aspects physicochimiques de l'encapsulation et de la

1

Thse

Prsente par

Gildas Komenan GBASSI

Pour obtenir le grade de

Docteur de lUniversit de Strasbourg

Discipline : Chimie

Aspects physicochimiques de lencapsulation

et de la dsencapsulation des probiotiques

Soutenue publiquement le 30 novembre 2010 devant la commission dexamen:

Pr. Eric Marchioni Directeur de thse Pr.Thierry Vandamme Directeur de thse Pr. Remi Saurel Rapporteur externe Pr. Samir Benayache Rapporteur externe Dr. Philippe Andre Examinateur Dr. Dalal Aoude-Werner Examinateur

COLE DOCTORALE DES SCENCES CHMQUES

.

.

.

.

N dordre UdS: 825

Thse

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Ce travail de thse a t ralis conjointement au Laboratoire de Chimie Analytique

des Molcules Bioactives (UMR 7178) et au Laboratoire de Conception et Application de

Molcules Bioactives (UMR 7199). Ce travail a donn lieu 2 publications dans des revues

spcialises comit de lecture, ainsi qu 3 communications sous forme de posters aux

congrs internationaux organiss par le groupe de recherche sur la bioencapsulation

(ditions 2007, 2008 et 2009). Les rfrences compltes de ces publications et

communications sont dtailles en annexe de ce manuscrit.

Avant-Propos

Avant-Propos

3

Mes premiers remerciements vont lendroit de mes deux encadreurs, les

professeurs Eric Marchioni et Thierry Vandamme, qui mont accueilli dans leurs laboratoires

respectifs, et mont exprim leur confiance en me permettant deffectuer ce travail de thse.

Vous mavez aid durant ces annes de thse dvelopper une rigueur scientifique et un

esprit critique. Je garderai un souvenir de mon passage ici, qui jen suis convaincu, me sera

dune utilit tout au long de ma carrire professionnelle.

Je suis trs sensible l'honneur que me font les professeurs Remi Saurel (Universit

de Bourgogne, Dijon, France) et Samir Benayache (Universit Mentouri, Constantine,

Algrie) en acceptant d'tre les rapporteurs de ce travail de thse. Soyez assurs de ma

profonde reconnaissance.

Mes remerciements vont lendroit du Dr Philippe Andre, qui de faon spontane,

sest prt certaines de mes questions sur la microbiologie, et qui a accept volontiers de

siger dans ce jury de thse, ainsi quau Dr Dalal Aoude-Werner qui a galement accept de

siger dans ce jury.

Je tiens exprimer ma gratitude envers monsieur Denis HEISSLER, directeur de

lEcole Doctorale des Sciences Chimiques de Strasbourg, pour mavoir mis en contact avec de

nombreux directeurs de laboratoire, dans ma recherche initiale dun laboratoire daccueil.

Jexprime ma reconnaissance au Dr Sad Ennahar pour avoir accept de se joindre

ce travail. Merci davoir pris le temps de porter un jugement sur lensemble de la production

scientifique issue de ce travail (rsum de congrs, proposition darticles, mmoire de

thse).

Ma reconnaisse va galement lendroit du Pr Jean Yves PABST (Doyen de la facult

de pharmacie de Strasbourg) pour ses conseils, son soutien et ses encouragements continus.

Un grand merci aux personnes ci-dessous : Dr Batrice Heurtault (UMR 7199, Facult

de Pharmacie), Dr Nadia Messadeq (Service de microscopie lectronique, IGBMC), Dr

Clarisse Maechling (UMR 7081, Facult de Pharmacie), Dr Bruno Kieffer (UMR 7104, ESBS),

Cyril Antheaume (Service Commun dAnalyse, Facult de Pharmacie) pour mavoir aid

Remerciements

4

comprendre le bien fond et la pertinence des techniques de caractrisation des interactions

molculaires.

Merci au personnel enseignant de mes laboratoires daccueil avec qui jai eu

changer dans le cadre de mon travail (Martine pour les questions de statistique, Franoise

pour la dtermination de la teneur en azote totale des protines, Nicolas tout rcemment

sur les techniques dmulsion).

Merci tous les doctorants que jai ctoys au cours de cette thse, des anciennes

(Amandine, Diane et Esther) pour mavoir aid mintgrer, ceux de ma promotion (Julie,

Pierre, Mustafa), et ceux qui seront encore l pour quelques annes (Carole, Cline, Elie,

Erwan, Etienne, Li, Omar, Zhou).

La vie se droulant galement en dehors du laboratoire, merci tous les amis des

Doctoriales dAlsace 2007, du Nouveau Chapitre de la Thse (ABG 2009), et tous ceux qui

ont contribu rendre mon sjour Strasbourg agrable.

Enfin, un merci spcial ma mre, mon pouse et mes enfants qui nont cess de me

soutenir, et ma famille plus largie, mme si la distance a fait que je nai pu vous voir

frquemment. Je terminerai par remercier mes responsables de lUFR des sciences

pharmaceutiques de luniversit de Cocody (Cte dIvoire), notamment les professeurs Yolou

Seri (Directeur du Laboratoire de Chimie gnrale et minrale) et Malan Anglade (ancien

Doyen de lUFR des Sciences Pharmaceutiques), pour avoir autoris ma si longue absence,

malgr mes charges denseignement.

Remerciements

5

C : Degr Celsius % : Pourcentage ADN : Acide Desoxyribonuclique AFSSA : Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Aliments AG : Acide Galacturonique ARN : Acide Ribonuclique ARNr : ARN ribosomal ATCC : American Type Culture Collection CCRC : Culture Collection and Research Center CIP : Collection de lInstitut Pasteur cm : Centimtre DM : Degr de Methylation DSMZ : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetic EFSA: European Food Safety Authority FAO : Food and Agriculture Oganization (United Nations) GRAS: Generally Recognized As Safe g : Gramme g/L : Gramme par Litre h : Heure ISO : International Standard Organization JOCE : Journal Officiel de la Communaut Europenne JOUE : Journal Officiel de lUnion Europenne KDa : Kilodalton LDL : Low Density Lipoprotein log10 : Logarithme Dcimal M : Molarit ou concentration molaire MM : Masse Molculaire MSDA : Manuel Suisse des Denres Alimentaires m/v : Masse sur Volume MEB : Microscope Electronique Balayage min : Minute mL : Millilitre mm : Millimtre MRS : de Man, Rogosa et Sharp mV : Millivolt NCIMB : National Collection of Industrial and Marine Bacteria NCYS : National Collection of Yeast Cultures nm : Nanomtre OMS : Organisation Mondiale de la Sant PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS : Phosphate Buffer Saline pH : Potentiel Hydrogne SDS : Sodium Dodecyl Sulfate UFC : Unit Formant une Colonie UFC/g : UFC par Gramme UFC/mL : UFC par Millilitre L : Microlitre V : Volt

Liste des abrviations

6

Figure 1. Schma de lappareil digestif de lhomme.

Figure 2. Schma des compartiments de lappareil digestif de lhomme et leurs microflores.

Figure 3. Classification des diffrentes allgations.

Figure 4. Schma du positionnement des aliments fonctionnels.

Figure 5. Procd dencapsulation des bactries par les techniques dextrusion et dmulsification.

Figure 6. Monomres et squences de la chane dalginate.

Figure 7. Principales tapes de la glification des alginates.

Figure 8. Structure de lacide galacturonique des pectines.

Figure 9. Structure et diffrents types de carraghnanes.

Figure 10. Mcanisme de glification des kappa et iota carraghnanes.

Figure 11. Structure tridimensionnelle dun monomre de bta-lactoglobuline.

Figure 12. Schma du procd dencapsulation des souches de L. plantarum

Figure 13. Influence du pH sur le potentiel zta des dispersions aqueuses de biopolymres.

Figure 14. Influence du pH sur labsorbance des dispersions aqueuses de biopolymres.

Figure 15. Reprsentation graphique de la taille particulaire de dispersions aqueuses dalginate et de

protines de lactosrum.

Figure 16. Images macroscopiques de billes frachement labores.

Figure 17. Images de microscopie lectronique balayage de billes lyophilises.

Figure 18. Profil lectrophortique dun chantillon de protines de lactosrum incub pendant 4

heures dans un liquide acide artificiel.

Figure 19. Profil lectrophortique dun chantillon de bta-lactoglobuline incub pendant 4 heures

en prsence denzymes et de sels biliaires.

Figure 20. Morphologie des billes dalginate.

Figure 21. Vue interne des billes dalginate non imprgnes et imprgnes.

Figure 22. Vue externe des billes dalginate non imprgnes et imprgnes.

Figure 23. Spectres infra rouge des billes dalginate de calcium lyophilises

Figure 24. Dispositif exprimental de simulation gastro-intestinale.

Figure 25. Effets du pH sur la survie des bactries encapsules.

Figure 26. Effets du pH, des enzymes et sels biliaires sur la survie des bactries encapsules.

Figure 27. Influence de la matrice alimentaire sur la survie de L. plantarum 299v encapsule.

Liste des figures

7

Tableau 1. Principaux milieux artificiels utiliss pour la simulation du liquide gastrique.

Tableau 2. Principaux milieux artificiels utiliss pour la simulation du liquide intestinal

Tableau 3. Principaux microorganismes considrs comme probiotiques.

Tableau 4. Principales allgations attribues L. plantarum 299v aprs des tudes in vivo chez

lhomme.

Tableau 5. Synthse des avis rendus par lAFSSA depuis 2002 sur les dossiers scientifiques portant sur

des produits probiotiques usage humain.

Tableau 6. Principales sources de polymres naturels.

Tableau 7. Composition en protines de lactosrum du lait bovin.

Tableau 8. Influence de lacidit du liquide gastrique sur la survie des souches libres de probiotiques.

Tableau 9. Conditions exprimentales utilises pour llaboration des billes de biopolymres.

Tableau 10. Tolrance lacidit (pH 1,8) des souches non encapsules de L. plantarum.

Tableau 11. Tolrance lacidit (pH 3) des souches non encapsules de L. plantarum.

Tableau 12. Evaluation de la taille particulaire de dispersions aqueuses dilues dalginate de sodium

et de protines de lactosrum.

Tableau 13. Conditions exprimentales dans le modle gastro-intestinal.

