ana-maria cristina bololoi a alogues du...

THESE

en vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UIVERSITE DE TOULOUSE

délivré par

L’UIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER et

L’UIVERSITE POLITEHICA BUCAREST

Spécialité : CHIMIE MACROMOLECULAIRE ET SUPRAMOLECULAIRE

par

Ana-Maria Cristina BOLOLOI

Ingénieur UPB – Bucarest

OUVEAUX AMPHIPHILES CATAIOIQUES

AALOGUES DU GALACTOSYLCERAMIDE :

CORRELATIO STRUCTURE, PROPRIETES PHYSICO-

CHIMIQUES ET ACTIVITE ATI-VIH

Présentée et soutenue le 19 mai 2008 devant la commission d’examen

Mme. M.J. Stébé, Directeur de recherche CNRS, Nancy Rapporteur

Mlle. L.R. Stan, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Rapporteur

M. B. Pucci, Professeur à la Faculté des Sciences, Avignon Examinateur

M. A. Vigroux, Professeur à l’Université Paul Sabatier, Toulouse Examinateur

Mme. I. Rico-Lattes, Directeur de recherche CNRS, Toulouse Directeur de thèse

M. S.I. Rosca, Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest Directeur de thèse

Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique, UMR 5623

Université Paul Sabatier – Bât. 2R1, 118 route de 'arbonne, 31062 Toulouse Cedex 04

Avant propos

Avant-propos

REMERCIEMENTS

Ces travaux de thèse ont été réalisés au Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique de l’Université Paul Sabatier à Toulouse, dirigé successivement par Mme Isabelle Rico-Lattes puis par Mme Monique Mauzac. Je tiens à les remercier toutes deux pour leur accueil au sein de cette grande famille des IMRCP et pour leur gentillesse.

Je tiens à remercier encore une fois Mme Isabelle Rico-Lattes, ma directrice de thèse, de

m’avoir donné la possibilité de réaliser cette étude dans les meilleures conditions et de m’avoir suivie tout au long de ce travail. Je vous remercie pour votre rigueur scientifique, votre dynamisme et vos qualités humaines qui m’ont permis d’évoluer aussi bien sur le plan professionnel que personnel.

Je voudrais également remercier M. Sorin Ioan Rosca, mon deuxième directeur de thèse, de m’avoir permis de découvrir la beauté et quelques secrets de la chimie organique, de m’avoir dirigé vers les IMRCP et d’avoir accepté cette thèse en cotutelle. Je vous remercie également pour votre très grande pédagogie qui m’a beaucoup apportée.

Mes sincères remerciements s’adressent à M. Armand Lattes qui m’a accueillie très chaleureusement dans l’univers des IMRCP dont il est le créateur.

Je suis très reconnaissante à Muriel Blanzat et Emile Perez qui ont encadré quotidiennement ces travaux de recherche avec énormément de conseils, de motivation et de force de travail. Merci également pour votre bonne humeur, votre disponibilité et votre gentillesse.

Je voudrais remercier Mme Marie-José Stébé (Directeur de recherche CNRS à Nancy) et Mlle Raluca Stan (Professeur à l’Université "Politehnica" Bucarest) d’avoir accepté de juger ce travail en tant que rapporteurs.

Mes remerciements s’adressent également à M. Alain Vigroux (Professeur à l’Université Paul Sabatier à Toulouse) qui a accepté de présider le jury de cette thèse et à M. Bernard Pucci (Professeur à la Faculté des Sciences à Avignon) pour sa participation en tant qu’examinateur.

Je suis également très reconnaissante à M. Helmuth Möhwald et à M. Gerald Brezesinski de l’Institut Max-Planck à Golm, en Allemagne, de m’avoir accueillie dans leur laboratoire pendant mon stage Marie Curie.

Je tiens également à remercier M. Angelo Valleriani et le programme Marie Curie EST (Early-Stage Research Training) pour le support financier de ces travaux.

Avant-propos

Mes sincères remerciements s’adressent à Mme Anne-Marie Aubertin et à Géraldine Albrecht qui ont réalisé les expériences d’évaluation d’activité antivirale et qui m’ont accueillie très chaleureusement dans leur laboratoire de l’Institut de Virologie INSERM à Strasbourg.

Je suis très reconnaissante à Cédric-Olivier Turrin et à Grégory Spataro de l’équipe de M. Jean-Pierre Majoral (Laboratoire de Chimie de Coordination, Toulouse) pour la synthèse des dendrimères et leur si plaisante collaboration.

Je remercie encore une fois très chaleureusement M. Bernard Pucci et son équipe de

l’Université d’Avignon (Laboratoire de Chimie Bioorganique et des Systemes Moléculaires Vectoriels) pour la synthèse des acides mixtes fluorés/hydrogénés et leur collaboration.

Je souhaite également remercier le Dr. Brigitte Tiersch et le Prof. Dr. Joachim Kötz de l’Université de Potsdam, Allemagne, pour leur collaboration en cryofracture et l’équipe de microscopistes, tout particulièrement, Vincent Collière et Lucien Datas du Service Commun de Microscopie Electronique de l’Université Paul Sabatier (TEMSCAN).

Je voudrais remercier très chaleureusement toute l’équipe : Stéphanie Cassel, Sophie Franceschi, Elodie, Romain, Sabrina, Roland, Roberto, Sergii, Lyuba, Plamen, Hugo, Alex, Cécile, Denis …Merci pour la bonne ambiance que vous avez su créer et pour les moments très agréables passés ensemble.

Je remercie également toutes les personnes des IMRCP pour leur amabilité et leur gentillesse. Un grand merci s’adresse particulièrement à : Lacramioara, Menana, Florence, Javier, Kamil, Waël, Yann, Florence Frechou, Fernanda, Arielle, Jean-Christophe, Sandrine, Charles Louis, Christian...

Un grand merci s’adresse aux amis de tarot : Muriel, Richard, Marlene, Marie, Elisabeth, Vincent, Clément, Kamal, Cosmin, Andreea et Raluca. Merci infiniment pour les moments magnifiques passés ensemble.

Je tiens également à remercier l’équipe de Bucarest : Mme Sanziana Rosca, Cristinel, Raluca, Dienut, Manuc, Andrada, Nico… Merci pour les moments inoubliables.

Diana et Vincent, Raluca et Bassam, Ana et Florin merci de tout cœur de votre amitié, de votre soutien et de votre compréhension.

Enfin, je tiens à remercier mes parents et ma famille pour tout ce que vous m’avez appris et offert.

Alin, merci de tout cœur d’avoir été toujours là pour me soutenir et me redonner la confiance et la force d’aller plus loin. Cette réussite nous appartient à tous les deux. Merci !

Merci à tous.

Avant-propos

LISTE DES ABREVIATIONS

AD : Acide Désoxyribonucléique

AR : Acide Ribonucléique

ARm : Acide Ribonucléique messager

ARV : AIDS Related Virus

AZT : 3’-azido-2’-déoxytimidine

CA : Capside

CAC : Concentration d’Agrégation Critique

CC50 : Concentration Cytotoxique à 50%

CCR : Récepteur de chimiokines non spécifiques (CC)

CD4 : Classe de Différenciation 4 (Récepteur cellulaire du VIH)

CD4+ : Cellules exprimant le CD4

CD4- : Cellules n’exprimant pas le CD4

CEM-SS : Lignée cellulaire lymphocytaire; SS - "syncytial sensitivity"

CXCR : Récepteur de chimiokines spécifiques à une seule protéine (CXC)

DC3 : Dendrimère comportant des chaînes alkyles en C3

DC10 : Dendrimère comportant des chaînes alkyles en C10

FDA: American Food and Drugs Administration

F8 : Acide CF3(CF2)7COOH

GalCer : GalactosylCéramide

GalCer +: Cellules exprimant le GalactosylCéramide

gp : Glycoprotéine

HAART: Highly Active Antiretroviral Treatment

HTLV-III: Human T-Cell Leukemia Virus III

H2F6H4 : Acide CH3(CH2)3(CF2)6(CH2)2COOH

H4F8 : Acide CF3(CF2)7(CH2)4COOH

IC50 : Concentration Inhibitrice à 50%

IP : Inhibiteurs de la Protéase

IR : Infrarouge

IRRAS : Spectroscopie Infrarouge de Réflexion-Absorption

I : Intégrase

ITI : Inhibiteurs Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse

Avant-propos

ITI : Inhibiteurs Non-Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse

ItTI : Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse

IT : Indice Thérapeutique

LAV : Lymphadenopathy Associated Virus

L12 : N-dodécylamino-1-déoxylactitol

L16 : N-hexadécylamino-1-déoxylactitol

L12DC3 : Association catanionique entre le L12 et le dendrimère DC3




L16H13 : Association catanionique entre le L16 et l’acide myristique, CH3(CH2)12COOH

L16H4F8 : Association catanionique entre le L16 et l’acide CF3(CF2)7(CH2)4COOH

L16H2F6H4 : Association catanionique entre le L16 et l’acide CH3(CH2)3(CF2)6(CH2)2COOH

L16F8 : Association catanionique entre le L16 et l’acide CF3(CF2)7COOH

MA : Matrice virale

C : Nucléocapside

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

OUSIDA : Programme Commun des Nations Unies Sur le VIH/SIDA

p17 : Protéines de la matrice

PR : Protéase

RM : Résonance magnétique nucléaire

RCI50 : Concentration Inhibitrice Normalisée

SIDA : Syndrome d’Immunodéficience Acquise

T4

(T CD4+) :

Lymphocytes exprimant le récepteur CD4

TEM : Microscopie Electronique à Transmission

TI : Transcriptase Inverse

TS : Tension Superficielle

V3 : Région variable 3

VIH : Virus d’Immunodéficience Humaine

VIS : Virus de l’Immunodéficience du Singe

Sommaire

Sommaire

SOMMAIRE

ITRODUCTIO GEERALE......................................................................... 1

CHAPITRE I : MISE AU POIT BIBLIOGRAPHIQUE...................................... 7

I ITRODUCTIO ......................................................................................... 11

II GEERALITES SUR LE SIDA..................................................................... 12

III LE VIRUS D’IMMUODEFICIECE HUMAIE (VIH) ............................... 15

III.1 Généralités sur le VIH.......................................................................................... 15

III.2 La structure du VIH-1 .......................................................................................... 16

III.3 Cycle de réplication du VIH................................................................................. 19

IV LA CHIMIOTHERAPIE DU VIH-1 .............................................................. 22

IV.1 Inhibiteurs de l’entrée virale................................................................................ 24

IV.1.1 Inhibiteurs de reconnaissance et de fixation................................................................ 24

IV.1.1.1 Inhibiteurs des récepteurs cellulaires CD4 ......................................................... 25

IV.1.1.2 Inhibiteurs des glycoprotéines virales gp 120 .................................................... 26

IV.1.1.3 Inhibiteurs des corécepteurs du VIH-1 ............................................................... 34

IV.1.1.3.1 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5......................................................... 34

IV.1.1.3.2 Inhibiteurs des corécepteurs CXCR4 ............................................................ 36

IV.1.1.3.3 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5 et CXCR4....................................... 38

IV.1.2 Les inhibiteurs de fusion ............................................................................................. 38

IV.1.2.1 Inhibiteurs ciblant la région NHR de la gp 41................................................... 39

IV.1.2.2 Inhibiteurs ciblant la région CHR de la gp 41. ................................................... 40

IV.1.3 Inhibiteurs de la décapsidation (de la nucléocapside virale) ....................................... 41

IV.2 Inhibiteurs de la transcriptase inverse................................................................. 42

IV.2.1 Structure et activité de la transcriptase inverse ........................................................... 42

IV.2.2 Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse................................................. 42

IV.2.3 Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse. ................................................ 45

IV.2.4 Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse ......................................... 45

IV.3 Inhibiteurs de l’intégrase ..................................................................................... 47

IV.4 Inhibiteurs de transcription (transactivation)...................................................... 50

IV.5 Inhibiteurs de la protéase..................................................................................... 52

IV.6 Polythérapies........................................................................................................ 54

IV.7 Le développement des systèmes de vectorisation pour la thérapie anti-VIH...... 56

IV.8 Inhibiteurs de l’étape de latence du VIH ............................................................. 57

IV.9 Le stade actuel du développement des vaccins anti-VIH ..................................... 58

V COCLUSIOS ........................................................................................... 59

VI BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................ 61

Sommaire

CHAPITRE II : SYTHESE, PROPRIETES BIOLOGIQUES ET PHYSICO-

CHIMIQUES DE OUVEAUX LEURRES DU VIH .................. 69

I ITRODUCTIO ......................................................................................... 73

II ITERET DES DERIVES CATAIOIQUES DEDRITIQUES AALOGUES DU

GALCER .................................................................................................... 74

III SYTHESE DE OUVEAUX TESIOACTIFS CATAIOIQUES DEDRITIQUES

AALOGUES DU GALCER.......................................................................... 79

III.1 Synthèse des dendrimères catanioniques analogues du GalCer.......................... 79

III.2 Analyse structurale par résonance magnétique nucléaire................................... 81

IV ETUDE DE L’ASSOCIATIO DES DEDRIMERES CATAIOIQUES A

L’ITERFACE EAU / AIR............................................................................. 83

IV.1 La technique de la balance de Langmuir ............................................................ 83

IV.2 Etude des monocouches d’amphiphiles catanioniques dendritiques par la

technique de la balance de Langmuir ................................................................. 85

V PROPRIETES BIOLOGIQUES DE OUVEAUX CATAIOIQUES

DEDRITIQUES AALOGUES DU GALCER................................................. 89

V.1 Caractéristiques biologiques................................................................................ 89

V.1.1 Paramètres biologiques ............................................................................................... 89

V.1.2 Lignées cellulaires et souches virales.......................................................................... 90

V.1.3 Présentation de la méthode utilisée ............................................................................. 90

V.2 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des dendrimères catanioniques analogues

du GalCer............................................................................................................ 91

VI ETUDE DE L’ITERACTIO ET DE L’ICORPORATIO DES DEDRIMERES

CATAIOIQUES VIS-A-VIS D’U MODELE MEMBRAAIRE ...................... 96

VII PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES CATAIOIQUES DEDRITIQUES

AALOGUES DU GALCER........................................................................ 107

VII.1 Etude des propriétés tensioactives ..................................................................... 107

VII.2 Etude de la distribution de taille des agrégats................................................... 111

VII.3 Etude de la morphologie des agrégats............................................................... 113

VIII COCLUSIOS ET PERSPECTIVES......................................................... 120

IX BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................... 123

CHAPITRE III : MISE AU POIT DE VECTEURS CATAIOIQUES HYBRIDES

AALOGUES DU GALCER .............................................. 125

I ITRODUCTIO..................................................................................... 129

Sommaire

II MISE AU POIT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES TESIOACTIFS MIXTES

FLUORES / HYDROGEES ...................................................................... 131

II.1 Caractéristiques particulières des chaînes alkyles fluorocarbonées................. 131

II.2 Composés covalents mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés dérivés de sucres132

II.3 Composés catanioniques mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés .................... 135

III MISE AU POIT DE VECTEURS CATAIOIQUES HYBRIDES AALOGUES

DU GALCER .......................................................................................... 136

III.1 Tensioactifs catanioniques pour la délivrance de principes actifs .................... 136

III.2 Synthèse d’analogues catanioniques du GalCer de nature hybride fluorocarboné

/ hydrocarboné .................................................................................................. 138

III.3 Analyse structurale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer............. 142

IV PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES COMPOSES CATAIOIQUES

HYBRIDES FLUORES / HYDROGEES..................................................... 145

IV.1 Etude des propriétés tensioactives ..................................................................... 145

IV.2 Etude de distribution de taille des agrégats....................................................... 148

IV.3 Etude de la morphologie des agrégats............................................................... 151

V ETUDE DE L’ITERACTIO ETRE LES COMPOSES CATAIOIQUES ET

DES MOOCOUCHES DE PHOSPHOLIPIDES ........................................... 157

VI EVALUATIO DES PROPRIETES DE VECTORISATIO SUR CELLULES

IFECTEES PAR LE VIH........................................................................ 162

VI.1 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des associations catanioniques hybrides

analogues du GalCer ........................................................................................ 162

VI.2 Evaluation des propriétés physico-chimiques dans les conditions de vectorisation

........................................................................................................................... 164

VI.3 Formulations de l’AZT avec les tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et

L16F8 .................................................................................................................. 171

VII COCLUSIO ........................................................................................ 174

VIII BIBLIOGRAPHIE.................................................................................... 176

COCLUSIO GEERALE ......................................................................... 179

PARTIE EXPERIMETALE ........................................................................ 185

I PRODUITS COMMERCIAUX UTILISES ...................................................... 189

I.1 Réactifs ............................................................................................................... 189

I.2 Solvants .............................................................................................................. 189

II TECHIQUES DE CARACTERISATIO STRUCTURALE ............................. 190

II.1 RM; ................................................................................................................... 190

II.2 Infrarouge........................................................................................................... 190

Sommaire

II.3 Spectrométrie de masse...................................................................................... 190

II.4 Analyses centésimales ........................................................................................ 191

III SYTHESE ............................................................................................... 191

III.1 ;-dodécylamino-1-désoxylactitol - L12 ............................................................. 191

III.2 ;-hexadécylamino-1-désoxylactitol - L16.......................................................... 193

III.3 Dendrimères catanioniques analogues du GalCer ............................................ 195

