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Biologie Cellulaire &

Biologie Moléculaire

L3 UE 5.2 EP1 2014-2015

Cours n° 7-8 : mardi 30 septembre et mardi 7 octobre 14h-16h Chap. IV Cycle cellulaire

Cycle cellulaire

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Go Différenciation

Quiescence

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Technique 5 : Analyse des phases du cycle cellulaire par Cytométrie

Cytométrie

1 Incubation des cellules avec un fluorophore (intercalant de l’ADN) 2 Analyse de l’intensité de fluorescence émise par cellule (proportionnelle à

la quantité d’ADN) 3 Représentation nombre de cellules en fonction de l’intensité de

fluorescence 4 Détermination du pourcentage de cellules en fonction des phases du cycle

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Objectif : connaître le « statut prolifératif » d’une population cellulaire ou la proportion des cellules dans chacune des phases du cycle.

Analyse du cycle cellulaire et synchronisation

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Quantité d’ADN par cellule

2N

4N

1 2

Régulation du cycle cellulaire

•  Epigénétique (état de méthylation de H4K20) •  Organisation génomique Histones •  Régulation de l’expression PCNA, Orc1 •  Phosphorylation/déphosphorylation cdk-cyc •  Interactions protéine/protéine cdk-cyc, p53 •  Intégration (molécules, complexes) p53

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Cell cycle regulated establishment of the different H4K20 methylation states.

Jørgensen S et al. Nucl. Acids Res. 2013;nar.gkt012

© The Author(s) 2013. Published by Oxford University Press. 188

H4K20me3 H4K20me2

Peu de H4K20me1 sur nouvelles histones

H4K20me1 sur nouvelles histones

Protection des H4K20me1 SUV4-20H1 SUV4-20H2

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HMT

HMT

Technique 6 : Northern blot

Northern blot analyse des ARN (principalement les ARN messagers)

1 Purification d’ARN totaux ou d’ARN polyadénylés 2 Dénaturation 3 Electrophorèse (dénaturante) en gel d’agarose 4 Transfert sur membrane 5 Hybridation avec une sonde nucléotidique marquée (radioactive, …) 6 Révélation (autoradiographique, …)

Contrôles • Coloration bromure d’éthydium du gel d’agarose

(vérification de l’état des ARN et normalisation des quantités déposées)

• Hybridation avec un gène de ménage (validation de l’expérience)

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Régulation de l’expression de Orc1

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Northern blot

Sonde Orc1

Sonde GAPDH

Heures après induction de la prolifération cellulaire

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Contrôle : Dépôts des ARN totaux

ARNr 28S

ARNr 18S

+

migration

Northern blot

Phosphorylation/déphosphorylation Un facteur universel : le MPF

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Cycline B P34 Cdc2 cdk1

Site actif

M-Phase promoting factor

Deux familles : eucaryotes supérieurs

Cdk 1 à 20 Cyclines A – L , O, T, Y

Cdk : « Cycline dependant kinase »

Phosphoryle sérine et thréonine

Jeux de régulations multiples

Cycline

Régulation du cycle cellulaire par les complexes hétérodimériques cdk-cyclines

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c-fos, c-jun

•  Régulation de l’activité des complexes cdk-cyclines – Localisation – Phosphorylation –  Inhibiteur

•  Substrats – Lamine – Origines de réplication – pRb

193

Régulation par localisation : Cycline B

194

S

G2/M

Accumulation cellulaire Localisation : cytoplasme puis noyau Activité MPF

G1

P

Régulation du MPF

195

cdk7-cycline H

kinase du système de contrôle de l’intégrité de l’ADN

Réponse aux lésions ADN et

au stress environnemental

Site de fixation de la protéine 14-3-3

CDKI

P

Substrat du MPF : division cellulaire

196

Enveloppe nucléaire Membrane interne Lamina nucléaire Lamines A, B et C Chromosome (interphasique) Séquence de 10 000 pb Domaines régulateurs Matrice nucléaire Séquences d’insertion de 140 pb (dans la matrice nucléaire ex. boucle 1 : )

