biochimie 2 – introduction -...

Biochimie 2 – Introduction

James SturgisLaurent Aussel

Biochimie 2 – Contenu

La biochimie cellulaire– le métabolisme– le couplage

Les protéines– leur structure– leur purification

Les enzymes– leur cinétique

Biochimie 2 - Organisation

Les cours... Les TD

– A partir de fin septembre (29/9)....

Les TP– A la fin du semestre.

Cours JS– 7/9, 9/9, 16/9, 23/9

Cours LA– 30/9, 7/10, 21/10,

4/11, 18/11

Partiel JS– 14/10

Revisions LA– 25/11

Biochimie 2 - Examen

Les cours Les TD Le TP...

Questions de cours Exercices /

problèmes

Partiel– JS seulement 35%

Final – LA et JS - 50%

TP– 15%

Deuxieme session– Examen 85%– Test TP 15%

Biochimie 1 – Rappels

Les molécules de la vie...

– Les petits

● Glucides - Nucléotides

● Acides Aminés - Acides Gras

● Vitamines - et autres

– Les grands

● Polysaccharides - Acides Nucléiques

● Protéines - Lipides



– Les petits




– Les grands



PyridoxalVitamine B6



– Les petits




– Les grands



Biochimie 1 et Biochimie 2

Les cellules ne sont pas seulement fabriquées de plusieurs composants différents...

Les molécules et cellules sont dynamiques...– Les conversions– leur cinétique et– leur catalyse.

Les conversions biologiques

Les organismes biologiques sont capables de faire de la chimie.


Agriculture... Les plantes produisent la biomasse à partir de l'air, l'eau et la lumière.Les animaux herbivores produisent des protéines à partir de sucres..


Photo par Velela

Les bactéries qui nettoient l'eau...


Transmission electron micrograph of thin sections illustrating gold precipitation associated with Au(III)-reducing microorganisms and lack of gold precipitation with G. sulfurreducens. (A) P. islandicum; (B) T. maritima; (C) S. algae; (D) G. sulfurreducens; (E) G. ferrireducens; (F) P. furiosus; (G) strain 234. Appl Environ Microbiol. 2001 July; 67(7): 3275–3279. doi: 10.1128/AEM.67.7.3275-3279.2001.

Les bactéries qui collectent l'or.


La levure qui fabrique de l'alcool a partir des sucres (maltose/saccharose ou amidon).

La chimie biologique

Sucre (maltose/saccharose ou amidon) + Eau + Levure

Maltose

Saccarose

Amidon

Levure et eau

La chimie biologique

Une production de gaz carbonique ...et d'alcool

CO2

EthanolLevure et eau

Maltose

Saccarose

Amidon

Danger

La chimie organique

... et dans le flacon!

Les cellules se divisent.

Les levures croissent sur les glucides.

Le temps de croissance est environ 60 minutes

... et dans le flacon

Une température qui augmente.

La fermentation est une processus exérgonique et génère de la chaleur.

Ceci est souvent un problème en industrie.

Couplage des processus

Production de– Ethanol et CO

2

– Levures– Chaleur

Glucide + levure -> CO2 + éthanol + 2 x levure + chaleur

Couplage de réactions

Diverses réactions dans la cellule sont couplées ensemble.

Couplage des réactions

D'une part utilisation d'un glucide comme fioul pour la cellule, et production de déchets (gaz carbonique et alcool).

D'autre part production de nouvelles cellules avec « l'énergie » dérivée.

Deux processus couplés

Proteines etc.

Alcool et CO2.

Glucose

Couplage des réactions

« Catabolisme » utilisation d'un glucide comme fioul pour la cellule, et production de déchets (gaz carbonique et alcool).

« Anabolisme » production de nouvelles cellules avec « l'énergie » dérivée.

Deux processus couplés« Métabolisme »

Proteines etc.

Alcool et CO2.

Glucose

... et si on tue les cellules?

Expérience ancienne de Hans et Edouard Büchner (1897) poussée plus loin par Harden et Young (1905).

Catabolisme toujours possible, production d'alcool et gaz carbonique.

Pas d'anabolisme Dégagement de plus de chaleur.

Glucose + levure (mort) -> CO2 + éthanol + levure (mort) + 2 x chaleur

... et si on tue les cellules?

Expérience ancienne de Hans et Edouard Büchner (1897) poussée plus loin par Harden et Young (1905).

Métabolisme déréglé dans des cellules mortes. Le couplage entre anabolisme et catabolisme

conserve de l'énergie. Le suc de levure est capable de chimie.

Glucose + levure (mort) -> CO2 + éthanol + levure (mort) + 2 x chaleur

Catalyseurs – Enzymes

Les composants actives du suc de levures sont des « enzymes »

Parfois ils ont des cofacteurs ou coenzymes.

Elles ont un pouvoir catalytique impressionnant

Les Enzymes

Accélèrent des réactions, souvent énormément.

Dans une eprouvette...

[Produit]

Temps

Additiond'enzyme.

Beaucoup d'enzyme et réactives

Moins d'enzyme ou réactives

Les Enzymes


Sont saturables

[Réactif]

[Produit]

temps

vitesse de la réaction

Pente = vitesse

Les Enzymes


Sont saturables Sont caractérisées, au

plus simple, par deux paramètres:– k

cat (pouvoir catalytique)

– KM (affinité)

vitesse de la réaction

[Réactif]

KM

Vmax

Liens entre anabolisme et catabolisme

Catabolisme : utilisation de fioul

Anabolisme : fabrication des molécules de la vie.

Liées par– des petites molécules– ATP et NADH– des macromolécules AnabolismeCatabolisme

Macromolécules

Petit Molécules

ATP et NADH

l'ATP – l'argent comptant de la cellule

C'est quoi cette molécule?

Pourquoi est-elle si utile?

Comment est stockée l'énergie?



