation de greffons refuseacutes Traitement ou une preacutevention IR Utilisation de reins leacuteseacutes preacute conditionnement Reacutevolution agrave venir matrices
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation =
Mauvaise fondation
Conclusion
IMPACT CLINIQUE DE LrsquoIR DUREacuteE DE LrsquoISCHEacuteMIE FROIDE
bull Dureacutee drsquoischeacutemie froide correacuteleacutee agrave ndash Non-fonction primaire ndash Survie greffon ndash Survie patient
Stahl PLoS One 2008
Non-fonction primaire
Ischeacutemie-froide
Apoptose Neacutecrose
Deacutemographie des donneurs
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
Identifier les meacutecanismes impliqueacutes en fonction de la seacuteveacuteriteacute des conditions ischeacutemiques Effet sur lrsquoangiogenegravese du greffon reacutenal
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
EVOLUTIONS DES LEacuteSIONS DE LrsquoIR
Conservation Hypothermique +- Additifs Perfusion Machine Perfusion Machine +
Oxygegravene Perfusion Machine + Oxygegravene
+ Additifs
Donneurs vivants ou standard Donneurs Marginaux
(extended criteria cardiac deathhellip)
Qualiteacute de lrsquoorgane
Niveaux leacutesionnels
Biomarqueurs Deacutecision
COMMENT CONSERVER ET EacuteVALUER CES ORGANES POUR ADAPTER LEUR CONSERVATION
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation = Mauvaise fondation
CONCLUSION
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
laquo Des embryons porc-humain pour faire pousser des organes raquo Bientocirct des cochons porteurs drsquoorganes
humains Laissez-moi sortir
La deacutecellularisation et la recellularisation drsquoun organe
Le Bioprinting
Les Bioracteurs
Take home message
Traitement sucircr mais point de croisement organes et IR Nouveauteacute cliniques ouvertures recherche fondamentale Augmenter le pool donneurs marginaux Marqueur IR et Critegraveres drsquoeacutevaluation du greffon apport de la meacutetabolomique Machine normothermique faisabiliteacute eacutevaluation de greffons refuseacutes Traitement ou une preacutevention IR Utilisation de reins leacuteseacutes preacute conditionnement Reacutevolution agrave venir matrices
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation =
Mauvaise fondation
Conclusion
IMPACT CLINIQUE DE LrsquoIR DUREacuteE DE LrsquoISCHEacuteMIE FROIDE
bull Dureacutee drsquoischeacutemie froide correacuteleacutee agrave ndash Non-fonction primaire ndash Survie greffon ndash Survie patient
Stahl PLoS One 2008
Non-fonction primaire
Ischeacutemie-froide
Apoptose Neacutecrose
Deacutemographie des donneurs
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
Identifier les meacutecanismes impliqueacutes en fonction de la seacuteveacuteriteacute des conditions ischeacutemiques Effet sur lrsquoangiogenegravese du greffon reacutenal
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
EVOLUTIONS DES LEacuteSIONS DE LrsquoIR
Conservation Hypothermique +- Additifs Perfusion Machine Perfusion Machine +
Oxygegravene Perfusion Machine + Oxygegravene
+ Additifs
Donneurs vivants ou standard Donneurs Marginaux
(extended criteria cardiac deathhellip)
Qualiteacute de lrsquoorgane
Niveaux leacutesionnels
Biomarqueurs Deacutecision
COMMENT CONSERVER ET EacuteVALUER CES ORGANES POUR ADAPTER LEUR CONSERVATION
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation = Mauvaise fondation
CONCLUSION
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
Take home message
Traitement sucircr mais point de croisement organes et IR Nouveauteacute cliniques ouvertures recherche fondamentale Augmenter le pool donneurs marginaux Marqueur IR et Critegraveres drsquoeacutevaluation du greffon apport de la meacutetabolomique Machine normothermique faisabiliteacute eacutevaluation de greffons refuseacutes Traitement ou une preacutevention IR Utilisation de reins leacuteseacutes preacute conditionnement Reacutevolution agrave venir matrices
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation =
Mauvaise fondation
Conclusion
IMPACT CLINIQUE DE LrsquoIR DUREacuteE DE LrsquoISCHEacuteMIE FROIDE
bull Dureacutee drsquoischeacutemie froide correacuteleacutee agrave ndash Non-fonction primaire ndash Survie greffon ndash Survie patient
Stahl PLoS One 2008
Non-fonction primaire
Ischeacutemie-froide
Apoptose Neacutecrose
Deacutemographie des donneurs
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
Identifier les meacutecanismes impliqueacutes en fonction de la seacuteveacuteriteacute des conditions ischeacutemiques Effet sur lrsquoangiogenegravese du greffon reacutenal
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
EVOLUTIONS DES LEacuteSIONS DE LrsquoIR
Conservation Hypothermique +- Additifs Perfusion Machine Perfusion Machine +
Oxygegravene Perfusion Machine + Oxygegravene
+ Additifs
