biodégradation d'alcanes à chaîne courte par des consortia

Roly Ravalason

Biodégradation d'alcanes à chaînecourte par des consortia microbiens

et par Fusarium spp.

Aspects cinétiques, microbiologiques etenzymatiques

Sous la direction de Pierre Christen, Sergio Revah et InèsGarcia

Février - AoOt 2004

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UAM-IztapalapaInstitut de Recherche pour le

développement

REMERCIEMENTS

Je tiens a remercier toute l'équipe du laboratoire de traitement des effluents gazeux de laUAM-Iztapalapa pour son accueil chaleureux, l'aide et le soutien qu'ils m'ont accordés tout aulong de ce stage.

Je remercie tout particulièrement Pierre Christen qui a permis le très bon déroulement de cestage.

Je remercie aussi Inès Garcia qui a pris de son temps pour me suivre et me conseiller lors dela deuxième partie de ces travaux.

Merci à Sergio Revah pour son aide et ses conseils tout au long de ces travaux.

Je remercie également Richard Auria, grâce auquel ce stage a pu s'effectuer.

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AVANT-PROPOS

Ce travail a été effectué dans le cadre d'un projet de collaboration entre l'Institut deRecherche pour le Développement (lRD) et l'Université Autonome Métropolitaine de Mexico(UAM-Iztapalapa).

L'IRD est impliqué dans différents projets de recherche au Mexique, en particulier en ce quiconcerne les biotechnologies appliquées à l'environnement. Les principales thématiques derecherche concernent les études génétiques du maïs, l'étude de symbiose entre bactéries etplantes, la microbiologie des milieux extrêmes et l'élimination de composés gazeux parbiofiltration.

Au sein de ce dernier projet se développent principalement deux thématiques de recherche:la production de molécules d'intérêt par bioconversion et l'étude de la biofiltration decomposés organiques volatiles.

Les travaux effectués ici s'inscrivent dans le cadre de cette dernière thématique de recherche.Les recherches s'effectuent conjointement entre le laboratoire de traitement des effluentsgazeux de la UAM-Iztapalapa et le laboratoire de microbiologie de l'IRD de Marseille.

Les thèmes abordés concernent l'étude de la biodégradation d'alcanes volatiles par desbactéries et champignons filamenteux. Cette étude comprend la caractérisation cinétique etmicrobiologique de la biodégradation du pentane, de l'hexane et de l'heptane par des consortiamicrobiens, et l'étude enzymatique de la dégradation de l'hexane par une souche de Fusarium.

L'IRD permet aussi, outre les travaux de recherche effectués dans ses laboratoires oules laboratoires qui accueillent cette institution à l'étranger, la diffusion scientifique, à traversentre autres ses "Clubs Jeunes, Recherche et Développement". Un de ces clubs a étédéveloppé à la UAM-Iztapalapa, géré par l'IRD et l'université mexicaine. Ces clubspermettent l'éducation et la sensibilisation des jeunes à la recherche scientifique, à travers desprojets de recherche et des manifestations. A Mexico le club jeune travaille sur l'étude dechampignons comestibles et de micro-organismes. Ce dernier projet consiste en l'étude descapacités de dégradation de micro-organismes, pour évaluer la possibilité de les utiliser enbiofiltration.

C'est dans ce cadre qu'au long de ce stage il a été possible de promouvoir la diffusionscientifique à Mexico, à travers la participation à une émission de télévision (Canal Once) etune émission de radio (Radio France International).

LISTE DE,S TABLEAUXPartie 1

Tableau 1: Utilisation des alcanes dérivés du pétrole brut en fonction de la longueur de la chaîne p.1carbonée

Tableau 2: Composition typique d'une essence p.2Tableau 3 : Propriétés physico-chimiques du pentane, de l'hexane et de l'heptane p.8Tableau 4: Résultats obtenus lors d'études du traitement biologique du pentane et de l'hexane p.IOTableau 5 : Dégradation du pentane par les consortium A, B, C et D - Ensemble des résultats obtenus p.18Tableau 6 : Evolution du pourcentage de conversion du pentane en COl avec les cycles de p.19

dégradationTableau 7 : Dégradation de l'hexane par les consortium A, B, C et D - Ensemble des résultats obtenus p.20Tableau 8 : Dégradation de l'heptane par les consortia A, B, Cet D - Ensemble des résultats obtenus p.22Tableau 9 : Dégradation du pentane par les consortia A, B, C et D (deuxième série de cycles) - p.23

Ensemble des résultats obtenusTableau 10 : Ensemble des résultats obtenus lors de l'étude de la dégradation d'un mélange des trois p.24

solvantsTableau 11: Valeurs de concentrations initiales utilisées pour l'étude de la dégradation des solvants p.28

isolés ou au sein d'un mélangeTableau 12 : Consortia ayant présenté les valeurs de vitesse de dégradation les plus élevées en p.30

fonction du solvantTableau 13 : Résultats des tests d'identification microbienne préliminaire p.31Tableau 14 : Identification préliminaire des bactéries en fonction des caractères biochimiques et p.32

morphologiques pris en compte lors de l'étudeTableau 15 : Identification préliminaire des bactéries isolées des quatre consortia microbiens p.32

Partie 2

Tableau 1 : Composition du milieu minéral utilisé pour la production de biomasseTableau 2 : Composition des tampons utilisés pour les extractions enzymatiquesTableau 3 : Mélange réactionnel utilisé pour les mesures d'activité déshydrogénaseTableau 4 : Activités oxygénases obtenuesTableau 5 : Valeurs d'activité hexanol déshydrogénase obtenuesTableau 6 : Activités alcool déshydrogénase reportées pour différents micro-organismesTableau 7 ; Concentration en protéine des extraits enzymatiques utilisés

p.37p.37pAOp.42pA4pA5pA6

LISTE DES FIGURES

Partie 1

Figure 1: Voies de dégradation aérobie des alcanes, par oxydation terminale ou subterminale. D'après pAVan Beilen J.B. et al., 2003.

Figure 2: Photographie d'une bouteille sérologique utilisée lors des études de dégradation en p. 13microcosme

Figure 3 : Type de courbe utilisé pour l'application du modèle de Gompertz. Evolution de la quantité p.14de pentane consommé en fonction du temps.

Figure 4 ; Représentation schématique d'une microculture de champignon filamenteux p.16Figure 5 ; Cinétique de dégradation du pentane par le consortium A, et évolution des pourcentages p.17

d'02 et de CO2.Figure 6; Evolution des vitesses de dégradation de l'hexane pour chacun des consortium p.21

Figure 7 : Comparaison des vitesses moyennes de dégradation du pentane pour chacun des consortia, p.24pour chaque série de cycles

Figure 8 ; Cinétiques de dégradation du pentane, de l'hexane et de l'heptane au sein d'un mélange des p.26trois solvants - Consortium C, cycle 9 de dégradation.

Figure 9 : Vitesse moyennes de dégradation du pentane, de l'hexane et de l'heptane isolés ou au sein p.27d'un mélange des solvants, pour le consortium C.

Figure 10 : Vitesses moyennes et maximales de dégradation du pentane, de l'hexane et de l'heptane p.29pour chacun des consortia

Partie 2

Figure 1 : Premières étapes de la voie hypothétique de dégradation des alcanes pas Fusarium spp., et p.36enzymes impliquées

Figure 2 : Schéma de l'appareillage utilisé pour la mesure de l'activité oxygénase p.39Figure 3 : Principe de fonctionnement des alcool déshydrogénases p.39Figure 4 : Cinétique de dégradation de l'hexane par Fusarium spp. pAlFigure 5 : Evolution de la quantité d'oxygène dissous lors de la mesure de l'activité hexane oxygénase p.42

Figure 6 : Influence de la concentration en substrat sur la vitesse initiale des réactions enzymatiques p.43

Figure 7 : Cinétique d'apparition de la forme réduite du cofacteur NAD lors de la mesure de l'activité p.44hexanol déshydrogénase

SOMMAIRE

INTRODUCTION GENERALE 1

1. GENERALITES SUR LES ALCANES 11.1. Origine et utilisation 11.2. Devenir des hydrocarbures dans l'environnement 21.3. Traitement des pollutions 2

2. METABOLISME DES ALCANES 32.1. Facteurs influençant la biodégradabilité des alcanes 3

2.1.1. Influence de la température 32.1.2. Influence de la concentration en polluant 32.1.3. Influence des caractéristiques physico-chimiques des polluants 3

2.2. Métabolisme aérobie des alcanes 42.2.1 Métabolisme bactérien: 42.2.2. Métabolisme des levures: 62.2.3. Métabolisme fongique: 62.2.4. Métabolisme anaérobie des alcanes 6

3. PENTANE, HEXANE ET HEPTANE 73.1. Utilisation et devenir dans l'environnement 73.2. Réglementation 73.3. Propriétés physico-chimiques 83.4. Toxicité 8

3.4.1. Pentane 83.4.2. Hexane 83.4.3. Heptane 9

4. TRAITEMENT DES C.O.V 9

PARTIE 1 11

BIODEGRADATION DU PENTANE, DE L'HEXANE ET DE L'HEPTANE PAR DES CONSORTIAMICROBIENS: ASPECTS CINETIQUES ET MICROBIOLOGIQUES 11

1. INTRODUCTION ET OBJECTIFS 122. MATERIEL ET METHODE 12

2.1. Origine des consortia 122.2. Etude des capacités de dégradation des consortia en microcosmes 13

2.2.1. Adaptation préalable des consortia 132.2.2. Préparation des microcosmes 13

2.3. Suivi des cinétiques de dégradation 142.3.1. Méthodes analytiques 142.3.2. Détermination des vitesses de dégradation 142.3.3. Calculs des rendements et pourcentages de conversion 15

2.4. Identification microbienne 152.4.1. Isolation des micro-organismes 152.4.2. Identification bactérienne 152.4.3. Identification fongique 16

3. RESULTATS ET DiSCUSSiON 173.1. Cinétiques de dégradation des solvants 17

3.1.1. Courbes de cinétique de dégradation 173.1.2. Dégradation du pentane 183.1.3. Dégradation de l'hexane 203.1.4. Dégradation de l'heptane 223.1.5. Dégradation du pentane (deuxième série de cycles) 233.1.6. Dégradation d'un mélange des solvants 253.1.7. Résumé 29

3.2. IDENTIFICATION MICROBIENNE 313.2.1. Résultats globaux 31

3.2.2. Identification bactérienne préliminaire 324. CONCLUSION ET PERSPECTIVES 33

PARTIE II: 35

BIODEGRADATION DE L'HEXANE PAR FUSARIUM SPP. -ASPECTS ENZYMATIQUES 35

1. INTRODUCTION - OBJECTIFS 362. MATERIEL ET METHODE 37

2.1. Souche utilisée 372.2. Production de biomasse 372.3. Cinétiques de dégradation de l'hexane par Fusarium spp 382.4. Extraction enzymatique 382.5. Mesure de l'activité oxygénase 382.6. Mesure de l'activité déshydrogénase 392.7. Mesure de la quantité de protéines 40

3. RESULTATS ET DISCUSSION 413.1. Cinétique de dégradation de l'hexane par Fusarium spp .413.2. Mesure des activités oxygénases 423.3. Mesure de l'activité hexanol déshydrogénase 443.4. Activité enzymatique du contrôle 453.5. Concentration en protéines des différents extraits enzymatiques .46

4. CONCLUSION ET PERSPECTNES 46

CONCLUSION GENERALE 48

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 49

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Introduction

1. Généralités sur les alcanes

1.1. Origine et utilisation

Les alcanes sont des hydrocarbures saturés, de faible réactivité chimique, pouvant êtreutilisés en tant que combustibles ou en tant que matières premières pour la fabrication d'autresmolécules en pétroléochimie.

Ils sont présents naturellement dans les matières organiques fossiles telles que le gaz naturelou le pétrole.

Le gaz naturel est constitué principalement de méthane (de 70 à 95% en volume), associé àd'autres alcanes tels que l'éthane, le propane et le butane, à du dioxyde de carbone, du diazoteet du sulfure d'hydrogène. Il est utilisé traditionnellement pour la production de chauffage etd'électricité, mais aussi dans l'industrie papetière ou chimique.

