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BIO-CONJUGAISON DE LA FIBRONECTINE SUR SURFACE DE TÉFLON POUR APPLICATIONS DANS LE
DOMAINE VASCULAIRE
Mémoire
Michaël Byad
Maîtrise en génie des matériaux et de la métallurgie
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Michaël Byad, 2016
BIO-CONJUGAISON DE LA FIBRONECTINE SUR SURFACE DE TÉFLON POUR APPLICATIONS DANS LE
DOMAINE VASCULAIRE
Mémoire
Michaël Byad
Sous la direction de :
Gaétan Laroche, directeur ou directrice de recherche
iii
Résumé
Depuis trente ans, des efforts ont été menés dans le domaine de l'ingénierie des
matériaux afin de concevoir des appareils médicaux pouvant être en contact avec les
tissus humains. Néanmoins l'interaction entre la surface du matériau et
l'environnement physiologique entraine la plupart du temps des complications. Le
laboratoire d'ingénierie des surfaces est spécialisé dans l'élaboration de surfaces
biomimétiques capables d'interagir de manière proactive avec leur environnement.
Pour des applications cardiovasculaires, une des stratégies consiste à utiliser des
protéines de la matrice extracellulaire, comme la fibronectine, connue pour la
promotion de l'adhésion des cellules endothéliales. Dans ce contexte, parce que la
bioactivité de la fibronectine est fortement liée à sa conformation, l'objectif est de
comparer différentes stratégies d'immobilisation en caractérisant la quantité de
fibronectine immobilisée ainsi que son activité biologique. Les précédentes études
menées au laboratoire ont souligné le fait que la fibronectine immobilisée par les
cystéines présente une meilleur bioactivité que lorsque celle-ci est immobilisée par
les groupements lysines qu'elle contient. L'actuel projet porte sur l'étude de l'influence
de l'utilisation d'un bras d'ancrage hydrophile ou hydrophobe entre la protéine et la
surface sur la bioactivité de la protéine. Les résultats ont d'une part montré l'efficacité
des bras d'ancrage dans l'immobilisation de la fibronectine et d'autre part les limites
de leur utilisation pour une étude comparative portant sur la quantification et la
bioactivité de la protéine.
iv
Table des matières
Résumé ....................................................................................................................... iii
Table des matières ...................................................................................................... iv
Liste des tableaux ...................................................................................................... vii
Liste des figures ........................................................................................................ viii
Liste des abréviations ................................................................................................... x
Remerciements .......................................................................................................... xii
Avant-Propos ............................................................................................................. xiii
Introduction .................................................................................................................. 1
1. CHAPITRE 1 : Revue de littérature et hypothèse ................................................ 3
1.1. Historique des biomatériaux ........................................................................... 3
1.2. Biocompatibilité des biomatériaux synthétiques ............................................. 5
1.2.1. Réponses biologiques à l'implantation d'un biomatériau synthétique. ..... 5
1.2.2. Rôle de l'eau dans la biocompatibilité ...................................................... 7
1.3. Stratégies pour améliorer la compatibilité au sang des matériaux synthétiques ............................................................................................................. 7
1.3.1. Polymères en contact avec le sang ......................................................... 8
1.4. Modifications de surface des biomatériaux pour améliorer la compatibilité au sang 14
1.4.1. Endothélialisation des prothèses artérielles synthétiques ...................... 14
1.4.2. Immobilisation de biomolécule ............................................................... 17
1.5. Techniques de modification de surface ........................................................ 23
1.5.2. Traitement plasma ................................................................................. 26
1.5.3. Revêtement ........................................................................................... 29
1.5.4. Auto-assemblage (SAMS) ..................................................................... 29
1.5.5. Polymérisation radicalaire par transfert d'atome initié par la surface ..... 30
v
1.6. Techniques de caractérisation ..................................................................... 30
1.6.1. Méthode de spectroscopie ..................................................................... 30
1.6.2. Immunofluorescence ............................................................................. 32
1.6.3. Angle de contact .................................................................................... 36
1.7. Hypothèses, défis et approches ................................................................... 37
1.7.1. Fonction d’adhésion cellulaire de la fibronectine ................................... 38
1.7.2. Conformation et bioactivité .................................................................... 39
1.7.3. NH-ester ................................................................................................ 40
1.7.4. Maléimide .............................................................................................. 41
1.7.5. Sélection des Bras d'ancrage d’ancrage ................................................ 41
1.7.6. Amination du PTFE par traitement plasma ............................................ 43
1.7.7. Choix de l’ELISA indirecte ..................................................................... 43
1.7.8. Sélection des anticorps pour cibler la fibronectine ................................. 43
2. CHAPITRE 2: Matériels et méthodes expérimentales ........................................ 46
2.1. Matériels ....................................................................................................... 46
2.2. Méthodes ..................................................................................................... 47
2.2.1. Techniques de modification de surface et préparation des échantillons 47
2.2.2. Techniques de caractérisation ............................................................... 48
3. CHAPITRE 3: Résultats et Discussion ............................................................... 51
3.1. Analyse XPS des différentes étapes de fonctionnalisation du PTFE ........... 51
3.1.1. Étude de la fonctionnalisation du PTFE par plasma .............................. 51
3.1.2. Greffage de la fibronectine sur le PTFE par le Sulfo-KMUS .................. 52
3.1.3. Greffage de la fibronectine sur le PTFE par le SM(PEG) 2 .................... 57
3.2. Résultats angles de contact ......................................................................... 60
3.3. Résultats ELISA ........................................................................................... 61
vi
Conclusion ................................................................................................................. 65
Bibliographie .............................................................................................................. 67
vii
Liste des tableaux
Tableau 1 : Médiateurs chimiques provenant du plasma sanguin et intervenant dans la réponse biologique ................................................................................................. 6
Tableau 2 : Tableau de résultats pour les analyses d'échantillon par la mesure d'angle de contact ..................................................................................................... 60
viii
Liste des figures
Figure 1 Structure d'une artère ................................................................................. 15
Figure 2 Schéma représentant l'endothélisation d'une prothèse artérielle à base PTFE ......................................................................................................................... 16
Figure 3 schéma de fonctionnalisation de la surface d'un biomatériau par l’intermédiaire d’un bras d’ancrage ........................................................................... 24
Figure 4 Type de modification de surface par traitement plasma pour les polymères 27
Figure 5 : schéma représentant le dispositif instrumental pour effectuer un traitement plasma ...................................................................................................................... 29
Figure 6 Schéma représentant les étapes du fonctionnement d'un XPS ainsi que les différents types de donnée acquise à l'issue d'une analyse ..................................... 31
Figure 7 Représentation schématique de la structure d'un anticorps ........................ 33
Figure 8: Schéma des différents types d'ELISA ....................................................... 36
Figure 9 Représentation des angles de contact par dépôt de liquide sur une surface solide lisse et homogène .......................................................................................... 36
Figure 10 Schéma de la structure de la fibronectine, de ces domaines destinés à l'adhésion cellulaire ou de biomolécules .................................................................. 39
Figure 11 Réaction entre le NHS ester et une amine primaire .................................. 41
Figure 12 Réaction entre le groupement maléimide et un groupement sulfhydryle ... 41
Figure 13 : Structure du Sulfo-KMUS ........................................................................ 42
Figure 14 : Structure du SM(PEG)2 ........................................................................... 42
Figure 15: Schéma réactionnel de la production de résorufine à partir de l'amplex red en présence de l'HRP et de H2O2 .............................................................................. 44
Figure 16: Spectre d'émission et d'excitation de la résorufine .................................. 45
Figure 17 Spectre XPS de survol pour les échantillons de PTFE et de PTFE traité par plasma avant et après dérivation chimique ............................................................... 52
Figure 18 Spectres de survol obtenus pour les différentes étapes de fonctionnalisation avec le Sulfo-KMUS ...................................................................... 54
ix
Figure 19 Spectres haute résolution C1s a) échantillon de PTFE après traitement plasma b) échantillon PTFE avec le Sulfo-KMUS c) échantillon PTFE avec le Sulfo-KMUS et la fibronectine ............................................................................................. 56
Figure 20 Spectres haute résolution C1s a) échantillon de PTFE après traitement plasma b) échantillon PTFE avec le SM(PEG)2 c) échantillon PTFE avec le SM(PEG)2 et la fibronectine ...................................................................................... 58
Figure 21: Domaine linéaire de la courbe de calibration ........................................... 61
Figure 22: ELISA avec des anticorps primaires polyclonaux (FnA représente la fibronectine adsorbée, FnG représente la fibronectine greffée) ................................ 62
Figure 23: ELISA avec des anticorps primaires monoclonaux (FnA représente la fibronectine adsorbée, FnG représente la fibronectine greffée) ................................ 63
x
Liste des abréviations
ARN : acide ribonucléïque
ECM : matrice extra cellulaire
EGF : facteur de croissance épidermique
ELISA : méthode immuno-enzymatique sur support solide
ePTFE : PTFE expansé
FGF : facteur de croissance des fibroblastes
FN : fibronectine
FXIIA : facteur activé de Hageman
GAG : Glycosaminoglycanes
Ig : immunoglobuline
KNEED : séquence petidique Lys-Asn-Glu-Glu-Asp
PDGF : facteur de croissance plaquettaire
PDMS : polydiméthylsiloxane
PEG : polyéthylène glycol
PES : polyéthersulfone
PET : polytéréphtalate d’éthylène
PLA : acide polylactique
PMMA : polyméthacrylate de méthyle
PP : polypropylène
PRTA-s : polymérisation radicalaire par transfert d’atome initié par la surface
PS : polystyrène
PTFE : polytétrafluoroéthylène
PU : polyuréthane
PVDF : Polyvinylidène fluoride
PVP : Polyvinylpyrrolidone
xi
PHSRN : séquence peptidique Pro-His-Ser-Arg-Asn
REDV : séquence peptidique Arg-Glu-Asp-Val
RGD : séquence peptidique Arg-Gly-Asp
SMC : cellule musculaire lisse
SM(PEG)2 : succinimidyl-[(N-maléimidopropionamido)-diéthylèneglycol] ester
Sulfo-KMUS : N-κ-maléimidoundécanoyl-oxysulfosuccinimide ester
TGF : facteur de croissance transformant
tPA : activateur du plasminogène
VEGF : facteur de croissance des cellules endothéliales vasculaires
XPS : spectroscopie photoélectronique par rayons X
xii
Remerciements
Je souhaite en premier lieu remercier le professeur Gaétan Laroche de l’université
Laval pour m’avoir proposé ce projet, ses conseils scientifiques ainsi que pour la
liberté accordée pour conduire ce projet.
Je remercie aussi le professeur Lee de l’université Dalhousie pour son aide et sa
supervision.
Je remercie les professionnelles de recherche Andrée Anne Guay Bégin et Pascale
Chevallier pour leurs conseils scientifiques ainsi que leur contribution respective au
niveau expérimental. Ce projet n’aurait pas pu être mené à terme sans leur aide. Je
tiens à remercier Corinne Hoesli pour ses conseils concernant l’ELISA. Ainsi que tous
les collègues étudiants que j’ai pu côtoyer pendant mon projet de maitrise.
Je remercie aussi le CRSNG pour son support financier via le NSERC CREATE
Program on Regenerative Medicine.
xiii
Avant-Propos
L’auteur souhaite souligner la contribution des professionnels de recherche Andrée-
Anne Guay-Bégin et Pascale Chevallier du centre hospitalier universitaire de Québec,
Hôpital Saint François d’Assise, dans la réalisation de certaines étapes
expérimentales de ce projet. En effet, la préparation et la fonctionnalisation des
échantillons de PTFE destiné à être analysés en utilisant la méthode des ELISA ainsi
que les tests ELISA ont été réalisés par leur intermédiaire. De plus, les tests XPS ont
été conduits par ces professionnels. Les autres étapes expérimentales exposées
dans ce mémoire de maîtrise ont été réalisées par l’auteur.
1
Introduction
L’objectif de ce projet de maîtrise est de proposer une amélioration de la
compatibilité au sang des prothèses vasculaires à base de PTFE. Ces prothèses
sont à l’heure actuelle utilisées avec succès pour remplacer les vaisseaux artériels de
grand diamètre. Cependant le succès est relatif en ce qui concerne les prothèses de
faible ou moyen diamètre car pour ce type de prothèse l’hydrophobicité inhérente à la
surface du PTFE favorise la formation de thrombus artériel et réduit conséquemment
leur efficacité. En effet, l'hydrophobicité de surface du PTFE induit une adsorption de
protéines retrouvées dans le plasma sanguin. De nombreuses études portent
actuellement sur la génération de tissus pouvant remplacer les artères
endommagées. Même si ce domaine a connu de significatives avancées ces
dernières années, les problématiques liées aux propriétés mécaniques ainsi qu’à la
biocompatibilité de ces matériaux générés par ingénierie tissulaire constituent un frein
à leur implantation chez le patient. Les matériaux synthétiques à base de PET ou de
PTFE, de par leur faible coût et la facilité de les manipuler, représentent à ce jour
l’alternative la plus efficace pour remplacer les vaisseaux sanguins derrière
l’intervention de type autologue. Il existe différentes façons d'améliorer la
compatibilité au sang des matériaux de type synthétique comme le PTFE faisant
intervenir des modifications physico-chimiques et biologiques. Ces modifications de
surface opérées sur les prothèses synthétiques comptent parmi les plus utilisées
l’immobilisation d’anticoagulant tel que l’héparine [1] ainsi que le recouvrement par
une monocouche de cellules endothéliales [2].