Pourquoi est-elle si utile? Comment est stockée

l'énergie?


ADP~P

ADP + H+ + Pi ATP + H

2O

∆G°' = -29,2 kJ mol-1


Pourquoi est-elle si utile? Comment est stockée

l'énergie?

Couplage et thermodynamique

Le couplage d'une réaction favorable avec une deuxième réaction défavorable peut rendre la réaction

défavorable possible.

A B

C D

1er réaction favorable A->B

2ème réaction favorable C->D



défavorable possible.

A B

D C


2ème réaction defavorable D->C



défavorable possible.A B

D C


2ème réaction defavorable D->C

A + D B + C

deux réactions couplées, favorable

Couplage et ATP


défavorable possible.Glucide Ethanol + CO

2

ADP + Pi ATP

1er réaction favorable Glucide -> Ethanol + CO2

2ème réaction defavorable ADP+Pi -> ATP

Glucide + ADP + Pi Ethanol + CO2 + ATP

deux réactions couplées, favorable

Couplage et ATP – Catabolisme


défavorable possible.Macromolécules Petits molécules

ADP + Pi ATP

1er réaction favorable dégradation de macromolécules

2ème réaction defavorable synthèse d'ATP

Macromolécules + ADP + Pi Petits molécules + ATP

deux réactions couplées, favorableConservation d'énergie

Couplage et ATP – Anabolisme


défavorable possible.ATP ADP + Pi

Petits molécules Macromolécules

1er réaction favorable hydrolyse d'ATP

2ème réaction defavorable synthèse de macromolécules

Macromolécules + ADP + PiPetits molécules + ATP

deux réactions couplées, favorableConservation d'énergie

le NAD(P)H – le pouvoir reducteur

C'est quoi cette molécule? Pourquoi est-elle si utile?

Couplage et NAD(P)H

Couplage d'une réaction d'oxydation avec une deuxième réaction de réduction afin de conserver le

pouvoir réducteur.Macromolécules Petits molécules

NAD(P)+ NAD(P)H

1er réaction oxydation de macromolécules

2ème réaction réduction de NAD(P)+

Macromolécules + NAD(P)+ Petits molécules + NADH

deux réactions coupléesConservation de pouvoir réducteur

Les acides nucléiques – « ARN monde » et l'origine de la vie...

Les molécules de couplage ATP et NADH jouent un rôle important dans la cellule. Ce sont des nucléotides.

Conditions de la vie...

Transmission d'information génétique (ADN)

Anabolisme pour reproduction de l'information.

Effecteurs – catalyseurs – codés par les gènes pour faire le métabolisme (Protéine)

Origine de la vie...

Quoi ?– Membrane– Métabolisme– Génétique

Quand ?– Il-y-a 4,25 GYa..... avant

LUCA il-y-a 3,75 GYa.... après la formation de la Terre il-y-a 4,5 GYa.

LUCA – le dernier ancêtre commun

Un membrane lipidique avec plein de protéines membranaires.

Un génome en ADN Un métabolisme

complexe avec ARN et ADN.

Peut-être un consortium avec beaucoup de virus?

LUCA – le dernier ancêtre commun

Un membrane lipidique avec plein de protéines membranaires.

Un génome en ADN Un métabolisme

complexe avec ARN et ADN.

Peut-etre un consortium avec beaucoup de virus?

ARN avant ADN

Les ribosomes, ARN messagers et ARN de transfert jouent un rôle active important dans la cellule.

L'ADN jouent un rôle plus passive et est remplaçable par ARN.

La conversion d'une nucléotide en desoxy-nucléotide est secondaire dans le métabolisme.

Certains virus utilisent ARN et pas ADN comme matière génétique.

Avant LUCA

Avant LUCA possible d'avoir des cellules avec l'ARN en place de l'ADN.

Avant....

ARN

Protéine

Métabolisme

Membrane

Avant LUCA

Ribosome ARN messager et ARN de transfert est une machinerie complexe pour convertir ARN en protéine....

Avant sa évolution la vie était comment?....

ARN ou Peptides?

Monde des ARN ou des peptides?

ARN

Métabolisme Métabolisme

Peptides

Membrane

Monde des ARN (RNA world) Métabolisme d'abord

ARN monde

Les ARN peuvent jouer les deux rôles...– Transmission

d'information– Catalyse de réactions

ARN monde

Les ARN peuvent jouer les deux rôles...– Transmission

d'information– Catalyse de réactions

Le ribosome est une ribozyme!!!

ARN monde

Les reliques aujourd'hui..– Les ARN entre ADN et

protéine.– Les ribozymes pour les

réactions clés de la cellule– Les ARN comme

molécules de couplage– Les ARN et bases pour

leur réactivité.

Evolution prébiotique

Evolution d'ADN

Evolution des ribosomes et génétique ou ribosomes et protéines.

Evolution des membranes et metabolisme.

ARN

Métabolisme Métabolisme

Peptides

Membrane

ARN

Protéine

Métabolisme

Chimie

ARN

Protéine

Métabolisme

ADN

Evolution prébiotique

L'évolution prébiotique est conservé dans– Les molécules du

vivantAcides aminés LGlucides D

– Les réactions du métabolismeUtilisation d'ATPPréférence pour K+

Le Métabolisme une Introduction

Une vue globale

Métabolisme - une vue globale

Anabolisme

Petites molécules

Molécules de CouplageATP, NAD(P)H

Macromolécules

Catabolisme


Petites molécules

Molécules de CouplageATP, NAD(P)H

Macromolécules

Amino Acides Nucléo GlucAcides Gras -tides -ides

Macromolécules

Protéines ARN/ADN Lipides Polygluc.

