annee universitaire 2020 2021 session 1 d’automne …

Votre numéro d’anonymat :

ANNEE UNIVERSITAIRE 2020 / 2021 SESSION 1 D’AUTOMNE

CORRIGÉ PARCOURS/ETAPE : M1 Biologie, Agrosciences / Projets et Méthodologies en Biologie CodeUE : 4TBA706U Epreuve : Examen final - Projets et Méthodologies en Biologie - Biostatistique Date : 18 janvier 2021 Heure : 11 :00 Durée : 1 h Calculatrice et documents non autorisés Epreuve de M. DESLOUS & Mme CABASSON Nombre de pages : 8

UF Biologie

Clarté, précision, concision, syntaxe et orthographe des réponses sont des critères pris en compte pour l’évaluation de vos connaissances. Répondre sur l’énoncé du sujet et indiquer votre numéro d’anonymat.

TOUTES les questions concernent les informations de l’article de L. WAN et al. TIR domains of plant immune receptors are NAD+-cleaving enzymes that promote cell death (Plant Science 2019). http://science.sciencemag.org/ on August 22, 2019 EXERCICE 1 : Statistique descriptive : décrire les variables (Temps estimé : 10 minutes ; 8 points) A partir des légendes des figures 1 et 2, compléter le tableau ci-dessous pour : 1) Etablir la liste des variables considérées dans cette étude (1ere colonne) 2) En précisant leur type de façon détaillée (nombre et valeur des modalités, des valeurs de la variable, 2ème colonne) ; 2) Préciser si ces variables sont des facteurs (OUI/ NON, 3ème colonne) ; 3) Donnez le nom du type de graphe réalisé sur la figures 1 et sa particularité par rapport à ce que vous avez l’habitude de réaliser (dessous le tableau).

N° identité étudiant :

2/10

Nom de la variable Type de la variable Modalités Facteur

Teneur en NAD+ (µM) Mutants catalytiques supposés d’E. coli/gènes Temps en min. Teneur en v-cADPR normalisée, métabolite variant de l’Adenosine Diphosphate Ribose cyclique (métabolite)

Espèce végétale Plant TIRs/génotypes

Quantitative continue Qualitative nominale Qualitative ordinale Quantitative continue Variable qualitative nominale Variable qualitative nominale

Nombre infini de valeurs dans l’intervalle [0,1] µM 4 génotypes RBA1 WT, RBA1 E86A, Bd TIR WT, Bd TIR E 127A 2 modalités : 0 et 60 min. Nombre infini de valeurs dans l’intervalle [0,2000] area/mg 2 modalités : A. thaliana et N benthamiana 7 modalités : untreated, empty vector (EV), HOP BA1 WT, HOPBA1 H56F, N.b. WT, N.b eds 1-2. N. b. nrg 1-1

NON OUI OUI NON OUI OUI

3 ) Type de graphe (Figure1) : Nuage de points (2 variables croisés). Des barres d’erreur ont été ajoutées à partir des points moyens. …………………………………………………………………………………………………………….


3/10

Figure 1 : Plant TIR proteins can degrade NAD+ and NADP+. In vitro transcription-translation–generated TIR-only proteins lowered NAD+ levels relative to putative catalytic mutants. Error bars represent SEM. Asterisks indicate statistical significance calculated separately for each gene [one-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey’s test:*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001].

Figure 2 : To validate that plant TIRs are indeed NADases in planta, we measured TIR-dependent accumulation of v-cADPR in planta (biomarker). TIRs produce v-cADPR in planta. A) v-cADPR accumulates in Arabidopsis (Ag-0) 24 hours after inoculation with Pseudomonas fluoruscent BA1). HopBA1H56F is encoded by a loss-of-function mutant [with histidine (H) at residue 56 changed to phenylalanine (F)] (14). (B and C) v-cADPR accumulates upon RBA1 and BdTIR expression in N. benthamiana and eds1-2 and nrg1-1 mutants. Cell death triggered by non-TIR immune function did not induce v-cADPR accumulation. Error bars represent SEM. Asterisks indicate statistical significance [one-way ANOVA with Tukey’s test for (B) and Kruskal-Wallis with Dunn’s test for (C)*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001].

