Bi 231: Ingénierie des Protéines

cours 1

Plan Général

• I. Introduction et rappels.• II. Purification des protéines.• III. Surexpression d'une protéine.• IV. Mutagenèse: techniques et applications. • V. L'insuline : exemple d'une stratégie.• VI. Analyse d'articles.

I. Introduction et rappels.

11 –Objectifs du module.

12 –Rappels : Propriétés physico-chimiques des protéines (aa, pI, spectre d'absorption), structure II, III et IV des protéines, modifications post-traductionnelles.

13 –Rôles des Protéines in vivo.

11 –Objectifs du module :

Notions de bases sur :• Expression de protéines,

• Purification,• mutagenèse.

Pourquoi et comment ?

Définitions :

• Ingénierie des protéines : Ensemble des techniques d’expression et de modifications de protéines recombinantes.

• Protéines recombinantes : Protéines exprimées à partir d’un ADN modifié.

• Vecteur d’expression : molécule d’ADN permettant l’expression d’une protéine dans un hôte donné.

• Hôte : Organisme ou type cellulaire où la protéine est exprimée.

12 –Rappels :

Propiétés physico-chimiques des protéines :

• Une protéine = polymère d’acides aminés.

• Formule générale : 20 types (cf poly)

• pI = point isoélectrique = pH où la charge globale d’une protéine est nulle.

• Masse molaire en kiloDalton (kDa ou kD) (1kD= 1000 g.mol-1).

• Autres caractéristiques :- Spectre visible,- IR, - CD, - RMN,- Spectrométrie de masse,- …

Modifications post-traductionnelles :

Types de modification

- Pont disulfure,- Phosphorylation,- Glycosylation- Acylation - Clivage- Biotinylation- …

Rôles

(a) Régulation de l'activité des protéines

(b) Etiquettage : reconnues par des partenaires métaboliques ou systèmes de dégradation

(c) ancrer dans une membrane

(d) cascades de signalisation(e) adressage (f) définir une identité

immunologique

Structure des protéines

• Structure I : séquence = enchaînement linéaire des aa

• Structure II : repliement d’aa proches, hélice , feuillet , boucles, non structuré (random coil).

• Structure III : interactions des structures II entre elles.

• Structure IV : interactions stables entre plusieurs chaînes polypeptidiques.

Rôle des Protéines in vivo

• Structure• Transport • Stockage • Fixation• Catalyseur• Mécanique• Signalisation• Capteur• Immunité

• kératine• hemoglobine• Ferrétine• • Enzyme• Myosine• Hormones• Guanylate cyclase• anticorps

Plan Général

• I. Introduction et rappels.• II. Purification des protéines.• III. Surexpression d'une protéine.• IV. Mutagenèse: techniques et applications. • V. L'insuline : exemple d'une stratégie.• VI. Analyse d'articles.

II. Purification des protéines.

21 –Buts et objectifs.

22 –Moyens.

23 –Origine de la protéine.

24 –Méthodes de caractérisation.

21 –Buts et Objectifs :

Expression d’une protéine : étudier son fonctionnement, sa structure, …

Modification de sa séquence :• Conséquences sur son fonctionnement,• Facilite sa purification,• Ajout d’autres caractéristiques

(chromophore, épitope => suivit),• …

22 purification d’une protéine

Selon :

• Charge, pI

• Masse moléculaire

• Affinité

• Hydrophobicité/polarité

• Volume

→ Electrophorèse,et chromato échangeuse d’ions

→SDS PAGE et masse→Chromato d’affinité →Chromato hydrophobe

et phase inverse→Tamis moléculaire =

gel filtration

23 Origine de la protéine

• Organisme d’origine (Procaryotes, Archea, Eucaryotes / animaux, végétaux, levures)

• Compartiment cellulaire.

• toxicité

24 Méthodes de caractérisation

• Identité.• Pureté.

• Séquence.• Spectre UV-vis, RMN, IR, Raman, CD, ...

• Tests enzymatiques.• Tests d’affinité (Biacore).

• Immunogénéicité.• ...

Identification d’une protéine.

• Séparation des peptides par gels 2D,• Découpage et extraction,• Digestion trypsique,• Séparation sur C18• Analyse par spectrométrie de masse

Etude d'un protéome d’une cellule à un temps t

Pureté d’une protéine

• SDS-PAGE,

• IEF, gel 2D

• Spectrométrie de masse

• séquençage