banque d'adn 1

7/25/2019 Banque d'Adn 1

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3. Fabriquer une banque3. Fabriquer une banquedADNdADN


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3. Fabriquer une banque dADN3. Fabriquer une banque dADN

lorigine de lADN

Lensemble des clones obtenus sappelle une banque dADN

Les banques dADN sont classes selon :

le vecteur utilispour la fabriquer


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3.1. Les banques dADN gnomique3.1. Les banques dADN gnomique


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3.2. Les banques dADNc3.2. Les banques dADNc

Dfinition:

ADN "complmentaire :copie ADN d'un ARN

copie dpourvue des

introns squences noncodantes du !ne#


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4. Identifier un gne4. Identifier un gnespcifiquespcifique


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4.1. Utilisation de sondes4.1. Utilisation de sondes

petit morceau dADN s$nt%tis dont la squence correspond

au moins en partie & celle d'un des brins du fra!ment dADN que

lon veut identifier

capable de se fier spcifiquement sur l'autre brin

complmentaire de l'autre brin de lADN

Le terme utilis pour identifier un clone est cribla!e (

)onde :


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4.1. Utilisation de sondes4.1. Utilisation de sondes


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4.2. Identiication directe des clones !ar "#bridation4.2. Identiication directe des clones !ar "#bridation

utilisation dune sonde marquee : radioactivit#

rvlation par autoradio!rap%ie


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4.3. Anal#se de lADN clon !ar squen$age4.3. Anal#se de lADN clon !ar squen$age

Dfinition :

Le squen*a!e de lADN est la dtermination de la succession

des nuclotides le composant(

+ec%nique de routine en laboratoire

+ec%nique base sur le mcanisme de rplication de lADN


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4.3.1. La mt"ode de %a&am et 'ilbert4.3.1. La mt"ode de %a&am et 'ilbert

un tube par t$pe de coupure une

aprs ,- aprs A- aprs +- aprs .#(

/n fonction des concentrations

den0$me et dADN- on obtient une

coupure par molcule avec tous les

cas diffrents prsents(


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4.3.2. La mt"ode de (anger4.3.2. La mt"ode de (anger

s$nt%se dADN avec des arr1ts

de s$nt%se- en utilisant des

didso$nuclotides ddNTP)

c%aque tube contient donc en fin

de raction une population de

fra!ments de taille variable- a$ant

tous la m1me etrmit 2 et se

terminant tous en 3 par le m1meddN+4 & toutes les positions

possibles(


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4.4. Anal#se !ar des tec"niques de transert4.4. Anal#se !ar des tec"niques de transert

4.4.. !e sout"ern blot4.4.. !e sout"ern blot

Di!estion de lADN par les en0$mes de restriction

)paration des fra!ments par lectrop%orse

Dp5t dune membrane absorbante sur le!el

Les bandes dADN sont absorbes parcapillarit

Rvlation par autoradio!rap%ie

6mmersion de la membrane dans unesolution contenant la sonde marque


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4.4.2. Autres tec"niques de transert4.4.2. Autres tec"niques de transert

7lan!e dARN spar dans un !el

+ransfert sur une membrane

.ribla!e par une sonde marque

4rincipale application :

dterminer si un !ne est transcrit dans un tissu donn

ou dans certaines conditions eprimentales(

Nort"e# blot :


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4.4.2. Autres tec"niques de transert4.4.2. Autres tec"niques de transert

7lan!e de protines spares dans un !el

+ransfert sur une membrane

.ribla!e par une sonde marque

8 anticorps marqus diri!s contre la protine & identifier

$estern blot :


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I%. Ingnierie gntique desI%. Ingnierie gntique des

plantesplantes


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1. )rinci!e de la mani!ulation gntique1. )rinci!e de la mani!ulation gntique

&tape : .%oi du !ne et introduction du !ne dans un vecteur

&tape ': 6ntroduction du plasmide recombin dans la bactrie

&tape 3 : )lection des cellules transformes

&tape 4 :+ransfert du !ne dans la plante

7t%ode de transfert direct c%imique- p%$sique9#

7t%ode de transfert indirect A!robactries#

&tape ( : R!nration de la plante


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2. Les mt"odes de transert indirect de g*nes2. Les mt"odes de transert indirect de g*nes

4lusieurs souc%es da!robactries dont les plus connues sont :

A!robactrium r%i0o!enes qui %ber!e le plasmide Ri

8 responsable du c%evelu racinaire

8 dveloppement anormal des racines

A!robactrium tumefaciens qui %ber!e le plasmide +i


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2.1. Agrobacterium tumeaciens2.1. Agrobacterium tumeaciens