Monoméres

Petites molécules

CO2


Macromolécules


Monoméres

Petites molécules


Macromolécules


Monoméres

Petites molécules

CO2

Petites molécules

Les différents compartiments de la cellule sont spécialisés dans différents aspects du métabolisme


Lysosome GolgiNoyau

Mitochondrie

Cytosol

Réticulum endoplasmique

Ribosomes


Macromolécules


Monoméres

Petites molécules

CO2

Petites molécules


Lysosome GolgiNoyau

Mitochondrie

Cytosol


Ribosomes

Les différents compartiments et les membranes ne sont pas homogènes mais sont structurés avec des machines moléculaires qui ont souvent des rôles métaboliques spécifiques...


Lysosome GolgiNoyau

Mitochondrie

Cytosol


Ribosomes



Beck et al. Science 2004



Baumeister Biol.Chem. 2004



Baumeister Biol.Chem. 2004

Un Protéosome


Macromolécules


Monoméres

Petites molécules

CO2

Petites molécules


Lysosome GolgiNoyau

Mitochondrie

Cytosol


Ribosomes


Macromolécules


Monoméres

Petites molécules

CO2

Petites molécules

Métabolisme - une voie anabolique

Le différentes interconversions et synthèses sont organisées en voie métabolique...

C'est une petite simplification pour rendre la compréhension plus facile.

La synthèse des Nucléotides.


La synthèse des nucléotides.ATP produit et substrat

ARN

ARN polymerase

ATP GTP CTP UTP

AMP GMP UMP

1 ATP

2 ATP

PRPP

UracilAdenine

Guanine

Ribose 5 P

2 ATP

Glucose 6 P2 NADPH + CO

2

Phosphates

Glucide

Base


Beaucoup de composés phosphorylés

Beaucoup d'ATP utilisé

Plein de petites étapes simples pour faire des réactions complexes.

ARN

ARN polymerase

ATP GTP CTP UTP

AMP GMP UMP

1 ATP

2 ATP

PRPP

UracilAdenine

Guanine

Ribose 5 P

2 ATP

Glucose 6 P2 NADPH + CO

2


Macromolécules


Monoméres

Petites molécules

CO2

Petites molécules

Métabolisme - une voie catabolique

La fermentation de glucose en alcool et dioxyde de carbone.

Le catabolisme d'une glucide monomérique.

Métabolisme - une voie catabolique

Différentes étapes..• activation du substrat• récupération d'énergie• élimination des déchets

Beaucoup d'ATP

Plein de petites étapes simples pour faire des réactions complexes.

1 ATP

4 ATP

2 NADH

Glucose 6 P

2 NADH

Glucose

Fructose 1,6 bisP

Pyruvate

1 ATP

Ethanol et CO2

Une réaction chimique

Les réactions cataboliques

Glucose

Glucose (C6H12O6) -> 2 x CO2 + 2 x ethanol (C2H6O)

Stœchiométrie

OC

H

HHO

HH

CH2OH

HOH

OHOH

CCCC

Ethanol

CH3 CH

2OH

Gaz Carbonique

O=C=O

Une voie métabolique – Les étapes

Les premières étapes : activation du substrat

Glucose

OC

H

HHO

HH

CH2OH

HOH

OHOH

CCCC

Fructose 1,6 bisPhosphate

HOHH

CH2OPO

3

2-

HO

OHOH

CCCC

CH2OPO

3

2-

Activation du substrat

Récupération d'énergie

Élimination des déchets


Ensuite récupération d'énergie

PyruvateX2

CH3

O

O

CC

O-

Fructose 1,6 bisPhosphate

HOHH

CH2OPO

3

2-

HO

OHOH

CCCC

CH2OPO

3

2-






Pyruvate

CH3

O

O

CC

O-




Ethanol +CO

2

CH3

CH2OH

OCO


Les différents voies contiennent souvent des composants communes.

Le métabolisme est souvent fait par des organites et des machines spécialisées.

Les molécules de couplages (ATP, NADH) jouent un rôle important.

Les voies métaboliques sont composées de plusieurs réactions simples.

Le Métabolisme : une voie catabolique

La fermentation alcoolique

Transport du glucose

Localisation importante pour le métabolismeActivation du substrat

Import HXT1/2

Hexokinase

Phosphoglucoisomerase

Phosphofructokinase



OC

H

HHO

HH

CH2OH

HOH

OHOH

CCCC

Glucose (extracellulaire)

OC

H

HHO

HH

CH2OH

HOH

OHOH

CCCC

OC

H

HHO

HH

CH2OH

HOH

OHOH

CCCC

Glucose (intracellulaire)

OC

H

HHO

HH

CH2OH

HOH

OHOH

CCCC

Activation du glucose

HexokinaseInvestissement d'énergie.


Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase



Glucose O

CH

HHO

HH

CH2OH

HOH

OHOH

CCCC

ATP

Glucose 6 Phosphate O

CH

HHO

HH

CH2OPO

3

2-

HOH

OHOH

CCCC

ADP

Une isomérisation

PhosphoglucoisomeraseActivation du substrat

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase



Fructose 6 Phosphate

CH2OH

HOHH

CH2OPO

3

2-

HO

OHOH

CCCC

OC

H

HHO

HH

CH2OPO

3

2-

HOH

OHOH

CCCC

Glucose 6 Phosphate

Une deuxième activation

PhosphofructokinaseActivation du substrat

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase



Fructose 1,6 bis-Phosphate

CH2OPO

3

2-

HOHH

CH2OPO

3

2-

HO

OHOH

CCCC


CH2OH

HOHH

CH2OPO

3

2-

HO

OHOH

CCCC

ATP ADP

Clivage de la Molécule

AldolaseActivation du substrat


Aldolase

Triose Phosphate isomerase

Glyceraldehyde 3 phosphate deshydrogenase

Phosphoglycerate kinase

Phosphoglyceromutase

Enolase

Pyruvate Kinase


Di-hydroxy acétone

phosphate CH

2OPO

3

2-

HOH

HOC

C


CH2OPO

3

2-

HOHH

CH2OPO

3

2-

HO

OHOH

CCCC

Glycéraldéhyde 3 Phosphate

CH2OPO

3

2-

HO H

OCC

H

TIM - Triose phosphate isomerase

TIM

Di-hydroxy acétone

phosphate CH

2OPO

3

2-

HOH

HOC

C


CH2OPO

3

2-

HO H

OCC

H



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase


TIM - une enzyme parfaite

Di-hydroxy acétone

phosphate CH

2OPO

3

2-

HOH

HOC

C


CH2OPO

3

2-

HO H

OCC

H

Une protéine en forme de baril, avec feuillets β et hélices α



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase



Di-hydroxy acétone

phosphate CH

2OPO

3

2-

HH

OHOC

C

Mechanisme d'action

His 95

His 95Glu165

H N+CO

O-



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase



Intermediaire ene-di-ol

CH2OPO

3

2-

HOHOHC

C

Mechanisme d'action

His 95

His 95Glu165

:NCO

OH



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase



Glycéraldéhyde 3

phosphate CH

2OPO

3

2-

H

HOOHC

C

Mechanisme d'action

His 95

His 95Glu165

H N+CO

O-



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase



Di-hydroxy acétone

phosphate CH

2OPO

3

2-

HOH

HOC

C


CH2OPO

3

2-

HO H

OCC

H

Accéleration de la réaction par 1010x

Vitesse limitée par les rencontres enzyme substrat

Guidage de la réaction.



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase


Une oxydation

Une réaction complexe... Oxydation d'aldéhyde en acide et phosphorylation

O

H

CH2OPO

3

2-

OPO3

2-

OH

C

C

1,3bisphospho glycerate

H

H

CH2OPO

3

2-

O

OH

C

C

Glyceraldehyde 3Phosphate

NAD+

Pi NADH



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase


Récupération d'énergie 1

O

H

CH2OPO

3

2-

O-

OH

C

C

3 phospho glycerate

ATP

O

H

CH2OPO

3

2-

OPO3

2-

OH

C

C

1,3bisphospho glycerate

ADP


Une phosphorylation à l'envers



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase


Un transfert intramoléculaire

O

H

CH2OH

O-

OPO3

2-

C

C

2 phospho glycerate

Phosphoglycérate mutase

O

H

CH2OPO

3

2-

O-

OH

C

C

3 phospho glycerate

Des mutases catalysent des transferts intramoléculaires d'un groupe chimique



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase


Une déshydratation

O

H

CH2OH

O-

OPO3

2-

C

C

Phosph énol pyruvate

Enolase

2 phospho glycérate

O

CH2

O-

OPO3

2-

C

C

H2O



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase


Récupération d'énergie 2

Pyruvate

Pyruvate Kinase

O

CH3

O-

O

C

C

Phosph énol pyruvate

O

CH2

O-

OPO3

2-

C

C

ATPADP

Une phosphorylation à l'envers



Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase


Décarboxylation

Acetaldehyde

Pyruvate Décarboxylase

O

CH3

O

O

C

C

Pyruvate

O

CH3

O-

OCH



Élimination des déchetsPyruvate decarboxylase

Alcool deshydrogenase

O O-

C

Régénération de NAD+



Élimination des déchetsPyruvate decarboxylase


Ethanol

Alcool Déshydrogenase

CH3

OHC

H

Acetaldehyde

CH3

OC

H

H

NADH NAD+

Enzyme à Zn2+

Le Métabolisme : une voie catabolique

Intégration cellulaire

Les enzymes

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase

Aldolase

Triose phosphare isomerase




Enolase

Pyruvate Kinase

Pyruvate decarboxylase


1 Transporteur4 Kinases (Phosphoryl transferts)2 Deshydrogenases1 Deshydratation2 Isomérase1 Mutase2 Clivage de liaison C-C.

Le bilan 1

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase

Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase



Glucose

O

C

H

H

HO

H

H

CH2OH

H

OH

OH

OH

C

C

C

C

2 ATP

Fructose 1,6 bis Phosphate

HO

H

H

CH2OPO

3

2-

H

O

OH

OH

C

C

C

C

CH2OPO

3

2-

2 ADP

Le bilan 2

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase

Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase



GlucoseO

C

H

H

HO

H

H

CH2OH

H

OH

OH

OH

C

C

C

C

2 ATP2 NAD+

4 ADP2 Pi

2 ADP2 NADH4ATP

2 Pyruvate

O

CH3

O-

O

C

C

Le bilan 3

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase

Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase



Glucose

O

C

H

H

HO

H

H

CH2OH

H

OH

OH

OH

C

C

C

C

2ADP2 Pi

2ATP

2 Ethanol

CH3

OHC

H

H

O=C=O

2 gaz carbonique

Liens avec le reste du métabolisme

•Autres voies•Autres substrats•Autres produits•Liens avec anabolisme•Source de carbone

Glucose

Glucose 6 Phosphate

Fructose 6 phosphate

Fructose 1,6 bis phosphate

Di hydroxy acetone phosphate

Glyceraldehyde 3 phosphate

1,3 bis phsopho glycerate

3 phospho glycerate

2 phospho glycerate

Phophenol pyruvate

Pyruvate

Acetaldehyde

Ethanol

Glucose

Glucose 6 Phosphate






3 phospho glycerate

2 phospho glycerate

Phophenol pyruvate

Pyruvate

Acetaldehyde

Ethanol



Glucose

Glucose 6 Phosphate






3 phospho glycerate

2 phospho glycerate

Phophenol pyruvate

Pyruvate

Acetaldehyde

Ethanol



MaltoseAmidon

Fructose

Glucose

Glucose 6 Phosphate






3 phospho glycerate

2 phospho glycerate

Phophenol pyruvate

Pyruvate

Acetaldehyde

Ethanol



Acides nucléiques

LactateCO

2

Acides GrasAcides aminés

Glucose

Glucose 6 Phosphate






3 phospho glycerate

2 phospho glycerate

Phophenol pyruvate

Pyruvate

Acetaldehyde

Ethanol



NADH

ATP

Glucose

Glucose 6 Phosphate






3 phospho glycerate

2 phospho glycerate

Phophenol pyruvate

Pyruvate

Acetaldehyde

Ethanol



Acides GrasAcides aminés

Acides nucléiques

L'énergétique

Thermodynamique et métabolisme

Rappel de la thermodynamique

G = changement d'énergie libre (de Gibbs)

G° = changement d'énergie libre standard (de Gibbs) dans les conditions standard = 1M de réactif et de produit (pH 0).