Donneurs vivants ou standard Donneurs Marginaux
(extended criteria cardiac deathhellip)
Qualiteacute de lrsquoorgane
Niveaux leacutesionnels
Biomarqueurs Deacutecision
COMMENT CONSERVER ET EacuteVALUER CES ORGANES POUR ADAPTER LEUR CONSERVATION
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation = Mauvaise fondation
CONCLUSION
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation =
Mauvaise fondation
Conclusion
IMPACT CLINIQUE DE LrsquoIR DUREacuteE DE LrsquoISCHEacuteMIE FROIDE
bull Dureacutee drsquoischeacutemie froide correacuteleacutee agrave ndash Non-fonction primaire ndash Survie greffon ndash Survie patient
Stahl PLoS One 2008
Non-fonction primaire
Ischeacutemie-froide
Apoptose Neacutecrose
Deacutemographie des donneurs
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
Identifier les meacutecanismes impliqueacutes en fonction de la seacuteveacuteriteacute des conditions ischeacutemiques Effet sur lrsquoangiogenegravese du greffon reacutenal
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
EVOLUTIONS DES LEacuteSIONS DE LrsquoIR
Conservation Hypothermique +- Additifs Perfusion Machine Perfusion Machine +
Oxygegravene Perfusion Machine + Oxygegravene
+ Additifs
Donneurs vivants ou standard Donneurs Marginaux
(extended criteria cardiac deathhellip)
Qualiteacute de lrsquoorgane
Niveaux leacutesionnels
Biomarqueurs Deacutecision
COMMENT CONSERVER ET EacuteVALUER CES ORGANES POUR ADAPTER LEUR CONSERVATION
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation = Mauvaise fondation
CONCLUSION
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
IMPACT CLINIQUE DE LrsquoIR DUREacuteE DE LrsquoISCHEacuteMIE FROIDE
bull Dureacutee drsquoischeacutemie froide correacuteleacutee agrave ndash Non-fonction primaire ndash Survie greffon ndash Survie patient
Stahl PLoS One 2008
Non-fonction primaire
Ischeacutemie-froide
Apoptose Neacutecrose
Deacutemographie des donneurs
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
Identifier les meacutecanismes impliqueacutes en fonction de la seacuteveacuteriteacute des conditions ischeacutemiques Effet sur lrsquoangiogenegravese du greffon reacutenal
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
EVOLUTIONS DES LEacuteSIONS DE LrsquoIR
Conservation Hypothermique +- Additifs Perfusion Machine Perfusion Machine +
Oxygegravene Perfusion Machine + Oxygegravene
+ Additifs
Donneurs vivants ou standard Donneurs Marginaux
(extended criteria cardiac deathhellip)
Qualiteacute de lrsquoorgane
Niveaux leacutesionnels
Biomarqueurs Deacutecision
COMMENT CONSERVER ET EacuteVALUER CES ORGANES POUR ADAPTER LEUR CONSERVATION
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation = Mauvaise fondation
CONCLUSION
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
CONDITIONS DrsquoISCHEMIE REPERFUSION
WI CS WI+CS
Chirurgie de lrsquoaorte Conservation des organes =DDAC
Identifier les meacutecanismes impliqueacutes en fonction de la seacuteveacuteriteacute des conditions ischeacutemiques Effet sur lrsquoangiogenegravese du greffon reacutenal
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
EVOLUTIONS DES LEacuteSIONS DE LrsquoIR
Conservation Hypothermique +- Additifs Perfusion Machine Perfusion Machine +
Oxygegravene Perfusion Machine + Oxygegravene
+ Additifs
Donneurs vivants ou standard Donneurs Marginaux
(extended criteria cardiac deathhellip)
Qualiteacute de lrsquoorgane
Niveaux leacutesionnels
Biomarqueurs Deacutecision
COMMENT CONSERVER ET EacuteVALUER CES ORGANES POUR ADAPTER LEUR CONSERVATION
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation = Mauvaise fondation
CONCLUSION
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
Leacutesions aigues
Reacuteparation complegravete Leacutesions chroniques
Reacuteparation inadapteacutee
EVOLUTIONS DES LEacuteSIONS DE LrsquoIR
Conservation Hypothermique +- Additifs Perfusion Machine Perfusion Machine +
Oxygegravene Perfusion Machine + Oxygegravene
+ Additifs
Donneurs vivants ou standard Donneurs Marginaux
(extended criteria cardiac deathhellip)
Qualiteacute de lrsquoorgane
Niveaux leacutesionnels
Biomarqueurs Deacutecision
COMMENT CONSERVER ET EacuteVALUER CES ORGANES POUR ADAPTER LEUR CONSERVATION
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation = Mauvaise fondation
CONCLUSION
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
Conservation Hypothermique +- Additifs Perfusion Machine Perfusion Machine +
Oxygegravene Perfusion Machine + Oxygegravene
+ Additifs
Donneurs vivants ou standard Donneurs Marginaux
(extended criteria cardiac deathhellip)
Qualiteacute de lrsquoorgane
Niveaux leacutesionnels
Biomarqueurs Deacutecision
COMMENT CONSERVER ET EacuteVALUER CES ORGANES POUR ADAPTER LEUR CONSERVATION
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation = Mauvaise fondation
