Biocatalyse

M2 BOBI 2008-2009

Plan du cours

Introduction à la biocatalyseCatalyse acide/base (protéines à Zinc)Réactivité de O2 en (bio)catalyseFixation de O2 (protéines à Fer et Cuivre)Activité « oxygénase » des protéines à FerActivité « oxydase » et « oxygénase » des protéines à Fer et Cuivre

Introduction à la BiocatalyseI. Introduction

II. Pré-organisation des enzymesIII. III. Métaux et biocatalyse

I. Introduction

+ faible, + réaction facileQuand < énergie thermique à une température donnée, réaction spontanée

Coordonnée de réaction

Energie d’activation

Etat de transitionEnergie

ΔrG°

Un catalyseur va …

Être non consomméRendre possible une réaction:

Oxydation du méthane en méthanol par la Méthane Monooxygénase

Accélèrer une réaction:Hydrolyse d’amides: k = 0.01 sHydrolyse d’amides: k = 0.01 s--11 sans enzyme, sans enzyme, 1000000 s1000000 s--11 avec Carboxypeptidaseavec Carboxypeptidase

Comment ?

Diminue l’énergie d’activationRevient à stabiliser l’état de transition

Coordonnée de réaction

Energie d’activation

Etat de transitionEnergie

ΔrG°

Etat de transition

Rouge: Réaction catalysée

Catalyse par des enzymesPré-organisation du site actif: plus complémentaire avec l’état de transition qu’avec le substrat initial

Coordonnée de réaction

Energie Etat de transition

Site actif

‡

Forte affinité

Pour une catalyse efficace

Très complémentaire

Faible affinité

Structure tridimensionnelle des enzymesStructure tridimensionnelle des enzymes

Substrat

Etat de transition

Produit

II. Préorganisation des enzymes (protéines)

Amino-acides connectés par des liens amides

Résidus R vont jouer un rôle primordial dans:Solubilité, interactions entre biomolécules (Balance hydrophile / lipophile)Stabilité de la structure, fixation du substrat(Liaisons H ou hydrophobe, ponts S-S)Catalyse acide / baseCoordination de métaux

Structure des protéines

Primaire: séquence d’acides aminés

Secondaire: repliement de régions de protéines

• Hélices α:Ala, Glu, Leu, Met, Pro, Gly, Tyr, Ser

Structure des protéines

Secondaire: repliement de régions de protéines• Feuillets β:Val, Leu, Ile, Trp, Tyr, Thr, Phe

Structure des protéines

Structure tertiaire: forme de la protéine entière

Structure quaternaire: Résulte de l’interaction entre plusieurs sous-unités. Responsable de l’allostérie de l’hémoglobine par ex.

Ex de structure quaternaire

Assemblage permettant l’allostérie

Site actifLà où la réaction catalytique a lieuDomaine très restreint de la protéine

Site actif: réaction catalytique

Enveloppe protéique: Stabilité, régulation, allostérie, fixation de cofacteurs, interaction avec d’autres biomolécules

III. Métaux et biocatalyse

Acidité de Lewis: Facilitent les réactions acide-baseMultiples degrés rédox accessibles: Facilitent les réactions rédoxActivation par coordination: Facilitent le transfert d’atomes ou de groupements

Métaux omniprésents car la plupart des grandes réactions biochimiques peuvent être facilitées !!!

Concentration en métaux au niveau cellulaire

Nb atome / Cellule(E. Coli)

Concentration

Log

8

6

4

2

0Mg K Fe Zn Ca V,Cr,Mn,Co,

Ni,Cu,As,Se,Mo

LogC

-1

-2

-3

-4

-5

Mg,K Ca Fe,Zn-6

Cu,V,Cr,Mn,Co,Ni,Cu,As,Se,Mo

Cellule

Milieu de culture

Rôles biochimiques des métaux:

Structure (protéines, ADN, os): Ca, Zn, MgTransfert d’information, maintien de pression osmotique: Na, K, CaCatalyse acide-base: Zn, MgTransfert d’électrons: Fe, Cu, Mn, Mo, W, V, Co, NiTransport d’O2 (Fe, Cu) et fixation de N2 (Fe, Mo, V)

Rôles biochimiques des métaux:

Structure (protéines, ADN, os): Ca, Zn, MgTransfert d’information, maintien de pression osmotique: Na, K, CaCatalyse acide-base: Zn, MgTransfert d’électrons: Fe, Cu, Mn, Mo, W, V, Co, NiTransport d’O2 (Fe, Cu) et fixation de N2 (Fe, Mo, V)

LogC

-1

-2

-3

-4

-5

Mg,K Ca Fe,Zn-6

Cu,V,Cr,Mn,Co,Ni,Cu,As,Se,Mo

Cellule

La nature a sélectionné des métaux:

Abondance dans la croûte terrestre:Si: 2.8x105

Fe: 5x104

Ca: 3.6x104

Na: 2.8x104

K: 2.6x104

Mg: 2.1x104

Mn: 950V: 135Cr: 100Ni: 75Zn: 70Cu: 55Co: 25

Rem: Soulignés = métaux rédox actifs en bio

AbondantsSinon coût énergétique

La nature a sélectionné des métaux

AbondantsSinon coût énergétique

Plutôt labiles (Cr rare en bio)Réactions facilitées au niveau des sites actifs de métalloprotéines