G°' = changement d'énergie libre standard (de Gibbs) version biologique... condition standard pH 7.

Rappel de la thérmodynamique

G = changement d'énergie libre (de Gibbs)

Changement d'énergie libre est l'énergie disponible (-ve) ou nécessaire (+ve) pour faire une réaction

G = H - TSH = Changement d'enthalpieS = Changement d'entropie

La thermodynamique des réactions

∆G = ∆G° - RT ln K

∆G° – une mesure de la facilité (chimique) d'une réaction.

– A un molaire des produits et substrats la valeur de G.

– A l'équilibre G° = RT ln Keq

.

∆G – une mesure de l'équilibre (ou non) d'une réaction.

Glyceraldehyde3P + Pi + NAD+

BisPhosphoGlycerate + NADH

K = [Glyceraldehyde 3 P][Pi][NADH]

[bisphosphoglycerate][NAD+]

∆G°' = +6.0 KJ/mol


∆G = ∆G° - RT ln K

∆G° - une mesure de la facilité (chimique) d'une réaction.

∆G – une mesure de l'équilibre (ou non) d'une réaction.

– Si ∆G = 0 une réaction est à l'équilibre.

Glyceraldehyde3P + Pi + NAD+

BisPhosphoGlycerate + NADH

K = [Glyceraldehyde 3 P][Pi][NADH]

[bisphosphoglycerate][NAD+]

∆G°' = +6.0 KJ/mol


∆G°' ∆GHexokinase -16,0 -32,0PGI +1,6 -2,4PFK -13,6 -21,2Aldolase +22,8 -1,2TIM +7,2 +2,4G3PDH +6,0 -1,6PGK +18,0 +1,2PGM +4,4 +0,8Enolase +1,6 -3,2PyruvateK -30,0 -16,0

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase

Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase


Alcool deshydrogenase Réactions difficilesRéactions faciles


∆G°' ∆GHexokinase -16,0 -32,0PGI +1,6 -2,4PFK -13,6 -21,2Aldolase +22,8 -1,2TIM +7,2 +2,4G3PDH +6,0 -1,6PGK +18,0 +1,2PGM +4,4 +0,8Enolase +1,6 -3,2PyruvateK -30,0 -16,0

Réactions difficilesRéactions faciles

Réactions proche de l'équilibreRéactions Loin de l'équilibre

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase

Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase




Les sites de régulation correspondent aux réactions hors équilibre et aux goulots d'étranglement...

Ils correspondent souvent aux points de branchement...

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase

Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase



La cinétique chimique

L'ordre d'une reaction...


Pour une réaction chimique très simple...

La vitesse de la réaction est la concentration de produit formé, ou substrat utilisé, par seconde.

Unités de mesure Molaire par seconde (M sec-1)

Substrat (S) Produit (P)

d [P ]

dtou

−d [S ]dt



La vitesse de la réaction varie en fonction des conditions:– La concentration du substrat (S).– L'environnement (T et P par exemple).




Une equation de vitesse:

– La concentration du substrat (S) puissance 1, c'est une réaction de premier ordre.

– L'environnement (T et P par exemple) agis sur la constante de vitesse (k)


d [P ]

dt=

−d [S ]dt

= k [ S ]1



– La vitesse se mesure en M sec-1.– La concentration du substrat (S) en M.– La constante de vitesse (k) donc en sec-1.


d [P ]

dt=

−d [S ]dt

= k [ S ]1


Les réactions chimiques ne sont pas toujours si simples...

Une réaction de deuxième ordre

– La vitesse se mesure en M sec-1.– La concentration du substrat (S) en M.– La constante de vitesse (k) donc en M-1sec-1.

Substrat (S) + Substrat (S) Produit (P)

d [P ]

dt=

−d [S ]dt

= k [ S ]2


Les réactions chimiques ne sont pas toujours si simples...

Une réaction de zéro ordre

– La vitesse se mesure en M sec-1.– La concentration du substrat (S) n'est pas important.– La constante de vitesse (k) donc en M sec-1.


d [P ]

dt=

−d [S ]dt

= k [ S ]0

Catalyseur


Comment mesurer l'ordre d'une réaction?

Regarde ln(vitesse) en fonction de ln([S])

– La pente donne l'ordre.

d [P ]

dt= k [S ] x ; ln

d [P]

dt = ln k x ln [ S ]

ln([S])

ln(vitesse) pente ordre (x)

ln(k)


Les équations de vitesse peuvent être integrées pour donner une description de l'évolution des concentrations dans le temps...

d [ S ]dt

= −k [S ]0

∫ d [S ] = −∫ k dt[S ] = −kt

[S t ] = max 0,[ S0]−kt[Pt ] = min kt ,[S0 ]

temps

[ ]

[P]

[S]

la pente = k


Les équations de vitesse peuvent être integrées pour donner une description de l'évolution des concentrations dans le temps...

d [S ]dt

= −k [ S ]1

∫d [S ][S ]

= −∫ k dt

ln [S ] = −kt [ S ] = e−kt

[S t ] = [ S0]e−kt

[P t ] = [S0] 1−e−kt temps

[ ]

[P]

[S]


Un graphique du ln([S]) en fonction du temps donne une droite avec pente -k pour une réaction de premier ordre.

