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PACESPACESPACESPACES
PLAN
• I. PRESENTATION
• II. DEFINITION ET PRINCIPAUX CRITERES
• III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS
• IV. FORMATION DES BIOFILMS
• V. REGULATION ET CONTRÔLE GENETIQUE DES BIOFILMS
• VI. EXEMPLES DE BIOFILMS
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• Les biofilms = première forme de vie (≈ 3,5 109 années)
• Les biofilms = présents partout dans l’environnement terrestre :
• pores au sein des glaciers
• Fumeurs noirs des abysses sous de hautes pressions (100 MPa)
• eau à haute concentration saline, milieu irradié, etc..
• Ces formations vivantes associent une colonisation de diversenvironnements avec un processus de survie et d’adaptation
• Ces biofilms se développent en santé sur de très nombreuses surfaces :– cathéters, valves, implants, tissus biologiques, peau, muqueuses, dents,
yeux poumons, nez, oreilles, etc..
– Conditions physiologique et pathologique (Infection nosocomiale)
I. PRESENTATION
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Omniprésence des biofilms dans la nature
Fumeurs noirs
glaciersgeyser
désert
Illustrations non au concours PACESD4
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Biofilms & médecinecathéters, valves, implants
à éliminer après 4 jours (CLIN)Cathéters, endoscopes etc. sources de contamination
Nombreuses surfaces – désinfection difficile
Illustrations non au concours PACESD5
65 % des infections bactérienneschez l’’homme dues à des biofilms
Chicurel M. Nature 2000 408 : 284-286
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Biofilm in vivo - MEB
Colonie bactérienne in vivo chez l’homme Vue Canal dentaire obturé
Illustrations non au concours PACESD6
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• Dans les suspensions liquides :• la plupart des micro-organismes sont regroupés en amas mobiles
• animés par des mouvements browniens• dépourvues de toutes attaches à une surface : état planctonique
• Sur les surfaces (naturelles ou synthétiques) :
• la plupart des micro-organismes forment des amas adhérents
• avec un remaniement permanent dans le biofilm : état sessile
• Toutes ces communautés vivantes organisées = « Biofilm »
I. PRESENTATION (suite)
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I. PRESENTATION (suite)
Etude des micro-organismes dans ces biofilms in vivo montre :
• Organisation en communautés structurées
• hétérogène ou homogène dans l’espace et le temps• Liaison à une matrice de polymères exocellulaires (EPS)
• Tous ces micro-organismes se développent :
• non isolément et sous la forme de microcolonies
• de taille, de forme, de densité et d’organisation variées(agrégat, monocouche, multicouche, suspension ou adhérent)
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W. G. CHARACKLIS (1990) :« Un biofilm est une communauté microbienne adhérant à une surface et
fréquemment incluse dans une matrice de polymères exocellulaires »Cette matrice est aussi appelée « couche muqueuse »
• Les biofilms sont des couches de micro-organismes associés à un type de surface etconstitués d’un seul type ou de plusieurs types de micro-organismes (levures,bactéries, protozoaires ou combinaisons de toutes ces espèces)
• - Les critères principaux sont ceux d’une structure biologique :• avec plus microorganismes que de matrice exocellulaire
• avec un âge et une densité
• avec une limite de visibilité comprise entre deux seuils :
en dessous de 104 cellules/cm2 : pas de visibilité
au-dessus de 108 cellules /cm2: visibilité
II. DEFINITION ET CRITERES PRINCIPAUX
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Les biofilms se développent souvent de manière hétérogène :
• en microcolonies discontinues
• séparées par des espaces où circule librement des liquides et molécules
• Les biofilms se développent parfois de manière homogène :• s’ils sont organisés par des champs de forces
• dans des conditions expérimentales
• La structure des biofilms dépend :
• des micro-organismes qui le composent
• des molécules engagées dans leur formation
• des variations physico-chimiques de leur environnement
II. DEFINITION ET CRITERES PRINCIPAUX (suite)
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Microcolonie (30 µm Ø) Streptococcus mutans sur l’émail
