apport de la molécillaire au diagnostic

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université de Jijel Faculté des sciences exacte et des sciences De la nature et de la vie DEPT : Biologie Moléculaire et Cellulaire

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Mémoire de fin d'étuae

En vue de L'obtention du Diplôme des Etudes

Supérieures (D.E.S) en Biologie

Option : microbiologie

Thème

Apport de la biolo~e molécillaire au diagnostic . bactériologique

Membres du Jury Présenté par:

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BENSEGHIER Salima ~ -. .. ' / ' :--- .. (1 ) BOUDADI Nabila ~ Examinateur : ADJEROUD Nawel /. .... BOUDOUIRA Imane (~

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SOMMAIRE

Introduction .. . . .. . .. .. .. .. .. . . .. . . . .. . . .. . . . .. . . .. . . . .. . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. .. . .. . . . . .. 1

Chapitre 1 : Généralités

1.1 . La naissance de la biologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2

I.2. Les bases fondamentales de la biologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 2

1.3 . Les avantages et les inconvénients de la biologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.4. Les principes applications de la biologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

I.4.1. Le Domaine médical . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

I.4.2. Le Domaine agroalimentaire . . . .. . . .. ... .. . . . . . .. .. . . . . .. . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . .. . 4

I.4.3. Le domaine toxicogénomique...... ...... .. .... .... .. .. ... ... ... .. . .. .. .. .. . .. .. ... .. .... 4

I.4.4. Le domaine de l'environnement.. .................. ..................... ................ 5

I.4.5 . Le domaine de la microbiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Chapitre II: Quelques techniques de base de biologie moléculaire

II. l . Hybridation moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

11. l. l . La température fusion de l' ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

II.1.2. Limites de l' identification de séquence nucléique par l'hybridation moléculaire 8

II.1. 3. Application de l'hybridation.. ... . ...... . .... ...... .... ... .. ....... . ..... . . . .......... ... 9

Il .2. Amplification génétique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

II.2.1. La technique de PCR . . . . .. .. . . .. . .. . . . .. . . . .. .. . . . .. . . . . . .. . .. . . . . . . .. . . . . . . . . .. . .. . . .... 10

II.2.2. Quelque variantes de la PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 11

11.2.3. LCR (Ligase Chain Reaction) ... . . . . .. . . . ... .. . . . . . .. . .. .. . .. ... . . .. ... . .. . . . .. . . .. . .. 12

II.2.4. La technique NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) .. .. . .... 13

II.2.5.TMA (Transcription-Mediated Amplification) . . . . . . .. . . .. .. . . .. ... . .. . .. .. . ... . .. . . .. 13

II.3.Technique de séquençage de l'ADN ................................. ... ......... ......... 13

II.3.1 . Méthode de Sanger . ............. . ... .. .... .. .... .................. . .. . . ........... . ...... 13

II.3.2. Méthode de Maxam et Gilbert....... ... ..................... ....... ........ ............ 14

II.3 .3. Autres méthodes de séquençage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Chapitre III : Application des méthodes de biologie moléculaire au diagnostique bactériologique

III. l . Méthodes classiques d' identification des bactéries ..... .. .. ... .... ... ... .. ....... . .. ..

111.1.1. Les différents types de prélèvements utilisés pour le diagnostic des maladies Infectieuses .... .... ..................... ............ .... . ........................ . ...... .

lll.1 .2. Identification macroscopique .......... .......... ..................................... .

16

16

17

III.1.3. Identification microscopique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

III.1.4. Identification biochimique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

III.1.5. Les tests de sensibilités aux antibiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 22

III.2. Méthodes d'identification des bactéries par la biologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . 24

III.2.1. Le typage bactérien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

III .2.2. Détection de la résistance aux antibiotiques, basée sur l' ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

III.2.3. Les puces à ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Chapitre IV: Diagnostic moléculaire de quelques maladies infectieuses

IV .1. Diagnostic moléculaire de la tuberculose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

IV.2. Le diagnostic moléculaire de l'endocardite infectieuse .. . .. . .. . . . . .. . . . . . . . .. . . .. . .. 28

IV.3. Le diagnostic moléculaire de listériose . . . .. . . . . .. . . .. .. . . . .. .. . .. . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . .. 29

Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

Références bibliographiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

ADN

ARN

ARNm

ARNr

ATB

CMI

LCR

PCR

pH

SPH

Tm

LCR

TMA

NASBA

OGM

Liste des abréviations

Acide DésoxyRiboNucléique

Acide RiboNucléique

ARN messager

ARN ribosomique

Antibiotique

Concentration Minimale Inhibitrice

Liquide CéphaloRachidien

Polymèrase Chain Réaction

potentiel Hydrogène

Séquençage Par Hybridation

Température melting

Ligase Chain Reaction

Transcription-Mediated Amplification

Nucleic Acid Sequence-Based Amplification

Organismes Génétiquements Modifies

La Liste des figures

Figure 01. Détection de bactéries pathogènes dans un échantillon biologique..... 5

Figure 02. le Principe d'hybridation moléculaire.. .......... ........................ ... 7

Figure 03 . Mise en évidence de la séparation des deux brins d'un ADN et 8 mesure de la température de fusion (Tm) ................................. .

Figure 04. le principe de PCR.... . ....... ..... . . ... ...................................... 11

Figure 05. Le trouble..... . ............ . ...... . .. ....... ... .. ....................... .. 17

Figure 06. Hématurique . . . . .. . . . .. . .. . . .. .. . .. . . .. . . . .. . .. . . . . . . . .. . .. . . . . .. . .. . . .. . . . . ... 17

Figure 07. Coloration anormale .............. ... ............... .. ... . ............ . . .... .. 17

Figure 08. L'odeur . ... ...... ...... .. ... . . . . . .. ..... . .. .. .... . . .. ...... . .. . .... . . ... .... . ... 18

Figure 09. Les colonies.................................................................... 18

Figure 10. L'observation microscopique à l' état frais. .. ................................ 18

Figure 11. L'observation microscopique après coloration simple .. ................. 19

Figure 12. L' observation microscopique après la coloration de Gram. ....... .. ... . 20

Figure 13. L'observation microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen...... 20

Figure 14. La structure du gène de l'ARN16S ..... ... .. .. .... .......... .... . . .. ... . . ... 25

Figure 15. Amplification génique directe des Mycobactéries...... .. ... ..... ....... ... . 28

INTRODUCTION

Introduction

La biologie moléculaire consiste à étudier la structure des gènes, leur expression et le contrôle de leur expression.

Depuis l'invention de la technique d'amplification par PCR (polymérase chain réaction) en 1983, la biologie moléculaire s'est implantée rapidement dans les laboratoires de microbiologie clinique. En effet, bien que de nombreuses techniques de microbiologie demeurent traditionnelles (examen macroscopique, examen microscopique, culture bactérienne, tests biochimiques ... ), la biologie moléculaire a pu trouver sa place en routine dans un grand nombre de laboratoires d'analyses médicales. L'étude des agents infectieux à l 'aide des outils de biologie moléculaire est ainsi devenue indispensable dans certaines indications.

La biologie moléculaire regroupe un ensemble des techniques comme l' amplification génétique, l'hybridation moléculaire et le séquençage, ces techniques sont basées sur l' étude, la détection et la modification des acides nucléiques. Le rôle du laboratoire de bactériologie clinique repose sur l'isolement et l'identification de l'agent pathogène, l'étude de la résistance aux agents antibactériens ainsi que l'étude du lien de clonalité. Selon le germe en cause, le délai de réponse peut prendre plusieurs jours voire des semaines ou même des mois. Le traitement est donc souvent instauré uniquement sur les données cliniques sans l'aide du diagnostic bactériologique. Avec des techniques de biologie moléculaire qui sont des tests d'identification rapides, sensibles et spécifiques pour la plupart des microorganismes. Les techniques de biologie moléculaire sont de nouveaux outils qui complètent les méthodes classiques de diagnostic bactériologique.

La biologie moléculaire présente un certain nombre d'avantages et d'inconvénients par rapport aux techniques classiques utilisées au cours du diagnostic des maladies bactériennes (tuberculose, endocardite infectieuse, listériose .. . etc.).

Dans notre travail, nous allons essayer de montrer, qu'il ne s'agit pas de vouloir absolument utiliser la biologie moléculaire, ni même remplacer les techniques traditionnelles, mais que la biologie moléculaire peut compléter très efficacement les techniques classiques dans le diagnostic bactériologique.

1

CHAPIRTEI

GÉNÉRALITÉS

Chapitre 1 Généralités

La biologie moléculaire est une expression qui en elle-même n'a pas une grande signification, mais qui est maintenant consacré par l'usage, et que l'on utilise dans le sens de «biologie moléculaire des gènes ». La biologie moléculaire consiste en effet à étudier la structure des gènes, leur expression et le contrôle de leur expression. Elle entraîne donc à travailler essentiellement avec des molécules d' ADN et d' ARN (Etienne, 1999). Elle va expliquer les relations qui existent entre la structure et la fonction des molécules biologiques et la manière dont elles contribuent à l'opération et au contrôle des processus biochimiques (Turner et al., 2000).

1.1. La naissance de la biologie moléculaire

Le 20éme siècle coïncide avec la naissance de la génétique : débutant avec la redécouverte des travaux de Mendel précisément en 1900, qui est le premier qui a établit les lois de l'hérédité, se poursuivant par le développement de la théorie chromosomique de l'hérédité avec les travaux de Morgan sur la drosophile : les gènes sont alors localisés sur les chromosomes. Moran avec Sturtevant ont constitués les premières cartes génétiques à partir du développement des procédures de mutagenèse expérimentale par Muler (Alibert, sans année).

Les premières phénomènes qui allait permettre de progresser dans l'identification du support de l'hérédité est celui de la transformation bactérienne, rapporté en 1928 par Griffith. Ce phénomène représente alors un test d'activité biologique, grâce auquel il est possible de déterminer la nature du matériel génétique. Ce test ne sera pas mis à profit par Griffith lui-même, mais en 1944 par Avery qui l'utilise pour élucider la nature biochimique du matériel génétique: il s'agit de l' ADN (Alibert, sans année). A la suite, la biologie moléculaire a connu une explosion qui a abouti à la découverte de la structure en double hélice de l' ADN par Crick et Watson en 1954, à celle du code génétique et des mécanismes de la transcription et de la traduction des protéines (Swynghedauw et Silvestre, 2008). Vers la fin des années 1970, une autre étape importante dans la génétique a été atteinte ; les chercheurs ont découvert qu'il était possible de manipuler des molécules d' ADN dans un tube à essai(in vitro) en « clonant » le premier gène, cette découverte a permis d'autre avancées en génétique moléculaire comme le développement de technique de recombinaison de l' ADN (génie génétique) et l'essor de l'industrie des biotechnologies (Ebord et Stansfield, 2003).

