Paris, 10 octobre 2013

Marie-Anne Loriot

INSERM UMR-S 775,Université Paris Descartes

UF Pharmacogénétique et Oncologie Moléculaire,Hôpital Européen Georges Pompidou

Approches méthodologiques en pharmacogénétique

IDENTIFICATION  DE  SOUS-­‐POPULATIONSen  fonc'on  de  la  réponse  et  de  la  toxicité

Non toxique

Toxique

Inefficace Efficace

LA PHARMACOGENETIQUE

Facteurs nongénétiques

Médicament

REPONSE

EFFICACITE/TOLERANCEINEFFICACITE/TOXICITE

Facteurs génétiquesPolymorphismes génétiques

- métabolisme- transport - cible pharmacologique- immunité (HLA)

- sexe, âge

- Comorbidités

- Alimentation

- Interactionsmédicamenteuses

LA PHARMACOGENETIQUE

Facteurs nongénétiques

Médicament

REPONSE

EFFICACITE/TOLERANCEINEFFICACITE/TOXICITE

- sexe, âge

- Comorbidités

- Alimentation

- Interactionsmédicamenteuses Thérapeutique

prédictiveet

personnalisée

OBJECTIF:

Facteurs génétiques

Pharmacogénomique

Etude  des  conséquences  des  variaAons  de  l’ADN  et  de  l’ARN  sur  la  réponse  auxmédicaments

PharmacogénéAque

Influence  des  variaAons  de  la  séquence  en  ADN  sur  la  réponseaux  médicaments

( )n

Gène  défectueux,  «  non  fonc'onnel  »  (délé'on,  muta'on  inac'vatrice)

Gène  ac'f,  «  normal  »

( )n Amplifica'on  du  gène  ac'f

pas  de  gène  acAf

métaboliseursLENTS

1  gène  acAf

métaboliseursRAPIDES  OU

 INTERMEDIAIRES

2  gènes  acAfs

métaboliseursRAPIDES

plus  de  2  gènes  acAfs

métaboliseursULTRARAPIDES

Bases moléculaires de la variabilité génétique: Polymorphismes génétiques

Génotype

Phénotype

Phase III: transporteurs ABC type ABCB1 (MDR1), SLC

Phase I Phase II

POLYMORPHISMES GÉNÉTIQUES DES ENZYMES DU MÉTABOLISME DES MÉDICAMENTS

FREQUENCE DES POLYMORPHISMES GENETIQUES

CYP 1A1 (induction ~ 10%)CYP 2A6* (5%)CYP 1A2 (10%)CYP 2C9 (3-5%)CYP 2C19 (5-20%)CYP 2D6* (5-7%)CYP 3A5 (80%)

GSTM1* (50%)GSTT1 (10-20%)GSTP1 (10%)UGT1A1 (10-15%)NAT2 (50%)TPMT(<1%)ABCB1 (25%)

* : gènes pour lesquels une duplication est connue

Populations Caucasiennes : % homozygotes mutés

Variations des fréquences selon l’ethnie (Asiatiques, Africains..)

*  Rôle  important  quand:

-­‐  fenêtre  thérapeuAque  étroite-­‐  efficacité  difficile  à  évaluer  rapidement-­‐  efficacités  voisines  avec  profils  de  tolérance  variable

*  Il  est  possible  de  prédire  la  réponse-­‐  génotypage-­‐  phénotypage

INTERET DE LA PHARMACOGENETIQUEINTERET DE LA PHARMACOGENETIQUE

Dépistage  des  «  sujets  à  risque  »    

Phénotype

- activité réelle- quantifiable- mise en oeuvre plus difficile (in vivo, in vitro, ex vivo)- variations (xénobiotiques, pathologies)- pas permanent

Génotype

- facile- permanent- pas quantifiable- pas activité réelle

EXEMPLES DE PHENOTYPAGE in vivo

CYP 1A1 : induction lymphocytes ERODCYP 1A2 : caféine sang PX/C (NAT2)CYP 2A6 : CoumarineCYP 2C9 : DiclofenacCYP 2C19: Méphénytoïne, Proguanil,

OméprazoleCYP 2D6 : Debrisoquine, Spartéine,

DextromethorphaneCYP 2E1 : ChlorzoxasoneCYP 3A4 : 6-ß-OH-Cortisol (induction),

13, 14 (C)Erythromycine,Midazolam, Dapsone,Dextromethorphane

GENOTYPAGE

* Méthodes fondées sur la PCR : RFLP, PCR allèle-spécifique, OLA ..(spécifiques) séquençage

* Méthodes non spécifiques: SSCP, DGGE

D-HPLC :

==> détection de nouveaux polymorphismes

* « Carte génétique » : puces à ADN

Intérêt pour les études sans à priori

Relation génotype phénotype

Exemple de la TPMT

UtilisationsGastro-entérologie, cancérologie, transplantation,dermatologie….

