Applicazione  in  campo  biomedico  del  modelling  di  

proteine.

Maria  Valen*ni

1  Giugno  2011

Biologia in una slide...

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DNA

Biologia in una slide...

DNA

Biologia in una slide...

DNA RNA

Biologia in una slide...

DNA RNA

Biologia in una slide...

DNA RNA PROTEINE

Proteine

Peptide Bond

Proteine

Le proteine sono polimeri di residui aminoacidici.

20 aminoacidi in natura.

La funzione biologica e’ legata alla struttura tridimensionale!

✓proteine come  biofarmaci  

✓proteine  della  famiglia  delle  citokine  per  scopi  terapeu7ci  

✓PEGhilazione    di  proteine    per  aumentarne  la  biodisponibilita’    

Proteine in biomedicina

Biofarmaci

Come  e’  il  farmaco  ideale  ?  

•Altamente specifico ed affine, buona solubilita’, stabile e sicuro (effetti collaterali minimi)

•di produzione economica, facile da formulare, di semplice assunzione e con il giusto profilo farmacocinetico.

Grazie  agli  studi  gene7ci  sappiamo  che  molte  mala?e  sono  provocate  dal  mulfunzionamento  o  dalla  assenza  di  specifiche  proteine.

Dal  punto  di  vista  farmacologico,  le  proteine  hanno  il  grande  vantaggio  di  essere  naturalmente  adaDe  ad  essere  metabolizzate  nel  corpo  umano

Biofarmaci

Biofarmaci

Biofarmaci:  sostanze  biologiche  o  loro  deriva7  molto  simili  alla  molecola  naturale,    prodoDe  aDraverso  processi  biotecnologici.  

Biofarmaci

Biofarmaci:  sostanze  biologiche  o  loro  deriva7  molto  simili  alla  molecola  naturale,    prodoDe  aDraverso  processi  biotecnologici.  

Il  primo  biofarmaco  approvato  per  uso  terapeu*co  e’  stata  l’insulina  umana  prodo>a  a>raverso  tecniche  di  DNA    ricombinante  

Biofarmaci

Biofarmaci:  sostanze  biologiche  o  loro  deriva7  molto  simili  alla  molecola  naturale,    prodoDe  aDraverso  processi  biotecnologici.  

Il  primo  biofarmaco  approvato  per  uso  terapeu*co  e’  stata  l’insulina  umana  prodo>a  a>raverso  tecniche  di  DNA    ricombinante  

L’uso  della  tecnologia  del  DNA  ricombinante  perme>e  la  preparazione  di  buone  quan*ta’  di  proteina  e  riduce  la  possibilita’  di  reazioni  avverse:  malaGa  di  Creutzfeld-­‐Jakob,  Hepa*te  B  o  HIV,  che  possono  essere  causate  da  impurita’  presen*  nelle  proteine  estra>e  in  natura.

Proteine come Biofarmaci

An7corpi  monoclonali:  OKT3,  an*corpo  monoclonale  an*rige>o,  impiegato  nei  trapian*  d’organo  e  nelle  

malaGe  autoimmuni.  Immunotossine,  an*corpi  monoclinali  u*lizza*  nelle  terapie  contro  il  cancro.  

Citokine  :  Interferone  alfa,  biofarmaco  u*lizzato  nella  cura  di  epa**  virali  e  nel  cancro.  Interferone  beta,  usato  nel  tra>amento  della  sclerosi  mul*pla  e  di  altre  malaGe  

autoimmuni.Eritropoi*na,  sostanza  che  controlla  lo  sviluppo  delle  cellule  nel  sangue,  usata  nelle  

anemie.Granulocyte  Colony  s*mula*ng  Factor,  incrementa  la  formazione  di  granuloci*  neutrofili  

(specifici  globuli  bianchi)  nel  midollo  osseo  importan*  per  le  difese  immunitarie.  Somministrato  quando,  a  seguito  di  una  chemioterapia,  il  numero  di  granuloci*  neutrofili  rischia  di  raggiungere  valori  troppo  bassi,  aumentando  il  rischio  di  infezione.

Ormoni  :Insulina  u*lizzata  nella  cura  del  diabete.GH,  è  l’ormone  della  crescita  u*lizzato  per  curare  le  forme  di  nanismo.  