A B C


4/10

EXERCICE 2 : Statistique décisionnelle (Temps estimé : 20 minutes ; 8 points) 1) A partir des informations du « Matériel et méthode » de l’article, faire un schéma présentant le plan d’expérience mis en œuvre pour les essais de métabolites NADase sur Arabidopis thaliana (ce n’est pas le protocole qui est demandé), En déduire l’individu statistique et l’effectif de l’échantillon (n).

Effectif de l’échantillon n= 12 (d’après la figure 1) Individu statistique : un extrait de feuille d’A. thaliana « Arabidopsis thaliana Ag-0 and Col-0 plants… For NADase metabolite assays, leave samples were collected at 24h post infiltration. Six leaf disks (8mm in diameter) from 6 leaves from 6 different plants were pooled ..» 6 plantes 6 feuilles (1 par plante) 36 disques foliaire (6 disques par feuille) 1 extrait pour le dosage de NADase

2) La description du plan d’expérience dans le matériel et méthode vous paraît-elle complète ? Si vous choisissez la réponse négative, quels éléments auriez-vous rajoutés ?

NON, pour trouver l’effectif, il faut consulter la figure 1 L’échantillon est équilibré (3 extraits par génotype) Echantillonnage non apparié (extraits indépendants)

3) A partir des légendes des figures 1/2 et de la partie « Statistique » du Matériel et Méthodes : a) Dans l’encart ci-dessous, établir la liste de tous les outils de statistique décisionnelle présentés dans cet article en indiquant pour chacun les raisons qui justifient ce choix ; b) Pour l’outil présenté dans la figure 2A, précisez les hypothèses de travail, le résultat statistique obtenu et la conclusion que les auteurs ont pu tirer ; c) Pour la figure 2A, les auteurs n’ont pas indiqué le test statistique utilisé. Quelle suggestion pouvez-vous faire pour le test statistique mis en œuvre ? d) Quelle(s) commande(s) de R utiliseriez-vous pour réaliser le test statistique défini en c) ?

Figure 1 Analyse de variance à 1 facteur : Comparaison de k groupes (k>2) déterminés par un facteur Facteur = génes avec 4 modalités (k=4) Variable = teneur en NAD+ Test de Tukey : Comparaison multiple de moyennes Test post hoc l’ANOVA qui montre une différence significative entre au moins 2 groupes. Comparaison des teneurs de NAD+ deux à deux entre les 4 génotypes L’ANOVA étant un test statistique paramétrique, les conditions d’application ont dû être vérifées (étude de contraste sur les résidus) Figure 2 A et B Facteur = génotype avec 4 modalités par plante (k=4) Variable = teneur en v-cADPR normalisée Idem ci-dessus Figure 2C

Test de Kruskal-Wallis : Comparaison de plus de 2 distributions de rangs, test non paramétrique car les conditions d’application d’un test paramétrique n’ont pas dû être vérifiées Test de Dunn Comparaison de la moyenne des rangs par rapport à une référence (témoin)


5/10

Génotype de référence = Bd TIR WT

4) Précisez la signification des expressions suivantes (vocabulaire statistique attendu, ce n’est pas une traduction qui est attendue) :

Expression Signification/Implication

« Error bars generally represent SEM » Les barres sur la figure décrivent la dispersion des données qui est l’erreur standard de la moyenne (SEM) qui dépend de l’écart-type s (SEM = s / racine carrée de n)

« one-way analysis » C’est une analyse statistique qui permet de prendre une décision sur l’effet d’un facteur. Par exemple analyse de variance à un facteur.

« *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 » C’est le seuil de significativité pris en compte qui correspond au risque de première espèce ou alpha. Si la valeur de la p-value (P) est inférieure à ce seuil, l’hypothèse H0 est rejetée.