1.2. Les bases fondamentales de la biologie moléculaire

De manière générale les acides nucléiques sont des macromolécules constituées de chaines de nucléotides. Selon le sucre dont il est composé on distingue deux types d'acides nucléiques :

)> L' ADN (acide désoxyribonucléique) est une longue molécule ressemblant à une échelle dont les deux brins seraient enroulés en une double hélice. Chaque brin de l'hélice est une molécule linéaire faite de l'assemblage d'éléments appelés nucléotides. Il existe quatre types de nucléotides chaque type est porteur d'une des quatre bases azotées possible, A (adénine), G (Guamine), T (Thymine) et C (ytosine). Ces quatre bases constituent l'alphabet génétique à partir duquel est constitué, par combinaison adjacents sous forme de triplets. Le code génétique assurant la correspondance entre l'information génétique et les chaines peptidiques. Deux brins d' ADN étaient complémentaires de sorte que les barreaux de l'échelle en double hélice sont toujours de type A=T ou G=C. Cette complémentarité joue un rôle à la fois dans la duplication de l' ADN et dans l'expression des gènes. Dans les deux processus, un ou les deux brins d' ADN servent de matrice pour la synthèse d'un brin complémentaire (Spencer et al., 2006).

)> L' ARN (acide ribonucléique) est un autre type d'acide nucléique qui est chimiquement proche de l' ADN. Ses nucléotides contiennent comme sucre le ribose au lieu du désoxyribose et la

2


base uracile remplace la thymine. Par ailleurs, contrairement à l' ADN qui est formé de deux brins complémentaire enroulés en double hélice par appariement, l' ARN n'est constitué généralement que d'un seul brin. Cependant, il convient de noter qu'un ARN et un brin d' ADN pourront localement, très ponctuellement, s'apparier pour former une structure complémentaire (Spencer et al., 2006).

1.3. Les avantages et les inconvénients de la biologie moléculaire

Les techniques d' identification ainsi que les critères de classification mis à la disposition des microbiologies évoluent sans cesse. Le développement des techniques de biologie moléculaire à en particulier, introduit de nouveaux critères d'identification basés sur l'étude de la présence de certaines gènes sur l'étude de leur séquence .... , l'extrême variété des génomes a permis la différenciation de germe jusqu'alors confondus ( Durand et Frezet, 2003). Bien que les nombreuses techniques soient différentes, elles présentent toutes des avantages et des inconvénients communs

1.3.1. Les avantages

La biologie moléculaire représente un ensemble d'outils dont le but est la mise en évidence des acides nucléiques (ADN ou ARN). L'étude de la littérature internationale sur ce sujet montre sa puissance d' analyse. Tous les agents infectieux connus (bactéries, virus, champignons, parasites, . .. . ) sont détectables par cette méthode. La biologie moléculaire est aussi parfois le seul outil capable de détecter des nouveaux agents pathogènes. Comparée aux techniques de microbiologie classiques, la biologie moléculaire présente de nombreux avantages: le résultat est sensible, rapide et spécifique, permet la confirmation du diagnostic, un traitement adapté et une hospitalisation plus, courte les infections nosocomiales peuvent être dépistées pluttôt, la source d' infection identifiée, le traitement et la prophylaxie ajustés. Enfin, l'automatisation se développe progressivement, facilitant ainsi la mise en place de ces techniques et améliorant ses performances (notamment sa rapidité d' analyse) tout en diminuant ces inconvénient (Lamoril et al., 2007).

La biologie moléculaire présente aussi plusieurs avantages dans le domaine de l' agriculture. Certains de ces avantages liés au développement accru de la transgénèse en tant que composante particulière des biotechnologies pourraient s'avérer riches de conséquences en général: il ne s' agit moins, en effet que de modifier l'économie mondiale par l'amélioration des systèmes de bioconversion des matières renouvelables, face à la diminution des réserves fossiles , de permettre l'utilisation de procédés moins consommateur d'énergie (transformation des produits agricoles par les biocatalyseurs ) ou encore d'assurer un meilleur respect de !'environnements (Académie des sciences, 1993).

1.3.2. Les inconvénients

L' inconvénient principal de la biologie moléculaire est la contamination aboutissant à de faux positifs. Les techniques de biologie moléculaire faisant le plus souvent appel aux méthodes d'amplification génique. A l'opposé, dans certain cas des inhibiteurs d' amplification peuvent être présents aboutissant alors à de faux négatif, les contrôles sont donc importants. Par ailleurs, dans certains cas, la mise en évidence d'un acide nucléique ne permet pas d' affirmer la viabilité de l' agent infectieux. Enfin, la biologie moléculaire nécessite un ensemble d' appareils et de kits couteux, un personnel spécialisé et entrainé, et des locaux spécifiques (Lamoril et al., 2007).

3


1.4. Les principales applications de la biologie moléculaire

Depuis la découverte de la technique d'amplification génique par PCR, les applications de la biologie moléculaire ont connu un essor spectaculaire. Le séquençage du génome humain et d 'un certain nombre d'agents infectieux, le décryptage en cours de nombreux autre génomes, les apports de la génomique et de la protéomique, la compréhension croissante des mécanismes physiologiques et physiopathologiques montrent l'implication importante de la génétique moléculaire dans de nombreuses pathologies et dans l' étude des facteurs de risques de nombreuses maladies. Par conséquent, la génétique moléculaire et dans son ensemble, la biologie moléculaire prennent une place de plus en plus importante dans le domaine de la médecine (Bougard et al., 2005).

1.4.1 Domaine médical

1.4.1.1. Identification des cibles pour la recherche thérapeutique

Dans la biologie moléculaire, on utilise plusieurs techniques tel que la PCR classique, et le séquençage. Parmi ces techniques les puces à ADN au séquençage, leurs contribution s' accompagne d'une aide à la compréhension plus fine du génome et de sa régulation ainsi, grâce au puces à ADN ont été mis en évidence de nouveaux gènes spécifiques s'exprimant dans le tissu cérébral de l' enfant ou apparaissant associés à des pathologies inflammatoires rhumatismales ou intestinales. Les puces à ADN devraient contribuer à l'identification de cible thérapeutique pour la recherche pharmaceutique. Elles servirent aussi à déterminer la résistance aux antibiotiques de certaines souches microbiens pour permettre de mieux lutter contre celles-ci (Kruschina et al., 2002).

1.4.1.2. Pharmacogénomique

La pharmacogénomique consiste à identifier les gènes impliqués dans l' efficacité (ou l' inefficacité) d'un produit ou ces effets indésirables. Elle conduit à une meilleure compréhension des mécanismes d' action des médicaments, en montrant qu'une molécule sur une action variable, la puce à ADN ouvre le champ des potentiels thérapeutiques. Elle permet aussi d'identifier les effets secondaire d'un produit et, lors des essais cliniques, de faire des mesures de toxicité (Kruschina et al., 2002).

1.4.1.3. Analyse de mutation

A coté de la séquence sauvage on utilise plusieurs sondes identiques à une mutation prés. Les sondes vont couvrir l' ensemble des mutations potentielles (substitution, délétion, addition) de manière générale. L'analyse de substitution (pour une positon donné) impliqué donc l'utilisation de quatre sondes une pour la séquence sauvage et trois pour chacun des nucléotides pouvant se substituer au nucléotide originale. Cela permet ainsi de repérer des séquences mutantes dans un échantillon test (Krushina et al., 2002).

1.4.2. Domaine agroalimentaire

Les techniques de biologie moléculaire peuvent être utilisés dans la détection des séquences provenant d' organismes génétiquements modifies (OGM) dans les semences ou dans certains aliments, dans la détection d' agents infectieux dans l'aliment comme la Salmonelle ou la Listeria et dans le contrôle des microorganismes utilisé dans certaine fabrication (Krushina et al., 2002).

1.4.3. Le domaine toxicogénomique

Dans le cas de l' analyse de la réponse toxicologique, les techniques de biologie moléculaire sont plus utilisés tel que la puce à ADN, on doit au départ faire l'hypothèse que l' effet toxicologique, direct ou indirect d' une substance résulte de la modification de l' expression de

4


certains gène ou des moins qu' il lui est associé. Les mesures consistent alors à évaluer l'expression différentielle de gènes de deux échantillons, grâce à un marquage par fluorescence en deux couleur cela permet de comparer les profils d'expression génique de deux tissus différents (Krushina et al., 2002).

1.4.4. Le domaine de l'environnement

La détection des agents infectieux dans l'alimentation, l'air ou l'eau (Salmonella, Listeria, Legionnella). Le contrôle de la qualité de l'eau passe aujourd'hui par l'analyse de 64 paramètres de qualité dont certains doivent être surveillés en permanence, par exemple les puces à ADN permettent de détecter la présence, même entrés une faible quantité d'un microorganisme en le reconnaissant à travers son empreinte génétique, l'utilisation de puce ADN permet un diagnostic et donc une intervention plus rapide (figure 01) (Krushina et al., 2002).

... . . .......... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Révél tion

Caractérisation rapide du ou des

pathogènes présents dans le prélèvement

résultat obtenus en 24h)

Puce à ADN contenant des sondes dirigé contre les ARN 16s de

Plusieurs Bactéries pathogènes (Salmonelle, Legionelle,

Staphylocoque .. . .)

Hybri

Eau, produit alimentaire, tissus infectés

prélèvement

Amplification des gènes d' ARN 16s présente + Marquage

FigureOl : Détection de bactéries pathogènes dans un échantillon biologique (Krushina et al., 2002).

1.4.5. Le domaine de la microbiologie

Ce demaine représente la bactériologie, virologie, parasitologie et mycologie. Dans ce domaine, la littérature est abondante et rapporte l'étude d'un nombre très important d'agents infectieux. Parmis les nombreuses techniques employés dans ce domaine, la PCR reste la technique d'amplification la plus utilisée (Bogard et al ., 2005). Ainsi la détection de microorganismes (présente, mutation, capacité à résistance à certains antibiotiques ou à des inhibiteurs d' enzymes, identification des espèces) par exemple, des matrices des sondes ont développé l'identification de pathotype d' Escherichia coli et des gène de virulence associé (Bekal et al., 2003), de Mycobactérium tuberculosis résistantes à la rifampin(Troesh et al., 1999), de bactéries de la flore intestinale et d'autres cibles importantes pour le diagnostic clinique (Westin et al., 2001).

5


La bactériologie clinique est l' étude des germes responsable d ' infection chez l' homme. Ces infections peuvent être de nature diverse, respiratoire, digestive, urinaire, génitale . .. etc. (Serre et al., 2002).

Le diagnostique bactériologique est un ensemble de moyens permettant de confirmer telle ou telle étiologie infectieuse d'origine bactérienne. Ces moyens sont variés et caractérisent soit le diagnostic direct soit indirect.