III.3.1 Mélanges catanioniques comportant le N-hexadécylamino-1-désoxylactitol : L16DC3

et L16DC10 ................................................................................................................. 195

Mélange catanionique L16DC3 ........................................................................................... 195

Mélange catanionique L16DC10 .......................................................................................... 196

III.3.2 Mélanges catanioniques comportant le N-dodécylamino-1-désoxylactitol : L12DC3 et

L12DC10...................................................................................................................... 197

Mélange catanionique L12DC3 ........................................................................................... 197

Mélange catanionique L12DC10 .......................................................................................... 198

III.4 Associations catanioniques bicaténaires analogues du GalCer ........................ 199

III.4.1 Association catanionique L16H4F8 ............................................................................. 199

III.4.2 Association catanionique L16H2F6H4 ......................................................................... 200

III.4.3 Association catanionique L16F8 ................................................................................. 201

III.4.4 Association catanionique L16H13 ............................................................................... 202

IV TECHIQUES DE CARACTERISATIO PHYSICO - CHIMIQUE................... 203

IV.1 Préparation des solutions de catanioniques ...................................................... 203

IV.2 Mesure de tension de surface ............................................................................. 203

IV.3 Evaluation de la taille et de la distribution de taille des agrégats - Diffusion

quasi-élastique de la lumière (DLS).................................................................. 204

IV.4 Caractérisation des agrégats ............................................................................. 205

IV.4.1 Microscopie électronique par transmission............................................................... 205

IV.4.2 Cryofracture .............................................................................................................. 206

IV.5 Isothermes de compression ................................................................................ 209

IV.6 Spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) .............................. 210

V TESTS BIOLOGIQUES ............................................................................... 212

V.1 Conditions expérimentales d’infection des cellules CEM-SS ............................ 212

V.2 Evaluation de l’activité anti – VIH : incorporation d’uridine tritiée ([3H]-

uridine) .............................................................................................................. 213

V.3 Evaluation de la cytotoxicité : test MTT ............................................................ 213

LISTE DES PRODUITS ............................................................................... 215

Introduction générale


3

INTRODUCTION GENERALE

L’origine exacte du Virus d’Immunodéficience Humaine (VIH), le virus responsable

du Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA) demeure jusqu’à nos jours inconnue. Une

première évidence de l’infection d’un être humain par ce virus, qui sera dénommé 27 ans plus

tard VIH, provient d’un sérum prélevé en 1959 en Afrique. Ce n’est qu’en 1981 que

l’épidémie de SIDA commence à se manifester comme une maladie inconnue dans les pays

développés et qu’en 1983 que les scientifiques identifient l’action destructrice du VIH sur le

système immunitaire humain comme cause de l’apparition du SIDA. Depuis, le nombre de

personnes infectées par le VIH dans le monde et décédées suite au SIDA est en croissance

continue. Encore aujourd’hui, ce qui semble être le centre épidémiologique, l’Afrique

subsaharienne, reste la région la plus gravement touchée et le SIDA y est toujours la

principale cause de mortalité.

Les importants progrès réalisés dans le domaine médical ont abouti à la mise au point

de régimes polythérapeutiques anti-VIH qui sont capables d’améliorer et de prolonger la vie

des personnes infectées par le VIH. L’efficacité de ces régimes polythérapeutiques est due à

l’utilisation combinée d’au moins trois principes actifs agissant à différentes étapes du cycle

de réplication du VIH : l’entrée virale, la transcription et la maturation du VIH.

De nombreux inhibiteurs de transcription et de maturation du VIH ont été déjà

acceptés pour l’utilisation clinique. Ceux-ci agissent après l’infection, au sein de la cellule,

afin de stopper la multiplication virale et la propagation de l’infection. Le nombre important

des composés de cette classe est justifié par une recherche continue des composés de plus en

plus actifs mais également par la nécessité de leur continue variation au sein des polythérapies

afin d’éviter les effets secondaires et/ou une résistance virale à un certain produit.

En ce qui concerne les inhibiteurs de l’entrée virale, seulement deux principes actifs

ont été agréés pour une utilisation clinique: l’enfuvirtide et le maraviroc. Malgré le rôle

crucial de ces inhibiteurs des étapes précoces de l’infection, qui bloquent la reconnaissance et

l’interaction entre le virus et la cellule, empêchant la pénétration du VIH et la contamination

cellulaire, ils présentent des inconvénients non-négligeables tels: une faible biodisponibilité,

un prix élevé de fabrication et des effets secondaires.

En répondant aux besoins urgents des patients atteints par le VIH en matière de

nouvelles classes d’inhibiteurs de l’entrée virale, le développement des analogues

synthétiques du galactosylcéramide (GalCer – récepteur cellulaire alternatif du VIH) s’est


4

montré très prometteur. De par leur capacité à interagir et à bloquer les glycoprotéines virales

gp120, par un effet de concurrence avec les récepteurs cellulaires principaux (CD4) du VIH,

les analogues du GalCer empêchent le virus de pénétrer et d’infecter les cellules humaines. De

ce fait, ces composés fonctionnent comme leurres du VIH.

Connaissant la nécessité d’obtention d’antirétroviraux à faible coût, lorsque la plupart

des personnes infectées par le VIH vit dans des pays pauvres, des travaux précédemment

réalisés au laboratoire des IMRCP ont eu comme but de rendre les analogues du GalCer

économiquement attractifs. Ainsi, tout en conservant les impératifs structuraux indispensables

pour mimer le récepteur cellulaire, une nouvelle famille originale d’inhibiteurs de l’entrée

virale a été mise au point: les tensioactifs catanioniques analogues du galactosylcéramide.

Issus d’une réaction acido-basique entre les deux composés constitutifs, ces produits se sont

montrés très prometteurs en se distinguant par de bonnes activités antivirales, une méthode

simple de synthèse et à faible coût.

Ainsi, en nous appuyant sur l’expérience antérieure de notre laboratoire dans ce

domaine, l’étude actuelle aura pour but l’amélioration de l’activité antivirale de nouvelles

associations catanioniques du GalCer. Deux approches différentes seront envisagées.

Dans un premier temps, nous mettrons à profit l’effet de multiplicité de sites actifs afin

d’obtenir une affinité finale leurre multisite - virus supérieure à la somme des interactions

individuelles monosite - virus. Afin d’améliorer la marge de sécurité de ces principes actifs,

l’étude se concentrera également sur la diminution de la toxicité cellulaire de ces nouveaux

analogues du GalCer multivalents. Dans ce sens, une nouvelle famille des composés

catanioniques dendritiques sera synthétisée et étudiée.

Ainsi, la stratégie envisagée pour l’amélioration de l’activité antivirale sera celle d’une

multiplication de sites de reconnaissances. Par ailleurs, la stratégie de diminuer la toxicité

cellulaire impliquera des modifications structurales au sein de l’association catanionique afin

de renforcer l’effet hydrophobe entre les éléments constitutifs pour empêcher une éventuelle

dissociation de l’entité catanionique, dissociation supposée être responsable de la toxicité

cellulaire de ce type de composés.

Concernant la synthèse de ces nouveaux analogues catanioniques du GalCer, certains

facteurs structuraux indispensables pour l’affinité avec le virus seront conservés, à savoir, un

motif galactose, une hydrophobie adéquate, une flexibilité des chaînes alkyles et certaines

configurations stéréochimiques. Ainsi, la simplicité et la souplesse de la méthode de synthèse


5

utilisée nous permettront d’obtenir des amphiphiles dendritiques catanioniques pouvant se

comporter comme des "clusters" de sites actifs, par simple association acido-basique des N-

alkylamino-1-déoxylactitols (composés comportant les sites actifs) avec des composés acides

dendritiques comportant des chaînes alkyles. Le squelette dendritique aura pour rôle de

supporter les multiples sites actifs et, quant aux chaînes alkyles, elles participeront à la

consolidation de l’entité catanionique ainsi qu’au renforcement de l’affinité avec le VIH.

Une étude des interactions entre ces nouveaux composés vis-à-vis des modèles

membranaires ainsi qu’une étude physico-chimique détaillée nous permettra d’établir une

corrélation entre les propriétés biologiques (activité antivirale et respectivement toxicité

cellulaire) et les caractéristiques structurales de ces associations catanioniques dendritiques.

Ainsi, nous verrons de quelle manière des éléments tels que la structure, l’hydrophobie, la

conformation, et l’organisation supramoléculaire dans une solution aqueuse sont déterminants

pour l’activité et la cytotoxicité de ces produits. L’analyse du mode d’organisation de chaque

produit dans toute la gamme de concentrations utilisées en biologie cellulaire se montrera

également d’une grande importance.

Dans un deuxième temps, nous allons profiter de la présence de la glycoprotéine

gp120 autant à la surface du virus qu’à la surface des cellules infectées par le VIH afin

d’augmenter l’activité antivirale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer par une

stratégie de multiciblage. Cette fois-ci une famille hybride d’analogues catanioniques du

GalCer sera synthétisée et étudiée à la fois pour la capacité d’agir à l’état non agrégé en tant

que leurre du VIH, ainsi qu’en tant que système de délivrance spécifique de principes actifs

anti-VIH, à l’état agrégé.

Nous verrons que de par leur design, cette nouvelle série d’analogues catanioniques

mixtes du GalCer réunit des éléments bien adaptés pour la vectorisation de principes actifs

anti-VIH. Ainsi, leur nature catanionique permet une auto-association en milieu aqueux avec

la formation spontanée d’agrégats vésiculaires. De plus, la présence au sein des associations

catanioniques d’un segment fluoré, plus hydrophobe, a été prévue pour améliorer la stabilité

des vésicules au cours du temps. Aussi, la multiplicité des sites de reconnaissance existant à la

surface des vésicules, engendrant une augmentation de la probabilité d’interaction avec le

virus, pourrait assurer une bonne reconnaissance et spécificité pour la glycoprotéine gp120.

Ainsi, des vésicules stables, formées spontanément par ces composés hybrides dans un milieu

aqueux pourraient agir en tant que transporteurs spécifiques, guidant les principes actifs anti-

VIH incorporés au sein des agrégats vers les cellules humaines infectées par le virus. Cela est


6

envisageable car, comme nous l’avons déjà mentionné, les analogues du GalCer ont une forte

affinité pour les glycoprotéines virales gp120 qui bourgeonnent à la surface membranaire des

cellules infectées par le VIH.

Concernant leur synthèse, des variations structurales seront réalisées au niveau de la

longueur et de la position d’un segment fluoré au sein de l’association catanionique, tout en

conservant les mêmes éléments structuraux antérieurement décrits pour maintenir l’affinité

avec le virus. Ainsi, la structure du N-alkylamino-1-déoxylactitol sera conservée, car c’est

cette structure qui permettra la reconnaissance avec la gp120, tandis que les modifications

structurales seront réalisées seulement au niveau de l’acide gras fluoré, le deuxième

composant de l’association catanionique.

Une étude des propriétés physico-chimiques et biologiques in vitro de ces nouveaux

assemblages catanioniques nous permettra d’identifier le composé le plus adapté à

l’application envisagée soit, la vectorisation de principes actifs anti-VIH.

Une dernière partie décrira les modes opératoires, les techniques d’analyse employées

ainsi que les caractéristiques des produits préparés au cours de ces travaux.

Chapitre I

Mise au point bibliographique

Chapitre I Mise au point bibliographique

9

I ITRODUCTIO ......................................................................................... 11

II GEERALITES SUR LE SIDA..................................................................... 12

III LE VIRUS D’IMMUODEFICIECE HUMAIE (VIH) ............................... 15

III.1 Généralités sur le VIH.......................................................................................... 15

III.2 La structure du VIH-1 .......................................................................................... 16

III.3 Cycle de réplication du VIH................................................................................. 19

IV LA CHIMIOTHERAPIE DU VIH-1 .............................................................. 22

IV.1 Inhibiteurs de l’entrée virale................................................................................ 24 IV.1.1 Inhibiteurs de reconnaissance et de fixation................................................................ 24

IV.1.1.1 Inhibiteurs des récepteurs cellulaires CD4 ......................................................... 25 IV.1.1.2 Inhibiteurs des glycoprotéines virales gp 120 .................................................... 26 IV.1.1.3 Inhibiteurs des corécepteurs du VIH-1 ............................................................... 34

IV.1.1.3.1 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5......................................................... 34 IV.1.1.3.2 Inhibiteurs des corécepteurs CXCR4 ............................................................ 36 IV.1.1.3.3 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5 et CXCR4....................................... 38

IV.1.2 Les inhibiteurs de fusion ............................................................................................. 38 IV.1.2.1 Inhibiteurs ciblant la région NHR de la gp 41................................................... 39 IV.1.2.2 Inhibiteurs ciblant la région CHR de la gp 41. ................................................... 40

IV.1.3 Inhibiteurs de la décapsidation (de la nucléocapside virale) ....................................... 41 IV.2 Inhibiteurs de la transcriptase inverse................................................................. 42

IV.2.1 Structure et activité de la transcriptase inverse ........................................................... 42 IV.2.2 Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse................................................. 42 IV.2.3 Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse. ................................................ 45 IV.2.4 Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse ......................................... 45

IV.3 Inhibiteurs de l’intégrase ..................................................................................... 47

IV.4 Inhibiteurs de transcription (transactivation)...................................................... 50

IV.5 Inhibiteurs de la protéase..................................................................................... 52 IV.6 Polythérapies........................................................................................................ 54

IV.7 Le développement des systèmes de vectorisation pour la thérapie anti-VIH...... 56

IV.8 Inhibiteurs de l’étape de latence du VIH ............................................................. 57 IV.9 Le stade actuel du développement des vaccins anti-VIH ..................................... 58

V COCLUSIOS ........................................................................................... 59

VI BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................ 61


10


11

INTRODUCTION

De nos jours, le Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA) provoqué par le

Virus d’Immunodéficience Humaine (VIH) est considéré comme la principale cause de

mortalité dans l’Afrique subsaharienne et la quatrième pathologie mortelle dans le monde. On

estime à 14 000 le nombre de personnes infectées par le VIH chaque jour (soit 5 millions de

personnes par an), dont plus de 95% d’entres elles vivent dans des régions sous-développées

du monde. La mise au point d'un remède contre le SIDA sûr, efficace, facile à administrer et

peu coûteux est donc une urgence.

Ce premier chapitre présentera une mise au point bibliographique sur le Virus de

l’Immunodéficience Humaine (VIH) : l’impact de sa propagation dans le monde, sa structure,

son mécanisme de multiplication et les moyens de lutte développés ces 25 dernières années

contre ce terrible virus.

En suivant les principales étapes du cycle de réplication du VIH, il sera fait une

présentation des diverses stratégies thérapeutiques. Parmi cet "arsenal" anti-VIH riche d’une

très vaste diversité de produits, on va retrouver des composés déjà agréés en chimiothérapie et

d’autres, très prometteurs qui se trouvent encore dans différentes phases d’essais cliniques.

D’une manière générale, cette partie bibliographique veut offrir une image concise des

avancées réalisées dans ce domaine afin de mieux situer l’apport de nos travaux dans la lutte

contre le VIH.


12

I GENERALITES SUR LE SIDA

Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) est devenu l’une des épidémies les

plus dévastatrices de l’histoire. Depuis que les scientifiques ont identifié en 1981 le virus VIH

(Virus d’Immunodéficience Humaine), cette épidémie a fait plus de 25 millions de victimes

humaines.

Le SIDA s’installe dans l’organisme humain suite à l’infection par le VIH. Ce virus

attaque les cellules T CD4+ (les lymphocytes T4 et les macrophages) du système

immunitaire humain et réussit à l’affaiblir en quelques années, le rendant inefficace contre des

agents pathogènes externes comme les bactéries, les champignons ou d’autres virus .

Le VIH faisant partie de la famille des Lentivirus (lentus = lent), les symptômes du

SIDA n'apparaissent qu'après une assez longue période d'incubation. Ainsi, l’évolution

typique de l’infection par le VIH peut être divisée en trois phases : la primo-infection, la

phase de latence clinique et la phase SIDA qui précède la mort (Figure 1).

Figure 1: Evolution typique de l’infection par le VIH [1]

.

La première étape s’installe environ 3 – 6 semaines après l’infection et se caractérise

par une importante et rapide augmentation de la charge virale dans le sang, suite à la

multiplication massive du VIH et à la mort de nombreuses cellules T CD4+. Souvent, les

symptômes cliniques caractéristiques comme : fièvre, diarrhée, maux de tête, éruptions

cutanées et léthargie peuvent induire en erreur vers d’autres maladies.

La phase de latence clinique peut durer, en fonction des individus, entre 8 et 12 ans et

se définit par une absence de symptômes cliniques, une fausse période de bonne santé


13

résultant de la lutte soutenue du système immunitaire contre le VIH qui n’arrête pas de se

multiplier. Il semble donc que pour un temps, le système immunitaire réussisse à contrôler la

réplication virale. Durant cette période, un grand nombre de virus et de cellules infectées sont

produits et détruits chaque jour afin de maintenir un équilibre entre la réplication virale et la

réponse immunitaire. Des études ont montré que la demi-vie du virus dans le sang est

d’environ 6 heures tandis que pour les cellules infectées, la demi-vie est de seulement 1,5

heures [2, 3].

Après quelques années, l’organisme ne peut plus combattre le VIH en raison d’une

chute prononcée du nombre de lymphocytes T CD4+, la concentration en particules virales

augmente alors rapidement, par exemple à la suite d’une maladie infectieuse et le SIDA

s’installe [4, 5].

