biochimie appliquée

Biochimie appliquée

Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA

Préparé par:

Mr. HALLA Noureddine

II- Biochimie des substances d’origine animale (2)

Culture de cellules animales (eucaryotes):

Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

qui apporte les nutriments

essentiels à la survie et à la croissance.

Culture de cellules animales

le prélèvement de cellules, tissus ou

organes d'un animal ou d'une

plante

leur placement ultérieur dans

un environnement

artificiel récipients de cultures appropriés

contenant un milieu liquide ou

semisolide


Introduction

Différentes sources

Insectes

Poissons

Mammifères

Humains


Introduction

Différents types

Épithéliales/endothéliales (membranes)

Fibroblastes (tissus connectifs)

Myoblastes (muscles)

Neurones (syst. nerveux)

Hépatocytes (foie)

Erythrocytes (sang)

Lymphocytes (syst. immunitaire)


Introduction

Différents types

• Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC).

• Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié.

Durée de vie limitée (30-50 divisions).

• Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.


Introduction

Différents types


Introduction

Evolution des cellules en culture

Courbe de croissance d'une population cellulaire

A partir du premier repiquage on parle de

lignée cellulaire

les cellules viables se fixent sur le support alors que les

mortes restent dans le milieu de culture


Introduction

Evolution des cellules en culture

Longévité d'une culture cellulaire On rencontre 2 cas :

- Cultures normales ou définies : les cellules ne se multiplient que pendant un

nombre limité de générations (30 à 50 repiquages) puis

meurent : leur vie et leur mort est programmée.

On observe alors une diminution de leur vitesse de

prolifération, phase de sénescence.

- Culture continue ou lignées transformées ou immortelles. La

vitesse de multiplication ne diminue pas, ce qui permet un nombre de repiquage indéfini.

Ces cellules adhérentes perdent leur besoin d'ancrage et peuvent

être cultivées en suspension.

1 2


Introduction

Cellules transformées

Naturelles ChimiquesVirales

immortalisées spontanément in

vitro

- mutées pour des gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire (comme

par exemple la protéine p53).

transformées artificiellement par un virus oncogène (c.à.d. un gène immortalisant tel que T de SV40)


Introduction

Différentes lignées

MRC5, W138 HeLa CHO Vero Sf9 293

secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes,

vaccins

cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche

ovaire de hamster chinois, stable,

adhérente/suspension, versatile

reins de singe verts africains, stable,

adhérente, versatileSpodoptera frugiperda,

stable, système d’expression baculovirus

embryon de rein humain, transformée

par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus,

adaptée à la suspension (293S)


Introduction

Caractéristiques générales

Capable d’exocytoseNe sécrète pas d’enzymes

Modifications post-traductionnellesIntrons/épissage (splicing)


Introduction

À quoi servent les cultures de cellules?

Systèmes de modèles pour étudier :

1

2

3

4

5

La biologie et la biochimie cellulaires de base,

les interactions entre les cellules et les agents induisant

des maladies, les effets des médicaments sur

les cellules, Le processus et le déclenchement du

vieillissementles études nutritionnelles.


Introduction


Systèmes de modèles

Tests de toxicité pour étudier les effets de nouveaux médicaments,

cosmétiques et produits chimiques sur la survie et la croissance d'une

grande variété de types de cellules.


Introduction



Tests de toxicité

Recherche sur le cancerLes cellules normales et les cellules cancéreuses pouvant toutes deux

être cultivées. De plus, il est possible, en utilisant

des produits chimiques, virus et rayonnements, de convertir les cellules cultivées normales en

cellules cancéreuses.


Introduction



Tests de toxicité

Recherche sur le cancer

Virologie

- la réplication de virus dans les cultures cellulaires (à la place des animaux) pour les utiliser

dans la production de vaccins. - en détection clinique et

isolement de virus, - en recherche fondamentale

pour étudier comment ils se développent et infectent les

organismes.


Introduction



Tests de toxicité


VirologieLa cellule comme usine de

production

trois domaines se sont montrés plus intéressants:

la production à grande échelle de virus pour une utilisation en production de vaccins.

la production à grande échelle de cellules génétiquement

modifiées pour produire des protéines présentant une valeur médicale ou commerciale. (les

anticorps monoclonaux, l'insuline, les hormones, etc.)

l'utilisation de cellules en remplacement de tissus et

d'organes.


Introduction



Tests de toxicité



productionConseil génétique

un outil important pour le diagnostic précoce d'affections

embryonnaires


Introduction



Tests de toxicité




Génie génétiqueLa capacité de reprogrammer les cellules

en culture par du nouveau matériel génétique (ADN et gènes) pour étudier les effets cellulaires de l'expression de

ces gènes (nouvelles protéines).


Introduction



Tests de toxicité




Génie génétique

Thérapie géniqueLes cellules sont cultivées un moment puis réimplantées

dans le patient.


Introduction



Tests de toxicité




Génie génétique

Thérapie génique

Découverte de médicaments

Définition

Le cycle cellulaire est l'ensemble des phases par lesquelles une cellule passe

entre deux divisions successives.

Définition


Généralités


La division cellulaire est le processus fondamental par lequel

une cellule-mère donne deux cellules-filles identiques

Généralités


Interphase la mitose

Les phases du cycle de division cellulaire

Généralités



Généralités


Les kinases cycline-dépendantes

Entre 1990 et 2000, une douzaine de Cycline / Cdk sont décrites chez l’homme.

Six d’entre elles interviennent dans le contrôle direct du déroulement du cycle cellulaire.

Les Cdk sont des sérine-thréonine kinases

Généralités


Les kinases cycline-dépendantes

Généralités



M

G2

S

Généralités



G1G1

S

G2

M

P P

Les facteurs mitogènes

tyrosine kinases ou encore couplés à des protéines G.

cascades

la stimulation de la transcription de gènes essentiels pour l’entrée en division (en particulier cyclines D,

CDKs).