Le pétrole quand à lui est un mélange complexe d'hydrocarbures associés à des composésoxygénés, azotés et sulfurés ainsi qu'à certains métaux. Son raffinage, qui comprend unepremière étape de distillation, permet d'en extraire la gamme des produits pétroliers. Letableau ci-dessous présente l'utilisation des différents hydrocarbures dérivés du pétrole enfonction de la longueur de la chaîne carbonée:

Tableau 1: Utilisation des alcanes dérivés du pétrole brut en fonction de la longueurde la chaîne carbonée

Longuèùr de la chaîne éâtboriée Etat physique ",Utilisation

(nombre d'atomes de carbône) (à température etpression ordinaire) 1

Gaz combustibles1 - 4 Gazeux Matières premières pour la

pétroléochimie5-7 Liquide Solvants

Base de fabrication des carburants6 - II Liquide Matières premières pour la

pétroléochimie

II - 16 LiquideBase de fabrication des carburants

Combustibles

Supérieur à 18 SolideHuiles lubrifiantes

Combustibles

Le raffinage du pétrole brut donne naissance à de nombreux produits dérivés, tels quel'essence ou encore le fuel. Ainsi l'essence est constituée de 500 hydrocarbures différents,comportant généralement de cinq à douze atomes de carbone. Le tableau suivant présentela composition typique d'une essence.


Tableau 2: Composition typique d'une essence

. V· , type d'hyqrocaibure' -,." Pourcent'lge tyj:liqu'édans une essence-Hydrocarbure aliphatique linéaire

30 à 50%Hydrocarbure aliphatique ramifié

Hydrocarbure aliphatique cyclique 20 à 30%Hydrocarbure aromatique 20 à 30%

1.2. Devenir des hydrocarbures dans l'environnement

L'utilisation des hydrocarbures fossiles peut être source de différentes pollutions: leraffinage, le transport, l'extraction et la combustion du pétrole et de ses dérivés peut entraînerla pollution des eaux continentales, de l'atmosphère et des sols.

Ainsi dans le cas d'un déchargement de pétrole dans un milieu aqueux, les alcanes de chaînecarbonée inférieure à 15 carbones subissent un phénomène d'évaporation. Cette évaporationest suivie de la solubilisation des composés hydrosolubles, puis leur émulsification. Lesphénomènes de photooxydation et de biodégradation entraînent par la suite une dégradationdes composés.

L'augmentation de la densité du pétrole suite à ces phénomènes peut entraîner unesédimentation de celui-ci.

La biodégradation est le mécanisme le plus important de dégradation naturelle deshydrocarbures. La biodégradabilité des produits pétrolier, tels que l'essence, a fait l'objet denombreuses études. Il a ainsi été montré que la majorité des constituants de l'essenceprésentaient une très bonne biodégradabilité par les microflores de l'environnement (SolanoSerena F. et al., 2001). Cependant .les taux de décomposition dans les écosystèmes naturelssont encore mal connus.

1.3. Traitement des pollutions

Les hydrocarbures ont ainsi la particularité de pouvOlr se retrouver dans les troiscompartiments de l'environnement, en fonction de l'origine de la pollution et du typed'hydrocarbure rejeté dans l'environnement.

Il existe différentes techniques de traitement des pollutions par les hydrocarbures, ellespeuvent être physico-chimiques ou biologiques.

D Traitements physico-chimiquesLes composés gazeux peuvent être aspirés pour ensuite être traités ex-situ, par adsorption,

condensation ou encore incinération.Les eaux souterraines contaminées peuvent être pompées pour être traitées hors-site.Une barrière réactive souterraine peut être placée en aval de la pollution, permettant le

traitement des polluants au passage de celle-ci.La pollution peut être confinée grâce à l'installation d'une cloison étanche.

2


Q Traitement biologiqueLes traitements biologiques peuvent être une alternative intéressante au traitement physico

chimique des hydrocarbures, en termes de coûts d'installation et de maintien, et de facilitémaintenance. Les traitements biologiques s'appuient sur la capacité des micro-organismes autiliser les hydrocarbures en tant que source de carbone et d'énergie pour leur croissance, et àles transformer en composés peu toxiques tels que le COz et l'eau. Afin de comprendre lemécanisme de traitement biologique d'une pollution, il est nécessaire de connaître lefonctionnement du métabolisme microbien par rapport au polluant.

2. Métabolisme des alcanes

2.1. Facteurs influençant la hiodégradahilité des alcanes

La dégradation des alcanes dépend de différents facteurs, tels que la température, lescaractéristiques physico-chimiques des composés.

2.1.1. Influence de la température

De faibles température affectent négativement le métabolisme microbien, en particulier auniveau de sa vitesse. Cependant certaines souches psychrophiles sont capables de dégrader lesalcanes à de faibles température. C'est ainsi le cas d'une souche appartenant au genreRhodococcus, capable de dégrader les alcanes linéaires et branchés d'un carburant de typediesel (White L. et al., 1998).

2.1.2. Influence de la concentration en polluant

Un autre facteur important est la concentration en polluant. En effet au-delà d'une certaineconcentration les hydrocarbures peuvent être toxiques pour les micro-organismes.

2.1.3. Influence des caractéristiques physico-chimiques despolluants

Les caractéristiques physico-chimiques du polluant sont aussi une influence sur sabiodégradabilité. Ainsi sa solubilité dans l'eau, son état physique ou encore sa volatilité sontautant de facteurs à prendre en compte. Cependant certains mécanismes microbienspermettent une adaptation à l'hydrophobicité de certains alcanes. Ainsi le transport desalcanes au sein des cellules microbiennes ne serait pas uniquement passif: certains microorganismes sont capables de produire des surfactants permettant une meilleure émulsificationdes alcanes, et facilitant donc leur solubilisation (Neu T., 1996). Certaines bactéries sont enoutre capables de modifier la composition de la surface de leurs cellules afin d'augmenter sonhydrophobicité et de ce fait leur affinité avec les alcanes.

3


2.2. Métabolisme aérobie des alcanes

2.2.1 Métabolisme bactérien:

L'oxydation bactérienne est une voie commune de dégradation des alcanes dans les sols etles eaux.

Dans le cas des hydrocarbures aliphatiques, la dégradation aérobie par les bactéries faitintervenir une oxydation séquentielle des groupements méthyles de la chaîne carbonée,produisant successivement l'alcool, l'aldéhyde ou la cétone, et l'acide gras correspondant. Lavoie la plus commune est celle de l'oxydation terminale de l'alcane, suivie d'une ffi-oxydation.Mais une oxydation subterminale, ou biterminale, a déjà été observée. Par la suite les acidesgras intègrent la voie de la ~-oxydation.

La figure ci-dessous présente la voie générale du métabolisme aérobie des alcanes, ainsi queles enzymes impliquées:

Carbone eténergie

cooldrogénase

13-Oxydation

e Alcool secondaire

• R-CH2OH-CH3

Al

Irdéshy

CétoneR-CO-CH3

Alcanenooxygénasbtenninale

Alcane mo

R-CH2-CH3su

se

Alcool primaireR-CH2-CHOH

e'F

AldéhydeR-CH2-CHO

se,Ir

Acide carboxyliqueR-CH2-COOH .

Alcane-lmonooxygéna

Alcooldéshydrogénas

Aldéhydemonooxygéna

Figure 1: Voies de dégradation aérobie des alcanes, par oxydation terminale ousubterminale. D'après Van Beilen I.B. et al., 2003.

o Alcane hydroxylaseLa première étape fait généralement intervenir une monooxygénase, mais quelques

dioxygénases ont été caractérisées, en particulier pour le geme Acinetobacter.Les bactéries utilisent couramment un système enzymatique nommé système alcane

hydroxylase qui permet d'oxyder les alcanes en leur alcool respectif. Le système alcanehydroxylase de souches de Pseudomonas putida (anciennement Pseudomonas oleovorans) aété largement étudié (Kok M. et al., 1989), d'autres études ont été menées pour définir ceux debactéries du geme Acinetobacter, ou encore Burkholderia (Marin M. et al., 2001).

Le système alcane hydroxylase de Pseudomonas putida est une monooxygénase constituéede trois enzymes: une alcane hydroxylase (AlkB), une rubredoxyne (Alk) et une rubredoxyne

4


réductase (AlkT). Elle pennet l'introduction d'oxygène moléculaire au niveau terminal de lachaîne carbonée de l'alcane considéré.

L'alcane hydroxylase est une protéine ferrique intégrée à la membrane. La rubredoxynepennet le transfert des électrons de la rubredoxyne réductase, une flavoprotéine NADHdépendante, vers AlkB. La rubredoxyne et la rubredoxyne réductase sont des protéinessolubles (Kok M. et al, 1998).

Chez Pseudomonas putida ce système permet la dégradation d'alcanes de longueur variantde 5 à 12 carbones. Mais de manière générale chez l'ensemble des bactéries étudiées cesystème est fonctionnel sur une gamme relativement large d'hydrocarbures, dont la longueurpeut varier de 5 à 44 atomes de carbone (Van Beiling J.B. et al., 2003).

Cl Autres monooxygénasesIl existe, outre le système alcane hydroxylase, d'autres monooxygénases impliquées dans le

métabolisme des alcanes: le cytochrome P450, l'ammonium monooxygénase ou encore labutane et la méthane monooxygénase.

Le cytochrome P450 de bactéries du genre Bacillus a été étudié, il est impliqué dans lemétabolisme des acides gras, et selon les espèces la spécificité par rapport au substrat, le tauxde conversion peuvent varier (Lentz O. et al., 2004). Il est aussi présent chez des bactéries dugenre Rhodococcus ou encore Acinetobacter, chez lesquels il pennettrait la biodégradationd'alcanes de 4 à 16 atomes de carbone.

La butane monooxygénase est présente chez des bactéries du genre Pseudomonas ouNocardioides, et de même permettrait la dégradation d'alcanes à chaîne courte.

La méthane monooxygénase est présente chez les bactéries méthanotrophes, et catalyse,outre l'oxydation du méthane, celle d'autres alcanes. Mais dans ce cas seul le méthane peutêtre utilisé en tant que source de carbone et d'énergie par les bactéries, les autres substratscarbonés ne permettant pas la croissance bactérienne, et étant dégradés par cométabolisme.

Cl Alcool déshydrogénaseLa deuxième étape de la dégradation des alcanes fait intervenir une alcool déshydrogénase,

qui permet l'oxydation de l'alcool en l'aldéhyde ou la cétone correspondante. ChezPseudomonas aeruginosa deux alcool déshydrogénases ont été décrites, l'une constitutive etl'autre inductible, les deux semblant être régulées en fonction de la longueur de la chaînecarbonée du substrat.

Certaines études ont permis de mettre en évidence l'existence d'alcool déshydrogénasesspécifiquement actives sur des alcools secondaires. C'est ainsi le cas d'une alcooldéshydrogénase caractérisée chez Rhodococcus erythropolis, capable de catalyser ladéshydrogénation du 2-octanol (Ludwig B. et al., 1995).

Une autre étude a pennis de mettre en évidence chez une autre souche appartenant à cetteespèce l'existence d'une alcool déshydrogénase possédant en outre une activité aldéhydedismutase (Schenkels P. et al., 2000)

Cl Coexistence de plusieurs systèmes enzymatiquesCertaines études ont montré que certaines espèces possédaient parfois plusieurs systèmes

enzymatiques différents, permettant la dégradation de différents types d'hydrocarbures. C'estainsi le cas de bactéries du genre Pseudomonas, qui possèdent à la fois un système permettantla dégradation d'hydrocarbures aliphatiques de C5 à C 12, et un système permettant ladégradation du naphtalène, un hydrocarbure aromatique polycyclique. Une étude a montréqu'une bactérie du genre Nocardioides possédait de même deux monooxygénases distinctes,une contenant du cuivre, et une monooxygénase ferrique intégrée à la membrane, qui peuvent

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être exprimées en même temps, et seraient régulées en fonction de la longueur de la chaînecarbonée de l'alcane considéré.

2.2.2. Métabolisme des levures:

De nombreux genres de levure ont été répertoriés comme étant capables de croître sur desalcanes. Ont peut ainsi citer des levures du genre Candida, Saccharomyces, ou encore Pichia.

Certaines levures possèdent une monooxygénase de type cytochrome P450 qui permet selonles espèces et les conditions de culture la dégradation d'hydrocarbures, ou encore qui peut êtreimpliquée dans le métabolisme d'autres molécules telles que l'ergostérol.

Candida tropicalis peut synthétiser deux types de cytochrome P450 en fonction du substratde croissance, le glucose ou un hydrocarbure aliphatique (Sanglard D. et al, 1984). Chez cettemême espèce des alcool déshydrogénases, enzymes impliquées dans la deuxième étape dedégradation des alcanes, ont été décrites, et existeraient sous deux formes, soluble ouparticulaire.