[S t ] = [ S0]e−kt

ln [S t ] = ln [ S0]−kt

temps

ln([S])

ln([S0])

pente -k

Une réaction réversible

Pour une réaction réversible les choses sont légèrement plus complexes...


d [P ]

dt=

−d [S ]dt

= k1[ S ]−k−1[P ]

k+1

k-1


La réaction réversible va vers une équilibre...


d [P]dt

= 0

k1[S∞ ] = k

−1[P∞]

k+1

k-1

K eq =[P∞ ]

[S∞ ]=

k1

k−1

d [P ]

dt=

−d [S ]dt

= k1[ S ]−k−1[P ]



Substrat (S) Produit (P)k

+1

k-1

d [ S ]dt

= k−1[P]−k1[S ]

d [S ]dt

= k−1[P]−k1[ S ]−k−1[P∞]k1[S∞ ]

d [S ]dt

= k−1[P]−[P∞]−k1[ S ]−[S∞]




+1

k-1

mais [P]−[P∞] = −[S ]−[S∞ ]

etd [S ]−[S∞ ]

dt=

d [ S ]dt

d [ S ]−[S∞]

dt= −k−1k1[ S ]−[S∞]




+1

k-1

d [ S ]−[S∞]

dt= −k−1k1[ S ]−[S∞]

∫d [S ]−[ S∞]

[S ]−[S∞ ]= −∫ k−1k1dt

ln[S ]−[S∞] = k−1k1t

[S t] = [ S∞][ S0]−[S∞ ]e−k−1k1 t

La constante de vitesse apparente est la somme des deux constantes de vitesses pour les réactions partielles.


Conclusions– L'ordre cinétique d'une réaction renseigne sur le

mecanisme de la réaction.– La vitesse d'une réaction depend

des concentrations des réactifs et d'une constante de vitesse reliées par une equation de vitesse.

Le constant de vitesse

La théorie des états de transition

La constante de vitesse


Que determine la constante de vitesse de la réaction?

Une resolution par la théorie des états de transition...



La réaction chimique passe par une état de transition:

Ca correspond a la structure avec la plus haute energie libre pendant la réaction.

S‡ PS



S‡

P

S

Déroulement de la réaction

EnergieLibre G



S‡

P

S


EnergieLibre G

G‡


La réaction chimique passe par une état de transition:– Supposons:

– Une equilibre entre les états S et S‡

– Une decomposition de S‡ en P limité par la fréquence d'une liaison qui se brise.

S‡ PSK‡



– Une equilibre entre les états S et S‡

– Une decomposition de S‡ en P limité par la fréquence d'une liaison qui se brise.

S‡ PSK‡

d [P ]

dt= [S‡ ]

[S ‡]

[S ]= K ‡ ; G ‡

= −RT ln K ‡



– Une valeur de peut egalement être determiner de 6,2 10+12 sec-1 à 25°C.

S‡ PSK‡

≈k B T

h

d [P ]

dt= e

−G ‡

RT [S ]



– Il est egalement possible de decomposer l'energie libre de l'état de transition...

S‡ PSK‡

d [P ]

dt=

k B T

he−G ‡

RT [S ]; ks p =k B T

he−G‡

RT

G‡= H ‡

−T S‡


La constante de vitesse d'une réaction chimique dépend de:

– L'énergie libre de l'état de transition,– La temperature (d'une facon un peu complexe).

k s p =k BT

he−G ‡

RT

Le cinétique enzymatique

Catalyseurs et vitesse.


Les composants actives du suc de levures sont des « enzymes »

Elles ont un pouvoir catalytique impressionnant.

Comment ça marche?


Les enzymes ne changent pas l'equilibre d'une reaction (G°)

Elles changent la constante de vitesse des réactions en modifiant l'état de transition.– Sa structure S‡ et

– Sa energie libre G‡

S‡

P

S


EnergieLibre G

G‡

G°

S‡


Les enzymes ne changent pas lors de la catalyse...

Une cycle catalytique. Pour simplicité nous

considerons des systèmes avec.– Peu d'enzymes– Sans accumulation de

produits

EnzymeE

ComplexeES

SubstratS

ProduitP

La cinétique enzymatique.

Analyse de Michaelis et Menten (1913)

ES E+PE+SK

sk

cat

Liaison des substrats rapide et reversible avec une constante de dissociation de K

s.

Réaction de premier ordre pour la production de produit avec une constante de vitesse de k

cat.



ES E+PE+SK

sk

cat

d [P ]

dt= v = kcat [ES]

K s =[E ][ S ][ES ]

Ks est une constante de

dissociation en unités de M.

La concentration totale de Enzyme reste constante...

[E totale ] = [E ][ES ]



ES E+PE+SK

sk

cat

d [P ]

dt= v = kcat [ES ]

[ES ] =[E totale] [S ]

K s[S ]

Equation de Michaelis Menten

v =kcat [E totale ][S ]

K s[S ]

v =V max [S ]

K M[S ]



ES E+PE+SK

sk

cat



K s[S ]

v =V max [S ]

K M[S ]

Version derivé de l'analyse en terme des paramétres moléculaires.