Citokine

Le  citokine  sono  proteine  regolatrici  della  comunicazione  intercellulare  nel  sistema  immunitario.Sono  secrete  in  risposta  a  microbi,  an*geni  e/o  s*moli  ambientali.  Agiscono  come  modulatori,  soppressori  o  enhancer  di  risposte  specifiche  del  sistema  immunitario

Stru>ura  molto  semplice  (4-­‐alpha  helix  bundle)    ma  svolgono  mol*  ruoli  diversi  in  pathways  importan*  ....

Poly(ethylene  glycol)  (PEG)  e’  un  polimero  inorganico  idrofilo  neutro    usato  per  migliorare  le  proprieta’  farmauce*che  dei  biofarmaci.

I  farmaci  PEGhila*  presentano  mol*  vantaggi  una  migiore  stabilita’  e  solubilita’  in  acqua,  maggiore  resistenza  alla  inaGvazione  proteoli*ca  ,bassa  tossicita’,migliore  profilo  faramcocine*co,  minore  immunogeni*cita’  e  minore  clearence  renale.

PEGhilazione

Il caso del G-CSF e dell’MTgase.

Il caso del G-CSF e dell’MTgase.

BIOKER    produce  proteine    per   scopi  terapeu*ci  che  sono  so>oposte  a  PEGylazione  per  aumentarne  la  biodisponibilità  ed  emivita  nel  corpo  umano.

Il caso del G-CSF e dell’MTgase.

BIOKER    produce  proteine    per   scopi  terapeu*ci  che  sono  so>oposte  a  PEGylazione  per  aumentarne  la  biodisponibilità  ed  emivita  nel  corpo  umano.

G-­‐CSF    ha    una  emivita    corta  in  vivo,    per  superare  questo  problema  si  modifica  legandola  in  modo  covalente  ad  una  molecola  di  polyethylene  glycol  (PEG).

Il caso del G-CSF e dell’MTgase.

BIOKER    produce  proteine    per   scopi  terapeu*ci  che  sono  so>oposte  a  PEGylazione  per  aumentarne  la  biodisponibilità  ed  emivita  nel  corpo  umano.

G-­‐CSF    ha    una  emivita    corta  in  vivo,    per  superare  questo  problema  si  modifica  legandola  in  modo  covalente  ad  una  molecola  di  polyethylene  glycol  (PEG).

Il   processo   di   PEGylazione   prevede   l’uso  di   un   enzima,   la   transglutamminasi   ba>erica  MTGase,    in  modo  che  la  molecola  di  PEG  si  leghi  chimicamente  a  specifici  residui  di  glutammina  della  proteina.

Il caso del G-CSF e dell’MTgase.

BIOKER    produce  proteine    per   scopi  terapeu*ci  che  sono  so>oposte  a  PEGylazione  per  aumentarne  la  biodisponibilità  ed  emivita  nel  corpo  umano.

G-­‐CSF    ha    una  emivita    corta  in  vivo,    per  superare  questo  problema  si  modifica  legandola  in  modo  covalente  ad  una  molecola  di  polyethylene  glycol  (PEG).

Il   processo   di   PEGylazione   prevede   l’uso  di   un   enzima,   la   transglutamminasi   ba>erica  MTGase,    in  modo  che  la  molecola  di  PEG  si  leghi  chimicamente  a  specifici  residui  di  glutammina  della  proteina.

Per   la   approvazione   da   parte   degli   en*   competen*   e’   richiesta   la   riproducibilita’   e   la  predicibilita’   della   aGvita’     del   farmaco;   per   questo   e’   necessario   predire   a   priori  potenziali  si*  di  peghilazione    ed  in  modo  par*colare  essere  capaci  di  disegnare  proteine  con  un  unico  sito  di  peghilazione  .  