Formation de microcolonies
Illustrations non au concours PACESD11
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Formation des clones
• Une micro colonie grandit pour former un clone comp osé de plusieurs colonies• Toutes les bactéries du clone sont identiques• Au début , il n’y a pas de mélange de clones différents• Au delà d’une certaine croissance , les clones différents vont s’interpénétrer
Illustrations non au concours PACESD12
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L’adhésion est :Accumulation de micro-organismes et matériels extracellulaires
sur une surface solide
• Processus s’effectuant en plusieurs étapes :
• Transport vers la surface• Adhésion non spécifique ou réversible• Adhésion spécifique ou irréversible
• L’adhésion est constituée de :
• Phénomènes physico-chimiques suivis de
• Phénomènes biologiques
III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS(suite)
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III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
Tiré de Boutaleb N. thèse de chimie 2007
Illustrations non au concours PACESD14
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C’est un processus au cours duquel on constate :
• Variations avec modifications génétiques , phénotypiques et métaboliques• 40% des gènes sont modifiés pour E. coli (Prigent- Combaret et LeJeune, 1999)• 4% des gènes de P. aeruginosa (Chicurel, 2000).
• Variation des capacités d’adhésion aux surfaces intra/inter-espèces
• Variation de l’adhésion selon la nature et l’état de surface• La rugosité et les altérations des surfaces modifient la structure des biofilms
• Variations d’adhésion selon les conditions physico-chimique et biologique :• Concentration en cations divalents (Ca++, Mg++..) facilite + ou – l’adhésion• Surfaces modifiées par poly-éthylène glycol (PEG)
ou par groupements Arg-Gly-Asp (RGD) facilite l ’adhésion
III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
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III. 1. Adhésion non spécifique :• Décrite pour les cellules au travers de la théorie DLVO
(DERJARGUIN –
LANDAU – VERWEY – OVERBEEK)
• Dues interactions non spécifiques des charges ou à l’énergie de surface
• Mécanismes :• Combinaison effets d’attraction de forces de Van der Walls et
+ effets de répulsion (Coulomb) par charges ioniques (double couche en surface)
• La théorie DVLO prend en compte la variation d’énergie entre :• l’énergie d’attraction (VA ) et• l’énergie de répulsion (VR), et ce• en fonction de la distance entre deux particules
• La résultante des 2 énergies VA et VR donne l’énergie totale d’interaction (VT)
III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
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Répulsion
Attraction
Couche ionique
Rapport des Forces d’attraction et de répulsion pou r un micro-organisme à l’approche d’une surface solide
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Illustrations non au concours PACES
III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
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Les cations polyvalents augmentent l’adhésion entre les cellulessouvent chargées négativement dans les milieux biologiques
• Un pont intermoléculaire entre les cellules se constitue
par interaction électrostatique
• La répulsion électrostatique est fortement influencée par
concentration ionique de la solution :
• plus la concentration ionique est importante
• plus la force de répulsion électrostatique est faible• plus la distance entre les cellules se réduit
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III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
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III.2. Adhésion spécifique :• L’adhésion spécifique est le fait de :
• structures moléculaires à la surface des micro-organismes bactériens
(phospholipides, acides teichoïques, LPS, résidus d’acidesgras)
• d’appendices filamenteux ou organelles propres aux microorganismes
(pili ou fimbriae et flagelles)
• Structure des pili ou fimbriae :
• Les pili (pilus = poil) ou fimbriae (frange) :
� 2 types de pili (fimbriae): les pili communs d’attachements et les pilis «sexuels »
� Les pili communs : courts, nombreux sur la surface bactérienne
� Les pilis « sexuels » (F) : longs, polaire et favorisent les échanges (conjugaison)D19