EXERCICE 3 : Statistique inférentielle (Temps estimé : 15 minutes ; 4 points ; Attention toutes les questions sont inter-dépendantes) Parmi les figures présentées, l’une d’elles fait référence à un outil utilisé en analyse statistique inférentielle. 1) Quelle est cette figure (indiquez le chiffre ET la lettre) ? Figure 2C (ou figure 1) 2) Quel est le nom complet et précis de cet outil ? Analyse de variance = ANOVA (ANalysis Of VAriance) 3) A quelle est la problématique biologique cet outil d’inférence est-il dédié ici ? A accepter ou rejeter H0 : les 4 génotypes ont la même teneur moyenne en v-cADPR normalisée. 4) Quelles sont les conditions d’application de cet outil que les auteurs ont dû vérifier ? Une étude des contrastes permettra de vérifier si les résidus sont indépendants, ont une distribution normale, s’il y a homoscédasticité entre les groupes et s’il n’y a pas de points aberrants. 5) Proposer un seul outil statistique pour vérifier chacune des conditions d’application. shapiro.test() pour valider la normalité des résidues ou une droite de Henry (diagramme des quantiles) bartlett.test() pour vérifier l’homoscédasticité c’est-à-dire l’homogénéité des variances entre les 4 groupes. Un boxplot pour vérifier s’il n’y a pas de points aberrants Un nuage de points des résidus pour vérifier l’indépendance (absence de corrélation)


6/10

EXERCICE 4 : Maîtrise du logiciel R (Points bonus : 2 points) Expliquer le sens des messages renvoyés par le logiciel R et proposer une solution (la plus précise possible). 1) Message 1 >str(data) data$facteur1 = chr >boxplot(data$X~data$facteur1) Error in ~data$facteur1: is not a factor Problème :Le facteur 1 est reconnu comme un caractère (variable discrète) mais pas comme un facteur. Solution : Avec la nouvelle version de R, ajouter un argument lors du chargement du jeu de

données : stringsAsFactors afin de reconnaître les caractères (variables qualitative) comme des

facteurs)

>data <- read.csv(file = "data.csv", …, stringsAsFactors = TRUE)

lors de la commande boxplot() data$factor1 sera reconnu comme un facteur 2) Message 2 Error in describe(data) : could not find function "describe" Problème : la commande describe() n’est pas reconnue Solution : il faut installer puis charger le package (prettyR) qui comprend cette commande >library(prettyR) 3) Message 3 >pie(data$variable1) >Error in pie : ‘x’ value must be positive Problème : la commande ne permet pas de tracer le diagramme circulaire Solution : Cette commande nécessite d’établir au préalable le tableau des effectifs >pie(table(data$variable1)) 4) Message 4 >mean(data$variable1) >NA Problème : la commande ne renvoie pas le calcul de ma moyenne. Il y a probablement au moins une donnée manquante (ou les données ne sont pas numérique). Solution : vérifier la présence de NA et ajouter l’argument pour les retirer (ou recherger correctement le jeu de données avec le bon symbole de la décimale ; ou ,)

>table(data$variable1,useNA=’always’)

Modifier la commande si présence de NA

>mean(data$variable1, na.omit=TRUE)