Metodi  computazionali

Metodi  computazionali

Predizione  di  si*  specifici  di  peghilazione  nel  G-­‐CSF:

•    metodi  computazionali  per  lo  studio  della  struDura  di  proteine

Metodi  computazionali

Predizione  di  si*  specifici  di  peghilazione  nel  G-­‐CSF:

•    metodi  computazionali  per  lo  studio  della  struDura  di  proteine  allinemen*,  patches  idrofobici,  Solvent  Accessible  Surface  

Metodi  computazionali

Predizione  di  si*  specifici  di  peghilazione  nel  G-­‐CSF:

•    metodi  computazionali  per  lo  studio  della  struDura  di  proteine  allinemen*,  patches  idrofobici,  Solvent  Accessible  Surface  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  della  dinamica:

Metodi  computazionali

Predizione  di  si*  specifici  di  peghilazione  nel  G-­‐CSF:

•    metodi  computazionali  per  lo  studio  della  struDura  di  proteine  allinemen*,  patches  idrofobici,  Solvent  Accessible  Surface  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  della  dinamica:  Dinamica  Molecolare,  Normal  Modes  Analysis  

Metodi  computazionali

Predizione  di  si*  specifici  di  peghilazione  nel  G-­‐CSF:

•    metodi  computazionali  per  lo  studio  della  struDura  di  proteine  allinemen*,  patches  idrofobici,  Solvent  Accessible  Surface  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  della  dinamica:  Dinamica  Molecolare,  Normal  Modes  Analysis  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  delle  interazioni  con  altre  proteine:

Metodi  computazionali

Predizione  di  si*  specifici  di  peghilazione  nel  G-­‐CSF:

•    metodi  computazionali  per  lo  studio  della  struDura  di  proteine  allinemen*,  patches  idrofobici,  Solvent  Accessible  Surface  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  della  dinamica:  Dinamica  Molecolare,  Normal  Modes  Analysis  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  delle  interazioni  con  altre  proteine:  Docking  Proteina-­‐Proteina

Metodi  computazionali

Predizione  di  si*  specifici  di  peghilazione  nel  G-­‐CSF:

•    metodi  computazionali  per  lo  studio  della  struDura  di  proteine  allinemen*,  patches  idrofobici,  Solvent  Accessible  Surface  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  della  dinamica:  Dinamica  Molecolare,  Normal  Modes  Analysis  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  delle  interazioni  con  altre  proteine:  Docking  Proteina-­‐Proteina

Metodi  computazionali

Predizione  di  si*  specifici  di  peghilazione  nel  G-­‐CSF:

Confronto  con  da*  sperimentali  

•    metodi  computazionali  per  lo  studio  della  struDura  di  proteine  allinemen*,  patches  idrofobici,  Solvent  Accessible  Surface  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  della  dinamica:  Dinamica  Molecolare,  Normal  Modes  Analysis  

•  metodi  computazionali  per  lo  studio  delle  interazioni  con  altre  proteine:  Docking  Proteina-­‐Proteina

Metodi  computazionali

Predizione  di  si*  specifici  di  peghilazione  nel  G-­‐CSF:

Confronto  con  da*  sperimentali  

 “Site-­‐directed  enzyma*c  PEGyla*on  of  the  human  granulocyte  colony-­‐s*mula*ng  factor.”C.  Maullu,  D.  Raimondo,  F.  Caboi,  A.  GiorgeG,  M.  Sergi,  M.  Valen*ni,  G.  Tonon  and  A.  TramontanoFEBS  J.  276,  6741–6750  (2009)  

Scale e tempi della modellazione

Molecular Dynamics (atoms)

Macro-homogeneous Fluid-Dynamics

(volume of fluids )

Coarse-grained Modelling

(blobs)

Time

Distance

Quantum Mechanics (electrons) femtoseconds

picoseconds

nanoseconds

microseconds

seconds

minutes

hours

1A 1nm 1µm 1mm meters

Normal mode

analysis

G-CSF struttura secondaria

G-CSF: sequenza e struttura secondaria

17  Glutammine  (Q)

G-CSF: sequenza e struttura secondaria

17  Glutammine  (Q)

8  buried  SAS  <  25%

G-CSF: sequenza e struttura secondaria

17  Glutammine  (Q)

8  buried  SAS  <  25%

5  not  in  alpha  helix  

G-CSF: sequenza e struttura secondaria

17  Glutammine  (Q)

8  buried  SAS  <  25%

5  not  in  alpha  helix  

G-CSF: sequenza e struttura secondaria

17  Glutammine  (Q)

8  buried  SAS  <  25%

5  not  in  alpha  helix  

G-CSF: sequenza e struttura secondaria

17  Glutammine  (Q)

8  buried  SAS  <  25%

5  not  in  alpha  helix  

G-CSF: sequenza e struttura secondaria

17  Glutammine  (Q)

8  buried  SAS  <  25%

5  not  in  alpha  helix  

G-CSF: sequenza e struttura secondaria

17  Glutammine  (Q)

8  buried  SAS  <  25%

5  not  in  alpha  helix  

G-CSF: sequenza e struttura secondaria

G-CSF: struttura 3D

Protein Data Bank (PDB): struttura 2D9Q (X-ray)