III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
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•Les pili ou fimbriae communs sont issus :•de polymérisation protéines tubulaires fines, dites pilines
•pilines ensuite assemblées à des polypeptides comme l’adhésine
•assemblage des pilines distinctes forme un tube creux
•à l’extrémité du tube se trouve l’adhésine
•l’adhésine a une conformation moléculaire capable d’interagir et de fixer aux récepteursglycolipidiques ou glycoprotéiques des cellules eucaryot es
•Les pili ou fimbriae communs sont :•suffisamment minces (3-10 µm épais/0,3 à 2 µm long) pour que les cellules surmontentla répulsion électrostatique
•à l’origine de la stabilisation de l’adhésion aux surfaces ou aux cellules
•principalement sur la surface des micro-organismes gram négatifs
•rarement sur la surface des micro-organismes grams positifsD20
III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
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Schema du P-Pilus chez Escherichia coli
Structure majeure Pap A fixé mbrane externe par Pap H
Prot. fibrillum Pap E connectée à Pap A par prot. d’adaptation Pap K
Adhésine PapG connectée par une prot. d’adaptation Pap FD21
Illustrations non au concours PACES
III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
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• Fonction des pili ou fimbriae :• Les microorganismes bactériens mobiles disposent des pili communs
pour leur mobilité au sein de systèmes de ciliatures divers :
� Ciliature monotriche pour un seul pili à un pôle
� Ciliature péritriche pour plusieurs pili autour de la cellule bactérienne
� Ciliature amphitriche pour un pili à chaque pôle opposé de la cellule bactérienne
� Ciliature lophotriche pour plusieurs pili sur le même pôle de la cellule bactérienne
• Les pili communs d’attachement sont des organelles d’adhésion
pour la colonisation des surfaces de l’environnement et la résistance aux flux
• Les pili sexuels , porteur d’un facteur de transfert F de matériel génétique ,pour les échanges génétiques entre les cellules lors de la conjugaison
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III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
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• L’adhésion spécifique intercellulaire :• La liaison spécifique entre l’adhésine bactérienne et le(s) récepteur(s)
cellulaires influence la formation et la composition du biofilm
• L’adhésine bactérienne se lie spécifiquement à un récepteur cellulairecomplémentaires différents selon le type de tissu(épithélium urinaire, gastro-intestinal, surfaces dentaires, co-agrégation interbactérienne)
• Différents récepteurs cellulaires interagissent selon une spécificitéintra ou inter espèces :
• La colonisation par E. coli CFA/I et CFA/II est limitée à l’homme
• La colonisation par E. coli K88 concerne le porc• La colonisation par E. coli K99 concerne les agneaux, veaux et porcelets
(de GRAAF F.K. et al.1994) D24
III. BASES DE L’ADHESION DES BIOFILMS (suite)
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3 niveaux influencent la formation d’un biofilm :
- Le phénotype et le métabolisme bactérien
- Le type et état de surface
- L’environnement physico-chimique et biologique
• La formation se déroule en 5 étapes :
- L’adhésion initiale (non spécifique) de type réversible
- L’adhésion irréversible (spécifique) : colonies en surface avec attachements
- La colonisation avec 2 étapes de maturation :
� Maturation Iaire : croissance surface, formation EPS - biofilms monocouche (10 µm)
� Maturation II aire : croissance multicouches - biofilm multicouche (100 µm)
- La dispersion/dissolution : rupture liaisons inter-cellulaires et EPS
IV. FORMATION DU BIOFILMS
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IV. FORMATION DU BIOFILMS (suite)
La formation - croissance – dissociation du biofilm dépendent de :
• l’équilibre et le gradient des molécules biologique s au sein du biofilm soit :
� gradients molécules signals bactériennes des mêmes espèces (quorum sensing )
Favorise la croissance
� interactions molécules signals bactériennes d’espèces diverses (quorum quenching )
Limite la croissanceD26
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IV.1. L’adhésion des micro-organismes