7/10

Abréviations : NaAD : Nicotinic acid Adenine Dinucleotide (related molecule to NAD+) NAD+ : forme oxydée de la Nicotinamide Adenine Dinucleotide NADP+ : forme oxydée de la Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate TIR : Enzymes capables de dégrader NAD+ (domaines Toll/récepteur d'interleukine-1 (TIR) des NLRs) NLR : Récepteurs immunitaires à répétition riches en leucine (NLR) se liant aux nucléotides des plantes v-cADPR= variant de l’Adenosine Diphosphate Ribose cyclique (métabolite) EV = vecteur vide (empty vector) HopBA1 = effecteur de type III délivré par Pseudomonas fluorescens, il active la mort cellulaire dépendante de la RBA1 chez Arabidopsis. HopBA1 induit une accumulation de v-cAPDR chez Arabidopsis, tandis que les bactéries contiennent un allèle de perte de fonction, HopBA1H56F. BdTIR = Protéine exclusivement TIR de fonction inconnue provenant de la monocotylédone Brachypodium distachyon. SEM = Erreur standard de la moyenne (SEM = écart-type / racine carrée de n) Abstract Plant nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) immune receptors activate cell death and confer disease resistance by unknown mechanisms. We demonstrate that plant Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domains of NLRs are enzymes capable of degrading nicotinamide adenine dinucleotide in its oxidized form (NAD+). Both cell death induction and NAD+ cleavage activity of plant TIR domains require known self-association interfaces and a putative catalytic glutamic acid that is conserved in both bacterial TIR NAD+-cleaving enzymes (NADases) and the mammalian SARM1 (sterile alpha and TIR motif containing 1) NADase. We identify a variant of cyclic adenosine diphosphate ribose as a biomarker of TIR enzymatic activity. TIR enzymatic activity is induced by pathogen recognition and functions upstream of the genes enhanced disease susceptibility 1 (EDS1) and N requirement gene 1 (NRG1), which encode regulators required for TIR immune function. Thus, plant TIR-NLR receptors require NADase function to transduce recognition of pathogens into a cell death response. ***Plant materials, growth conditions, extract preparation for metabolite identification Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum were grown in walk-in growth rooms maintained at 24 °C/20 °C with a 16-h/8-h (day/night) cycle. In Agrobacterium-mediated transient expressions, relevant strains were grown overnight, and the cell pellet was resuspended in induction buffer containing 10 mM MES (pH 5.6), 10 mM MgCl2, and 150 μM acetosyringone. Agrobacteria (GV3101 pMP90) were hand-injected with 1mL needleless syringes at OD600nm of 0.8 (Injections into N. benthamiana included 0.1 OD600nm of GV3101 carrying 35S:P19, a viral suppressor of gene silencing) into 5- to 6-week-old N. benthamiana or N. tabacum leaves. Images of cell-death phenotypes were taken 2-5 days post inoculation. For western blots to check protein expression of TIR domains, leaf samples of SARM1, RBA1 and MLA10 CC were collected at 26h post infiltration, while leave samples of BdTIR, SAM-RPS4 and RPP1 were collected 40h post infiltration. For NADase metabolite assays, leaf samples were collected at 26h post infiltration or 40h post infiltration, as above. Nine leaf disks (8 mm in diameter) from at least 4 leaves from 4 different plants were pooled and weighed, and then homogenized into powder and dissolved in 450 μL 50% (v/v) methanol and stored at -80 °C. 150 μL of supernatant after centrifugation was analyzed by mass spectrometry. Arabidopsis thaliana Ag-0 and Col-0 plants were grown in walk-in rooms maintained at 21° C/18° C with a 9-h/15-h (day/night) cycle. In Pseudomonas fluorescens (Pf0-1) or Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (DC3000) mediated effector-delivery assays, Pf0-1 or DC3000 strains were grown overnight, washed once with 10 mM MgCl2 and then diluted in 10 mM MgCl2 to an OD600nm of 0.2 (Pf0-1) and an OD600nm of 0.1 (DC3000). These cultures were hand-injected with needleless syringes into 4- to 6-week old Arabidopsis rosette leaves around 10 AM. The cell death phenotypes were recorded 24h and 30h post inoculation. For western blots to check protein levels, leaf samples were collected 24h post inoculation. For NADase metabolite assays, leaf samples were collected at 24h post infiltration. For NADase metabolite assays, leave samples were collected at 24h post infiltration. Six leaf disks (8mm in diameter) from 6 leaves from 6 different plants were pooled and weighed, and then homogenized into powder and dissolved in 300 μL 50% (v/v) methanol and stored at -80 °C. 150 μL of supernatant after centrifugation was analyzed by mass spectrometry.