Dinamica Molecolare setup

Analyze data and print results

Set particle positions

Assign particle velocities

Calculate force on each particle

Move particles by time step

Reached preset nos. of time step?

Save current positions and velocities

no

yes Il tempo totale di simulazione si divide in time -steps.

Vengono aggiunta acqua e ioni per simulare le condizioni all’interno del corpo umano.

G-CSF DInamica Molecolare (MD)

G-CSF: risultati MD

MTgase

Struttura X-rays (PDB code 1IU4).

ha una struttura a disco con una tasca

contenente la triade catalitica (CYS64,

HIS274, ASP255).

G-CSF + MTgase

Transglutamination site (GLN134)

Active site (CYS64,ASP255,HIS274)

Protein-Protein Docking

1  Search  Algorithms:    esplora  tu>o  lo  spazio  delle  configurazioni  delle  due  proteine,  generando  mol*ssime  configurazioni  (decoys).

2  Scoring  Func7on:    per  classificare  ognuna  delle  stru>ure  (decoys)  generate.  E’  basata  su  principi  primi  ma  con*ene  anche  termini  empirici.  

E’  un  problema  computazionalmente  molto  pesante!  Per  assicurare  un  buon  sampling  di  tu>o  lo  spazio  delle  mutue  posizioni  bisonga  generare  un  grande  numero  di  stru>ure  (100K).  

Risultati docking

Il  decoy  con  score  minimo  non  è  come  ci  aspeDavamo!!!Cosa  ci  dice  questo  risultato?  

Con  il  sopware  Rose>aDock,  in  parallelo  sul  cluster  di  calcolo  ad  alta  prestazioni  del  CRS4,  sono  stait  genera*  100K  decoys  per  ognuno  dei  quali  le  posizioni  delle  due  proteine  sono  scelte  in  maniera  random.

Protein-Protein Docking

L’  interpretazione  dei  risulta*  del  Docking  e’  un  problema  sta*s*co:  bisogna  tenere  in  considerazione  sia  il  miglior  score  che  la  distribuzione  spaziale  dei  decoys  con  miglior  scores.  

Più  spesso  una  conformazione  viene  trovata  più  probabile  è  in  realta!

Cluster  analysis  dei  200  decoys  con  score  migliore  (RMSD  cut-­‐off=2.5Ǻ)

Protein-Protein Docking

L’  interpretazione  dei  risulta*  del  Docking  e’  un  problema  sta*s*co:  bisogna  tenere  in  considerazione  sia  il  miglior  score  che  la  distribuzione  spaziale  dei  decoys  con  miglior  scores.  

Più  spesso  una  conformazione  viene  trovata  più  probabile  è  in  realta!

Cluster  analysis  dei  200  decoys  con  score  migliore  (RMSD  cut-­‐off=2.5Ǻ)

Protein-Protein Docking

L’  interpretazione  dei  risulta*  del  Docking  e’  un  problema  sta*s*co:  bisogna  tenere  in  considerazione  sia  il  miglior  score  che  la  distribuzione  spaziale  dei  decoys  con  miglior  scores.  

Più  spesso  una  conformazione  viene  trovata  più  probabile  è  in  realta!

Non  è  presente  alcun  cluster  significa*vo  per  numerosità!

Cluster  analysis  dei  200  decoys  con  score  migliore  (RMSD  cut-­‐off=2.5Ǻ)

Calcolo  dei  normal  modes  del  MTgase  tramite  sopware  Betagm  (gaussian  network  model,  MicheleG  et  al.,Proteins  2004)  

MTgase: Normal Modes Analysis

La  stru>ura  cristallografica  del  MTgase  presenta  una  conformazione  piu>osto  chiusa  della  tasca  contenente  il  sito  catali*co.  