2.2.3. Métabolisme fongique:

Le métabolisme fongique des alcanes, a été moins étudié que celui des bactéries,. Lesystème enzymatique le plus couramment décrit dans le cas des champignons filamenteux estde type cytochrome P450. La voie métabolique des alcanes de certains champignonsfilamenteux, tels que Cladosporium resinae, a été décrite, et est similaire a celle décrite chezles bactéries: l'alcane est oxydé en l'alcool primaire correspondant, puis en aldéhyde via unedéshydrogénase, enfin en l'acide carboxylique correspondant. Les acides gras ainsi fonnéssont ensuite oxydés via la J3-oxydation (Walker J.D. et al., 1973).

Une étude effectuée sur cinq échantillons de sols contaminés par du pétrole brut a permis demontrer que les champignons filamenteux les plus couramment retrouvés dans ce cas étaientdes ascomycètes, du genre Aspergillus ou Penicillium (April T.M. et al, 2000), genresfréquemment reportés dans les études de la dégradation fongique des hydrocarbures.Cependant la composition fongique d'un sol contaminé par des hydrocarbures dépend de lacomposition des ces hydrocarbures. Il semblerait ainsi que les champignons appartenant augenre Zygomycète soient plus sensibles à la présence d'hydrocarbures aromatiquespolycycliques.La fraction la plus facilement biodégradée était la fraction aliphatique, entreC12 et C26.

Certaines espèces sont capables de croître en utilisant les alcanes gazeux en tant que sourcesde carbone et d'énergie. C'est ainsi le cas d'espèces du genre Graphium, capable d'utiliser leméthane, le butane ou encore le propane (Curry S. et al., 1996).

2.2.4. Métabolisme anaérobie des alcanes

Les voies dégradation aérobie des alcanes ont été les plus étudiées, mais les alcanespeuvent être dégradés en conditions anaérobies par certains micro-organismes. Dans ce casl'accepteur final d'électron peut être le sulfate ou encore le nitrate. Des études ont montré quedans certains cas l'activation des alcanes en anaérobiose se fait via leur déshydrogénation,formant un alcène. D'autres ont montré que la première étape est l'ajout ou le retrait d'unnombre impair d'atomes de carbone en position tenninale ou subterminale de l'alcane, avantsa dégradation en acide gras.

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Certaines classes d'alcanes, tels que les aromatiques, les alcanes branchés ou encore lesalcanes à chaîne courte sont récalcitrants à la biodégradation anaérobie, de forts taux debiodégradation de ces composés ont été observés au sein de sédiments sous conditionssulfato-réductrices. En conditions méthanogènes le taux de dégradation, la vitesse et le spectrede composés dégradés étaient beaucoup plus réduits (Suflita 1.,2001).

3. Pentane, hexane et heptane

3.1. Utilisation et devenir dans l'environnement

Le pentane, l'hexane et l'heptane sont des solvants pétroliers, produits couramment employéscomme constituants des peintures, vernis ou encore laques. On les utilise aussi commeintermédiaires de synthèse d'autres molécules, ou agents de dégraissages. En France, lessolvants pétroliers représentaient 21 % de la consommation totale de solvants en 1994 (BoustC.,2004).

Les solvants pétroliers sont des composés organiques volatiles (COV) et peuvent ainsi êtreémis dans l'atmosphère, à travers leur utilisation en industrie, leur émission avec les gazd'échappement, ou encore au niveau de sites de stockage tels que les stations distributricesd'essence, au niveau desquels il peut y avoir un phénomène d'évaporation. Ils peuvent ainsiêtre la source d'une pollution photochimique s'ils sont combinés aux oxydes d'azote, etpeuvent être impliqués dans l'augmentation de la quantité d'ozone dans l'atmosphère. Le rejetvers l'atmosphère est la principale voie de pollution par le pentane, l'hexane et l'heptane.Cependant les eaux et sols peuvent aussi être contaminés dans une moindre mesure par cescomposés.

3.2. Réglementation

La réglementation européenne prévoit une diminution des rejets de COV au niveauindustriel, à travers la directive 1999/ l3/CE du Conseil Européen. Cette directive propose soitla diminution de la teneur en solvant des produits utilisés, soit l'amélioration du traitement desrejets atmosphériques à travers leur incinération, leur adsorption on encore leur traitementbiologique. Ce texte a été complétée en 2002 par une autre directive concernant la diminutionde la production d'ozone.

Au niveau nord-américain des règlements devraient être adoptés ou renforcés, pour allerdans le sens de la diminution des rejets de C.O.V., par l'Agence de Protection del'Environnement américaine (EPA) et Environnement Canada.

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3.3. Propriétés physico-chimiques

Le tableau ci-dessous présente les principales caractéristiques physico-chimiques des troissolvants étudiés:

Tableau 3 : Propriétés physico-chimiques du pentane, de l'hexane et de l'heptane

. MaSse . Point de Point - Densité (20°C, Constante·de Henry Solubilité-

Al~~ne molaiie fusion d'ébullition eau=l); ~(atTn.rr?1molj20°C)" dans l'eau(g.mor l ) . , (20 OC)"

Pentane 72.2 -129.0 36.0 0.63 2.30 41.2 mg/LHexane 86.2 -95.3 68.7 0.66 0.77 12.5 mg/LHeptane 100.2 -90.6 98.4 0.68 1.30 2.68 mg/L

ad'après la US Army Corps of Engineers, 2002.

3.4. Toxicité

3.4.1. Pentane

o Chez les animaux (Commission Européenne, 2002):Toxicité aiguë: l'inhalation du pentane a eu des effets neurotoxiques sur les animaux étudiés.Toxicité chronique: aucun effet chronique n'a été observé lors d'études chez les animaux.Le pentane ne semble pas avoir d'effet mutagène et aucune donnée n'est disponible sur de

possibles effets carcinogènes ou génotoxiques.

o Chez l'homme:Le pentane étant très volatile, la principale voie d'exposition à ce composé pour l'homme est

l'inhalation. L'inhalation peut provoquer des effets asphyxiants et anesthésiants. Les effetssont ressentis à des concentrations supérieures à SOOOppm. A plus de 130 OOOppm l'inhalationdu pentane peut provoquer la mort.

Une exposition répétées à de fortes concentrations en pentane peut provoquer des lésions auniveau des nerfs de la main et du pied.

Par contact avec la peau le pentane peut provoquer des irritations et des dermatoses.

3.4.2. Hexane

o Chez les animaux (INRS, 1992):Toxicité aiguë: l'hexane présente une toxicité aiguë faible chez les animaux. Chez la souris il

a une action narcotique et anesthésique à une concentration de 1000ppm, et peut provoquerune irritation des voies aériennes à 16 000 ppm, après une inhalation de quelques minutes. Aucontact prolongé de la peau, on observe des signes neurologiques.

Toxicité chronique: on observe des effets neurotoxiques après une inhalation prolongée del'hexane par les animaux, tels que la diminution des vitesses de conduction nerveuse, uneatrophie musculaire et testiculaire, ainsi qu'une atteinte pulmonaire.

Aucun effet tératogène n'a été observé, et les données ne sont pas suffisantes pour concluresur un éventuel effet cancérigène.

8


Cl Chez l'homme:Toxicité aiguë: en cas d'exposition à des concentrations élevées d'hexane (supérieures à

1000ppm), on observe des effets sur le système nerveux central avec nausées, céphalées,vertiges ainsi qu'une irritation des voies respiratoires et des yeux. L'ingestion del'hexane avecinhalation peut provoquer une pneumopathie.

Toxicité chronique: l'inhalation prolongée de l'hexane peut provoquer polynévrites qui setraduisent par des troubles sensitifs puis moteurs, et parfois touche système nerveux central,provoquant des problèmes de coordination de la démarche et des troubles de la vision. Lecontact prolongé avec la peau peut provoquer des irritations et des dermatoses.

3.4.3. Heptane

Cl Chez les animaux (INRS, 2003):Toxicité aiguë: une inhalation de concentrations supérieures à 10 OOOppm d'heptane peut

provoquer chez la souris une dépression du système nerveux central, et une irritation des voiesrespiratoires.

Toxicité chronique: après inhalations répétées, il a été observé chez le rat des anomalies dusystème nerveux périphérique. Cependant peu d'études ont reporté un effet toxique chroniquede l'heptane.

Cl Chez l'hommeL'inhalation d'une concentration de SOOOppm d'heptane provoque, au bout de quelques

minutes, des vertiges, et peut aller jusqu'à la perte de connaissance. En cas d'ingestion etinhalation, l'heptane peut provoquer une pneumonie. Au contact de la peau l'heptane peutprovoquer une sensation de brûlure sans lésion importante. Un contact répété peut provoquerdes dermatoses.

4. Traitement des C.O.V

Différents types de traitement des C.O.V. existent. On peut ainsi citer l'adsorption surcharbon actif, la condensation ou la séparation sur membranes, techniques qui peuvent êtreutilisées seules ou combinées. Il existe aussi des techniques biologiques, telles que labiofiltration.

En comparaison d'autres techniques physico-chimiques de traitement des C.O.V., labiofiltration présente des avantages certains en termes de coûts d'investissement et de stabilitéopérationnelle. De plus la biofiltration permet un traitement en continu des polluants sansutilisation de produits chimiques. Dans le cas du pentane, de l'hexane, et de l'heptane,différents systèmes de biofiltration ont été étudiés. Les résultats obtenus pour certaines étudessont présentées dans le tableau ci-après.

9

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Introduction---- ~ _._.~~~.._...- --

Tableau 4: Résultats obtenus lors d'études du traitement biologique du pentane et del'hexane

.~, . E.tude Spigno G. et al., 2003 audwiIi K. et aI; 1999. Daviil.~on 8., 2000Polluant hexane hexane pentane

MicroorganismeAspergillus niger

consortium bactérienconsortium bactérien

utilisé

Technologie utilisée biofiltre biofiltrebiolaveur

Support argile expansétourbe traitée à l'huile de polyéthylène

silicone

Volume 17,7 cm316 cm3

250 cm3

Concentration à7 à 8 g.m3air 20 à 30 g1m3réacteur.h 500 à 5000 ppm

l'entréeCapacité

16,4 g1m3réacteur.h 60 g1m3réacteur.hd'él imination 150 g1m3réacteur.h

maximaleproche de 100%

Efficacité90% 91.6%

jusqu'à une charge ded'enlèvement 4g1m3réacteur.h

10

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie 1

PARTIE I

Biod,êgradation du pentane, derhexane et de Itheptane par des

t' ~ b'consor .la mlcrO ..··lens: aspectsIl> ""t' t Il> b· l' ..CIne lques e·· mIcro JOoglqU.es

11

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie l

1. Introduction et objectifs

Afin de mettre en place un système de biofiltration il est nécessaire de choisir dans unpremier temps le ou les micro-organismes les plus aptes à effectuer la biodégradation ducomposé considéré, et éventuellement de les adapter à la présence de ce composé. Pour cela ilest courant d'effectuer des tests à petite échelle en laboratoire, au cours desquels sont évaluéesles capacités de biodégradation de différents micro-organismes. De nombreuses études ontporté sur l'étude de micro-organismes isolées et de leur capacité de dégradation propres.Cependant l'intérêt de l'utilisation de consortia est de permettre une synergie entre lesdifférents micro-organismes constitutifs, et une possible amélioration des capacités dedégradation de ceux-ci par rapport aux micro-organismes isolés. Ceci est d'autant plus vraidans le cas de consortia de bactéries et champignons filamenteux. En effet plusieurs étudesont mis en évidence une amélioration de la biodégradation de certains composés lorsqu'unconsortium bactérien était additionné d'un champignon filamenteux. Dans l'une d'entre elles,un consortium constitué de bactéries du genre Pseudomonas, Serratia, Acinetobacter,Flavobacterium s'est avéré capable de dégrader du diesel au sein d'un sol à une taux de2,13~iesel/gso1.jour. Le taux de minéralisation était alors de 85%. L'ajout d'un champignonfilamenteux, appartenant à l'espèce Pleurotus ostreatus, a permis d'augmenter ce taux à 4,28gdiesel/gsol.jour, et d'atteindre un taux de minéralisation de 96% (Marquez-Rocha F. et al,2001).

L'objectif de l'étude présentée ci-après a donc été de caractériser les capacités de dégradationde quatre consortia microbiens, par rapport à trois composés: le pentane, l'hexane et l'heptane.Cette caractérisation a permis par la suite le choix du consortium le mieux adapté pour labiofiltration de ces composés.

2. Matériel et méthode

2.1. Origine des consortia

Les capacités de dégradation de quatre consortia microbiens ont été étudiés. Ils ontrespectivement été nommés consortium A, B, C et D.