Tableau 14. Concentrations rsiduelles de L. plantarum dans les billes non imprgnes (pH 1,8)

Tableau 15. Concentrations rsiduelles de L. plantarum dans les billes non imprgnes (pH 3)

Tableau 16. Concentrations rsiduelles de L. plantarum dans les billes imprgnes (pH 1,8)

Tableau 17. Concentrations rsiduelles de L. plantarum dans les billes imprgnes (pH 3)

Tableau 18. Vrification de la viabilit des bactries aprs incubation des billes durant 2 h

Tableau 19. Vrification de la viabilit des bactries aprs incubation des billes durant 2,25 h

Liste des tableaux

8

TABLE DES MATRES

AVANT-PROPOS

Remerciements

Liste des abrviations

Liste des figures

Liste des tableaux

NTRODUCTON GNRALE

CHAPTRE 1: CONTEXTE DE LTUDE

1. Physiologie de lappareil digestif humain

2. Microflore intestinale et probiotiques

3. Mthodologie de lencapsulation des probiotiques

CHAPTRE 2: ENCAPSULATON DES PROBOTQUES

1. NTRODUCTON

2. MATRELS ET METHODES

3. RSULTATS ET DSCUSSON

4. CONCLUSON

CHAPTRE 3: DSENCAPSULATON ET DEVENR DES PROBOTQUES

1. NTRODUCTON

2. MATRELS ET METHODES

3. RSULTATS ET DSCUSSION

4. CONCLUSON

CONCLUSON GNRALE

RFRENCES BBLOGRAPHQUES

ANNEXES (Liste des communications et publications scientifiques)

RSUM COURT (versions franaise et anglaise)

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118

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138

158

160

9

NTRODUCTON GNRALE

ntroduction gnrale

10

Les tudes ralises ces dernires annes dans le domaine de lencapsulation ont port

sur de nombreux ingrdients bioactifs de natures diverses (vitamines, enzymes, principes

actifs mdicamenteux, cellules drives du foie ou du pancras, probiotiques etc). Toutefois,

peu dtudes ont t consacres la protection des probiotiques par encapsulation, la

stabilit des systmes de protection mis en uvre, et la libration des probiotiques

encapsuls dans un modle simulant le systme digestif (Chandramouli et al., 2004; Picot et

Lacroix, 2004; Madureira et al., 2005; Mainville et al., 2005). Lutilisation de lencapsulation

comme moyen de protection des probiotiques dans les aliments, ainsi que lvaluation de la

stabilit de ces probiotiques au sein de la matrice alimentaire, ont fait lobjet de peu dtudes

(Sultana et al., 2000; Sun et Griffiths, 2000; Picot et Lacroix, 2004; Michida et al., 2006;

Nebesny et al., 2007).

La tolrance des probiotiques ( ltat non encapsul) aux conditions

environnementales (pH acide, temprature, enzymes, sels biliaires etc) a t largement dcrite

dans la littrature (Sultana et al., 2000; Hansen et al., 2002; Lian et al., 2003; Krasaekoopt et

al., 2004 ; de Giulio et al., 2005; Saarela et al., 2006; Ding et Shah, 2007; Champagne et

Gardner, 2008). Bien que les techniques dencapsulation soient des procds de longue date,

le besoin de comprendre le processus de dsencapsulation (libration) des probiotiques

encapsuls demeure un challenge. Rares sont les tudes qui ont t consacres aux aspects

physicochimiques de cette dsencapsulation.

Lengouement suscit par lencapsulation des probiotiques date des annes 1980. En

effet, les premiers travaux publis ont port sur les ferments lactiques du yaourt, savoir

Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. Ces espces lactiques ont t piges

dans des hydrogels dalginate de calcium (Prevost et al., 1985). Dautres espces de ferments

lactiques ont aussi t piges dans des hydrogels dalginate de calcium (Prevost et Divies,

1987; Steenson et al., 1987; Audet et al., 1991). Dautres encore lont t dans des hydrogels

base dun mlange de carraghnane et de gomme caroube (Audet et al., 1988).

A partir des annes 1990 sont apparues de nouvelles formes galniques capables

dimmobiliser les ferments lactiques. Ce sont notamment les billes (Divies et al., 1990;

Lacroix et al., 1990; Kearney et al., 1990; Champagne et al., 1992a) et les capsules (Yoshioka

et al., 1990; Cheong et al., 1993; Yoo et al., 1996). Le cur dune capsule est un liquide

envelopp dune membrane de biopolymre. Daprs Yoo et al. (1996), la croissance des

ntroduction gnrale

11

cellules est beaucoup plus importante dans les capsules. Toutefois, ces capsules demeurent

instables aprs la production dacide lactique par les cellules au cours de la fermentation. La

mise au point des capsules fait appel aux techniques dmulsification (Arnaud et al., 1992;

Poncelet et al., 1999). Lajout de tensioactifs est fortement conseill pour stabiliser lmulsion

en formation (Sheu et al., 1993; Yoo et al., 1996; Kebary et al., 1998). Parfois, des solvants

organiques (glutaraldhyde, hexamthylne-1-6 diisocyanate, tolune 2-4 diisocyanate) ont

t utiliss au cours de lmulsification comme agents de rticulation (Groboillot et al., 1993;

Hyndman et al., 1993).

A loppos des capsules se trouvent les billes qui sont formes dune matrice

(Totosaus et al., 2002). La stabilit de la matrice dpend des caractristiques

physicochimiques du biopolymre (composition chimique, masse molculaire etc). Elle

dpend aussi du type dinteractions (interactions lectrostatique, hydrophobe, covalente etc)

que peut tablir le biopolymre dans des conditions de temprature, de pH, de force ionique

ou de salinit du milieu (Totosaus et al., 2002; Draget et al., 2009). Lapparition dans les

annes 1990 dune gnration de bioracteurs, quips de multiples aiguilles, a permis de

produire lchelle industrielle des billes de appa-carraghnane (Hunik et Tramper, 1993) et

dalginate (Seifert et Philips, 1997a ; Brandenberger et Widmer, 1998).

Certains de ces bioracteurs ont produit des billes de 800 m de diamtre (Seifert et

Philips, 1997a). Dautres par contre ont produit des billes denviron 470 m de diamtre, avec

une capacit de production de 50 billes par seconde (de Vos et al., 1997). Brandenberger et

Widmer (1998) ont propos un bioracteur capable de gnrer des billes dun diamtre moyen

de 340 m, pour un traitement de 5 litres de suspension par heure. En gnral, ces

bioracteurs affichent les paramtres rhologiques et viscolastiques de la suspension,

permettent une strilisation interne des aiguilles par une vapeur 120C, procdent

lenrobage des billes aprs leur formation. Labsence de contamination croise est aussi un

des avantages majeurs de la plupart de ces bioracteurs. Malgr la performance de ces

derniers, leur cot lev limite leur utilisation dans les laboratoires universitaires.

Lobjectif de ce travail de thse a t dencapsuler des probiotiques, afin de les

protger, mais surtout, de dterminer les conditions de leur libration dans des situations

exprimentales bien dtermines. Les travaux exprimentaux de cette thse sont exposs dans

les chapitres 2 et 3 de ce manuscrit. Le chapitre 2 traite de lencapsulation des probiotiques.

ntroduction gnrale

12

Ce chapitre se focalise sur les conditions de fabrication des billes base de biopolymre, de

mme que sur les conditions de leur optimisation. Des paramtres physicochimiques (charge

lectrique, turbidit, taille particulaire, pH) des biopolymres en suspension ont t

dtermins. Ce chapitre se termine par un examen macroscopique et microscopique des billes

fabriques. Le chapitre 3 sest intress au pouvoir de protection des billes fabriques. Le

niveau de protection des probiotiques immobiliss dans les billes a t valu. Lincubation

des billes dans des milieux artificiels simulant des conditions gastrique et/ou intestinale a t

ralise. Le pouvoir de protection des billes a aussi t valu au sein dun environnement

simulant une matrice alimentaire. Enfin, un modle exprimental du tractus gastro-intestinal

artificiel a permis de dterminer les conditions de libration des probiotiques encapsuls.

Toutefois, un chapitre 1 bibliographique dnomm "Contexte de ltude" a pass en

revue les principales fonctions de lappareil digestif quil convient de rappeler, tant donn

que la sphre digestive est le lieu de prdilection des probiotiques. Les milieux artificiels

simulant lappareil digestif, ainsi que la microflore intestinale dont est issue une bonne partie

des probiotiques, ont galement t abords. Lintrt de la protection des probiotiques par

encapsulation, de mme que les mthodes et matriaux dencapsulation applicables aux

probiotiques, viennent mettre un terme ce chapitre.

ntroduction gnrale

13

CHAPTRE 1:

CONTEXTE DE LTUDE

Chapitre 1 : Contexte de ltude

14

1. Physiologie de lappareil digestif humain

Tous les organismes vivants ont un appareil spcialis dans la digestion et labsorption

des nutriments. Cet appareil diffre dune espce une autre dans son anatomie et

lorganisation de ses fonctions. Cest ainsi que chez lhomme, la fermentation des fibres a lieu

dans le clon (partie terminale du tube digestif faisant suite lintestin grle) alors quelle a

lieu chez les ruminants dans le rumen (partie situe au dbut du tube digestif avant lintestin

grle) (Cuillerier et Marteau, 2002). Une bonne connaissance de la physiologie de lappareil

digestif humain est indispensable si on dsire utiliser des modles in vitro pour simuler le

systme digestif. Chez lhomme, lappareil digestif reprsent la figure 1, est compos du

tube digestif et des glandes annexes. Ces dernires comprennent les glandes salivaires, le foie

et le pancras.

Figure 1. Schma de lappareil digestif de lhomme (daprs Cuillerier et Marteau, 2002) (1) Oesophage (2) Estomac (3) Duodnum (4) Jjunum + Ilon (5) Caecum (6) appendice (7) Clon (8) Rectum (9) Anus

La morphologie et la structure du tube digestif varient dune personne une autre en

termes de dimension et de zone de surface dabsorption (Desesso et Jacobson, 2001). Le tube

digestif permet labsorption slective de nutriments ncessaires au maintien dun tat

nutritionnel adquat (Cuillerier et Marteau, 2002). Labsorption nest possible, en rgle

gnrale, que pour de petites molcules. Une digestion pralable des aliments est ncessaire

pour les transformer en nutriments absorbables. La motricit permet de contrler le temps de


15

rsidence des aliments dans les diffrents compartiments du tube digestif (estomac, intestin

grle et clon). Le tube digestif de lhomme assure plusieurs fonctions.

