biochimie appliquée
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Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA. Biochimie appliquée. II- Biochimie des substances d’origine animale (2) . Préparé par: Mr. HALLA Noureddine. Culture de cellules animales (eucaryotes): Le cycle cellulaire et les moyens d'études. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Biochimie appliquée
Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA
Préparé par:
Mr. HALLA Noureddine
II- Biochimie des substances d’origine animale (2)
Culture de cellules animales (eucaryotes):
Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
qui apporte les nutriments
essentiels à la survie et à la croissance.
Culture de cellules animales
le prélèvement de cellules, tissus ou
organes d'un animal ou d'une
plante
leur placement ultérieur dans
un environnement
artificiel récipients de cultures appropriés
contenant un milieu liquide ou
semisolide
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
Différentes sources
Insectes
Poissons
Mammifères
Humains
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
Différents types
Épithéliales/endothéliales (membranes)
Fibroblastes (tissus connectifs)
Myoblastes (muscles)
Neurones (syst. nerveux)
Hépatocytes (foie)
Erythrocytes (sang)
Lymphocytes (syst. immunitaire)
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
Différents types
• Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC).
• Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié.
Durée de vie limitée (30-50 divisions).
• Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
Différents types
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
Evolution des cellules en culture
Courbe de croissance d'une population cellulaire
A partir du premier repiquage on parle de
lignée cellulaire
les cellules viables se fixent sur le support alors que les
mortes restent dans le milieu de culture
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
Evolution des cellules en culture
Longévité d'une culture cellulaire On rencontre 2 cas :
- Cultures normales ou définies : les cellules ne se multiplient que pendant un
nombre limité de générations (30 à 50 repiquages) puis
meurent : leur vie et leur mort est programmée.
On observe alors une diminution de leur vitesse de
prolifération, phase de sénescence.
- Culture continue ou lignées transformées ou immortelles. La
vitesse de multiplication ne diminue pas, ce qui permet un nombre de repiquage indéfini.
Ces cellules adhérentes perdent leur besoin d'ancrage et peuvent
être cultivées en suspension.
1 2
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
Cellules transformées
Naturelles ChimiquesVirales
immortalisées spontanément in
vitro
- mutées pour des gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire (comme
par exemple la protéine p53).
transformées artificiellement par un virus oncogène (c.à.d. un gène immortalisant tel que T de SV40)
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
Différentes lignées
MRC5, W138 HeLa CHO Vero Sf9 293
secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes,
vaccins
cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche
ovaire de hamster chinois, stable,
adhérente/suspension, versatile
reins de singe verts africains, stable,
adhérente, versatileSpodoptera frugiperda,
stable, système d’expression baculovirus
embryon de rein humain, transformée
par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus,
adaptée à la suspension (293S)
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
Caractéristiques générales
Capable d’exocytoseNe sécrète pas d’enzymes
Modifications post-traductionnellesIntrons/épissage (splicing)
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
À quoi servent les cultures de cellules?
Systèmes de modèles pour étudier :
1
2
3
4
5
La biologie et la biochimie cellulaires de base,
les interactions entre les cellules et les agents induisant
des maladies, les effets des médicaments sur
les cellules, Le processus et le déclenchement du
vieillissementles études nutritionnelles.
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
À quoi servent les cultures de cellules?
Systèmes de modèles
Tests de toxicité pour étudier les effets de nouveaux médicaments,
cosmétiques et produits chimiques sur la survie et la croissance d'une
grande variété de types de cellules.
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
À quoi servent les cultures de cellules?
Systèmes de modèles
Tests de toxicité
Recherche sur le cancerLes cellules normales et les cellules cancéreuses pouvant toutes deux
être cultivées. De plus, il est possible, en utilisant
des produits chimiques, virus et rayonnements, de convertir les cellules cultivées normales en
cellules cancéreuses.
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
À quoi servent les cultures de cellules?
Systèmes de modèles
Tests de toxicité
Recherche sur le cancer
Virologie
- la réplication de virus dans les cultures cellulaires (à la place des animaux) pour les utiliser
dans la production de vaccins. - en détection clinique et
isolement de virus, - en recherche fondamentale
pour étudier comment ils se développent et infectent les
organismes.