Malgré un accès récemment amélioré aux traitements antirétroviraux et à la prise en

charge de la maladie dans de nombreuses régions du monde, en 2006 le nombre total de

personnes vivant avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) a atteint son plus haut

niveau, soit environ 39,5 millions de personnes. L’Afrique subsaharienne reste la plus touchée

avec plus de 24 millions de personnes infectées, et les femmes de cette région géographique

vivant avec le VIH représentant 77% du nombre total de femmes atteintes par le VIH dans le

monde (Figure 2).

Figure 2: Répartition mondiale des personnes vivant avec le VIH

(Source ONUSIDA/OMS – décembre 2006)


14

Durant cette même année 2006, plus de 4 millions de personnes ont contracté la

maladie et l’épidémie de SIDA a fait plus de 3 millions de décès, dont plus d’un demi-million

d’enfants. Prenant en considération l’explosion de l’infection dans l’Asie du sud-est, plus

particulièrement en Chine, en Indonésie et au Vietnam, l’ONUSIDA (Le Programme

Commun des Nations Unies Sur le VIH/SIDA) considère que l’épidémie est toujours dans son

stade préliminaire et que sans un traitement efficace le nombre de victimes atteintes par ce

virus va continuer d’augmenter d’une manière inquiétante [6].

La propagation du virus d’une personne à une autre se fait par plusieurs voies : plus

fréquemment lors des relations sexuelles mais aussi par le contact direct avec du sang

contaminé, et par transmission mère – enfant lors de l’accouchement ou de l’allaitement [7].

Aucun être humain n’est a l’abri de ce virus qui ne connait pas de limite d’age, de différences

raciales ou sociales.

Les enjeux sont immenses. A l’échelle mondiale, moins d’une personne sur cinq

exposée au risque d’infection par le VIH peut accéder à des services de prévention de base.

Parmi les personnes vivant avec le VIH, une sur dix seulement a fait un test et sait qu’elle est

infectée.

En dépit de remarquables progrès réalisés en chimiothérapie sur l’efficacité des

traitements modernes qui peuvent diminuer la charge virale au-dessous des limites de

détection du VIH, il subsiste toujours des problèmes, comme la résistance du virus aux

principes actifs, qui entraîne un échec thérapeutique. La réalité est encore plus désolante dans

les pays du tiers monde ou la thérapie anti-SIDA n’est pas accessible dans la plus grande

majorité des cas. Tous ces éléments sont autant de signaux d’alarmes qui mettent en évidence

le besoin urgent de développer de nouveaux principes actifs anti-VIH bons marchés, des

méthodes de prévention et des vaccins efficaces.


15

II LE VIRUS D’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH)

II.1 Généralités sur le VIH

Même si les premiers indices sur le VIH ont été consignés dans deux rapports du

Centre de Contrôle des Maladies d'Atlanta, USA, en 1981 indiquant plusieurs jeunes

homosexuels atteints d’une maladie inconnue, le virus a réellement été décrit pour la première

fois en 1983, par les groupes français du Professeur Montagnier et du Docteur Barré-Sinoussi

de l’Institut Pasteur à Paris [8]. Ils ont dénommé le virus LAV (Lymphadenopathy Associated

Virus), et C. Dauguet, leur collaborateur, a été le premier à visualiser ce virus à l’aide de son

microscope électronique.

En 1984, les équipes du Professeur Gallo et du Professeur Levy à San Francisco

isolent indépendamment le virus du SIDA qu’ils appellent HTLV-III (Human T-Cell

Leukemia Virus III) et respectivement ARV (AIDS Related Virus) [9, 10].

Ensuite, la situation dans la littérature spécialisée est devenue assez rapidement

confuse en raison de cette multiplicité de noms (LAV, HTLV-III et ARV) utilisés pour

désigner le même virus. Cette situation a été résolue en 1986, par l’Organisation Mondiale de

Santé qui prend la décision finale d’appeler le virus responsable du SIDA le Virus

d’Immunodéficience Humaine (VIH).

Actuellement dans le monde il y a deux espèces virales du VIH appelées VIH-1 et

VIH-2. Le VIH-2, isolé par le groupe du Professeur Montagnier en 1986 n’a que 40%

d’homologie avec le VIH-1, les différences étant situées surtout au niveau de leur enveloppe

externe. De plus, le VIH-2 a la particularité d’être localisé dans la partie Ouest de l’Afrique,

d’avoir un moindre potentiel infectieux que le VIH-1, d’évoluer plus lentement vers le SIDA

et d’être plus proche du virus de l’immunodéficience du singe (VIS) que le VIH-1 [11].

Les souches de type VIH-1 ont été classées en deux grands groupes: M, et O. Le

groupe M étant divisé en 9 sous-types qui peuvent être corrélés à des zones géographiques: A,

B, C, D, E, F, G, H, et NT (Figure 3). La majorité des mutations créant ces différences se

trouvent dans la région C2-V3 de la glycoprotéine de l’enveloppe virale et dans les protéines

de la capside.


16

Figure 3: Répartition géographique mondiale des sous-types du VIH-1

(« Le Monde » 21 mai 2003) Cette extraordinaire variabilité du VIH-1 est le résultat du fait que la transcriptase

inverse (TI) produit une erreur tous les 2000-5000 nucléotides polymérisés [12], auquel

s’ajoute le taux extrêmement élevé de réplication du virus qui atteint environ 1010 de

particules virales produites chaque jour [13, 14].

Etant la source de cette variabilité virale inquiétante et impossible à contrôler, la

transcriptase inverse (TI) est devenue une des principales cibles thérapeutiques anti-VIH.

II.2 La structure du VIH-1

L’étude de la structure du VIH a été une des premières préoccupations des

scientifiques. Comprendre la complexité structurale du VIH et sa pathogenèse a été l’étape

primordiale qui a permis d’envisager et de développer des stratégies thérapeutiques efficaces.

Gelderblom et ses collaborateurs ont été les premiers à établir par microscopie électronique la

morphologie et la structure du VIH-1 [15].

Les virus matures du VIH-1 ont une morphologie sphérique d’un diamètre d’environ

100-120 nm et sont protégés par une membrane d’origine cellulaire formée d’une bicouche

lipidique transpercée de "spicules" composées des glycoprotéines globulaires de surface gp

120 et des glycoprotéines transmembranaires gp 41 (Figure 4). Initialement, le nombre de


17

"spicules" a été approximé à 72 par analogie avec le VIS (le Virus de l' Immunodéficience du

Singe) [16] mais des résultats récents ont montré que le VIH dispose d’approximativement 14

± 7 "spicules" Env par virion. [17]

Figure 4: Structure du VIH

(Source : Laboratoire du Pr. Dominique Dormont (CEA, Orsay)) Détail: Structure de la glycoprotéine d’enveloppe du VIH- 1

[18]

La protéine gp 41, insérée dans la membrane phospholipidique virale est liée de façon

non-covalente à la glycoprotéine gp 120 extérieure, principalement par l’association des deux

régions hydrophobes à l’extrémité carboxy-terminale (C-terminale - CHR) et amino-terminale

(N-terminale - NHR) (Figure 4 détail) [19, 20].

Cette glycoprotéine d’enveloppe est une des principales cibles pour les stratégies

thérapeutiques, car la gp 120 est responsable des processus de reconnaissance, co-

reconnaissance et d’ancrage du virus dans la cellule hôte. La gp 41, par son extrémité N-

terminale et une partie de la région centrale qui sont exposées à l’extérieur du virus, détient un

rôle clef dans le processus de fusion virale [21, 22].


18

Sous la membrane extérieure, les protéines de la matrice (MA, ou p17) forment une

sous-couche et les protéines de la capside (CA, ou p24) délimitent le cœur du virus, en forme

de cône.

Le VIH-1 appartenant à la famille des rétrovirus, le matériel génétique est constitué

par deux simples brins identiques d’ARN confinés par les protéines de la nucléocapside (NC,

ou p7). Afin d’assurer sa réplication dans les cellules hôtes humaines, le VIH doit convertir

les brins d’ARN en molécules d’ADN viral par le processus de transcription.

Outre le matériel génétique viral, à l’intérieur de la nucléocapside, le VIH possède

trois enzymes essentielles à sa réplication (la transcriptase inverse (TI), l’intégrase (IN) et la

protéase (PR)) ainsi que d'autres protéines virales (p6, Tat, Rev, Vif, Nef, Vpr et Vpu) et

cellulaires (ex. actine).

La transcriptase inverse catalyse la transcription de l’ARN virale simple brin en un

ADN double brin qui va être inséré par l’intégrase dans le génome de la cellule hôte. Le rôle

de la protéase est d’ajuster la longueur de chaque protéine virale synthétisée dans la cellule

hôte, processus appelé maturation virale.

Parce que l’activité de chaque enzyme virale est indispensable à la survie et à la

multiplication du VIH, elles sont devenues des cibles thérapeutiques de choix dans le combat

contre le VIH.

Connaître et comprendre le mécanisme complet du fonctionnement du VIH-1 implique

aussi une bonne compréhension de son génome. Ainsi, les scientifiques qui ont étudié le sujet

ont découvert que le matériel génétique du VIH-1 est constitué, comme pour tous les

rétrovirus, de trois gènes principaux : gag, pol et env et de six gènes supplémentaires codant

pour des protéines dites accessoires assurant différents rôles de régulation : Tat, Rev, Vif,

Nef, Vpu et Vpr.

Le gène gag code pour les protéines structurales : de la matrice, de la capside, de la

nucléocapside. La protéine p6, le gène pol (pour POLymérase) code pour les enzymes

virales : la protéase, la transcriptase inverse et l'intégrase. Le gène env (pour ENVeloppe)

code pour les protéines d'enveloppe, les glycoprotéines transmembranaires et de surface. Le

produit de ces gènes est généré sous la forme de précurseurs (polyprotéines) qui sont rendus

fonctionnels par l’action de clivage de la protéase [23, 24].


19

II.3 Cycle de réplication du VIH

Le mécanisme de réplication du VIH peut être résumé en six étapes principales. Ces

étapes, schématisées dans la Figure 5, vont être détaillées dans les paragraphes suivants.

Figure 5 : Cycle de réplication du VIH

1. L’entrée virale est un processus complexe caractérisé par 4 sous-étapes :

reconnaissance, fixation, fusion et décapsidation.

Le VIH-1 cible particulièrement les lymphocytes T CD4+, les macrophages et les

cellules du système nerveux (plus particulièrement les macrophages de la moelle osseuse et

du cerveau et les astrocytes) [25]. La reconnaissance et l’attachement entre le virus et les

cellules visées se réalisent par l’intermédiaire de la glycoprotéine de surface du virus, gp 120,

et des récepteurs présents sur la membrane cellulaire [26]. Les plus connus des récepteurs

cellulaires sont :

5. Traduction


20

i) le CD4 – le plus fréquent et le plus important récepteur, qui est présent sur la

membrane cellulaire des lymphocytes T4 et des macrophages [25]. Le site d’interaction du

CD4 avec la gp 120 se trouve dans la dépression formée à l’interface des trois domaines :

interne, externe et le pont central [27] (Figure 6A). La boucle V3 joue également un rôle

important dans ce processus de reconnaissance.

ii) les corécepteurs (récepteurs des chimiokines). Parmi la grande diversité des

corécepteurs des chimiokines existants à la surface des cellules humaines, il y en a deux plus

particulièrement importants, le CXCR4 et le CCR5 qui favorisent l’entrée du VIH-1 dans les

lymphocytes, les monocytes et les macrophages [28]. Agissant après la fixation de la gp 120

sur le récepteur, les corécepteurs interagissent avec la gp120 au niveau de la boucle V3

(Figure 6A et 6B – exemplifié sur le CCR5) afin de renforcer l’interaction virus - cellule.

iii) le galactosylcéramide (GalCer), présent à la surface des cellules nerveuses, des

cellules épithéliales du colon et des fibroblastes [29, 30], est un récepteur glycosphingolipidique

avec une affinité très prononcée pour la même boucle V3 de la gp 120 [31, 32] (Figure 6A).

http://www.theses.ulaval.ca/2005/22933/ch02.html

Figure 6 : Représentation schématique de la gp 120 (composée de cinq régions constantes intercalées entre cinq régions variables (V1 à V5)) et les sites d’interaction avec les récepteurs

et corécepteurs cellulaires

Apres ancrage, la glycoprotéine gp 41 se charge de réaliser la fusion entre la

membrane virale et la membrane cellulaire. Suite à la fusion virus –cellule, la nucléocapside

virale pénètre à l’intérieure de la cellule hôte et se libère par décapsidation.

Connaissant les détails de l’interaction virus – cellule, plusieurs approches

thérapeutiques ont été imaginées afin de bloquer l’infection par le VIH-1 au niveau de son

entrée dans la cellule. Comme nous venons de le voir, la boucle V3 est une cible essentielle

A B


21

qui une fois bloquée pourrait stopper l’entrée virale, aussi bien dans les cellules comportant

comme récepteur le CD4 ou le GalCer.

2. Rétrotranscription

Après décapsidation, l’ARN viral est largué dans le cytoplasme cellulaire et forme un

complexe avec la transcriptase inverse qui va catalyser la rétrotranscription de cet ARN

simple brin en ADN complémentaire double brin.

Des études ont montré que la rétrotranscription débute assez rapidement, l’ADN viral

devenant détectable seulement 4 heures après l’infection par le VIH-1 [33]. Cette observation

constitue une raison de plus pour intensifier les efforts thérapeutiques vers le développement

d’inhibiteurs efficaces de l’entrée virale du VIH-1.

3. Intégration

Une fois l’ADN synthétisé, il forme un complexe de preintégration avec l’intégrase et

d’autres protéines virales puis il est transporté dans le noyau cellulaire à travers les pores de la

membrane nucléaire [25]. Dans le noyau, l’intégrase accomplit sa mission et insère l’ADN

viral dans l’ADN de la cellule. De cette manière la cellule hôte est transformée en un

provirus.

4. Transcription

Le génome proviral détient maintenant le contrôle de la machinerie de synthèse

cellulaire et, en s’exprimant par l’intermédiaire de l’ARN polymérase il va détourner tous les

organites cellulaires dans son propre but : la synthèse des protéines nécessaires à sa propre

reproduction.

L’ARNm (messager) une fois synthétisé va être exporté dans le cytoplasme.

5. Traduction

Pendant cette étape commence la synthèse effective des éléments viraux sous le

contrôle de l’ARN messager qui est traduit en polyprotéines (Gag, Gag-Pol et Env) et en

protéines fonctionnelles (Tat, Nef et Rev).

6. Assemblage, maturation et bourgeonnement

L’ARN viral et les protéines virales Gag et Gag-Pol sont assemblés dans des particules

virales immatures au niveau de la membrane cellulaire et partiellement libérés par


22

bourgeonnement. Ces particules vont subir un processus de maturation et vont devenir

infectieuses suite à l’action de la protéase sur les protéines Gag et Gag-Pol qui vont être

clivées et transformées dans la capside conique par les enzymes virales actives [34-37].

La maturation se produit durant l’assemblage à la surface de la membrane cellulaire

humaine et/ou après le bourgeonnement des particules virales dans le milieu extracellulaire [38].

Il est important également de souligner que les glycoprotéines virales gp 120

bourgeonnent à la surface des cellules humaines infectées par le VIH. De ce fait, ces cellules

acquièrent une affinité pour les cellules saines comportant des récepteurs CD4 avec lesquelles

fusionnent. Ce processus détériore également les cellules humaines, engendrant la formation

de syncitia [39] - cellules géantes comportant jusqu'à 500 noyaux.

III LA CHIMIOTHERAPIE DU VIH-1

Chacune des étapes du cycle de réplication du VIH offre une cible thérapeutique

potentielle pour le combattre. Actuellement il y a 21 principes actifs agréés par la FDA

(American Food and Drugs Administration) pour une utilisation clinique contre le VIH. En

fonction de leurs structure chimique et de leur mécanisme d’action, ces composés peuvent

être classés en 5 familles : i) inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (au

nombre de 7); ii) inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse (1) ; iii) inhibiteurs

non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (3) ; iv) inhibiteurs de la protéase (8) et v)

inhibiteurs de l’entrée virale (2) [40].

Initialement, le traitement des individus infectés par le VIH a consisté en

l’administration de principes actifs appartenant à une seule classe - la monothérapie. Les

résultats modestes enregistrés et surtout, l’apparition de résistance du virus au principe actif

ont conduit au remplacement de la monothérapie [41, 42] par la polythérapie (HAART – Highly


23

Active Antiretroviral Treatment) qui consiste en l’administration de trois ou plusieurs

principes actifs appartenant à deux ou plusieurs classes d’antirétroviraux.

Cette stratégie thérapeutique a conduit à une très importante diminution du nombre des

décès et à une augmentation de l’espérance de vie parmi les personnes infectées par le VIH

car elle diminue et maintient la charge virale plasmatique à un niveau inférieur à la limite de

détection, et ce pour une longue période [43, 44].

Pour le moment, la polythérapie est la meilleure stratégie pour combattre le VIH mais

elle présente aussi un nombre important d’inconvénients : les traitements sont rudes et

toxiques, il y a apparition de réactions secondaires (lipodystrophie, diabète, augmentation des

niveaux de triglycérides et de cholestérol, complications cardiovasculaires) et le plus grave –

la résistance du virus aux médicaments, conséquence de l’élimination incomplète du VIH [45-

47]. Connaissant ces limitations, la recherche de nouveaux traitements plus doux, et plus variés

est cruciale.