1.1. Fonction de digestion

La digestion est la dpolymrisation des molcules complexes ingres, suivie de leur

transformation en nutriments simples absorbables. Elle est facilite par la mastication

pralable et les mouvements de trituration et de brassage des aliments. Elle fait appel des

enzymes et des scrtions non enzymatiques qui maintiennent le chyme ltat liquide. La

salive est le premier lubrifiant des aliments. Elle contient lamylase salivaire qui dbute la

digestion de certains aliments comme les amidons. La salive contient aussi une lipase dite

linguale qui agit uniquement au niveau de la cavit buccale (Cook et al., 1994), et qui

hydrolyse une trs faible quantit de triglycrides (moins de 2%) en acides gras libres

(Armand, 2008). Dans lestomac, les scrtions gastriques sont le rsultat de cellules

spcialises dans la production dacide chlorhydrique.

Le pH acide de lestomac participe la dnaturation des constituants alimentaires (cas

de certaines protines comme lalbumine bovine srique). Dautres cellules scrtent la

pepsine: une protase dont lactivit est optimale des pH compris entre 1,7 et 3,5 (Hersey,

1994; Tobey et al., 2001). Il existe une lipase gastrique (Canaan et al., 1999) qui hydrolyse 25

40% des triglycrides dans lestomac (Armand, 2008), librant des acides gras libres

directement absorbs dans la muqueuse gastrique. Carriere et al. (2000) ont tudi les effets

des lipases gastrique et intestinale chez des volontaires sains, aprs leur avoir fait absorber un

repas lipidique solide et/ou liquide (repas principalement riche en triglycrides).

La recherche des produits du catabolisme des triglycrides (diglycrides,

monoglycrides, acides gras libres) la sortie de lestomac et au niveau du duodnum t le

principal indicateur du degr de lipolyse. Les auteurs ont rapport (en se rfrant aux masses

molculaires des composs dtects) la prsence de triglycrides, de diglycrides, de

monoglycrides et dacides gras libres dans les liquides gastriques et duodnaux. Dans

lintestin, les enzymes pancratiques sont nombreuses et de structures varies (Coan et Travis,

1972; Terata et Nakanuma, 1995; Rose et al., 2003).


16

On distingue les enzymes protolytiques (trypsine, chymotrypsine, carboxypeptidases

etc), les enzymes lipolytiques (lipase, phospholipase etc), les enzymes glycolytiques

(amylase) et les enzymes nuclolytiques (ribonuclase, DNAse etc). La bile quant elle est

secrte par le foie, et est stocke dans la vsicule biliaire sous la forme dacides biliaires

(Hoffmann, 1994a). Dverss dans le duodnum, les acides biliaires sont prsents dans les

autres compartiments de lintestin grle, et en faible concentration dans le clon (Hoffmann,

1994b). Les acides biliaires ont un rle essentiel dans lmulsification des graisses.

Lmulsion qui en rsulte est attaque par les lipases pancratiques. Ces dernires terminent la

digestion des matires grasses, et conduisent la formation dacides gras libres, de

monoglycrides et de lysophospholipides (Armand, 2008).

1.2. Fonction dabsorption

Labsorption est le processus qui permet le passage slectif des nutriments dans la

circulation sanguine. Elle a lieu pour lessentiel dans lintestin grle. Les mcanismes

dabsorption diffrent selon les substances absorbes (Leverve, 1999). Dans le cas des

protines, leur digestion aboutit la libration de peptides et dacides amins qui sont

absorbs au niveau des entrocytes de lintestin grle, par un mcanisme actif impliquant un

transporteur et un apport dnergie. Le transporteur est diffrent selon quil sagisse dacides

amins neutres, acides ou basiques (Gardner, 1994). Labsorption des peptides est

quantitativement trs faible, mais reste possible (Gardner, 1994; Chabance et al., 1998).

Labsorption des lipides fait intervenir des mcanismes complexes. Leur solubilisation

sous la forme de micelles ncessite une quantit suffisante de sels biliaires dans la lumire

intestinale. Les micelles se dissocient par la suite, facilitant le passage des constituants

lipidiques dans la membrane des entrocytes, lexclusion des sels biliaires qui restent dans

la lumire intestinale.

Dans lentrocyte seffectue la synthse de triglycrides et dapolipoprotines.

Lassociation de triglycrides, dapolipoprotines, de phospholipides et de cholestrol forme

les chylomicrons (Tso, 1994). Labsorption des glucides comme le glucose, le galactose et le

fructose se fait principalement au niveau du duodnum et du jjunum (respectivement premier

et deuxime compartiment de lintestin grle). Le glucose et le galactose sont absorbs selon


17

un mcanisme actif alors que labsorption du fructose se fait par diffusion facilite. Les

glucides non absorbs arrivent dans le clon o ils sont hydrolyss en sucres simples sous

laction de la microflore colique (Cummings, 1995). Au niveau des minraux, labsorption est

fonction de la nature du minral impliqu. Lexemple du fer montre que ce dernier est absorb

au niveau du duodnum et du jjunum, selon un processus actif rgul en fonction de ltat

des stocks de fer (Andrew, 1999). Labsorption du fer dpend de sa forme physicochimique.

Le fer organique li lhmoglobine est absorb plus vite que le fer inorganique ferreux, ce

dernier encore plus rapidement que le fer ferrique.

Les vitamines hydrosolubles sont absorbes dans le duodnum et le jjunum

lexception de la vitamine B12. Cette dernire est absorbe grce un rcepteur spcifique

prsent dans lilon (troisime compartiment de lintestin grle). Les vitamines liposolubles

(A, D, E, K) sont absorbes avec les lipides. Cette absorption dpend de la prsence de sels

biliaires et de la formation de micelles (Cuillerier et Marteau, 2002). Leau et les lectrolytes

comme le Na+ sont absorbs par voie essentiellement paracellulaire (par les pores des

jonctions serres) selon un gradient dosmolarit. La permabilit leau varie selon les sites

du tube digestif: elle est trs faible dans lestomac mais importante dans lintestin grle et le

clon (Cuillerier et Marteau, 2002).

1.3. Fonction de motricit

La motricit digestive permet le brassage du chyme, mais surtout, le contrle du temps

de rsidence des aliments dans chaque compartiment du tube digestif. Au niveau du pharynx

et de lsophage sont mis en uvre diffrentes activits motrices. Ces activits, contrles

par le systme nerveux central, permettent dacheminer rapidement les aliments dans

lestomac (Dent et Holloway, 1996). La fonction motrice de lestomac se manifeste dans la

digestion des aliments. Lestomac joue un rle de rservoir et intervient dans le brassage et le

broyage des aliments. La vidange gastrique dpend du volume de laliment prsent et de sa

composition. La vidange des liquides est plus rapide que celle des solides (Malmud et al.,

1982). La rgulation de la motricit et de la vidange gastrique est complexe (Cuillerier et

Marteau, 2002). Les diffrentes activits motrices de lestomac assurent le passage du contenu

du bol alimentaire vers le duodnum.


18

Lintestin grle facilite le mlange de laliment avec les scrtions enzymatiques et

biliaires, et favorise la progression de laliment vers le clon (Bassotti et al., 1999; Rao,

2009). Le clon, dans les conditions physiologiques, remplit une triple fonction. La premire

est lachvement de labsorption de leau, des lectrolytes et des sels biliaires non absorbs

dans lintestin grle. La seconde est la fermentation des rsidus glucidiques, source de

facteurs trophiques pour la muqueuse colique, et dnergie pour lorganisme. La troisime est

le stockage des rsidus de la digestion (Ducrotte et Gourcerol, 2005).

Lactivit motrice du clon intervient dans la progression du contenu intestinal et dans

la fonction de rservoir (Camilleri et Ford, 1998). La motricit colique varie au cours du

nycthmre: elle est faible pendant le sommeil, elle augmente aprs les repas ou lors dune

activit physique. Lanus et le rectum ont pour fonction essentielle dassurer la continence ou

la dfcation. Leur motricit et leur physiologie sarticulent autour dun quilibre entre ces

deux fonctions. Ces fonctions sont sous le contrle de lindividu qui choisit de rpondre ou

non ce besoin en fonction des conditions dans lesquelles il se trouve (Ducrotte et Gourcerol,

2005).

1.4. Fonction de barrire slective

Le tube digestif est quip de nombreux moyens de dfense contre des

microorganismes pathognes (Marteau, 2000b). La motricit gastro-intestinale est un moyen

de contrle des populations bactriennes dans lintestin. Lacidit de lestomac est une

barrire la survie des microorganismes. Toutefois, certains microorganismes peuvent

survivre durant la traverse de lestomac, grce une capacit intrinsque leve de rsistance

lacidit, ou la faveur dune baisse de la scrtion acide de lhte, ou bien la protection

confre par certains aliments pouvoir tampon lev (Mahida et al., 1997; Marteau, 2000b).

Les scrtions acides, biliaires et enzymatiques ont des effets bactriostatiques voire

bactricides. Le mucus exerce des proprits dadhrence en mimant les rcepteurs bactriens.

La flore endogne soppose le plus souvent la colonisation du tube digestif par des

microorganismes trangers. Ces diffrents moyens de dfense constituent des barrires de

protection. En cas de rupture de cette barrire, il est possible dassister une prolifration de

microorganismes pathognes dans le clon, cest le cas notamment de Clostridium difficile

(Marteau, 2000c). Dautres moyens de dfense existent et se rapportent limmunit digestive


19

(Mestecky, 1998). En effet, lintestin est le premier organe immunitaire de lorganisme. Sa

muqueuse renferme environ 60% des cellules immunitaires qui assurent deux types de

rponse immunitaire. La rponse immunitaire mdiation cellulaire qui est assure par les

lymphocytes T de la muqueuse intestinale, et la rponse immunitaire mdiation humorale

qui est assure par des anticorps, principalement des immunoglobulines de type A (Mestecky,

1998; Cellier et al., 2000).

1.5. Appareil digestif et milieux artificiels simuls

Dans la littrature scientifique, des modles exprimentaux de simulation gastro-

intestinale ont t dcrits. Ces modles valuent la tolrance des microorganismes lacidit,

la bile et aux enzymes. On retrouve globalement deux types de modles exprimentaux,

mieux connus sous les appellations de "modle conventionnel" et de "modle dynamique". Le

modle dynamique diffre du conventionnel par son caractre semi-automatis. Diffrentes

approches de simulation ont t proposes. Le modle conventionnel simule soit la partie

gastrique du tube digestif, soit la partie intestinale.