Le but est ici d’expérimenter de nouvelles directions concernant l’endothélialisation
de la surface du polymère nécessaire à une bonne compatibilité du matériau en
contact avec le sang par l’intermédiaire de l’immobilisation de protéine de la matrice
extracellulaire. Les différentes stratégies élaborées par le laboratoire d’ingénierie des
surfaces de l’Université Laval au cours des dernières années ont porté sur l’ancrage
d’une protéine en particulier à savoir la fibronectine. Il a été notamment démontré que
la nature chimique du type d’ancrage influence la qualité globale du procédé
2
d’endothélialisation. Cependant aucun travail à ce jour ne porte sur une étude
comparative concernant l'influence de l'utilisation de bras d'ancrage possédant la
même géométrie mais porteur d'une hydrophobicité différente a été réalisée. La
plupart des travaux faisant intervenir notamment l'adsorption physique de protéines
de la matrice extracellulaire. Le rôle de l’hydrophobicité de la surface est important
dans la façon dont la configuration des protéines immobilisées et promouvant
l’adhésion cellulaire va se présenter. Par conséquent ce paramètre va modifier la
qualité de l’endothélialisation du matériau. Le projet vise à démontrer qu’en
immobilisant la fibronectine sur PTFE par l’intermédiaire de deux types d’ancrage
covalent faisant intervenir deux degrés d’hydrophobicité différents, la bioactivité de
celle-ci va être modifiée. Ce mémoire de maîtrise s’organise sur trois chapitres
principaux. Le premier chapitre comporte une revue de littérature sur les différentes
stratégies existantes utilisées pour améliorer la compatibilité des matériaux
synthétiques. Dans un second temps le matériel et méthode et la troisième partie
sera consacré aux résultats ainsi qu’à la discussion.
3
1. CHAPITRE 1 : Revue de littérature et hypothèse
Dans cette revue de littérature, après avoir introduit et donné une définition des
biomatériaux, nous étudierons les concepts de biocompatibilité au sang des
matériaux de type polymère non dégradable ainsi que la relation entre la cellule et la
surface des matériaux. Dans un second temps, nous présentons quelles sont les
techniques permettant de promouvoir la compatibilité au sang de ces matériaux. Ce
chapitre se focalise la plupart du temps sur les polymères, néanmoins plusieurs
techniques présentées ici sont aussi utilisées pour améliorer d’autres matériaux qui
sont amenés à être en contact avec le sang tels que les métaux (stents) et
céramiques (verres bioactifs). Ensuite les techniques pour caractériser les
modifications de surfaces associées au champ des biomatériaux seront présentées.
Tout au long de ce chapitre, les stratégies employées lors de cette maitrise afin
d’améliorer l’hémocompatibilité des prothèses de PTFE lors de ce seront décrites.
Il est à noter que les études portant sur l’ingénierie tissulaire malgré leur grand
nombre, notamment en ce qui concerne l’utilisation de polymère dégradable ont été
volontairement mises de côté pour l’écriture de cette revue de littérature.
1.1. Historique des biomatériaux
Les premières traces retrouvées d'un matériau implanté dans un corps humain datent
d'il y a 9000 ans à peu près. Les premières sutures ont été pratiquées pour la
première fois il y a plusieurs milliers d'années. En 1829, les premières études sur la
bioréactivité des matériaux ont été menées en implantant divers métaux dans le
corps des chiens. Les conditions de corrosion et de dégradation de ces métaux ainsi
que la réaction des divers tissus organiques ont, dès lors, été étudiées. Le
développement des polymères à partir des années 40 vont amener les scientifiques à
s'interroger sur les possibles réactions liées à leur implantation dans le corps humain.
Les premières études ont lieux avec le nylon, le polyméthacrylate de méthyle
(PMMA) et le polytétrafluoroéthylène (PTFE). La curiosité des médecins et
4
chirurgiens pour l'utilisation des matériaux s'est développée pendant les deux guerres
mondiales. Lorsque la situation ne permet aucune alternative les chirurgiens héros
font preuve d'inventivité dans leurs actes chirurgicaux. Cette période voit ainsi
l'invention de nouveaux dispositifs médicaux. Cependant, l'encadrement par les
agences de contrôle gouvernementales a mis peu à peu fin à cette période de grande
créativité [3].
La première génération de biomatériaux s'est principalement focalisée sur la volonté
de créer des biomatériaux synthétiques bio-inertes [4]. Cette génération de
biomatériaux est à l'heure actuelle encore très utilisée. En effet, le PMMA est encore
utilisé pour les lentilles de contact. Par ailleurs, le PTFE et le polytéréphtalate
d’éthylène (PET) apparaissent encore comme la meilleure alternative dans le
remplacement des vaisseaux artériels malades. L'avantage des matériaux polymères
synthétiques étant leur faible coût de production ainsi que le peu de conditionnement
nécessaire, une stabilité structurelle avant leur implantation ainsi qu'une relative
facilité d'utilisation pour les chirurgiens lors des actes chirurgicaux.
La deuxième génération des biomatériaux est apparue après la découverte des
verres bioactifs par Clarke en 1990. Cette découverte a mis en évidence l'importance
de la structure du matériau dans le processus de régénération osseux. Ainsi le
matériau par son mimétisme structural a vocation à être actif dans le processus de
régénération d'un organe et non plus uniquement un matériau inerte
physiologiquement. Une grande partie de ces nouveaux matériaux visent donc à
l'intégration de fonction physiologique telle que l'ostéointégration ou l'adhésion
cellulaire. Il est souvent nécessaire que ces structures soient favorables à l'intégration
ou l'immobilisation d'agent physiologiques qui ont vocation soit de produire ou
régénérer un nouveau matériau 'naturel' ou d'assimiler un matériau synthétique.
Tout un pan de la recherche sur l'amélioration des prothèses vasculaires vise le
recrutement de cellules endothéliales sur la surface des biomatériaux déjà utilisés
tels que le PTFE. De même le relargage d'agents chimiques diminuant l'influence de
5
la prolifération des cellules musculaires lisses est une voie de recherche très
présente. La troisième génération de biomatériaux fait appel au génie tissulaire afin
de régénérer des organes. La recherche se porte alors à produire des matériaux à
base de matériaux biodégradables qui par leurs interactions avec des cellules
prélevées chez le patient vont laisser place à des organes naturels. Néanmoins il
existe des difficultés à régénérer des tissus/organes possédant les mêmes propriétés
mécaniques.
Les avancées de la médecine tout au long du 20ème siècle ont été associées au
progrès scientifique. Ainsi, l'imagerie médicale et les techniques telles que l'imagerie
à résonnance magnétique ont permis de redéfinir la pratique même de diagnostic
médical effectuée par les professionnels de santé. L'essor des nanotechnologies
depuis les 15 dernières années offre de nouvelles perspectives dans le monde
médical.
1.2. Biocompatibilité des biomatériaux synthétiques
La définition de la biocompatibilité énumérée par Williams en 1987 est l'habilité d'un
matériau à réagir de manière appropriée avec un environnement hôte et ce pour une
application spécifique [5]. En effet, la plupart des biomatériaux sont implantés dans le
corps et sont donc sujet à un contact prolongé avec l'environnement physiologique.
Idéalement, l'implantation est définitive car le matériau est reconnu et interagit avec
les éléments du corps humain comme le ferait un tissu normal. Ceci n'est que très
rarement le cas et la majorité des biomatériaux implantés doivent être remplacés à
partir d'une certaine durée. Les interventions chirurgicales sont de ce fait une
nouvelle contrainte appliquée à l'utilisation de ces biomatériaux. Ainsi, les
biomatériaux qui connaissent le meilleur succès en termes de biocompatibilité sont
les matériaux qui ne sont pas en contact prolongé avec un environnement
physiologique comme les lentilles oculaires.
1.2.1. Réponses biologiques à l'implantation d'un biomatériau synthétique.
6
Après l'implantation d'un matériau, dans le cadre d’un implant dans le système
vasculaire, une réponse biologique se développe liée à l'interaction entre le sang et le
matériau. Plusieurs revues de littérature ont, par le passé, décrit les différentes
réactions et étapes de cette réponse biologique [6–8]. En effet, le contact avec le
sang est responsable dans un premier temps de l'adsorption sur la surface de
protéines contenues dans le plasma sanguin ainsi que le dépôt de facteur de
coagulation et ce par un mécanisme combinant à la fois l'effet Vroman et un jeu
d'interactions hydrophobes et électrostatiques entre le matériau et le sang [8].
L'adsorption sur la surface de protéines telles que les glycoprotéines IIb-IIa,
fibrinogène, thrombine et le facteur de Von Willebrand favorise à la fois l'adhésion
plaquettaire et l'activation du complément. Une fois le complément activé, la
thrombose artérielle se propage par la libération d'éléments tels que la thromboxane
B2 et la β-thromboglobuline par les plaquettes sanguines.
Tableau 1 : médiateurs chimiques provenant du plasma sanguin et intervenant dans la réponse biologique (6)
Médiateurs Exemples Agents vasoactifs Histamine, sérotonine, adénosine, facteur relaxant dérivé endothélial,
prostacycline, endothéline, thromboxane a2 Protéases plasmatiques - Système kinine - - Système complément - - Coagulation/système
fibrinolytique
Bradykinine, Kallikreine C3a, C5a, C3b, C5b-C9 Produits de la dégradation de la fibrine, facteur activé de Hageman (FXIIA), activateur du plasminogène tissulaire (tPA)
Leucotriènes Leucotriène B4 (LTB4), acide hydroxyeicosatetranoïque (HETE) Protéases lysosomales Collagènase, élastase Radicaux libres dérivé de l’oxygène
H2O2, anion superoxyde, oxyde nitrique
Facteurs d’activation plaquettaire Lipides de la menbrane cellulaire Cytokines Interleukine-1 (IL-1), TNF Facteurs de croissance PDGF, facteur de croissance des fibroblastes (FGF), facteur de croissance
transformant (TGF-α ou TGF-β), facteurs de croissance épidermique (EGF)
Par ailleurs, l'adsorption sur la surface produit des changements en ce qui concerne
la composition biologique de cette interface dont le résultat est la mise en marche
d'une réponse biologique spécifique à la nature de cette interface. Cette interface a
été décrite comme une matrice de transition [9]. De même, des molécules permettant
7
l'adhésion cellulaire telles que la fibronectine et la thrombospondine sont retrouvées
dans ce nouvel environnement. La formation de caillot sanguin est l'une des
principales problématiques à résoudre pour améliorer la durée de vie des
biomatériaux qui sont en contact avec le sang. Ce phénomène est dû à la fois aux
réactions induites par l'agrégation des plaquettes sanguines mais aussi par la
coagulation du sang.
1.2.2. Rôle de l'eau dans la biocompatibilité
L'eau est un solvant retrouvé dans la majorité des environnements biologiques. Le
sang est composé de 45% en volume de molécules de sels et d'eau et contient 10%
de protéines [10]. L'une des premières interactions lors de l'implantation d'un
biomatériau a lieu avec les molécules d'eau [11].
Les matériaux ayant la meilleure résistance à l'adsorption protéique et de ce fait la
meilleure biocompatibilité présentent des propriétés de surface d'hydrophilicité. Les
molécules d'eau sont retenues ou liées sur la surface par des liaisons hydrogènes
pour les matériaux présentant des groupements chimiques hydrophiles à leur surface
ou par solvatation ionique pour les matériaux présentant des groupements chimiques
zwittérioniques et constituent ainsi une barrière physique et énergétique empêchant
l'adsorption protéique.
1.3. Stratégies pour améliorer la compatibilité au sang des matériaux synthétiques
Comme il est décrit dans 1.2.1, le contact avec le plasma sanguin lors de
l’implantation d’un matériau synthétique est le phénomène déclencheur de la réponse
biologique. Le plasma sanguin est composé d’une centaine de protéines différentes
parmi lesquelles l'albumine, les immunoglobulines et la fibronectine constituent 50%
des protéines contenues dans le plasma. Par ailleurs, le rôle d'une protéine comme la
fibronectine dans le processus d'agrégation plaquettaire a été identifié depuis de
nombreuses années [12]. L’adsorption des protéines issues du plasma sanguin sur la
8
surface du matériau va donc dans une certaine mesure réguler la formation de
thrombose.
Par conséquent, les propriétés de surface des matériaux en contact avec le sang
vont déterminer l’ampleur de la réponse biologique apportée par le plasma sanguin.
Ces propriétés sont la nature chimique de la surface, l'énergie libre de surface,
l'élasticité et la topographie. De plus, ces propriétés vont réguler et moduler
l'interaction avec les cellules [9]. L’une des stratégies élémentaires employées afin
d’améliorer la compatibilité au sang des biomatériaux synthétiques est de coordonner
le choix du polymère avec les contraintes imposées (mécaniques ou physico-
chimique) par l’environnement d’accueil. Cette partie présente donc les divers
polymères utilisés pour fabriquer des matériaux destinés à être en contact avec le
sang durant leur implantation ou utilisation.
1.3.1. Polymères en contact avec le sang
Historiquement, les biomatériaux fabriqués à partir de polymère sont les premiers à
avoir présenté des résultats positifs en ce qui concerne l’implantation dans le corps
humain. La maîtrise et le contrôle de la synthèse des polymères permettent une
grande marge de manœuvre dans le contrôle des propriétés physico-chimiques et
mécaniques du biomatériau désiré. La plupart des matériaux synthétiques utilisés
pour des applications biomédicales sont sélectionnés pour leur neutralité chimique et
biologique ainsi que pour leur stabilité mécanique. Leur nature physico chimique et
leur stabilité structurale peuvent aussi servir à réaliser des modifications pour rendre
leur surface bioactive [13].
1.3.1.1. Polyéthersulfone (PES)
Le PES est utilisé pour les membranes servant pour l'hémodialyse, la filtration et les
bioréacteurs [14–16]. Il s'agit d'un polymère qui possède une bonne résistance
chimique, stabilité thermique et hydrolytique et des bonnes propriétés mécaniques
[17,18]. Néanmoins lorsque ce polymère est utilisé pour des applications qui
9
induisent un contact avec le sang, il est nécessaire de modifier sa surface afin d'éviter
la coagulation sanguine [19].
1.3.1.2. Polyéthylène téréphtalate (PET)
Le PET est utilisé en tant que matériau pour la suture ainsi que pour les prothèses
artérielles (DACRON®) et les prothèses ligamentaires dû à sa bonne biocompatibilité,
son inertie chimique et ses propriétés mécaniques [20–22]. Il présente néanmoins
une certaine hydrophobicité de surface qui lui empêche d’inhiber l’adsorption
protéique, caractéristique que ce matériau partage avec le PTFE. Roll et al. ont, par
ailleurs, publié une intéressante revue de littérature portant sur l’étude comparative
entre le PTFE et le PET dans l'efficacité de l’implantation des pontages [23].
