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Apport de la biologie moléculaire en onco-hématologie : exemple de la Leucémie Myéloïde Chronique Claire Abbal/ARL-22.03.11

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Page 1: Apport de la biologie moléculaire en onco-hématologie ... · Apport de la biologie moléculaire en onco-hématologie : ... La majorité des cellules sont « incolores » ... Croyances

Apport de la biologie moléculaire en onco-hématologie : exemple de la Leucémie Myéloïde Chronique

Claire Abbal/ARL-22.03.11

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Description 1ère patiente avec probable LMC (1827)

Alfred Velpeau (1795-1867)

Alfred Donné (1808-1878)

1844 : Description d’un cas similaire (« sang semi-purulent ») + observations microscopiques.La majorité des cellules sont « incolores » (globules blancs) et non rouges.

Historique LMC : découverte (1)

Autopsie • Hépatosplénomégalie• Aspect du Sang :

Symptômes • Fièvre• Fatigue• Abdomen gonflé

« Epais comme du gruau, davantage semblable à du pus qu’à du sang »

Claire Abbal/ARL-22.03.11

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Rudolf Virchow (1821-1902)

1845 Virchow, R. Frorieps Notizen, 36, 151-156

«Weisses Blut » Leucémie

La leucémie est une maladie autonome et progressive (=cancer ).

Historique LMC : découverte (3)

Claire Abbal/ARL-22.03.11

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Ernst Neumann (1834-1918)

• Les leucocytes sont produits dans la moelle osseuse

• Par une cellule unique capable d’auto-renouvellement

Croyances du XIXème siècle : Les globules rouges sont issus des globules blancs. Les globules blancs sont produits par les ganglions lymphatiques ou par la rate.

Historique LMC : Contexte

Claire Abbal/ARL-22.03.11

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CSH

MonocytaireMyéloïde Erythroïde

Granulocytes Monocytes Erythrocytes

DIFFERENCIATION

Thrombocytes

Mo

elle

Oss

eu

seSa

ng

Mégacaryocytaire

lymphopoïèse

Progéniteur Myéloïde Commun

… … … …

Hematopoïèse

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Paul Ehrlich(prix Nobel 1908)

Invention de la coloration cellulaire

(1879)

Frottis sanguinLMC

Myélémie

+

Granulocytose

LMC : Caractérisation cellulaire du frottis sanguin

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Image Cytogenetics Gallery: Pathology Department University of Washington

P. Nowell &D. Hungerford

LMC et Chromosomes (1)

Découverte du chromosome de Philadelphie (Phi) (1960)

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• La translocation t(9;22) génère un gène de fusion : BCR-ABL

• Le BCR-ABL code pour une protéine chimérique « fonctionnelle »

Découverte de la t(9;22) (1973)Janet D. Rowley

LMC , chromosomes et gènes

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BCR-ABL

StimulationProlifération

Inhibition Apoptose

Instabilité génomique

Phénotype Malin CANCER

Adapté de DEININGER W.N. et al.,Blood, 2000, 96, 3343

Inhibition suppresseurs

tumeur

Effets de la protéine chimérique BCR-ABL

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Le BCR-ABL exerce ses effets via son activité Tyrosine Kinase (TK)

Proliferation

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Leu

cocy

tose

Nombre élevé

Myé

lém

ie

Nombre élevéPassage dans

le sang

BCR-ABL

Physiopathologie LMC

CSH CSL

Prolifération, immortalité

Différenciation OK

DIFFERENCIATION

Sang

Cellule souche hématopoïétique

Cellule souche leucémique BCR-ABL+

PromyélocytesMyélocytes

MétamyélocytesNon

segmentés

CellulesBCR-ABL+

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Elimination des érythrocytes

(choc hypotonique)

Cell. mononucléées+ Granulocytes

Sang Périphérique

Lysat cellulaire « ARN-stabilisé »

ARN

ADNc

Extraction

Transcriptioninverse

BCR-ABL+ ???Polymerase Chain Reaction

(PCR)

Lyse préservant ARN

LMC : prise en charge du prélèvement

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e1-a2

e14-a2

e19-a2

e13-a2

P1 (e1) P2 (e3)

P2 (e3)P’1 (e12-e13)

P2 (e3)P’1 (e12-e13)

P2 (e3)P’1 (e12-e13)

Détection du BCR-ABL au diagnostic

MBCR-ABL

BCR-ABL

521 pb

957 pb

342 pb

417 pb

PCR : amplification enzymatique d’une séquence d’ADN délimitée par des amorces homologues et spécifiques

mBCR-ABL

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K562 (e14-a2) in HL-60

Rare e19-a2 « BCR-ABL »(960bp)

800

100 bp50 bp

Marqueurs de PM

150 200

1000

800

400

e14-a2(417 bp)

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TRAITEMENTS (1980-2001)

Les Phases de la LMC

Chronique Accélération Blastique

Durée 5 ans 6 mois 3 mois

• IFN- ± Ara-C : non curatif + problèmes de tolérance

• Greffe allogénique : risquée, réservée aux <55 ans.

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Et si on bloquait spécifiquement le BCR-ABL ?