De faon gnrale, le modle conventionnel est constitu dun racteur contenant le

liquide artificiel. Par contre, le modle dynamique est constitu de plusieurs racteurs. Le

racteur est le plus souvent un rcipient en verre (bcher, erlenmeyer) ou non (tube Falcon,

microplaque etc). A lorigine, le modle dynamique tait compos de cinq racteurs

interconnects. Les racteurs 1 et 2 ont respectivement simul lestomac et lintestin grle,

alors que les racteurs 3, 4 et 5 ont simul les trois compartiments du clon (clon ascendant,

clon transverse et clon descendant) (Molly et al., 1993). Par la suite, le modle est pass

quatre racteurs qui ont simul cette fois-ci lestomac, et les trois compartiments de lintestin

grle (duodnum, jjunum et ilon) (Minekus et al., 1995). Les modles proposs par la suite

sont passs deux racteurs, dont lun a permis de simuler lestomac et lautre la partie

suprieure de lintestin grle (Mainville et al., 2005).

Le rcent modle propos par Barmpalia-Davis et al., (2008), plus labor dans son

architecture, comprenait les lments suivants: deux racteurs dune capacit de 500 mL,

quatre pompes pristaltiques, deux pH-mtres et un bain-marie stabilis 37C. Le racteur 1

a simul lestomac, le racteur 2 a simul toute la partie intestinale. La pompe 1 a dlivr un

aliment liquide dans le racteur 1 (estomac). La pompe 2 a transfr laliment liquide du


20

racteur 1 vers le racteur 2 (partie intestinale). La pompe 3 a dlivr la bile dans le racteur

2. La pompe 4 a aussi dlivr des scrtions pancratiques dans le racteur 2. Le pH-mtre 1 a

contrl le pH du racteur 1 et le pH-mtre 2 a contrl celui du racteur 2. Lensemble du

dispositif a t coupl un ordinateur central.

Un modle dynamique de simulation exclusive des diffrents compartiments du clon

a t dcrit dans la littrature (Macfarlane et al., 1998; FSA, 2005). Quel que soit le type de

modle utilis, celui-ci doit contenir un liquide de simulation gastro-intestinale. Les

principaux liquides artificiels utiliss pour la simulation de la partie gastrique sont dtaills

dans le tableau 1.


21

Tableau 1. Composition des principaux milieux utiliss pour la simulation du liquide gastrique.

Nature et composition du milieu pH Concentration en pepsine (g/L)

Volume (mL)

Dure de lexposition (min)

Rfrences

Milieu base de NaCl (2 g/L) 1,55 1,55 2 2 et 3

0 0 0 0

10 10 5 10

120 180 60 120

Krasaekoopt et al. (2004) Lee et Heo (2000) Annan et al. (2008) Hansen et al. (2002)

Milieu base de NaCl (5 g/L) 2 2 2 et 3

3 3 3

10 2 10

60 180 240

Chen et al. (2006) Michida et al. (2006) Lian et al. (2003)

Milieu base de NaCl (8,5 g/L) 2,5 1,5 ; 2 et 3 2

3 3 0

np np 30

90 90 120

de Giulio et al. (2005) Izquierdo et al. (2008) Shima et al. (2006)

Milieu base de NaCl (9 g/L) 1,8 3 10 120 Gbassi et al. (2009)

Milieu base de HCl (3,65 g/L) 1,1 1,9 1 et 2

0 0,26 0

10 80 np

120 30 120

Graff et al. (2008) Picot et Lacroix (2004) Favaro-Trindade et Grosso (2002)

Milieu base de MRS (55 g/L) 2 0 np 120 Ding et Shah (2007)

Milieu base de peptone (7,5 g/L) 1 ; 2 et 3 0,3 10 20 FSA (2005)

Milieu base de fromage (8,5 g/L) 2,5 et 3 2 et 3

0,016 0

np np

120 180

Madureira et al. (2005) Vinderola et al. (2000)

Milieu contenant glucose (3,50 g/L) NaCl (2,05 g/L) KCl (0,37 g/L) KH2PO4 (0,60 g/L) CaCl2 (0,11 g/L) bile de porc (0,05 g/L) et lysosyme (0,10 g/L)

2

0,013

np

90

Corcoran et al. (2005)

Milieu contenant lait crm (12 g/L) glucose (2 g/L) extraits de levures (1 g/L) et cystine (0,05 g/L)

2 et 3 2 et 3

0 0

10 10

60 180

Chandramouli et al. (2004) Sultana et al. (2000)

(np) non prcis


22

A la lecture du tableau 1, il est vident que les milieux proposs sont de nature et de

composition variables. Ces milieux ont t utiliss pour tudier la tolrance des probiotiques

lacidit. Une prfrence pour le milieu NaCl a t constate. Plus de la moiti des auteurs

lont propos. Il est noter que les concentrations de 2 et 5 g/L de NaCl utilises semblent

insuffisantes pour maintenir lisotonie du milieu. En effet, dans le contexte dune cellule, le

compartiment intracellulaire et le compartiment extracellulaire sont spars par une

membrane plasmique semi-permable.

Pour les soluts qui ne peuvent traverser passivement la membrane plasmique, il

sapplique alors le phnomne dosmose. Leau va diffuser vers le compartiment qui est le

plus concentr pour diluer le solut qui ne peut traverser la membrane plasmique, et remdier

ainsi la diffrence de concentration en soluts de part et dautre de la membrane. Une

solution isotonique par rapport au milieu intracellulaire contient une quantit de soluts

dissous gale celle du cytoplasme.

Dans les procdures microbiologiques ncessitant lutilisation de diluant isotonique, le

srum physiologique 0,9% (9 g/L de NaCl) est utilis pour la suspension et/ou la dilution de

microorganismes non exigeants. Il est galement utilis pour la prparation de suspension de

cellules microbiennes, comme les suspensions de bactries. Il a t recommand par la socit

amricaine de microbiologie dans les tests de tolrance aux substances antimicrobiennes

(Gerhardt, 1981; Chapin et Lauderdale, 2003). Les auteurs ont rapport que le phosphate

(Na2HPO4, NaH2PO4, K2HPO4 et KH2PO4) peut tre ajout au milieu NaCl pour le

tamponner. Dans ce cas, la concentration en NaCl doit tre ramene entre 8 et 8,5 g/L.

Le NaCl fournit un milieu isotonique qui maintient lintgrit et la viabilit des

cellules microbiennes. En outre, les phosphates garantissent une valeur de pH physiologique

stable (entre 5,8 et 7,4) cause de leur pouvoir tampon, ce qui participe au maintien de la

viabilit des cellules. Cette stabilit du pH est perturbe ds lors que le milieu est acidifi,

des pH semblables ceux rencontrs dans le liquide gastrique.

Lutilisation dune solution aqueuse dacide chlorhydrique en tant que milieu gastrique

artificiel peut tre prjudiciable la survie des microorganismes, du fait dun manque

disotonie. Les milieux base de MRS et de peptone, ainsi que les milieux contenant des

ingrdients alimentaires (fromage, lait crm), au-del des lments nutritifs quils peuvent


http://en.wikipedia.org/wiki/Disodium_phosphatehttp://en.wikipedia.org/wiki/Disodium_phosphatehttp://en.wikipedia.org/wiki/Monosodium_phosphatehttp://en.wikipedia.org/wiki/Monosodium_phosphate

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procurer la cellule, peuvent se rvler instables en cas de modification du pH. Cest le cas de

certaines protines comme lalbumine bovine srique qui est hydrolyse en milieu acide.

Concernant le degr dacidit des milieux proposs, il est noter que les valeurs de pH varient

entre 1 et 3. Cet intervalle de pH couvre les valeurs de pH gnralement observes au niveau

gastrique chez lhomme (Lubran, 1966).

Au cours dune investigation clinique portant sur lvaluation du degr dacidit du

liquide gastrique humain, Lubran (1966) a dos par titrimtrie 177 chantillons de liquide

gastrique, prlevs par intubation, chez des sujets sains. Lauteur a rapport que les valeurs de

pH obtenues taient toutes infrieures 3, et a mis en vidence trois valeurs frquentes (pH

1,02; 1,50 et 2,39). Labsence de donnes rcentes sur les valeurs de pH du liquide gastrique

tmoigne de la complexit de la mesure de lacidit gastrique chez lhomme (Lubran, 1966;

Christiansen, 1967).

Lun des obstacles la mesure de lacidit gastrique demeure lchantillonnage. En

effet, la technique daspiration du liquide gastrique (par intubation) est une contrainte la

slection de potentiels volontaires sains. Le second obstacle se rapporte au dosage de lacidit

du liquide gastrique et linterprtation des rsultats de ce dosage. Le liquide gastrique est un

mlange dacide fort (acide chlorhydrique) et dacides faibles (acides organiques comme

lacide citrique) (Lubran, 1966).

Le dosage de lacide chlorhydrique, qui est un bon indicateur de lacidit gastrique,

reflte mieux la ralit lorsque le point final du dosage est fix pH 3,5 (Lubran, 1966;

Christiansen, 1967) et non pH 7 (Bock, 1962; Baron, 1963). Pour Pratha et al. (2001), la

production inconstante dacide chlorhydrique dans lestomac ne permet pas de garantir un pH

stable. Linstabilit du pH gastrique est galement d au volume de liquide gastrique qui nest

pas toujours constant la sortie de lestomac (Pratha et al., 2001). En pratique, la mesure du

pH demeure le procd en vigueur pour dterminer le degr dacidit dun milieu gastrique

artificiel.

Dans le tableau 1, la pepsine a parfois t utilise comme modle denzyme gastrique.

Des divergences ont t notes quant la concentration de pepsine utilise. Les donnes de la

littrature sur la physiologie digestive mentionnent la prsence de pepsine au niveau gastrique

(Hersey, 1994; Tobey et al., 2001; Roberts et al., 2007). Par contre, aucune information nest

ce jour disponible sur la concentration exacte de cette enzyme au niveau gastrique. Cela


24

sexplique par le fait que la pepsine est scrte sous la forme de pepsinogne (forme

inactive) qui est ensuite active en pepsine en fonction du pH du milieu (Hersey, 1994).

Lactivit de la pepsine ncessite un pH < 5,6. Cette activit est optimale pour des valeurs de

pH comprises entre 1,7 et 3,5 (Hersey, 1994; Tobey et al., 2001). Tout milieu gastrique

artificiel doit donc inclure cette enzyme dans sa composition.

Sagissant du volume de liquide gastrique utilis pour la simulation in vitro, de

nombreux auteurs ont omis de le mentionner dans leurs publications (Vinderola et al., 2000;

Favaro-Trindade et Grosso, 2002; Corcoran et al., 2005; Madureira et al., 2005; de Giulio et

al., 2005; Ding et Shah, 2007; Izquierdo et al., 2008). Toutefois, un volume de 10 mL a t

rapport dans la plupart des tudes. Ce volume bien que trop faible pour reprsenter le liquide

gastrique, peut cependant se justifier par des besoins dconomie en consommables (ractifs,

enzymes etc) et de praticabilit lors des manipulations. Les donnes de la littrature sont

quasi-inexistantes en ce qui concerne le volume dun estomac rempli ou jeun.