1

2

3

4

5

Lamines : substrat du MPF cdk1-cycB dissociation de la lamina nucléaire destruction de l’enveloppe nucléaire nécessaire pour la division cellulaire

Phosphatase

Régulation du cycle cellulaire par les complexes hétérodimériques cdk-cyclines

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Ex. Désactivation des origines de réplication : phosphorylation de cdt1 par cdk2-cyc A pour induire sa dégradation et cdc6 pour induire sa relocalisation cytoplasmique.

cdk-cycline : phosphorylation de Rb

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(Lysine ou) Histone Méthyl Transférase : HMT

cdk1 cyclines A, D et E ADN polymérase α histone H2A PCNA Rb Topoisomérase II MSH2

(Lysine ou) Histone Méthyl Transférase HMT

Régulation : phosphorylation + méthylation

Phosphatase

Intégration des régulations

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Phosphorylation/Méthylation pour pRb Méthylation : Histone/non histone

HMT : SET7 Méthylation 1• de protéines non-histone (contrôle de l’expression génique) 2• des histones (H3K4: activation)

Contrôle de l’activité de E2F Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris

Substrats de méthylation non histones de la HMT : SET7

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HMT SET7 monométhyle H3K4 : chromatine active

mais aussi des protéines non-histone pour le contrôle de l’expression génique :

SET7 méthyle p53 (sur K372) entrainant sa stabilisation et sa localisation nucléaire

SET7 méthyle (sur K142) DNMT1 (DNA cytosine-5 methyltransferase 1) entrainant sa dégradation.

SET7 méthyle le récepteur des estrogènes (sur K302) favorisant son action.

Action contrebalancée par la « Lysine-Spécifique Déméthylase » (LSD).

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HDM HDM

HAT

Intégration miARN et cycle cellulaire bis

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SWI/SNF-like complex

HAT

C-myc : Facteur de Transcription pour un nombre important de gènes : exemples EF2 et miR-17

Régulation précise de la synthèse de E2F pour éviter l’accumulation de « Double Strand Breaks » suivi d’un blocage du cycle cellulaire

Hypothèse : miRNAs (miR-17) coordonnent la progression dans le cycle cellulaire

C-myc peut recruter Sur les promoteurs :

ARNm protéine

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Molécule intégrative : p53

202

Lésion ADN

p53 p53

Transcription Interactions complémentaires

Apoptose

Répresseur de nombreux gènes Complexes avec TF IID

(p53-TBP, p53-TAF)

Facteur de transcription Fixe module p53 Induit expression : p21 un inhibiteur de cdk Inhibiteuer de cdk4-cycD, cdk2-cycE Ne reconnaît pas cdk7-cycH et peu MPF Induit inhibition de la phosphorylation de Rb Arrêt du cycle cellulaire en G1

P53-RP-A

P53-ADNlésé

P

Médiator

Molécule intégrative : p53

203

Méthylation

Acétylation

K372

interactions

interactions

HMT : SET7/9

Phosphorylation

K382ac

HDAC : SIRT1

LSD

Cartographie des « MPT » de p53

204 Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris

Organisation génomique : gènes des histones

•  Domaine •  Amas ou cluster •  Répétition •  Extrémité 3’ non codante des messagers

205

Synthèse des histones nécessaire en phase S

Domaine régulateur : « Histone »

206

207

Page 32

P

Flêches : sites hypersensibles à la Dnase I Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris

Répétition en tandem des domaines « histones »

208 Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris

Structure des ARNm « histones »

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5’ non codant partie codante 3’ non codant

Séquence 3’ non-codante régulatrice de la stabilité de l’ARNm « histone »

Pas de d’extension poly-adénylée

AAAA

Couplage avec la réplication

©