Les pages suivantes présenteront une mise au point bibliographique sur la thérapie anti

– SIDA, les principes actifs "classiques" et les nouvelles avancés tout en expliquant leur

mécanisme d’action. Les produits seront présentés en suivant chaque étape du cycle de

réplication du VIH.

Tout d’abord voici la définition de quelques paramètres biologiques importants qui

caractérisent l’activité antivirale in vitro :

- la concentration inhibitrice à 50% (CI50) est définie comme la concentration

minimale en composé nécessaire pour inhiber de 50% l’activité d’un marqueur du virus (ex.

la transcriptase inverse). Plus la valeur de la CI50 est faible, plus le produit est actif.


minimale en composé nécessaire pour inhiber de 90% la réplication du virus.

- la concentration cytotoxique à 50% (CC50) est définie comme la concentration létale

en composé pour 50% des cellules non infectées par le virus. Plus la valeur de la CC50 est

élevée, moins le produit est toxique.

- l’indice thérapeutique (IT) est défini comme le rapport entre la toxicité et l’activité

inhibitrice (CC50 / CI50). Plus la valeur de l’IT est élevée, plus le produit est efficace.


24

III.1 Inhibiteurs de l’entrée virale

L’entrée virale est un processus qui se développe en trois étapes : l’adsorption,

l’interaction des corécepteurs et la fusion. La première étape, qui consiste en l’interaction

entre la glycoprotéine virale gp120 et le récepteur cellulaire CD4, produit un changement

conformationel du complexe des deux récepteurs (gp120-CD4) qui permet l’intervention des

corécepteurs (CCR5 ou CXCR4) afin de renforcer le rapprochement virus – cellule. Les

études sur des cellules intestinales humaines HT-29 (CD4- /GalCer+/CXCR4+) ont montré que

dans le cas des cellules dépourvues du récepteur CD4, la gp120 utilise le GalCer et un

corécepteur (le CXCR4 dans le cas présent) afin d’initier cette première étape [48].

Dans l’étape suivante la glycoprotéine gp 41 forme un complexe à six hélices par

interaction entre ses deux régions hydrophobes NHR (N-terminale) et CHR (C-terminale) ce

qui favorise le rapprochement des deux membranes et leur fusion (Figure 7) [49, 50].

Dans les paragraphes suivants nous verrons les principaux inhibiteurs spécifiques à

chacune des étapes de l’entrée virale.

Figure 7: Schéma détaillé de l’entrée virale du VIH

III.1.1 Inhibiteurs de reconnaissance et de fixation

Les inhibiteurs de reconnaissance et de fixation interfèrent soit avec les récepteurs

(CD4, GalCer) ou les corécepteurs (CCR5, CXCR4) cellulaires soit avec les récepteurs viraux

(gp 120) afin d’empêcher l’adsorption du virus sur la cellule humaine.


25

III.1.1.1 Inhibiteurs des récepteurs cellulaires CD4

Une stratégie afin d’empêcher la formation du complexe gp 120-CD4 a été de masquer

les récepteurs CD4 avec des anticorps anti-CD4 [51]. Ainsi, l’utilisation d’anticorps

monoclonaux anti-CD4 (mAbs) ont conduit à des résultats prometteurs mais ils n’ont jamais

été considérés comme des principes actifs anti-VIH dû au risque immunosuppressif. Selon le

même concept, un nouvel anticorps anti-CD4 a été mis au point, le TNX-355 [52]. Administré

aux personnes infectées par le VIH, le produit a une bonne capacité à réduire la charge virale

plasmique et il se trouve en phase clinique II. Son avantage réside dans le fait qu’il ne

présente pas de danger immunosuppressif car, par rapport aux anticorps anti-CD4 qui ciblent

le domaine 1 du CD4, le TNX-355 interagit avec le domaine 2 du récepteur sans interférer

avec les fonctions immunologiques de celui-ci.

Une autre molécule capable de bloquer le récepteur cellulaire CD4 et, de cette

manière l’interaction CD4 – gp120, est un pentapeptide modifié par Neffe et Meyer [53]

(Figure 8). Les premiers résultats expérimentaux ont montré que le produit manifeste une

bonne constante de fixation (KD = 39µM) sur le CD4.

Figure 8 : Composé peptido – mimétique capable de bloquer le CD4


26

III.1.1.2 Inhibiteurs des glycoprotéines virales gp 120

Une des premières tentatives afin de bloquer la fixation du virus sur la cellule par le

biais de la gp 120, a été l’utilisation de fragments solubles de CD4 (sCD4) [54]. Les

expériences in vitro ont montré une bonne activité de neutralisation virale mais in vivo les

molécules ont présenté une faible efficacité. Dans le but d’améliorer l’affinité de fixation, la

société Progenics a synthétisé une protéine de fusion CD4-immunoglobuline appelé PRO542 [55]. Le produit possède une structure d’immunoglobuline modifiée avec des sites

d’attachement spécifiques aux récepteurs CD4 afin de mieux leurrer les gp 120 du VIH.

Contrairement aux sCD4, le PRO542 possède une très bonne activité anti-VIH-1 in vivo et in

vitro, et il se trouve en deuxième phase des tests cliniques. Toutefois, le principal

inconvénient du PRO542 reste son administration par voie intraveineuse.

Le BMS – 378806, un dérivé de 4-méthoxy-7-azaindole est un très bon inhibiteur de

l’infection par le VIH in vitro et in vivo. Lin et ses collaborateurs [56] ont montré que le

produit interagit avec le site de reconnaissance du CD4 situé sur la gp 120 [57]. Malgré sa

bonne biodisponibilité et ses faibles interactions avec les protéines, les tests cliniques sur le

BMS – 378806 ont été arrêtés en faveur de son analogue plus efficace BMS – 488043 (CI50 =

37nM) [58] qui a déjà dépassé les phases cliniques I et II (Figure 9).

Figure 9: Structures chimiques de deux inhibiteurs de petite masse moléculaire bloquant

l’interaction gp120-CD4

Les dérivés polyanioniques sont d’autres inhibiteurs efficaces de la gp 120. Cette

classe de molécules comprend des polysulfates, polysulfonates, polycarboxylates,

polyphosphates, polyphosphonates, polyoxometalates, etc. Par exemple, voici quelques

représentants parmi les plus connus de cette classe : le carrageenan (Carraguard) - fabriqué à

partir de carragénine, substance tirée des algues rouges, le polymère naphtalène sulfonate -

PRO 2000, l’analogue de cosalane [59], le sulfate de dextrine (D2S), le sulphate de cellulose et

la suramine (Figure 10). La suramine étant le tout premier principe actif anti-VIH identifié [60]

et utilisé dans le traitement clinique [61, 62].

BMS – 378806 BMS – 488043


27

Suramine

Figure 10: Exemple d’inhibiteurs polyanioniques de la gp 120

L’activité inhibitrice de ces composées réside dans le blocage des sites chargés

positivement de la boucle V3 de la gp120 par des interactions électrostatiques avec le

polyanion [63, 64] .

En raison d’une certaine toxicité et d’une faible efficacité in vivo, les dérivés

polyanioniques n’ont pas été agréés comme médicaments systémiques anti-VIH, mais en tant

que microbicides, ils se trouvent dans les dernières étapes des tests cliniques pour la

prévention de la transmission sexuelle du VIH [65, 66].

Le FP – 21399 (Figure 10) est un dérivée bis(disulfonaphtalenique) qui, administré par

injection intraveineuse, arrive a stopper l’infection par le VIH par fixation électrostatique au

niveau de la boucle V3 de la gp 120 [67]. La bonne activité antivirale semble être due a

l’accumulation dans les ganglions lymphatiques [68]. Ce produit se trouve dans la première

phase des tests cliniques et mis à part quelques effets secondaires mineurs, il semble très

prometteur [69].

Analogue de Cosalane

FP – 21399

n ~ 20 PRO 2000 D2S (MW 5000 – 50 000)


28

Des études sur des cellules épithéliales du colon humain[30, 70, 71] et sur des cellules

d’origines neuronale[72] ont montré que le VIH utilise le galactosylcéramide [29, 73] comme

porte d’entrée dans ces cellules démunies des récepteurs CD4.

De structure glycosphingolipidique, le galactosylcéramide, généralement nommé

GalCer comporte une seule unité de D-galactose fixée par une liaison β-O-glycosidique au

céramide, d’où le nom de Galβ1Cer (Figure 11). Le céramide à son tour, présente une D-

sphingosine liée par une fonction amide à un acide gras en C24 hydroxylé.

Figure 11: Structure chimique du galactosylcéramide (GalCer)

Etant identifié comme récepteur alternatif au VIH-1, en raison de son affinité

prononcée pour la boucle V3[74, 75] de la protéine virale gp 120 et de la reconnaissance

spécifique pour la séquence d’acides aminés 650-685 de la glycoprotéine virale gp41[76], le

galactosylcéramide a ouvert de nouvelles perspectives dans le domaine thérapeutique anti-

VIH. Ainsi, plusieurs groupes de recherche ont synthétisé et testé la capacité des analogues

synthétiques du GalCer à leurrer le VIH, essayant de cette manière de stopper la propagation

de l’infection virale.

Il est très important de souligner que les analogues synthétiques du GalCer, de par leur

capacité à reconnaître et à se fixer sur la boucle V3 de la gp 120, sont capables de neutraliser

l’infection par le VIH à la fois sur les cellules comportant le GalCer à leur surface mais aussi

sur les cellules lymphocytaires comportant le récepteur CD4 [77, 78]. Cette inhibition est

possible car une fois bloquée, par un effet de concurrence d’affinité, la boucle V3 n’est plus

capable d’initier l’interaction avec le récepteur cellulaire CD4, rendant impossible l’infection

virale des lymphocytes. De ce fait, les analogues synthétiques du GalCer représentent des

outils très prometteurs pour la thérapie anti-VIH.

D-galactose céramide

liaison β-O-glycosidique

acide gras en C24 hydroxylé

D-sphingosine

HO

3’


29

Le groupe de Bernardski a synthétisé les premiers analogues du GalCer afin de leurrer

le VIH et de l’empêcher d’entrer dans la cellule hôte en lui bloquant compétitivement l’accès

aux récepteurs gp 120. Ces premiers analogues synthétiques comportaient une liaison C- ou

O-glycosidique (Figure 12) et exprimaient une activité inhibitrice de l’étape de

reconnaissance cellulaire caractérisé par une CI50 de 150µM[79].

O

HO

HOOH

OH

O CH2 CH3

NH3

Cl

OH

12

analogue O-glycosidique

NH CH2 CH3

NH3

Cl

O

12

analogue C-glycosidique

O

HO

HOOH

OH

Figure 12: Analogues synthétiques C- ou O-glycosidiques du galactosylcéramide

De nouveaux analogues C- et aza-C- glycosidiques du galactosylcéramide (Figure 13)

ont été synthétisés et testés pour leurs capacités à bloquer la fixation du VIH sur le GalCer.

L’étude a mis en évidence que le dérivé aza-C- glycosidique possède une plus grande affinité

pour la gp120 que le GalCer tandis que le dérivé C- glycosidique possède une affinité

équivalente à celle du GalCer [80].

CH2 CH31O

analogue C-glycosidique

O

HO

HOOH

OH

CH2 CH31O

analogue aza-C-glycosidique

NH

HO

HOOH

OH

Figure 13: Analogues C- et aza-C glycosidique du galactosylcéramide

En respectant encore plus les caractéristiques structurales du GalCer nécessaires au

maintien de l’affinité avec la glycoprotéine gp 120, le groupe d’Isabelle Rico-Lattes a

synthétisé des analogues bicaténaires hydrosolubles du galactosylcéramide. Les tests

biologiques concernant leurs propriétés anti-VIH réalisés en collaboration avec l’équipe de

Jaques Fantini [78] ont montré que l’analogue le plus actif du GalCer était le composé CA52

(Figure 14). Ce produit arrive à inhiber la fixation de la suramine, inhibiteur polyanionique

précédemment décrit, sur la boucle V3 de la gp 120. Une concurrence peut exister entre ces

deux composés du fait que le CA52 se fixe sur la séquence d’acides aminés 318 – 323

(GPGRAF) bloquant partiellement le site de reconnaissance de la suramine (IQRGP-R-F) sur

la boucle V3 (Figure 14). En se fixant lui-même sur la boucle V3 du récepteur viral, le

composé CA52 s’est avéré capable d’inhiber l’entrée du VIH à la fois dans les cellules


30

épithéliales du colon HT-29 (qui comportent le récepteur GalCer mais pas le CD4) et dans les

cellules mononucléaires du sang périphérique - PBMC (comportent le récepteur CD4 mais

pas le GalCer). La valeur de la CI50 de 108 µM mesurée sur les cellules PBMC est similaire à

celle obtenue sur les cellules HT-29.

Figure 14: Structure du CA52 et des sites d’interactions caractéristiques

(flèche bleu pour la CA52 et en rouge pour la suramine) sur la boucle V3 de la

gp120 [78]

Après quelques années, dans ce même groupe, une nouvelle classe d’analogues

bicaténaires hydrosolubles du GalCer a vu le jour – les analogues catanioniques du

galactosylcéramide (Figure 15). L’originalité de ces composés consiste en leur simplicité de

synthèse car la liaison covalente entre les deux chaînes alkyles a été remplacée par une liaison

ionique, facilement obtenue par une réaction acido-basique. Même s’ils possèdent des

concentrations inhibitrices dans une large gamme (CI50 = 0,9 – 1000 µM, mesurées sur des

cellules lymphocytaires CEM-SS), ces composés se sont avérés peu efficaces, avec des

indices thérapeutiques faibles en raison de leur cytotoxicité [81] . Cette étude a permis de

vérifier que l’activité inhibitrice et la toxicité de ces composés semblent être directement

proportionnelles à leur hydrophobie. La toxicité de ces dérivés bicaténaires hydrosolubles du

GalCer a été expliquée par leur incorporation dans la membrane plasmique en raison de

l’affinité des chaînes alkyles pour la membrane, ce qui engendre la perturbation des fonctions

cellulaires.

Figure 15: Analogues catanioniques bicaténaires hydrosolubles du galactosylcéramide


31

Une autre stratégie adoptée afin d’améliorer l’activité anti-VIH des analogues du

GalCer a été d’augmenter le nombre de sites actifs afin de favoriser et de stabiliser

l’association avec le virus. En partant de cette idée, de nouveaux analogues géminis du

GalCer et des dendrimères catanioniques analogues du GalCer ont été synthétisés comportant

2 et respectivement 6 ou 12 sites actifs (Figure 16).

O

OH

HOOH

OH

OH

HOOH

OH

O NH2

n

C

O

O

10C

O

O

O

OH

OHHO

HO

HO

OHHO

HO

ONH2

n

Figure 16: Analogues catanioniques géminis et analogues catanioniques dendrimères du

galactosylcéramide

Les résultats obtenus ont démontré que la partie hydrophobe de la molécule a une forte

influence sur l’activité anti-VIH de ces composées. Plus particulièrement, le composé Gemini

16 (Figure 16) a montré une excellente activité anti-VIH (CI50 = 0,5 µM, sur des cellules

lymphocytaires CEM-SS) et un bon indice thérapeutique (IT > 200). Cette valeur est

comparable avec celles de l’AZT et du DDI, deux principes actifs anti-VIH déjà utilisés en

chimiothérapie [81].

En ce qui concerne les dérivés dendrimères [82], les tests biologiques réalisés in vitro

ont montré que l’effet de multiplicité de sites actifs augmente considérablement l’activité

antivirale de ces composés (Tableau 1). Ainsi, la concentration inhibitrice du composé

dendritique G12 est de seulement 1,1 µM (testé sur cellules CEM-SS). Malheureusement,

cette bonne activité antivirale est mise en défaut par l’importante cytotoxicité du produit (2,9

µM). Cette cytotoxicité a été associée à la conformation en "chou-fleur" adoptée par ces

Gemini 16 n=12

Dérivé dendritique G12



32

produits, forme qui favorise, comme dans le cas des analogues bicaténaires précédemment

présentés, l’incorporation dans les membranes cellulaires.

Il faut cependant souligner que dû à la multiplication des sites actifs, ces composés

dendritiques sont plus actifs in vitro que l’aminolactitol constitutif testé individuellement

(CI50 = 50 µM). Un simple calcul concernant l’activité inhibitrice par site de reconnaissance

(RCI50 - tableau 1), a révélé que l’activité inhibitrice des composés multisites (dendrimères)

est plus efficace par rapport à celle du même nombre de monosites. Toutefois, les valeurs

RCI50 proches (12,6 et 13,2) enregistrées pour les deux dérivés dendritiques comportant

respectivement 6 et 12 sites actifs montrent que pour cette famille des composés l’effet de

multiplicité de sites reste limité par l’encombrement stérique.

Composés CI 50 (µµµµM) CC50 (µµµµM) IT RCI 50 (µµµµM)

(*CI 50)

L16

1

50

70

1,4

50


6

2,1

3,5

1,7

12,6


12

1,1

2,9

2,6

13,2

(N x CI50 = RCI50, représente la concentration inhibitrice normalisée, exprimée comme la concentration inhibitrice du catanionique dendritique multipliée par le nombre de sites actifs, N)

Tableau 1 : Résultats biologiques des analogues catanioniques dendritiques

[83]

Une description plus détaillée de cette famille de dendrimères catanioniques sera faite

dans le deuxième chapitre car ils ont une forte liaison avec les travaux de cette thèse.