~ Diagnostic direct : la mise en évidence de la bactérie elle-même, donc de son culture ou de son isolement qui permettra l'identification ultérieur ainsi que de préciser sa sensibilité aux antibiotique.

~ Diagnostic indirect: la mise en évidence de la réponse de l' organisme à l' infection par la présence d'anticorps spécifiques, le plus souvent sérique ou plus rarement par une réponse d'hypersensibilité, dite allergique (Anonyme, 2002).

Bien que le diagnostic bactériologique repose encore aujourd'hui sur les techniques classiques telles que la culture, l' isolement et l'observation microscopique après la coloration . . . , les méthodes de biologie moléculaire permettent dans certain cas d' identifier plus rapidement et plus précisément le germe en cause. La recherche quantitative des acides nucléique bactérienne (ADN et ARN) directement dans le prélèvement clinique peut être effectuée. Cependant, pour les germes a croissance rapide, ce mode de détection reste limite a quelques laboratoires spécialisés (Serre et al., 2002).

6

CHAPITRE II

QUELQUES TECHNIQUES DE BASE DE ,

BIOLOGIE MOLECULAIRE

Chapitre II Quelques techniques de base de biologie moléculaire

11.1 Hybridation moléculaire

Beaucoup de méthode de biologie moléculaire repose sur le principe de l'hybridation moléculaire, il s'agit de la propriété qui présente une molécule d' ADN monobrin de s'associer spontanément, de façon spécifique et réversible à autre molécule monobrin. Si celle-ci est complémentaire, schématiquement l'hybridation est la capacité d'appariement d'une molécule d' ADN simple brin avec son brin complémentaire, alors qu'elle est incapable de s'apparier avec une séquence non complémentaire (Gelehrter et al., 1991)

~ Principe Les méthodes d'hybridation utilisent des acides nucléiques marqués, nommés sondes,

cette appellation provient du fait que cette sonde placée dans un milieu très complexe contenant de nombreuses molécules non marquées d'acide nucléique, ne s'associera pas que avec ceux qui ont une homologie de séquence (complémentaire). Ces sondes servent à identifier une séquence nucléique dans un milieu complexe (figure 02) (Lamoril et al., 2005).

,

5'A TCAGTACCTTATACGCTTCGT 3'

3, T AGTCA TGGAA TA TGCGAAGCAA 5'

• Chauffage refroidissement

Dénaturation renaturation

5' ATCAGTTACCTTATACGCTTLGTT3'

3'TAGTCATGGAATATGCGAAGCAA5'

5'~ ATCAGTTACCTTATC 3' sonde

L'hybridation

~ 1J 5'ATCAGTTACCTTATC 3'

TAGTCAAGGAATAGCGAAGCAA 5' 3'

Figure 02: le Principe d'hybridation moléculaire

11.1.1. La température fusion de l' ADN

La température de fusion de l' ADN appelée également température de demi dénaturation. Lorsqu'un ADN bicaténaire est chauffé à une température supérieure à la température de fusion (Tm), les deux brins de la molécule se séparent par suite de la rupture des liaisons hydrogènes (liaison faibles) qui les maintiennent appariés. Le passage de la forme bicaténaire à la forme simple brin est brutal pour une très faible variation de température autour de la Tm du fait du caractère coopératif de la réaction. Le passage de la forme bicaténaire à la forme monocaténaire s'objective très facilement par mesure de la variation de densité optique à 260nm (figure 03), le coefficient d'extinction d' ADN

7


monocaténaire étant sensiblement plus élevé que celui de l' ADN bicaténaire (effet hyperchrome).

nm

cœ ( .. - - - - l

C01

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Figure 03 : Mise en évidence de la séparation des deux brins d'un ADN et mesure de la température de fusion (Tm) (Kaplan et Delpech, 2007).

11.1.2. Limites de l'identification de séquence nucléique par hybridation moléculaire

Le diagnostic par sonde nucléique est une méthode d' identification dont on peut mesure à l'heure actuelle la remarquable efficacité. Le principe est simple: il consiste, si l'on prend l'exemple d'une application en microbiologie, à démontrer dans un milieu biologique la présence d'un acide nucléique (ADN ou ARN) dont la séquence est spécifique du germe recherché, c'est -à-dire qu'elle n' existe qu'au sein du génome de ce germe. Ceci impose la connaissance préalable de la séquence nucléique que r on cherchera à repérer, ainsi que la vérification de sa spécifique. Ce type de diagnostic fait appel à l'hybridation moléculaire: pour détecter une séquence cible donnée dans un prélèvement biologique, on ajoute une sonde de séquence complémentaire que s'y s'associe si ceHe-ci est présente dans l' ADN à analyser. Après avoir éliminé les sondes non fixées au cible, il est nécessaire de détecté les hybridations formés. Le moyen le plus simple est de recourir au marquage, en fixant un élément générateur de signal sur la sonde. Ce générateur est de nature soit isotopique, soit enzymatique (phosphatase alcaline ou peroxydase), soit fluorescente. Cependant, l'hybridation moléculaire est confTontée à la marque de sensibilité du signal produit: il est difficile de la détecter s'il y a peu de cibles présentes dans le milieu à analyser. Bien que quelque trousses de détection par hybridation moléculaire aient ainsi été commercialisées, notamment pour la recherche de Chlamydia.tracomatis, il n'est d'une manière générale, intéressant de mettre en ouvre ce système que sur des milieux préalablement amplifiées par des cultures in vitro, le milieu contenant au bout d'un certain temps un nombre suffisant de

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Chapitre Il Quelques techniques de base de biologie moléculaire

germes, donc de séquences cibles à hybrider avec les sondes ajoutées au milieu. L ' apparition des techniques d'amplification génique, dont la polymérase chaine réaction (PCR), fortement potentialisées la sensibilité du diagnostic par sondes reproduisant de façon accélérée le processus de culture, la PCR permet d'obtenir un nombre considérable de copies de séquences nucléiques identiques. L'augmentation considérable de sensibilité offerte par cette technique permet de détecter de très faibles quantité de séquences cibles, ce qui évite dans de très nombreux cas d' avoir recour aux isotopes. Mais l'intérêt de la PCR ne réside pas uniquement en un système puissant de détection de séquences cibles (Bogard et al., 2005).

II.1.3. Application de l'hybridation moléculaire

L'hybridation moléculaire est la base de très nombreuses techniques tel que :

• Southern blot Cette technique permet la détection d'un fragment d' ADN génomique spécifique, au

sein d'un mélange d' environ lmillion de fragment. Dans cette technique l' ADN génomique d'un individu est dégerée par une enzyme de restriction. Les multiples fragments qui en résultent sont séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel, et l' ADN est transféré sur un filtre de nitrocellulose puis hybridé avec une sonde marqué. Seuls les fragments d ' ADN contenant les séquences homologues à la sonde seront détectés (Gelebrter et al., 1991).

• Nortbern blot Cette technique permet de détecter une molécule d' ARN spécifique au sein d' un

mélange complexe. Dans cette technique les ARN messagers sont préparés à partir du tissu à étudier est séparés selon leur taille sur un gel. L' ARN peut être transféré sur un filtre est hybridé avec une sonde d ' ADN (Gelehrter et al., 1991).

• Reverse blot Cette technique appelée hybridation inverse, son principe est basé sur l' utilisation de

sondes spécifique d' allèle qui sont préalablement immobilisées sur un support qui peut être une microplaque ou une membrane de nylon (Lamoril et al., 2005).

• Dot -blot (ou reverse dot-blot) Cette technique est utilisée pour quantifier un ARN donné (dont on possède la sonde)

au sien d'une population hétérogène d'ARN sans séparation préalable. Avec le développement des techniques de PCR, voir même l'utilisation des puces à ADN qui peuvent conduire dans certaines conditions expérimentales à des résultats quantitatifs (Kaplan et Delpecb, 2007).

• Puces à d' ADN

Une puce à ADN ou microarray est un outil d'analyse des acides nucléiques composé d'un support solide, qui ont disposés à des positions spécifiques (Schena, 2003). Le principe de la puce à ADN est basé sur la technique d'hybridation, immobilisée sur un support solide, des oligonucléotides (simple brin) spécifique de différents gène ou ADNc connus constituent les sondes dans le rôle est de détecter les cibles marqués complémentaire, présents dans le mélange complexe à analyser (ARNm extraits de cellules, tissus ou organismes entièrs et couverts ADNc). Les sondes sont greffées sur support par un bras robotique, les signaux d'hybridation sont détectés selon le type de marquage, et la lecture nécessite des méthodes optiques sophistiquées (balayage laser, camera, . .. etc) (Krushina et al., 2002).

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II .2. Amplification génétique

L' amplification génique multiplie de manière exponentielle un fragment d' ADN cible: la quantité de fragments identique générés est en suite aisément détectée à l'aide de sondes. Afin d'amplifier le signal obtenu, lors d'une hybridation moléculaire entre la cible et la sonde marquée, il est nécessaire de multiplier le nombre de systèmes générateurs de signal. Pour ce la il est possible d'agir à trois niveaux.

~ Amplification de cibles Les méthodes telles que la PCR consistent à générer à partir d'une matrice cible un

nombre considérable de copies identique, jusqu'à 109molécules environ dont la détection et l'analyse seront ainsi simplifiées.

~ Amplification de sondes

L'amplification de sondes multiplie le nombre d'acides nucléiques sondes, aboutissant à une quantité de copies du même ordre de grandeur que ce qui est obtenu par amplification de cible.

~ Amplification du signal

Ce procédé consiste en une augmentation de la capacité du système à générer un signal par hybridation avec un nombre élevé de sondes marquées, sans modifier la quantité des molécules cibles présentes initialement. Cette méthode n'est pas un système d'amplification génique, mais elle exploite un système originale de sondes nucléique branchées qui leur confère une sensibilité supérieure aux sondes traditionnelles, ses applications recouvert le même domaine que l'amplification génique (Bogard et al., 2005).

11.2.1. La technique PCR

La réaction en chaine par polymérase est une technique puissante qui a rapidement devenue l' une des techniques les plus largement utilisées en biologie moléculaire, car elle est rapide, simple et peu couteuse. La technique amplifie les fragments d' ADN spécifiques d' infimes (Anonyme, 2003).

~ Principe

La technique PCR consiste à amplifier une séquence d' ADN en présence des amorces. Ces dernier peuvent s'apparier avec des séquences complémentaires situés sur chaqu' un des brins d' ADN de part et d'autre de la région à amplifier. Après une dénature de la séquence cible. Les amorces s'hybrider avec la séquence complémentaire pendant la renaturation. Une ADN polymérase thermorésistante permet la synthèse d'ADN à partir de l' amorce (étape élongation). Le cycle est répété 20 à 30 fois, a chaque cycle la quantité d' ADN synthétisé est doublée (figure 04) (Vildé et Nauceil, 2005).