Ces consortia provenaient de biofiltres permettant la dégradation de composés gazeux telsque l'hexane ou le Méthyl-Tertio- Butyl-Eter. Ainsi les consortia B et D sont issus de biofiltrepermettant lé dégradation de l'hexane. Le consortium B en particulier est à l'origine unconsortium de Pseudomonas.

12

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie l

2.2. Etude des capacités de dégradation des consortla ennucrocosmes

2.2.1. Adaptation préalable des consortia

Les quatre consortia ont été préalablement adaptés au pentane, durant deux mois. Pour ceciils ont été placés en milieu minéral, en bouteilles sérologiques fermées, sous atmosphère depentane et oxygène régulièrement renouvelée.

2.2.2. Préparation des microcosmes

Par la suite les consortium ont été transférés en milieu minéral, tamponné à pH 4,0.Le consortium B a été préalablement testé sur un milieu minéral particulier, à pH 7,0. Ce

milieu était celui utilisé lors des études de biodégradation de l'hexane en biofiltre par ceconsortium. Il a par la suite été transféré sur le même milieu que celui utilisé pour les autresconsortia.

Les études de biodégradation ont été effectuées en bouteilles sérologiques de 125 mL,contenant 17mL de milieu minéral et 3mL d'inoculum. Les bouteilles étaient scellées par desvalvules mininert permettant le prélèvement d'échantillons gazeux. Les bouteilles ont étéplacées sur agitateur rotatif à 100rpm, dans une chambre à température contrôlée de 30°C. Lafigure ci-dessous présente un bouteille sérologique:

Figure 2: Photographie d'une bouteille sérologique utilisée lors des études dedégradation en microcosme

Le volume de l'espace de tête était de 105mL, celui de la phase liquide de 20mL.Les consortia ont été mis en présence de chacun des solvants (pentane, hexane, heptane et

mélange des trois solvants) et les cinétiques de dégradation des composés ont été étudiées.Les expériences ont été effectuées en bateh, la phase gazeuse étant renouvelée dès que la

totalité du solvant présent en phase gazeuse, ou de l'oxygène, avait été consommé.Un cycle de dégradation d'un solvant était terminé lorsque le consortium était adapté à ce

solvant, c'est-à-dire lorsque la vitesse de dégradation du solvant était constante.

13


2.3. Suivi des cinétiques de dégradation

2.3.1. Méthodes analytiques

Les cinétiques de dégradation du pentane, de l'hexane et de l'heptane ont été réalisées eneffectuant, à intervalles de temps réguliers, des prélèvements de la phase gazeuse desbouteilles. Les quantités initiales et résiduelles des composés ont été déterminées par CPGFID. Les valeurs obtenues ont pennis de tracer des courbes de dégradation de type [alcane] =

f(temps) pour chacun des consortia et chacun des solvants.Afin d'évaluer la production de C02 et la consommation d'oxygène par les consortia, la

concentration en chacun de ces gaz était elle aussi détenninée par chromatographie en phasegazeuse.

2.3.2. Détermination des vitesses de dégradation

Il a été possible de calculer deux types de vitesses de dégradation: une vitesse dedégradation moyenne et une vitesse de dégradation maximale.

La vitesse de dégradation moyenne correspond à l'opposé de la valeur de la pente de lapartie linéaire des courbes de cinétique.

Les vitesses de dégradation maximales ont été calculées en appliquant le modèle deGompertz aux courbes de cinétiques. Pour appliquer ce modèle il est nécessaire d'inverser lescourbes de cinétique afin d'obtenir des courbes du type de celle présentée ci-dessous:

50

~ ".-----

o:'2 30

~g!ou 20o

~~ 10

i tefO 20 3D 40 50 60 10

Temps (heures)

Figure 3: Type de courbe utilisé pour l'application du modèle de Gompertz.Evolution de la quantité de pentane consommé en fonction du temps.

Le modèle est basé sur l'équation suivante:

y = a.é-exp(-k(t-tc»)

où: a est la concentration maximale du composé considéré. Ici il s'agit de la concentrationinitiale en solvant.

k est la valeur de la pente de la tangente à la courbe au point d'inflexion.te est la valeur du temps au point d'inflexion de la courbe.

14


La valeur de la vitesse maximale de dégradation est ainsi calculée à partir de l'équation cidessous:

Vmax = a.k/e

2.3.3. Calculs des rendements et pourcentages de conversion

Les différentes données obtenues ont aussi pennis de calculer différents rendements:Le rendement respiratoire qui correspond à la quantité d'oxygène consommé par rapport à la

quantité de dioxyde de carbone produit. Il est noté n02/nC02.Le rendement oxygène sur solvant, qui correspond à la quantité d'oxygène consommé sur la

quantité de solvant dégradé. Il est noté Y02/solvant.Le rendement dioxyde de carbone sur solvant, qui correspond à la quantité de dioxyde de

carbone produit sur la quantité de solvant dégradé. Il est noté YC02/solvant.

2.4. Identification microbienne

2.4.1. Isolation des micro-organismes

Les microorganismes de chaque consortium ont été isolés sur boîte de Pétri, sur quatre typesde milieu différents: le milieu PDA (potato dextrose agar), le milieu Sabouraud, le milieuTrypto-Caséine Soja et le milieu Agar Nutritif.

Les milieux PDA et Sabouraud sont spécifiques des levures et champignons filamenteux.Leur pH respectif est de : 5,6 et 6,0.

Le milieu Trypto-Caséine Soja pennet la mise en culture de bactéries exigeantes. Son pH estde 7,3.

L'agar nutritif pennet la mise en culture de bactéries non exigeantes, sont pH est proche dela neutralité.

2.4.2. Identification bactérienne

Les bactéries ont par la suite été identifiées par l'intennédiaire de différents tests:

a Observation macroscopique et microscopiqueL'aspect des colonies sur milieu de culture, leur taille et leur couleur, ont été observées.Un état frais des micro-organismes a été fait, pennettant d'observer leur éventuelle mobilité.

a Coloration de GramChacune des souches isolées a été caractérisée selon sa coloration de Gram.

a Recherche de la catalaseLa recherche de l'enzyme catalase s'est faite en udisant du péroxyde d'hydrogène, mis

directement en présence d'un état frais de chaque colonie.

15


2.4.3. Identification fongique

Cl Observation macroscopiqueLes champignons filamenteux isolés sur boîte de Pétri ont été caractérisés par observation

macroscopique, par rapport à leur forme, texture et couleur.

Cl Microcu1tureChacun des champignons filamenteux isolé sur boîte de Pétri a été par la suite placé en

microcu1ture afin de permettre une observation microscopique des hyphes et corps fructifères.La figure ci-dessous présente un schéma d'~ne microcu1ture:

Lamelle -_.r

Cube d'agar --i~-""";f~~~~6~~~--=~:-----

Support

Lame

Glycérol (5%)

Figure 4: Représentation schématique d'une microculture de champignonfilamenteux

Après inoculation du cube d'agar, les différentes boîtes ont été placées à l'étuve à 30°C,jusqu'à atteindre une croissance suffisante du myce1ium sur la lamelle de verre. Les lamellesont ensuite été observées au microscope.

16


3. Résultats et discussion

3.1. Cinétiques de dégradation des solvants

3.1.1. Courbes de cinétique de dégradation

La figure ci-dessous présente les cinétiques de dégradation du pentane, la consommationd'oxygène et la production de C02 par le consortium A.

50 22

• 20

j ....0.- oenta~ 40

~O.16

l ,-,'-, CO. 16

j 30 14

~........................... 12 0

" a=. 10...,

1:1 20 ~CIl a1:1 6 ...,Cl

~'Q

~10

" • 4CIl ,-u .."

â .. 2

U 0 .--0

0 10 20 30 40 50 60 70

Temps (heures)

Figure 5 : Cinétique de dégradation du pentane par le consortium A, et évolution despourcentages dU2 et de C02.

17

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie l-- --_...... _. ---

3.1.2. Dégradation du pentane

Le tableau ci-dessous présente les résultats obtenus pour chacun des consortia, pour lepentane:

Tableau 5: Dégradation du pentane par les consortium A, B, Cet D - Ensemble desrésultats obtenus

'", Vitesse de dégradationnC021n02{'mg/Lair.heure) Nombre de

PourcentageY02/pentane YCO)pentane pP:!

de (valeurConsortium ~ycles ... (valeur (valeur

çonversion théorique:Moyenne Gompertz

d'aêlaptation en CO2 ..0.63) théorique: 8) théorique: 5)initial final

A 2.27 3.10 10 79.3 0.56 7.49 4.\8 4.0 5.7B 1.57 2.\4 9 75.5 0.45 7.75 3.77 6.\ 5.3C 3.20 3.20 19 71.6 0.60 5.74 3.58 4.0 5.5D \.05 1.30 3 80.4 0.56 7.23 3.83 4.0 6.2

o Vitesse de dégradation du pentaneLes quatre consortia se sont avérés capables de dégrader le pentane à des vitesses

relativement élevées. Le consortium C était celui qui présentait la vitesse de dégradation laplus élevée, en tennes de vitesse moyenne et de vitesse maximale. Cependant il a été celui quia présenté le temps d'adaptation le plus long, il a en effet fallu effectuer dix-neuf cycles dedégradation en batch avant d'atteindre une vitesse de dégradation constante. On peutremarquer que les vitesses de dégradation moyenne et maximale sont identiques. En effet lacinétique de dégradation du pentane est parfaitement linéaire pour ce consortium, alors qu'elleest de type sigmoïde pour les trois autres.

Contrairement à ce qui a été observé pour le consortium C, le consortium le plus rapide às'adapter à la dégradation du pentane a été aussi celui qui a présenté les vitesses dedégradation les plus faibles: le consortium D s'est adapté au bout de trois cycles dedégradation, en présentant cependant des vitesses de dégradation près de sept fois inférieuresen termes de vitesses maximale, que le consortium C.

Si l'on compare les capacités des consortia A et C, même si la vitesse de dégradation duconsortium C est légèrement supérieure à celle du consortium A, ce dernier s'est avérécapable de s'adapter beaucoup plus rapidement à la dégradation du pentane, puisqu'il n'a falluque dix cycles de dégradation en batch avant d'atteindre une vitesse de dégradation constante.

o Conversion du pentane en CO2Le pourcentage de conversion du pentane en CO2 a été pratiquement le même pour chacun

des consortia, variant de 70 à 80%. Les 20 à 30% de solvant non retrouvés sous forme de C02pourraient correspondre à des intermédiaires métaboliques de la voie oxydative du pentane,tels que le pentanol, le pentanal ou encore l'acide pentanoïque. Ces composés, plus solublesen phase aqueuse que le pentane, auraient pu ne pas être détectés en phase gazeuse.

Il est aussi possible qu'une partie du pentane soit utilisé pour produire de la biomasse.En effet si les micro-organismes ne sont pas limités dans leur croissance par la quantité de

nutriments ou encore par l'oxygène, ils peuvent utiliser le pentane en tant que source decarbone. De ce fait le pourcentage de conversion en C02 devrait être faible au début del'expérience, du fait de la prédominance de la production de biomasse sur l'oxydation

18


complète du pentane. Il devrait aussi augmenter au fur et à mesure que le milieu utilisé, nonrenouvelé, s'appauvrit en nutriments, et que l'oxydation complète en C02 devienne ainsiprivilégiée. Cependant l'observation de l'évolution du pourcentage de conversion en C02 aucours du temps ne pennet pas d'émettre de conclusion allant dans ce sens, comme le montre letableau ci-dessous.

Tableau 6 : Evolution du pourcentage de conversion du pentane en C02 avec lescycles de dégradation

Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de Pourcentage de

Cycle de dêgradationconversion du conversion du conversion du conversion du

pentane en CO2 pentane en CO2 pentane en CO2 pentane en CO2

Consortium A Consortium B Consortium C Consortium 01 31.42 68.07 n.a. 82.562 n.a. n.a. n.a. n.a.3 85.99 88.44 73.58 57.494 74.22 (47.44) 73.57 70.755 68.02 71.21 n.a. 84.066 n.a. n.a. 88.15 n.a.7 (109.40) 74.64 n.a. 74.868 n.a. n.a. 69.20 n.a.9 84.44 83.95 55.79 80.9510 74.47 74.47 n.a. 52.02Il 88.90 92.81 n.a. 90.49

Le pourcentage de conversion du pentane en CO2 varie beaucoup d'un cycle de dégradationà un autre. Ces variations pourraient être dues à la précision requise pour une mesure de tellesquantités de C02.

o RendementsLes valeurs obtenues pour les différents rendements rejoignent les observations faites sur le

pourcentage de conversion en C02. Ils sont inférieurs aux valeurs théoriques, ce qui signifieque la quantité d'oxygène consommée, ou de CO2 produit, sont inférieures aux quantitésnécessaires à l'oxydation complète du pentane.

o Evolution de la valeur du pH:Malgré l'effet tampon des milieux utilisés, le pH du milieu de culture des quatre consortia

tend à atteindre une valeur comprise entre 5,3 et 6,2. Ceci pourrait s'expliquer par laproduction de métabolites particuliers au cours de la dégradation du pentane.