Version phenomenologique et usuel de l'equation. Plus utile?



v =V max [S ]

K M[S ]

Si:

[S ] ≫ K M ; v ≈V max [S ]

[ S ]= V max

[S ] = K M ; v =V max K M

K MK M

=V max

2

[S ] ≪ K M ; v ≈V max [S ]

K M

v

[S]

KM

Vmax

Vmax

/2



v =k cat[E totale] [S ]

K M[ S ]

Si :

[S ] ≫ K M ; v ≈ kcat [E totale]

réaction de premièreordre

[S ] ≪ K M ; v ≈k cat

K M

[E totale] [S ]

réaction de deuxièmeordre

v

[S]

KM

Vmax

Vmax

/2





K M[S ]

v =V max [S ]

K M[S ]

La courbe est caracterisée par deux paramètres de l'enzyme:

kcat

: sa pouvoir catalytique. (la

constante catalytique)K

M : sa affinité ( la constante de

Michaelis)

et leur rapport:k

cat/K

M : la constante de spéciticité


Un petit mot pratique:– Vitesse en chimie (Molaire par seconde)

– Vitesse en biochimie (Molaire par minute)

– Une unité d'activité enzymatique (U) est 1mole min-1 mesure de la quantité d'enzyme.

– Vitesse est en U l-1.

– Souvent nous connaissons les mg de protéine et pas les moles d'enzyme...

U (mg protéine)-1 est l'activité specifique.

U (μmole enzyme)-1 est kcat

(la constante catalytique)


Analyse de Briggs et Haldane (1925)

ES E+PE+Sk

+2

v = k2 [ES ][E totale] = [E ][ES ]

presumeuneetat dynamiquestabled [ES ]

dt= 0 = k1[E ] [S ]−k−1k2[ES ]

k+1

k-1



ES E+PE+Sk

+2

v =k2[E totale] [S ]

k−1k2

k1

[ S ]

k+1

k-1

V max = k2 [E totale ]

K M =k−1k

2

k1



ES E+PE+Sk

+2

k+1

k-1

Differentes suppositions (modèle) mais la meme resultat!!!Differente interpretation des paramètres...


v =V max [S ]

K M[S ]


Souvent les cinétiques enzymatiqes suivent l'equation de Michaelis et Menten.– k

cat : la constante catalytique souvent nommé

« turnover number », une mesure de la vitesse maximale de l'enzyme.

– KM : la constante de Michaelis, une mesure

d'affinité de l'enzyme pour sa substrat.

– kcat

/KM : la constante de spécificité.

Représentations graphiques

Pas pratique pour l'evaluation des paramétres K

M et V

max

sans un ordinateur...

v =V max [S ]

K M[S ]

v

[S]

KM

Vmax


Transformations linéaires– Lineweaver et Burk

v =V max [S ]

K M[S ]

1v=

1V max

K M

V max

×1[S ]

1/v

0 1/[S]

1/Vmax

-1/KM

pente KM/V

max


Transformations linéaires– Eadie et Hofstee

v =V max [S ]

K M[S ]

v = V max−K M×v[ S ]

v

v/[S]

Vmax

Vmax

/KM

pente -KM

Enzymes et métabolisme

Les réactions dans une cellule dependent des enzymes présentes.– Les enzymes accellerent des réactions.– Elles choisissent les réactions qui vont avoir lieu.

Régulation du Métabolisme

S'adapter ou mourir

Régulation du métabolisme

Les voies métaboliques sont fortement régulées

Toutes les différentes réactions sont coordonnées– Les cellules ne dégradent pas une substance dont

elles ont besoin!

Les enzymes qui accélèrent des réactions peuvent être arrêtés!


Les points de régulation sont des réactions hors équilibre.

Dans l'exemple que nous avons regardé il y en a 6.

La modification de l'activité de ces enzymes dans la cellule changera le flux métabolique.

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase

Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase



Régulation des réactions

Trois stratégies différentes...– Modifier les taux des enzymes (leur quantité)– Modifier l'activité des enzymes présentes (leur

vitesse)– Modifier l'accessibilité des enzymes.

Pas forcement une seule à la fois. Différentes méthodes s'opèrent à des vitesses

différentes.

Régulation des réactions

Variations des taux d'enzymes– Expression des gènes et dégradation des protéines.– Lente (une petite heure)

Variation de l'activité de l'enzyme– Modification chimique– Liaison d'un inhibiteur– Rapide (secondes)

Variation de l'accessibilité– Modification des transporteurs (leur taux ou leur activité).

Régulation de l'activité enzymatique

PhosphofructokinaseActivation du substrat

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase




CH2OPO

3

2-

HOHH

CH2OPO

3

2-

HO

OHOH

CCCC


CH2OH

HOHH

CH2OPO

3

2-

HO

OHOH

CCCC

ATP ADP


Taux des enzymesActivité des enzymesAccès aux substrats des enzymes

[Fructose-6-Phosphate]

Vite

sse

de r

éact

ion

[ATP]faible

[ATP]fort

Le substrat (ATP) est un inhibiteur




Vite

sse

de r

éact

ion

[ATP]+

[AMP]

[ATP]fort

Le AMP détruit cet effet.



OOPO

3

2-

CH2OH

2-O3POH

2C

H

H

H

OH

OH

Fructose 2,6 bis phosphate est un régulateur




Vite

sse

de r

éact

ion

[F26BP]faible

[F26BP]fort



Fructose-6-Phosphate

Fructose-2,6-bis Phosphate

Phosphofructokinase2

Pi

ATP ADP

H2O






Enz-P

Enz





Enz-P

Enz

Signal externe...






Enz-P

Enz Signal externe


Phosphofructokinase

ATP

AMP

ATP


Régulation par:● Énergie,● Substrats● Environnement

de la cellule




Enz-P

Enz Signal externe


Phosphofructokinase

ATP

AMP

ATP

Régulation des taux d'enzyme

Dans la levure : plusieurs transporteurs...

– HXT1-17– GAL2– SNF3– RGT2

De la famille MFS (Major facilitator superfamilly)

Saccharomyces très riche en transporteurs MFS.


Régulation d'un transporteur passif!

Transport passif mais hors-équilibre.

Système de régulation complexe des multiples transporteurs

– Régulation transcriptionelle des gènes.

– Régulation de l'activité– Régulation de la stabilité.