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Chapitre II

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Quelques techniques de base de biologie moléculaire

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Figure 04 : le principe de PCR

II.2.2. Quelque variantes de la PCR

II.2.2.1. La RT-PCR (Reverse-transcription PCR)

Le meilleur reflet du nombre initial de copie d'une séquence nucléique présente dans un échantillon donné est sans conteste la cinétique d'amplification par PCR (précédée de transcription inverse, s'il s'agit de quantifier le nombre de copies d' ARN messager). Après extraction d'un ARN, celui-ci est transformé en ADN complémentaire (ADNc) par transcription inverse. Dans un second temps, 1' ADNc est amplifié par PCR (Bainque et al., 2008).

II.2.2.2. La nested-PCR Il s'agit d'une PCR avec deux couples d'amorces, un couple d'amorce (couple

externe) effectuant une première PCR suivie d'une second PCR à J'aide d'un second couple d'amorce (couple interne) s'hybridant à l'intérieur du première couple. Deux PCR successives sont donc réalisées. Cette PCR «nichée» (nested) permet d'augmenter la sensibilité du système ainsi d'augmenter considérablement le risque de contamination (Deybach et al., 2007).

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11.2.2.3. La PCR-Elisa

Le produit amplifie est marqué au cours de la PCR grâce à une des deux amorces marquées (par exemple, par un résidu de digoxygénine). Après fixation en microplaque à l 'aide d'une sonde capture, la révélation est effectuée à l'aide d'un anticorps spécifique (par exemple, antidigoxygénine) (Dey hach et al., 2007).

11.2.2.4. PCR en temps réel

La technologie de la PCR en temps réel est basée sur la détection et la quantification d'un« reporter »fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons générés durant la réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase exponentielle ou la première augmentation significative dans la quantité d'amplicons est en corrélation direct avec la quantité initiale de la matrice originale cible. Plusieurs instruments de PCR en temps réel sont commercialisés. Ces appareils utilisent généralement un système en tube fermés et la quantification ne requiert aucune manipulation post-amplification, ce qui minimise ou élimine les problèmes de contamination par les amplicons suite à la réaction de PCR et réduit le temps d' analyse. Le processus complet est donc automatisé du début à la fin rendant ainsi cette technologie intéressante pour les applications d'analyse à grand échelle (Houde et Poitras, 2002)

11.2.2.5. La PCR multiplex

Plusieurs couples d' amorce sont ajoutés dans un même tube et la PCR s' effectue en même temps pour chaque couple d'amorce. La PCR multiplex permet donc la mise en évidence de plusieurs cibles dans un seul tube. Elle peut être réalisée de manière conventionnelle (PCR classique), par PCR-Elisa ou par PCR en temps réel (Lamoril et al., 2007).

11.2.2.6. La PCR longue (long PCR)

Dans une PCR classique, il est difficile d'amplifier des fragments dont la longueur entre 2 et3 kb, surtout s' ils contiennent beaucoup de G et C. L'optimisation des conditions expérimental et l'utilisation d'autres polymérase, que la Taq polymérase ont permis de mettre au point une procédure appelée longue PCR, qui permet d'amplifier des fragments dans la longueur peut atteindre 40kb. L'incubation doit être effectuée a un pH plus élève que dans une PCR normale, il faut ajouter du glycérol, déminuer la durée de l'étape de dénaturation et d'augmenter celle de l'étape d'élongation. Enfin, et surtout, il faut utiliser deux polymérases, la première est une polymérase déletée de sa partie N-terminale et de ce fait diminuée l'activité 5~ 3'exonucléasique, la seconde est une polymérase à haute fidélité, qui sont des polymérases capable de corriger les erreurs grâce à leur activité 3,__. 5' exonucléasique qui les caractérisent (Kaplan et Delpech, 2007).

11.2.3. LCR (Ligase Chain Reaction)

Il s'agit d'une technique d'amplification de sondes. Après hybridation de quatre sondes adjacentes (deux sondes spécifiques du brin sens et deux spécifiques du brin antisens), Les sondes sont collées à l' aide d'une ligase à condition que la complémentarité soit absolue (absence de misappariement). Plusieurs cycles permettent ainsi l'amplification des sondes « collées ». Ses performances sont similaires à celles de la PCR (Lamoril et al., 2007).

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11.2.4. La technique NASBA

NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) Cette technique permet l' amplification à partir d' ADN ou d' ARN. Son principe est basé sur la transcription d' ARN produit-en de nombreux exemplaires au cours de la réaction. Trois enzymes sont utilisées à cet effet, une transcriptase inverse, une RNase H et une T7 ARN polymérase. 100 copies à 1000 copies d' ARN sont obtenues à chaque cycle (la PCR ou la LCR en produisent deux à chaque cycle). La sensibilité de la NASBA est similaire à celle de la PCR. Cette technique a été couplée à la détection par des balises moléculaires (Lamoril et al., 2007).

11.2.5. TMA (Transcription-Mediated Amplification)

Cette technique est proche de la NASBA et donne des performances similaires. Elle utilise le même principe, la différence résidant dans l'utilisation de deux enzymes au lieu de trois, la reverse transcriptase possédant aussi une activité RNase H (Lamoril et al., 2007).

11.3. Technique de séquençage de l' ADN

Le séquençage est une méthode qui consiste à déterminer la succession de nucléotide sur l' ADN. Ce procédé permet de déterminé les différentes anomalies responsable de maladies génétiques ou de réaliser des études d'épidémiologie moléculaire en microbiologie ou dans d'autre domaines. En 1977, deux principales méthodes ont été initialement développées : la méthode chimique, qui fut décrite par Maxam et Gilbert, et la méthode enzymatique décrite par Sanger, il y a d'autres techniques récente comme le séquençage automatisé de l ' ADN, séquençage en cycle, le séquençage par hybridation, ces techniques ont été utilisés et appliqués à l'analyse des génomes (Bogard et al., 2005).

11.3.1. Méthode de Sanger

Actuellement, la technique enzymatique de Sanger, dite aux «didésoxynucléosides triphosphates» (ddNTP) qui est la plus utilisée pour effectuer le séquençage d 'un segment d'ADN. Le principe général de cette technique est d'effectuer la synthèse d' un brin d 'ADN qui soit radioactif et complémentaire du brin dont on veut déterminer la séquence. L'originalité consiste à utiliser des didésoxynucléotides, et à ce que le brin d' ADN à séquencer soit inséré dans un vecteur de clonage (Beaumont, 2006).

L' ADN monocaténaire à séquencer sert de brin matrice pour la synthèse d' ADN in vitro en présence d'une amorce. L'amorce est un oligonucléotide synthétique marqué au bout 5' (figure 04), on effectue quatre réactions de polymérisation séparées, chacune en présence d'une faible concentration d'un des quatre ddNTP, en concentration équivalente et plus élèves des quatre désoxynucléosides (dNTP). Dans chaque tube à réaction, le ddNTP s' incorpore au hasard dans les positions du dNTP correspondant, car l'absence de groupe hydroxyle en 3' empêche l'addition du nucléotide (Lodish et al., 1997).

Les produis de ces quatre réactions sont ensuite séparés par électrophorèse, sur quatre couloirs parallèle d'électrophorèse en gel de polyacrylamide, les fragments nouvellement synthétisé sont repérés grâce au marqueur incorporé dans l'amorce, dans chacun des couloirs, les bandes représentent les différents fragments qui se sont terminés à l' un des nucléotides donné, mais à des positions différents sur l' ADN. En lisant ensuite les bondes dans l' ordre à partir de bas du gel et à travers les quatre couloirs, on peut déterminer la séquence exacte de l' ADN nouvellement synthétisé (Albert et al., 2005).

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11.3.2. Méthode de Maxam et Gilbert

C'est une méthode chimique basée sur le fait que certaines réactions rompent l' ADN préférentiellement au niveau d'une des bases. Le démithylsulfate libère la guanine, lorsqu' en milieu acide il libère l'adénine. L'hydrazine libère la thymine et la cytosine, en milieu saline elle libère uniquement la cytosine (Pierre, 1993).

En peut décomposer ce séquençage chimique en six étapes successives :

);;>- Marquage

Les extrémités des deux brins d' ADN à séquencer sont marquées par un traceur radioactif (P32

). Cette réaction se fait en général au moyen d' ATP radioactif et de poly nucléotide Kinase.

);;>- Isolement du fragment d' ADN à séquencer

Celui-ci est séparé au moyen d'une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide. Le fragment d' ADN est découpé au gel et récupère par diffusion.

);;>- Séparation de brins Les deux brins de chaque fragment d' ADN sont séparés par dénaturation thermique,

puis purifiés par une nouvelle électrophorèse.

);;>- Modification chimique spécifique

Les ADN simple brin sont soumis à des réactions chimiques spécifiques des différents types de bases. Walter Gilbert a mis au point plusieurs types de réactions spécifiques effectuées en parallèle sur une fraction de chaque brin d' ADN marqué. Par exemple une pour le G (alkylation par le diméthyle-sulfate), une pour G et les A (dépurination) une pour les Cet une pour les C et les T (hydrolyse alcaline), ces différents réactions sont effectuées dans des conditions très ménagées, de sorte qu'en moyenne chaque molécule d' ADN ne port que zéro ou une modification.

);;>- Coupure

Après ces réactions, l' ADN est clivé au niveau de la modification par réaction avec une base, la pipéridine.

);;>- Analyse

Pour chaque fragment, les produits des différentes réactions sont séparés par électrophorèse et analysés pour reconstituer la séquence d' ADN recherché. Cette analyse est analogue à celle que l'on effectue pour la méthode de Sanger (Ronaghi, 2000).

11.3.3. Autres méthodes de séquençage

11.3.3.1. Séquençage automatisé de l' ADN

Actuellement, les séquençages manuels utilisant le marquage radioactif est de moins en moins utilisé: il est remplacé par le séquençage automatique .Dans ce cas, il est possible de remplacer la radioactivité par un marquage non radioactif, en général, un marqueur émettant une fluorescence (Lamoril & al., 2005).

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Dans la pratique, des marqueurs fluorescents sont attachés aux nucléotides terminateurs de chaine chacun des quatre didésoxynucléotides porte un fluorophore de spectre caractéristique. Le marqueur est incorporé dans la molécule d' ADN par l' ADN polymérase qui effectue ainsi deux opérations simultanées pour terminer la chaine et attacher le fluorophore à l'extrémité 3 'de la molécule. On peut aussi utilisée des amorces fluorescentes avec des didésoxynucléotides non marqués. En utilisant quatre colorants fluorescents différents. Il est possible d'effectuer l'électrophorèse des produits des quatre réactions de terminaison de chaine déférentes sur la même piste d'un gel de séquençage. Les bandes d' ADN sont détectées par leur fluorescente caractéristique quant elles passent devant un détecteur (Primrose et al., 2004).