Indications dans les maladies inflammatoireschroniques de l’intestin (MICI) de l’adulte et de l’enfant:- maintien de la rémission clinique (taux de réponse 50%)- sevrage des patients cortico-dépendants- prévention des rechutes post-opératoires

Efficacité à long terme (taux de rechute 5-10% par an)

Délai d’efficacité: 12 à 18 semaines

MEDICAMENTS  THIOPURINIQUES:AZATHIOPRINE  ET  6-­‐MERCAPTOPURINE

THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :métabolisme des thiopurinesmétabolisme des thiopurines

AZATHIOPRINEImurel ®

6-MERCAPTOPURINE (6-MP)

TPMT HGPRT XO

6-MMP6-THIOGUANINES

ACIDE THIOURIQUE

ACTIFSImmunosuppresseursMaladie de CrohnLeucémie aigue lymphoblastique

TOXIQUES(dose dépendant)Hématotoxicité

Myélosuppression

ACTIVITE TPMT : DISTRIBUTION TRIMODALE

M/M

M/Wt

Wt/Wt

CONSEQUENCES DES VARIATIONS DE L’ACTIVITE TPMT

Toxicité hématologique:Corrélation entre taux de 6-TGN et activité TPMT: lien avecla myélotoxicitéDéficit en TPMT: dans 1/3 des cas de toxicités

Toxicité hépatique:Dérivés méthylés hépatotoxiquesRapport 6-TGN/6-MMPEn cas d’activité TPMT élevée production accrue de 6-MMP

Résistance pharmacologiqueEn cas d’activité élevée: seuil d’activité à définir

Adaptation de posologieEn fonction du génotype ou du phénotype

Principales mutations

ATG Stop

5 ’ 3 ’

Structure du gène

POLYMORPHISME DE LA TPMT

TPMT* 2 : G238C Ala Pro

TPMT*3A : G460A Ala Thr

A719G Tyr Cys

TPMT*3B : G460A Ala Thr

TPMT*3C : A419G Tyr Cys

7 %

78 %

< 1 %

5%

Répartition des allèles variants:

PHENOTYPAGE TPMTPHENOTYPAGE TPMT

Cytosolsérythrocytaires

Activité érythrocytaire = reflet de la TPMT hépatique

Réaction enzymatique: 6-MP 6-MMP

Mesure radiométrique ouSéparation par HPLC

CORRÉLATION GÉNOTYPE/PHÉNOTYPE=> prédiction du phénotype à partir du génotype

Identification de biomarqueursApproche gène candidat

Exemple des anticoagulants oraux

PROBLEME DE SANTE PUBLIQUE

PROBLEMESLIES AUX

TRAITEMENTSAVK

18 000hospitalisations

par an

Première caused’accidents iatrogènes > 900 000 patients

traités

≈ 5000 décès par an

Coumadine® (warfarine)cp à 2 et à 5 mg

Préviscan® (fluindione)cp à 20 mg

AVK EN FRANCE

Sintrom® Mini-Sintrom®

cp à 4 et à 1 mg (acénocoumarol)

4-OH-Coumarine et ses dérivés :Acénocoumarol Sintrom®Warfarine Coumadine ®Tioclomarol Apegmone ®

Indane-dione et ses dérivés :Fluindione Previscan ®Phenindione Pindione ®

O

O

R

O

O H

O

R

État d’hypocoagulabilité

LES MÉDICAMENTS ANTI-VITAMINE K

Cycle de lavitamine K

Synthèse de facteursnon fonctionnels

X

II

IXVII

Observance du traitement

Alimentation (vit. K)

Situation physiopathologiqueInteractions médicamenteuses

Facteurs génétiques

Risque

hémorragique

VARIABILITE DANS LA REPONSEVARIABILITE DANS LA REPONSE

Risque

thrombotique

Nb de

patients

Doses de warfarine (mg/semaine)

HYPERSENSIBILITE RESISTANCE

METABOLISME

des AVK

O

O

R

O

O

R

Dans le foie:

6 and 7hydroxylationpar CYP2C9

ELIMINATION(biliaire et rénale)

↑ hydrophile

METABOLISME DES AVK

Super-famille d‘enzymes essentiellespour le métabolisme desmédicaments

17 familles de CYPs comprenant environ 50isoformes identifiées chez l‘Homme

classification: CYP 2 C 9

famille> 40% homologie

de séquence sous-famille> 55% homologie

de séquence

isoenzyme

*1

allèle

Variations environnementales: inhibition/induction

Polymorphismes génétiques

VARIABILITE DANS L’ACTIVITE DU CYP 2C9

Variants alléliques

CYP2C9*1

CYP2C9*2 (Cys144Arg)

CYP2C9*3 (Leu359Ileu)

Fréquence Allélique

0,79-0,86

0,08-0,19

0,06-0,1

Activité

100 %

12 %

5 %

24 variants alléliqueshttp://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2c9.htm

Populations caucasiennes

CIBLE PHARMACOLOGIQUE des AVK

AVK

CYP2C9VKOR

VKOR =Vitamine K

époxyderéductase

inactif

Facteurs Vit K dépendantsinactifs

Facteurs Vit K dépendantsactifs

VIT Koxydée

VIT Kréduite

GGC GGC=γ-glutamylcarboxylase

Cycle de la

vitamine K

CYP2C9 explique 21% de la variabilitéVKORC1 explique 13% de la variabilité

VKORC1 DOSE 95% CI p n PATIENTSCC 6,2 5-7,3 Ref 54CT 4,8 3,8-5,9 0,002 69TT 3,5 2,2-4,8 0,001 24

Relation entre SNP 1173C>T (intron 1) et

dose de warfarine à l’équilibre

« A polymorphism in VKORC1 gene is associated with aninter-individual variability in the dose-anticoagulant effect of

warfarin »D'Andrea, Blood. 2004

À partir d’une étude chez des volontaires sains (n=230) recevant une dose unique d’acénocoumarol

détermination de la part génétique dans la variabilité de la réponse pharmacologique

Collaboration CIC St Antoine, Pr Laurent BecquemontINSERM U525, David-Alexandre Trégouët

Génotype *1/*1 *1/*2 *1/*3 *2/*2 *2/*3 *3/*3

Nombre 143 44 30 4 8 1

Effets des allèles CYP 2C9*2 et *3 sur la réponse à l’acénocoumarol

(« ratio facteur VII » = J0/J24 x100 )

RESULTATS CYP 2C9 (région codante)

CYP 2C9 *2 CYP 2C9 *3

Répartition des génotypes:

NS 14% de la variabilité

P< 0.001

ANALYSE PAR SNP ou PAR HAPLOTYPE

Gène X

Réponse

SNP 1

SNP 2

Gène XSNP 3

Gène X

SNP 1 SNP 2

Gène XSNP 1 SNP 3

Gène XSNP 2 SNP 3

Gène X

= haplotype 1

= haplotype 2

= haplotype 3

Réponse

1 gène, plusieurs SNPs

ANALYSE PAR SNP ou PAR HAPLOTYPE

SNP 1 SNP 2

Gène BSNP 1 SNP 3

Gène BSNP 2 SNP 3

Gène B

= haplotype 1

= haplotype 2

= haplotype 3

Réponse

SNP 1 SNP 2

Gène ASNP 1 SNP 3

Gène ASNP 2 SNP 3

Gène A

= haplotype 1

= haplotype 2

= haplotype 3

≥ 2 gènes, plusieurs SNPs

7 haplotypes déterminés par 4 Tags (2-4-6-7)

Marqueurs Fréquences

T C C A A G C 0.286

T C C A G G T 0.242

C A T C A G T 0.231

T A C A A G T 0.089

T C C C A G T 0.048

T A C A A G C 0.030

T A C A A A T 0.010

Intérêt  des  Tag  SNP

HA

PLO

TYPE

S

région 5’Flanquante and promoteur Région codante région 3’non traduite

STRATEGIE UTILISEE POUR ETUDEHAPLOTYPIQUE DE VKORC1

http://pga.gs.washington.edu/data/vkorc1/welcome.html

29 SNPs répartis sur 10 kb

17 SNPs avec fréquence > 5%

-4931 T>C -4451 C>A -2659 G>C -1877 A>G -1639 G>A 497T>G 698C>T 1173C>T 1542G>C 3730G>A 4901 A>C 5113 G>A 5408 G>C2255C>T