CONCLUSION
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
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- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
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- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
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- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
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- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
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- Diapositive numeacutero 68
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- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
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- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
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- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
Bonne preacuteservation = Bonne fondation
Mauvaise preacuteservation = Mauvaise fondation
CONCLUSION
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
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- Diapositive numeacutero 32
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- Diapositive numeacutero 34
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- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
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- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
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- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
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- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
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- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
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- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
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- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
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- Take home message
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- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
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- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
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- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
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- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
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- Diapositive numeacutero 109
-
Facteurs de risques (groupes ethniques acircgehellip) Donneurs
marginaux facteurs comorbiditeacutes (HTA hellip) existants qualiteacute de la
conservation
Leacutesions chroniques Reacuteparation complegravete
Filtration glomeacuterulaire alteacutereacutee Dysfonction mitochondriale
Densiteacute capillaire alteacutereacutee
Peacutericytes
Switch meacutetabolique (cellules constitutives inflammatoires et interstitium)
Deacutepocircts de collagegravene et fibrose
Reprogrammation
FACTEURS IMPLIQUEacuteS DANS LE DEacuteVELOPPEMENT DES LEacuteSIONS CHRONIQUES
Interventions potentielles Preacute conditionnement du donneur Ameacutelioration de la conservation Nouvelles technologies de conservation Interventions chez le receveur
Interventions potentielles Controcircler la pression arteacuterielle Reacuteduire la proteacuteinurie Controcircler les dyslipideacutemies Reacutegime arrecirct du tabac exercice Arrecirct du cycle cellulaire
Cellules inflammatoires-Tubulaires-Pericytes-Endotheacuteliales
Modifications du milieu (interstitiel PO2) Stimulation des fibrocytes et myofibroblastes
Seacutecreacutetion alarmines et cytokines
Leacutesions aigues
Epigeacuteneacutetique
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
LrsquoISCHEacuteMIE Agrave LrsquoEacuteCHELLE CELLULAIRE CIBLES EXPOSEacuteES
Leacutesions microvasculaires
Perfusion perturbeacutee Adheacutesion cellulaire
augmenteacutee Permeacuteabiliteacute augmenteacutee
Persistance drsquoune ischeacutemie
Inflammation
Leacutesions cellulaires
Leacutesions eacutevolueacutees
Apoptose Neacutecrose
Leacutesions mineures Alteacuterations du
squelette
Perte de polariteacute cellulaire
Deacutetachement cellulaire Deacutebris
Leacutesions cellulaires
Alteacuteration de fonction
Ischeacutemie
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
Pyruvate
ATP
NADH H+
Acetyl CoA
Cycle de Krebs NADHH+
FADH2
ADP + Pi ATP
Phos Ox
O2
NAD+
Glucose
Glycolyse
CONSEacuteQUENCES DE LA DIMINUTION DES APPORTS EN OXYGEgraveNE SUR LE MEacuteTABOLISME EacuteNERGEacuteTIQUE
O2
Lactate
NADHH+
NAD+
Lactate deacuteshydrogeacutenase
(LDH)
Glycolyse en condition anaeacuterobie
ATP
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