1.3.1.3. Polytétrafluoroéthylène (PTFE)
Le PTFE ou polytétrafluoroéthylène est aussi appelé TEFLON® dans sa dénomination
commerciale. Il a été découvert en 1938 chez Dupont. Il s’agit d’un fluoropolymère
semi-cristallin de formule (-CF2-)n possédant une basse température de transition
vitreuse (-70°C) Il est connu pour sa stabilité thermique avec un haut point de fusion
ainsi que pour son hydrophobicité. La structure en hélice de sa chaîne principale
confère au PTFE d’excellentes propriétés lubrifiantes [24]. La taille importante du
rayon atomique des atomes de fluor rend difficile d’accès les liaisons carbonées par
d’éventuel réactant [25]. Il possède donc une grande résistance aux solvants
chimiques tels que les acides forts. Ce polymère est notamment très utilisé en tant
que revêtement permettant d’éviter l’adhésion d’agent biologique que ce soit dans les
outils de cuisine, les structures architecturales ainsi que les appareils biomédicaux.
Ses propriétés mécaniques en font aussi un matériau très utilisé pour l’étanchéité des
structures.
La version dite expansée (ePTFE), qui a été découverte en 1969, est utilisé pour les
prothèses artérielles [26]. Sa production nécessite des conditions différentes au
niveau de la phase d'extrusion du polymère. L'expansion du PTFE initiale est réalisée
par l'intermédiaire de traction uniaxiale ou biaxiale. Cette version présente des
10
caractéristiques améliorées en ce qui concerne sa porosité permettant de lui conférer
une meilleure imperméabilité envers les bactéries. De plus, il s'agit d'un matériau plus
léger et ayant de meilleures propriétés de fluage par rapport au PTFE. Le PTFE est
un polymère qui peut être utilisé aux côtés du PET pour fabriquer des prothèses
artérielles. Néanmoins l'utilisation des prothèses artérielles à base de PTFE expansé
reste moins efficace que les greffons de type autologue [27]. Sa structure
microporeuse ainsi que sa grande flexibilité, sa résistance aux compressions en font
un matériau adapté pour les sutures. Néanmoins la surface du matériau induit la
formation de thrombose sur le long terme notamment en ce qui concerne les
prothèses de faible diamètre [28]. En effet sa faible énergie de surface est
responsable de son caractère hydrophobe ce qui est problématique dans son
utilisation pour les prothèses artérielles car il n’empêche pas l’adsorption et
l’attachement des protéines issues du plasma sanguin [29]. Plusieurs stratégies ont
été développés sur le PTFE afin de promouvoir l'adhésion de cellule endothéliale sur
sa surface et de réduire ainsi l'adsorption protéique et l'agrégation plaquettaire [30–
36].
11
1.3.1.4. Polydiméthylsiloxane (PDMS)
Parmi les polymères présentant des propriétés antiadhésives et élastiques, il y a le
PDMS [37]. La structure du PDMS permet de modifier les propriétés mécaniques et
structurales du matériau facilement en utilisant la synthèse de block copolymère et en
alternant les unités molles et dures. Le PDMS possède des propriétés hydrophobes
qui cependant ne permettent pas d'éviter l'adhésion des protéines sur sa surface [38].
De plus, la mobilité des chaines intrinsèques vers la surface fait du PDMS un
matériau compliqué à modifier par traitement plasma. Des méthodes alternatives
existent cependant comme les modifications par auto assemblage couche par couche
ou l'étirement de la surface durant le traitement [39].
1.3.1.5. Polyvinylpyrrolidone (PVP)
Le PVP expose des propriétés hydrophiles, antiadhésives, une bonne solubilité dans
l'eau, non toxique et biocompatible. Il est utilisé notamment en tant que substitut du
plasma sanguin, cosmétique, additif, pour le revêtement des biomatériaux [40,41].
Depuis récemment, ce polymère est utilisé pour améliorer l'hémocompatibilité des
membranes à base de PES [41].
1.3.1.6. Polyvinylidène fluoride (PVDF)
Comme le PTFE, il s'agit d'un fluoropolymère qui présente une bonne stabilité
thermique, une bonne résistance chimique ainsi qu'une forte hydrophobicité [42]. Par
ses propriétés intrinsèques, sa surface peut être fonctionnalisée par traitement
plasma, chimique, par irradiation ou ozone [43].
1.3.1.7. Polystyrène
La modification du polystyrène pour améliorer sa compatibilité au sang peut être
réalisée par un traitement plasma [44]. Le polystyrène est aussi utilisé en tant que
substrat pour la culture cellulaire [45]. Tsai et al. ont utilisé ce polymère qui possède
de très bonnes propriétés hydrophobes afin d’étudier le rôle de l’adsorption du
12
fibrinogène dans la médiation de l’adhésion plaquettaire provoquée par le contact
avec le sang [46].
1.3.1.8. Polyéthylène glycol (PEG)
Le polyéthylèneglycol est un polymère qui est souvent utilisé pour ses facultés à
interagir avec l'eau. Bien qu’il ne soit pas utilisé directement en tant que biomatériau
pouvant se substituer à des organes ou à des tissus endommagés, il peut servir
d’interface entre le matériau et des molécules biologiques. Il est ainsi soluble dans
l'eau et peut être immobilisé sur la surface d'appareils biomédicaux car il possède
une très faible énergie d'interface avec l'eau. Dès lors, la surface des polymères
initialement hydrophobe devient hydrophile. Cette compatibilité avec l'eau est due
notamment au fait que lors du mélange du PEG dans l'eau, l'entropie du mélange
diminue. De plus, la structure du PEG et le positionnement de ses atomes d'oxygène
dans sa structure cristalline possèdent une grande similarité avec la distance et
l'organisation des atomes d'oxygène dans l'eau [47]. En condition aqueuse, le PEG
forme un réseau intramoléculaire qui contient la molécule d'eau et rend ainsi
complexe l'accès à la surface des protéines [13]. De ce fait, l'utilisation du PEG réduit
considérablement l'adsorption protéique sur une surface [48] et améliorer la
compatibilité au sang [49].
Ce polymère est aussi utilisé comme partie de molécules chimiques mono ou
bifonctionnelles qui peuvent se lier à des protéines. On parle alors de conjugaison
biologique [50]. La densité du PEG [51] ainsi que sa longueur de chaine, l'orientation
et la conformation du polyéthylène glycol influencent grandement l'adsorption
protéique [52]. Par ailleurs, il est difficile de réaliser un grand recouvrement de la
surface car les premières molécules immobilisées constituent une gêne stérique pour
l'accès d'autres molécules [53]. Baraymoglu et al ont démontré que l'activité des
protéines ou enzymes immobilisées pouvait être favorisée par la conjugaison avec le
PEG [54].
13
1.3.1.9. Polyuréthane
De par ses propriétés élastiques et dégradables qui peuvent être maitrisées, il s'agit
d'un polymère qui est souvent utilisé pour la réalisation d'échafaudage en ingénierie
tissulaire pour le remplacement des vaisseaux sanguins [55–57]. Son utilisation est
très répandu dans les systèmes d'administration des médicaments [58] mais aussi
pour les valves cardiaques artificiels [59]. Des nanofibres de polyuréthane peuvent
être utilisées afin de créer des prothèses artérielles présentant des bonnes propriétés
de biocompatibilité [60,61]. Ainsi suivant la composition chimique du polyuréthane, la
durée de dégradation du polymère peut être contrôlée par la présence en plus ou
moins grande quantité de liaisons ester. Ces liaisons étant susceptibles d'être
hydrolysées. La présence de segments polyéther dans le polymère le rend sensible à
la dégradation par oxydation alors que les associations entre polycarbonate et
polyuréthane vont rendre le matériau sensible à la dégradation du type hydrolytique
[56].
Certaines études visent à fabriquer des réseaux 3D poreux à base de polyuréthane
pouvant par la suite relarguer des protéines de la matrice extracellulaire telle que la
fibronectine [62]. Il possède une bonne biocompatibilité et ses propriétés mécaniques
peuvent être aisément adaptées aux types d'utilisation recherchées. Néanmoins, le
polyuréthane, lors d'un contact prolongé avec le sang, est susceptible de permettre le
développement de thrombose artérielle [56]. De nombreuses études ont mis en avant
pour l'amélioration de l'hémocompatibilité, la fonctionnalisation du polyuréthane par
des groupements zwittérioniques [63].
1.3.1.10. Polypropylène
Le polypropylène est un polymère utilisé pour des applications biomédicales telles
que les fils de sutures chirurgicaux, implants médicaux, interfaces bioréceptives dû à
leur rigidité, flexibilité et leur résistance aux impacts. Sa chaîne principale carbonée
est responsable de l'hydrophobicité du polypropylène [64]. Il est de plus utilisé en tant
14
que maillage pour la réparation de la zone pelvienne et la chirurgie abdominale [65–
68].
1.4. Modifications de surface des biomatériaux pour améliorer la compatibilité au sang
Une surface est définie comme étant la partie supérieure d'un matériau dont
l'épaisseur ne dépasse pas la taille des atomes ou molécules qui se situent à cet
endroit [11]. Plusieurs classifications des modifications de surfaces ont été
présentées par le passé que ce soit par le type de technique employée ou le type
d'interface biologique créée [13].
1.4.1. Endothélialisation des prothèses artérielles synthétiques
Le phénomène d'endothélialisation consiste en la création d'une monocouche de
cellules endothéliales à la surface du matériau [36]. Les vaisseaux sanguins naturels
sont constitués de plusieurs couches à savoir l'adventice, la media et l'intima.
L'adventice est la couche la plus externe de la paroi artérielle alors que la média se
situe sur la face interne des vaisseaux sanguins, cette face étant en contact direct
avec le sang. Cette dernière couche est formée principalement par l'endothélium.
15
Figure 1 Structure d'une artère [69]
16
Plusieurs techniques sont utilisées à l'heure actuelle afin de favoriser
l'endothélialisation d'un matériau [70]. Tout ceci dans l'objectif de limiter l'occlusion
des vaisseaux sanguins lorsque ceux-ci sont propices au développement de
thromboses artérielles. Les patients déjà atteint d'une maladie cardiovasculaire ou
d'une thrombose vasculaire dans le passé sont considérés à risque lorsque l'on
implante un greffon synthétique dans le système vasculaire [71].
Figure 2 Schéma représentant l'endothélisation d'une prothèse artérielle à base PTFE
17
1.4.2. Immobilisation de biomolécule
L’immobilisation de biomolécule sur le biomatériau synthétique présente deux
objectifs principaux à savoir le recrutement de cellules endothéliales sur la surface et
la régulation de l’environnement physiologique par les agents anticoagulants ou les
inhibiteurs de la prolifération des cellules musculaires lisses.
1.4.2.1. Protéines de la matrice extracellulaire
Les cellules sont liées entre elles par l'intermédiaire de la matrice extracellulaire. La
matrice extracellulaire de la paroi des vaisseaux sanguins est une structure
hétérogène de protéines fibreuses, glycosaminoglycanes(GAG), protéoglycanes qui
présente des signaux biochimiques ainsi que des sites d'adhésion cellulaire
influençant et régulant les fonctions essentielles de la matrice extracellulaire [72]. Les
constituants les plus importants de l'ECM sont le collagène, la fibronectine [73],
vitronectine [74] et la laminine [75,76] pour leur rôle direct dans l'adhésion cellulaire
[77].
Les constituants de cette matrice vont donc par leur rôle, organiser et structurer les
cellules en tissus. De ce fait, ils font figure d'environnement et de support pour les
cellules. La matrice extracellulaire va aussi guider la plupart des phénomènes
physiologiques tels que le processus de cicatrisation. Son importance dans
l'expression de fonctions cellulaires telles que la migration et l'adhésion est décisive
dans le cheminement de ce processus. Son importance se situe aussi dans la
régulation de la prolifération et de la différenciation des cellules des vaisseaux
sanguins. Cette régulation des fonctions cellulaires par cet environnement est
influencée par la pression exercée par le flux sanguin. La matrice extracellulaire avec
ses constituants est ainsi un élément capital dans la relation entre la cellule et la
surface d’un matériau.
Par conséquent, l’immobilisation de protéines de la matrice extracellulaire est une
stratégie viable afin de favoriser un processus d’endothélialisation du matériau et
18
améliorer sa compatibilité au sang. En effet, l'immobilisation des protéines de la
matrice extracellulaire a été utilisée par le passé pour améliorer la compatibilité au
sang des prothèses artérielles synthétiques à base de PTFE et PET par le biais d'un
traitement plasma [28].
Par ailleurs, l’isolement de ce type de protéine par rapport à leur environnement initial
n’est pas sans risque. Cette matrice extracellulaire représente un environnement
complexe où les stimulations mécaniques ont directement une influence sur la
bioactivité des protéines. D’autre part, l’environnement direct de chaque protéine a un
impact de type synergétique sur l’expression de leur bioactivité. Ainsi la plupart des
protéines de la matrice extracellulaires lorsqu'elles sont immobilisées n'ont pas un
pouvoir anticoagulant complet et ne peuvent empêcher la formation de thrombose
[49].
1.4.2.1.1. Tropoélastine
La tropoélastine est un précurseur des fibres d'élastine qui est présent en grande
proportion dans la paroi des vaisseaux sanguins. Elle est responsable de leur
propriété mécanique telle que l'élasticité. Lorsqu'elle est immobilisée sur une surface,
cette protéine permet de diminuer la thrombogénéicité du matériau tout en ne
favorisant pas l'apparition de caillot sanguin [78].
1.4.2.1.2. Fibronectine
Parmi ces protéines de la matrice extracellulaire, la fibronectine constitue un élément
essentiel du processus d'adhésion cellulaire. Il s’agit de la protéine d’adhésion
cellulaire la plus présente dans le corps humain. Elle se retrouve dans la matrice
extracellulaire sous forme fibrillaire et sous forme globulaire dans le sang.
Il s'agit d'une glycoprotéine composée de deux dimères dont le poids moléculaire
total est de 440 kDa. Ses chaines polypeptidiques sont reliées entre elle par des
ponts disulfures. La fibronectine est caractérisée à l'état fibrillaire principalement par
19
la répétition de trois domaines dit FN-I, FNII et FN III. Il y a ainsi 12 FN-I, 2-FN-II et 15
à 17 FN-III contenus dans chaque sous unités de fibronectine.