Import HXT1/2

Hexokinase


Phosphofructokinase

Aldolase





Enolase

Pyruvate Kinase




HXT1 transporteur à basse affinité (100mM)

HXT3 transporteur à moyenne affinité (50mM)

HXT2,6 et 7 transporteurs à haute affinité (1-2mM)

HXT4 transporteur à moyenne affinité (10mM).

Les autres? HXT2,6 et 7

HXT4

HXT3HXT1

Signalisation et biochimie cellulaire

Comment sentir l'extérieur

Signalisation et régulation

HXT1 transporteur à basse affinité (100mM)

HXT3 transporteur à moyenne affinité (50mM)

HXT2,6 et 7 transporteurs à haute affinité (1-2mM)

HXT4 transporteur à moyenne affinité (10mM).

Les autres? HXT2,6 et 7

HXT4

HXT3HXT1


Plusieurs voies de régulation et de signalisation chevauchantes... c'est complexe.

– Induction de gènes par le glucose (Rgt1)

– Répression de gènes par le glucose (Mig1)

– Régulation globale par le glucose (Gpr1)

Voie de Rgt1

Rgt1 est un répresseur de transcription qui est actif sans glucose.

Elle a besoin de deux autres molecules pour bien lier à l'ADN– Mth1– Std1

Rgt1

CGGANNA

Mth1 Std1

hxt1-4

Voie de Rgt1

Rgt1 est un répresseur avec Mth1 et Std1.

Deux des « transporteurs » de glucose Rgt2 et Snf3 sont des détécteurs/senseurs.

Les senseurs ont également une affinité pour Mth1 et Std1

Les senseurs s'associent avec une protéine kinase Yck1 ou Yck2.

Rgt1

CGGANNA

Mth1 Std1

hxt1-4

Rgt2Snf3

Mth1 Std1Yck1/2

Voie de Rgt1

En présence de glucose...– Les senseurs Snf3/Rgt2

activent la kinase Yck1/2– La kinase phosphoryle

Mth1 et Std1.– Les formes phosphorylées

ne se lient plus ni à Rgt1 ni aux senseurs (Snf3/Rgt2).

– Rgt1 ne lie plus l'ADN et les gènes (hxt1-4 incluses) sont induit.

Rgt1

CGGANNA hxt1-4

Rgt2Snf3

Mth1

Std1

Yck1/2

P

P

Voie de Rgt1

De plus, pour rendre le tout « irréversible » les formes phosphorylées de Std1 et Mth1 sont prises en charge par Grr1 qui les envoi pour etre ubiquitinylées et dégradées

Rgt1

CGGANNA hxt1-4

Rgt2Snf3

Mth1

Std1

Yck1/2

PPGrr1

Voie de Rgt1

GlucoseSnf3Rgt1

Yck1Yck2

Std1-PMth1-P

Std1Mth1

Grr1

Rgt1hxt1hxt2hxt3hxt4

Voie de Mig1

Mig1 est un represseur de transcription actif que en présence de glucose.

Il ne se lie à l'ADN que en présence de co-represseur– Med8 ou– Hxk2 (Hexokinase 2)

dimerique. Mig1hxt2/4Med8

Hxk2 Hxk2

Voie de Mig1

Mig1 est un represseur de transcription actif que en presence de glucose.

Hxk2 existe sous deux formes:– un monomère phosphorylé

et actif et – un dimère dephosphorylé,

inactif qui peut entrer dans le noyau.

Mig1hxt2/4Med8

Hxk2 Hxk2

?

Hxk2Hxk2

Hxk2 P

?

Voie de Mig1

Mig1 peut egalement etre phosphorylé par Snf1

Mig1hxt2/4Med8

Hxk2 Hxk2

?

Mig1P

Mig1

?

Snf1

Voie de Mig1

Mig1 est un represseur de transcription actif que en presence de glucose.

Hxk2 existe sous deux formes:– un monomère phosphorylé

et actif et – un dimère dephosphorylé,

inactif qui peut entrer dans le noyau.

Mig1hxt2/4Med8

Hxk2 Hxk2

?

Hxk2Hxk2

Hxk2 P

Voie de Rgt1 et Mig1

GlucoseSnf3Rgt1

Yck1Yck2

Std1-PMth1-P

Std1Mth1

Grr1

Rgt1hxt1hxt2hxt3hxt4

Mig1

Med8(Hxk2)

2

Snf1

Mig1-P

Hxk2-P

?

?

Régulation par glucose externe

Signalisation du glucose– Détecteur– Transmission du signal– Effecteurs

Dans la levure il existe un système de détection de glucose

– en plus de celui déjà vu– même en absence du

métabolisme.

Glucose

Levure

Stockage desGlucides

Résistance au stress

Croissance

Diffférentiation

Longeur de vie

Grr1Rgt1Mig1 Tpk123

Voie de Gpr1

Tpk est la protéine kinase A (PKA) un point central a la régulation cellulaire.

Aussi beaucoupd'autres effets.




Enz-P

Enz Tpk1/2/3


Phosphofructokinase

ATP

AMP

ATP

Voie de Gpr1

Gpr1 est un RCPG (récepteur couplé aux protéines G.)

Il active l'adénylate cyclase Cyr1

Qui produit un second messager AMPcyclique.

Qui active le PKA.

cAMP

Gpr1Cyr1

Tpk1

PFK2

Voie de Gpr1

Intégré avec autres voies de signalisation...

PKA/Tpk1-2-3 ont plusieurs différents substrats.

cAMP

Gpr1Cyr1

Tpk1

PFK2

Ras1/2

Métabolisme et Régulation

Régulation a plusieurs niveaux:– Gènes– Protéines– Métabolites.

La régulation est un processus dynamique.

Régulation par plusieurs facteurs:– Interieur– Extérieur.

Points spécifiques de régulation.

Importance de la signalisation.

biochimie 2 – introduction -...

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