-4931 T>C -4451 C>A -2659 G>C -1877 A>G -1639 G>A 497 T>G 1173 C>T

Sélection des «Tag »SNPs

in silico

STRATEGIE UTILISEE POUR L’ANALYSE DU GENE VKORC1

6 Tag SNPs (5 dans la région 5’, 1 dans l’intron 1)

95 % de la diversité haplotypique

ANALYSE HAPLOTYPIQUE DES POLYMORPHISMESDU GENE VKORC1 EN RELATION AVEC LA

REPONSE PHARMACOLOGIQUE

7 haplotypes: SNP -1639G>A =« marqueur des haplotypes »

Base de données => SNPs : reconstruction des haplotypes corrélation avec variation du facteur VII

SNPs Effet haplotypique

-4931T> C -4451C>A -2659G>C -1639G>A 497T>G Fréquence Variation du Factor VII (%) (95% CI)

C C G A G 0.27 18.9 (16.7-21.1)

C C G A T 0.12 18.6 (14.0-23.2)

T C G A G 0.019 19.2 (7.5-30.9)

18.9 (16.9-20.9)

T C G G T 0.23 34.3 (32.4-37.2)

T A C G T 0.21 36.8 (33.6-39.9)

T A G G T 0.11 37.6 (32.8-42.3)

C C G G T 0.017 41.5 (22.3-60.7)

36.0 (34.2-37.8)

EFFET DE LA MUTATION VKORC1 –1639G>A SUR LAREPONSE A L’ACENOCOUMAROL

Variation Facteur VII

Génotype VKORC1

37% de la variabilité

P<0.001

Bodin Blood 2005

EFFET ADDITIF DE VKORC1 EFFET ADDITIF DE VKORC1 ––1639G1639G>A ET CYP2C9*3>A ET CYP2C9*3SUR LA REPONSE A LSUR LA REPONSE A L’’ACENOCOUMAROLACENOCOUMAROL

Variation Facteur VII

(%)

5%15%

Bodin et al, 2005

Adaptation de posologie en fonction du génotype

Sconce et al, Blood 2005

54.2.001

Toutes lesvariables

16.0.001

D= 2.12+ 0.0237 (taille)Taille

15.0.001

D= 2.41- 0.297 (VKORC1)VKORC1 génotype(-1639G>A)

17.5.001

D= 2.01- 0.252 (*2) - 0.454 (*3)CYP2C9 génotype(*2 et *3)

16.7.001

D = 2.85 - 0.0137 (âge)Age

Valeur du R2

(%)pEquation de la régression

(D= dose)Modèle, xvariables

Modélisation de la dose de warfarine incorporant les génotypesCYP2C9 and VKORC1 et les caractéristiques cliniques des malades

variables: âge (années); génotype (nb d’allèles variants : 0,1,2); taille (cm)

D= 0.628 - 0.0135 (âge) - 0.240 (*2) -0.0370 (*3) - 0.241 (VKORC1) + 0.0162(taille)

Adapted from Sconce et al, 2005

Correlation analysis of calculated warfarin doseusing regression model versus actual dose in unrelated second

cohort of stable patients

Regression equation for modeling warfarin daily dose:

Dose (mg) = 0.628 – 0.0135 (Age) – 0.240 (CYP2C9*2) – 0.370 (CYP2C9*3) – 0.241 (VKOR) + 0.0162 (Height)

(r = 0.80; P < .001)

DESCRIPTIF DE LDESCRIPTIF DE L’’ETUDE ETUDE

Critères de sélection des patients

- Caucasiens hospitalisés, ≥ 75 ans-Initiation d’un traitement par warfarine avec INR cible = 2,5 (2 à 3)- Consentement signé

Inclusion

- INR > 1,3 avant traitement- Traitement par AVK récent- Refus de consentement

Exclusion

J04mg

le soir

Schéma d’initiation posologique > 70 ansSiguret V et al, Am J Med, 2005

J3Mesure de

l’INRet adaptation deposologie selonun algorithme

Contrôle del’INR toutes les24-72 h

Adaptation sinécessaire(paliers 1mg)

J14mg

le soir

J24mg

le soir

Identique pour tous les patients

***

Pautas E, Moreau C et al, Clin Pharm Ther 2010

RESULTATS : RESULTATS : Dose à l’équilibre

0 1 2 ≥ 30123456789

Number of variant alleles

Do

se d

e w

arf

ari

ne

À l

’éq

uil

ibre

(m

g/j

)