8/10

Endogenous NAD+ measurements in E. coli. Recombinant plasmids in either pET24a+ (RPP1) or pET30a+ (others) were transformed into Shuffle T7 Express Competent E. coli (New England BioLabs). Single colonies were grown overnight and the next day, cultures were diluted in LB media, grown at 30°C until they reached an absorbance (A600) of approximately 0.4-0.8. 0.1 mM IPTG final concentration was added to induce protein expression. Cultures were harvested approximately 2 hours later, and then normalized to A600 of approximately 0.5 ± 0.05. 500 μl of culture suspension was then aliquoted, and centrifuged. The supernatant was decanted, the pellet washed with PBS, and centrifuged again. Metabolites from the bacterial pellet were extracted by adding 200 μL 0.5M Perchloric acid (HClO4). Samples were then placed on ice for at least 10 minutes, spun down, and supernatant collected. 180 μL of supernatant was then added to approximately 67 μL of 3M Potassium Carbonate (K2CO3). Samples were placed on ice for at least 10 minutes, and centrifuged. NAD+ metabolites were then measured by HPLC. Plasmids Bacterial expression plasmids were cloned in pET24a+ (RPP1) or pET30a+ (others). Recombinant plasmids include, SARM1 – StrepTag-SARM1-TIR-HisTag (TIR: 561-724); RBA1 – StrepTag-RBA1-HisTag (TIR: 1-191); Bd – StrepTag-Bd-HisTag (TIR: 1-224); RPS4 – StrepTag-RPS4-HisTag (TIR: 1-200); RPP1 – HisTag-RPP1-StrepTag (TIR: 1-254). Plant expression constructs were generated using Gateway-compatible vector systems. Entry clone were generated by BP clonase in pDONR207 or synthesized in pUC57-Kan (Genescript). Site-directed mutants were generated by PCR mutagenesis. Cloning primers are available upon request. Plant expression vectors are from the pGWB600 series. Plant expression clones for BdTIR (NCBI accession XM_003560026) and HsSARM1 SAM-TIR were codon-optimized for Arabidopsis and synthesized by GenScript. The N-terminal HA-SAM vector was constructed by cloning the SAM domain from HsSARM1 (1xHA tag-SARM1478-578-GGGGS) into the XbaI site of pGWB602. The RPS4Ws 1-250 entry clone was a gift from Kee Hoon Sohn. The RPP1NdA 1-254 entry clone was a gift from Brian Staskawicz. The MLA10 CC domain (endpoints: 1-160) entry clone was a gift from Farid El-Kasmi. RBA1 is from Arabidopsis accession Ag-0 (14). **Statistics Figure legends indicate type of statistical test used. Error bars generally represent SEM. For some points where error bars would be shorter than the height of the symbol, Graph Pad Prism software indicates error bars were not drawn.