19

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie 1--- ----_...._--------_.. -_.-

3.1.3. Dégradation de l'hexane

Le tableau ci-dessous présente les résultats obtenus pour chacun des consortia, pourl'hexane:

Tableau 7 : Dégradation de l'hexane par les consortium A, B, Cet D - Ensemble desrésultats obtenus

Vitesse de dégradation (Pourcentage fiC02Jn02 pH(rng/Lair.heure) Nombre de Y02/hexane YC02/hexahe

Consortium cyclesde (valeur

(valeur (valeurconversion théorique:

Moyenne. . Gbmpertz; d'adapta:tipn

en CO2 ·0:63). théorique): 8) théorique: 5)

initial finali 'J'

A 0.73 1.00 3 63.5 0.60 6.33 3.81 4.1 5.3B 4.37 5.77 7 48.8 0,41 4.91 2.36 6.4 5.7C 2.19 4.18 7 52.9 0.55 5.30 2.96 4.3 5.3D 0.52 0.56 2 63.7 0.58 6.70 3.82 4.6 5.2

o Vitesse de dégradation de l 'hexaneLes quatre consortia se sont avérés ici aussi capables de dégrader l'hexane à des vitesses

relativement élevées, cependant les consortia B et C présentent des vitesses de dégradationnettement supérieures à celles des consortia A et D. Mais le nombre de cycles nécessaires àl'adaptation à la dégradation a été ici plus faible pour ces deux derniers. On peut estimer qu'ilsse sont presque immédiatement adaptés à la dégradation de l'hexane.

La figure suivante présente l'évolution de la vitesse moyenne de dégradation de l'hexane en .fonction du numéro du cycle de dégradation,

20


5

••• a .

•

• Vm· Consortiwn A a• Vm - Consortiwn B

1 & Vm - Consortiwn C• Vm· Consortiwn 0

;c 4,5..:~ 4

.§, 35= '.2~ 3

l!.~ 25"Cl '.."Cl.. 2==..~ 1,5e~ 1~;; 0,5

• • &..........................•. 7.1 ~ru~r.~ir.h

&

&: O,73mg/Lair.h......................•....•••••••• :- ••••••• #•••••••••

• • O,52mg/Lair.h&

• 4.37mg/Lair.h

141210642

o-l---__,__---~--__,__---.-----r------.-----,

oNuméro du cycle de dégradation

Figure 6 : Evolution des vitesses de dégradation de l'hexane pour chacun desconsortium

Seules les vitesses linéaires ont été prises en compte, les vitesses maximales nepouvant pas toujours être calculées pour tous les cycles.

a Vm: vitesse moyenne

On peut constater que plus la vitesse de dégradation moyenne finale, c'est-à-dire lorsque leconsortium est adapté à la dégradation, est élevée, plus le temps d'adaptation est long. En effetla vitesse de dégradation du solvant augmente de façon régulière, ce qui pourrait être dû à uneaugmentation elle aussi régulière de la quantité d'enzymes et éléments impliqués dans lemétabolisme du solvant. L'adaptation à la dégradation du solvant pourrait donc se traduire parune activation progressive de systèmes cellulaires, plus ou moins performants en fonction duconsortium et du solvant étudié.

Q Comparaison avec les valeurs obtenues pour le pentaneLes valeurs de vitesses de dégradation atteintes par les consortia B et C sont nettement

supérieures à celles obtenues en présence de pentane, et atteint plus du double pour leconsortium B. Par contre elles sont beaucoup plus faibles pour les consortia A et D.

Q Evolution des valeurs de pHDe même que ce qui a été observé dans le cas de l'hexane, le pH du milieu de culture tend à

atteindre la même valeur, comprise entre 5,2 et 5,7.

21


o Conversion de l'hexane en C02Le pourcentage de conversion de l'hexane en C02 a ici été légèrement plus faible que celui

obtenu pour le pentane. En effet les valeurs varient entre 50 et 60%, alors qu'elles étaientproches de 80% pour le pentane

3.1.4. Dégradation de l'heptane

Le tableau ci-dessous présente les résultats obtenus pour chacun des consortia, pourl'heptane

Tableau 8: Dégradation de l'heptane par les consortia A, B, C et D - Ensemble desrésultats obtenus

Vitesse de dégradatIonPourèel)tage nC02/n02

YC02/pentanel(mg/Lair.heure};

Nombre de YOi/pentane pHConsortium

.. 1""" cycles de (valeur(valeur (valeur 1

d'adaptationconversion théorique:

théorique: 8) théorique: 5)Moyenne Gompertz en CO2 0.63) initial final

A 2.69 3.59 4 53.7 0.54 5.18 3.76 5.4 6.2B 5.80 7.30 3 52.6 0.45 8.19 3.68 6.0 6.2C 5.99 6.52 2 51.8 0.52 8.06 3.23 5.5 5.7D 1.50 2.06 1 49.0 0.51 6.96 3.43 5.3 5.8

o Vitesse de dégradation de l'heptane:Tous les consortia se sont avérés capables de dégrader l'heptane après un temps d'adaptation

très courts en comparaison des autres solvants. Dans le cas du consortium D le tempsd'adaptation a été nul. II est possible que les systèmes enzymatiques utilisés par le consortiumD pour la dégradation de l'hexane et de l'heptane impliquent les mêmes enzymes, ce quiexpliquerait le fait que l'adaptation ne soit pas nécessaire ici.

Les vitesses de dégradation ont été dans l'ensemble supérieures à celles obtenues pour lepentane et l'hexane. Les consortia B et C ont été ceux présentant les vitesses de dégradationles plus élevées, comme dans le cas de l'hexane.

o Pourcentage de conversion en C02Le pourcentage de conversion en C02 a ici été plus faible que celui calculé pour le pentane

et l'hexane. Les valeurs tournent autour de 50% de conversion.

22


3.1.5. Dégradation du pentane (deuxième série de cycles)

Le tableau ci-dessous présente l'ensemble des résultats obtenus lors de l'étude de ladeuxième série de cycles de dégradation du pentane.

Tableau 9 : Dégradation du pentane par les consortia A, B, Cet 0 (deuxième série decydes) - Ensemble des résultats obtenus

.~:" Vitesse dé dégradation(mg/Lair.,heure) Nombre de

Pourcentage nCQz/nOzYOz/pentane YCOz/pentane pH

Consortium cyclesde (valeur

(valeur (valeur<j'adaptation

conversion théorique:théoriqlle: 8) théorique: 5)

Moyenne. Gompertz en COz 0.63) initial final

A 3.82 4.51 13 72.8 0.49 7.56 3.62 65 7.2B 3.39 3.79 Il 70.9 0.51 6.88 3.54 5.6 5.9C 5.33 n.a. 5 63.1 0.49 6.48 3.16 6.6 6.80 1.38 1.65 7 69.8 0.46 7.55 3.78 5.8 6.4

o Vitesse de dégradation du pentaneLe consortium C est celui qui a présenté la plus grande valeur de vitesse moyenne de

dégradation du pentane. Les consortia A et B ont présenté des valeurs de vitesse moyennesimilaires, tandis que le consortium D est celui qui a présenté la valeur de vitesse moyenne laplus faible.

On peut constater que le temps d'adaptation au solvant a été plus long lors du passage del'heptane au pentane que lors du passage de l'hexane à l'heptane. Pourtant les consortia ont étéplacés durant deux mois en présence de pentane, et par la suite un suivi cinétique surplusieurs cycles de dégradation a permis de mettre en évidence le fait que les consortias'étaient adaptés à la dégradation du pentane. Néanmoins suite à une série de cycles dedégradation de l'hexane et de l'heptane, les consortia n'ont pas été immédiatement capables dedégrader le pentane à une vitesse constante.

Cependant on peut remarquer que les vitesses de dégradation finales obtenues ont été plusélevées pour la deuxième série de cycles que pour la première, comme le montre la figuresuivante.

23


6

..:j0>.§.5IIIc:IIIi:IIIa. 4::J"tlc:,21ij"tl 3

~Cl

'4l"tlIII"tlIII 2c:c:~oEIIIli)

~:;:

Consortium A Consortiwn 8 Consortium C

• Première série de cycles

.Seconde série de cycles

Consortium 0

Figure 7: Comparaison des vitesses moyennes de dégradation du pentane pourchacun des consortia, pour chaque série de cycles

Dans tous cas, mis à part pour le consortium D, la vitesse moyenne de dégradation finale estnettement supérieure pour la deuxième série de cycles. Ainsi le fait d'avoir placé lesconsortium en présence d'hexane et d'heptane a pennis une augmentation par la suite de lavitesse de dégradation du pentane, peut-être par une sélection spécifique de certainsmicroorganismes au sein des consortia, ou encore par l'induction d'autres systèmesenzymatiques plus efficaces pour la dégradation du pentane.

24


3.1.6. Dégradation d'un mélange des solvants

Le tableau ci-dessous présente les résultats obtenus lors de l'étude de la dégradation d'unmélange de pentane, d'hexane et d'heptane. L'étude a été réalisée uniquement sur les consortiaB, C et D.

Tableau 10 : Ensemble des résultats obtenus lors de l'étude de la dégradation d'unmélange des trois solvants

Vitesse de dégradation Vitesse'ce.dégradation Vitesse de dégradatiOIi Nombre de Pourceniagè dépentane (mglLair.heure) hexane (mglLàir.heure) heptane(mglLair.heure) cyclès conversion en

Consortium·

MoYenn~.1 Gompertz

d'adaptation COz

, Moyenne . Gompertz Moyenne Gompertz

A n.a. n.a. n.a. 1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.B 1.03 n.a. 0.72 n.a. 0.89 n.a. n.a: 52.9C 1.64 2.19 2.73 3.80 2.60 3.99 3 44.50 0.45 0.50 0.75 0.86 0.96 1.18 4 30.2

a Valeur non dispOnIble car l'étude s'est faIte sur deux cycles

Les trois consortia étudiés (B, C et D) ont tous été capables de dégrader les trois solvants ausein d'un mélange. Pour les trois solvants le consortium C est celui qui a présenté les vitessesde dégradation les plus élevées.

Le graphique ci-après présente l'aspect des courbes de cinétique de dégradation du mélangede solvants pour le consortium C.

25

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie 1............. . ............................•............ " .•.......• .

35

"2' 30'ro--l--0'1E 25--c:CIl.2: 20oIIIc:Q)

c: 15.QroL..

1:10~c:oU 5

'4• • Â

<::'" ~' .....1:"'II, :::'". '.'

'.

· .•.. Pentane(mg/l)· .•.. Hexane(mg/I)· ."'.. Heptane(mg/I)

••• ........ '... .....-...."'.....302510 15 20

Temps (heures)

5

O+----,----,------,------,------"I'~...-~

o

Figure 8: Cinétiques de dégradation du pentane, de l'hexane et de l'heptane au seind'un mélange des trois solvants - Consortium C, cycle 9 de dégradation.

Il ne semble pas qu'un des solvants soit consommé de façon préférentiel par rapport auxautres. Les trois cinétiques de dégradation sont globalement linéaires, et les trois solvants sontdégradés simultanément. Ceci pourrait permettre d'émettre l'hypothèse que les mêmesystèmes enzymatiques sont utilisés par les micro-organismes du consortium C, pour ladégradation du pentane, de l'hexane et de l'heptane. Il est aussi possible que même si lessystèmes enzymatiques sont différents, ils peuvent être activés de façon simultanée enprésence des trois composés.

26


La figure ci-dessous pennet de comparer les vitesses de dégradation de chaque solvant, isoléou au sein d'un mélange des trois solvants .

.._..7

.c...::§ 6---O'J

E----c 5o:;:;co-0~ 4O'J

'(1)-0

-2 3(1)cc~2oE(1)Cf)Cf)(1).....:> o

Pentane

• Sovant seul

• Solvant mélange

Hexane Heptane

Figure 9 : Vitesse moyennes de dégradation du pentane, de l'hexane et de l'heptaneisolés ou au sein d'un mélange des solvants, pour le consortium C.