ApoptosisProliferation

+ Inhibiteur de Tyr Kinase (TKI)

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Edition du 28 Mai 2001

Imatinib Mesylate (Glivec®; Novartis)

• Le Glivec normaliseLa FS des patients LMCEn quelques semaines

• Mieux toléré que IFN

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Les inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) : une thérapie ciblée.

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Suivi de la réponse au traitement

Radich JP. Blood. 2009;114:3376-3381. Dx, diagnosis; FISH, fluorescence in situ hybridization; RT-PCR, real-time polymerase chain reaction.

Ch

arge

en

cel

lule

s le

ucé

miq

ues

(lo

g10

)

Dx

~5 log reduction

1-2-log reduction

CytogeneticsFISH

RT-PCR

Mois de Traitement

Temps© 2009 by American Society of Hematology (ASH). Reproduced with permission of ASH via Copyright Clearance Center.

RQ-PCR

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La RQ-PCR mesure la quantité de BCR-ABL en nombre de copies.

PROBLEMEBCR-ABLmes. ≠ BCR-ABLréel

CAR Dégradation d’ARN (proportionnelle au temps) Efficacité des étapes d’extraction d’ARN, de RT … Imprécision de mesure (dosage ARN, RQ-PCR)Imprécision du pipetage

Suivi de la réponse au traitement

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Suivi de la réponse au traitement

BCR-ABLréel=BCR-ABLmes x F(err)

ABLréel=ABLmes x F(err)

Mesure simultanée de l’expression d’un gène « housekeeping » : ABLNormalisation du BCR-ABL par l’ABL.

SOLUTION

Comme ABL est constant (temps, individus), le s valeurs BCR-ABL peuvent être comparées: d’un point de suivi à un autre chez un même patient d’un patient à l’autre (études cliniques)

à condition que les analyses comparées aient été faites dans le même laboratoire.

(BCR-ABL/ABL)local x FClocal = BCR-ABL % IS

Standardisation Internationale

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Molecular Response (IS)

Decreasing residualleukaemia

BCR-ABL

%, I

S

Total N

um

be

r of Le

ukae

mia

Ce

lls

RQ-PCR non detectedComplete Molecular Response

100

101

0.10.01

0.001

0

1012

1011

1010

109

108

107

106

105

104

103

102

101

0

Major Molecular Response

Diagnostic

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P = .0186%

95%

62%

58%

P = .0186%

95%

62%

58%

≤ 0.1% (n = 164)

>0.1-1% (n = 47)

>1-10% (n = 25)

>10% (n = 13)

BCR-ABL % (IS)

Wit

ho

ut

Eve

nt,

%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Months Since Start of Treatment

0 12 24 36 48 60 72 84

IRIS: Achievement of MMR by 18 Months Associated With Improved EFS

Hughes TP, et al. Blood. 2008;112:129-130 [abstract 334] (oral).

* MMR defined as BCR-ABL% (IS) ≤ 0.1.

EFS, event-free survival; MMR, major molecular response.

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0.001

0.01

0.1

1

10

100

Cf co

mm

en

taire

08

.01

.20

07

29

.08

.20

07

14

.11

.20

07

05

.03

.20

08

26

.06

.20

08

15

.01

.20

09

BC

R/A

BL

%

sang

moelle

seuil de détection

Mme B, LMC, M

StopImatinib

(effets 2ndaires)

Nilotinib

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M A, LMC

0.001

0.01

0.1

1

10

100

Dia

g

MR

D2

MR

D4

MR

D6

MR

D8

MR

D1

0

MR

D12

MR

D14

MR

D1

6

MR

D1

8

BC

R/A

BL

/A

BL

%

sang

moelle

seuil de détection

valeur corrigée

Imatinib (mg/j) Dasatinib (mg/j)

400 600 800 600 800 100

11 m 9 m 10 m 6 m 2 m 15 m

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0.0001

0.001

0.01

0.1

1

10

100

03

.08

.04

13

.10

.04

11

.11

.04

05

.01

.05

30

.03

.05

23

.05

.05

23

.06

.05

24

.08

.05

03

.11

.05

18

.12

.20

08

BC

R/A

BL

%

sang

moelle

seuil de détection

Mme S, LMC MBCR-ABL,

Réfractaire au glivec, greffée en 2005

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Mise en évidence et identification d’une mutation

PCR de la portion génique codant pour le domaine KD du BCR-ABL et séquençage

Intérêt : une mutation résistante à un TKI peut être sensible à un autre TKI adaptation thérapeutique selon l’identité de la mutation

Mutations in KD domain of BCR-ABL confer resistance to TKIs

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Différents types de mutation

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Claire Abbal/ARL-22.03.11

Orientation clinique selon le type de mutation

T315I greffe cell. souche allogénéique ou nouvelle molécule en test

Q252H, V299L, F317 Nilotinib plutôt que Dasatinib

Y253H, E255K/V, F359V/C Dasatinib plutôt que Nilotinib

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Carole GERBEX Frédéric Bauer

Marzia Terzaroli-Wirz Stéphane Mathieu

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Laboratoire d’Hématologie Moléculaire BH18-632

Dr C. AbbalMme M. Terzaroli-WirzMme C. GerbexM. Frédéric BauerM. Stéphane Mathieu

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