+actrie du sol , res!onsable de la galle du collet

Rgion du collet(= zone de liaison entre la tige et la racine)

Agrobacterium tumefaciens


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2.1.1. La galle du collet2.1.1. La galle du collet

dveloppement anarc%ique des tissus & lemplacement dune blessure

!alle du collet apparent & un cancer v!tal

Ncrose de la partie arienne et mort de la plante


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.ellules de la tumeur fabrique des molcules :les opines

molcules amais prsentes dans les plantes saines

substances nutritives pour les a!robactries

activent la multiplication des bactries

s$nt%se dopines dtourne les voies du mtabolisme normal dela plante


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Dviation du mtabolisme de ces plantes 8

;pration de ) gnie gntique naturelle *

Responsables :Les agrobactrieset leur !rands plas#idesde b

/emple : le plas#ide +i


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2.1.2. Le !lasmide -i2.1.2. Le !lasmide -i

nomm +ipour +u#or inducing

responsable de la virulence d'Agrobacterium tumefaciens

.e plasmide est utilis de fa*on routinire pour produire desplantes trans!niques(


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arte sim!liie du !lasmide -iarte sim!liie du !lasmide -i

ORI:Origine de rplication

OCC:zone de dgradation des opines par

la bactrie

ADNT:partie trans!re et s"e#pri$ant

uni%ue$ent dans la cellule &gtale

'ren!er$e une !onction ONC responsablede la proli!ration

'ren!er$e une !onction OP responsable

de la snt*+se des opinesTaille : ,-- .b

'li$ite par deu# bordures dites /droites

et gauc*es0


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arte sim!liie du !lasmide -iarte sim!liie du !lasmide -i

?one vir :fonction de virulence-responsable du transfert de lADN@+

Taille : ,-- .b

sa capacit 1 reconna2tre des cellules

&gtales

1 les in!ecter

1 trans!rer de l"ADNT 3us%u"au noau

1 intgrer cet ADNT au gno$e de

la cellule &gtale


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2.1.3. -ransert de lADN dans les cellules /gtales2.1.3. -ransert de lADN dans les cellules /gtales

Lint!ration de lADN@+ au !nome de la cellule v!tale

responsable 8

de la formation de tumeur de la scrtion des opines

4our introduire des !nes nouveau 8

tilisation de la r!ion@+ dun plasmide +i dsarm ne contient

plus les !nes responsables de la tumeur#


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2.1.3. -ransert de lADN dans les cellules /gtales2.1.3. -ransert de lADN dans les cellules /gtales

Les plasmides +i 8

pas de sites uniques de restriction permettant le clona!e

direct de lADN

Avant d1tre transmis &Agrobacterium =

!ne & transfrer doit 1tre introduit dans un vecteure : plasmide#


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a. -ransert de lADN !ar co0intgrationa. -ransert de lADN !ar co0intgration

trans!ert d"un g+ne d"intr4t dans un plas$ided"E.coli

ce plas$ide est appel / inter$diaire 0

le plas$ide est trans!r dans Agrobacteriu$

co$portant un plas$ide dsar$

prsence de s%uence *o$ologue per$et la

reco$binaison des deu# plas$ides

!or$ation d"un grand plas$ide Ti


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b. -ransert de lADN !ar /ecteur binaireb. -ransert de lADN !ar /ecteur binaire

construction d"un &ecteur inter$diaire : 5ordure gauc*e et droite du plas$ide Ti

6e g+ne d"intr4t 7 g+ne de rsistance 1

antibioti%ue

le plas$ide est trans!r dans Agrobacteriu$

co$portant un plas$ide dsar$

pas de s%uence *o$ologue donc pas de

reco$binaison des deu# plas$ides

%uand Agrobacteriu$ parasite la cellule8 elle

ne trans$et %ue le plas$ide inter$diaire


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3. Les mt"odes de transert direct de g*nes3. Les mt"odes de transert direct de g*nes

+ec%niques alternatives au a!robactries

difficile dintroduire de lADN dans des cellules v!tales paroi

cellulosique#

traitement des parois avec des cellulases obtient des protoplastes seulement entours dune membrane

plasmique

,rotoplaste :cellule v!tale artificiellement dbarrasse de samembrane cellulosique ri!ide- !arde ses structures essentielles et son

mtabolisme


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3.1. -ransormation c"imique3.1. -ransormation c"imique

7ise en contact avec certains sels :

.a.l


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3.1. -ransormation c"imique3.1. -ransormation c"imique