On peut constater que pour le pentane et l'heptane les vitesses de dégradation sont plusélevées lorsque le solvant est isolé que lorsqu'il est en présence des deux autres solvants. Pourl'hexane les vitesses de dégradation sont similaires dans les deux cas. Néanmoins il estdifficile de conclure ici sur un éventuel phénomène de synergie ou d'inhibition, en effet lesétudes ont été effectuées en batch, sur de petits volumes, avec la nécessité de la prise encompte de la limitation en oxygène pour choisir les concentrations initiales des solvants.

Les concentrations initiales de chaque solvant ont été choisies en fonction de la quantitétotale d'oxygène présente initialement dans le système, en tenant compte de la stœchiométriedes réactions d'oxydation. Ces valeurs sont présentées dans le tableau ci-après.

27


Tableau 11: Valeurs de concentrations initiales utilisées pour l'étude de ladégradation des solvants isolés ou au sein d'un mélange

"Moyenne de l'ensemble des valeurs de concentratIOn InItlale de chaque sérIe de cycles de dégradation"valeur maximale de concentration initiale pour une série donnée de cycles de dégradation.

SolvantJ

Pentane Hexane Heptane.. Isolé Mélange Isolé Mélange Isolé Mélange

Concentrationinitiale

43,1 24,1 48,8 29,5 53,6 30,0moyenne"

(mg/Lair.h)Concentration

initiale65,4 30,2 71,4 41,1 77,4 34,0

maximaleb

(mg/Lair)..

Les valeurs de concentrations initiales sont nettement supérieures lors des expenenceseffectuées avec les solvants isolées, ce qui peut avoir une influence sur la valeur de la vitessede dégradation du solvant. En effet ces solvants étant très faiblement solubles dans l'eau,l'étape de transfert vers la phase aqueuse de ces composés est limitante dans le phénomène dedégradation. Cette étape est influencée par le gradient de concentration entre la phase gazeuseet la phase liquide, donc par la concentration initiale en solvant. Afin de limiter l'influence dece phénomène sur l'étude des cinétiques de dégradation, il faudrait dans le cas du mélangetravailler avec un volume de phase gazeuse plus élevé. Ceci permettrait de choisir desconcentrations initiales similaires à celles utilisées lors de l'étude des solvants isolés.

28


3.1.7. Résumé

La figure ci-après présente l'ensemble des valeurs de vitesses moyennes et maximalesobtenues pour chacun des consortia et chacun des solvants.

7

:2.~ 6ru---l

Ô>

55c.QCUTIru 4 -Œ

-0)TI

.;g 3 -0)cc0)

1)'2E0)Cf)

2 1:>

o

.Pentane

• Hexane

.Heptane

o Pentane (2émesérie de cycles)

Consortium A Consortium B Consortium C Consortium D

.Heptane

61 • Pentane

~)) .Hexane

ru---l

~6§ 0 Pentane (2éme série de.~ 5 lL-_c...;.y_c_le-,s)'-- _TIruŒ~.0)TI0)

Cii 3

E'xruE 20)Cf)Cf)

.~ 1>

Consortium A Consortium B Consortium C Consortium 0

Figure 10 : Vitesses moyennes et maximales de dégradation du pentane, de l'hexaneet de l'heptane pour chacun des consortia

On peut remarquer que globalement les consortia B et D ont présenté les valeurs de vitessemoyenne et maximale les plus élevées pour les solvants. Le consortium D a présenté lesvaleurs de vitesses maximales et moyennes les plus faibles.

29


Le tableau ci-dessous présente les consortia ayant présenté les valeurs de vitesses les plusélevées pour chaque solvant.

Tableau 12: Consortia ayant présenté les valeurs de vitesse de dégradation les plusélevées en fonction du solvant

~. Consortium ayant la vitesse Consortium llyant la vitesseSolvant moyenne de dégradation la"plus maximale de dégradation la plus

1 1 ~. ,- élevée élevéeConsortium A (première série de

Consortium A (première etcycles de dégradation)

PentaneConsortium C (deuxième série de deuxième série de c~cles de

cycles de dégradation)adégradation)

Hexane Consorti um B Consortium BHeptane Consortia B et ce Consortia B et Co

aLes différences de vitesse de dégradatIOn entre les consortla A et C sont de 29% pour la première séne decycles et de 28% pour la deuxième série de cycles

bLa valeur de vitesse maximale n'est pas disponible pour le consortium Ccvaleurs identiques à 3% près.dvaleurs identiques à 10% près.

En tennes de vitesses de dégradation, les consortia les plus perfonnants pour chaque solvantsont les mêmes si l'on considère la vitesse moyenne et la vitesse maximale. Dans le cas dupentane le consortium le plus perfonnant diffère si l'on considère la première ou la deuxièmesérie de cycles.

On peut penser que la vitesse maximale serait celle à prendre en compte pour l'extrapolationdes valeurs obtenues au sein d'un système de biofiltration car il s'agit d'un systèmefonctionnant en continu et ne présentant pas les problèmes de limitation en oxygène etnutriments rencontrés lors des études en microcosme.

Cependant pour le choix du consortium le mieux adapté à la dégradation d'un solvantconsidéré, ce critère n'est pas suffisant. Il faut en effet prendre en compte, outre la vitesse dedégradation, le temps d'adaptation nécessaire, le pourcentage de conversion en C02, et aussila vitesse spécifique de dégradation.

Ainsi le consortium C, présentant les meilleures vitesses moyennes de dégradation dupentane (lors de la deuxième série de cycles) et, avec le consortium B, les meilleures vitessesmoyenne et maximale de dégradation de l'heptane, a nécessité un temps d'adaptationbeaucoup plus long que les autres consortia.

En ce qui concerne les pourcentages de conversion, pour chacun des solvants les consortiaont présenté des taux de conversion similaires. Si l'on considère les solvants pris séparément,il semblerait que le taux de conversion en C02 du pentane soit supérieure à celui de l'hexaneet de l'heptane. Cependant cette valeur reste à corroborer.

Une mesure de la quantité de biomasse pourrait pennettre de calculer la vitesse spécifique dedégradation des solvants, exprimée en mglh.gbiomasse.

30

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie 1--------_.- ----

3.2. Identification microbienne

3.2.1. Résultats globaux

Le tableau ci-dessous présente l'ensemble des résultats obtenues lors des testsd'identification microbienne préliminaire.

Tableau 13 : Résultats des tests d'identification microbienne préliminaire....

. BactériesType-de '.

yram+ BaG:téries Gram - Champignonsmicro-

.. Morphologi . Test Mo~pholo Test fi lamenteuxorganisme Mobilité· Mobilité

. c;atala,se-

gie catalasee .. ."

4 bacilles + - : \ 4 bacilles - : 2Positifs

+ +(ciliature (ciliature

Consortium polaire) : 2 polaire) :1

A \+ +

.. (Ciliature (Ci liaturepéritriche) : périt riche)

, \ : \5 bacilles +:4 .. : \ 8 bacilles - -:5

+(ciliature

polaire) : 2+ +

Consorti!i)'n : (Ciliature (ciliature 4'B péritrich.e) : polaire) :\ 2

- : \ + +cil iature (ciliaturepolaire péritriche)

:\2 bacilles + + 4 bacilles +: \ +

(ciliature (ciliaturepolaire) : \ polaire)

Consortium+ - : 3 - : \

C(Ciliature \

péritriche) : +1 (cil iature

péritriche:3

3 bacilles +:2 -: \ 5 bacilles +:2 -

+ (ci liature

Consortium péritri che) :2

0 2- : \ + (ciliature .. : 3 +

" polaire) (ciliaturepéritriche)

Des bactéries et champignons filamenteux ont été isolés de tous les consortia, cependant ladiversité bactérienne est ici plus grande dans tous les cas. Le consortium B est celui qui a

31

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie 1--_..._-_..._-------------

présenté le plus grand nombre de micro-organismes différents. Le consortium C a présenté leplus petit nombre de micro-organismes en terme de variété.

3.2.2. Identification bactérienne préliminaire

Le tableau ci-dessous présente les critères morphologiques et biochimiques qui ont étéutilisés afin de procéder à une identification préliminaire des bactéries isolées de chacun desconsortia. Les genres et familles retenus ici sont uniquement des bactéries aérobies strictes ouaéro-anaérobies facultatives. Il s'agit des genres ou familles bactériennes rencontrées les plusfréquemment en fonction des caractères utilisés, cependant la liste peut ne pas être exhaustive.

Tableau 14 : Identiiication préliminaire des bactéries en fonction des caractèresbiochimiques et morphologiques pris en compte lors de l'étude

Caractères morp)J,q)ogiQues et biochimiques ~ PréidentificationBacille Gram- Catalase- Entérobactérie'

AIcaliJ!enesBacille Gram- CataJase+ Mobile (ciliature polaire) Pseudomonas, Burkholderia, Aeromonas

Mobile (ciliatureEntérobactérie

péritriche)Immobile Entérobactérie, Acinelobacler

Bacille Gram+ Catalase- LaclobacillusBacille Gram+ Catalase+ Bacillusb

Actinomycète (Nocardia, Rhodococcus, Gordonia)C

a test rarement négatif pour la catalasebbacilles larges, à extrémités carréesCbactéries pouvant se présenter sous forme de longs filaments ou de bacilles courts

Le tableau ci-après présente les résultats de l'identification préliminaire des bactéries isoléesde chacun des consortia.

Tableau 15: Identiiication préliminaire des bactéries isolées des quatre consortiamicrobiens

Nombre de bactéries Nombre de bactéries Nombre de bact~ries Nombre de bactériesType bactérien de ce type isolées d~ de ce type isolées du de ce type isolées du de ce type isolées du

consortium A consortium B consortil,lm C consortium DEntérobactérie ou

2 3A Ica ligenes - -

Entérobactérie . 1 . -Pseudomonas,

Burkholderia ou 2 2 1 -

AeromonasEntérobactérie ou

2 5 2Acinetobacler

-

Bacillus ou4 4 2 1

actinomycèteLactobacillus . 1 1 2

On retrouve ici des genres bactériens fréquemment cités lors des études de biodégradationdes alcanes, tels que des bactéries de type Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes, Bacil/usou encore des bactéries de type actinomycète. Cependant l'identification est à corroborer, avecd'autres tests biochimiques tels que le test oxydase ou l'étude du métabolisme respiratoire et

32


fennentaire. L'utilisation de galeries de tests biochimiques permettrait de préciserl'identification bactérienne. Une étude génétique des ARN ribosomiaux, permettrait elle ausside préciser l'identification.

4. Conclusion et perspectives

Les travaux effectués ici ont permis l'étude des cinétiques de dégradation du pentane, del'hexane et de l'heptane par quatre consortia microbiens, ainsi que l'isolement et unepréidentification des bactéries et champignons filamenteux de chacun des consortia. Cetteétude a permis le choix des consortia les mieux adaptés à la dégradation de chacun dessolvants. Ce choix s'est effectué en prenant en compte les vitesses moyennes et maximales dedégradation des solvants, le pourcentage de conversion en CO2 du solvant, et le tempsd'adaptation nécessaire à la dégradation du solvant. Des mesures de biomasse pourraientpennettre de compléter ces critères en prenant en compte les vitesses spécifiques dedégradation des solvants.

Il a été remarqué lors d'études précédentes que de façon générale les valeurs de vitesses dedégradations obtenues en microcosmes sont inférieures à celles obtenues au sein d'unbiofiltre. Ceci est probablement dû au fait que le microcosme est un système fermé, au seinduquel le milieu de culture et l'oxygène ne peuvent être régulièrement renouvelés. De plus lasurface de contact entre les phases gazeuses et liquides est faible, ce qui augmente lesproblèmes de diffusion du substrat gazeux vers la phase aqueuse. Pourtant les vitesses dedégradation observées ici sont relativement élevées, on peut donc espérer obtenir de bonsrésultats de dégradation en colonne de biofiltration.

Les résultats obtenus semblent montrer qu'il n'y a pas d'influence de la durée du temps dediète entre deux cycles de dégradation, sur la vitesse de dégradation des solvants. Ce résultatsest important en biofiltration, en effet il est possible que l'alimentation en polluant ne soit pascontinu au sein d'un système de biofiltration

L'étude microbiologique effectuée ici a permis de mettre en évidence la diversitémicrobienne de chacun des consortia. Les observations macroscopiques et microscopiques,ainsi que les tests biochimiques réalisés, ont abouti à une identification préliminaire des typesbactériens présents dans chacun des consortia. Les types bactériens retrouvés ici font partie demanière générale de ceux cités le plus fréquemment dans les études de biodégradation desalcanes.