11.3.3.3. Séquençage par hybridation (SPH)

Le SPH par lecture de petits blocs. L'analyse porte sur des sous séquences chevauchantes qui sont lues et réassemblées au moyen d'un programme informatique qui reconstitue la séquence étudiée. En pratique, le fragment est amplifié par PCR puis marqué à la fluorescence. Le fragment marqué est ensuit mis en contact avec la puce sur laquelle sont fixés plusieurs sondes de séquences connus. Après l'étape d'hybridation, plusieurs lavages sont réalisés pour éliminer toutes les cibles non hybridées à la puce. La lecture de la puce est ensuite réalisé par les systèmes de détection de fluorescence liés à une caméra CCD ou par microscope confocal (Amaziane et al. , 2005).

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<CHAPITRE III

APPLICATION DES MÉTHODES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE AU DIAGNOSTIQUE

BACTERIOLOGIQUE

Chapitre III Application des méthodes de biologie moléculaire au diagnostic bactériologique

Traditionnellement, la première étape consiste à obtenir une culture pure; ensuite après certains testes et observations on peut avoir de nombreuses espèces connues, jusqu'à ce qu'on en trouve une qui corresponde. Tout cela peut prendre beaucoup de temps, aussi actuellement des méthodes d'identification rapide sont mis au point pour les déterminations médicales et vétérinaires (ou un diagnostic précoce peut être crucial) et aussi pour l'industrie alimentaire, l'identification rapide est basée sur les acides nucléiques (Singleton, 1999).

Les méthodes traditionnelles sont largement employés et elles sont utiles pour illustrer les caractéristiques distinguant les bactéries l'une de l'autre, ensuite les méthodes moléculaire sont indispensable parce que ces techniques prennent une place plus importante dans la stratégie diagnostique.

III.1. Méthodes classiques d'identification des bactéries

Les études qualitatives et quantitatives, ainsi que la manipulation même des bactéries, font appel à des techniques classiques de laboratoire particulières, diversifiées et rigoureuses. Leur mise en oeuvre dépend autant de la nature des échantillons que des objectifs recherchés (Bousseboua, 2005).

III.1.1. Les düférents types de prélèvements utilisés pour le diagnostic des maladies infectieuses

Le résultat des examens bactériologiques dépend pour une grande part des conditions de prélèvement et de transport de l'échantillon. Les prélèvements doivent être effectués en principe avant l'administration d'antibiotiques. Tous les prélèvements sont évidement réalisés avec du matériels stériles. La nature du prélèvement est fonction du siège de l'infection:

• Lorsque l'on soupçonne une septicémie ou une endocardite, c'est le sang qui est prélevé (hémoculture). Après une désinfection cutanée soigneuse, le sang est recueilli , puis ensemencé dans un flacon «aérobie» et un flacon «anaérobie», afin de permettre la croissance d'un large éventail de bactérie. La densité bactérienne étant souvent faible, il faut inoculer un volume de sang d'au moins lüml par flacon chez l'adulte. Les hémocultures doivent être répétées au moins 3 fois pour augmenter les chances de succès et faciliter leur interprétation.

• Le recueil d'urines est effectué en milieu de jet, après une toilette locale.

• Les prélèvements profonds sont généralement recueillis par ponction. Les prélèvements superficiels (cutanés ou muqueux) sont le plus souvent recueillis à l'aide d'un écouvillon.

• Pour les prélèvements génitaux, il ne faut pas utiliser d'écouvillon en coton.

• Les sécrétions bronchiques peuvent être recueillies par expectoration, ce qui entraine une contamination salivaire (se traduisant par la présence de cellules épithéliales). Un prélèvement de bonne qualité est celui contenant de nombreux polynucléaire et peu de cellules épithéliales. On obtient de meilleurs résultats en ayant recours à diverses techniques plus ou moins invasives: aspiration bronchique, prélèvement distal protégé, brossage bronchique ou lavage broncho-aléatoire.

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L'acheminement au laboratoire doit être le plus rapide possible. En effet beaucoup de prélèvements sont contaminées par la flore commensale et ces prélèvements sont laissés assez longtemps à température ambiante, les bactéries se multiplient et peuvent fausser l' interprétation des résultats. Par ailleurs certaines bactéries sont fragiles. Leur exposition à l'air et la dessiccation (très rapide sur les écouvillons) peuvent les tuer. C'est pourquoi il existe des milieux de transport permettant la conservation des bactéries fragiles ou des anaérobies strictes (Nauceil, 2000).

IIl.1.2. Identification macroscopique

Toute infection bactérienne s'accompagne, outre la présence de bactéries, de signes biologiques liés à l'inflammation avec l'éventuelle présence de leucocytes, notamment de polynucléaires. Ces éléments peuvent entraîner au delà d'un seuil, une modification visuelle, clairement perceptible à l'oeil nu, qui signe une anomalie patente. Divers éléments sont alors obtenus après la croissance sur milieu nutritif comme le montrent les exemples suivants : -Le trouble du milieu liquide (urine, liquide pleural ou articulaire) (figure 05). -Hématurique : urine, LCR (liquide cephalo rachidien) (figure 06). -Coloration anormale (figure 07). -Odeur : une odeur caractéristique lors d'une infection à germes anaérobies stricts dans un liquide pleural (figure 08). -Consistance : on observe cette consistance dans le cas d'une selle diarrhéique. -L'observation des colonies differenciées sur le milieu solide (figure09).

ARTICULAIRE

Figure 05 : Le trouble

Figure 06 : Hématurique Figure 07 : Coloration anormale

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Chapitre Ill Application des méthodes de biologie moléculaire au diagnostic bactériologique

Figure 08 : L, odeur Figure09 : Les colonies

111.1.3.Identification microscopique :

L'examen microscopique a un intérêt diagnostique au delà d'un certain seuil, donc souvent, on notera aucune anomalie macroscopique, d'où la nécessité de rechercher des bactéries et des éléments cellulaires de type polynucléaire au microscope optique.

111.1.3.1.Etat frais :

Pour observer des germes à l'état frais on utilise généralement le grossissement de 400. Une préparation est obtenue avec le dépôt d'une goutte de suspension entre lame et lamelle, puis on observe au microscope d'une part, la présence éventuelle de bactéries (coque, diplocoque, chaînette, coccobacille), d'autre part le type de mobilité comme celle des rameurs ou celle en"en vole de moucheron". Par ailleurs, lors de cette observation, seront évaluées les cellules avec une appréciation semi-quantitative (rares, peu nombreuse, nombreuse, très nombreuse) ou mieux quantitative, exprimée par nombre d'éléments\mm3 ou ml ou par champ (figaft 10) (Anonyme, 2002).

Figure 10: L'observation microscopique à l'état frais

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III.1.3.2. Après coloration

On recourt souvent à la coloration pour détecter classer ou identifier les bactéries ou pour observer des composants bactériens particuliers. Dans la plupart des cas, les cellules sont tuées et fixées avant d'être colorées. Les colorants sont habituellement appliqués à un mince film de cellules étalées sur une lame de microscope. On peut examiner les cellules d'une culture pure en pratiquant comme ceci: au moyen d'une boucle d'inoculation, on dépose un peu d'eau sur une lame porte -objet propre, puis on mélange à cette eau un tout petit peu de matériel prélevé sur une colonie pour obtenir une suspension de cellules. Avec la boucle encore, on étale cette suspension sur une surface d'un ou deux centimètres carrés et on laisse sécher ce qui donne un frottis. Le frottis est ensuite fixé par deux passages rapides dans la flamme d'un Bec Bunsen, il est ainsi prêt pour la coloration et à l'examen au microscope (Singleton, 2005).

A. La coloration simple

Le frottis fin est traité par un seul colorant basique (bleu de méthylène). Cette technique est rapide, peu courante, à l'exception de l'examen de pus urétral pour la recherche de gonocoque (diplocoque en grain de café intracellulaire) (figure 11) (Anonyme, 2002).

Figure 11: L'observation microscopique après coloration simple.

B. La coloration de Gram

Un frottis fixé à la chaleur est coloré pendant une minute au violet de cristal ; il est ensuite rincé rapidement à l'eau courante, traité pendant une minute par la solution de lugol (solution aqueuse d'iode et d'iodure de potassium) et de nouveau rincé rapidement. On souvent alors le frottis coloré à une étape de décoloration en le traitant avec un solvant comme l'éthanoL l'acétone, ou l'acétone iodée. Il s'agit là de l'étape critique: la lame est maintenue inclinée et on fait couler le solvant sur le frottis pendant 1 à 3 secondes seulement, jusqu'à ce que le colorant cesse de s'échapper librement du frottis. Celui-ci est alors immédiatement rincé à l'eau courante. A ce stade, les cellules Gram- seront incolores, les cellules gram+ violettes. On soumet ensuite le frottis à une contre coloration de 30 secondes à la fuchsine basique diluée, pour coloré en roses les cellules gram négatives

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présentes. Après un bref rinçage, on sèche le frottis au buvard et on l'examine à l'objectif à immersion (figure 12).

• 8

Figure 12 :L'observation microscopique après la coloration de Gram

C. La coloration de Ziehl-Neelsen

Les bactéries «acido-résistantes » différent de toutes les autres bactéries. En ceci: une fois qu'elles ont été colorées par la fuchsine basique concentrée, chaude, ensuite les décolorer par les acides minéraux ou par des mélanges d'acide et d'éthanol. On cite parmi ces bactéries, Mycobactérium tuberculosis. Un frottis fixé à la chaleur est recouvert d'une solution concentrée de fuchsine basique ensuite la lame est chauffée jusqu'à ce que la solution se mette à fumer; elle ne devrait pas bouillir. On maintient la lame chaude pendant environ 5 minutes, on la laise refroidir puis on la rince à l'eau courante. L'étape de décoloration consiste à passer la lame dans des bains successifs d'acide-alcool (par exemple 3% VN d'acide chlorique concentré dans l'éthanol à 906/o). Après un lavage à l'eau, le frottis subit une contre coloration avec un colorant de contraste (comme le vert de malachite, puis la lame a nouveau lavée et séchée). Les cellules acidorésistantes se colorants en rouge, les autres en vert (figure 13) (Singleton, 2005).

Figure 13: L'observation microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen

fill.4. Identification biochimique

Après examen des caractéristiques microscopiques et de croissance d'une bactérie, des tests biochimiques spécifiques peuvent être effectués. Ces tests représentent la méthode la plus courante pour l'identification des bactéries. Les principaux tests biochimiques sont:

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111.1.4.1. Test au rouge de méthyle

C' est un test qualitatif de la production d' acides par des bactéries après croissance en milieu MR VP. Après l' addition de quelques gouttes de rouge de méthyle, une couleur rouge brillante indique un test positif; l'apparition d'une couleur jaune ou orange indique une réponse négatif utilisé pour séparer les bactéries entériques (Prescott et al., 2003).