P

M

G2

S

Généralités



G1G1

S

G2

M

Plusieurs facteurs

Les cellules sont maintenues en G1

Protéines de la famille du

rétinoblastome, pRb, p107 et p130

La famille E2F

Transcription

P

M

G2

S

Généralités



G1G1

S

G2

M

Cycline E/ Cdk 2 Cycline D / Cdk 4Cycline D / Cdk 6

Progression G1

Protéines de la famille du

rétinoblastome, pRb, p107 et p130

La famille E2F

Transcription de l’ADN

P

M

G2

S

Généralités



G1G1

S

G2

M

La fin de G1 – préparation à la transition G1/S

La famille E2F

assemblage d’un complexe préréplicatif

(pre-RC)

ORC (Origin Recognition

Complex )

cdt1cdc6

ATPase facteur de transcriptio

n

recrute accrochage

complexe MCM 2-7

(mini-chromosome

maintenance )

cdc45

M

G2

S

Généralités



G1G1

S

G2

M

La transition G1/S

ORC

MCM 2-7

Plusieurs protéines et complexes protéiques doivent s’associer aux complexes pré-réplicatifs afin que la synthèse d’ADN puisse

commencer

MCM10

Cycline E/ Cdk 2

cdc7

DNA topoisomerases

DNA polymerase

DNA helicase

Activation

M

G2

S

Généralités



G1

S

G2

M

S

G1

M

G2

S

Généralités



G1

S

G2

M

G2

S

La phase G2 est souvent présentée comme une phase « de préparation » à la mitose. Elle est marquée par le début de la

condensation des chromosomes.

La kinase CDK1/cycline A est active en G2, mais ses fonctions demeurent inconnues. Sa participation à l’activation de est une

hypothèse.

M

G2

S

Généralités



G1

S

G2

M

G2

CDK1/ cycline B (forme active)

Survivine

LaminesNucleoline

Condensine

Peroxiredoxine

M

G2

S

Généralités



G1

S

G2

MM

G2

est une période caractérisée par le mouvement des chromosomes vers les pôles, la disparition du fuseau, la décondensation des chromosomes et le début de la

cytokinèse.

La phase M comporte des phases décrites essentiellement sur la base de la morphologie des chromosomes et de l’enveloppe nucléaire, phases décrites il y a

plus de cent ans :

1 la prophase

2 La prométaphase

3 la métaphase

4 l’anaphase

5 la télophase

correspond à la fin de condensation des chromosomes, rupture de l’enveloppe nucléaire

est la période de formation du fuseau et du début d’alignement des chromosomes

est la phase d’alignement des chromosomes dans le fuseau, à équidistance des pôles

voit la disjonction des chromosomes

M

G2

S

Généralités



G1

S

G2

MM

La condensation des chromosomes

La condensation des chromosomes est parmi les

premiers évènements morphologiques de la division

qui aient été décritsLa condensine, un complexe

constitué de 5 sous unités, est le principal responsable du

phénomène de condensation chromosomique. Ses sous-unités

sont, chez l’homme, hCAP-C, hCAP-E, hCAP-D2, hCAP-G et

hCAP-H.

La condensine conduit une seule réaction : le super-enroulement, ATP-dépendant, de la molécule

d’ADN dans des conditions topologiques définies.

Enfin la phosphorylation de l’histone H3 (et de CENP-A) par la kinase Aurora-B est également directement impliquée dans la condensation chromosomique.

M

G2

S

Généralités



G1

S

G2

MM

Le fuseau mitotique

Les microtubules sont des assemblages non covalents d’hétérodimères de tubuline α et β

M

G2

S

Généralités



G1

S

G2

MM

La séparation des chromatides et la transition métaphase/anaphase

M

G2

S

Généralités



G1

S

G2

MM

La cytokinèse

La cytokinèse est l’étape finale de la division qui conduit à l’individualisation des deux cellules-filles

M

G2

S

Généralités



G1

S

G2

MM

Le cycle des centrosomes

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire


Observation directe: cellules en phase M

Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN

biochimiquement (analysant des protéines spécifiques)



Observation directe: cellules en phase M

Vidéomicroscopie de time lapse

La durée moyenne est déduite selon le calcul suivant : le temps en culture x [log2]/[log facteur de multiplication du de nombre de

cellules]

Une observation générale

Etudes de cellules vivantes avec le Microscope à contraste de phase.




la thymidine tritiée (3H-thymidine)

1

un marquage de l'ADN par l’ iodure de propidium ou DAPI

(À l'aide de la technique de cytometrie de flux )

2

Incorporation de la bromo-deoxyuridine (BrdU) dans leur

ADN.

3





1

pour mesurer l'activité de l'ADN polymérase, (une façon

indirecte pour mesurer la division cellulaire)





1

autoradiographies




un marquage de l'ADN par l’ iodure de propidium ou DAPI

(À l'aide de la technique de cytometrie de flux )

2

Pour estimer l’état prolifératif d’une

population cellulaire par une estimation du

pourcentage de cellules en phase S (estimation du

contenu en ADN par cellule.




Incorporation de la bromo-deoxyuridine (BrdU) dans leur

ADN.

3

Pour estimer le pourcentage des cellules en phase S de

façon plus précise



biochimiquement (analysant des protéines spécifiques)

Détermination de l’activité des protéines kinases cycline-

dependantes (Cdk)

Les protéines impliquées dans la commande du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères ont été identifiées grâce aux

études chez la levure (Saccharomyces Cerevisiae et Schizosaccharomyces ).

biochimie appliquée

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