Il s'agit ici de consortia de bactéries et de champignons filamenteux, il serait intéressantd'étudier l'apport de chacun de ces types de micro-organismes sur la dégradation des solvants.En effet les solvants étudiés ici sont très hydrophobes, donc peu solubles dans l'eau. Ils sontdonc de ce fait difficiles à dégrader par des bactéries. Cependant les champignons filamenteuxsont capables de former des hyphes hydrophobes, qui pourraient donc potentiellementaugmenter l'affinité du micro-organisme pour le solvant. L'inconvénient des champignonsfilamenteux est que leur vitesse de croissance est beaucoup plus faible que celle des bactéries,d'où la difficulté à produire de la biomasse en grande quantité afin d'inoculer un biofiltre àgrande échelle.

On peut ainsi émettre l'hypothèse d'une synergie entre ces deux types de micro-organismeslors de la dégradation des solvants étudiés ici, que ce soit en terme de facilité de transfert et detransport des polluants, mais aussi d'un point de vue métabolique. Il serait donc intéressant de

33

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie 1..............................................................................................................................

pouvoir étudier les cinétiques de dégradation de chacun des deux types de micro-organismesisolément.

34


PARTIE II:B ' d'" d' t' d: l'''h'lo'egra; ,a Ion ::e " ,exane par

Fus,arium spp, - As:pectsenzymatiques

35


1. Introduction - Objectifs

Les champignons filamenteux du genre Fusarium appartiennent au groupe desdeutéromycètes. Ce genre regroupe une vingtaine d'espèces que l'on retrouve chez les plantes(dont il est un pathogène) et dans les sols. Morphologiquement le mycelium sont cloisonnés.La plupart des espèces se caractérisent par la production de chlamydiospores de formesparticulières.

Des espèces du genre Fusarium ont été reportés comme étant capable de dégrader desalcanes. Ainsi une souche isolée de sols contaminés par des hydrocarbures a été capable dedégrader des alcanes de 10 à 40 atomes de carbones, mais aussi certains hydrocarburesaromatiques tels que le benzène

Le métabolisme aérobie des alcanes par les champignons filamenteux est moins connu quecelui des bactéries. Néanmoins ces deux types de métabolisme paraissent similaires et feraientintervenir les mêmes types d'enzymes, principalement des oxygénases et desdéshydrogénases. Dans le cas de Fusarium un cytrochrome P450 a été caractérisé, chez unesouche de Fusarium oxysporum (Kitazume et al, 2000). Ce cytochrome serait impliqué dansl'oxydation des acides gras isssus du métabolisme des alcanes.

Ici les travaux ont consisté en l'étude des premières enzymes intervenant dans la dégradationde l'hexane par une souche de Fusarium, en posant l'hypothèse que la voie de dégradation estla suivante chez ce champignon:

Alcane mono(ou di)oxygénase

Figure 1: Premières étapes de la voie hypothétique de dégradation des alcanes pasFusarium spp., et enzymes impliquées

D'après cette hypothèse la voie de dégradation de l'hexane par Fusarium serait du mêmetype que celle généralement rencontrée chez les bactéries: l'alcane serait séquentiellementoxydé en alcool, aldéhyde puis acide carboxylique, avant d'entrer dans le cycle de la poxydation. Cette oxydation séquentielle ferait successivement intervenir une alcool mono(oudi)oxygénase, une aldéhyde déshydrogénase puis une aldéhyde mono(ou di)oxygénase lorsdes premières étapes de la dégradation.

36


L'objectif de l'étude menée ici a été d'évaluer les capacités de dégradation de l'hexane parune souche de Fusarium, puis d'extraire et d'étudier l'activité des enzymes impliquées dans lespremières étapes de dégradation de l'hexane.

2. Matériel et méthode

2.1. Souche utilisée

La souche utilisée ici est un Fusarium spp., adapté à la dégradation de l'hexane lors detravaux précédents. Cette souche était alors capable de dégrader l'hexane a une vitesse de0,5mg/Lair.h.

2.2. Production de biomasse

La production de biomasse a été effectuée au sein de bouteilles sérologiques de un à deuxlitres, fermées par des valvules mininert permettant d'effectuer des prélèvements de la phasegazeuse. Le volume de milieu de culture était de 200mL pour les bouteilles de un litre et de400mL pour les bouteilles de deux litres.

La composition du milieu de culture est présenté dans le tableau suivant:

Tableau 1 : Composition du milieu minéral utilisé pour la production de biomasse

Composé Concentration (mg/L). ';~'

.' , .' l' "

NaNO) 18KH2P04 1,3

MgS04,7H2O 0,38

CaS04,2H2O 0,25

CaCh 0,055FeS04,7H2O 0,015MnS04, H20 0,012ZnS04,7H2O 0,013

CuS04,7H2O 0,0023

CoCl 2,6H2O 0,0015H)Bo) 0,0015

pH 4,0

Afin de favoriser la croissance de la souche, 0,01 % (pN) d'extrait de malt a été rajouté aumilieu minéral. L'extrait de malt est particulièrement adapté à la croissance des levures etchampignons filamenteux du fait du taux important de glucides qu'il contient.

L'inoculation s'est faite en utilisant la souche de Fusarium spp. conservée sur milieu solide.Le milieu utilisé pour la conservation était le milieu minéral précédemment décrit,addidtionné de 15gIL d'agar et de 0,01% (pN) d'extrait de malt.

La croissance microbienne s'est faite en présence d'hexane, introduit à une concentration de15 à 20mg/Lair.

37


Un contrôle a été effectué en faisant croître la souche sur milieu minéral additionné de0,01 % (pN) d'extrait de malt, sans hexane. Une mesure de l'activité hexane oxygénase a étéeffectuée sur ce contrôle.

2.3. Cinétiques de dégradation de l'hexane par Fusarium spp.

Les cinétiques de dégradation de l'hexane par Fusarium sp. ont été étudiées, en effectuantune mesure des concentrations initiales et résiduelles d'hexane par CPGIFID, à intervalles detemps réguliers. Dans le même temps, une mesure quantités d'02 consommé et de C02 produita été effectuée. La vitesse maximale de dégradation a été mesurée en utilisant le modèle deGompertz.

2.4. Extraction enzymatique

L'extraction enzymatique s'est faite en congelant le mycelium avec de l'azote liquide avantde le broyer à l'aide d'un mortier. Le broyât a par la suite été placé dans un tampon decomposition suivante:

Tableau 2 : Composition des tampons utilisés pour les extractions enzymatiques

Composition du tampon Utilisation de l'extrait enzymatique,., Mesure de l'activité oxygénase . Mesure de l'activité déshydrogénase

Tampon Phosphate O,OSM - pH 7,0 Tris-HCI 0, lM - pH 7,SDithioerytrol 0,04M 0,4M

Inhibiteurs de protéases O,OSmUg de biomasse O,OSmUg de biomasse

La quantité de tampon ajoutée a été calculée afin d'obtenir un rapport 1: 1 (volume/poids)entre le tampon et la biomasse.

Le mélange tampon/biomasse a été centrifugé 20 minutes à 10 OOOrpm, à une température de4°C.

Le surnageant de centrifugation a été récupéré puis congelé à une température de -20°Cjusqu'aux mesures d'activités enzymatiques.

2.5. Mesure de l'activité oxygénase

L'activité oxygénase a été déterminée en mesurant l'évolution de la quantité d'oxygènedissous du mélange réactionnel de composition suivante:

,.t'L':' ,)- Volu'ne.(uL)1-Composé Mesure de l'activité hexane Mesure de J'activité hexanaI,

oxygénase oxygénaseExtrait enzymatique ISO 10O

SubstratTampon phosphate saturé en hexane Hexanal

SO 6Tampon phosphate additionné de 1300

MgCI/Volume total ISOO

ale chlorure de magnésIum est un constItuant de l'oxygénase, nécessaIre à son actiVité.

38


Le suivi de l'évolution de l'oxygène dissous s'est faite à l'aide d'une sonde à oxygène. Leschéma du montage réactionnel est présenté ci-après.

Entrée d'eau

Sortie d'eau

-"'\"':,......._--------_....-'V"

Traitementinformatique des

données

Chambre réactionnelle enverre à température réguléegrâce à un bain thermostaté

Mélange réactionnel

Sonde à oxygène

Figure 2 : Schéma de l'appareillage utilisé pour la mesure de l'activité oxygénase

L'activité oxygénase a été exprimée en nmol d'oxygène consommé par minute.

Un contrôle a été effectué en suivant la disparition de l'oxygène dissous dans le même milieuréactionnel, sans extrait enzymatique. Un second contrôle a été effectué en suivant ladisparition de l'oxygène dissous dans le même milieu réactionnel sans substrat.

2.6. Mesure de l'activité déshydrogénase

Les déshydrogénases sont des enzymes nécessitant un cofacteur de type NAD, dont laréduction sous la fonne NADH, H+ se fait en parallèle de l'oxydation du substrat. Lefonctionnement de ces enzymes est schématisé ci-dessous:

NAD NADH, H+

Figure 3 : Principe de fonctionnement des alcool déshydrogénases

39


Il est donc possible de mesurer l'activité déshydrogénase en suivant l'apparition de la formeréduite du cofacteur par spectrophotométrie, présentant un maximum d'absorption à 340nm.

Le suivi de cette mesure s'est effectué en utilisant le mélange réactionnel suivant:

Tableau 3: Mélange réactionnel utilisé pour les mesures d'activité déshydrogénase

Composé ..;~;, ;; r:.;4 , .-,,/Volume (uL) .u' C' L

Extrait enzymatique 600Tampon Tris-HCI 2400Substrat (hexanol) 4

Volume total 3000

Les mesures se sont effectuées à une température constante de 30°C, contrôlée grâce à unbain thennostaté.

L'activité enzymatique était exprimée en nmoINADH,H+ formé/min. La concentration encofacteur était calculée en utilisant la loi de Beer-Lambert, selon l'équation suivante:

CNADH,H+ = A/EL

Où CNADH,H+ est la concentration en NADH,H+A est la valeur d'absorbance mesurée.e est la valeur du coefficient d'extinction molaire du NADH,W (égale à 6220 LlmoLcm).L est la valeur de longueur de la cuve de spectrophotométrie utilisée, ici égale à lcm.

Un contrôle a été effectué en suivant la production de la forme réduite du cofacteur dans lemême milieu réactionnel, sans substrat.

2.7. Mesure de la quantité de protéines

Afin de pouvoir mesurée l'activité spécifique des enzymes étudiées, une mesure de laquantité de protéines présentes dans les extraits enzymatiques en utilisant la méthode deBradford.

Les activités spécifiques ont été exprimées en nmol02 consommé/min.mg protéines dans le casdes oxygénases, et en nrnoINADH,H+ produit/min.mg protéines dans le cas des déshydrogénases.

40


3. Résultats et discussion

3.1. Cinétique de dégradation de l'hexane par Fusanum spp.

La figure ci-dessous présente la cinétique de dégradation de l'hexane par la souche étudiée.

18

8

10

12

L:" 16

in.s u(llC

~(ll

.cC(ll

C·o.~

ë(ll

uCoo

o so 100 150 200 250 300

Temps (heures)

Figure 4 : Cinétique de dégradation de l'hexane par Fusarium spp.

Les vitesses de dégradation maximales calculées ont été en moyenne de 0,16mghexane/Lair.h.Cette valeur est plus faible que celles obtenues précédemment pour la même souche,puisqu'alors la vitesse de dégradation maximale obtenue était de 0,5 mghexane/Lair.h. Cecipourrait être dû au passage de la souche sur milieu riche, en effet pour favoriser sa croissancela souche a été mise en présence d'extrait de malt, ce qui a pu provoquer une inhibition de lavoie métabolique de dégradation de l'hexane. La voie métabolique généralement empruntéepar un micro-organisme pour sa croissance est celle consommant le moins d'énergie, etl'extrait de malt est un substrat plus facilement biodégradable que l'hexane.

41

Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Partie 2-'- ...._------------ ---------_.. -- ...__. "- -- ----

3.2. Mesure des activités oxygénases

La figure ci-dessous présente la cinétique de consommation de l'oxygène dissous dans le casde la mesure de l'activité hexane oxygénase.

6

::J0

0

(J,5 0

.sVI:J0

.~ 4"00)C

.0)

~30c0)

g 2.,~ëfi 1c0ü

aa 2

o o

3

oo 0

4 5

Temps (minutes)

Figure 5: Evolution de la quantité d'oxygène dissous lors de la mesure de l'activitéhexane oxygénase

Les résultats obtenus ont pennis de calculer les activités oxygénases suivantes:

Tableau 4 : Activités oxygénases obtenues

'F,~ Concentration en protéines Activité totale .i'

Activité totaieActivité mesurée

(nmol02 consonimé/min)des extraits enzymatiques (11Jl10! O2

• (mg/L) consommé/min.mgprotéines)Hexane oxy,génase 0,020 31,8 4,13Hexanaloxy,génase 0,005 31,8 1,57

Contrôle sans extrait n.d" 31,8 n.d.enzymatique

Contrôle sans substrat n.d. 31,8 n.d.