Toutes ces études ont permis de déterminer une relation structure – activité biologique

du GalCer et de ses analogues synthétiques :

• les deux éléments constitutifs du GalCer : le sucre, comme partie hydrophile, et les

chaînes hydrophobes sont indispensables [84], l’activité étant perdue en utilisant

individuellement un de ces deux éléments.

• la nature du sucre "galactose" permet une grande spécificité d’interaction avec

l’enveloppe virale, tandis que l’utilisation du glucosylcéramide (GlcCer) mène à une

perte d’affinité [85].


33

• la configuration β de la liaison glycosidique est d’une grande importance pour un

ancrage efficace du GalCer à la gp120 [32, 86]. Le remplacement de la liaison β-O-

glycosidique avec une liaison β-C-glycosidique [79, 87] ou β-S-glycosidique [88]

semble minimiser ou annuler respectivement la capacité du galactose à interagir

avec la gp 120. De plus, quelques groupes de recherche ont montré que l’utilisation

d’un espaceur hydrophile placé entre le sucre et le lipide d’ancrage augmente

l’interaction spécifique entre l’hydrate de carbone et le récepteur protéinique [89, 90].

• la partie hydrophobe du GalCer doit être suffisamment longue pour une bonne

efficacité d’ancrage. Le groupe de I. Rico-Lattes a montré que l’effet hydrophobe

joue un rôle primordial dans le processus de reconnaissance [77], la présence d’une

chaîne d’acide gras à 16 atomes de carbone étant optimale. Ces résultats ont été

confirmés par le groupe de Silberger et Bhat [32], qui a démontré qu’en variant la

longueur de la chaîne de l’acide gras du GalCer de 16 à 24 atomes de carbone, la

différence d’efficacité d’ancrage n’était pas significative. Il y a donc un seuil pour la

longueur de cette chaîne d’acide gras à partir de laquelle l’activité des produits ne

peut plus être améliorée.

• l’hydroxyle en position 3’ n’est pas indispensable car sa sulfonation n’altère pas

l’affinité du GalCer pour la gp 120 [72].

• le nombre de sites actifs [82, 83, 85, 91] ainsi que la conformation [81] adoptée par ces

analogues du GalCer sont aussi des facteurs déterminants pour une bonne activité

antivirale.


34

III.1.1.3 Inhibiteurs des corécepteurs du VIH-1

En fonction de la nature des corécepteurs cellulaires impliqués lors de la fixation sur

la cellule hôte trois types de VIH-1 peuvent être définis:

i) les virus VIH-1 R5 qui s’attachent aux corécepteurs CCR5 présents sur les

macrophages ;

ii) les virus VIH-1 X4 qui utilisent les corécepteurs CXCR4 existants sur les

lymphocytes T ;

iii) et les virus VIH-1 R5X4 qui peuvent interagir avec les deux corécepteurs

(CCR5 et CXCR4) infectant aussi bien les lymphocytes T que les macrophages.

L’utilisation d’inhibiteurs des corécepteurs empêchant l’interaction de ces derniers

avec le complexe gp 120 – CD4 (ou gp 120 - GalCer) constitue également une stratégie

thérapeutique prometteuse pour combattre l’infection par le VIH.

III.1.1.3.1 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5

Plusieurs grandes entreprises pharmaceutiques se sont lancées dans la recherche

d’inhibiteurs efficaces du CCR5 et ont ainsi pu identifier un nombre important de produits

susceptibles d’inhiber l’interaction gp 120 – CCR5. Parmi les composés les plus efficaces on

peut citer: SCH-C (SCH-351125) (IC90 >1µM) et SCH-D (SCH-417690 ou Vicriviroc) (CI50=

1,2 nM) développés par Schering-Plough [92]; TAK-779, TAK-220 (CI50 = 0,5 – 1,7nM) et

TAK-652 (CI50 = 0,5 – 2,4 nM) appartenant à Takeda Chemicals [93, 94]; UK-427,875

(Maraviroc) - propriété de Pfizer Inc. et GW873140[95] né de la collaboration Ono

Pharmaceutical et GlaxoSmith Kline [49, 96] (Figure 17). Deux de ces composés : Maraviroc et

Vicriviroc sont passés en 2007 en phase clinique III [97]. De plus, le 6 août 2007 le Maraviroc

a été agréé par l’administration américaine des médicaments (FDA) avec toutefois

d’importantes restrictions d’utilisation car il augmente le risque de crise cardiaque. Egalement

à titre indicatif, ce médicament commercialisé sous le nom de Selzentry ® fera partie des

traitements anti-rétroviraux fortement actifs (highly active antiretroviral therapy, HAART).

Même si ces résultats sont plutôt encourageants, l’inhibition des corécepteurs CCR5

peut avoir à long terme de graves répercussions [98]. Ainsi, Le Vicriviroc est déjà suspecté

d’être responsable de l’apparition de tumeurs malignes [99].


35

Figure 17 : Exemples de produits chimiques inhibant le corécepteur CCR5

Tous ces composés organiques de faible masse moléculaire ont une bonne

biodisponibilité orale et se trouvent en différentes phases des tests cliniques sauf le SCH - C

et le TAK779 qui ont été retirés en raison de réactions secondaires au niveau cardiaque.

Maraviroc UK-427,875

Vicriviroc SCH-D

GW873140

TAK-779

TAK-220

SCH-C

TAK-652


36

III.1.1.3.2 Inhibiteurs des corécepteurs CXCR4

Même si la recherche des inhibiteurs de CXCR4 a été devancée par les études des

inhibiteurs de CCR5, ils ne sont pas moins importants pour la thérapie anti-VIH. Il y a déjà

quelques classes de produits très prometteurs qui agissent comme inhibiteurs de CXCR4.

Deux dérivés peptidiques cationiques T22 [100] (Figure 18) et ALX40-4C [101], ainsi

qu’un produit de faible masse moléculaire, l’AMD3100 (Figure 19), ont été identifiés comme

inhibiteurs du VIH bien avant l’identification des corécepteurs en 1996.

Les inconvénients des dérivés peptidiques cationiques (T22 et ALX40-4C, un

polypeptide formé par neuf résidus d’arginine) sont le manque de biodisponibilité orale et la

complexité de synthèse qui peut conduire à des traitements onéreux.

HO2C - Arg -Arg - Trp - Cys - Tyr - Arg - Lys - Cys - Tyr

H2 - Arg - Cys -Lys - Arg -Tyr - Cys - Tyr

S

S

S

S

Lys

Gly

T 22

Figure 18: Structure du T22 (peptide cationique à 18 acides aminés)

Une classe importante d’inhibiteurs de CXCR4 est la famille des bicyclames [102]

(Figure 19). Le produit le plus performant utilisé pour le développement de ces nouveaux

agents anti-VIH a été le monocyclame AMD1498 qui présente une concentration active de

400 µM. Ultérieurement synthétisés, les bicyclames AMD1657 et AMD2763 se sont avérés

de bons inhibiteurs anti-VIH-1 et VIH-2 à des concentrations micromolaires (CI50 = 0,14 - 1,4

µM.) Des études complémentaires ont montré que les bicyclames liés par un pont aromatique

sont environ 100 fois plus efficaces que les bicyclames connectés par une chaîne

aliphatique[103].

Le composé AMD3100 a longtemps été le composé le plus actif de la série des

bicyclames aromatiques, de par sa capacité à bloquer la réplication du VIH-1 et VIH-2 à des

concentrations actives de 1-10nM [104]. Malgré une considérable activité anti-VIH manifestée

dans les phases cliniques I et II, les études sur l’AMD3100 ont été stoppées due à une

"efficacité sous-optimale". Il a été remplacé par un nouveau dérivé, AMD11070 (ou

AMD070) (CI50 = 1-15 nM sur cellules T) [105] qui présente une bonne biodisponibilité orale.


37

Toutefois, en raison d’une importante hépatotoxicité l’AMD 11070 n’a jamais dépassé

la phase II des tests cliniques [106].

Figure 19: Structures chimiques des inhibiteurs de CXCR4

Un autre inhibiteur de CXCR4 est le KRH-1636 (Figure 20) [96], un composé de faible

masse moléculaire qui a une bonne activité anti-VIH autant in vitro qu’in vivo. Les

expériences sur le rat ont montré que ce composé exprime une bonne biodisponibilité orale et

une bonne activité antivirale contre les souches X4 et R5X4 du VIH-1 (CI50 = 1 – 4,2 nM)

mais il n’est pas capable d’agir contre la souche R5 du VIH-1 [107].

Figure 20: Structure chimique du KRH-1636.

AMD1498 AMD2763

KRH-1636

AMD1657

AMD3100 AMD11070


38

III.1.1.3.3 Les inhibiteurs des corécepteurs CCR5 et CXCR4

Récemment, le groupe de Schols a présenté le premier inhibiteur qui a la capacité

d’agir à la fois au niveau des corécepteurs CCR5 et des corécepteurs CXCR4. Le produit de

faible masse moléculaire, dénommé AMD3451 est un analogue de N – pyridinylmethyl

cyclame (Figure 21) qui possède la particularité de bloquer l’entrée virale aussi bien pour le

VIH-1 R5 que pour le VIH-1 X4 et ce pour des concentrations inhibitrices variant entre 1,2 et

26,5 µM en fonction de la nature des cellules ciblées [108]. Les études ont montré que le

composé AMD3451 interagit différemment avec le CXCR4 que l’AMD3100, inhibiteur

spécifique de ce corécepteur. Pour le moment, les sites précis d’interaction entre l’AMD3451

et les corécepteurs CCR5 et CXCR4 restent toujours à identifier, mais sa capacité à bloquer

l’infection cellulaire des virus HIV-1 : R5, R5/ X4 et X4 lui offre une place privilégiée car

souvent le malade peut être infecté par un mélange de différents types de VIH-1.

Figure 21: Structure chimique d’un inhibiteur des corécepteurs CCR5/CXCR4

III.1.2 Les inhibiteurs de fusion

La glycoprotéine virale gp 41 est celle qui réalise la fusion entre la membrane virale et

cellulaire [109, 110]. Les deux régions de la gp 41 : la NHR et la CHR (N- et respectivement C-

terminale) peuvent représenter de bonnes cibles pour les inhibiteurs de l’étape de fusion du

VIH-1 (Figure 22).

Figure 22: Représentation schématique de la glycoprotéine virale gp 41 [69]

AMD3451


39

III.1.2.1 Inhibiteurs ciblant la région NHR de la gp 41

Pour le moment, le seul inhibiteur de fusion agréé par l’administration américaine des

médicaments (FDA) pour une utilisation clinique est l’enfuvirtide (ENF) connu aussi sous les

noms de : DP-178, T20 ou fuzeon. Le produit développé par les entreprises Trimeris et Roche

est un peptide synthétique comportant 36 acides aminés (Figure 23), dont la séquence a été

synthétisée afin de mimer la région CHR. Cette particularité structurale lui permet de se fixer

de manière compétitive sur la région NHR de la gp 41, empêchant l’ancrage de la région

virale CHR. Ainsi, le complexe à six hélices malformé entre l’enfuvirtide et NHR-gp 41 peut

stopper la fusion virus – cellule [111].

Bien qu’il soit très actif, son prix prohibitif et son manque de biodisponibilité orale,

font que l’enfuvirtide est utilisé seulement dans des cas particuliers pour les personnes

infectées par le VIH qui ne répondent pas ou plus aux polytherapies.

Figure 23: Structure de l’enfuvirtide [50]

Avec des modifications sur certains acides aminés est né le T-1249, une protéine de 39

acides aminés. Cet inhibiteur de fusion de deuxième génération mis au point par Trimeris et

Roche est de 2 jusqu'à 100 fois plus actif que le T20. Il a une demi-vie environ 2 fois plus

longue que le T20 et un profil de résistance virale différent de ce dernier, en étant actif contre

T 20


40

les virus résistants à T20. Malgré tous ces avantages, le T-1249 est bloqué dans sa phase II

des tests cliniques en raison de problèmes de formulation [112].

Pour pallier aux deux principaux inconvénients du T20 : son manque de

biodisponibilité orale et son prix trop élevé, le groupe de Jiang [113] a identifié deux dérivés du

pyrrole, le NB-2 et le NB-64 (Figure 24) qui ont l’avantage d’être de petites molécules et de

bloquer la fusion du VIH-1 à des concentrations micromolaires. Ces composés se fixent au

niveau de la poche hydrophobe de la gp 41 par des interactions hydrophobes et ioniques. Des

tests ont montré que l’absence du groupement COOH conduit à une perte d’activité. L’activité

antivirale de ces composés NB-2 et NB-64 n’est malheureusement pas assez importante pour

pouvoir les considérer comme de futurs médicaments, mais comme des pionniers d’une

nouvelle génération d’inhibiteurs de fusion de faible masse moléculaire.

Figure 24: Structures chimiques des dérives du pyrrole : B-2 et B-64

III.1.2.2 Inhibiteurs ciblant la région CHR de la gp 41.

Comme la région NHR de la gp 41, la région CHR peut représenter une cible pour les

inhibiteurs de fusion du VIH-1. Le premier inhibiteur de fusion de la région CHR a été le

DP107 ou T21, un peptide à 38 acides aminés [114, 115]. Ce composé peut bloquer la fusion

entre le VIH-1 et la cellule humaine en se fixant sur la région CHR de la gp 41, et stoppant de

cette manière l’interaction indispensable au processus de fusion entre les deux régions NHR

et CHR.

Un nouvel inhibiteur de fusion de la région CHR, le 5-Helix [116] manifeste un bon

potentiel pour la thérapie anti-VIH. En effet, bien qu’il nécessite une administration par voie

parentérale, cet inhibiteur peut être synthétisé à grande échelle et à moindre coût que le T20.

Même s’il présente quelques avantages, le principal inconvénient de ce composé réside dans

la difficulté à obtenir sa conformation spécifique active [49].


41

Le dérivé de l’acide bétulinique RPR 1036011 (Figure 25) est un composé non-

peptidique, de faible masse moléculaire qui a été décrit comme inhibiteur anti-VIH-1 avec

une CI50 de 10nM [117]. Même si le mécanisme exact d’action reste inconnu il y a des indices

qui montrent l’interaction du RPR 103611 avec la gp 41.

Figure 25: Structure chimique de l’inhibiteur de fusion RPR 103611, un dérivé de

l’acide bétulinique

III.1.3 Inhibiteurs de la décapsidation (de la nucléocapside virale)

Des composés comme le 3-nitrosobenzamide (NOBA), le 2,2’-dithiobisbenzamide

(DIBA), et l’azodicarbonamide (ADA) (Figure 26) interfèrent avec les processus de

désassemblage de la nucléocapside virale (NCp7) et le largage des constituants viraux dans la

cellule humaine [118, 119]. Ces études ont montré que ces produits s’amarrent au niveau des

deux domaines nommés "doigts de zinc" de la nucléocapside virale, sans affecter les "doigts

de zinc" des protéines cellulaires humaines.

Figure 26: Structure schématisée de la Cp7 et structure chimique de l’ADA

L’azodicarbonamide (ADA) est le premier composé appartenant à cette classe

d’inhibiteurs de la NCp7 qui a dépassé les deux premières phases d'essais cliniques. Bien que

l’ADA soit un inhibiteur des "doigts de zinc" de la nucléocapside virale, il semble que son

action in vivo soit plus complexe et qu’il puisse interagir avec une multitude de cibles.

RPR 103611

Cp7


42

III.2 Inhibiteurs de la transcriptase inverse

III.2.1 Structure et activité de la transcriptase inverse

La transcriptase inverse (TI) du VIH-1 catalyse la synthèse de l’ADN proviral en

utilisant comme référence l’ARN viral. Cette enzyme est composée de deux sous unités

dénommées p66 et p51 (respectivement 66kDa et 51kDa), chacune d’entre elles ayant quatre

sous domaines nommés : "doigts", "paume", "pouce" et "connexion" (Figure 27) [120]. Les

trois premiers sous domaines appartenant au p66 agissent comme une pince qui fixe l’ARN au

site actif de la polymérase (POL sur la Figure 27) qui réalise la synthèse de l’ADN viral. Le

p66 contient un domaine supplémentaire (RNaseH) de 120 acides aminés qui accomplit

l’activité d’endonuclease (la dégradation des intermédiaires ARN-ADN formés pendant

l’activité de la polymérase) [121].

Figure 27: Structure de la transcriptase inverse du VIH-1

Les principes actifs antirétroviraux qui ciblent la transcriptase inverse du VIH-1

peuvent être classés en fonction de leur structure chimique et de leur mécanisme d’action en:

inhibiteurs nucléosidiques (INTI), inhibiteurs nucléotidiques (INtTI) et inhibiteurs non-

nucléosidiques (INNTI).

III.2.2 Inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse.

L’ère thérapeutique des inhibiteurs de la TI commence en 1985 par la découverte de

l’activité antirétrovirale de l’azidothymidine (Zidovudine, AZT), un composé synthétisé en

1964 en tant qu’anticancéreux.


43

A présent, il y a sept inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI)

agréés pour le traitement contre les infections par le VIH : zidovudine (AZT), didanosine

(ddI), zalcitabine (ddC), stavudine (d4T), lamivudine (3TC), abacavir (ABC) et emtricitabine

((−) FTC) (Figure 28).