Par ailleurs, les fibronectines plasmatiques sont synthétisées principalement dans le
foie par des hépatocytes. Les fibronectines cellulaires sont composées d'un grand
nombre de fibronectine isoformes responsable de la spécificité envers les cellules.
L'épissage des précurseurs ARN mitochondriaux conduit au fait qu'un seul de gène
fibronectine conduit à produire un grand nombre de variation au niveau des
propriétés de d'adhésion cellulaire et de solubilité. La fibronectine peut être un ligand
pour une douzaine de récepteur issue de la famille des intégrines [79].
1.4.2.1.3. Laminine
L'immobilisation de la laminine a été réalisée sur une surface d’ePTFE par
l'intermédiaire d'un bras d'ancrage hétérobifonctionnel afin de promouvoir
l'endothélisation des prothèses vasculaires [75]. Cette protéine favorise aussi les
mécanismes d'angiogenèse important dans la reconstruction des vaisseaux sanguins
[80] et d'adhésion cellulaire [81].
1.4.2.2. Fragments et peptides
Les fragments de protéines peuvent être porteurs d'une fonction telle que l'adhésion
cellulaire. De nombreuses études visent à se servir de ces fragments ou de
séquences peptidiques responsables de l'adhésion cellulaire afin d'améliorer le
recrutement de cellule sur une surface. En comparaison des protéines, la taille de ces
fragments est beaucoup plus petite ce qui permet de tapisser la surface avec une
densité plus élevée de fragment protéique dont la fonctionnalité est directement
accessible à l'environnement physiologique. En 1984, la séquence peptide RGD
(arginine, acide aspartique, glycine) a été mise en évidence comme étant une
séquence promouvant l'adhésion cellulaire [12]. Ainsi depuis cette découverte, de
nombreuses études ont porté sur l'incorporation de cette séquence peptidique dans le
développement de biomatériaux à base de polymère, et ce dans le but de favoriser
20
leur endothélisation [82]. Cette endothélisation peut être favorisée en immobilisant le
fragment recombinant rhFNIII7-10 porteur des motifs RGD et proline-histidine-serine-
arginine-asparagine (PHSRN). Ce dernier site est une séquence d’activation
appartenant au domaine III9 ayant un rôle synergétique avec le motif RGD dans la
liaison avec l’intégrine [83].
Lei et Al. ont immobilisé différents fragments peptidiques servant pour l'adhésion
cellulaire (RGD), au recrutement de cellules endothéliales (REDV et YIGSR) et la
promotion de l'angiogénèse (SVVYGLR) sur une surface de PET. Lors de cette
étude, l’immobilisation simultanée de plusieurs séquences peptidiques améliore
l’endothélialisation du polymère [20]. Larsen et al. ont développé une technique pour
améliorer l'endothélialisation des prothèses vasculaires à base de PTFE ou ePTFE
avec laquelle le peptide d'adhésion cellulaire RGD est immobilisé par l'intermédiaire
d'un fluoro-surfactant. Cette stratégie a permis d'améliorer la croissance des cellules
qui se sont adsorbées sur la surface [36]. Chollet et al. ont souligné l'influence de la
densité des peptides RGD immobilisés sur du PET sur la quantité de point focaux
[21]. Ces peptides peuvent être immobilisés dans des polymères tels que le PTFE,
PLA, PMMA, PS par mélanges, copolymérisation, traitements chimique ou physique.
Kuwabara et al. utilisent un peptide CAG (cystéine-alanine-glycine) dérivé du
collagène IV pour favoriser l'adhésion de cellules endothéliales sur des prothèses
artérielles de faible diamètre [84]. Néanmoins cette stratégie permet de limiter la
prolifération des cellules musculaires lisses par rapport à l'utilisation du peptide RGD
qui présente une plus forte affinité pour les SMCs [85]. Par ailleurs, il a été démontré
que l’immobilisation du fragment recombinant de fibrillin1 appelé PF8 permettait un
meilleur attachement des cellules endothéliales que la fibronectine [31].
L'immobilisation des fragments N terminaux N10 et N18 de la tropoélastine permet de
maintenir le même niveau de bioactivité et de réduire la thrombogénéicité du
matériau mais présente l'avantage de diminuer la résistance à la dégradation par la
protéase [86]. L'immobilisation couplée des peptides RGD et des fragments IKVAV et
21
YIGSR issus de la laminine sur du polyéthylène(glycol) monoacrylate a aussi été
étudiée [87].
1.4.2.3. Facteur de croissance
Les facteurs de croissance sont des molécules chimiques solubles capables de
provoquer une réponse cellulaire spécifique. Le type de réponse biologique peut être
la migration, la prolifération, la différenciation ou l'adhésion cellulaire. La liaison
spécifique du facteur de croissance à un récepteur transmembranaire de la cellule est
responsable de la réponse engendrée. Par ailleurs, l’ECM joue un rôle dans la
diffusion de ce type de molécule [88]. L'utilisation de facteur de croissance de
l'endothélium vasculaire a été employée pour capturer des cellules endothéliales.
Smith et Al.[89] ont montré que l'immobilisation de facteur de croissance de cellule
endothéliale via une stratégie impliquant l'héparine pouvait capturer des cellules
endothéliales dans le sang humain et ce sous contrainte de flux. Shin et Al.[90] ont
démontré cependant que l'amélioration de l'adhésion cellulaire par l'immobilisation de
facteur de croissance n'est pas forcément efficace suivant le type de type de stratégie
utilisée. Les facteurs de croissance d'origine plaquettaire PDGF sont nécessaires à la
vascularisation et peuvent être utilisés en ingénierie tissulaire pour favoriser
l'angiogénèse. Il existe 4 types de PDGF: A,B,C et D, avec des formes homodimères
et hétérodimères. Le PDGF-BB est par exemple impliqué dans la stabilisation des
nouveaux vaisseaux sanguins [91]. Chow et al. ont souligné l'effet synergétique que
pouvait avoir l'héparine sur les facteurs de croissance VEGF et FGF2 en agissant
comme un cofacteur, stabilisant les récepteurs et protégeant ces molécules de la
protéolyse ce qui eut pour finalité d'améliorer l'angiogenèse [92].
1.4.2.4. Agent anticoagulant
L'importance de l'héparine [93] en tant qu'anticoagulant a fait l'objet de nombreuses
revues de littérature dans le passé [94,95] et notamment sur la relation avec
l'antithrombine III [52]. L'héparine lorsqu'elle est immobilisée sur une surface permet
de supprimer la formation de thrombose artérielle [93,96]. Néanmoins, cette protéine
22
ne peut être utilisée directement à cause de sa solubilité dans l'eau [17]. De plus, sa
présence favorise la prolifération des cellules musculaires lisses [93]. Tang et al [97]
ont démontré que l'immobilisation de l'héparine sur des membranes de polyéther
sulfone permettait de diminuer l'adsorption de protéine, la suppression de l'adhésion
plaquettaire et la diminution de la génération du complexe Thrombine-Antithrombine
tout en gardant une bonne cytocompatibilité. Jin et al.[98] ont souligné l'importance
de la densité des bras d'ancrage permettant d'attacher l'héparine sur une surface de
propylène dans l'adsorption protéique. De même, le poids moléculaire des
monomères utilisés pour produire le substrat va modifier l'adsorption. Pour remédier à
la faible densité d'immobilisation de l'héparine, des études ont portées sur la structure
de l'héparine et ses propriétés d'anticoagulant. De ce fait, plusieurs stratégies ont
développées afin d'immobiliser des groupements chimiques tels que les sulfates,
sulfamide ou les groupements carboxylates qui sont connus pour être responsable de
ce pouvoir anticoagulant dans la structure de l'héparine. On parle alors de polymère
Héparine-like [17,95]. Hoshi et al.[93] ont utilisé le poly(1,8-octanedio-co-citrate) qui
est un polyester élastomérique afin d'immobiliser l'héparine sur une surface d'ePTFE.
Le résultat de cette stratégie est la réduction de l'adhésion plaquettaire, la
prolifération cellulaire et favorise la production d'oxyde nitrique.
L'acide citrique peut être utilisé en tant qu'anti coagulant dans le procédé de
plasmaphérèse. L'acide citrique va réagir avec les cations Ca2+ du sang et va ainsi
provoquer l'arrêt de la cascade la coagulation [99]. Xiang et al. ont ainsi combiné la
synthèse et l'utilisation de copolymère zwittérioniques, apportant une résistance à
l'adsorption protéique et des plaquettes sanguines et l'acide citrique pour ses qualités
d'anticoagulant afin d'améliorer la compatibilité au sang d'un polysulfone. Le procédé
utilisé étant une immobilisation covalente par chimie click [19,100]. Li et al. ont
développé une méthode pour améliorer la compatibilité au sang des membranes pour
l'hémodialyse de polyéthersulfone en immobilisant l'acide citrique. L'acide citrique
greffé au polyuréthane est en ensuite mélangé au polyéthersulfone. Cette stratégie a
démontré de bons résultats en ce qui concerne la cytocompatibilité ainsi que de
23
bonnes propriétés anticoagulantes [19]. De même, l'hirudine peut être utilisé en tant
qu'agent anticoagulant [101].
Les oxydes nitriques peuvent servir aussi à supprimer l'activation des cellules
sanguines. Yositomi et al. ont ainsi démontré qu'un polymère recouvert d'oxydes
nitriques en contact avec le sang supprime la production de cytokines et d'espèce
oxydées réactives qui sont le symptôme de l'activation des cellules sanguines [102].
La coagulation sanguine ainsi que le procédé d'activation peuvent être également
inhibés et réduits par l'immobilisation de la benzamidine [101-104].
1.5. Techniques de modification de surface
1.5.1.1. Adsorption physique etimmobilisation covalente
L'adsorption physique due à sa simplicité à mettre en œuvre est la méthode qui est la
plus utilisée. Elle peut être réalisée sur une grande diversité de support. Ainsi elle
peut être mise en œuvre sur des implants métalliques [106]. Des études ont
notamment porté sur l'adsorption des protéines du plasma sanguin et ont comparé
les différents effets sur des substrats polymériques comme le PTFE, le PET et
l'ePTFE [30]. Une des techniques majeures pour induire une immobilisation covalente
de biomolécule est le traitement plasma [107]. Dans ce cas de figure, ce type de
traitement est la première étape nécessaire pour fonctionnaliser la surface du
matériau. Plusieurs études ont tenté de comparer les procédés d’immobilisation
covalente à l’adsorption physique [108,109]. L’adsorption présente l’avantage de ne
pas faire intervenir d’élément chimique pouvant dénaturer les protéines et leur
conformation. Cependant, dans le cadre des prothèses vasculaires, les surfaces sont
soumises de façon permanente à des contraintes mécaniques produites par le flux
sanguins. L’immobilisation de protéine par l’intermédiaire d’une liaison covalente est
donc plus durable dans le temps [110]. De plus, cette technique présente l’intérêt de
cibler plus spécifiquement un type de conformation pour les protéines greffées.
24
1.5.1.2. Bras d'ancrage ou espaceur
L'utilisation de bras d’ancrage peut amener une modification de la stabilité de la
biomolécules immobilisées [111]. Néanmoins, les bras d'ancrage permettent de
diminuer l'encombrement stérique des protéines lorsque celles-ci sont liées via leur
intermédiaire sur une surface. De ce fait, la protéine étant éloignée de la surface
possède un plus grand degré de liberté dans sa mobilité. Il peut aussi protéger la
protéine d'une dénaturation provoquée par l'hydrophobicité associée à la surface du
polymère [13].
Figure 3 schéma de fonctionnalisation de la surface d'un biomatériau par l’intermédiaire d’un bras d’ancrage [12]
Plusieurs études ont été réalisées afin de trouver de nouveaux moyens d'immobiliser
les protéines sur une surface de manière covalente [112]. Salchert et Al. [105] utilise
des bras d'ancrage comme le PEG afin d'immobiliser un anticoagulant comme la
benzamidine [113]. Biltresse et al. [114] ont démontré l'importance de la longueur des
bras d'ancrage dans la réactivité des molécules immobilisés sur une surface de PET
initialement fonctionnalisée avec des groupements hydroxyle par traitement chimique
par voie humide.
1.5.1.3. Bioconjugaison [115]
La bioconjugaison est la liaison entre deux ou plusieurs molécules pour former un
nouveau complexe dont les propriétés associées à chacune de ces molécules. Ces
25
molécules peuvent être d’origine naturelle ou synthétique. Une molécule peut être
ainsi être ciblée en y attachant de façon covalente une molécule porteuse d’un signal
fluorescent, radioactif ou biotine et ainsi faire office de marqueur pour l’imagerie
médicale. Parmi les molécules intervenant on retrouve les ARN, glucides, les
polysaccharides, les oligonucléotides, les lipides. Les molécules intervenant dans
cette bioconjugaison sont appelées bras d'ancrage. Il existe différentes classes de
bras d'ancrage suivant leur réactivité, leur nature et fonctions. Il y a ainsi des bras
d'ancrage avec un seul site réactif, présentant deux mêmes fonctions réactives dites
homobifonctionnels, ayant deux fonctions différentes dites hétérobifonctionnels.
Certaines molécules trifonctionnelles ont été aussi développées. La longueur du bras
d'ancrage peut être aussi modifiée. De même des propriétés spécifiques peuvent être
introduites. Nous avons ainsi des bras d'ancrage n'introduisant pas d'espacement. Le
procédé de bioconjugaison a notamment été utilisé pour la purification, la détection
ou la localisation de domaine cellulaire spécifique impliqué dans le développement
d'une maladie. Un certain type de réaction chimique est associé à la réaction de
bioconjugaison. Ces réactions font intervenir les fonctions des bras d'ancrages ainsi
que des groupements chimiques présents dans la structure des molécules.