9/10

Traduit avec www.DeepL.com/Translator (version gratuite) Résumé Les récepteurs immunitaires NLR (Plant nucleotide-binding leucine-rich repeat) activent la mort cellulaire et confèrent une résistance à la maladie par des mécanismes inconnus. Nous démontrons que les domaines Toll/récepteur d'interleukine-1 (TIR) des NLR des plantes sont des enzymes capables de dégrader le nicotinamide-adénine-dinucléotide sous sa forme oxydée (NAD+). L'induction de la mort cellulaire et l'activité de clivage du NAD+ des domaines TIR des plantes nécessitent des interfaces d'auto-association connues et un prétendu acide glutamique catalytique qui est conservé dans les enzymes de clivage du NAD+ des TIR des bactéries (NADases) et dans la NADase SARM1 des mammifères (motif stérile alpha et TIR contenant 1). Nous identifions une variante de l'adénosine diphosphate ribose cyclique comme biomarqueur de l'activité enzymatique TIR. L'activité enzymatique TIR est induite par la reconnaissance des pathogènes et fonctionne en amont des gènes de susceptibilité à la maladie 1 (EDS1) et du gène de besoin en N 1 (NRG1), qui codent les régulateurs nécessaires à la fonction immunitaire TIR. Ainsi, les récepteurs TIR-NLR des plantes requièrent la fonction NADase pour transduire la reconnaissance des pathogènes en une réponse de mort cellulaire. ***Matériaux végétaux, conditions de croissance, préparation des extraits pour l'identification des métabolites Nicotiana benthamiana et Nicotiana tabacum ont été cultivés dans des chambres de culture maintenues à 24 °C/20 °C avec un cycle de 16 h/8 h (jour/nuit). Dans les expressions transitoires médiées par Agrobacterium, les souches pertinentes ont été cultivées pendant la nuit, et le culot cellulaire a été remis en suspension dans un tampon d'induction contenant 10 mM MES (pH 5,6), 10 mM MgCl2, et 150 μM acétosyringone. Des Agrobacteria (GV3101 pMP90) ont été injectées à la main avec des seringues sans aiguille de 1mL à 0,8 DO600nm (les injections dans N. benthamiana comprenaient 0,1 DO600nm de GV3101 portant 35S:P19, un suppresseur viral de la réduction au silence des gènes) dans des feuilles de N. benthamiana ou de N. tabacum âgées de 5 à 6 semaines. Des images des phénotypes de mort cellulaire ont été prises 2 à 5 jours après l'inoculation. Pour les western blots, afin de vérifier l'expression protéique des domaines TIR, des échantillons de feuilles de SARM1, RBA1 et MLA10 CC ont été prélevés 26 heures après l'infiltration, tandis que des échantillons de feuilles de BdTIR, SAM-RPS4 et RPP1 ont été prélevés 40 heures après l'infiltration. Pour les tests de métabolites de la NADase, les échantillons de feuilles ont été collectés 26 heures après l'infiltration ou 40 heures après l'infiltration, comme ci-dessus. Neuf disques foliaires (8 mm de diamètre) d'au moins 4 feuilles de 4 plantes différentes ont été mis en commun et pesés, puis homogénéisés en poudre et dissous dans 450 μL 50% (v/v) de méthanol et stockés à -80 °C. 150 μL du surnageant après centrifugation ont été analysés par spectrométrie de masse (voir ci-dessous). Les plantes d'Arabidopsis thaliana Ag-0 et Col-0 ont été cultivées dans des chambres maintenues à 21° C/18° C avec un cycle de 9 h/15 h (jour/nuit). Dans les essais de livraison d'effecteurs médiés par Pseudomonas fluorescens (Pf0-1) ou Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (DC3000), des souches de Pf0-1 ou de DC3000 ont été cultivées pendant la nuit, lavées une fois avec 10 mM de MgCl2 puis diluées dans 10 mM de MgCl2 à un DO600nm de 0,2 (Pf0-1) et un DO600nm de 0,1 (DC3000). Ces cultures ont été injectées à la main avec des seringues sans aiguille dans des feuilles de rosette d'Arabidopsis âgées de 4 à 6 semaines vers 10 heures du matin. Les phénotypes de mort cellulaire ont été enregistrés 24h et 30h après l'inoculation. Pour que les Western Blots puissent vérifier les niveaux de protéines, des échantillons de feuilles ont été prélevés 24 heures après l'inoculation. Pour les tests de métabolites de la NADase, des échantillons de feuilles ont été collectés 24h après l'infiltration. Pour les tests de métabolites de la NADase, des échantillons de feuilles ont été collectés 24 heures après l'infiltration. Six disques de feuilles (8 mm de diamètre) provenant de 6 feuilles de 6 plantes différentes ont été mis en commun et pesés, puis homogénéisés en poudre et dissous dans 300 μL 50% (v/v) de méthanol et stockés à -80 °C. 150 μL du surnageant après centrifugation ont été analysés par spectrométrie de masse (voir ci-dessous). Mesures de NAD+ endogène dans E. coli Des plasmides recombinants dans pET24a+ (RPP1) ou pET30a+ (autres) ont été transformés en E. coli Shuffle T7 Express Competent (New England BioLabs). Les colonies individuelles ont été cultivées