Figure 28: Structure des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (ITI)

agréés comme principes actifs anti-VIH

Connus aussi sous le nom d’analogues 2’, 3’-didéoxynucléosidiques, ces inhibiteurs de

la transcriptase inverse doivent subir in vivo, sous l’activité de la nucléoside kinase, trois

étapes de phosphorylation qui transforment le produit successivement en son analogue 5’-

monophosphate, 5’-diphosphate et 5’-triphosphate. Cette forme triphosphate constitue la

forme active qui agit comme inhibiteur compétitif / substrat alternatif pour l’enzyme ciblée, la

transcriptase inverse. Une fois incorporé dans l’ADN, le INTI stoppe inévitablement la

croissance de l’ADN viral en raison de l’absence d’un groupement OH en position 3’ qui est

nécessaire pour la formation d’une liaison ester avec le groupement phosphate du nucléotide

suivant (Figure 29) [122].


44

Figure 29: Mécanisme d’action des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase

inverse, en prenant comme exemple le premier représentant de la classe, l’AZT [122]

Quoique les INTI soient très efficaces, pouvant diminuer la charge virale du VIH dans

le plasma jusqu'à une quantité presque négligeable, ils présentent de graves effets secondaires

manifestés principalement par une forte toxicité et l’apparition de résistance du virus aux

médicaments en raison de ses multiples mutations. Ainsi, le plus grand défi pour concevoir de

nouveaux inhibiteurs nucléosidiques actifs réside dans la conception de principes actifs

évitant ces deux grands inconvénients. Il existe déjà un nombre important d’analogues 2’, 3’-

didéoxynucléosidiques qui sont actuellement testés cliniquement. Parmi ces composés se

trouve : le reverset, le SPD 754 ((-) dOTC) et l’amdoxovir (Figure 30). Ces nouveaux INTI

sont actifs contre distincts variants du VIH-1 qui ont acquis une résistance au traitement avec

les inhibiteurs nucléosidiques classiques comme le lamivudine ou l’AZT [123].

Figure 30: Structures de nouveaux ITI


45

III.2.3 Inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse.

Les inhibiteurs nucléotidiques de la transcriptase inverse ont le même mécanisme

d’action que les inhibiteurs nucléosidiques mais ils comportent un groupement phosphate afin

de diminuer le nombre d’étapes d’activation nécessaires. Au lieu de la triple phosphorylation,

les composés de cette classe exigent seulement deux étapes de phosphorylation qui leur

permettent d’éviter la première étape de mono phosphorylation qui est la plus lente. Pour le

moment le ténofovir est le seul inhibiteur nucléosidique agréé comme principe actif anti-

SIDA. A présent, le ténofovir, utilisé sous sa forme orale de disoproxil fumarate [124] (Figure

31) en combinaison avec 3TC et efavirenz (un inhibiteur non-nucléosidique de la transcriptase

inverse) semble être une des thérapies anti-SIDA les plus efficaces.

Figure 31: Structure chimique du ténofovir disoproxil fumarate

Ces inhibiteurs nucléosidiques et nucléotidiques de la transcriptase inverse se sont

révélés être des composants indispensables à la chimiothérapie du VIH, chaque régime de

traitement polythérapeutique contenant au moins un membre de cette classe de principes

actifs.

III.2.4 Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse

Les inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) sont des

inhibiteurs spécifiques de la réplication virale du VIH-1[125]. Ils interagissent directement avec

une poche allostérique de la transcriptase inverse située à approximativement 15 Å du centre

catalytique de l’enzyme [126]. Par ces interactions de nature hydrophobe [127], les INNTI

produisent un changement conformationnel de l’enzyme dont l’activité catalytique est

diminuée. Donc, les INNTI bloquent de manière non-compétitive l’interaction entre la

transcriptase inverse et le substrat.

Ces inhibiteurs sont actifs seulement sur le VIH-1 dont la transcriptase inverse est

capable de fixer les INNTI et non sur le VIH-2 ou d’autres rétrovirus.


46

L’ère des INNTI a commencé dans les années 90 avec la découverte des dérivés du

HEPT et TIBO (Figure 33) [128-130]. Depuis, plus de 30 classes de composés ont été identifiées

comme des INNTI. Parmi cette multitude de produits seulement 3 ont été acceptés par la FDA

pour le traitement anti-VIH : nevirapine, efavirenz et delaviridine [121] (Figure 32).

Figure 32: Structures des ITI agréés comme principes actifs anti-VIH-1

Malheureusement, les études ont montré que le traitement avec ces produits conduit à

l’apparition de la résistance virale. Plus inquiétant a été le fait qu’un seul type de mutation de

la transcriptase inverse engendrait souvent la résistance envers différents inhibiteurs non-

nucléosidiques [131].

Une deuxième génération de INNTI est actuellement développée afin d’éviter les

problèmes liés aux mutations [132, 133]. Des composés comme : l’emivirine, la tivirapine, la

capravirine [132, 134], le tiocarboxanilide [135], l’etravirine [136, 137] et la calanolide A [138] (le seul

inhibiteur non-nucléosidique naturel, extrait d’un arbre tropical – Calophyllum lanigerum)

sont autant de nouveaux candidats pour la thérapie anti-VIH (Figure 33).

HEPT

Emivirine

TIBO

Tivirapine

evirapine Efavirenz Delaviridine


47

Figure 33: Structures de nouveaux inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase

inverse

Même si les INNTI décrits ces seize dernières années sont structurellement différents,

ils présentent tous une conformation de type "papillon" avec une partie polaire centrale et

deux "ailes" latérales hydrophobes [139].

Malgré ces inconvénients de résistance virale, les inhibiteurs non-nucléosidiques de la

transcriptase inverse jouent un rôle important en polythérapie intensive en raison de leur

grande sélectivité, leur toxicité relative réduite et une concentration active dans une gamme

nanomolaire [123].

III.3 Inhibiteurs de l’intégrase

L’intégrase (IN) est l’enzyme virale responsable de l’insertion du nouvel ADN double

brin viral dans le génome de la cellule hôte. Dans le cytoplasme cellulaire l’intégrase clive

deux nucléotides terminaux à chaque bout 3’ de l’ADN viral et forme de cette manière un

complexe de preintégration (Figure 34A). Le complexe est ensuite transporté dans le noyau et

les bouts 3’ de l’ADN viral sont directement insérés dans l’ADN cellulaire par des réactions

de transestérification (Figure 34B).

Figure 34: Schéma d’insertion de l’AD viral dans l’AD cellulaire

Capravirine Tiocarboxanilide Etravirine Calanolide A


48

Puisque le VIH-1, comme d’autres rétrovirus, ne peut pas se reproduire sans

intégration dans un chromosome hôte et puisque dans l’organisme humain il n’y a pas

d’homologue de l'intégrase, cette enzyme a été considérée comme une cible thérapeutique de

choix.

De nombreux composés ont été décrits comme inhibiteurs de l’intégrase du VIH-1 :

des composés poly-hydroxylés aromatiques (l’acide aurintricarboxylique), des analogues de

cosalane, des flavonones (quercetagetin), et encore plusieurs autres (Figure 35). Les produits

appartenant aux deux premières classes présentent une bonne activité inhibitrice à des

concentrations actives micromolaires malgré une possible interférence avec le complexe

gp120-CD4.

Figure 35: Structures chimiques de premiers inhibiteurs de l’intégrase du VIH

Le problème avec les inhibiteurs de l'intégrase est que même s’ils sont efficaces lors

des tests enzymatiques, leur activité anti-VIH en culture cellulaire peut être masquée par leur

cytotoxicité. Même s’ils expriment une activité antivirale, cela pourrait, au moins dans

quelques cas, être attribué à des actions antivirales qui ont visé d’autres étapes que

l’intégration dans le cycle de réplication du VIH. L’acide L-chicoric est représentatif d’une

telle situation (Figure 36). Cet acide a été rapporté comme inhibiteur de l’intégrase du VIH-1

dans la culture cellulaire mais en fait, des études ultérieures ont démontré qu’il doit son

activité anti-VIH à une interaction avec la boucle polycationique V3 de la gp 120 [140].

Figure 36: Structure chimique de l’acide L-chicoric

acide aurintricarboxylique

cosalane

quercetagetin


49

Les acides dicétoniques tel que le L-708,906 et le L-731,988 (Figure 37) se sont

montrés de véritables inhibiteurs de l’intégrase. Ces dérivés sont capables de bloquer

l’insertion des parties terminales 3’ de l’ADN viral dans l’ADN cellulaire [141]. De plus, le L-

708,906 ne perd pas son activité antivirale même s’il est ajouté dans la culture cellulaire 7

heures après l’infection, temps correspondent au début de l’intégration de l’ADN proviral [142].

Le composé S–1360 (Figure 37) a été le premier inhibiteur de l’intégrase ayant passé

les premières étapes des essais cliniques [143]. La concentration active de 20 nM et l’indice

thérapeutique d’environ mille font de ce composé un des meilleurs inhibiteurs de l’intégrase.

Récemment toute une nouvelle classe d'inhibiteurs de l’intégrase du VIH-1 a été

identifiée, celle du 5H-pyrano [2,3-d:-6,5-d '] dipyrimidine. Le composé le plus actif de la

série est le pyranodipyrimidine V-165 (Figure 37) qui arrive a inhiber la réplication du VIH-1

a une concentration active de 8,9 µM [144].

Figure 37: Structures des meilleurs inhibiteurs de l’intégrase

En 2007, Beatriz Grinsztejn [145] et ses collaborateurs ont rapporté qu’un nouvel

inhibiteur de l’intégrase dénommé raltegravir (MK-0518) a dépassé la phase II des tests

cliniques, ce qui en fait probablement le plus prometteur des dérivés de cette classe.

Administré en combinaison avec des principes actifs anti-SIDA (ténofovir et lamivudine) aux

malades ayant une charge virale de 5000 copies d’ARN par ml, le raltegravir arrive à

diminuer cette charge virale, après 24 mois au-dessous de 50 copies d’ARN par ml. Il y a

également peu de temps, le raltegravir dont la structure chimique est représenté ci-dessus [146,

147] a été agréé pour la phase III des tests cliniques. Cet inhibiteur de l’intégrase administré par

voie orale, commercialement connu sous le nom d’ISENTRESS™ (raltegravir), sera peut-être

L-708,906 S–1360

L-731,988

Raltegravir (MK-0518) Pyranodipyrimidine (V-165)


50

le premier principe actif de cette classe à être agréé pour le traitement du SIDA. Par rapport

aux autres substances actives anti-VIH, ce composé ne perturbe pas les niveaux de cholestérol

ou de triglycérides mais il manifeste quelques effets secondaires comme : nausées,

vomissements, fatigue, maux de tête et diarrhée.

III.4 Inhibiteurs de transcription (transactivation)

Au niveau de la transcription, l’expression des gènes du VIH-1 peut être inhibée par

des composés qui interagissent avec des facteurs cellulaires comme les protéines virales Tat [148] et Rev. Le rôle principal de la Tat est d’activer la transcription de l’ARN viral et celui de

la Rev de transporter l’ARNm viral du noyau dans le cytoplasme afin qu’il puisse coder pour

les protéines structurales du VIH-1 [149]. Donc, le ciblage de ces deux protéines virales peut

représenter une bonne stratégie d’intervention thérapeutique dans le cas de l’infection par le

VIH.

Une importante variété d’inhibiteurs du processus de transcription (de la Tat) ont déjà

été décrits : des fluoroquinolines (Fluoroquinoline K-37) [150, 151], flavopiridol [152], le

bistriazoloacridone temacrazine [153], neplanocin A, 3-deazaneplanocin A [154] et des analogues

des peptides qui miment différents domaines de la Tat comme le peptide CGP64222.

Toutefois, il semble que ce dernier composé interagisse initialement avec les corécepteurs

CXCR4, fait qui n’est pas surprenant si l’on tient compte de sa similarité structurale avec les

inhibiteurs peptidiques du CXCR4 [155] (Figure 38).

Figure 38: Structures chimiques de quelques inhibiteurs de la protéine virale Tat

Fluoroquinoline K-37 Flavopiridol

Temacrazine

X= : eplanocin A

X=CH : 3-Deazaneplanocin A

CGP64222


51

L’activité de la Rev peut être inhibée par la molécule de faible masse moléculaire PKF

050-638 [156], par les dérivés du N-aminoimidazole (NAIMS) dont la structure générale est

présentée ci-dessous et par l’ensemble de trois dérivés d’oxyde de pyridine JPL-32, JPL-88 et

JPL-133 [157, 158] (Figure 39). Les produits appartenant à ces deux dernières classes semblent

avoir un double mécanisme d’action. Ils inhibent le cycle de réplication du VIH en

interagissant autant sur la protéine virale Rev que sur la transcriptase inverse et ce, par le

même mécanisme que les inhibiteurs non-nucléosidiques [157, 159]. Par ailleurs le JPL-32

semble aussi être un inhibiteur de la Tat [149].

Figure 39: Structures chimiques de quelques inhibiteurs de la protéine virale Rev.

PKF 050-638 -aminoimidazole (AIMS)

X1, X

2 : Halogène, Alkyle

R : Alkyle, Aryle

Y : SH, H

Oxydes de pyridine JPL -32, -88 et 133


52

III.5 Inhibiteurs de la protéase

Une fois l'ADN viral intégré dans le génome de la cellule hôte, le génome proviral est

copié et traduit par les enzymes cellulaires afin de produire de grandes chaînes de

polypeptides connues sous le nom de polyprotéines Gag et Gag-Pol. La protéase du VIH-1

clive ces polyprotéines en de plus petites protéines structurales et fonctionnelles (la protéase

(p11), la transcriptase inverse (p66 /p51) et l’intégrase (p32)) permettant de cette façon au

virion d’arriver à maturité tout en préservant sa capacité à infecter d’autres cellules [149, 160].

La protéase du VIH-1 est une enzyme dimère formée par deux polypeptides identiques

associés de manière non covalente. Chacun des monomères comprend 99 acides aminés et

contient la séquence Asp-Thr-Gly qui fournit le groupement aspartique nécessaire au clivage

des polyprotéines par hydrolyse (Figure 40). Ce site actif de l'enzyme est localisé à l’interface

des deux monomères [121].

Figure 40: Structure tridimensionnelle de la protéase bloquée par un inhibiteur

spécifique (www.dsch.univ.trieste.it)

Les inhibiteurs de la protéase du VIH-1 interviennent dans cette étape tardive du cycle

de réplication et bloquent la formation de nouvelles particules virales infectieuses. Tous les

inhibiteurs de la protéase (IP) agréés pour le traitement des infections par le VIH : saquinavir,

ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, et atazanavir comportent le même

motif, soit une liaison d’hydroxyle d’éthylène (à la place de la liaison peptidique) qui confère

un caractère non-clivable à la molécule (Figure 41). Ainsi, ces sept IP agissent comme des

inhibiteurs peptidomimétiques de la protéase du VIH-1 [161].

Site catalytique Inhibiteur peptidomimétique


53

Figure 41: Structures des inhibiteurs de la protéase agréés pour traiter l’infection par le

VIH-1

Même s’ils sont très actifs, les inhibiteurs peptidomimétiques présentent quelques

inconvénients. L’inconvénient majeur est que le VIH-1 développe une résistance soit envers

un inhibiteur soit envers toute une classe d’inhibiteurs de la protéase [162]. De plus, la grande

majorité de ces principes actifs possèdent une faible biodisponibilité orale, en raison de leur

structure peptidique. Les effets secondaires comme une brusque augmentation du niveau de

cholestérol dans le sang et la lypodystrophie sont aussi inquiétants car il semble que ces

principes actifs interfèrent avec l’acide aspartique de la protéase humaine impliquée dans le

métabolisme des lipides [123]. A tous ces désavantages il faut ajouter que les inhibiteurs

peptidomimétiques ont le pire profil de toxicité de toute la gamme des principes actifs anti-

VIH-1 agréés pour une utilisation clinique.

Tipranavir est le premier composé non peptidique de faible masse moléculaire qui

arrive à inhiber la protéase du VIH-1 et celle du VIH-2. Encore plus important, avec une

concentration active de 30nM, le Tipranavir (Figure 42) est efficace sur 90% des virus VIH-1

résistants aux autres inhibiteurs de la protéase [163, 164]. Actuellement testé cliniquement, il

représente un grand espoir pour la thérapie anti-VIH.

Saquinavir Ritonavir

Indinavir sulfate

elfinavir

Amprenavir Lopinavir

Atazanavir


54

Figure 42: Structure du Tipranavir, le premier inhibiteur non peptidique de la protéase

Malgré leur toxicité reconnue, les inhibiteurs de la protéase sont indispensables pour la

polythérapie rétrovirale moderne et des recherches sont en cours pour trouver de nouvelles

molécules actives ciblant d’autres séquences de l’enzyme moins prédisposées à la mutation.

III.6 Polythérapies

La Zidovudine (AZT), le premier inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse

a été le principe actif pionnier utilisé dans la thérapie anti-VIH-1. Les expériences ont montré

qu’à court terme, le traitement précoce de la primo-infection par la zidovudine en

monothérapie permettait un meilleur contrôle de la charge virale, une remontée plus rapide du

taux de lymphocytes T CD4 et une réduction de la fréquence des infections opportunistes [165,

166].

Le développement de la résistance virale du VIH a conduit au remplacement de la

monothérapie qui était devenue inefficace par la polythérapie qui a pour but l’éradication du

VIH en attaquant simultanément différentes étapes du cycle de réplication du virus tout en

essayant d’obtenir la meilleure synergie entre les principes actifs, et en essayant de supprimer

l’émergence de virus résistants.