111.1.4.2. La réaction de Voges-Proskauer

Les bactéries VP-positives produisent de l'acétone ou de l'acétyl méthyl carbonyl, qui donne une couleur rouge avec les réactifs. Cette réaction est utilisé pour différencier les bacilles des bactéries entériques (Prescott et al., 2003).

111.1.4.3. Hydrolyse de l'amidon

Après incubation d'une gélose à l'amidon, la boite est couverte d'une solution d' iode. Un test positif est indiqué par la zone décolorée qui entoure les colonies bactériennes. Cette réaction est utilisé pour détecter la production d'amylase par certaines bactéries (Prescott et al., 2003).

111.1.4.4. Test de catalase sur lame

A l' aide d'une tige en bois ou d'une boucle en nickel-chrome, une colonie isolée prélevée d'une gélose, est déposée dans une goutte d'eau oxygénée sur une lame en verre. L'apparition de bulles d' air indique une repense positive; un test de catalase négatif est indiqué par l' absence de bulle (Prescott et al., 2003).

111.1.4.5. La réaction du nitrate

Après 24 à 48 heures d' incubation, du nitrate est ajouté aux culture en tube, la formation de gaz indique une réaction positif de réduction du nitrate, le virage de couleur de milieu en rouge indique une réduction du nitrate en nitrite (Prescott et al., 2003).

111.1.4.6. Test de l'indole

Certaines bactéries transforment le tryptophane en indole. La présence d' indole est mise en évidence par l'addition du réactif de kovacs. L'apparition d'une couleur rouge à la surface indique un test indole positif, et la couleur jaune orange est une réponse négative (Prescott et al., 2003).

111.1.4.7. Test de l'oxydase

Ce test met en évidence l'existence du cytochrome oxydase, enzyme caractéristique d'un métabolisme respiratoire aérobie, spécifique de la réduction de l'oxygène moléculaire. Il est pratiqué usuellement à l' aide d' un disque oxydase. Le matériel bactérien est alors étalé sur le disque à l' aide d'une anse métallique. Les bactéries oxydase positive donnent une coloration violette au disque, normalement dans les 10 secondes (Bousseboua, 2005).

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111.1.4.8. Test de désamination de la phénylalanine

Lorsqu'on ajoute une solution de chlorure ferrique 10% à une gélose inclinée contenant de la phénylalanine, l'apparition d'une couleur verte foncé indique la présence de l'enzyme (test positif). L'absence de couleur verte, le test est négatif (Prescott et al., 2003).

111.1.4.9. Production d'uréase

La gélose inclinée à l'urée de Christensen. Des bactéries uréase-positives hydrolysent l'urée en ammoniaque, qui fait virer l'indicateur de pH. Le rouge de phénol, rechange vers le rouge-violet. Le contrôle négatif pas inoculé, si la couleur ne change pas, la réaction sera retardée plus de 24 heure (Prescott et al., 2003).

111.1.4.10. Réaction de fermentation

Ce test est réalisé sur milieu MEV AG dans les tubes à essai, le test est positif lorsque la production d' acide qui donne une couleur jaune et de gaz dans la cloche de Durham. S' il n'y a pas production ni d'acide ni de gaz donc il n'y' a pas de fermentation de sucre (test négatif) (Prescott et al., 2003).

111.1.5. Les tests de sensibilités aux antibiotiques

L' antibiotique est un agent antimicrobien à action spécifique qui inhibe la croissance ou détruit les bactéries. Dans la majorité des traitements, l'antibiotique est utilisé pour aider le patient, c'est-à-dire pour éviter une dissémination du foyer infectieux en attendant que les défenses de l'organisme se chargent de détruire le germe. On peut effectuer des tests pour déterminer la sensibilité d'un agent pathogène à une série d' antibiotiques le profil des sensibilités d'une souche donnée s' appelle un antibiogramme. Les résultats de tels tests peuvent permettre au clinicien de choisir le ou les antibiotiques et d' éviter les antibiotiques auquel le pathogène est résistant (Singleton, 2005).

111.1.5.1. Les méthodes par diffusion en gélose

On ensemence une suspension bactérienne sur une plaque de gélose, puis on dépose, sur la gélose ensemencée, une série de disques de papier filtre imprégnés d' A TBs (antibiotique sensibles). Enfin, on incube la boite de gélose à 37°è pendant 18 à 24 heures (en pratique, une nuit) (Darbas, 2007). L' interaction entre la bactérie et l' ATB s'exprime par une zone d'inhibition dont le diamètre est une expression indirecte de la CMI (concentration minimale inhibitrice). Grâce à des études comparatives portant sur un grand nombre de souches appartenant à des espèces bactériennes différentes, des droites de régression liant pour un antibiotique donné les CMI aux diamètres d' inhibition correspondants ont été tracées. Il existe ainsi deux diamètres critiques D et d correspondants respectivement à la concentration critique minimale et maximale: le diamètre étant calculé suivant la fonction : D=f (de CMI). Ils permettent de classer une réaction bactérienne en fonction du diamètre d' inhibition dans la catégorie sensible (S), résistance (R), ou sensible intermédiaire (I). La lecture de l'antibiogramme de la bactérie isolée d'un foyer infectieux consiste en la mesure des défférents diamètres des zones d' inhibition entourant les disques d'antibiotiques testés. Ils sont comparés aux deux diamètres critiques de l' antibiotique correspondant portés sur une table de lecture. La réponse est soit S,

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I ou R selon que ce diamètre est respectivement plus grand que D, entre les deux diamètres D et d, ou plus petit que d (Amhis et al., 2001).

111.1.5.2. Les méthodes par dilution

A. La méthode de dilution en milieu liquide

Elle consiste à préparer une série de vue à hémolyse avec le même milieu de culture liquide puis constituer une gamme de concentration de l'antibiotique à tester. Il reste un tube témoin de croissance de la souche à tester. Enfin on ajoute la même quantité de germes dans chaque tube. La galerie ainsi préparée sera incubée à 37°C pendant 18 heures. Enfin, elle sera examinée à l'oeil nu. La croissance bactérienne se traduit par un trouble du milieu de culture, alors que dans l'autres le bouillon reste clair (Darbas, 2007). Le principale inconvénient de cette méthode est la quantité de tube à manipuler, soit 1 OO tubes pour une dizaine d'antibiotiques à examiner (Anonyme, 2002 ).

B. La méthode de dilution en milieu solide

Elle consiste à incorporer l'antibiotique à une concentration donnée dans la gélose, maintenue liquide à 42C0

• Une série de boites de Pétri est préparée avec des concentrations défférentes d'antibiotique. Puis préparée des suspensions des défférentes bactéries à examiner qui sont alors distribuées dans les microcupules métalliques. Des tiges métalliques stériles plongent dans chaque cupule. Puis par un mouvement de translation sont déposées les déférentes bactéries sous le même volume (de l'ordre microlitre) à la surface du milieu gélosé solide. Après avoire ensemencer la série de boite, celle-ci sont incubées dans une étuve jusqu'au lendemain. La lecture est alors effectuée: il est facile de repérer l' emplacement de chaque souche et de noter la croissance ou l'absence de croissance. Cette méthode semiautomatique permet d' examiner des séries de 20 souches à 98 souches selon le type de plaque. Cette méthode de détermination de la CMI par une approche direct est, en fait, peu pratiquée car pour tester la sensibilité à 10 antibiotiques nécessite de préparer une certaine de boites contenant les diverses concentrations d'antibiotique (Anonyme, 2002 ).

111.1.5.3. E-test

La détermination rapide de la CMI d'un antibiotique est parfois nécessaire pour vérifier ou compléter les donnés de l'antibiotique (Fauchère et al, 1997). Elle est désormais possible grâce à l'utilisation d'une bandelette de plastique de 4cm de large sur Sem de long environ, porte sur sa face inferieur un gradient de dilution d'un ATB, tandis que, sur la face supérieure, une graduation indique les concentrations d' A TB correspondantes (Darbas, 2007). Cette bandelette est déposée sous une gélose ensemencée en inondation ou par écouvillonnage. Elle détermine dans la gélose un gradient de concentration del' ATB tel que la zone d'inhibiteur délimite une ellipse plus ou moins longue selon la CMI de l' A TB. La lecture de. La CMI se fait directement sur la bandelette au point d'intersection avec la zone d' inhibition, la simplicité de cette technique ne doit pas faire oublier les concentrations rigoureuse de réalisation indiquées par le fournisseur, en particulier l'inoculum et le temps de séchage avant de déposer la bandelette doivent être respectés. Cette technique semble bien corrélée avec la technique de référence pour de nombreux couples antibiotique/bactérie. Son seul inconvénient est son prix élevé (Fauchére et al., 1997).

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111.2. Les méthodes d'identification des bactéries par biologie moléculaire

111.2.1. Le typage bactérien

En situation communautaire comme en milieu hospitalier, la connaissance des réservoirs de germes pathogènes des vois de transmission de ses germes est importante pour la compréhension épidémique, des mécanismes impliqués dans la survenue des infections nosocomiales (infection acquises à l'hôpital) et dans la dissémination des bactéries multirésistantes, qui constituent actuellement des problèmes de santé publique majeurs. La possibilité de différencier, au sein d'une espèce bactérienne, les souches qui fond partie d'une même chaine de transmission de celles qui en sont indépendantes apporte une aide précieuse à l' interprétation des donnés des enquêtes épidémiologiques. Ainsi la répartition des souches selon des critères qui les différencient au sein d'une espèce, défini le typage dont l' objectif est de déterminer un lien de clonalité entre les souches isolées dans un contexte épidémiologique particulier. Le typage a été réalisé par l'étude de caractères phénotypiques comme la résistance aux A TB, la sensibilité aux bactériophages, l'activité vis-à-vis divers substrats ... etc. Cependant le manque de reproductibilité des résultats, leur aspect non quantitatif, le nombre souvent important de souche non typables et la complexité de certaines techniques a favorisé le développement du typage moléculaire. De nombreuses méthodes et techniques ont été proposées explorant des composants bactériens différents comme les protéines, les isoenzymes, l' ADN plasmidique ou l' ADN total. Elles reflètent la difficulté, quelque soit la méthode, de déterminer le lien de clonalité entre souche. (Serre et al., 2002).