Nombre d’allèles variants

P < 0,0001Effet additif des génotypesCYP2C9 et VKORC1

ÂgeÂge p = .02CYP2C9CYP2C9 p = .0010VKORC1VKORC1 p < .0001EPHXEPHX p = .015CYP4F2CYP4F2 p = .054

Modèle de régression multivarié

variabilité génétique : ≈25%

PART GENETIQUE DE LA VARIABILITEPART GENETIQUE DE LA VARIABILITEDANS LA DOSE DE WARFARINE A LDANS LA DOSE DE WARFARINE A L’’EQUILIBREEQUILIBRE

Modèle statistique obtenu par régression linéaire multivariée

EPHX11,7%

CYP2C93,2%

CYP4F21,1%

VKORC1

19,1%

CYP2C912,0%

CYP4F2 1,5%

VKORC1

30,0%

Takeushi, Plos 2009

Total : 43,5%

Age moyen : 66 ans

Total : 25,1%

Age moyen : 87 ans

% d

e va

riab

ilité

exp

liqué

e

Bilan des résultats : variabilité de la dose d’AVK à l’équilibre

fluindione

Part génétique très importante dans la réponse aux AVK

Patients âgés

EnfantsPatients âge moyen

warfarinePart non génétique

Part génétique

Identification de biomarqueurs

Approche GWAS« Genome Wide Association

study »

Les  études  d'associaAonLes  études  d'associaAon

MeKre  en  évidence  le  rôle  de  gènes/régions  "candidats"  dans  la

variabilité  d'un  phénotype

Comment  ?Comment  ?

Tester  l'associa'on  sta's'que  entre  des  polymorphismes  (marqueurs)

et  le  phénotype  d'intérêt

Puces à ADN

Marquage fluorescent de sondes Hybridation spécifique sur ADN de patientsGrande capacité de génotypage:densité variable, jusqu’à 1 milllion de SNPsLecture automatisée sur plate-forme dédiée

P-values for each GWAS SNP tested for association with warfarin dose.Horizontal axis shows SNP location and vertical axis is －log10(p-value) for each SNP tested by univariate regression (A) or multivariate regression (B). Red dots and red lettering show SNPs and implicated genes with p-values beyond the genome-wide significance threshold (1.5×10－7) which is denoted by a horizontal line. (A) Univariate regression shows genome-wide significant association to SNPs clustering near the warfarin drug target VKORC1 (e.g., P = 5.4×10－78, rs9923231) and near the warfarin-metabolizing gene CYP2C9 (P = 4.5×10－17 for non-synonymous *3 SNP rs1057910, P = 8.8×10－13 for non-synonymous *2 SNP rs1799853, P = 3.1×10－31 for *2*3 “composite” SNP rs4917639). (B) Multivariate regression adjusting for the contributions of VKORC1 and CYP2C9 had greater power than univariate regression and detected genome-wide significant association to the CYP4F2 gene (P = 8.3×10－10, non-synonymous SNP rs2108622).

Résultats de l’étude d’association avec l’hépatotoxicitéde la flucloxacilline

Nature genetics 200951 cas/282 témoins, puce Illumina Human1MRéplication dans étude indépendante (23 cas)

• Pic d’association p=8.7x10-33• Chromosome 6 = région MHC• Identification d’un marqueur en déséquilibre de liaison avec HLA-B*5701

CONCLUSION GENERALE

Bon usage de la pharmacogénétique va permettre:

Meilleure adéquation malade-traitement

Moins d’effets secondaires

Traitement plus efficace et à moindre coût

Phases de Développement Du Médicament

Utilisation en routine clinique

Ce qu’il faut retenir

• Il existe une grande variabilité interindividuelle dans la réponseaux médicaments;

• Les facteurs génétiques expliquent une part de cette variabilité;• Il est possible de prédire la réponse aux médicaments:

génotypage, phénotypage, corrélation génotype-phénotype;• Pour le génotypage: nécessité d’avoir des populations

homogènes (influence de l’ethnie sur la fréquence des SNPs)• Etudes cliniques ou chez le volontaire sain• Approches gènes candidats ou études pangénomiques «Genome

Wide Association Study »• Etudes en combinaison de SNP ou d’allèles: approche

haplotypique