Actuellement il y a 21 principes actifs antirétroviraux disponibles pour le traitement du

VIH/SIDA. Pour obtenir le meilleur effet thérapeutique, ces substances actives doivent être

combinées en polythérapies efficaces. Cette stratégie connue aussi sous le nom de thérapie

antirétrovirale fortement active (highly active antiretroviral therapy, HAART) consiste en

l’utilisation des deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI) ou un INTI

et un inhibiteur nucléotidique de la transcriptase inverse (INtTI) auxquelles est ajouté un

inhibiteur non-nucléosidique de la transcriptase inverse (INNTI) ou un inhibiteur de la

protéase (IP) (Figure 43) [127].

Tipranavir


55

http://www.theses.ulaval.ca/2005/22933/ch02.html

Figure 43: Représentation des cibles thérapeutiques anti-VIH actuellement visées

La tendance actuelle est de commencer la thérapie anti-VIH avec des traitements sans

inhibiteurs de la protéase (IP) qui semblent générer à force d’utilisation prolongée des effets

secondaires tel que la lypodystrophie, le diabète et des problèmes cardio-vasculaires.

Les associations possibles des deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase

inverse qui se sont avérées efficaces et bien tolérées sont: zidovudine (AZT) - didanosine

(ddI), zidovudine (AZT) - zalcitabine (ddC), zidovudine (AZT) - lamivudine (3TC), stavudine

(d4T) - didanosine (ddI) et stavudine (d4T) - lamivudine (3TC) [167].

Afin d’éviter la lourdeur du traitement (un grand nombre de pilules à ingérer ou une

haute fréquence des prises), plusieurs combinaisons d’antirétroviraux se retrouvent

actuellement sous forme d’une pilule unique. C’est le cas de Trizivir (AZT+3TC+ABC

(Abacavir)), Triomune (d4T+3TC+NVP (névirapine (INNTI)) [168], Truvada® (ténofovir plus

emtricitabine) et Atripla® (ténofovir plus emtricitabine plus éfavirenz)[124].

D’autres régimes polythérapeutiques efficaces sont les combinaison : lamivudine

(NRTI) - ténofovir (INtTI) - efavirenz (INNTI), Combivir (zidovudine /lamivudine) /

éfavirenz, mais aussi Trizivir /éfavirenz [169].

Un nouvel espoir dans la polythérapie anti-VIH est l’utilisation de l’enfuvirtide (le

seul inhibiteur de fusion) qui est réservé pour le moment à la thérapie de dernier recours en

raison de son coût de fabrication prohibitif et de son administration sous-cutanée [127].


56

III.7 Le développement des systèmes de vectorisation pour la thérapie anti-VIH

Même si l’utilisation de multithérapies antirétrovirales fortement actives (highly active

antiretroviral therapy, HAART) a entraîné une chute significative de la mortalité associée au

VIH/SIDA cette stratégie se heurte à des inconvénients comme : le prix élevé des traitements,

une importante toxicité, des effets secondaires provoqués par une utilisation prolongée de

certains principes actifs, la mutation du virus, etc… [170].

Ces dix dernières années, la recherche de différents systèmes de vectorisation

biologiques ou non-biologiques pour la thérapie anti-VIH a reçu une importante attention. Le

développement de ces systèmes de vectorisation propose la délivrance spécifique au niveau

cellulaire de principes actifs anti-VIH. De cette manière, la dose de principe actif administrée

est réduite tout en améliorant l’efficacité biologique et en diminuant la toxicité du principe

actif [171].

Parmi les transporteurs cellulaires spécifiques non-biologiques on retrouve les

liposomes définis comme des vésicules microscopiques (25nm jusqu’à quelques µm), formés

d’une ou plusieurs bicouches de phospholipides qui entourent un compartiment aqueux. Ils

sont capables d’encapsuler autant des composés hydrophiles solubilisés dans la phase aqueuse

que des produits hydrophobes par incorporation dans la bicouche lipidique. Les études in

vivo sur des rats ont montré que l’administration intraveineuse de l’AZT (Zidovudine -

inhibiteur de la transcriptase inverse du VIH) encapsulé dans la phase aqueuse des liposomes

permet l’obtention d’un relargage continu et une demi-vie du principe actif supérieure à

l’utilisation d’une solution aqueuse d’AZT. De plus, l’administration d’AZT incorporé dans

des liposomes permet une meilleure accumulation du principe actif dans le système

réticuloendothélial (RES) ou le VIH réside et se multiplie [172]. Cet exemple n’est pas unique,

l’administration de la Stavudine (d4T, un autre inhibiteur de la transcriptase inverse du VIH)

encapsulée dans des liposomes a montré une augmentation de la concentration de ce composé

dans les macrophages, d’où une meilleure activité biologique que dans le cas d’utilisation du

principe actif seul [173].

L’encapsulation de principes actifs anti-VIH en utilisant des liposomes semble une

bonne alternative pour la thérapie du SIDA mais, cette technique n’est pas infaillible car les

liposomes ont une faible durée de vie dans le système sanguin. De plus, le faible taux

d’encapsulation et la présence de traces de solvant toxique due à la méthode de préparation

sont d’autres problèmes attachés à ce système de vectorisation [174]. Donc, de nouveaux


57

transporteurs cellulaires spécifiques ayant une meilleure stabilité in vitro et in vivo sont de

plus en plus recherchés.

Nous rappelons que les glycoprotéines virales gp 120 bourgeonnent à la surface des

cellules humaines infectées par le VIH, ce qui transforme la gp120 en une cible de choix pour

le développement des thérapies anti-VIH spécifiques [88]. Ainsi, les analogues synthétiques du

GalCer capables de former des vésicules stables, tout en ayant une forte affinité pour la gp

120 pourront être utilisés comme transporteurs spécifiques de principes actifs anti-SIDA

dirigés soit vers le VIH soit vers les cellules déjà infectées.

III.8 Inhibiteurs de l’étape de latence du VIH

Les traitements polythérapeutiques utilisés actuellement permettent de diminuer la

charge virale du VIH-1 dans le sang jusqu'à des niveaux indétectables et de rétablir les

fonctions immunitaires de l’organisme. Pourtant, le virus VIH n’est pas éradiqué. Il reste en

latence dans les lymphocytes T CD4+ inactives, cellules considérées comme des "réservoirs"

du VIH [45, 175]. Comme les lymphocytes, le VIH est lui même "endormi" et ne se multiplie

plus jusqu’à ce que les cellules immunitaires reprennent leur activité [176]. C’est pourquoi la

thérapie intensive anti-VIH n’est pas efficace à ce stade, rendant impossible l’élimination

complète du VIH [177].

Une approche originale pour le développement de médicaments anti-VIH a été réalisée

par Margolis [178] et ses collaborateurs qui ont mis au point une stratégie de réactivation des

cellules T CD4+ latentes afin de permettre au virus de s’exprimer, le rendant ainsi accessible

à un traitement renforcé. Ils ont employé pour cela l’acide valproïque (connu aussi sur le nom

commercial de Depakine) (Figure 44) - un principe actif fréquemment utilisé dans le

traitement de l’épilepsie- pour inhiber l’enzyme HDAC1 (histone déacétylase 1) responsable

de la latence des lymphocytes T CD4+.

(CH3CH2CH2)2CHCOOH

Figure 44: Structure chimique de l’acide valproïque

L’étude a été réalisée sur seulement 4 patients qui se trouvaient sous traitement

antirétroviral intensif depuis au moins 2 ans. Après une période de 3 mois d’intensification de

l’effet de HAART avec enfuvirtide (l’inhibiteur de fusion du VIH-1) et acide valproïque, les


58

chercheurs ont observé une diminution moyenne de 75% du nombre des cellules infectées en

dormance chez trois des quatre patients.

Ces tests préliminaires ont indiqué que l’efficacité thérapeutique de l’acide valproïque

ajouté à la polythérapie virale classique semble avoir des effets remarquables sur l’éradication

du VIH. Pourtant, des études supplémentaires sont nécessaires pour comprendre pourquoi le

traitement n’a été que partiellement efficace (seulement 3 des 4 volontaires testés). De plus, il

a été exprimé avec raison que cette stratégie est complètement dépendante de la réussite du

traitement antirétroviral classique et qu’elle n’apporte pas de réponse aux personnes en multi-

échec thérapeutique.

III.9 Le stade actuel du développement des vaccins anti-VIH

Aujourd'hui, le SIDA est la principale cause de mortalité en Afrique subsaharienne et

est considéré comme le quatrième grand tueur dans le monde. Environs 14 mille personnes

sont infectées par le VIH chaque jour et plus de 95% d’entre eux vivent dans des pays sous-

développés. L'espérance de vie dans certains pays d’Afrique du Sud où un quart ou même un

tiers de la population générale est infecté par le VIH-1, est passée de 65 ans dans les années

1985-1990 à 37 ans en 2000–2005. Cette situation montre l'urgence de développer un vaccin

efficace contre le SIDA, facile à administrer et accessible aux plus pauvres.

La première phase clinique concernant un vaccin contre le VIH a été menée aux USA

en 1987. Depuis, plus de 35 vaccins ont été testés en plus de 65 phases cliniques I/II

impliquant plus de 10 mille volontaires humains sains [179]. Seuls trois vaccins ont réussi à

atteindre la phase III des tests cliniques [180, 181]. Cependant, le monde scientifique est encore à

des années du développement d’un vaccin sûr et efficace contre le VIH en raison de multiples

défis restant encore à affronter [182].

Un des obstacles majeurs est la haute variabilité génétique du virus [183] car, comme

nous l’avons déjà précisé, il existe 2 groupes du VIH-1 : M et O, le groupe majoritaire M

pouvant être divisé en 9 sous-types: A, B, C, D, E, F, G, H, et NT. En se multipliant, le VIH

est capable de générer un très grand nombre de mutants chez un même individu, par

conséquent il devient particulièrement difficile de mettre au point un vaccin efficace contre

toutes les souches virales qui en résultent.


59

Le développement d'un vaccin efficace est retardé aussi par le manque de

connaissance des réactions immunitaires de protection [184], la difficulté de produire une large

gamme d’anticorps de neutralisation [185], l'absence de modèles animaux adaptés, la

complexité liée à la préparation et la faisabilité des tests cliniques à une grande échelle,

surtout dans les pays en voie de développement [186].

IV CONCLUSIONS

La découverte de la structure du VIH et la compréhension de son cycle de réplication

ont donné aux scientifiques les moyens de développer de nombreuses stratégies

thérapeutiques afin de combattre ce terrible virus.

Même si le VIH est vulnérable à chaque étape de sa réplication virale, pour l’instant

les principes actifs agréés pour l’utilisation clinique ciblent seulement trois de ces étapes :

l’entrée virale, la transcription et la maturation du VIH. Ces principes actifs utilisés en

différentes combinaisons constituent les régimes polythérapeutiques. A l’heure actuelle, la

polythérapie est le seul moyen de diminuer et de contrôler la multiplication virale, en évitant

le plus possible les mutations du VIH.

On doit souligner le fait que malgré le grand nombre de produits synthétisés afin de

stopper l’entrée du VIH dans la cellule humaine, l’Administration Américaine des

Médicaments a approuvé pour l’utilisation clinique seulement deux inhibiteurs de l’entrée

virale : l’enfuvirtide (inhibiteur de fusion) et le maraviroc (inhibiteur des corécepteurs CCR5).

Le premier est utilisé seulement dans la thérapie de dernier recours en raison de son prix élevé

de fabrication et de sa faible biodisponibilité. Quant au deuxième, malgré son efficacité, il

présente des dangers car il augmente le risque de crise cardiaque.

Les recherches qui font le sujet de cette thèse seront consacrées dans un premier temps

au développement de nouveaux inhibiteurs de l’entrée virale. Parmi la multitude des produits

capables de bloquer l’entrée du VIH dans la cellule hôte, nous nous sommes particulièrement

intéressés aux analogues du galactosylcéramide qui, comme nous l’avons présenté, inhibent

l’infection sur cellules CD4+. Les recherches réalisées précédemment dans notre groupe ont

montré que les analogues catanioniques du galactosylcéramide sont des leurres chimiques du

VIH très efficaces, présentant des activités antivirales prometteuses.


60

Ainsi, en s’appuyant sur l’expérience antérieure de notre laboratoire dans ce domaine,

l’étude actuelle aura pour but la synthèse et l’étude de nouveaux assemblages catanioniques

dendritiques, analogues du galactosylcéramide qui, par un effet de multiplicité de sites seront

utilisés comme leurres multivalents pour le VIH. Afin de diminuer leur toxicité cellulaire, due

à une éventuelle dissociation de l’entité catanionique, nous allons renforcer l’effet

hydrophobe entre les éléments constitutifs par ajout de chaînes alkyles sur le dendrimère.

L’étude des propriétés physico-chimiques, les tests biologiques ainsi que l’étude des

interactions et de l’incorporation de ces composés dendritiques catanioniques dans des

modèles membranaires nous permettrons d’établir une corrélation entre la structure,

l’hydrophobie, la conformation et l’activité biologique de ces produits.

Dans un deuxième temps, nous profiterons de la présence de la gp120 sur les cellules

infectées pour mettre au point une méthode de vectorisation spécifique à l’aide de vésicules

formées par une nouvelle famille d’analogues catanioniques du GalCer – les dérivés

bicaténaires mixtes fluorés / hydrogénés. L’étude des propriétés physico-chimiques et

biologiques nous aideront à déterminer les caractéristiques structurales optimales afin

d’obtenir un système efficace de vectorisation de principes actifs anti-VIH.


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68

Chapitre II

Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du

VIH

Chapitre II Synthèse, propriétés biologiques et physico-chimiques de nouveaux leurres du VIH

71

I ITRODUCTIO ......................................................................................... 73

II ITERET DES DERIVES CATAIOIQUES DEDRITIQUES AALOGUES DU

GALCER .................................................................................................... 74

III SYTHESE DE OUVEAUX TESIOACTIFS CATAIOIQUES DEDRITIQUES

AALOGUES DU GALCER.......................................................................... 79

III.1 Synthèse des dendrimères catanioniques analogues du GalCer.......................... 79

III.2 Analyse structurale par résonance magnétique nucléaire................................... 81

IV ETUDE DE L’ASSOCIATIO DES DEDRIMERES CATAIOIQUES A

L’ITERFACE EAU / AIR............................................................................. 83

IV.1 La technique de la balance de Langmuir ............................................................ 83

IV.2 Etude des monocouches d’amphiphiles catanioniques dendritiques par la

technique de la balance de Langmuir ................................................................. 85

V PROPRIETES BIOLOGIQUES DE OUVEAUX CATAIOIQUES

DEDRITIQUES AALOGUES DU GALCER................................................. 89

V.1 Caractéristiques biologiques................................................................................ 89

V.1.1 Paramètres biologiques ............................................................................................... 89 V.1.2 Lignées cellulaires et souches virales.......................................................................... 90 V.1.3 Présentation de la méthode utilisée ............................................................................. 90

V.2 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des dendrimères catanioniques analogues

du GalCer............................................................................................................ 91

VI ETUDE DE L’ITERACTIO ET DE L’ICORPORATIO DES DEDRIMERES

CATAIOIQUES VIS-A-VIS D’U MODELE MEMBRAAIRE ...................... 96

VII PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES CATAIOIQUES DEDRITIQUES

AALOGUES DU GALCER........................................................................ 107

VII.1 Etude des propriétés tensioactives ..................................................................... 107

VII.2 Etude de la distribution de taille des agrégats................................................... 111

VII.3 Etude de la morphologie des agrégats............................................................... 113

VIII COCLUSIOS ET PERSPECTIVES......................................................... 120

IX BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................... 123


72


73

I INTRODUCTION

La mise au point bibliographique sur le VIH comprenant les thérapies actuellement

disponibles pour le combattre nous a montré la nécessité de développer de nouveaux

inhibiteurs de l’entrée virale. Il devra s’agir de composés efficaces et bon marché qui pourront

être utilisés dans les traitements antirétroviraux fortement actifs afin de stopper l’infection par

le VIH-1.

À la lumière des faits présentés ci-dessus et en s’appuyant sur les travaux réalisés

précédemment au laboratoire, les études de cette thèse seront centrées dans un premier temps

sur la synthèse de nouveaux analogues catanioniques du GalCer qui grâce à leur affinité pour

la glycoprotéine virale gp 120 peuvent agir comme des chimères pour le VIH-1. Afin

d’optimiser leur efficacité en tant que leurres, nous nous intéresserons principalement aux

composés comportant plusieurs motifs analogues du GalCer dans le but d’exploiter l’effet de

multiplicité de sites de reconnaissance. Dans cette optique, de nouveaux composés

catanioniques dendritiques comportant 12 sites de reconnaissance seront synthétisés. Au cours

de ces travaux l’accent sera mis sur la stratégie permettant de diminuer la toxicité cellulaire de

ces composés.

Par la suite nous présenterons la capacité de ces composés dendritiques à remplir leur

rôle d’inhibiteurs de l’entrée virale tout en vérifiant leur viabilité cellulaire. La quantification

de l’efficacité antivirale sera réalisée par des mesures de l’activité anti-VIH-1 et de la

cytotoxicité.

Afin de mieux comprendre la relation entre l’activité antivirale, la cytotoxicité et les

caractéristiques structurales de ces produits une corrélation entre les propriétés biologiques et

physico-chimiques sera établie. Cette relation permettra ainsi d’envisager de nouvelles

structures de composés catanioniques analogues du GalCer toujours plus efficaces d’un point

de vue thérapeutique.