111.2.1.1. Analyse du contenue plasmidique

Les bactéries peuvent héberger un ADN double brin, cet ADN est circulaire extra chromosomique ayant une réplication autonome dans la cellule appelé plasmide. L' étude du contenu plasmidique d'une souche bactérienne repose sur des méthodes simples et peu couteuse. Après l' extraction del' ADN plasmatique, la migration en gel d'agarose permet de déterminer le nombre et la taille du plasmide. Les profiles obtenus après digestion enzymatique et électrophorèse de l 'ADN plasmidique permettant de comparer le contenue plasmidique des souches étudiées avec une bonne précision. Cependant, l' instabilité du contenu plasmidique, les remaniements génétiques fréquentes , l' absence de plasmide dans certaines souches ou la présence du même contenu plasmidique dans des souches indépendants (n' ayant pas de lien épidémiologique donc a priori sans lien de clonalité) (Serre et al., 2002)

111.2.1.2. Analyse de gène del' ARN16S

La technique la plus couramment utilisé repose sur l'amplification puis le séquençage partiel du gène « rrs » codant l' ARNr16S, gène chromosomique d'une taille d'environ 1500 paires de bases (Wilhelm et al., 2004), présente des régions hautement conservés et communes à toutes les bactéries tandis que d'autres régions sont spécifiques d'espèces (figure 14) (Durand et Frezet, 2003). La séquence obtenue et ensuite comparée a une base de données. Les prélèvements cliniques (sang, pus, biopsies divers, liquide articulaires) doivent subir une étape d'extraction, sur colone de silice par exemples pour obtenir un ADN purifié. Le gène « rrs » codant pour l' ARNr 16S est amplifié par PCR, en utilisant deux amorces universelle complémentaire des extrémités 5' et 3' conservé. Un fragment dont la longueur varie en fonction des protocoles employés et ainsi obtenu. Ce produit d' amplification est

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Chapitre Ill Application des méthodes de biologie moléculaire au diagnostic bactériologique

ensuite séquencé, la souche bactérienne peut être enfin positionnée parmi l'ensemble des espèces connues (Wilhelm et al., 2004).

0 200 400 600 BOO 41000 41200 41400 41542

...------------------904-bp--------------~~~n:;::,-:. .. - Régions conservées

475-bp

}:=c:..a - Régions variables 284-bp . .,. Figure 14: La structure du gène del' ARN16S (Prots et Pbifippon., sans année).

III.2.1.3. Analyse de I' ADN génomique bactérien

Le polymorphisme de restriction de l' ADN total obtenu après digestion de l' ADN par des endonucléases de restriction ayant des sites de coupure fréquents et après migration éléctrophorétique à été utilisé pour comparer les souches bactériennes et évaluer leur lien de clonalité. Les fragments d' ADN séparés ont une taille de 0,5 à 50 Kb. L'analyse du polymorphisme de restriction del' ADN total après hybridation de type Southern blot avec une sonde marquée chaude ou froide a été proposée. Ainsi le nombre de bande à analyser après hybridation est réduit au fréquent contenant les séquences homologues à la sonde marquée. La localisation des fragments qui s'hybrident avec la sonde varie avec celle des sites de coupure et reflète la diversité du code génétique entre les souches étudiées. Plusieurs sondes ont été étudiées dont celles reconnaissant les séquences d' ADN codant pour l' ARN ribosomal16S et23S (ribotypage). La conservation de ces gènes dans le monde des eubactéries permet l'utilisation d'une sonde universelle. Néanmoins, la diversité des profils obtenus est variable avec l'espèce étudiée et ce marqueur peut se montrer faiblement discriminant. Le caractère discriminant d'une méthode est sa capacité à différencier les souches indépendantes (sans lien de clonalité) (Serre et al., 2002).

III.2.1.4. Analyse de polymorphisme génomique après amplification aléatoire

Parmi les techniques d'amplification décrites pour typer les souches bactériennes, la technique d'amplification aléatoire (RAPD: Random Amplified Polymorphie DNA), est la plus couramment utilisée. Elle consiste à amplifier plusieurs fragments d' ADN à l'aide d'une amorce de séquence aléatoire (une diz.aine d'oligonucléotides et un [C + G] > 40 %) s'hybridant à de basses températures (entre 37 et 45°C) à des séquences partiellement homologue et assez proches l'une de l'autre pour permettre l'amplification. Après une électrophorèse de produits amplifies, un profil est obtenu comportant des bandes en nombre variable représentant des fragments de taille variables qui sont caractéristiques de l' ADN cible. Cette technique est rapide, peu couteuse, techniquement facile à mettre en œuvre et applicable à toutes les bactéries (Serre et al., 2002).

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III .2.2. Détection de la résistance aux antibiotiques, basée sur l' ADN

Pour de nombreux pathogènes, la détermination de la sensibilité aux A TB peut se faire facilement et rapidement par les méthodes traditionnelles. Toutefois, ces méthodes n ' indiquent pas le mécanisme de résistances à l' ATB analysé, information qui peut s ' avérer nécessaire pour une antibiothérapie optimale (Singleton, 1999).

La détection d'un gène de résistance peut être associée à la souche responsable de l' infection. Il existe une très grande diversité de mécanismes et de gènes de résistance (mutations sur des gènes codant pour la cible d'un ATB ou sur les gènes régulateurs, acquisition de nouveaux gènes). Cette diversité génétique rend complexe le chois d ' amorce pour détecter tous les gènes impliqués et pour définir un test ayant des chances d ' être exhaustif. Pour ces raisons l' antibiogramme standard reste le mode de détection de la résistance le plus répondu. Le problème est posé par les mécanismes de résistance difficiles à détecter dans les conditions standards et dont les applications cliniques et épidémiologiques sont important. Les exemples types sont la détection de la résistance à la méticilline chez les Staphylocoques et certains phénotypes de résistance à la vancomycine chez les entérocoques qui peuvent passé inaperçus sur !' antibiogramme standard. Dans ces deux cas, un test additionnel de la détection, par PCR ou à l'aide d'une sonde marquée, des gènes de résistance absents dans les souches sauvages sensibles permet de classer ces souches en souches résistantes. Cette détection permet d' ajuster les traitements antibiotiques et de mettre en place des précautions d' isolement au prés des patients pour éviter leur dissémination, chez les bactéries à croissance lente comme Mycobacterium.tuberculsis. La détection de la résistance à la rifampicine, par PCR, séquençage ou détection à l'aide des sondes permet d' adapter le traitement très précocement alors que les délais de réponse sont très longs avec les techniques classiques (Serre et al., 2002).

111.2.3. Les puces à ADN

La technologie des sondes associées à celle de la PCR ont permis l' émergence d'une nouvelle méthode qui semble promise à un bel avenir: les puces à ADN. La fabrication des puces à ADN est une évolution technologique fantastique combinant différentes technologies: la micro-électronique, la biochimie, la biologie moléculaire, l' informatique et la microoptique constituent une miniaturisation de la technique du reverse dot blot visant à analyser des acides naturels ou amplifiés. La puce à ADN est constituée d'un réseau dense et régulier de microsurfaces appelées unités d'hybridation gravées sur un support plan (substance chimiquement inerte comme le polypropylène, le nylon, le verre ou le silicium) d'une dimension de 1 cm2 à 3 cm2

• Chacune de ces unités d'hybridation à une localisation déterminée et sur chacune d' elle est greffée des dizaines de milliers de sondes oligonucléotidiques dont les séquences sont quelconques ou correspondent au gène recherché. Les puces à basse densité pourraient être appliquées en bactériologie pour la détection et l'identification simultanée d'un grand nombre d'espèces bactériennes, la recherche de gènes de résistance aux antibiotiques. L'analyse des données par un ordinateur permettrait d'optimiser les conduites diagnostiques et thérapeutiques à tenir pour le malade. L ' analyse simultanée du terrain génétique du patient en particulier des éléments pouvant favoriser l'infection par certaines bactéries, peut également être envisagée. L'étude de prélèvements environnementaux permettrait aussi d'améliorer la prévention des infections nosocomiales (Kaplan et Delpech, 2007).

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<CHAPITRE I\f

DIAGNOSTIC MOLÉCULAIRE DE QUELQUES MALADIES INFECTIEUSES

Chapitre IV Diagnostic moléculaire de quelques maladies infectieuses

IV.1. Diagnostic moléculaire de la tuberculose

La tuberculose est une maladie infectieuse, provoquée, dans la plupart des cas, par un microorganisme bacille nommé Mycobacterium tuberculosis. Ce bacille pénètre habituellement dans le corps humain par inhalation dans les poumons. A partir de la localisation pulmonaire initiale, il se multiple et gagne d' autre partie du corps via le système sanguin, le système lymphatique, les vois aériennes, ou par propagation direct à d ' autre organes. Il existe deux types:

-la tuberculose pulmonaire : est la forme la plus fréquente de la maladie et concerne plus de 80% de cas.

-la tuberculose extra-pulmonaire: atteint des organes autres que le poumon, le plus souvent la plèvre, les ganglions lymphatique, la colonne vertébrale, les articulations, les vois génitourinaires, le système nerveux ou l'obtention de la tuberculose peut toucher n' import quelle partie du corps (Trébucq et al., 2000).

Dans le monde, l'infection à Mycobacterium tuberculosis consiste en un problème majeur de santé publique, un tiers de la population mondiale étant considéré comme contaminé et huit millions de nouveaux cas étant détecté chaque année. Par ailleurs, on assiste dans les pays développé à une résurgence de la maladie et à l'apparition des souches multirésistantes (Che.D ., 2005).

Pour déceler le Mycobactérium tuberculosis on utilise les méthodes classiques de diagnostic, mais actuellement, les techniques de biologie moléculaire ont supplanté les méthodes d'identification classique.

• Diagnostic moléculaire

Des méthodes d' identification par sondes nucléiques sont disponibles depuis 1987 pour identifier les Mycobactéries du complexe tuberculosis et certain atypique à partir de crachâtes. Elles utilisent des sondes complémentaires des séquences ARN ribosomial. Ces méthodes sont utilisables sur des primo-cultures en milieu liquide ou solides et donnent des résultats en quelques heures. Les sondes sont radiomarquées ou repérables en chimioluminescence. L'hybridation a lieu sur l' ARN ribosomial extrait par phénolyse. Ces méthodes combinées avec la détection radiométrique permet un diagnostique d ' espèce en quelque jours contre plus de trois semaines autrefois (Fauchére, 1997).

Pour détecter Mycobacterium tuberculosis on peut obtenir en quelques heures une multitude de séquences nucléotidiques, copies d'un seul exemplaire d'une séquence cible du bacille par une technique d'amplification génomique. On utilise ensuite des sondes spécifiques qui permettent d' identifier les différentes mycobactéries. Elle permet de détecter et d' identifier en 24 à 48 heures la présence de Mycobecterium tuberculosis dans un produit pathologique. Elle est cependant de faible sensibilité par rapport à la culture (en moyenne 80%), et sa spécificité est de 97% à 98% (Enarson, 1999).

Le mode opératoire comporte trois phases:

- Extraction de !'ARN par capture sur billes magnétiques à partir d'échantillons décontamines.

-Amplification par la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification).

-Hybridation inverse.