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
À quoi servent les cultures de cellules?
Systèmes de modèles
Tests de toxicité
Recherche sur le cancer
VirologieLa cellule comme usine de
production
trois domaines se sont montrés plus intéressants:
la production à grande échelle de virus pour une utilisation en production de vaccins.
la production à grande échelle de cellules génétiquement
modifiées pour produire des protéines présentant une valeur médicale ou commerciale. (les
anticorps monoclonaux, l'insuline, les hormones, etc.)
l'utilisation de cellules en remplacement de tissus et
d'organes.
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
À quoi servent les cultures de cellules?
Systèmes de modèles
Tests de toxicité
Recherche sur le cancer
VirologieLa cellule comme usine de
productionConseil génétique
un outil important pour le diagnostic précoce d'affections
embryonnaires
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
À quoi servent les cultures de cellules?
Systèmes de modèles
Tests de toxicité
Recherche sur le cancer
VirologieLa cellule comme usine de
productionConseil génétique
Génie génétiqueLa capacité de reprogrammer les cellules
en culture par du nouveau matériel génétique (ADN et gènes) pour étudier les effets cellulaires de l'expression de
ces gènes (nouvelles protéines).
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
À quoi servent les cultures de cellules?
Systèmes de modèles
Tests de toxicité
Recherche sur le cancer
VirologieLa cellule comme usine de
productionConseil génétique
Génie génétique
Thérapie géniqueLes cellules sont cultivées un moment puis réimplantées
dans le patient.
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction
À quoi servent les cultures de cellules?
Systèmes de modèles
Tests de toxicité
Recherche sur le cancer
VirologieLa cellule comme usine de
productionConseil génétique
Génie génétique
Thérapie génique
Découverte de médicaments
Définition
Le cycle cellulaire est l'ensemble des phases par lesquelles une cellule passe
entre deux divisions successives.
Définition
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
La division cellulaire est le processus fondamental par lequel
une cellule-mère donne deux cellules-filles identiques
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Interphase la mitose
Les phases du cycle de division cellulaire
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les kinases cycline-dépendantes
Entre 1990 et 2000, une douzaine de Cycline / Cdk sont décrites chez l’homme.
Six d’entre elles interviennent dans le contrôle direct du déroulement du cycle cellulaire.
Les Cdk sont des sérine-thréonine kinases
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les kinases cycline-dépendantes
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1G1
S
G2
M
P P
Les facteurs mitogènes
tyrosine kinases ou encore couplés à des protéines G.
cascades
la stimulation de la transcription de gènes essentiels pour l’entrée en division (en particulier cyclines D,
CDKs).
P
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1G1
S
G2
M
Plusieurs facteurs
Les cellules sont maintenues en G1
Protéines de la famille du
rétinoblastome, pRb, p107 et p130
La famille E2F
Transcription
P
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1G1
S
G2
M
Cycline E/ Cdk 2 Cycline D / Cdk 4Cycline D / Cdk 6
Progression G1
Protéines de la famille du
rétinoblastome, pRb, p107 et p130
La famille E2F
Transcription de l’ADN
P
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1G1
S
G2
M
La fin de G1 – préparation à la transition G1/S
La famille E2F
assemblage d’un complexe préréplicatif
(pre-RC)
ORC (Origin Recognition
Complex )
cdt1cdc6
ATPase facteur de transcriptio
n
recrute accrochage
complexe MCM 2-7
(mini-chromosome
maintenance )
cdc45
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1G1
S
G2
M
La transition G1/S
ORC
MCM 2-7
Plusieurs protéines et complexes protéiques doivent s’associer aux complexes pré-réplicatifs afin que la synthèse d’ADN puisse
commencer
MCM10
Cycline E/ Cdk 2
cdc7
DNA topoisomerases
DNA polymerase
DNA helicase
Activation
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1
S
G2
M
S
G1
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1
S
G2
M
G2
S
La phase G2 est souvent présentée comme une phase « de préparation » à la mitose. Elle est marquée par le début de la
condensation des chromosomes.
La kinase CDK1/cycline A est active en G2, mais ses fonctions demeurent inconnues. Sa participation à l’activation de est une
hypothèse.