"n.d. : non détectée

L'activité spécifique de l'hexane oxygénase est plus de deux fois supérieure à celle obtenueavec l'hexanal oxygénase. Ceci peut être dû à une plus grande affinité de l'hexanemonooxygénase pour son substrat. Il n'est pas possible de dire ici si la même monooxygénaseest impliquée dans l'oxydation de l'hexane et de l'hexanal, ou s'il sagit de deux enzymesdifférentes. Il pourrait être intéressant de tenter de séparer sur gel ces deux enzymespotentielles, en utilisant leurs substrats spécifiques, en fonction de leur poids moléculaire.

Afin de caractériser plus en avant ces enzymes,. Ceci pennettrait d'évaluer la vitessemaximale (Vmax) et la constante de Michaelis-Menten (Km), qui caractérise l'affinité d'uneenzyme pour son substrat. Plus la valeur de Km est élevée, moins l'affinité de l'enzyme pourson substrat est forte.

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Les paramètres Km et Vmax sont réliés par l'équation de Michaelis-Menten:

Vmax Vmax [S]=-----2 KM + [S]

Ils peuvent être déterminés expérimentalement en mesurant l'activité oxygénase àdifférentes concentrations en substrat.

Les courbes obtenues sont du type de celle présentée ci-dessous:

Vmax.......•..•••...•.~.~.~..~.~.~..~.~......~.........---

Km Concentration en substrat

Figure 6 : Influence de la concentration en substrat sur la vitesse initiale des réactionsenzymatiques

L'étude de l'activité enzymatique d'est effectuée ici à une température de 300 e et à pH 7,0.La mesure de l'activité enzymatique à différentes températures et valeurs de pH pourrait aussipermettre de déterminer les conditions optimales d'activité des enzymes.

Il n'a pas été possible ici de savoir si les enzymes impliquées étaient des monooxygénases oudes dioxygénases. Pour cela il faudrait effectuer une étude de l'activité enzymatique enconditions saturantes en substrat, a une concentration en substrat connue, de façon a ce que lesenzymes soient saturés et qu'une étude de la stœchiométrie de la réaction enzymatique puisseêtre faite.

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3.3. Mesure de l'activité hexanol déshydrogénase

La figure ci-dessous présente la cinétique d'apparition de la forme réduite du NAD, lors desmesures d'activité déshydrogénase effectuées.

0,35

0

0,3 00

00

0E 0,25 0

0<::0

0 0~ 0,2 0

"" 0

11l 0U

0<::2J 0,15 0

6 0

/J) 0

~ 00,1 0

00

0,05

°0 2 4 6 8 10 12

Temps (minutes)

Figure 7: Cinétique d'apparition de la forme réduite du cofacteur NAD lors de lamesure de l'activité hexanol déshydrogénase

Les valeurs d'activité enzymatique obtenues sont présentées dans le tableau suivant:

Tableau 5 : Valeurs d'activité hexanol déshydrogénase obtenues

Activité hexanol déShydrogénase Concentration en protéines de Activité hexanol déshydrogénase(nmol NADH,H+ prodl'itlmin) l'extrait (mg/L) spécifique (nmol NADH,H+

1 produitJmin.mgprotéii1es) .3,30 27,5 16,01

Dans le contrôle sans extrait enzymatique aucune activité déshydrogénase n'a été détectée.

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Le tableau suivant présente les valeurs d'activité alcool déshydrogénase reportées pardifférentes études.

Tableau 6 : Activités alcool déshydrogénase reportées pour différents microorganismes

."- Activité spécifique:!

Type de micro-organisme Espèce Substrat de Jienzyme (fJmoINADH,H-t'" Droduil/min.mgprotéines)

BactériesRhodococcus erythropolis 2-octanol 227"Pseudomonas mahoplilia 2-propanol 20"

LevuresPichia stipitis ethanol 3,7b

Candida boidinii 2-propanol 230"Phanerochaete éthanol

13000 à 17000'Champignons filamenteux chrysoslJorium

Fusarium spp hexanol 16010ad'après Ludwig B. et al., 1995bd'après Cho J. et al., 1999'd'après Keneary et aL, 2004

Les activités alcool déshydrogénases des bactéries et levures sont nettement inférieures àcelles reportées pour les champignons filamenteux pour les études citées. Ceci peut être dû àune meilleure affinité des enzymes de champignons filamenteux pour leur substrat.

De même ici il serait intéressant d'évaluer la vitesse maximale et la constante de MichaelisMenten de l'enzyme, ainsi que les conditions optimales de son activité.

3.4. Activité enzymatique du contrôle

L'activité hexane oxygénase après croissance sur milieu minéral et extrait de malt seuls a étémesurée. Aucune activité oxygénase n'a été détectée. Ceci signifierait que malgré le fait quecette souche ait montré préalablement des capacités à dégrader l'hexane, le transfert sur milieuriche lui a fait perdre ses capacités de dégradation du solvant.

Il serait ainsi possible que l'hexane oxygénase, et certainement l'ensemble des enzymesimpliqués dans le métabolisme de l'hexane, fasse partie d'un système inductible.

C'est ainsi le cas de Pseudomonas putida, chez lequel les enzymes impliquées dans ladégradation des alkanes sont codées par des gènes situés sur un plasmide. Ces gènes sontstructurés en un opéron, et leur expression est induite par les différents alcanes pelTIlettant lacroissance de la bactérie. En présence de glucose seul, aucune activité enzymatique associée àla dégradation des alcanes n'est observée (Grung A. et al., 1975).

Afin de pelTIlettre une meilleure connaissance du métabolisme de l'hexane pour cette souchede Fusarium, il serait possible d'étudier les inducteurs du système enzymatique responsablede la dégradation de l'hexane. Ces inducteurs peuvent être d'autres alcanes mais aussi lesintelTIlédiaires métaboliques de la voie de dégradation de l'hexane, tels que l'hexanol,l'hexanal ou encore l'acide hexanoïque. La mesure des différentes activités enzymatiquesassociées à la dégradation de l'hexane, après croissance de la souche sur ces différentscomposés, pourrait pelTIlettre de dételTIliner quelles sont les molécules inductrices dusystème.

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3.5. Concentration en protéines des différents extraitsenzymatiques

Le tableau suivant présente les valeurs de concentrations en protéines des différents extraitsenzymatiques étudiés.

Tableau 7 : Concentration en protéine des extraits enzymatiques utilisés

Nom de l'e?,trait i :/i ·LU ~ Vitesse de dégradation 1

.enzymatique '. maximale de l'hexàne,,Concentration

Volume totalUtilisation

obtenue avec la biomasseen protéines

du milieu de.. (mghexane consommé/Lair.h) culture

El Mesure des activitéshexane et hexanal 0,180 31,8 400mL

oxygénaseE2 Mesure de J'activité

0,146 27,5 400mLhexanoldéshydrogénase

E3 Contrôle - 859,3 100mL

La concentration en protéines des extraits enzymatiques issues de la biomasse placée enprésence de milieu minéral, extrait de malt et hexane (extraits El et E2) a été beaucoup plusfaible que celle issue du contrôle sans hexane, et ceci malgré le fait que les volumes desmilieux de culture aient été quatre fois supérieures pour les extrais El et E2.

La mesure de la concentration en protéines est une mesure indirecte de la biomasse. Cecisignifierait donc que la biomasse produite est beaucoup plus faible en présence d'hexane quesur extrait de malt seul. La croissance des micro-organismes en présence de solvant seraitdonc plus difficile. Une étude a montré que chez Pseudomonas putida la croissance surglucose était affectée par la présence de différents solvants tels que le toluène, l'hexadecaneou encore l'hexane (lsken S. et aL, 1999). Le rendement de production de biomasse était alorsréduit de près de 50%. Ceci pourrait être dû au fait que les solvants affectent la perméabilitémembranaire et l'affinité de la souche pour le glucose.

4. Conclusion et perspectives

L'étude préliminaire du métabolisme de l'hexane par Fusarium spp. a été effectuée ici, àtravers la mesure des activités enzymatiques associées à la dégradation aérobie des alcanes.

Des activités hexane et hexanal oxygénase, ainsi que hexanol déshydrogénase, ont étémesurées. Ces enzymes interviendraient donc dans les premières étapes de la dégradation del'hexane par Fusarium spp. II serait intéressant de caractériser ces enzymes, à travers ladétermination de paramètres tels que la vitesse maximale et la constante de MichaeIisMenten, les conditions optimales d'activité de ces enzymes, ainsi que les molécules surlesquelles ces enzymes sont actives.

Afin de produire de la biomasse en quantité suffisante pour la mesure des activitésenzymatiques, il a été nécessaire d'additionner à un milieu minéral de base de l'extrait de malt,

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ce qui a affecté les capacités de dégradation de l'hexane par la souche. La mesure de l'activitéenzymatique de la biomasse produite en absence d'hexane a permis de mettre en évidence lefait que le système enzymatique impliqué dans la dégradation de l'hexane est inductible chezFusarium spp. Il serait intéressant de déterminer quelles sont les molécules pouvant induire cesystème enzymatiques, parmi les alcanes ou encore les intermédiaires métabolique de la voiede dégradation de l'hexane.

Le fait que la biomasse puisse perde son activité lors d'un transfert sur milieu riche est unedonnée important en biofiltration. En effet l'inoculation de systèmes de biofiltration nécessiteune production de biomasse en grandes quantités, et dans le cas présent l'utilisation d'extraitde malt en tant que substrat de croissance a permis une croissance importante de la souche deFusarium utilisée. Mais il est important de noter que pour le montage d'un système debiofiltration pour lequel on utiliserait cette souche, une période d'adaptation à l'hexane seraitnécessaire avant de pouvoir inoculer le biofiltre.

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Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Conclusion

CONCLUSION GENERALE

L'ensemble des travaux menés ici ont pennis dans un premier temps d'étudier les capacitésde dégradation du pentane, de l'hexane et de l'heptane par quatre consortia microbiens, etd'effectuer une identification préliminaire des souches isolées de chacun des consortia. Il estapparu que tous les consortia se sont avérés capables de dégrader les trois solvants à des tauxrelativement élevés, mais ont présenté des temps d'adaptation à leur dégradation plus oumoins long en fonction du consortium considéré et du solvant considéré . L'étude descapacités de dégradation d'un mélange des trois solvants par trois de ces consortia a pennis demontrer que les trois solvants étaient dégradés de façon simultanée selon des cinétiquesglobalement linéaires. Ceci a pu permettre d'émettre l'hypothèse que le même systèmeenzymatique pourrait être impliqué dans la dégradation des trois solvants, ou, s'il s'agit desystèmes enzymatiques différents, qu'ils peuvent être activés de manière simultanée.

Des bactéries et champignons filamenteux ont été isolés de chacun des consortia. Ladiversité bactérienne s'est révélée plus importante dans tous les cas. Les bactéries isoléesfaisaient partie des genres bactériens généralement citées dans les études de dégradation desalcanes, tels que Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, ou des bactéries de typeActynomycète telles que celles du genre Rhodococcus.

Dans un deuxième temps la dégradation de l'hexane par Fusarium spp. a été étudié d'unpoint de vue cinétique et enzymatique.

Les extraits enzymatiques testés ont présenté une activité hexane et hexanal mono (ou di) oxygénases, et une activité hexanol déshydrogénase. La voie de dégradation de l'hexane parFusarium spp. serait donc similaire a celle décrite chez les bactéries, du moins dans sespremières étapes: il s'agirait d'une oxydation séquentielle produisant l'alcool, l'aldéhyde puisl'acide carboxilique dérivés de l'hexane, et faisant intervenir respectivement une mono(oudi)oxygénase, une déshydrogénase, puis une mono(ou di)-oxygénase.

La croissance de la souche sur milieu riche, constitué d'extrait de malt, en présence d'hexane,a provoqué une diminution de ses capacités de dégradation. Un contrôle, c'est-à-dire de labiomasse produite uniquement en présence d'extrait de malt, a été étudié. Aucune activitéhexane oxygénase n'a été détectée. Ceci signifierait que le système enzymatique impliquédans la dégradation de l'hexane chez cette souche serait inductible, et que la souche pourraitdonc perdre ses capacités de dégradation lors de transferts sur d'autres substrats de croissance.

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Biodégradation d'alcanes à chaîne courte - Références bibliographiques

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biodégradation d'alcanes à chaîne courte par des consortia

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