Enfin, pour ce qui est de la dure dincubation dans les milieux artificiels, il a t

observ des divergences. Une dure de 120 min a t note dans 40% des cas. Des dures de

180 min (20% des cas) ou de 60 et 90 min (15% des cas) ont galement t observes. Des

dures de 20 min (FSA, 2005) ou de 30 min (Picot et Lacroix, 2004) sont trop faibles,

largement en dea de la dure du sjour de laliment dans lestomac. A loppos, une dure de

240 min dans le milieu gastrique artificiel apparat excessive (Lian et al., 2003). En effet,

Malmud et al. (1982) au cours dune tude clinique, ont montr quune dure de 120 min tait

ncessaire pour assurer la vidange gastrique de 60% dun repas semi-solide, et de 90% dun

repas liquide. Graff et al. (2000) ont aussi montr quune dure moyenne de 120 min dans

lestomac tait necessaire pour assurer la vidange de la moiti de son contenu (aliment semi-

solide). Une tude mene chez des sujets dun plus jeune ge (5 10 ans) a conclu une

dure moyenne de 107 min pour assurer la vidange de la moiti du contenu de lestomac de

ces enfants, aprs absorption dun repas semi-solide (Singh et al., 2006). Une dure

dincubation de 120 min est donc raisonnable pour le sjour des probiotiques dans un milieu

gastrique artificiel.

Dans le tableau 2 sont prsents les milieux artificiels utiliss pour la simulation de la

partie intestinale. Les milieux contenant uniquement la bile en solution aqueuse nont pas t

rpertoris dans ce tableau. En effet, la bile ne saurait reprsenter elle seule le liquide


25

intestinal simul. Dans lintestin grle se trouvent la bile et le suc pancratique. Ce dernier

contient des enzymes pancratiques (Cuillerier et Marteau, 2002; Ouwehand et Vesterlund,

2003). Les tudes associant la prsence de bile et dau moins une enzyme pancratique ont t

privilgies.


26

Tableau 2. Composition des principaux milieux utiliss pour la simulation du liquide intestinal.

Nature du milieu pH Concentration en bile (g/L)

Concentration en enzymes (g/L)

Volume (mL)

Dure de lexposition (min)

Rfrences

Pancratine Trypsine

Milieu base de Na2HPO4 (2,84 g/L)

7,5 150 1,95 0 np 360 Picot et Lacroix (2004)

Milieu base de PBS (1 mol/L) 8 1 1 0 np 120 FSA (2005)

Milieu base de PBS (np)

7,4 2 1 0 np 180 Duc et al. (2004)

Milieu base de NaCl (5 g/L) 8 45 1 0 np 180 Michida et al. (2006)

Milieu base de NaHCO3 (25,2 g/L) 6,5 40 3,5 0,1 np 240 Barmpalia-Davis et al. (2008)

np (non prcis), PBS (phosphate buffered saline) dfinit en ralit un milieu compos de plusieurs sels (Gerhardt, 1981; NCCLS, 2000; Chapin et Lauderdale, 2003).


27

A la lecture du tableau 2, on remarque que les milieux utiliss sont base de sels de

sodium (phosphate, chlorure et carbonate). Si le chlorure de sodium 9 g/L a t recommand

par la socit amricaine de microbiologie pour son caractre isotonique (Gerhardt, 1981 ;

Chapin et Lauderdale, 2003) et le phosphate conseill pour son effet tampon, peu

dinformations sont disponibles quant lutilisation du carbonate de sodium. Les sels de

sodium ont t utiliss des concentrations diverses (2,84 g/L pour le phosphate de sodium; 5

g/L pour le chlorure de sodium et 25,2 g/L pour le carbonate de sodium).

Lutilisation du phosphate de potassium (KH2PO4) la concentration de 6,8 g/L a t

mentionne dans la littrature (Krasaekoopt et al., 2004). Le PBS utilis la concentration de

1 mol/L prte confusion. Le terme PBS (phosphate buffered saline) dsigne un milieu salin

tamponn en phosphate. En ralit, cest un milieu qui est compos principalement de NaCl

auquel dautres sels ont t ajouts. On y retrouve du NaCl (8,5 g/L), du K2HPO4 (1,1 g/L) et

du KH2PO4 (0,32 g/L) (Gerhardt, 1981). Parfois, il est compos de NaCl (8 g/L), de Na2HPO4

(1,44 g/L) et de KH2PO4 (0,24 g/L) (Chapin et Lauderdale, 2003). Il est parfois utilis tort

pour dsigner une solution aqueuse contenant exclusivement du chlorure de sodium (Shima et

al., 2006). Dans bien des cas, la composition du PBS na pas t mentionne (Duc et al.,

2004; FSA, 2005). De plus, cest un milieu dont les concentrations en sels peuvent tre

ajustes, ou compltes par dautres sels, en fonction des besoins recherchs (NCCLS, 2000).

Les valeurs de pH utilises par les diffrents auteurs sont comprises entre 6,5 et 8. Ces

valeurs refltent bien le pH habituellement retrouv au niveau de lintestin grle (Vandamme

et al., 2002). La dure dincubation des probiotiques dans le liquide intestinal artificiel a t

de 120, 180, 240 voire 360 min. Labsence de donnes scientifiques publies sur la dure de

transit dans lintestin grle peut expliquer les diffrences de dure dincubation constates.

Toutefois, une tude clinique non confirme, conduite par Graff et al. (2000), a montr quil

faut en moyenne 4 h (240 min) pour quun aliment semi-solide et radiomarqu parcourt les

diffrents compartiments de lintestin grle (duodnum, jjunum, ilon et caecum). Des

tudes complmentaires menes avec plusieurs aliments (solide et liquide) sont ncessaires

pour valider de telles informations.

Pour ce qui est de la concentration en bile et en enzymes, aucune donne publie ce

jour ne permet de prciser les teneurs exactes, ce qui peut expliquer les variations normes

constates dun auteur un autre (1, 2, 40, 45 et 150 g/L dans le cas de la bile).


http://en.wikipedia.org/wiki/Monosodium_phosphatehttp://en.wikipedia.org/wiki/Monosodium_phosphatehttp://en.wikipedia.org/wiki/Monosodium_phosphatehttp://en.wikipedia.org/wiki/Monosodium_phosphate

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De nombreux auteurs se sont limits au test de tolrance la bile pour prsager du

comportement des probiotiques dans lintestin. Diffrents liquides biliaires (bile porcine, bile

bovine, bile oxgall, sels biliaires) ont t utiliss diverses concentrations et dures

dincubation. Une trs grande disparit tant des concentrations que des dures dincubation a

t note: 3 g/L durant 2 h dincubation (Madureira et al., 2005), 5 et 10 g/L durant 3 h

(Hansen et al., 2002) ou 6 h ( Hansen et al., 2002; Chandramouli et al., 2004), 6 g/L durant

2,5 h (Krasaekoopt et al., 2004) ou 6 et 12 h (Lee et Heo, 2000), 6 et 20 g/L durant 4 h (Lian

et al., 2003), 10 et 20 g/L durant 3 h (Sultana et al., 2000) et 30 g/L durant 4 et 8 h (Ding et

Shah, 2007).

En se rfrant aux principales fonctions de lappareil digestif humain dcrit

prcdemment, il semble impossible de mimer les aspects mcaniques de la digestion

(mouvements de broyage, de trituration et de pristaltisme etc). Par contre, la simulation des

aspects physicochimiques de la digestion (pH, temprature, prsence de bile et denzymes

pancratiques etc) apparat tre un moyen simple de reproduire de faon artificielle les

conditions dans lestomac ou dans lintestin grle. Les tudes rsumes dans les tableaux 1 et

2 le montrent clairement. Ces tudes font galement ressortir labsence de protocole standard

dans lvaluation de la tolrance des probiotiques aux conditions gastrointestinales. La

recherche dun consensus dans la mise en place dun protocole standard devra se faire dans le

respect des conditions du tractus gastro-intestinal. La dure dincubation, le choix des valeurs

de pH, la prsence denzymes gastrique et intestinale, la prsence de bile sont des facteurs

essentiels dont il faut tenir compte. Ces facteurs doivent reflter autant que possible la ralit

chez lhomme.


29

2. Microflore intestinale et probiotiques

2.1. Composition et fonctions de la microflore intestinale

Les animaux ainsi que les tres humains vivent en quilibre avec une flore

microbienne extrmement dense et varie quils abritent pour lessentiel dans la cavit de leur

tube digestif. Cette flore reprsente un cosystme trs complexe dont la composition est

extrmement stable chez un individu donn, mais trs variable dun individu un autre, en

fonction notamment des habitudes alimentaires (Tannock, 1999). Si lon exclut la bouche,

directement en contact avec le milieu extrieur, les populations bactriennes prsentes dans le

tube digestif augmentent progressivement de lestomac jusquau clon (figure 2).

Figure 2. Schma des compartiments de lappareil digestif de lhomme et leurs microflores (adapt de Ouwehand et Vesterlund, 2003)


pH acide (HCl), O2, enzymes (pepsine, lipase), mucus. Microflore: 104 UFC/g Helicobacter pylori Lactobacilles Streptocoques Estomac

Mucus, pristaltisme. Seuls les

microorganismes provenant des aliments ou de la cavit buccale

sont prsents. Oesophage

Ilon Anarobiose, sels biliaires, enzymes. Microflore: 107-108 UFC/g Bactrodes, Clostridies Enterobactries, Entrocoques Lactobacilles, Veillonelles

Scrtions pancratiques et biliaires, mucus, O2 faible. Microflore: 103-104 UFC/g

Bactrodes Lactobacilles

Streptocoques Duodnum

Jjunum Scrtions pancratiques et biliaires, mucus, pristaltisme. Microflore: 105-107 UFC/g Bactrodes Lactobacilles Streptocoques

Colon Anarobiose, motricit,

enzymes bactriennes, acides gras volatiles, ammoniaque

Microflore: 1010-1011 UFC/g Bactrodes, Bifidobactries,

Clostridies, Entrocoques, Eubactries, Fusobactries,

Bacilles, Peptostreptocoques Ruminicoques, Streptocoques

30

Comme le montre la figure 2, lenvironnement gastro-intestinal comprend trois rgions

principales (estomac, intestin grle et clon) qui offrent des conditions trs diffrentes pour la

survie des microorganismes. Dans le premier compartiment quest lestomac, la prolifration

microbienne est fortement rduite cause de loxygne apport par la dglutition et par la

prsence dune forte acidit. Lestomac hberge slectivement les microorganismes qui

tolrent lacidit du milieu et qui vivent en arobiose. Cest le cas par exemple de

Helicobacter pylori (bactrie pathogne) qui est responsable des ulcres gastriques et

duodnaux.