Normal  Mode  Analysis  (NMA)  evidenzia  i  mo*  oscillatori  della  proteina  su  scale  di  tempo  molto  lunghe.

Calcolo  dei  normal  modes  del  MTgase  tramite  sopware  Betagm  (gaussian  network  model,  MicheleG  et  al.,Proteins  2004)  

MTgase: Normal Modes Analysis

La  stru>ura  cristallografica  del  MTgase  presenta  una  conformazione  piu>osto  chiusa  della  tasca  contenente  il  sito  catali*co.  

Normal  Mode  Analysis  (NMA)  evidenzia  i  mo*  oscillatori  della  proteina  su  scale  di  tempo  molto  lunghe.

E’  stata  scelta  una  configurazione  con  la  tasca  del  sito  catali*co  piu’  aperta:  “MTGase  open”

MTgase: “struttura aperta”

MTgase open :risultati docking

Nel  caso  di  docking  “open”  è  stato  generato  un  cluster  di  158  configurazioni  che  mostrano  una  interazione  specifica  dell’MTgase  con  la  GLN134,  indicando  che  tale  glutammina  è  un  sito  di  transglutamminazione  del  G-­‐CSF.

Esperimenti Mutagenesi

E’  stato  studiato    computazionalmente  anche  il  Mut4,  dimostrando  che  la  P132  rende  rigida  la  Q131!    

Inoltre...

Nell’ambito  della  collaborazione  con  BIOKER  sono  state  studiate  anche  altre  2  proteine  delle  citokine  :IFNb  ed  IFNa  

scopo  dello  studio  era  migliorarne  la  solubilita’    per  evitare  aggregazioni  che  rendono  difficile  il  delivery  di  queste  proteine.

Abbiamo  studiato  la  dinamica  dei    patches  idrofobici,  suggerendo  possibili  mutazioni  per  o>enere  patches  idrofobici  piu’  piccoli  e  sparsi  sulla  superficie  proteica,    salvaguardando  la  funzionalita’  della  proteina.  

Conclusioni

Conclusioni

Studi  computazionali  fanno  parte  della  pipeline  di  sviluppo  di  biofarmaci.

Conclusioni

Studi  computazionali  fanno  parte  della  pipeline  di  sviluppo  di  biofarmaci.

Proteine  sono  en*ta’dinamiche,  nel  loro  studio  non  si  puo’  prescindere  dalla  capacita’  di  riconformazione

Conclusioni

Studi  computazionali  fanno  parte  della  pipeline  di  sviluppo  di  biofarmaci.

Proteine  sono  en*ta’dinamiche,  nel  loro  studio  non  si  puo’  prescindere  dalla  capacita’  di  riconformazione

I  tempi  di  studio  delle  dinamiche  di  proteine  sono  oramai  brevi  e  quindi  perfe>amente  integrabili  nella  fase  di  proge>azione  e  studio  di  farmaci.

Conclusioni

Studi  computazionali  fanno  parte  della  pipeline  di  sviluppo  di  biofarmaci.

Proteine  sono  en*ta’dinamiche,  nel  loro  studio  non  si  puo’  prescindere  dalla  capacita’  di  riconformazione

I  tempi  di  studio  delle  dinamiche  di  proteine  sono  oramai  brevi  e  quindi  perfe>amente  integrabili  nella  fase  di  proge>azione  e  studio  di  farmaci.

Il  dialogo  tra  sperimentali  e  computazionali  perme>e  risparmio  di  tempo  e  denaro  ed  una  comprensione  piu’  approfondita  del  problema.  

Ringraziamenti

Bioker  SRL  :Carlo  Maullu,  Francesca  Caboi,  Sergio  Mauri,  Rodolfo  Schrepfer,  Giancarlo  Tonon.

CRS4  :  gruppo  di  bioinforma*ca  ,  gruppo  AGCT              Ilenia,  Ma>eo

 sistemis*  ed  High  Performance  Compu*ng  group.  

CNR  -­‐IRGB  (ex  INN)  :    con  cui  lavoro  ora  per  l’analisi  di  da*  genomici    (spero  che  prima  o  poi  troviamo  un  target  di  interesse  per  il  modelling  !)