La réactivité des protéines est caractérisée par les acides aminés portés par les
diverses biomolécules ciblées. Au total 9 acides aminés possèdent un type de
fonctionnalité spécifique sur leur chaine latérale. Ces acides aminés sont l'acide
aspartique, l'acide glutamique, la lysine, l'arginine, la cystéine, l'histidine, la tyrosine,
la méthionine et le triptophane. Les fonctions chimiques impliquées dans ces chaînes
latérales sont des amines primaires, des imidazoles, carboxylates, disulfures,
thioesters, groupements guanidyle, cycle phénol et indol. Ces fonctions sont
néanmoins réactives suivant le pH du milieu dans lequel la protéine se trouve. En
effet, suivant le pH ces fonctions vont être protonées ou déprotonées ce qui va
favoriser ou non leur réactivité. L'utilisation de la bioconjugaison doit cependant
préserver la bioactivité des protéines intervenant. De ce fait, les réactions ne doivent
26
pas impliquer des acides aminés proches des sites antigènes ou site d'adhésion et
s’effectuer de préférence à la périphérie de la molécule.
La cystéine est l'unique acide aminé qui contient un groupement sulfhydryle. À pH
physiologique, ce groupement est protoné et ne possède aucune charge. La réaction
entre deux cystéines conduit à la formation d'un pont disulfure. Bien souvent ces
ponts disulfures sont des éléments clés dans la conformation d'une protéine ou la
stabilisation de sa structure. La plupart du temps, les cystéines sont présentes au
centre de la conformation des protéines du fait de leur relative hydrophobicité.
1.5.2. Traitement plasma
Le plasma est le quatrième état de la matière et est composé de radicaux libres,
d'espèces ioniques excitées, d’électrons, etc. Il existe deux types de plasma à savoir
les plasmas chauds ou les espèces se trouvent en équilibre thermodynamique et les
plasmas dits froids ou les espèces en présence sont hors équilibre
thermodynamique. Les plasmas chauds sont très peu utilisés en laboratoire mais
peuvent cependant servir à fondre certains matériaux. Ce type de plasma est
représenté à l'état naturel par les vents solaires et les aurores boréales. Les plasmas
chauds sont utilisés plus fréquemment dans les laboratoires. Au sein de ce type de
plasma, les électrons possèdent une température différente en comparaison des
autres espèces intervenantes. La densité de particule chargée plus faible de ce type
de plasma permet de traiter la surface des matériaux tout en maintenant l'intégrité du
matériau. La production de ces espèces réactives est effectuée par l'intermédiaire
d'un gaz qui est excité par des ondes radio, des micro-ondes ou des électrons
produits par une décharge sur filament chaud. Les espèces réactives dans le plasma
vont réagir avec la surface des matériaux afin de les modifier chimiquement et
physiquement. Parmi les avantages des techniques de modification de surface
basées sur l'usage des plasmas figurent sa reproductibilité, son faible coût
d'utilisation, la variété du type de changement appliqué sur la surface à savoir des
modifications d'ordre chimique, physique, tribologique, électrique, optique, biologique
27
et mécanique. Cette technique peut être aisément transposée à l'échelle industrielle.
Elle permet de traiter une grande diversité d'échantillon au niveau morphologique. De
plus, des pochoirs peuvent être apposés sur la surface afin d'appliquer des motifs ou
traiter sélectivement certaines régions du matériau.
Le traitement plasma peut être appliqué sur la surface des biomatériaux solides pour
améliorer leur propriété de biocompatibilité [116]. La plupart des polymères
possèdent une faible énergie de surface ce qui en font des matériaux problématiques
pour attirer et attacher les cellules [117]. Ainsi, Carbone et al. ont utilisé le traitement
plasma afin de diminuer l'hydrophobicité de surface du PTFE et de ce fait rendre
l'adsorption protéique difficile. Une comparaison de deux types de traitement plasma
à pression atmosphérique Ar et Ar/O2 [32]. L'implantation ionique par traitement
plasma a été utilisée pour améliorer l'adhésion cellulaire sur des surfaces de PTFE et
ePTFE [34]. Les changements chimiques néanmoins doivent intervenir uniquement
sur la surface du polymère et ne doivent pas modifier ses propriétés intrinsèques [33].
De plus, l'introduction de groupement chimique sur la surface permet l'immobilisation
covalente ultérieure de polymères ou molécules bioactives [118].
Figure 4 : Type de modification de surface par traitement plasma pour les polymères[118]
28
Plusieurs types de traitement ont été développés pour fonctionnaliser une surface et
la rendre bioactive comme l'oxydation des surfaces par plasma, l'implantation ionique
par plasma, la polymérisation par plasma permettant de créer un revêtement bioactif
[119]. Le dépôt par plasma vapeur chimique permet d'immobiliser des biomolécules
par un lien covalent. L'intérêt de cette méthode est quelle est sèche et peut être
effectuée sur différent substrat sans que cela ne l'affecte [110]. Gomathi et al.[64] ont
utilisé un traitement plasma azoté pour augmente l'énergie de surface, la mouillabilité
et la compatibilité au sang du polypropylène. Cependant ce type de traitement
provoque la perte de masse par le décapage de la surface. Il est important de trouver
le bon compromis entre l'augmentation d'énergie de surface du polymère et sa perte
de masse qui est responsable de sa rugosité.
1.5.2.1. Principe d'un plasma à décharge contrôlée par barrière électrique à pression atmosphérique
L'utilisation d'un plasma à décharge contrôlée par barrière électrique à pression
atmosphérique présente les avantages d'être efficace, de traiter une large surface et
d'être plus économique car généralement l'équipement utilisé a un peu faible coût
que les instrumentations nécessitant d'effectuer les traitements sous vide. Néanmoins
l'uniformité du traitement est plus difficile à obtenir à pression atmosphérique car les
plasmas peuvent générer des arcs électriques. Dans ce cas de figure, les électrodes
métalliques sont séparées par matériau isolant permettant de limiter la décharge
électrique et de réduire la formation d'arc.
29
Figure 5 : schéma représentant le dispositif instrumental pour effectuer un traitement plasma [120]
1.5.3. Revêtement
En général, les groupements polaires appliqués en tant que revêtement (groupement
hydroxyle ou amine) permettent d'augmenter l'hydrophilicité de la surface et ainsi de
lui conférer des propriétés anti adsorption. En même temps, ces groupements
peuvent servir de point d'attache pour d'éventuelle fonctionnalisation ultérieure [121].
L’immobilisation des facteurs de croissance peut être réalisée l’usage d’une couche
de polydopamine. Ce procédé est inspiré par le recouvrement des moules. En effet,
la dopamine est responsable du pouvoir adhérant des moules par la présence de
groupement cathécol et d'amine primaire (lysine). De plus, le dépôt d'une couche de
polydopamine est stable et permet la conjugaison ultérieure de biomolécule
contenant des groupements thiols ou amine [90,92].
1.5.4. Auto-assemblage (SAMS)
Par cette méthode [122], les propriétés de surface peuvent être contrôlées au niveau
moléculaire et définir l'ordre et l'orientation de la surface. Néanmoins, la plupart des
études portent sur l'adsorption directe des protéines sur ce type de surface ou sur
30
l'adhésion cellulaire. De ce fait, la conformation des protéines absorbées sur la
surface est difficilement contrôlable. La majorité des supports sur lesquels est
appliqués cette technique est non polymérique [123].
1.5.5. Polymérisation radicalaire par transfert d'atome initié par la surface
L’amélioration de la compatibilité au sang ainsi que de l'endothélisation du
polycaprolactone peut être effectuée par l’intermédiaire d’une polymérisation
radicalaire par transfert d'atome initié par la surface [124]. Ce type de modification par
le biais d'une polymérisation radicalaire par transfert d'atome initié par la surface
(PRTA-s) permet de fonctionnaliser des membranes de PES par du PVP [125] et
ainsi d'augmenter l'hydrophilicité de surface de la membrane. Ce procédé permet de
former des chaînes polymères à la surface d’un matériau contenant des monomères
initiateurs de cette polymérisation. Cette stratégie par rapport au coating permet
d’avoir une plus grande densité ainsi qu’une meilleure résistance du revêtement au
cours du temps. La structure en brosse des chaînes polymères formées à la surface
du matériau inhibe l’adsorption protéique [126].
1.6. Techniques de caractérisation
1.6.1. Méthode de spectroscopie
1.6.1.1. Spectroscopie photoélectronique par rayons X (XPS)
La spectrométrie photoélectronique à rayon X (XPS) est généralement utilisée pour
vérifier l'efficacité de divers types de modification effectuée sur la surface du
matériau. Ainsi cet outil peut être utilisé après un traitement plasma ou
l'immobilisation d'agent biologique [127].
L’origine de l’XPS en tant que technique d’analyse remonte à 1970 lorsque Kai
Siegbahn et son équipe ont été capables de construire un instrument analysant les
émissions photoélectronique. Cependant, les principes physiques ayant servi à son
31
élaboration ont été découverts sur plus d’un siècle avant. La production d’un photon
est le résultat de l’éjection d’un électron initialement lié à un atome par l’intermédiaire
d’un photon. Lorsque cette énergie est suffisante cela va conduire à l’émission d’un
électron depuis l’atome. La rupture entre l'électron et le noyau atomique va
consommer une portion d'énergie apportée par le photon. Les photons étant sans
masse, l’interaction entre le photon et l’électron va produire un transfert d’énergie
complet. La mesure de l’énergie cinétique (K.E.) issue de cette émission d’électron va
permettre de quantifier l’énergie de liaison (B.E.) qui est spécifique d’un type
d'élément atomique.
Figure 6 Schéma représentant les étapes du fonctionnement d'un XPS ainsi que les différents types de donnée acquise à
l'issue d'une analyse [128]
A l’issue d’une analyse comme représentée par la Figure 6, l’énergie de distributions
de chaque émission est rapportée à un ordre d’énergie prédéfinie et associé à un
élément spécifique. De même, des informations issues d’une analyse XPS telles que
la distribution spatiale spécifique aux émissions électroniques émises ainsi que leur
distribution en profondeur.
La spectroscopie photoélectronique à rayon X est un outil pouvant être utilisé pour la
détection des protéines adsorbées ou immobilisées sur une surface. De plus, elle
32
peut fournir des analyses quantitatives pour une épaisseur et une surface donnée
[129]. En effet, l’XPS permet d’identifier la composition atomique d’une surface solide
sur une épaisseur de 10 nm à la condition que ces éléments appartiennent à Li-U.
L’exception étant pour les éléments H et He qui sont non détectables à cause de leur
faible environnement photoélectronique [128]. Le succès de cette technique lors des
30 dernières années est en partie dû au fait que la préparation des échantillons est
rapide et facile à mettre en œuvre. Les problèmes liés aux analyses XPS
d'échantillon de polymère est la faible intensité du signal issu des sources
monochromatiques, la faible résolution spatiale et les difficultés liées à la
compensation de charge [130]. Excepté pour l'hydrogène, les analyses permettent de
déterminer le pourcentage atomique de chaque atome. L'aire d'un pic de spectre XPS
est proportionnelle au nombre d'atome de l'élément étudié.
1.6.2. Immunofluorescence
La conformation des protéines peut être analysée par différentes méthodes telles que
les isotopes radioactifs, ELISA et FRET [131]. La méthode immuno-enzymatique
ELISA peut permettre de quantifier la présence de fibronectine sur un tissue mou
[132] ou immobilisée sur une surface [35].
1.6.2.1. ELISA
La méthode immuno-enzymatique ELISA est une méthode utilisée afin de quantifier
la présence d'un anticorps ou antigène. Il existe différents protocoles d'application. Le
principe de cette technique consiste à utiliser des anticorps qui de manière directe ou
indirecte vont marquer une protéine cible ou un épitope particulier d'une protéine et
par la suite être responsable de la production de fluorescence lorsque cet anticorps
est porteur d'une enzyme prédestinée à cette action. L'usage d'une courbe de
calibration en fonction de l'intensité du signal reçu permet de quantifier la protéine
immobilisée sur une surface. Contrairement à la plupart des autres essais basés sur
l'utilisation des anticorps, cette technique peut être quantitative. L'avantage de cette
technique est sa relative rapidité et facilité d'exécution. Généralement, les anticorps
33
sont immobilisés sur une surface solide de manière non spécifique (par adsorption)
ou spécifique (par bioconjugaison).
Les anticorps font partis du groupe des glycoprotéines parfois appelé
immunoglobuline présent dans le sérum des espèces animales. Parmi le groupe des
immunoglobulines, il existe 5 grandes classes: IgG, IgA, IgM, IgD et IgE.
Figure 7 Représentation schématique de la structure d'un anticorps [133]
34
La structure des anticorps comporte deux chaines polypeptidiques dites légères et
deux chaines polypeptidiques lourdes reliées entre elles par des ponts disulfures. Les
différences entre les sous classes d'anticorps se situent au niveau des chaines
lourdes. Cette structure comme illustrée par la Figure 7 est représentée
généralement par une forme en Y avec dans la partie supérieure les chaines légères
et sur toute la hauteur de la molécule les chaines lourdes. Les parties ou sites de
liaison aux antigènes de l'anticorps se situent principalement sur les extrémités N-
terminales des chaines lourdes et légères. Ainsi le site actif de l'anticorps ou paratope
se situe dans la cavité entre chaque paire de brins. La taille de la cavité variant
suivant les différences présentes par les chaines lourdes et légères. La spécificité de
l'anticorps va être le fruit des différents acides aminés présents sur le site actif et la
présence de certains groupes appelés épitopes dans la structure de l'antigène.
L'affinité entre l'antigène et l'anticorps est alors la conséquence des interactions
parmi des petites séquences entre les deux structures. Lors de la liaison entre le site
le site actif d'un anticorps et les épitopes d'un antigène, plusieurs forces d'interactions
entre en jeu telles que les forces de Van der Waals, les forces électrostatiques et les
interactions hydrophobes. Il est à noter que la plupart des liaisons impliquées sont le
résultat d'interactions hydrophobes [133].
1.6.2.1.1. ClassificationdesELISA
Les tests ELISA peuvent être classés en 3 catégories: directe, indirecte et sandwich.
Dans le cas d'une ELISA directe, l'anticorps intervenant auprès de l'antigène est
directement marqué par une enzyme et implique la plupart du temps des anticorps du
type monoclonal qui vont reconnaitre et se lier à un épitope spécifique de l'antigène.
L'antigène est lui attaché sur une surface solide. Bien souvent, il s'agit de plaques de
96 puits favorisant l'adsorption. La procédure peut aussi utiliser un antigène marqué
afin de reconnaitre l'anticorps adsorbé au fond du puits. Néanmoins cette méthode
est moins populaire. L'usage d'un substrat lors de l'étape finale va permettre, en
réagissant avec l'enzyme attachée à l'anticorps, de développer une couleur.