10/10

pendant la nuit et le lendemain, les cultures ont été diluées dans un milieu LB, cultivées à 30°C jusqu'à ce qu'elles atteignent une absorbance (A600) d'environ 0,4-0,8. Une concentration finale d'IPTG de 0,1 mM a été ajoutée pour induire l'expression des protéines. Les cultures ont été récoltées environ 2 heures plus tard, puis normalisées à un A600 d'environ 0,5 ± 0,05. 500 μl de la suspension de culture a ensuite été aliquotée, puis centrifugée. Le surnageant a été décanté, le culot lavé avec du PBS, et centrifugé à nouveau. Les métabolites du culot bactérien ont été extraits en ajoutant 200 μL 0,5M d'acide perchlorique (HClO4). Les échantillons ont ensuite été placés sur de la glace pendant au moins 10 minutes, filés, et le surnageant a été recueilli. 180 μL de surnageant ont ensuite été ajoutés à environ 67 μL de carbonate de potassium 3M (K2CO3). Les échantillons ont été placés sur de la glace pendant au moins 10 minutes, puis centrifugés. Les métabolites NAD+ ont ensuite été mesurés par HPLC comme décrit ci-dessous. Plasmides Les plasmides d'expression bactérienne ont été clonés en pET24a+ (RPP1) ou pET30a+ (autres). Les plasmides recombinants comprennent SARM1 - StrepTag-SARM1-TIR-HisTag (TIR : 561-724) ; RBA1 - StrepTag-RBA1-HisTag (TIR : 1-191) ; Bd - StrepTag-Bd-HisTag (TIR : 1-224) ; RPS4 - StrepTag-RPS4-HisTag (TIR : 1-200) ; RPP1 - HisTag-RPP1-StrepTag (TIR : 1-254). Les constructions d'expression des plantes ont été générées à l'aide de systèmes vectoriels compatibles avec les passerelles. Les clones d'entrée ont été générés par la clonase BP dans pDONR207 ou synthétisés dans pUC57-Kan (Genescript). Des mutants dirigés vers un site ont été générés par mutagenèse PCR. Les amorces de clonage sont disponibles sur demande. Les vecteurs d'expression végétale sont issus de la série pGWB600. Les clones d'expression végétale pour BdTIR (accession NCBI XM_003560026) et HsSARM1 SAM-TIR ont été optimisés par codon pour Arabidopsis et synthétisés par GenScript. Le vecteur HA-SAM N-terminal a été construit en clonant le domaine SAM de HsSARM1 (1xHA tag-SARM1478-578-GGGGS) dans le site XbaI de pGWB602. Le clone d'entrée RPS4Ws 1-250 était un cadeau de Kee Hoon Sohn. Le clone d'entrée RPP1NdA 1-254 est un cadeau de Brian Staskawicz. Le clone d'entrée du domaine MLA10 CC (terminaux : 1-160) est un cadeau de Farid El-Kasmi. RBA1 est issu de l'accession d'Arabidopsis Ag-0 (14). ***Statistique Les légendes des figures indiquent le type de test statistique utilisé. Les barres d'erreur représentent généralement le SEM. Pour certains points où les barres d'erreur seraient plus courtes que la hauteur du symbole, le logiciel Graph Pad Prism indique que les barres d'erreur n'ont pas été dessinées. Figure 1 : Les protéines végétales TIR peuvent dégrader le NAD+ et le NADP+. Les protéines in vitro générées par transcription-translation TIR seulement ont abaissé les niveaux de NAD+ par rapport aux mutants catalytiques présumés. Les barres d'erreur représentent le SEM. Les astérisques indiquent la signification statistique calculée séparément pour chaque gène [analyse de variance (ANOVA) avec le test de Tukey:*P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001]. Figure 2 : Pour valider que les TIR des plantes sont bien des NADases dans les planta, nous avons mesuré l'accumulation de v-cADPR dépendant des TIR dans les planta (biomarqueur). Les TIR produisent du v-cADPR in planta A) Le v-cADPR s'accumule dans Arabidopsis (Ag-0) 24 heures après l'inoculation avec Pseudomonas fluoruscent (HopBA1). Le HopBA1H56F est codé par un mutant de perte de fonction [avec l'histidine (H) au résidu 56 changée en phénylalanine (F)] (14). (B et C) v-cADPR s'accumule lors de l'expression de RBA1 et BdTIR chez N. benthamiana et les mutants eds1-2 et nrg1-1. La mort cellulaire déclenchée par une fonction immunitaire non-TIR n'a pas induit d'accumulation de v-cADPR. Les barres d'erreur représentent SEM. Les astérisques indiquent la signification statistique [ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey pour (F) et Kruskal-Wallis avec le test de Dunn pour (G) : *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001].

annee universitaire 2020 2021 session 1 d’automne …

Documents