Dans le deuxime compartiment quest lintestin grle (duodnum, jjunum, ilon), la

microflore est assez constante. On note par ailleurs la prsence dautres bactries au niveau de

lilon (bactrodes, clostridies, entrobactries, entrocoques etc). Dans le dernier

compartiment quest le clon, le transit digestif est plus lent, et la flore microbienne est plus

abondante, reprsentant 35 50 % du volume du contenu du clon (Cummings et al., 1989;

Gournier-Chteau,1994).

Il faut savoir quune partie de la flore gastro-intestinale (fraction minoritaire) demeure

non cultivable et moins explore, et ce pour diverses raisons: mconnaissance des besoins de

croissance de certaines bactries, slectivit des milieux utiliss, stress d aux conditions de

culture, ncessit danarobiose stricte, difficult stimuler les interactions entre les bactries

et les autres microorganismes ou les cellules de lhte (Zoetendal et al., 2004). La stabilit de

lcosystme intestinal est due la prsence de mcanismes de rgulation et de dfense

propres lhte ou la microflore rsidente. Les populations microbiennes affectent les

fonctions digestives et la physiologie de lpithlium intestinal par leurs activits

mtaboliques (Roberfroid et al., 1995). De nombreuses bactries intestinales participent la

dcomposition des substances non digres comme les fibres, les amidons et les sucres

(Gibson et Roberfroid, 1995). Une autre fonction exerce par la microflore intestinale est la

stimulation du systme immunitaire de lhte. Des tudes ont montr que la flore intestinale

stimule lactivit phagocytaire (Nicaise et al., 1993) et la scrtion de cytokines par les

macrophages (Nicaise et al., 1999). La reconnaissance de la microflore endogne par le

systme immunitaire de lhte se traduit par la production danticorps locaux et systmiques

(Apperloo-Renkema et al., 1993). Diffrents facteurs endognes contribuent maintenir le

bon fonctionnement de la microflore, contrlant ainsi lhomostasie intestinale (contrle des

quilibres hydrolectrolytique et acido-basique).


31

Parmi ces facteurs endognes, on retrouve le pH, les scrtions biliaires et

pancratiques, les interactions microbiennes, le mucus et le pristaltisme (Holzapel et al.,

1998). Les facteurs exognes comme la composition du rgime alimentaire, les circonstances

environnementales (antibiothrapie, chimiothrapie, stress, hygine etc) modifient le

fonctionnement de la microflore intestinale (Hopkins et al., 2002). A noter galement quavec

lge, il est possible dobserver une modification de la flore de putrfaction, faisant apparatre

des troubles du transit, une baisse du tonus intestinal, et une sensibilit accrue aux infections.

Dans bien des cas, lquilibre de la microflore intestinale est perturb, favorisant la

prolifration de microorganismes pathognes, ce qui peut compromettre la sant et le bien-

tre de lhte. La restauration de lquilibre de la microflore intestinale par lutilisation de

probiotiques apparat tre une alternative prometteuse. Les probiotiques, une fois ingrs, sont

capables de rgnrer la microflore et de contribuer renforcer les dfenses de lorganisme.

2.2. Microorganismes activit probiotique

Le terme probiotique drive de deux mots grecs ''pros'' et ''bios'' qui signifient

littralement ''pour la vie'', contrairement au terme antibiotique qui signifie ''contre la vie''.

Cest sans doute Vergin (1954) qui a introduit pour la premire fois le terme de probiotique,

en comparant dans un crit intitul Anti-und Probiotika les effets dltres des

antibiotiques sur la flore avec les effets bnfiques de substances produites par certaines

bactries. Quelques annes plus tard, Lilly et Stillwell (1965) parlent des probiotiques comme

des substances produites par des microorganismes, et qui stimulent la croissance dautres

microorganismes.

Par la suite, la dfinition du probiotique a privilgi la notion deffet bnfique sur la

flore de lhte par rapport un effet sur la croissance. Cette dfinition qui a t propose

par Fuller (1989) se basait sur des tudes chez lanimal. Une telle dfinition tait difficilement

acceptable faute de marqueurs adquats de leffet sur la flore. Cette dfinition tait galement

trs limitative car les microorganismes peuvent agir par dautres moyens quune action sur la

flore.

Toutefois, cette dfinition indiquait dj la recherche dun mcanisme daction et la

flore tait le premier site daction logique. La dfinition actuelle des probiotiques est celle

adopte par le comit mixte dexperts FAO/WHO (2002) qui les dfinit comme des


32

microorganismes vivants qui, lorsquils sont administrs en quantits adquates, exercent un

effet bnfique sur la sant de lhte. Cette dernire dfinition implique donc de dfinir des

critres de slection des microorganismes activit probiotique.

Le premier critre suggr par Doleyres et Lacroix (2005) est un critre technologique:

une souche probiotique doit tre produite grande chelle partir dun concentr de cultures

viables, survivre au cours des phases de prparation et de conservation, et tre stable jusquau

moment de son utilisation. Le critre technologique doit galement inclure les proprits

sensorielles (Saarela et al., 2000). Le second critre qui se rapporte la fonctionnalit de la

souche prend en compte les effets bnfiques sur la sant (Doleyres et Lacroix, 2005; Ammor

et Mayo, 2007).

Les probiotiques sont principalement des bactries et des levures. On nen connait pas

ce jour qui soit dorigine virale. La seule levure dclare probiotique au jour daujourdhui

est saccharomyces cerevisiae Boulardii (Segarra-Newnham, 2007). Depuis trs longtemps, les

probiotiques sont consomms dans les produits ferments, plus particulirement dans les

produits drivs du lait (Ballongue et al., 1993). Ils bnficient du statut GRAS (Generally

Recognized As Safe). Les principales espces de microorganismes activit probiotique sont

rpertories dans le tableau 3.


33

Tableau 3. Principales espces de microorganismes activit probiotique (adapts de Hozalpfel et al., 1998 et Shah, 2007)

Principales espces de bactries lactiques Espces de bactries non lactiques Espces de levures

Lactobacilles Bifidobactries Autres bactries lactiques

- Lactobacillus acidophilus

- Lactobacillus amylovirus

- Lactobacillus brevis

- Lactobacillus casei

- Lactobacillus cellobius

- Lactobacillus crispatus

- Lactobacillus curvatus

- Lactobacillus delbrueckii

- Lactobacillus farciminis

- Lactobacillus fermentum

- Lactobacillus gasseri

- Lactobacillus gallinarum

- Lactobacillus helveticus

- Lactobacillus johnsonii

- Lactobacillus paracasei

- Lactobacillus plantarum

- Lactobacillus reuteri

- Lactobacillus rhamnosus

- Bifidobacterium adolescentis

- Bifidobacterium bifidum

- Bifidobacterium breve

- Bifidobacterium infantis

- Bifidobacterium lactis (reclass

Bifidobacterium animalis)

- Bifidobacterium laterosporus

- Bifidobacterium longum

- Bifidobacterium thermophilum

- Enterococcus faecalis

- Enterococcus faecium

- Lactococcus lactis

- Leuconostoc mesenteroides

- Pediococcus acidilactici

- Sporolactobacillus inulinus

- Streptococcus diacetylactis

- Streptococcus intermedius

- Streptococcus thermophilus

- Bacillus spp

- Escherichia coli (souche nissle)

- Propionibacterium freudenreichii

Saccharomyces cerevisiae


34

Lidentification des espces de probiotiques repose sur deux approches qui sont

bases sur ltude des caractres phnotypiques et gnomiques (Charteris et al., 1997; Ammor

et al., 2005). Lvaluation des caractres phnotypiques prend en compte les exigences

nutritionnelles des microorganismes, leur tolrance loxygne, leur sensibilit aux

antibiotiques, ainsi que la couleur et la morphologie des colonies formes. Lvaluation des

caractres gnomiques (recherche dune parent gntique) fait appel aux techniques de

biologie molculaire, en particulier lhybridation des acides nucliques: hybridation

ADN/ADN et squenage des gnes codant lARN ribosomal (Charteris et al., 1997;

Stackebrandt et al., 2002; Marmonier et Teyssou, 2002).

Lactivit probiotique nest pas spcifique dune espce (Hozalpfel et al., 1998). Elle

est plutt spcifique de la souche de microorganisme issue de lespce (de Vries et al., 2006;

Shah, 2007). Une souche par dfinition provient dune succession de cultures drives d'une

culture pure (le plus souvent une colonie parfaitement isole). Une souche est gnralement

dpose dans une collection rpertorie qui lui attribue un code d'identification. La

connaissance de ce code permet didentifier la souche de faon formelle, et offre une

rfrence par rapport une possible volution de la souche (Azais-Braesco, 2007).

Le fait quune souche dispose de noms diffrents prte confusion. Cest le cas par

exemple de L. plantarum 299v qui est rpertorie sous le nom de L. plantarum DSMZ 9843

(Johansson et al., 1998), ou encore de L. rhamnosus GG qui est rpertorie sous le nom de L.

rhamnosus ATCC 53103 (Shah, 2004). Le reclassement de souches suite des donnes

exprimentales rcentes peut aussi prter confusion. Cest le cas avec B. lactis Bb 12 qui est

dsormais dsigne B. animalis Bb 12 (Shah, 2007). En ralit, B. lactis et B. animalis

appartenaient deux espces diffrentes. Aujourdhui, ces deux espces nen font quune (B.

animalis), celle-ci est subdivise en deux sous-espces. La nomenclature exacte est donc B.

animalis subsp animalis et B. animalis subsp lactis (Masco et al., 2004). Malgr cette

prcision, lappellation B. lactis Bb 12 continue dtre employe dans la littrature (Ringer-

Kulka et al., 2009).

Dautres formes de confusion existent, notamment avec les souches commerciales.