35
La méthode indirecte fait intervenir exclusivement un antigène immobilisé sur une
surface solide. Néanmoins contrairement à la méthode directe, elle fait intervenir
deux anticorps. L'anticorps primaire va d'abord se lier sur l'antigène puis l'anticorps
secondaire complexé à une enzyme va se lier à l'anticorps primaire. L'entité
développant la fluorescence n'est donc pas directement liée à l'épitope de l'antigène
immobilisé. L'anticorps primaire peut être immobilisé sur la surface solide, après un
premier lavage l'antigène est ajouté dans une solution tampon réduisant l'adsorption
non spécifique. Après l'incubation, l'antigène non attaché est retiré en effectuant un
lavage. L'antigène immobilisé est détecté par l'utilisation d'un deuxième anticorps
marqué d'une enzyme.
ELISA dite sandwich peut être directe ou indirecte. Elle permet de quantifier un
antigène immobilisé entre deux couches constituées d’anticorps. Ces deux couches
ont deux rôles différents. En effet l’une va servir à immobiliser l’antigène alors que la
seconde va permettre de le détecter. L’antigène, de ce fait, doit comporter deux
épitopes différents dont chacun sera capable de lier spécifiquement un anticorps ou
l’autre. L’utilisation de cette stratégie peut faire intervenir à la fois des anticorps
polyclonaux ou monoclonaux pour l’immobilisation ou la détection. Généralement un
anticorps polyclonal va être utilisé pour immobiliser le plus grand nombre d’antigène
et ainsi augmenter l’efficacité de la détection [133].
La Figure 8 illustre le mécanisme des différents types ainsi que les espèces
intervenantes.
36
Figure 8: Schéma des différents types d'ELISA [134]
1.6.3. Angle de contact
La mouillabilité est un paramètre important dans les procédés industriels liés à la
production des matériaux comme la lubrification, les revêtements liquide et
l'impression. La technique dite angle de contact est divisée en deux catégories à
savoir la méthode optique directe et la méthode par force indirecte.
Figure 9 Représentation des angles de contact par dépôt de liquide sur une surface solide lisse et homogène [135]
La méthode des angles de contact permet de mesurer la mouillabilité d'une surface
d'un matériau. Elle consiste à étudier comment un liquide se réparti sur la surface
37
d'un solide. La mouillabilité est déterminée en mesurant l'angle de contact formé par
le liquide en contact avec une surface solide. Cependant cette méthode ne se
résume pas à l'équilibre liquide vapeur avec une surface solide mais peut s'appliquer
à un équilibre entre deux liquides. Plus généralement, cet angle de contact est
déterminé par les forces de répulsion et d'interaction entre le liquide et le solide. La
tension de surface ou hydrophobicité de la surface peut ainsi être déterminée.
Lorsque l'angle de contact mesuré est inférieur à 90° le matériau est considéré
comme étant hydrophile alors qu'au-dessus de 90°, il est considéré comme
hydrophobe. Les matériaux dits superhydrophobes présentent un angle de contact de
150°. La forme des gouttes d'eau déposées sur une surface est due à la combinaison
des forces de tension de surface et des forces externes dont principalement la
gravité. L'angle de contact décrit par Thomas Young [136] comme étant le dépôt
d'une goutte liquide sur une surface solide idéale résulte de l'équilibre entre trois
différentes tensions interfaciales définies par l'équation suivante:
Où θγ est l'angle de contact et, γlv, γsv et γsl représentent respectivement les tensions
interfaciales liquide-vapeur, solide-vapeur et solide-liquide.
1.7. Hypothèses, défis et approches
Pour améliorer l’hémocompatibilité des prothèses artérielles à base de PTFE,
l’attachement d’une monocouche de cellules endothéliales sur la surface afin de
reproduire le recouvrement interne des vaisseaux naturels constitue une stratégie
intéressante pour éviter la formation de thromboses. Notre hypothèse est que
l’introduction du paramètre d’hydrophobicité/d’hydrophilicité dans le lien covalent
entre la surface et la protéine immobilisée va influencer la bioactivité de cette
dernière. L’usage de bras d’ancrage hétérobifonctionnels identiques dans leurs
réactivités chimiques mais porteur d’une hydrophobicité différente permet une étude
ciblée soulignant le rôle de cette propriété essentielle dans l’interaction entre une
38
surface et une protéine. Cependant la mise en relief de ce critère doit être favorisée
en immobilisant une même quantité de protéines indépendamment de la stratégie
utilisée. Cette partie expose les différents partis pris scientifiques afin de répondre à
cette problématique en essayant de les justifier comme le choix de la protéine
immobilisée, des bras d’ancrage choisis, du traitement plasma et de la technique
d’analyse pour observer sa bioactivité.
1.7.1. Fonction d’adhésion cellulaire de la fibronectine
La fibronectine interagit avec les cellules par l'intermédiaire des intégrines qui sont
des récepteurs transmembranaires permettant de relier la matrice extra cellulaire au
cytosquelette intracellulaire. Plus précisément, la fibronectine va réagir avec les
domaines α5β1 et αVβ3 des intégrines. Les sites d'adhésion cellulaire situés dans la
fibronectine sont localisés principalement dans les modules III8 et III10. La séquence
d'acide aminé ayant un rôle majeur dans cette adhésion cellulaire est le peptide RGD
du fragment III10 de la fibronectine. Cette séquence est un tripeptide constitué de
l'enchainement successif des acides aminés Arginine, Glycine et acide aspartique. La
fibronectine possède dans sa structure la séquence d'acide aminé dite RGD (Arg-Gly-
Asp) qui est reconnue par des complexes intégrines en présence de calcium [137].
Par ailleurs Leahy et al [138] ont déterminé la structure cristalline du domaine III10
correspondant à une structure en forme de bâtonnet de groupe d'espace P21. De plus
l'existence d'une rotation entre les domaines 9 et 10 qui est porteur de la séquence
RGD a été mise en évidence. Le peptide RGD du domaine III10 se situe dans une
boucle. La présentation du RGD est ainsi liée à la modulation de la morphologie de
cette boucle. Une séquence peptidique présentant une topologie circulaire ou en
forme de boucle va avoir une meilleure affinité pour αvβ3 and α3β1 intégrines [139].
Cette rotation est importante dans la modulation du site d'adhésion cellulaire. La
bioactivité de la protéine est donc fondamentalement reliée au type de conformation
qu’elle adopte.
39
De surcroît, il existe une synergie au sein même de la structure de la protéine entre
ses domaines qui va réguler sa fonction d’adhésion cellulaire. En effet,
l'immobilisation conjointe du peptide RGD et du fragment PHSRN ont souligné
l'importance de l'environnement du peptide d'adhésion cellulaire. Le PHSRN par son
rôle synergétique va améliorer l'adhésion au α5β1 de l'intégrine [140].
Par ailleurs, le site RGD ne constitue pas le seul site impliqué dans l’adhésion
cellulaire. A côté du peptide RGD, il existe d'autres peptides impliqués dans
l'adhésion cellulaire comme les peptides REDV [141], PHSRN [140] et KNEED [142].
A part ses propriétés d'adhésion cellulaires, la fibronectine peut lier plusieurs
biomolécules (Figure 10) telles que le collagène, la fibrine, Parmi les différents
domaines d'adhésion: collagène, fibrine, etc…
Figure 10 Schéma de la structure de la fibronectine, de ces domaines destinés à l'adhésion cellulaire ou de biomolécules (88)
1.7.2. Conformation et bioactivité
Le principal peptide d'adhésion cellulaire à savoir la séquence RGD se situe dans la
boucle présente entre les brins G et F. La particularité du domaine FN-III est que
40
celui-ci ne contient pas de pont disulfure à la différence des deux autres domaines.
Par conséquent l'absence de ce type de liaison permet le dépliement de ce domaine
lorsqu'il est soumis à des forces externes. Ceci confère une élasticité à la protéine.
De nombreuses études sont menées sur les propriétés mécaniques ainsi que les
variations de la stabilité mécanique de ce domaine en utilisant notamment la
technique de microscopie à force atomique. Le dépliement de ce domaine par
l'application de force à cet endroit rend la séquence RGD plus apparente. Par
conséquent, l'adhésion cellulaire issue de cette relation entre la structure de la
fibronectine est un phénomène dit méchanosensible. Par ailleurs, les propriétés
mécaniques et dynamiques de cet environnement interviennent aussi dans la façon
dont vont s'effectuer la migration et l'adhésion cellulaire [143].
Parmi les différentes stratégies visant à recruter des cellules endothéliales sur une
surface par l’immobilisation d’une biomolécule, la fibronectine présente l’avantage
d’être une grande molécule possédant de nombreux domaines qui vont interagir les
uns avec les autres afin d’augmenter le pouvoir d’adhésion cellulaire. En
comparaison, l’immobilisation directe de peptide RGD présente un peu faible pouvoir
ligand envers les cellules [36].
1.7.3. NH-ester
Lors de ce projet, l’usage d’une étape préliminaire représentée par l’amination de la
surface du PTFE par traitement plasma nous a conduit à choisir un bras d’ancrage
possédant une fonctionnalité réagissant avec des groupements amines suivant le
modèle présenté par la Figure 11.
Dans ce cas de figure, la fonctionnalité NHS ester (N-hydroxysuccinimide ester) qui a
été utilisée pour la première fois en 1975 par Bragg et Hou est très utilisée pour les
bras d’ancrage réagissant avec des amines [144].
41
Figure 11 Réaction entre le NHS ester et une amine primaire
1.7.4. Maléimide
La seconde fonctionnalité choisie est un groupement maléimide qui est à la base le
produit de la réaction entre l’anhydride maléique et l’ammoniac. La double liaison de
cette fonction va réagir suivant une réaction d’alkylation avec des groupements
sulfhydrile pour former des ponts disulfures (Figure 12). Dans le contexte des
protéines, comme expliqué dans le paragraphe 1.5.1.3, ces groupements sont portés
par les cystéines. Le pH du milieu aqueux doit se situer entre 6.5 et 7 afin que la
réaction puisse avoir lieu [145].
Figure 12 Réaction entre le groupement maléimidyle et un groupement sulfhydryle
1.7.5. Sélection des Bras d'ancrage d’ancrage
Les deux bras d’ancrage sélectionnés sont hétérobifonctionnels à savoir qu’ils sont
porteurs de deux fonctions réactives différentes. La fonction NHS ester est destinée à
réagir avec les amines greffées sur la surface après le traitement plasma et la
fonction maléimide va être responsable de l’attachement de la fibronectine en
réagissant avec les groupements thiols portés par les cystéines. Les bras d’ancrage
42
possède la même longueur soit environ 17Å. L’élément de variation entre les deux
bras d’ancrage se situe dans la chaine principale. En effet, le Sulfo-KMUS (N-κ-
maléimidoundécanoyl-oxysulfosuccinimide ester), représenté par la Figure 13,
présente une chaine à base d’alcane alors que le SM(PEG)2 (succinimidyl-[(N-
maléimidopropionamido)-diéthylèneglycol] ester) (Figure 14) possède une chaine
principale composée d’unités d’oxyde d’éthylène. Ce choix se justifie par une volonté
de moduler le caractère hydrophile/hydrophobe du lien covalent entre la protéine
greffée et la surface afin d’en observer l’influence sur la bioactivité de la fibronectine.
De surcroît, l’influence de ce paramètre a été mise en évidence en utilisant
l’adsorption physique comme technique d’immobilisation [146–149].
Figure 13 : Structure du Sulfo‐KMUS
Figure 14 : Structure du SM(PEG)2
43
1.7.6. Amination du PTFE par traitement plasma
L’activation de la surface de PTFE est provoquée par l’utilisation d'espèces réactives
issues du mélange gazeux du N2/H2. Les liaisons C-F sont rompues et les
groupements chimiques contenus dans le gaz vont réagir avec la surface activée. A
côté de cette fonctionnalisation, la création de ces radicaux libres sur la surface de
PTFE a pour conséquence, entre autre, de modifier la rugosité du polymère. Par
ailleurs l’exposition à ce type de plasma ainsi qu’au plasma oxygène modifie la
plupart des polymères en rendant leur surface plus hydrophile [150]. Il a été prouvé
qu’ajouter du dihydrogène au diazote permettait d’augmenter la fonctionnalisation de
la surface représentée par la concentration d'amine [151].
La fonctionnalisation de la surface du PTFE par traitement plasma pour y greffer des
groupements amines est une stratégie qui a été utilisée avec succès à plusieurs
reprises par le laboratoire d’ingénierie des surfaces de Québec. Lors de ce projet de
maitrise, cette fonctionnalisation est la première étape permettant d’expérimenter sur
les différentes façons d’immobiliser de manière covalente la fibronectine.
1.7.7. Choix de l’ELISA indirecte
L’ELISA indirecte utilise deux anticorps. Le premier anticorps se lie spécifiquement à
sa cible. Dans un deuxième temps, le deuxième anticorps appelé aussi anticorps
secondaire va reconnaitre l’anticorps primaire déjà lié. Cette technique permet de
d’augmenter l’intensité du signal obtenue et par la même occasion de diminuer
l’adsorption non spécifique des anticorps en augmentant le nombre de lavage
successif.
1.7.8. Sélection des anticorps pour cibler la fibronectine
L'anticorps monoclonal choisi est le MAB1934. Il s'agit d'un anticorps ayant pour
isotype IgG1, d'environ 262 kDa et produit chez la souris, anti fibronectine qui va
réagir spécifiquement avec un fragment d'adhésion cellulaire de 11.5 kd situé dans la
structure de la fibronectine [152,153]. L'anticorps polyclonal F3648 est produit chez le
lapin et réagit avec la fibronectine. L'anticorps secondaire NA931 est produit chez le
44
cheval et réagit spécifiquement avec les anticorps primaires issus de la souris.