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Le kit contient tous les composants nécessaires et la mise en œuvre de ces étapes. Dans une étude récemment publiée par Franco-Alvarez est réalisée à partir de 134 échantillons respiratoires et extra-pulmonaires, la sensibilité de ce test était de 92 % et sa spécificité était de l 00 o/o(Ruiz et aL, 2006). Concernant la détection des bacilles tuberculeux, les auteurs ne mettaient pas en évidence de différence significative avec le système Cobas Amplicor, MTB, technique se limitant et la détection du complexe Myco/Jacterium tuberculosis. En revanche la méthode« Géno Type Mycobacteria Direct» (figure 15) à permis l'identification de trois souches du complexe Myco/Jacterium avium, de deux souches de Myco/Jacterium kansasfiet d'une souche de Mycobacterium malmoense. Ce test est rapide, facile à mettre en œuvre et donc réalisable dans un laboratoire de routine. Il correspond parfaitement et indication principale de l'amplification génique, c'est-à-dire l'identification des principales espèces de mycobactéries à partir d'échantillons positifs par un examen direct afin d'entreprendre une thérapeutique adaptée dans les meilleurs délais.

Figure 15: Amplification génique directe des Mycobactéries: « génotype Mycobactéria direct »

IV.2. Le diagnostic moléculaire de l'endocardite infectieuse

L'endocardite infectieuse (El) est une maladie relativement fréquente puisque 1300 personnes sont diagnostiqués chaque année, surtout chez des sujets agés, et dont la mortalité reste superieur à 20% (Alouf et al., 1998).

Durant les 40 dernières années, des modifications sinificatives sont survenues dans la microbiologie des El: augmentation de la fréquence d'isolement des Staphylocoques, en particulier Staphylococcus aureus responsable d'EI hétérogènes et nosocomiales; émergence de certaines espèce de streptocoques comme Streptococcus gallolyticus subsp (exemple: Streptococcus bovis biotype 1), occupant en France en 1999, la première place des microorganismes; confirmation du rôle de bactérie intracellulaire comme Coxiella bumetii, et mise en évidence de nouveaux pathogènes comme les Bartonella ssp et Tropheryma whipplei. Certaines de ces bactéries sont difficiles à mettre en évidence et ont largement bénéficié de nouvelles techniques, en particulier moléculaire, pour en faire le diagnostic. Classiquement, on distingue les El à hémoculture positives et El à hémoculture négatives. C'est dans ce dernier cadre nosologique que la biologie moléculaire a la plus contribué à l'amélioration du pris en charge des malades (Podglajen et Mainardi, 2007).

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j

1


• Le diagnostic moléculaire:

Le diagnostic moléculaire basé sur l'amplification et le séquençage de l' ADN l 6S à l' aide d' amorces universelles est réalisé essentiellement sur des prélèvements tissulaires cardiaques (parfois sur des emboles). Il permet d'améliorer la prise en charge du patient dans à peu près 20 % des cas. Si l'on ne considère que les endocardites à hémocultures négatives, les techniques de biologie moléculaire permettent de trouver l'agent étiologique dans environ un tiers des cas. Nombreuses sont les études qui montrent l'utilité de ces techniques dans la mise en évidence de pathogènes de culture difficile, Parfois très rares comme Bartonella vinsonii, Cardiobacterium valvarum et Corynebacterium striatum. Précisons également que ces techniques peuvent aider à déterminer l'identification d'une bactérie isolée d'une hémoculture lorsque les caractères phénotypiques ne sont pas suffisants (Podglajen et Mainardi, 2007).

Enfin, de rares articles rapportent l' identification de l'agent étiologique de l'endocardite par amplification universelle de l' ADN 16s directement à partir du sérum, (Gastelis et al., 2006).

La bactérie identifiée, Cardiobacterium hominis, avait toutefois été obtenue en culture après plusieurs jours d'incubation. De nos jours, pour des raisons techniques et d'interprétation, la PCR universelle est rarement réalisée sur des prélèvements de sang. En revanche, certains gènes peuvent constituer des cibles pour la détection spécifique de certaines espèces bactériennes (Millar et Moore, 2004). L'obtention d'un amplicon signe alors la présence de l'espèce recherchée. Des cibles telles que les gènes codant pour la riboflavine-synthétase, pour des protéines de membranes, pour la protéine de choc thermique, peuvent être utilisées pour révéler la présence de Bartonella spp et Chlamydia burnetii. Ces PCR spécifiques, dont la plupart ont été développées selon des techniques en temps réel peuvent être réalisées sur le sérum (éventuellement le sang) et ne nécessitent donc pas que le patient soit opéré. Toutefois, la sensibilité de détection est extrêmement variable en fonction du germe et de la cible d'amplification recherchés, de la modification de la technique de PCR utilisée et de la phase de la maladie (Raoult et al., 2003).

IV.3. Le diagnostic moléculaire de la listériose

La listériose est une maladie infectieuse provoquée par Listéria monocytogenes. Les bactéries du genre Listeria sont des petits bacilles à Gram positif, à extrémités arrondies, a sporulé, non acido-alcoolo-résistantes, mobiles à 20-25°C. Il existe 7 espèces, mais seule l'espèce Listéria.monocytogenes joue un rôle en pathologie humaine. Cette bactérie responsable par diffusion hématogène de trois types d'infections chez l'homme :

~ Listériose de l'adulte et de l'enfant

. . Méningites, i:néningo-encéphalites, encéphalites, septicémie. La grande majorité de ces mfect10ns se prodmsent chez des malades porteurs de tares viscérales (Cirrhose cancers ~te .. . . ). ~a. l~stériose de l'adulte atteint essentiellement les personnes ~gées e~ lilllllunodepnmees.

~ Listériose de la femme enceinte

Infection bénigne pour la femme, se traduisant souvent par une simple fièvre mais gr~ve pour le fœtus, pouvant provoquer un avortement, la mort in utero ou l'accouchement prematuré.

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•


Listériose néonatale

Une septicémie, une méningite secondaires à la contamination dans les jours qm précèdent l'accouchement ou au moment de l'accouchement (Pierre et Curie, 2003).

• Le diagnostic moléculaire

Les techniques modernes sondes et amplification génétique (PCR), peuvent être très précieuse dans la recherche des Listéria monocytogenes, en raison de leur spécificité, de leur sensibilité et de leur rapidité.

~ Amplification génétique(PCR)

La voie de la PCR semble prometteuse avec la découverte d'une sonde spécifique de Listéria monocytogenes, sonde correspandant au gène de la listériolysine 0 , cytotoxine de cette espèce, responsable de la survie intracellulaire. Cette sonde a été construite à partir d'un fragment de 651 paires de bases du gène. À partir de ce polynucléotide, un oligonucléotide de 18 paires de bases a été sélectionné comme amorce de la PCR.

Sondes:

De la même façon, deux sondes ADN complémentaires de séquences d' ARN ribosomal de Listéria monocytogenes ont permis la mise au point de tests immunoenzymatique conduisant à la détection de ses bactéries après enrichissement.

Dans la technique développée par le diagnostic moléculaire, le protocole est le suivant:

- Lyse de l' échantillon (aliquote du boillon d'enrichissement ou suspension d'une colonie suspecte par exemple) pour libérer l' ARN ribosomial; - Hybridation avec la sonde de détection marquée par la fluorescéine et la sonde de capture possédant une séquence poly-A; - Capture de l'hybride par un dispositif en plastique introduit dans le tube et porteur d'une séquence poly-T; - Lavage; - Le dispositif est placé ensuite dans la solution contenant l'acide antifluorescéine marqué avec une enzyme de type peroxydase (horse radich peroxidase); - Lavages; - Le dispositif est placé alors dans la solution contenant les substrats; - Une solution d'arrêt est ajoutée; - Lecture au spectrophotomètre (Joffin et Joffin, 2000).

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CONCLUSION

L'utilisation de la biologie moléculaire en bactériologie permet, tout d'abord, un gain de temps réel ce qui devrait permettre un traitement adapté plus précoce, une diminution du nombre de jours d'hospitalisation et au total une baisse significative du coût. Mais comme nous avons pu le voir, il ne faut pas utiliser les techniques de biologie moléculaire lorsque les techniques traditionnelles font mieux et à moindre coût. En effet, malgré les imperfections, les techniques usuelles possèdent un avantage décisif de simplicité de mise en œuvre et sont bien corrélées avec les données cliniques. C'est seulement en cas d'insuffisance de ces techniques que la biologie moléculaire doit être utilisée (bactéries non cultivables ou nécessitant un temps d'incubation prolongé, difficulté d'identification) ou pour différencier une souche virulente d'une souche non pathogène.

La généralisation des tests de biologie moléculaire ne se fera probablement que lorsque leur degré d'automatisation sera suffisant pour permettre une réduction des coûts financiers et/ou une économie en personnels.

L'apparition de kits et d'automates va permettre d'améliorer la standardisation et la reproductibilité des résultats: la PCR se fait dans des micros tubes (capillaire) à paroi très fine limitant l'inertie lors des changements de température. On peut tout de même observer que l'utilisation de la biologie moléculaire a amélioré le diagnostic de pathologie tel que la tuberculose. Quant à l'interprétation des résultats, il faut rester vigilant car de nombreuses études sont encore nécessaires pour définir clairement les seuils de positivité traduisant une significativité pathologique. En effet, si la présence d'un micro-organisme pathogène dans un échantillon normalement stérile signe une pathologie, l'interprétation est moins évidente dans des prélèvements présentant une flore associée a l'existence de rares bactéries détectables par la méthode d' amplification n'est pas toujours synonyme de pathogénicité.

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REf1ERENCES

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Nom et prénom : Date de soutenance: 28.09.2010 )> BOUDADI Nabila )> BOUDOUIRA Imane

1 Titre : Apport de la biologie moléculaire au diagnostic bactériologique

Résumé Les récents développements en biologie moléculaire ont conduit à leur

introduction dans le domaine de la médecine sans avertissement, Où elles ont été notamment utilisées dans le diagnostic de nombreuses infections bactériennes, telles que: l'asthme, les germes de crise cardiaque, etc ... , ces développements ont été la conséquence de résultats non concluant qui mènent aux anciennes méthodes comme la transplantation. Pour cela nous avons recours à des techniques de biologie moléculaire qui se caractérise par la vitesse et la sensibilité. Mais cela ne signifie point que l'on peut se passer des méthodes anciennes, car ce sont des méthodes fondamentales et complètes.

Mots clés: diagnostic, infections bactériennes, biologie moléculaire.

Abstract Recent developments in molecular biology have led to their spontaneous

introduction into the field of medicine, especially where they have been used in the diagnosis of many bacterial infections, such as asthma, heart attack germs, etc.... these developments are the consequences of the insufficiency of old method data such as transplantation, For this we use techniques of molecular biology which are fast and sensitive. However, we can not neglect the use of traditional methods, because these are basic and complete.

Key words: diagnosis, bacterial infections, molecular bioJogy.

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apport de la molécillaire au diagnostic

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