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- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
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- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
Elle caracteacuterise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit ecirctre le plus court possible Consideacutereacutee comme une composante de lrsquoischeacutemie chaude (ou froide) Les meacutecanismes leacutesionnels sont mal connus
groupe FLIRT 13052020
ISCHEacuteMIE TIEDE (CHAUDE RELATIVE)
En normo thermie (37 degC) Lrsquointerruption de la vascularisation drsquoun organe (ischeacutemie) entraicircne la neacutecrose cellulaire rapide Lrsquoischeacutemie chaude lorsque lrsquoorgane nrsquoest plus perfuseacute par le sang du donneur mais nrsquoest pas encore reacutefrigeacutereacute est une peacuteriode tregraves mal toleacutereacutee et ne doit pas deacutepasser quelques minutes
ISCHEacuteMIE CHAUDE
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
Ischeacutemie et
Reperfusion
HIF1a VEGF Tsp1
Dysfonction endotheacuteliale et microvasculaire
Mort cellulaire (Apoptose neacutecrose)
Stress oxydant Activation de lrsquoendotheacutelium
Inflammationcoagulation
Atteinte du reacuteseau microvasculaire
Reacutegeacuteneacuteration et angiogeacutenegravese
LA PREMIEgraveRE CIBLE DE LrsquoIR LES CELLULES ENDOTHEacuteLIALES
Qualiteacute du greffon ++
10 des greffes
Donneur ideacuteal
DONNEURS VIVANTS
Qualiteacute greffon +
879 des greffes
Nombre en baisse
DONNEURS EN EacuteTAT DE MORT ENCEacutePHALIQUE
Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
DONNEURS MARGINAUX
- Eacutevaluation du greffon - Machine de perfusion - Traitement pharmacologique - Theacuterapie cellulaire
EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
agression seacutevegravere
agression modeacutereacutee
[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
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- Impact au moment de la reperfusion
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- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
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- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
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- Probleacutematique
- Principes de conservation
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- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
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10 des greffes
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Qualiteacute greffon +
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Nombre en baisse
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Qualiteacute greffon -
21 des greffes
pool greffons
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EacuteVOLUTION DES DONNEURS POUR LA GREFFE REacuteNALE
eacutetat leacutesionnel
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
bull Composition des solutions de conservation et hypothermie subnormothermie
bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
energetic metabolism oxygen hemoglobine) bull Modulation de lrsquoexpression proteacuteique (siRNA) bull Evaluation de la qualiteacute des greffons
Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
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ROS
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ROS
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DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
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- Lrsquohypothermie
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-
Donneur bull Preconditionnement ischeacutemique bull Reacuteanimation bull CRN
Conservation des greffons
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bull Machine de perfusion (oxygenation temp) bull Traitements pharmacologiques (inflammation coagulation
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Receveur bull Theacuterapie cellulaire (adipocytes amniocytes cell souche) bull Post-conditionnement (EPO adenosine)
APPROCHES THEacuteRAPEUTIQUES POUR LA PROTECTION DU GREFFON
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
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[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
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Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
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NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
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drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
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Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
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-
Temps
Agression
Reacutecupeacuteration
Apoptose