L'anticorps secondaire NA934, produit chez l'âne, réagit avec les anticorps primaires
issus du lapin. Ces anticorps secondaires sont conjugués avec une enzyme appelée
peroxidase de raifort (HRP) (Figure 15). Cette enzyme va catalyser la production d'un
agent coloré par l'intermédiaire de l'amplex® red (10-acetyl-3,7-
dihydroxyphenoxazine) [154]. Cette réaction est très sensible lorsque le milieu
présente un excès de peroxyde d'hydrogène H2O2. En effet, l'amplex red initialement
incolore est converti en résorufine qui est une espèce chimique très fluorescente
ayant une excitation maximale pour une longueur d'onde de 563 nm et une émission
maximale à 587 nm (Figure 16).
Figure 15: Schéma réactionnel de la production de résorufine à partir de l'amplex red en présence de l'HRP et de H2O2
45
Figure 16: Spectre d'émission et d'excitation de la résorufine [155]
46
2. CHAPITRE 2: Matériels et méthodes expérimentales
2.1. Matériels
Les feuilles de 250µm d’épaisseur de PTFE ont été achetées chez Goodfellow Corp.
(Devon, USA). Les deux bras d'ancrage à savoir le Sulfo-KMUS (sulfo-KMUS (N-[κ
maleimidoundecanoyloxy]sulfosuccinimide ester) ainsi que le SM(PEG)2 maléimide
ont été achetés chez Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA). L'acétone et
méthanol proviennent du laboratoire MAT (Montréal, QC, Canada). Le Bromo-5-
salicyaldehyde et la bovine sérum albumine ont été achetés chez Sigma-Aldrich
(Milwaukee, WI, USA). La fibronectine d'origine humaine a été acheté chez
laboratoire ERRMECe (Cergy-Pontoise, France). Les Plaquettes 96 puits de marque
Costar ont été achetées chez Fischer Scientific (Whitby, ON, Canada). Les anticorps
primaires polyclonaux anti fibronectine (F3648) issus du lapin proviennent de Sigma
Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Les anticorps primaires monoclonaux MAB 1934 issus
de souris destinés à réagir avec les peptides d'adhésion cellulaire telles que le
peptide RGD ont été achetés chez Chemicon international. Les anticorps
secondaires HRP pour Horseradish peroxidase (souris et lapin) proviennent de GE
Healthcare Biosciences (Piscataway, NJ, USA). L'Amplex red acheté chez life
technology. La solution tampon HEPES a été achetée chez Sigma-Aldrich. Les gaz
utilisés pour le plasma tels que le dihydrogène ou le diazote ont été achetés chez
BOC Canada (Québec, Canada).
47
2.2. Méthodes
2.2.1. Techniques de modification de surface et préparation des échantillons
2.2.1.1. Nettoyage des échantillons avant traitement
Le nettoyage des échantillons préalablement au traitement plasma est une étape
importante qui à la fois renforce l’efficacité de la fonctionnalisation, élimine les
possibles contaminations et renforce la cohérence des résultats obtenus. Au
préalable, les surfaces de PTFE sont nettoyées successivement avec de l'acétone,
de l'eau et du méthanol pendant 10 minutes dans un bain à ultra-sons. Dans un
premier temps les feuilles de PTFE sont découpées au scalpel afin de produire des
échantillons de dimensions 3.5*3.5 cm. Ces échantillons sont ensuite déposés dans
des béchers de 250 mL en s’assurant que, pendant la durée du nettoyage, les
échantillons baignent dans le solvant. Entre chaque nettoyage, les échantillons sont
séchés à l’air comprimé puis après le nettoyage au méthanol sont stockés dans un
dessiccateur sous vide.
2.2.1.2. Procédure du traitement plasma
Lors de ce projet de maîtrise, le prototype utilisé fait intervenir une décharge à
barrière diélectrique produite et maintenue par une fréquence de l'ordre du kHz. Le
traitement plasma appliqué avec une fréquence de 3kHz, un voltage de 14kV, un gaz
gap de 1mm et un traitement pendant 45 secondes. Un ruban adhésif de polyimide
est appliqué sur le pourtour de l’échantillon de PTFE à environ 0.5 cm des bords pour
permettre son immobilisation sur l’électrode. L’enceinte est ensuite fermée
hermétiquement puis, pendant 5 min, celle-ci est purgée par le mélange gazeux
N2/H2 de composition 95%/5% sous un flux constant 10 L/min [156]. Les échantillons
de PTFE sont fonctionnalisés par l'intermédiaire d'une décharge à barrière
diélectrique (DBD) à la pression atmosphérique avec une fréquence de 3kHz et une
tension de 14kV pour une durée de 45 secondes. Après le traitement, l’échantillon est
volontairement laissé dans l’enceinte pendant 5min avec le mélange gazeux afin de
neutraliser les éventuelles espèces réactives introduites.
48
2.2.1.3. Procédure pour le greffage de la fibronectine
Dans un premier temps, les bras d'ancrage sont solubilisés dans une solution de
diméthylsulfoxyde (DMSO) ayant pour concentration 3mg/mL. Les solutions sont
préparées en ajoutant 3mg du bras d’ancrage dans un aliquot de 2mL puis complété
en ajoutant 1mL de DMSO. L’aliquot est ensuite vortexé pendant 30 secondes afin de
favoriser la dissolution des bras d’ancrage. Les surfaces de PTFE traitées par plasma
de dimensions 1cm par 1.5cm, découpées à l’aide d’un scalpel, sont déposées au
fond de puits d'une plaque de culture cellulaire en orientant les faces ayant été
fonctionnalisées vers le fond du puits. Les bras d'ancrage dissous sont versés dans
chaque puits avec l’aide d’une micropipette P1000 et laissés en contact avec les
échantillons pendant deux heures. La plaque de culture cellulaire avec les
échantillons est placée sur une plaque d’agitation et agitée faiblement. Les surfaces
sont alors rincées avec de l'HEPES de pH 7.4 et déposées dans de nouveaux puits à
l’aide d’une pince afin de procéder au greffage de la fibronectine
Une solution de fibronectine 3μg/mL est préparée à partir d’une solution mère à
7.7mg/mL. On prélève 19.5μL de solution mère que l’on verse dans un flacon de
100mL. Un volume de 49.98mL de solution d’HEPES à pH 7.4 est ajouté au flacon.
La solution fille est ensuite versée dans des aliquots de 2mL et stockée à 4°C afin
d’en faciliter l’utilisation. Un volume de 1000μL de cette solution de fibronectine à
3μg/mL est prélevé et est versé dans le puits contenant l’échantillon à traiter. La
fonctionnalisation est effectuée pendant 3 heures, à température ambiante et sous
faible agitation. A la suite de cette fonctionnalisation, les échantillons sont transférés
dans des tubes à fond conique Falcon de 25mL à l’aide d’une pince. Les surfaces
sont alors rincées 5 fois avec de l'eau sous vortex pendant 30 secondes. Les
surfaces sont ensuite séchées à l’air comprimé.
2.2.2. Techniques de caractérisation
2.2.2.1. Spectroscopie photoélectronique par rayons X (XPS)
2.2.2.1.1. Instrumentation
49
Les analyses ont été réalisées avec un spectromètre PHI 5600-ci de Physical
Electronics. La pression minimale de base est de 5 x 10-9 mbar. La ligne Kα est issue
d'une source non-monochromatée de rayon-X d'aluminium (Al Kα = 1486.6 eV) à
300W [120]. Pour les spectres haute résolution, la source est composée de rayons X
monochromatés de magnésium (Mg Kα =1253.6 eV) à 300W. La surface ou aire
mesurée avec la source non-monochromatée de rayon X est de 0.005 cm2. La
profondeur d'analyse pour ce type de source est de 10nm. L'angle entre la normale
de la surface et le faisceau d'émission est de 45°.
2.2.2.1.2. Dérivationchimique
La dérivation chimique est une étape importante permettant d'identifier certaines
fonctions chimiques sur la surface d'un matériau. Il s'agit de procéder à une réaction
chimique entre les fonctions présentes sur la surface et un réactant qui peut être soit
en phase gazeuse soit en phase liquide [157]. Néanmoins le PTFE traité par plasma,
en présence de liquide peut voir sa composition en amine se modifier [158]. Les
réactants en phase gazeuse sont privilégiés comme le 5-bromosalicyladhedyde dont
la température de sublimation se situe aux alentours des 80°C.
2.2.2.1.3. Protocolededérivationchimique
Un bécher de 500mL contenant de l’eau est chauffé par l’intermédiaire d’une plaque
chauffante. Environ quelques dizaines de mg de 5-bromosalicyladhedyde sont
déposés au fond d’un tube de dérivation chimique en pyrex. Le 5-
bromosalicyladhedyde est recouvert de billes en verre. La couche formée par
l’accumulation des billes dans le tube possède une épaisseur de 1 à 2 cm.
L’échantillon de PTFE modifié est déposé au-dessus de cette couche de bille en
s’assurant que la face traitée du PTFE soit orientée vers le fond du tube afin de réagir
avec le réactant à l’état gazeux provenant du fond du tube. Le tube est refermé à
l’aide d’un bouchon. Un thermomètre est introduit dans le bécher afin de contrôler la
température de l’eau permettant de chauffer le tube. La réaction est réalisée à 80°C
50
pendant 2 heures en s’assurant que le niveau d’eau dans le bécher reste toujours à
la mi-hauteur du tube.
2.2.2.2. Protocole ELISA
Le lecteur de plaque utilisé pour les ELISA est un Fluoroskan Ascent provenant de
chez Labsystems. Les échantillons de PTFE sont poinçonnés sous forme circulaire
de 6mm de diamètre puis déposées au fond des puits d'une plaque costar de 96 puits
à l’aide d’une pince en veillant à ce que leur surface fonctionnalisée ne soient pas
retournées vers le fond du puits. Les surfaces sont bloquées avec une solution de
HEPES-5% BSA pendant 2 heures à 37°C. Un volume de 250 μL de solution
HEPES-5%BSA est versé dans chaque puits contenant l’échantillon à analyser. La
plaque est recouverte d’un film de paraffine afin d’éviter une possible contamination.
Les puits sont rincés ensuite avec une solution d'HEPES 7.4 trois fois. Les anticorps
primaires monoclonaux MAB1934 (dilution 1:500) ou polyclonaux F3648 (dilution
1:2500) sont incubés pendant 1h à 4°C en versant 100 μL dans chaque puits. Les
puits sont ensuite rincés avec une solution tampon ELISA (dilution 1:30). Les
anticorps secondaires HRP anti-souris ou anti-lapin sont alors incubés à température
ambiante pendant 1heure en versant 100 μL dans chaque puits. Le rinçage est à
nouveau effectué avec une solution tampon ELISA avant d'appliquer la solution
d'amplex red®. Un volume de 100 μL est ajouté dans chaque puits en s’assurant que
cette étape soit réalisée à l’abri de la lumière. L’ampli red réagit pendant 15 min puis
une quantité de 80μL de chaque puits est transférée dans une nouvelle plaque afin
d’être analysé par un lecteur de plaque.
2.2.2.3. Protocole pour la mesure des angles de contact
Les échantillons sont préparés suivant les étapes présentées en 2.2.1. L'appareil
pour mesurer les angles de contact est un VCA optima de marque AST products Inc.
Au minimum trois gouttes d’eau nanopure de 3µL sont déposées successivement sur
chaque échantillon afin d’effectuer les mesures.
51
3. CHAPITRE 3: Résultats et Discussion
3.1. Analyse XPS des différentes étapes de fonctionnalisation du PTFE
3.1.1. Étude de la fonctionnalisation du PTFE par plasma
L’analyse de l’étape d’amination de la surface de PTFE est réalisée par l’utilisation de
la spectroscopie photoélectronique par rayons X complétée par la méthode de
dérivation chimique. Cette procédure permet de quantifier les amines créées à partir
du traitement plasma parmi les atomes d’azote implantés. Le 5-bromo-salicyaldehyde
va réagir avec les amines situées à la surface afin de laisser place à des atomes de
brome [157]. Ces atomes de brome ajoutés à la surface des échantillons polymères
feront office de marqueur pour les amines ayant réagi.
Les pourcentages de fluor et de carbone de l’échantillon de PTFE initial mesurés sont
respectivement de 66.3% et de 33.7%. Ces pourcentages sont proches de la
composition théorique du PTFE qui compte deux atomes de fluor pour un atome de
carbone (Figure 17).
Après le traitement plasma, le taux de fluor présenté par l’intégration du pic à 685 eV
est de 32.8%, le pourcentage atomique d’oxygène est de 2.3%, d’azote de 10.7% et
de carbone de 54.2% à 285 eV.
Les pourcentages atomiques de fluor, d’oxygène, d’azote, de carbone et de brome
pour la Figure 17 sont respectivement de 29.4%, 4.2%, 5.2%, 57.6% et 3.6%. Le
pourcentage atomique de brome est alors reporté dans la formule suivante :
% 2%
100 9 %100
En prenant le pourcentage de Br de 3.6%, le pourcentage d’amine obtenu est de
5.4%.
52
Figure 17 Spectre XPS de survol pour les échantillons de PTFE et de PTFE traité par plasma avant et après dérivation
chimique
3.1.2. Greffage de la fibronectine sur le PTFE par le Sulfo-KMUS
Les analyses XPS de survol ont été effectuées dans l’objectif de vérifier les étapes de
greffage à la fois du bras d’ancrage Sulfo-KMUS et de la fibronectine. Après le
traitement plasma, les pics à 285eV, 400eV, 532eV et 690eV représentent
respectivement le carbone, l’azote, l’oxygène et le fluor. La composition atomique est
de 53.1% pour le carbone, 11.2% pour l’azote, 2.5% pour l’oxygène et 33.3% pour le
fluor.
Les échantillons avec le bras d’ancrage Sulfo-KMUS après que celui-ci ait réagi en
solution pendant 2 heures, ont été analysés après le rinçage à l’eau et sous vortex
53
des échantillons. Le spectre XPS associé à cet échantillon est présenté dans la
Figure 18. La composition en carbone est de 62.6%, en azote de 4.8%, en oxygène
de 10.1% et en fluor de 22.6%.
Le troisième spectre XPS présenté dans la Figure 18 est le spectre obtenu après
l’analyse des échantillons ayant été traités successivement avec les bras d’ancrage
Sulfo-KMUS puis la fibronectine. La composition atomique suite à l’intégration des
pics est de 66.5% pour le carbone, 6.9% pour l’azote, 10.9% pour l’oxygène et enfin
15.7% pour le fluor.