• 1ère étape rapide est l’adsorption des molécules en :
• Absorption molécules du milieu liquide sur surface (phénomène rapide)
• 2ème étape lente est l’adhésion par interactions physico-chimiques :
• Forces des Van der Waals + électrostatiques + acido-basiques
• Modification de la distance d’interaction entre la cellule et la surface
IV.2. La colonisation
• Dès adhésion, multiplication des micro-organismes
• Synthèse des polyosides à l’origine des polymères exocellulaires
• Formation la matrice exocellulaire (EPS)
IV. FORMATION DU BIOFILMS (suite)
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IV.2. La colonisation (suite)
• Interpénétration des micro-organismes dans EPS forment un « tissu »
• Échanges entre colonies de bactéries avec circulation de nutriments
• La production EPS a lieu grâce information génétique correspondante :
• P. aeruginosa active gène promoteur algC pour formation matrice d’alginates
• Arrêt de multiplication cellulaire n’est pas arrêt de formation du biofilm :
• Activité ATP toujours présente 4 mois après arrêt de multiplication
• Croissance biofilm peut se faire sur des mois et des années
IV. FORMATION DU BIOFILMS (suite)
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IV.2. La colonisation (suite)
• Formation biofilm aboutit à des structures en forme de champignons :
• Structures évoluant avec les conditions de croissance du milieu
• Structures de cellules génétiquement et phénotypiquement différentes
• Champignons composés de tiges ascendantes et de chapeaux :
• Tiges = cellules non mobiles (mutant non mobile pilA)
• Chapeaux = cellules motiles (sauvage mobile
pilA)
• Migration de cellules de + en + mobiles vers le haut des chapeaux
IV. FORMATION DU BIOFILMS (suite)
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FORMATION DU BIOFILM EN SURFACED’UN MATERIAU DENTAIRE
Illustrations non au concours PACES
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IV.3. Dispersion/dissolution
• La dispersion et la dissolution sont des retours vers l'état planctonique
• La dispersion et la dissolution du biofilm sont dues à :
• Impact des molécules de croissance du biofilm (quorum sensing )
• Impact des molécules de diminution du biofilm (quorum quenching )
• Interactions de ces molécules pour une régulation génétique et phénotypique
• Cet impact biochimique est dépendant de :
• L’environnement moléculaire du biofilm
• L’environnement physico-chimique du biofilmD32
IV. FORMATION DU BIOFILMS (suite)
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IV.3. Dispersion/dissolution (suite)
• La dispersion est souvent liée à :
• Modifications en apport de nutriments du biofilm ,
• Fluctuations concentrations oxygène ou augmentation oxyde nitrique (NO)
• Les colonies mobiles permettent la dissociation du biofilm dès que la dissolution des liaisons de la matrice exocellulaire (EPS) a lieu :
• Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.) (Kaplan J.B. et al. 2003)
• Bactérie à l’origine de maladie des gencives (maladie parodontale)
• Synthétise une enzyme la Dispersine B qui hydrolyse l’exopolymère du biofilm
• Libération A.a.
IV. FORMATION DU BIOFILMS (suite)
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Bactéries adhérentes sont :
• phénotypiquement différentes de celles en suspensio n
• Ont une expression génétiques différentes
• Production exopolymères a lieu qu’avec information génétique adéquate
V.1. Notion de « Quorum Sensing » (QS)
• « Quorum Sensing » vu avec Vibrio fisheri (bactérie bioluminescente marine)
• Vibrio fischeri capable en milieu liquide de produire de la lumière
• Production de lumière à partir d’une certaine concentration moléculaire
• Molécule dite activatrice de luminescence ou « Auto - Inducteur » (AI)
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V. Régulation de la formation des biofilms
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Notion de « Quorum Sensing »
Capacité des bactéries à juger de leur densité ou nombre par l’intermédiaire de molécules appelées auto-inducteurs (AI)
1. Avant d’atteindre ce seuil ou « quorum » le génome bactérien n’est pas totalement exprimé.
1. Ce seuil atteint , les AI activent de nouveaux gènes qui confèrent aux bactéries des phénotypes différents mieux adaptés au milieu.