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1
S
G2
M
G2
CDK1/ cycline B (forme active)
Survivine
LaminesNucleoline
Condensine
Peroxiredoxine
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1
S
G2
MM
G2
est une période caractérisée par le mouvement des chromosomes vers les pôles, la disparition du fuseau, la décondensation des chromosomes et le début de la
cytokinèse.
La phase M comporte des phases décrites essentiellement sur la base de la morphologie des chromosomes et de l’enveloppe nucléaire, phases décrites il y a
plus de cent ans :
1 la prophase
2 La prométaphase
3 la métaphase
4 l’anaphase
5 la télophase
correspond à la fin de condensation des chromosomes, rupture de l’enveloppe nucléaire
est la période de formation du fuseau et du début d’alignement des chromosomes
est la phase d’alignement des chromosomes dans le fuseau, à équidistance des pôles
voit la disjonction des chromosomes
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1
S
G2
MM
La condensation des chromosomes
La condensation des chromosomes est parmi les
premiers évènements morphologiques de la division
qui aient été décritsLa condensine, un complexe
constitué de 5 sous unités, est le principal responsable du
phénomène de condensation chromosomique. Ses sous-unités
sont, chez l’homme, hCAP-C, hCAP-E, hCAP-D2, hCAP-G et
hCAP-H.
La condensine conduit une seule réaction : le super-enroulement, ATP-dépendant, de la molécule
d’ADN dans des conditions topologiques définies.
Enfin la phosphorylation de l’histone H3 (et de CENP-A) par la kinase Aurora-B est également directement impliquée dans la condensation chromosomique.
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1
S
G2
MM
Le fuseau mitotique
Les microtubules sont des assemblages non covalents d’hétérodimères de tubuline α et β
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1
S
G2
MM
La séparation des chromatides et la transition métaphase/anaphase
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1
S
G2
MM
La cytokinèse
La cytokinèse est l’étape finale de la division qui conduit à l’individualisation des deux cellules-filles
M
G2
S
Généralités
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Les phases du cycle de division cellulaire
G1
S
G2
MM
Le cycle des centrosomes
Méthodes pour étudier le cycle cellulaire
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Observation directe: cellules en phase M
Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN
biochimiquement (analysant des protéines spécifiques)
Méthodes pour étudier le cycle cellulaire
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Observation directe: cellules en phase M
Vidéomicroscopie de time lapse
La durée moyenne est déduite selon le calcul suivant : le temps en culture x [log2]/[log facteur de multiplication du de nombre de
cellules]
Une observation générale
Etudes de cellules vivantes avec le Microscope à contraste de phase.
Méthodes pour étudier le cycle cellulaire
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN
la thymidine tritiée (3H-thymidine)
1
un marquage de l'ADN par l’ iodure de propidium ou DAPI
(À l'aide de la technique de cytometrie de flux )
2
Incorporation de la bromo-deoxyuridine (BrdU) dans leur
ADN.
3
Méthodes pour étudier le cycle cellulaire
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN
la thymidine tritiée (3H-thymidine)
1
pour mesurer l'activité de l'ADN polymérase, (une façon
indirecte pour mesurer la division cellulaire)
Méthodes pour étudier le cycle cellulaire
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN
la thymidine tritiée (3H-thymidine)
1
autoradiographies
Méthodes pour étudier le cycle cellulaire
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN
un marquage de l'ADN par l’ iodure de propidium ou DAPI
(À l'aide de la technique de cytometrie de flux )
2
Pour estimer l’état prolifératif d’une
population cellulaire par une estimation du
pourcentage de cellules en phase S (estimation du
contenu en ADN par cellule.
Méthodes pour étudier le cycle cellulaire
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN
Incorporation de la bromo-deoxyuridine (BrdU) dans leur
ADN.
3
Pour estimer le pourcentage des cellules en phase S de
façon plus précise
Méthodes pour étudier le cycle cellulaire
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
biochimiquement (analysant des protéines spécifiques)
Détermination de l’activité des protéines kinases cycline-
dependantes (Cdk)
Les protéines impliquées dans la commande du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères ont été identifiées grâce aux
études chez la levure (Saccharomyces Cerevisiae et Schizosaccharomyces ).