Dans un premier temps, la présence du Sulfo-KMUS sur la surface du PTFE est
soulignée dans un premier temps par l’augmentation de 2.5% à 10.1% du
pourcentage atomique d’oxygène. En effet, cette augmentation est le témoin des
différents atomes d’oxygène apportés par les fonctions maléimides du bras
d’ancrage, la structure du Sulfo-KMUS ayant 3 atomes d’oxygène au total. Par
ailleurs, l’apport d’atomes de carbone, présents dans la chaine principale du Sulfo-
KUMS, est aussi observé par une augmentation de 53.1% à 62.6%. De surcroît, l’un
des éléments permettant d’observer cette présence est la diminution de 33.3% à
22.6% du taux de fluor qui marque un recouvrement de la surface par les bras
d’ancrage.
Dans un second temps, la réussite du greffage de la fibronectine est soulignée par
une diminution significative de 22.6% à 15.7% du taux de fluor ainsi que par la légère
hausse de 4.8% à 6.9% du pourcentage atomique d’azote.
54
Figure 18 Spectres de survol obtenus pour les différentes étapes de fonctionnalisation avec le Sulfo‐KMUS
55
L’étude des spectres de haute résolution C1s apporte un éclairage sur
l’environnement direct des atomes de carbone présent sur la surface de l’échantillon.
Le spectre haute résolution C1s associé à l’échantillon fonctionnalisé après le
traitement plasma est présenté par la Figure 19. Au sein du pic représentant le
carbone, il peut être isolé quatre composantes dont les énergies de liaisons sont
environ 285eV, 287eV, 289eV et 291eV. Ces composantes représentent
respectivement les formes chimiques C−C et C−H, C−O et C−N, C−F et C꞊O et enfin
CF2.
Après l’amination du PTFE par plasma, la décomposition du pic de carbone donne
38.4% pour les formes C−C et C−H, 14.5% pour les formes C−O et C−N, 13.9% pour
les formes C−F et C꞊O et enfin 33.3% pour la forme CF2.
56
Figure 19 Spectres haute résolution C1s a) échantillon de PTFE après traitement plasma b) échantillon PTFE avec le Sulfo‐KMUS c) échantillon PTFE avec le Sulfo‐KMUS et la fibronectine
Le spectre C1 haute résolution du PTFE après le greffage du Sulfo KMUS (Figure
19b) présente 38.4% des formes C−C et C−H, 8.4% des formes C−O et C−N, 15.5%
57
des formes C−F et C꞊O et enfin 20.2% de forme CF2. Le spectre C1 haute résolution
du PTFE après le greffage du Sulfo KMUS avec la fibronectine (Figure 19c) présente
50.4% des formes C−C et C−H, 17.7% des formes C−O et C−N, 19.9% des formes
C−F et C꞊O et enfin 12.2% de forme CF2. La diminution de la proportion de CF2 de
33.3% à 20.2% atteste du recouvrement du PTFE par les bras d’ancrage. La légère
hausse observée pour le pic à 288eV de 13.9% à 15.5% permet d’identifier les deux
groupements carbonyles introduits par les fonctions maléimides du Sulfo-KMUS.
La structure de la fibronectine contient majoritairement des liaisons peptidiques.
L’influence de ces liaisons sur les spectres de haute résolution avant et après le
greffage de la fibronectine est marquée par l’augmentation des C−N et des C꞊O
représentés par les composantes à 287 et 289eV. Dans un second temps, la
diminution de 20.2% à 12.2% de la proportion de CF2 indique un recouvrement de la
surface par la protéine qui va ainsi faire figure d’écran pour le PTFE et ses
composants lors de l’analyse par XPS.
Cette étude des spectres haute résolution permet comme pour l’étude des spectres
de survol de valider les différentes étapes de greffage pour l’immobilisation de la
fibronectine sur le PTFE.
3.1.3. Greffage de la fibronectine sur le PTFE par le SM(PEG) 2
Contrairement aux analyses XPS avec le Sulfo-KMUS, les spectres de survol pour le
SM(PEG)2 n’ont pas été suffisants pour observer l’efficacité des greffages successifs
du bras d’ancrage et de la fibronectine. Les molécules de PEG étant souvent utilisées
en tant que revêtement afin d'empêcher l'adsorption protéique, leurs caractéristiques
a pu rendre le processus de greffage de la fibronectine en solution plus difficile.
L’étude s’est principalement portée sur les spectres de haute résolution C1s obtenus
après chaque étape de fonctionnalisation du PTFE. Le spectre haute résolution C1s
de l’échantillon de PTFE après traitement plasma (Figure 20a) présente à 285 eV la
composante comportant les formes chimiques C-C et C-H avec un pourcentage de
58
38.4%. Les formes chimiques C-N et C-O sont représentées par la composante à 287
eV dont l’intégration équivaut à 14.5%.
Figure 20 Spectres haute résolution C1s a) échantillon de PTFE après traitement plasma b) échantillon PTFE avec le SM(PEG)2 c) échantillon PTFE avec le SM(PEG)2 et la fibronectine
59
La Figure 20b présente un spectre C1s haute résolution effectué après le greffage du
SM(PEG)2. Les formes C−C et C−H sont présentes à 37.3%, les C−O et C−N à
25.7%, les C−F et C꞊O à 18.9% et les CF2 à 18.2%.
L’échantillon de PTFE après le greffage du SM(PEG)2 avec la fibronectine (Figure
20c) parmi les atomes de carbone mesurés il y a 37.9% de formes chimiques C−C et
C−H, 31.3% de C−O et C−N, 18.9% de C−F et C꞊O et enfin 18.2% de CF2.
La hausse du pourcentage de 14.5% à 25.7% du pic situé à 286eV est due
principalement aux deux C−O contenus dans la chaîne principale des bras d’ancrage
SM(PEG)2. De même, la hausse du pourcentage de 13.9% à 18.9% exprimé par les
formes chimiques C꞊O, C−F est liée à la présence des trois fonctions carbonyles
portées par le SM(PEG)2. De plus, la composante associée aux CF2 passe de 33.3%
à 18.2% ce qui indique le recouvrement du PTFE par le SM(PEG)2.
En comparant les figures, les composantes liées aux liaisons peptidiques contenues
dans la fibronectine telles que les C−N et C꞊O sont étudiés. La hausse observée pour
la composante chimique à ~286eV de 25.7% à 31.3% entre les spectres haute
résolution C1s du PTFE avant et après le greffage via le SM(PEG)2 est due aux C−N
apportées par les liaisons peptidiques de la fibronectine. Cette hausse est l’élément
principal qui permet de constater la présence de la fibronectine car le taux de CF2
~18% reste constant entre les deux étapes et ne peux témoigner d’un éventuel
recouvrement.
60
3.2. Résultats angles de contact
Les angles de contact pour l’échantillon témoin à savoir uniquement le PTFE est de
l’ordre de 108 ± 4° (Tableau 2). Les échantillons de PTFE modifiés avec le SM(PEG)2
et la fibronectine présentent un angle de contact de 72 ± 4° alors que les échantillons
de PTFE où la fibronectine est immobilisée par l’intermédiaire du Sulfo-KMUS est de
85 ± 8°. Les deux types d’échantillons de PTFE modifiés présentent une
hydrophilicité supérieure à celle des échantillons de PTFE bruts.
De plus, conformément à ce que les structures des bras d'ancrage laissaient
présager, le SM(PEG)2 apporte une hydrophilicité supérieure à celle du Sulfo-KMUS.
Ainsi, l’utilisation de ces bras d’ancrage modifie les propriétés de surface du PTFE en
ce qui concerne son hydrophobicité initiale.
Tableau 2 : Tableau de résultats pour les analyses d'échantillon par la mesure d'angle de contact
Échantillons PTFE Sulfo‐KMUS + Fn SM(PEG) 2 + Fn
Angle de contact 108 ± 4° 85 ± 8° 72 ± 4°
61
3.3. Résultats ELISA
Les analyses ELISA polyclonales ont été effectuées dans le but de quantifier la
fibronectine attachée sur la surface du PTFE par l'intermédiaire des bras d'ancrage.
Lors de ces procédures un anticorps primaire anti fibronectine a été utilisé afin de
marquer la fibronectine. Une calibration a été réalisée afin de quantifier la
fluorescence obtenue pour les divers échantillons
L'équation de la droite du domaine linéaire nous permet de déterminer la quantité de
fibronectine ainsi en reportant la valeur de l'intensité de la fluorescence associée aux
échantillons (Figure 21).
Figure 21: Domaine linéaire de la courbe de calibration
Les résultats obtenus montrent que l’échantillon de PTFE non traité et sans
fibronectine possède une fluorescence qui présente une réponse environ deux fois
moins importantes. Néanmoins les différences sont observées excepté pour
y = 2075,2x + 8,1546R² = 0,9839
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10
intensité Fluorescen
ce
Quantité de fibronectine (µg)
62
l’échantillon avec la fibronectine immobilisée par le SM(PEG)2 (Figure 22). L’intensité
de la fluorescence de ce contrôle est substituée aux valeurs obtenues avec les
échantillons comportant de la fibronectine afin de calculer la concentration de la
fibronectine sur chaque surface. La concentration obtenue est de 20 ng/cm2 pour les
échantillons avec la fibronectine adsorbée ou greffée par le Sulfo-KMUS. La
concentration observée pour la fibronectine immobilisée est de 30 ng/cm2. Ces
concentrations sont inférieures à ce qui est généralement observé dans la littérature
pour la fibronectine adsorbée sur un support tel que le PTFE [159,160].
Figure 22: ELISA avec des anticorps primaires polyclonaux (FnA représente la fibronectine adsorbée, FnG représente la
fibronectine greffée)
Les tests ELISA monoclonaux ont été réalisés par l’intermédiaire de l’anticorps
primaire MAB 1934 anti fibronectine destiné à cibler le peptide d’adhésion cellulaire
RGD (Figure 23). La disponibilité des peptides RGD de la fibronectine est
significativement supérieure lorsque celle-ci est immobilisée par l’intermédiaire du
0
10
20
30
40
50
60
70
Téflon Téflon+FnA KMUS‐FnG PEG‐FnG
63
bras d’ancrage SM(PEG)2 en comparaison de la stratégie hydrophobe. Néanmoins,
les résultats obtenus pour les ELISA polyclonales ont souligné la présence d’une plus
grande quantité, de manière non significative, de fibronectine ancrée par cette
stratégie. La disponibilité des sites RGD est cependant plus élevée lorsque la
fibronectine est adsorbée sur l’échantillon.
Figure 23: ELISA avec des anticorps primaires monoclonaux (FnA représente la fibronectine adsorbée, FnG représente la
fibronectine greffée)
D’après plusieurs études [146,161], les supports hydrophobes permettent un meilleur
dépliement de la conformation des protéines adsorbées sur leur surface. Cette
relaxation de la structure de la protéine immobilisée sur une surface hydrophobe est
liée aux forces de dispersion de London qui vont favoriser l'exposition des poches ou
domaines hydrophobes contenus dans sa conformation [162]. En mettant en
perspective les différentes analyses ELISA ainsi que les résultats obtenus pour les
analyses d’échantillon par la méthode des angles de contact, il est observé que les
échantillons de PTFE non fonctionnalisés avec la protéine adsorbée présente une
0
10
20
30
40
50
60
Téflon Téflon+FnA KMUS‐FnG PEG‐FnG
64
plus grande disponibilité de site RGD par rapport aux stratégies d’immobilisation
covalente avec le Sulfo-KMUS et le SM(PEG)2. Néanmoins, les échantillons de PTFE
avec la fibronectine immobilisée via le SM(PEG)2 expose une plus grande
disponibilité de site RGD dans la mesure ou les quantités de fibronectine immobilisée
pour les deux stratégies sont proches.
65
Conclusion
L’objectif initial de ce projet de maîtrise était de moduler la bioactivité de la
fibronectine immobilisée sur du PTFE en faisant intervenir le facteur
d’hydrophobicité/hydrophilicité. La stratégie employée pour immobiliser la molécule
s’effectue en trois étapes successives impliquant des modifications de type physique,
chimique et biologique avec notamment l’intervention de la technique de traitement
de surface par plasma. Ces trois étapes successives constituent un défi pour
préparer des échantillons avec la même quantité de protéine greffées à leur surface
ce qui caractérise l’étape fondamentale à une bonne analyse comparative concernant
la bioactivité du recouvrement crée.
Même si l’efficacité de la fonctionnalisation du PTFE a été observée à la fois par des
méthodes d’analyse telles que l’XPS et l’ELISA, il est important de mentionner les
difficultés rencontrées au niveau de la reproductibilité des résultats d’un échantillon à
l’autre. L’utilisation de bras d’ancrage hétérobifonctionnels présentant des propriétés
d’hydrophobicité différentes a rendu délicat la possibilité de faire une analyse
comparative efficace. Il serait intéressant d’observer le comportement en solution
ainsi que la disposition sur la surface de ces bras ancrage lors du processus de
fonctionnalisation. A ce titre l’absence de résultat probant concernant les analyses
XPS de survol avec les échantillons portant le bras d’ancrage à base de PEG avec la
fibronectine questionne sur le choix d’utiliser cette molécule au sein du bras
d’ancrage. En effet, son utilisation dans le cadre d’un recouvrement de surface est
souvent liée à une volonté d’empêcher l’adsorption de protéine.
Par ailleurs, l’observation de la bioactivité de la fibronectine pourrait être renforcée
par l’usage d’autre technique de caractérisation. La microscopie STED, combinée à
un marquage des protéines par fluorescence, est une méthode dont la résolution est
dix fois supérieure à la résolution maximale d’un microscope confocale. Ainsi cet outil
serait parfaitement adapté pour l’observation des protéines marquées par
fluorescence. De plus, son utilisation pourrait nous idée directe et visuelle sur les
66
divers recouvrements effectués. Des analyses quantitatives et ainsi qu'une étude de
la répartition des protéines et de leur site d'adhésion cellulaire permettrait d'avoir des
renseignements supplémentaires sur l'influence du déroulement de l'étape de
greffage sur la disposition finale des protéines. Cependant le coût important de cette
technique la rend peu accessible à ce jour.
67
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