Dont les complexes sont stables thermodynamiquement

Stabilité des biomolécules

Métaux les plus « universels » en biocatalyse: Fer et Cuivre

Fonction Fer CuivreTransport d’O2 Hémoglobine HémocyanineOxygénation Cytochrome P450 Tyrosinase

Catéchol dioxygénaseOxydase Hème peroxydase Amine oxydase

Peroxydase Galactose oxydaseTransfert d’électrons Cytochrome protéine « blue copper »Antioxydant Peroxydase Superoxyde dismutaseRéduction de nitrites Cytc nitrite réductase Cu nitrite réductase

Protéines à Fe et Cu ayant même fonction: Théorie de l’évolutionAdaptation du vivant à la présence d’oxygène: Fe2+ s’oxyde en Fe3+ qui

précipite et devient indisponible pour le vivant. Cu+ toxique s’oxyde en Cu2+

qui va être utilisé à la place du fer.

a- Acidité de Lewis

Comportement des ions métalliques dans l’eau:

H2O: base de Lewis Formation de complexes aquo M(H2O)n

z+

Effet du métal (acide de Lewis): Acidité des molécules d’eau coordinées augmenteEx: pKa Fe(H2O)6

3+ / Fe(H2O)5(OH)2+ = 2 !!Acidité augmente qd z augmente et r diminue

Propriétés générales des métaux

b- Propriétés rédox

En violet:Degrés d’oxydation courants en biologie

Effet de ligand sur le potentiel d’oxydation

Chargé négativement: Stabilise haut degré d’oxydationσ-donneur: Stabilise haut degré d’oxydationπ-accepteur: Stabilise bas degré d’oxydationEffet stérique !

Effet des ligands sur le potentiel d’oxydation

E° (Fe(H2O)63+ / Fe(H2O)6

2+) = 0.77 VE° (Fe(CN)6

3- / Fe(CN)64-) = 0.36 V

Explication:CN- est un meilleur ligand que H2O pour Fe3+

Degré +III du complexe favoriséPlus grand domaine de prédominance

EFeII FeIII

EFeII FeIII

H2O

CN-

Potentiels de métalloenzymes à Fe ou Cu catalysant des réactions rédox

En fonction du ligand tous les potentiels sont accessibles !!!En fonction du ligand tous les potentiels sont accessibles !!!

c- Sites actifs de métalloenzymesLe squelette protéique défini une sphère de coordination autour du métalNormalement un métal bien défini se fixeEffet de la seconde sphère de coordination souvent non négligeable

Première sphère: coordination directe (en rose)Deuxième sphère: acides aminés dans les feuillets b adjacents

Quel ligand pour quel métal ? Théorie HSAB

Hard

Soft

Cation Ligand

Liaison: dur-dur Caractère ioniquemou-mou Caractère covalent

d. Classes de ligands biologiques

Amino-acidesADN (phosphates)Sucres (hydroxyles)Cofacteurs, groupements prosthétiques (porphyrines …)Agrégats (ferritine)

d. Classes de ligands biologiques

Amino-acidesADN (phosphates)Sucres (hydroxyles)Cofacteurs, groupements prosthétiques (porphyrines …)Agrégats (ferritine)

d.1 Amino-acides

Coordination par les chaines latéralesH2N CHC

CH2

OHO

COH

O

H2N CHCCH2

OHO

SH

H2N CHCCH2

OHO

CH2COH

O

H2N CHCCH2

OHO

NNH

H2N CHCCH2

OHO

CH2CH2CH2NH2

H2N CHCCH2

OHO

OH

H2N CHCCH2

OHO

CH2SCH3

Hard

Soft

Cation Ligand

DurDur MouMou

pKa10.810.2 6.0

3.6 4.38.4

d.1 Amino-acides

Mode de coordination observé uniquement lorsque la biomolécule est flexibleRarement observé lorsque la protéine présente une structure tertiaire ou quaternaire

Cas particulier des oligopeptides: Complexationpar les N- d’amides déprotonés ou les carbonyles d’amides.

Le plus couramment rencontré: HèmeStructure dérivée du tétrapyrroleMétaux: essentiellement Fe (hémoglobine) et Mg (chlorophylle)

d.2 Groupements prosthétiques

Définition: groupe ou ligand fixant le métal et qui peut être enlevé (intact) de la protéine

HN

NNH

N

HN

NNH

N

COOOOC

Protoporphyrine IX

HN

NNH

N

COOOOC

O

HO

Hème a

HN

NNH

N

COOOOC

SS Cys

Cys

Hème c(lié de manière covalente

≠ prosthétique)

Cytochrome OxydaseCytochrome OxydaseCytochrome cCytochrome c

HémoglobineHémoglobine

PorphyrinesIon Rayon ionique (pm) Adéquation en tant que centre

métallique dans les tétrapyrrole

Réactivité des protéines à fer héminique(les plus courantes)

L’environnement protéique (ionisation)Le type d’hèmeLe métal, son degré rédox, son spin

Réactivité dictée par:

HN

NNH

N

COOOOC

Protoporphyrine IX

N

NN

N

COOOOC

Fe

HisHis de l’hémoglobinede l’hémoglobine

Fixation de la porphyrine à la protéine

Nécessite que la porphyrine soit métallée

Ferrochelatase+ Fe2+, - 2 H+

Hème

d.3 Autres modes de coordination (moins intéressants en catalyse)

Coordination avec des sucres:

ADN:Cœur minéral