Pour des raisons de confidentialit, il est difficile didentifier les probiotiques prsents sur le

march. A titre dexemple, la souche DN-173 010 du groupe Danone, isole partir de la

sous-espce B. animalis subsp animalis, est commercialise sous divers noms (Bifidus


35

digestivum au Royaume-Uni; Bifidus regularis aux tats-Unis et au Mexique; Bifidus

actiregularis dans les pays de la zone Euro etc). Cest galement le cas avec la souche BB-12

du groupe Chr. Hansen

. La socit continue de commercialiser sous la marque BB-12 les

deux sous espces B. animalis subsp animalis et B. animalis subsp lactis.

2.3. Probiotiques et allgations

Le mot "allgation" est d'origine latine, il est synonyme d'affirmation, de dclaration

ou de prtention. Les allgations restent des affirmations sans preuves, jusqu' ce qu'elles

puissent tre prouves. Ce mot prend de lampleur dans le domaine de lalimentation, avec le

concept dallgation nutritionnelle (nonce une proprit nutritionnelle particulire).

Dautres concepts sont apparus entre temps, savoir les allgations fonctionnelles

(dcrivent leffet dun ingrdient sur les fonctions normales de lorganisme), les allgations

sant (dcrivent lamlioration dune fonction dans un sens favorable la sant) et les

allgations thrapeutiques (prsentent lingrdient alimentaire comme possdant des

proprits de prvention, de traitement ou de gurison). La classification des allgations, tire

de lannexe I des directives du codex alimentarius, est reprsente la figure 3 (Cynober,

2008).

Figure 3. Classification des diffrentes allgations (adapt de Cynober, 2008)

Eleve

ALLGATIONS

Nutritionnelle Fonctionnelle Sant Thrapeutique

NIVEAU DE PRECISION DE LALLGATION

Faible

Fort

FACILITE DEMPLOI DE LALLGATION

Faible


36

Le codex alimentarius distingue deux catgories dallgations sant. La premire est

"toute vocation dune amlioration dune fonction et/ou dun paramtre physiologique,

biologique, psychologique dans le sens dapporter une contribution positive la sant ". La

seconde est "toute vocation dune relation entre un aliment ou un de ses composants et un

tat li la sant, ou relative la rduction du risque de maladies, sans faire rfrence une

maladie prcise".

En Europe, la commission europenne, appuye par les tats membres, a promulgu

un rglement spcifique sur cette question, le rglement n 1924/2006 (JOUE, 2007; Baelde,

2008; Bourlioux, 2008). Ce rglement englobe dans les allgations sant, celles qui dcrivent

ou mentionnent le rle dun nutriment ou dune substance dans la croissance ou le

dveloppement de lorganisme, dans les fonctions psychologiques ou comportementales, dans

le contrle du poids, et dans la baisse dun facteur de risque de maladies humaines.

En prenant en compte la "baisse dun facteur de risque de maladies humaines" qui

peut tre assimile une action de prvention de survenue de maladies, la commission

europenne a franchi un pas en se rapprochant de la frontire du mdicament, et en interdisant

par la mme occasion les allgations thrapeutiques. La prvention de risque de maladies

figure dans la dfinition du mdicament. Un mdicament est dfini comme "toute substance

ou composition prsente comme possdant des proprits curatives ou prventives lgard

de maladies humaines ou animales " (article L511 du code franais de la sant publique).

Une lgislation inadquate et des amalgames gnrent trs souvent la confusion (Cynober,

2006).

De nombreux ingrdients contenus dans les aliments revendiquent des effets

bnfiques sur la sant par le biais dallgations, et les probiotiques nchappent pas ce

phnomne. Pour ces microorganismes, il sagit surtout dallgations fonctionnelles ou de

sant qui mritent dtre prouves. Il faut donc apporter la preuve du bnfice li la

consommation de quantits habituelles du probiotique par la population cible. Si des lments

exprimentaux sur des cellules ou des animaux sont utiles, la preuve clinique, obtenue par des

tudes conformes la mthodologie reconnue, est indispensable. Analysons quelques donnes

publies sur les effets bnfiques ou non de quelques souches de probiotiques.


37

L. rhamnosus GG (L. rhamnosus ATCC 53103)

Le premier constat qui se dgage de ltude de cette souche est le nombre de

publications scientifiques qui lui ont t consacres. Sur lensemble des tudes publies de

1988 1998 portant sur les effets des probiotiques, environ 45% ont t consacres L.

rhamnosus GG (de Roos et Katan, 2000). Les auteurs ont rvl que la prise quotidienne de L.

rhamnosus GG retarde la phase diarrhique des infections lies au rotavirus. La preuve dune

prvention des diarrhes lies des toxines bactriennes (E. coli enterotoxinogne) a t

moins vidente. Une efficacit dans la lutte contre les diarrhes causes par C. difficile a t

allgue cette souche (Shah, 2007).

Une autre excellente revue de la littrature est parue dans les annales de

pharmacothrapie (Segarra-Newnham, 2007). Lauteur a pass en revue la littrature mdicale

(de janvier 1970 mars 2007) sur lusage de L. rhamnosus GG. Des tudes cliniques

contrles et des tudes de cas-tmoins ont valu ce probiotique dans le traitement ou la

prvention des pisodes aigus ou rcurrents de diarrhe associe C. difficile. Certaines de

ces tudes ont montr des rsultats favorables avec L. rhamnosus GG. Cependant, dautres

tudes ont mis en vidence une absence de bnfice de ce probiotique. Lhtrognit de ces

tudes a rendu toutes conclusions dfinitives difficiles. En outre, plusieurs cas de bactrimie

(prsence de bactries dans le sang) lie lusage de ce probiotique ont t rapports durant la

dernire dcennie. Les patients les plus frquemment affects par cette complication sont les

immunodprims. Malheureusement, ces patients sont galement ceux qui sont les plus

exposs aux diarrhes rcurrentes. En conclusion, lauteur estime que des tudes

additionnelles avec L. rhamnosus GG sont indispensables pour clarifier des questions restes

sans rponse (mcanisme daction, prsence dune bactriemie etc).

S. cerevisiae Boulardii

S. cerevisiae Boulardii est la souche qui, avec L. rhamnosus GG, ont fait lobjet dune

mta-analyse (Segarra-Newnham, 2007). Lauteur a rapport des rsultats mitigs concernant

cette levure, dans le traitement des diarrhes associes C. difficile. Shah (2007) a plutt

rapport des effets positifs dans le traitement des colites associes C. difficile. Pour

McFarland (2006), S. cerevisiae Boulardii aide prvenir les diarrhes associes une

antibiothrapie, et prsente une utilit dans les pathologies intestinales lies C. difficile.


38

B. animalis Bb-12

Autrefois connue sous lappellation de B. lactis Bb 12, cette souche probiotique a fait

lobjet de peu dtudes cliniques (Malinen et al., 2002; Mohan et al., 2006, Ringer-Kulka et

al., 2009). Sa principale cible est la flore endogne o elle entre en comptition avec certaines

bactries pathognes. B. animalis Bb 12 a rduit le nombre dentrobactries et de clostridies

au profit des bifidobactries chez des enfants supplments (Mohan et al., 2006). Ce

probiotique a eu un effet positif sur la prvention des diarrhes associes une antibiothrapie

(Shah, 2007). Il a aussi prsent un effet positif sur la physiologie digestive, en terme

damlioration de la consistance des selles mises (Ringel-Kulka et al., 2009). Aucun effet sur

la rduction de certains pathognes rsistants aux antibiotiques na t obtenu avec ce

probiotique (Mohan et al., 2006).

A travers ces trois exemples qui mettent en vidence les effets parfois controverss des

probiotiques, il est important de relativiser la porte de certains travaux, et de conserver

essentiellement la littrature scientifique pertinente, en indiquant prcisment quels critres

ont amen inclure telle tude et exclure telle autre. La prise en compte des facteurs

dimpact des revues comit de lecture peut tre un moyen sur dvaluer le niveau

scientifique des travaux, mme si cette approche nest pas idale. Pour preuve, un article

publi dans le "British Medical Journal" (Hatakka et al., 2001) a trait de ladministration de

L. rhamnosus GG en association dune antibiothrapie, chez des jeunes enfants (ge moyen

de 4,4 ans), afin de lutter contre des infections respiratoires et gastro-intestinales.

Le rsum des rsultats de ltude nous informe dune baisse de 17% du nombre

dinfections respiratoires, dune baisse de 19% de lutilisation des antibiotiques dans le

groupe dintervention, sans toutefois dire un mot sur les infections gastro-intestinales. En

parcourant le contenu de larticle, on se rend compte que leffet protecteur dans les infections

gastro-intestinales na pas t dmontr. En investiguant un peu plus encore, on note que les

plaintes des enfants taient enregistres par les parents, ce qui laisse la porte grande ouverte

une interprtation subjective. On note galement que les enfants malades taient suivis par des

mdecins diffrents, ce qui peut influencer linterprtation des signes cliniques observs chez

chaque enfant. Aussi, sur les 571 enfants qui participaient l'tude, 58 ont abandonn les

essais sans voquer de raisons. Ltude a conclu une lgre diffrence, statistiquement non

significative, en faveur du groupe dintervention (compar au groupe placbo). Cette


39

conclusion montre que la statistique ne peut pas et ne doit pas remplacer linterprtation

clinique. Aprs 3 mois dadministration quotidienne de ce probiotique, le bilan est bien

maigre: on peut juste sattendre une lgre protection. Cette tude montre quel point il est

important danalyser les donnes de la littrature avec tout le recul ncessaire, au risque

daboutir des conclusions trop htives ou parfois errones, mme si les travaux sont publis

dans des revues de qualit.

Le dernier exemple de probiotique est donn au tableau 4. Il sagit de L. plantarum

299v (L. plantarum DSMZ 9843). Les proprits allgues cette souche sont en rapport avec

la rduction du taux de cholestrol sanguin, la baisse des diarrhes associes C. difficile, et

la rduction probable des signes cliniques du syndrome du clon irritable.


40

Tableau 4. Principales allgations attribues L. plantarum 299v aprs des tudes in vivo chez lhomme (adapt de de Vries et al., 2006).

Dose utilise (UFC/Jour)

Nombre de sujets

Dure de la prise

Type dtudes cliniques Effets cliniques observs Rfrences

21010 26

21 jours

Essai contrl, randomis, en double aveugle, versus placebo

Augmentation du contenu fcal dacides gras chanes courtes Johansson et al. (1998)

2109 32 21 jours " Pas daugmentation du contenu fcal dacides gras chanes courtes Goossens et al. (2005)

1010 30 42 jours " Rduction du LDL-Cholestrol (9,6%) et du fibrinogne (13,5%) Bukowska et al. (1998)

21010 36 42 jours " Rduction du LDL-Cholestrol (11,7%) et du fibrinogne (21%) Naruszewicz et al. (2002)

51010 20 38 jours " Baisse de 30% des diarrhes associes C. difficile Wullt et al. (2003)

21010 60 28 jours " Rduction des signes cliniques du syndrome du clon irritable Nobaek et al. (2000)

21010 40 28 jours " Rduction des signes cliniques du syndrome du clon irritable Niedzielin et al. (2001)

6,3109 12 28 jours " Pas de rduction des signes cliniques du syndrome du clon irritable Sen et al. (2002)

UFC (Unit Formant une Colonie) LDL (Low Density Lipoprotein)


41

La validit scientifique des effets cliniques observs dans le tableau 4 est trs variable.