Illustrations non au concours PACES D35
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V.1. Notion de « Quorum Sensing » (QS)
• Le « Quorum Sensing » correspond à :
- Atteinte Seuil de concentration moléculaire par populations
bactériennes
- Seuil induisant la formation d’un biofilm
• Les bactéries utilisent différents types d’auto-inducteurs :
- Gram négatifs :
� petite molécule signal, soluble, diffusible
� Action sur protéine de régulation de la transcription appelée protéine R
Majorité molécules signals sont :
- N-acyl L-homosérine lactones ou homosérine lactone (HSL) D36
V. Régulation de la formation des biofilms (suite)
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Quorum sensing - découverte
Calamar Euprymna scolopes Organe lumineux qui le protège des prédateurs
Vibrio fisherii (fluorescent)À 108 / ml cette bactérie est luminescente
Illustrations non au concours PACES D37
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V.1. Notion de « Quorum Sensing » (QS) (suite)- Accumulation dans le milieu avec la croissance bactérienne- Fixation sur un récepteur cellulaire de la protéine R qu’il active- Transcription de gènes- Diminution la mobilité , modifications de phénotypes : formation du biofilm
• Chez Gram + : la communication demande 3 composants moléculaires :- un peptide signal- un ligand membranaire (Histidine-Kinase – HK)- une molécule régulatrice de la réponse intracellula ire (RR)
• Les molécules peptidiques signal interagissent avec les HK
• Les HK sont portées par des récepteurs membranaires• La stimulation des récepteurs = transduction du signal transmembranaire
• La transduction signal par molécules régulatrices intracellulaires (RR)D38
V. Régulation de la formation des biofilms (suite)
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V.1. Notion de « Quorum Sensing » (QS) (suite)
• Streptococcus mutans (S.m.) : bactérie donnant processus carieux, on a :
- Peptide signal : CSP (Competence Stimulating Peptide) codé gène ComC
- HK membranaire- Molécule régulatrice intracellulaire (RR)
• Mécanismes de Quorum Sensing chez S.m :- A partir d’un seuil de CSP , on a une stimulation HK membranaire
- HK membranaires stimule ensuite l’expression de molécules RR
- RR enclenche la transcription des gènes pour formation biofilm
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V. Régulation de la formation des biofilms (suite)
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Diverses molécules intervenant dans le Quorum Sensi ng
•Les plus connues des N-acyl-L-homosérine lactones (HSL) sont :
Illustrations non au concours PACESD40
V. Régulation de la formation des biofilms (suite)
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V.2. Notion de « Quorum Quenching » (QQ)
• Quorum Sensing = processus de stimulation du biofilm
Communication inter-cellulaire via gradient mol. signal pour une espèce bact.
• Quorum Quenching = processus de régulation du biofilm
Communication inter-cellulaire via interactions gradients mol. signal entre bact. diff.
• Les interactions moléculaires du « Quorum Quenching » :- limitent la formation du biofilm ou
- assure la co-aggrégation entre espèces différentes
• Diff. enzymes/mol. bloquent ou régulent le communication inter-cellulaire :- Le triclosan induit la production de HSL
- Les furanones halogénées limitent aussi l’activité de HSL- Les lactonases et les acylases dégradent molécules de HSL dans les milieux
V. Régulation de la formation des biofilms (suite)
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Quorum Quenching (QQ) et auto-inducteurs
Les bactéries deviennent résistantes aux Antibiotiques (ATB) ce qui pose des problèmes sérieux dans le cas d’infections agressives et résistantes = bactéries Multi-Drug Résistantes (MDR)
La recherche d’enzymes ou de molécules inactivant les auto-inducteurs (QQ) est une alternative , d’actualité et prometteuse, parallèlement à la mise au point de nouveaux antibiotiques.
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