Neacutecrose
L rsquoischeacutemie agrave l rsquoeacutechelle cellulaire vers la mort de la cellule
[ATP]=0 rupture membrane plasmique fuite de mateacuteriel cytosolique
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[ATP] minimum activation des caspases libeacuteration AIF cyt C clivage ADN 180pb
Autophagie
Reperfusion du greffon
ROS
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Leacutesions lieacutees aux
ROS
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DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
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- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
-
Reperfusion du greffon
ROS
Leacutesions initiales de lrsquoallogreffe
Leacutesions drsquoallogreffes Inflammation
Leacutesions suppleacutementaires
Rejet drsquoallogreffe
Leacutesions lieacutees aux
ROS
Meacutecanismes immunitaires inneacutes Ag-deacutependants
DAMPs-deacutependants (DCs cellules
NKhellip)
Activation de la
cascade du compleacutement
Meacutecanismes immunitaires
inneacutes (maturation desDCshellip)
Reacuteponses allo- auto-
immune adaptative
DAMPs
Cytokines
Chemokines Moleacutecules
drsquoadheacutesion
Proteacuteines alteacutereacutees NMHCII Neacuteo-Ag
Leacutesions
compleacutement amp
coagulation
Peptides DAMPs
Eveacutenements cytotoxiques
Conseacutequences de la reperfusion
- Biologie de la cellule exposeacutee au froidMeacutecanismes et conseacutequences des leacutesions drsquoischeacutemie reperfusion
- Lrsquohypothermie
- Introduction Geacuteneacuteraliteacutes RappelsSituation du problegraveme
- Diapositive numeacutero 4
- Transplantation
- Probleacutematique
- Reacuteanimation du DME
- Diapositive numeacutero 8
- Diapositive numeacutero 9
- Reacuteanimation du DDAC
- Diapositive numeacutero 11
- Proceacutedure de prise en charge drsquoun DDAC MII
- Diapositive numeacutero 13
- Preacuteconditionnement DDAC
- Diapositive numeacutero 15
- Meacutecanismes
- Diapositive numeacutero 17
- Diapositive numeacutero 18
- Diapositive numeacutero 19
- Diapositive numeacutero 20
- Diapositive numeacutero 21
- Cycle de Krebs
- Diapositive numeacutero 23
- Diapositive numeacutero 24
- Diapositive numeacutero 25
- Diapositive numeacutero 26
- Diapositive numeacutero 27
- Diapositive numeacutero 28
- Diapositive numeacutero 29
- Diapositive numeacutero 30
- Diapositive numeacutero 31
- Diapositive numeacutero 32
- Diapositive numeacutero 33
- Diapositive numeacutero 34
- Diapositive numeacutero 35
- Diapositive numeacutero 36
- Conseacutequences
- Diapositive numeacutero 38
- Diapositive numeacutero 39
- Diapositive numeacutero 40
- Diapositive numeacutero 41
- Impact de lrsquoischeacutemie sur la mitochondrie
- Impact au moment de la reperfusion
- Diapositive numeacutero 45
- Diapositive numeacutero 46
- Diapositive numeacutero 47
- Diapositive numeacutero 48
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 50
- Diapositive numeacutero 51
- Diapositive numeacutero 52
- Diapositive numeacutero 53
- Diapositive numeacutero 54
- Diapositive numeacutero 55
- Alteacuterations de lrsquointeacutegriteacute endotheacuteliale
- Diapositive numeacutero 57
- Diapositive numeacutero 58
- Diapositive numeacutero 59
- Diapositive numeacutero 60
- Conseacutequences de lrsquoischeacutemie
- Diapositive numeacutero 62
- Diapositive numeacutero 63
- Diapositive numeacutero 64
- Diapositive numeacutero 65
- Diapositive numeacutero 66
- Diapositive numeacutero 67
- Diapositive numeacutero 68
- Diapositive numeacutero 69
- Diapositive numeacutero 70
- Diapositive numeacutero 71
- Diapositive numeacutero 72
- Diapositive numeacutero 73
- Diapositive numeacutero 74
- Diapositive numeacutero 75
- Probleacutematique
- Principes de conservation
- Diapositive numeacutero 78
- Diapositive numeacutero 79
- Diapositive numeacutero 80
- Protocole envisageable en clinique
- Diapositive numeacutero 82
- Diapositive numeacutero 83
- Diapositive numeacutero 84
- Diapositive numeacutero 85
- Take home message
- Diapositive numeacutero 87
- Diapositive numeacutero 88
- Diapositive numeacutero 89
- Diapositive numeacutero 90
- Diapositive numeacutero 91
- Diapositive numeacutero 92
- Impact clinique de lrsquoIR DUREacuteE DE Lrsquoischeacutemie froide
- Diapositive numeacutero 94
- Diapositive numeacutero 95
- Diapositive numeacutero 96
- Diapositive numeacutero 97
- Diapositive numeacutero 98
- Diapositive numeacutero 99
- Lrsquoischeacutemie agrave lrsquoeacutechelle cellulaire Cibles exposeacutees
- Diapositive numeacutero 101
- Diapositive numeacutero 102
- Diapositive numeacutero 103
- Eacutevolution des donneurs pour la greffe reacutenale
- Diapositive numeacutero 105
- Diapositive numeacutero 108
- Diapositive numeacutero 109
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