L. plantarum 299v a montr des effets controverss dans lvaluation du contenu fcal en

acides gras chanes courtes, de mme que dans la symptomatologie du syndrome du clon

irritable (Johansson et al., 1998; Goossens et al., 2005; Nobaek et al., 2000; Niedzielin et al.,

2001; Sen et al., 2002). Les proprits allgues ce probiotique demeurent encore un stade

hypothtique, et des tudes plus approfondies sont ncessaires pour apporter des preuves

scientifiques plus convaincantes ces allgations.

Dans les diffrents travaux mentionns, la taille de lchantillon pose le problme de la

pertinence de certains rsultats. En recherche clinique, la notion de grand ou petit chantillon

repose sur la thorie statistique de lestimation. On parle de grand chantillon quand N > 30 et

de petit chantillon quand N < 30. N tant le nombre de volontaires par groupes de

comparaison (groupe placbo et groupe dintervention). Dans chacune des tudes, la

diffrence de taille des chantillons rend complexe la comparaison inter-tudes. Au problme

de la taille de lchantillon doit tre ajout le problme de sa reprsentativit. Cette dernire

doit reflter la population tudier. La dfinition de la reprsentativit est une question

difficile rsoudre au cas par cas. En effet, il faut prendre en compte selon le paramtre

tudier, limportance de lge, du sexe, du groupe ethnique, le style de vie et lalimentation, le

poids et la taille, lenvironnement (climat) etc.

Dans le tableau 4 sont galement mentionnes la dose quotidienne ingre et la dure

de traitement. Un minimum de 109 UFC/Jour a t administr par voie orale aux volontaires,

ce qui est en conformit avec certaines normes en vigueur comme celle des pays de lunion

europenne (JOUE, 2004). Les tudes cliniques ralises ont t contrles, c'est--dire que le

produit test a t compar un produit contrle (idalement un placebo). La randomisation

est galement un critre important: elle permet daffecter au hasard les volontaires un

traitement, vitant ainsi des biais importants. Enfin, on parle dtudes "en double aveugle"

selon que laffectation des sujets aux diffrents traitements est inconnue de tous.

Dans les tudes "ouvertes" ou "en simple aveugle", laffectation des sujets est

respectivement connue de tous ou connue seulement des investigateurs jusqu la fin du

traitement des donnes. Les tudes cliniques contrles, randomises, et en double aveugle

prsentent le meilleur niveau de qualit, et sont donc les plus recherches (Azais-Braesco,

2007). Toutefois, elles ne sont pas toujours possibles, ni adaptes toutes les situations, et


42

dautres configurations peuvent tout fait tre recevables. Quelle que soit ltude retenue,

celle-ci doit respecter les rgles de bonnes pratiques cliniques qui assurent linformation,

lanonymat, la libert et la scurit du volontaire, ainsi que la qualit de ltude, sur les

aspects traabilit, fiabilit des rsultats, et pertinence du traitement statistique.

La conduite dune tude clinique conforme aux rgles en vigueur reprsente un travail

important et rclame un grand professionnalisme. Il est aujourdhui impossible quun produit

probiotique, dont lallgation repose sur un dossier de qualit moyenne, puisse bnficier

dune valuation favorable par une agence nationale. Plusieurs produits contenant des

probiotiques ont t rcemment soumis lvaluation de comits dexperts. En France, sur les

8 dossiers qui ont jusquici fait lobjet de lavis de lAFSSA (Agence Franaise de Scurit

Sanitaire des Aliments), seuls 2 ont t jugs aptes justifier lallgation pour laquelle ils

taient proposs lvaluation (tableau 5). Ces avis sont intgralement disponibles sur le site

internet de lagence. Les avis ngatifs correspondent des dossiers dont la qualit a t juge

insuffisante.


43

Tableau 5. Synthse des avis rendus par lAFSSA depuis 2002 sur les dossiers scientifiques portant sur des produits probiotiques usage humain.

Date de la publication de lavis

Type de produits

Type de probiotiques Population vise

Allgation formule Dcision de lAFSSA

Quelques lments explicatifs motivant la dcision

12/11/2007 Aliment dittique

L. rhamnosus GG Enfants bas ge et nourrissons

Probiotique bon pour lintestin

Ngative Allgation vague, imprcise et non dmontre, aucune preuve de lactivit du probiotique sur une longue priode

14/10/2005 Complment alimentaire

L. rhamnosus GG + L. acidophilus R52

Enfants bas ge et nourrissons

Probiotique demploi scuris

Ngative Allgation vide de sens, ncessit de conduire des tudes cliniques afin dvaluer le bnfice/risque

16/12/2004 Produit laitier L. bulgaricus + S. thermophilus + B. lactis Bb 12

Adultes, enfants, adolescents

Aide renforcer les dfenses naturelles

Ngative Absence dtudes cliniques ralises avec le produit fini sur la population cible, posologies non justifies


L. rhamnosus GG Enfants bas ge et nourrissons

Aide lutter contre les allergies lies aux protines de vache

Ngative Absence de preuves cliniques, arguments scientifiques suggestifs


B. lactis Bb 12 Enfants bas ge et nourrissons

Participe au bon fonctionnement du tube digestif

Positive Allgation acceptable dun point de vue scientifique


P. freudenreichii shermanii

Enfants de plus de 3 ans et adultes

Stimule la flore intestinale bifide

Ngative Absence de preuves scientifiques incontestables, conditions demploi insuffisamment argumentes

23/01/2003 Produit laitier L. casei DN 114-001 Enfants de plus de 3 ans et adultes

Participe renforcer les dfenses naturelles

Positive Nombreuses tudes in vitro et in vivo attestant de lefficacit de la souche sur la flore intestinale


L. acidophilus + L. plantarum + L. casei + S. thermophilus + S. cremoris + E. faecum

Enfants de plus de 3 ans et adultes

Multiples allgations portant sur le systme digestif

Ngative Allgations non scientifiquement tablies, donnes insuffisantes pour mener une valuation rigoureuse de linnocuit


44

Dans le tableau 5, les probiotiques ont t prsents sous des formes alimentaires

diverses (aliment dittique, complment alimentaire, produit laitier). Or il est bien connu que

les aliments dittiques et les complments alimentaires sont rgis par une rglementation

bien prcise (JOCE, 1999, 2002). Les complments alimentaires sont des "produits destins

tre ingrs en complment de lalimentation courante, afin de pallier linsuffisance relle ou

suppose des apports journaliers" (JOCE, 2002). Les aliments dittiques sont des "aliments

destins une alimentation particulire et devant rpondre des besoins physiologiques

particuliers, soit en raison dune maladie comme par exemple le diabte, soit en raison dune

situation physiologique particulire comme la grossesse" (JOCE, 1999). Au regard de ces

deux dfinitions, on pourrait se demander sil existe un apport journalier recommand en

probiotiques, et si ces derniers rpondent des besoins physiologiques particuliers. Il est bien

vident que non. Par consquent, les produits probiotiques ne sauraient tre prsents sous ces

deux formes alimentaires. Malheureusement, de nombreux aliments contenant des

probiotiques sont de plus en plus prsents sous la forme de complments alimentaires

(Majaama et Isolauri, 1997; Vanderhoof et al., 1999; Pessi et al., 2000; Gionchetti et al.,

2003; de Vries et al., 2006).

Depuis ladoption de la nouvelle rglementation europenne (JOUE, 2007), il

appartient lautorit Europenne de scurit des aliments (EFSA, European Food Safety

Authority) de procder lharmonisation des avis mis par les agences nationales, mais aussi

lvaluation de nouvelles demandes de produits porteurs dallgations. Dans son rapport

doctobre 2009, LEFSA a discrdit toutes les allgations en rapport avec les probiotiques.

LEFSA a estim que les probiotiques nont pas apport la preuve de leur efficacit, en raison

dun manque dinformation concernant les souches pour lesquelles des avantages sur la sant

ont t revendiqus.

2.4. Cadre rglementaire des aliments contenant des probiotiques

En consommant des produits probiotiques, on recherche un effet bnfique sur la

sant. Toutefois, la nature de ce bnfice sant nest pas prcise. Daucuns disent que le

bnfice sant est dordre fonctionnel. Cest pourquoi, on qualifie les probiotiques de cultures

fonctionnelles (Shah, 2007; Ammor et Mayo, 2007). Cette approche semble idale pour

rpertorier les produits probiotiques dans la catgorie des aliments dits "fonctionnels", mais le

concept daliments fonctionnels est un concept flou et ambigu, et pour cause, il nexiste pas


45

de dfinition consensuelle de ces aliments (Cynober, 2008). Plusieurs dfinitions ont t

proposes pour ces aliments. Goldberg (1994) a dfini laliment fonctionnel comme "tout

aliment qui en plus de sa valeur nutritive, a un impact positif sur la sant de lindividu, sur sa

performance et son tat mental". Pour Diplock et al. (1999), un "aliment peut tre considr

comme fonctionnel sil a dmontr de faon satisfaisante quil exerce un effet bnfique sur

une ou plusieurs fonctions cibles de lorganisme, au-del des effets nutritionnels de base, de

manire amliorer la sant et le bien tre". Jones et Varady (2008) ont dfini laliment

fonctionnel comme "un aliment non ncessaire au fonctionnement de lorganisme mais qui

procure des bienfaits physiologiques additionnels amliorant globalement la sant".

Labsence dun consensus universel sur la dfinition de laliment fonctionnel montre

quil est urgent de dfinir un cadre rglementaire clair pour ce type daliment, afin de

permettre leur contrle, et dassurer la protection du consommateur. Les aliments fonctionnels

sont avant tout des aliments, et doivent par consquent se prsenter sous une forme

alimentaire. Ils sont censs amliorer la sant de ceux qui les consomment. Ils se positionnent

linterface des mdicaments et des complments alimentaires, comme le montre bien la

figure 4.

Figure 4. Schma du

aspects physicochimiques de l'encapsulation et de la

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