,- ou pol/t"/lne gl/col

a!it en prsence de .a


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3.2. -ransormation lectrique , lectro!oration3.2. -ransormation lectrique , lectro!oration

soumettre un mlan!e de protoplastes et dADN & desc%ocs lectriques


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3.3. La micro0inection3.3. La micro0inection

fines pipettes en verre capillaires tirs#

un microscope invers

permet linection dune solution dADN dans le no$au

inconvnient : traitement cellule par cellule


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3.4. La biolistique3.4. La biolistique

bombarder & %aute vitesse des microparticules de tun!stneF de diamtre# enrobes dADN

ADN se r%$drate et peut diffuser

)i la bille a atteint le no$au :

possibilit dint!ration de lADN

dans le !nome(


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3.. Lagrolistique3.. Lagrolistique

drive de la biolistique associe & la transformation indirecte

par les a!robactries

provoque des microblessures dans les tissus

enva%ir avec plus de facilit et de vi!ueur

au!menter le rendement de la transformation


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4. onclusions sur les mt"odes de transerts4. onclusions sur les mt"odes de transerts

!rande batterie de tec%niques de transformation !ntique

facteur limitant : tec%niques de r!nration in vitro

problme : prsence de !nes marqueurs utiliss

!nes de rsistances & des produits c%imiques ou antibiotiques#


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. La rgnration des !lantes !artir de cellules. La rgnration des !lantes !artir de cellules

r!nrer une plante entire & laide de ces cellules transformes

mises dans un milieu de culture %ormones decroissance : des auines et des c$to>ines#

apparition de petites pousses

transfert dans un nouveau milieu de culture permettant ledveloppement des racines

quand racines suffisamment dveloppes : les plantules sontrepiques


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. onirmation de la nature transorme des !lantes. onirmation de la nature transorme des !lantes


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5. A!!lications mdicales5. A!!lications mdicales

1.. -2e#ple du tabac transgnique1.. -2e#ple du tabac transgnique

plants de tabac pour fabriquer des protines

/ : %mo!lobine %umaine

transfert des !nes de l'%mo!lobine %umaine dans un plantde tabac

< !nes interviennent dans la s$nt%se de l%mo!lobine%umaine(


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5.1. 6&em!le du tabac transgnique5.1. 6&em!le du tabac transgnique


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5.1. 6&em!le du tabac transgnique5.1. 6&em!le du tabac transgnique

+ec"nique de llectrop"orse

permet de reprer les allles!nes# dont l'epression donne les

molcules rec%erc%es


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5.2. Autres a!!lications mdicales5.2. Autres a!!lications mdicales


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7. Autres a!!lications7. Autres a!!lications

.. !a protection des cultures

... !a rsistance des plantes au2 insectes

Gaire s$nt%tiser au plantes des protines toiques pour lesinsectes

4roblmes lis au %erbicides

nuisible & l'environnement

populations d'insectes rsistants

parfois inefficaces- suivant le stade de dveloppement de

l'insecte


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7.1.2. La tolrance des !lantes au& "erbicides7.1.2. La tolrance des !lantes au& "erbicides

6ntroduction d'un " !ne de tolrance " dans son !nome

4lante de culture " tolrante " au %erbicides

Hliminer les plantes sauva!es indsirables

soa- betterave- laitue- melon- pomme de terre- bl-col0a- tournesol(((

L'epression du !ne emp1c%e la substance active de dtruirela plante(


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7.1.3. La rsistance au& maladies7.1.3. La rsistance au& maladies

virus

c%ampi!nons

bactries p%$top%at%o!nes

pomme de terre- melon- concombre- betterave- tomate(((

Hviter des pertes de rendements


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7.1.4. La rsistance au& conditions climatiques7.1.4. La rsistance au& conditions climatiques

-spces rsistantes :

au froid

& la sc%eresse

& la salinit9

intr1t pour les pa$s en dveloppement


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7.2. A!!lications industrielles7.2. A!!lications industrielles

4euvent produire par eemple :

des lastomres

des plastiques biod!radables

/: le pol$%$dro$but$rate 4IJ#


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7.3. -ec"nique de d!ollution7.3. -ec"nique de d!ollution

dpollution des sols pollus,lantes utilises co##e agents bio5indicateurs

/ : tabac utilis pour valuer le de!r de pollution par l'o0one 0ones

ncrotiques sur les feuilles#

)biocapteurs*: capacit de pi!er de !randes quantits de polluants :

/ : mtau lourds et autres lments indsirables dans les sols

ammonium- mercure- csium- arsenic9#

/traction des toiques aprs calcination et rductions des cendres

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