74

II INTERET DES DERIVES CATANIONIQUES DENDRITIQUES ANALOGUES DU GALCER

La partie sucre des glycosphingolipides fonctionne comme récepteur de différents

agents pathogènes et suscite encore de nombreuses recherches car l’interaction sur un seul site

hydrate de carbone – protéine est souvent de faible affinité 1. La nature à su résoudre ce

problème en rassemblant les hydrates de carbone à la surface cellulaire sous forme de

"clusters", ce qui renforce les interactions par un effet multisites [1, 2]. Ainsi, par cet effet de

multiplicité de sites, l’affinité finale est supérieure à la somme des interactions individuelles

hydrate de carbone – protéine.

Ce principe de multiplicité de sites a été adopté et employé dans le domaine

biomédical afin d’obtenir une meilleure inhibition d’un agent pathogène. Le groupe de

Whitesides [3] a souligné l’effet inhibiteur supérieur des inhibiteurs multivalents par rapport

aux inhibiteurs monovalents. Ces derniers empêchent la fixation du virus à la surface

cellulaire par une inhibition compétitive tandis que les composés comportant plusieurs sites

de reconnaissance peuvent exercer leur action inhibitrice par une combinaison de deux

mécanismes : une affinité augmentée par une inhibition compétitive multivalente et/ou par

une inhibition stérique (Figure 1).

Figure 1 : Exemple d’inhibition d’une interaction polyvalente en utilisant des molécules

multivalentes[3]

Inhibiteur multivalent

Inhibition compétitive monovalente

Inhibition compétitive multivalente

Stabilisation stérique

Inhibiteur monovalent


75

En s’appuyant sur cette stratégie, le groupe de I. Rico-Lattes en collaboration avec

l’équipe de J.P. Majoral, a présenté un nouveau système analogue du GalCer, un tensioactif

catanionique dendritique comportant une grande densité de sites de reconnaissances à sa

périphérie, afin d’augmenter la probabilité d’interaction entre le virus et le leurre sans pour

autant augmenter la concentration active en produit [4]. Dans cette approche, les dendrimères

ont la particularité de pouvoir présenter à leur surface un grand nombre de fonctions leur

conférant une forte densité locale de sites réactifs [5, 6].

Afin d’évaluer l’influence de la multiplicité des sites actifs et de la structure sur

l’activité anti-VIH, les dendrimères utilisés ont été choisis de différentes générations,

comportant 6 et respectivement 12 fonctions acides en périphérie avec un cœur dendritique

tri- ou hexafonctionnel. Les tensioactifs catanioniques ont été obtenus en employant 6 ou 12

équivalents de N-hexadécylamino-1-déoxylactitol pour 1 équivalent de dendrimère

comportant 6 ou 12 fonctions acides en surface (Figure 2) [7].

Figure 2: Structure des tensioactifs catanioniques dendritiques synthétisés

antérieurement dans les deux laboratoires [7]

Grâce à cette étude, les auteurs ont démontré que l’activité antivirale de ces

tensioactifs catanioniques dendritiques multivalents (RCI50 = 1,44 - 13 µM) est nettement


76

supérieure à l’activité additive d’un nombre équivalent de monomères analogues du GalCer

(Tableau 1).

Ces résultats [7] confirment l’effet de multivalence déjà enregistré sur les activités

thérapeutiques de dérivés dendritiques [3, 8].

Composés CI 50 (µµµµM) RCI 50 (µµµµM)

(*CI 50) CC50 (µµµµM) IT

L16

1

50

50

70

1,4

1c-G1

6

2,1

12,6

3,5

1,7

1c-G2

12

1,1

13,2

2,9

2,6

2c-G0

6

0,37

2,22

9,3

25

2c-G1

12

0,12

1,44

3,9

32

(N x CI50 = RCI50, représente la concentration inhibitrice normalisée, exprimée comme la concentration inhibitrice du catanionique dendritique multipliée par le nombre de sites actifs, N)

Tableau 1 : Résultats biologiques des analogues catanioniques dendritiques synthétisés

antérieurement [7]

La structure du cœur dendritique a une influence importante sur la conformation de

l’assemblage catanionique et par conséquent sur l’activité anti-VIH. Les dendrimères

trifonctionnels imposent une structure en forme de "chou-fleur" aux assemblages

catanioniques tandis que les dendrimères hexafonctionnels conduisent à une forme

cylindrique (Figure 3). En conséquence, les composés à cœur hexafonctionnel sont moins

compacts, les sites actifs plus accessibles pour une interaction avec la gp120 virale et donc ces

tensioactifs catanioniques présentent une activité antivirale supérieure (CI50=0,37 et 0,12 µM

pour les composés possédant 6 respectivement 12 sites actifs) à celles des composés à cœur

trifonctionnel (CI50=2,1 et 1,1 µM pour les composés 6 et 12 fonctionnels respectivement) [7].


77

Figure 3: Modèles moléculaires obtenus après minimisation dans l’eau des tensioactifs

catanioniques dendritiques à cœur trifonctionnel (1c-G2) et hexafonctionnel (2c-G1)

Il faut aussi mettre l’accent sur le fait que cette étude a mis en évidence une fois de

plus, le rôle essentiel des chaînes alkyles présentes [9-11] dans la structure des analogues du

GalCer lors de l’interaction avec la glycoprotéine gp120 du VIH. Dans ce sens, ces

tensioactifs catanioniques dendritiques présentent des concentrations actives antivirales de

l’ordre du micromolaire, soit mille fois plus actifs que les glycodendrimères dépourvus de

chaînes alkyles présentés dans la littérature par Kensinger [12, 13].

Malgré leur bonne activité antivirale, ces dérivés catanioniques dendritiques analogues

du GalCer présentent une toxicité cellulaire non négligeable, toxicité expliquée par les auteurs

à l’aide de deux hypothèses.

Une première hypothèse lie la toxicité à une incorporation possible des composés dans

la membrane plasmique, incorporation favorisée par la conformation adoptée par ces

associations dendritiques et qui pourrait perturber les fonctions cellulaires. Ainsi, la

cytotoxicité (CC50=3,5 et 2,9 µM des composés comportant 6 et respectivement 12 sites

actifs) des composés à cœur trifonctionnel (1c-G1 et 1c-G2) pourrait être attribuée à leur

conformation en "chou-fleur" (Figure 3). En effet, de par l’arrangement en bouquet des

chaînes alkyles hydrophobes, cette conformation est plus prédisposée à une interaction et une

incorporation dans la membrane cellulaire par rapport aux dendrimères catanioniques à cœur

hexafonctionnel adoptant une forme cylindrique. Effectivement, de par la conformation

cylindrique, les chaînes alkyles de l’association catanionique 2c-G1 minimisent leurs

interactions avec le milieu externe hydrophile en s’associant fortement entre elles par effets

hydrophobes. Ainsi, l’accessibilité de ces chaînes est fortement limitée et l’interaction et la

fusion du dérivé avec la membrane cellulaire est peu favorable.


78

Cette stratégie d’hydrophobie masquée développée pour les composés géminis [14]

analogues du GalCer est présentée dans la figure 4 et, met en évidence la faible pénétration

dans la membrane cellulaire des composés adoptant une forme cylindrique. Ces composés

gémini qui ont une faible toxicité [14] se comportent donc comme des bolaamphiphiles (ou

bolaformes), interagissant peu avec les membranes cellulaires [15, 16]. En effet, des études

antérieurement réalisées au laboratoire, ont mis en évidence que les bolaformes [17] adoptant

une conformation "étirée" (espaceur inférieur à 12 groupements méthylène) ne perturbent pas

l’organisation membranaire. Ces composés, contrairement aux N-alkylamino-1-déoxylactitols [18], ne manifestent donc pas la capacité d’interagir et de désorganiser les membranes

cellulaires avec l’extraction des protéines membranaires, d’où leur faible toxicité cellulaire.

Figure 4: Représentation de l’influence de la conformation sur l’incorporation dans la

membrane cellulaire [14]

d’amphiphiles géminis

Cependant, malgré leur forme cylindrique, la cytotoxicité des composés 2c-G0 et 2c-

G1 à cœur hexafonctionnel reste assez importante (CC50=9,3 et 3,9 µM respectivement). Il

semble donc que d’autres paramètres soient responsables de la cytotoxicité de ces

dendrimères catanioniques. Une deuxième hypothèse lie la toxicité cellulaire à une

dissociation partielle de l’entité catanionique en raison d’un caractère hydrophobe trop faible

des branches du dendrimère. Ainsi, en raison d’un effet hydrophobe faible existant entre les

éléments constitutifs (dendrimère – aminolactitol) de l’association catanionique dendritique,

l’aminolactitol pourrait être relarguer et provoquer une perturbation des fonctions cellulaires

par un effet détergent sur les membranes cellulaires.

Conformation non - cylindrique

"espaceur replié"

Conformation cylindrique

"espaceur étiré"


79

III SYNTHESE DE NOUVEAUX TENSIOACTIFS CATANIONIQUES DENDRITIQUES ANALOGUES DU GALCER

A la suite de ces travaux réalisés par M. Blanzat et C.O. Turrin dans les groupes de I.

Rico-Lattes et de J.P. Majoral, l’étude présente propose la synthèse de nouveaux tensioactifs

catanioniques dendritiques multivalents à cœur hexafonctionnel comportant 12 fonctions

acides en surface car, comme nous l’avons précédemment présenté, ces deux caractéristiques

structurales offrent une meilleure activité anti-VIH à ce type de composés.

L’originalité de ces nouveaux tensioactifs catanioniques est liée à la présence de

chaînes alkyles terminales dans la structure des dendrimères qui auront pour rôle de renforcer

les effets hydrophobes entre le dendrimère et l’aminolactitol. Par cette consolidation de

l’assemblage catanionique dendritique nous espérons une diminution de la toxicité cellulaire

de ces nouveaux composés puisque comme nous l’avons précédemment noté, cette

cytotoxicité pourrait provenir d’un partiel désassemblage du système catanionique des

dendrimères à cœur hexafonctionnel.

III.1 Synthèse des dendrimères catanioniques analogues du GalCer

Ainsi, deux nouveaux dendrimères à cœur hexafonctionnel comportant 12

groupements acides phosphoniques terminaux et 12 chaînes alkyles supplémentaires, de deux

longueurs différentes (C3 et C10) ont été synthétisés au Laboratoire de Chimie de Coordination

dans l’équipe de J.P. Majoral à Toulouse par C.O. Turrin et G. Spataro (Figure 5).

PN

P

NP

N

ON N

Me

P

S

O

NH

O

P

OOH

OH

O

NH

O P

O OH

OH

R

R

O

N

NMe P

S

O

NH

O PO OH

OH

O

NH

O

POHO OH

R

R

O

N

NMeP

S

O

NH

OPOHO

HO

O

NHO

P O

OHHO

R

R

O

N

NMe

PS

O

NHO

P O

OHHO

O

NH

O

P

O

OH

OHR

R

O

NN

Me

PSO

NHO

PO

HOOH

O

NH

O

P

OHO

HOR

R

O

NN

Me

P

S

O

NH

O

P

OHO

HO

O

NH

OPOHO

HO

R

R

DC3 : R = C3H7

DC10: R = C10H21

Figure 5: Structure de nouveaux dendrimères à cœur hexafonctionnel comportant des

chaînes alkyles terminales


80

Le projet initial prévoyait l’utilisation, dans une toute première étape, d’un dendrimère

d’une structure similaire à celle présentée ci-dessus, mais dépourvu des chaînes alkyles

terminales. De par son utilisation, nous aurions pu réaliser un passage graduel vers la structure

des dendrimères étudiés dans les travaux courants car, il nous aurait permis d’étudier

l’influence sur les propriétés biologiques et physico-chimiques liée au remplacement des

fonctions acides carboxyliques terminales par des acides phosphoniques. En raison de

difficultés de purification qui ont conduit à l’obtention de ce dendrimère en quantités trop

faibles, son utilisation dans le cadre de l’étude actuelle n’a pas été possible.

La présence du phosphore dans la structure des dendrimères ainsi que dans les

groupements acides terminaux a permis une caractérisation aisée de ces structures et un

meilleur suivi de la pureté des composés synthétisés. De plus, des études précédemment

réalisées dans le groupe de J.P. Majoral ont mis en évidence le rôle clef des fonctions

phosphoniques terminales [19, 20] sur l’activité biologique de ce type de dendrimères, tout

particulièrement sur le processus d’activation des cellules monocytaires humaines.

Afin de déterminer l’hydrophobie adéquate de l’assemblage catanionique, générant

une toxicité cellulaire réduite et une bonne activité anti-VIH, nous avons fait varier la

longueur des chaînes alkyles de l’aminolactitol. Pour cela, nous avons employé deux

aminosucres : le N-hexadécylamino-1-déoxylactitol (L16) et le N-dodécylamino-1-

déoxylactitol (L12). Nous rappellerons que ces deux aminolactitols (Figure 6) possèdent les

impératifs structuraux (le motif D-galactose lié par une liaison β-O-glycosidique et une

longue chaîne hydrophobe) qui permettront la reconnaissance avec la gp120. De plus, les

chaînes alkyles ont également été greffées sur les dendrimères afin de renforcer cette

interaction avec le virus.

Les deux précurseurs cationiques, le N-dodécylamino-1-déoxylactitol (L12) et le N-

hexadécylamino-1-déoxylactitol (L16) ont été synthétisés en partant du lactose non protégé par

une méthode largement utilisée au laboratoire [21, 22]. Ainsi, la réaction spécifique des sucres

réducteurs avec la dodécylamine et l’hexadécylamine respectivement, suivie par la réduction

de l’imine intermédiaire par le borohydrure de sodium conduit à l’obtention du précurseur

cationique.

Les nouveaux tensioactifs catanioniques dendritiques ont été synthétisés par simple

addition dans un mélange eau : propan-1-ol (1: 3, v : v), à température ambiante, de 12

équivalents d’aminolactitol avec 1 équivalent du dendrimère comportant 12 fonctions acides

en surface. L’addition du propan-1-ol a été nécessaire en raison de la solubilité réduite de

l’acide dendritique dans l’eau (Figure 6).


81

L’équilibre acido-basique de la réaction est déplacé vers la formation du dendrimère

catanionique grâce aux effets hydrophobes et aux interactions de van der Waals entre les

chaînes alkyles des deux constituants de l’entité catanionique.

PHOOH

O

P

HO

HO O

PHO

HO O

P

OHHO

O

P

OHHO

O

P OH

OH

O P OH

OH

O

P

OH

OHO

POH

OHO

P

HO OH

O

P

HO OH

O

PHO

OH

O

DC3 : C3H7

DC10 : C10H21

=

=

OOH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NHn

+ 12

L12 : n = 8L16 : n = 12

Température ambiante 2 jours

H2O: PrOH = 1: 3

L16 DC3 L12 DC3

L16 DC10 L12 DC10

Figure 6: Synthèse de nouveaux analogues catanioniques dendritiques du GalCer

Les tensioactifs catanioniques ont été obtenus avec des rendements quantitatifs après

élimination des solvants par évaporation et lyophilisation.

Une étude par résonance magnétique nucléaire a ensuite été réalisée afin de confirmer

la structure de ces nouveaux analogues catanioniques du GalCer, notamment afin de vérifier

la formation des paires d’ions.

III.2 Analyse structurale par résonance magnétique nucléaire

Les composés synthétisés lors de ces travaux (les aminolactitols comme les

tensioactifs catanioniques) présentent en RMN dans D2O, des pics larges ce qui rend difficile

l’interprétation des spectres. En effet, ces dérivés tensioactifs s’auto-associent dans le solvant


82

deutéré pour former des systèmes organisés (micelles, vésicules etc.), ce qui altère fortement

la qualité des signaux. Cependant, l’utilisation de mélanges de solvants deutérés peut résoudre

ce type de problème.

Ainsi, pour une analyse précise de la structure et de la pureté de nos composés, nous

avons utilisé en RMN des mélanges de solvants deutérés soit, le mélange D2O : CD3OD :

CDCl3 (1: 3 : 1, v : v: v) pour l’aminolactitol L16 et le mélange D2O : nC3D7OD (1:3, v : v)

pour les tensioactifs catanioniques dendritiques. Ces mélanges de solvants permettent de

solubiliser complètement les produits, tout en évitant la formation d’agrégats

supramoléculaires, ce qui se traduit par une meilleure résolution des signaux. Ces mélanges

ont été mentionnés seulement à titre indicatif, la caractérisation complète des produits sera

décrite dans la partie expérimentale.

Dans le cas des dendrimères catanioniques, le 31P s’est révélé être une sonde fiable

permettant d’indiquer la transformation totale de l’acide phosphonique vers sa forme

déprotonée, spécifique à l’assemblage catanionique. A titre d’exemple on observe sur le

dérivé L16DC3 la disparition du signal à 21,89 ppm correspondant à la forme acide de l’atome

de phosphore au profit d’un signal à 17,27 ppm attribué à la forme déprotonée du tensioactif

catanionique (Figure 7).

Figure 7: Comparaison entre les spectres RM du 31

P du dendrimère DC3 et du

composé catanionique L16DC3 (solvant D2O/Propan-1-ol : 1/3, v/v)

H PO3 -

Catanionique L16DC3

H2PO3

Dendrimère DC3

ppm


83

Après la synthèse et la caractérisation de ces nouveaux composés dendritiques

catanioniques nous vérifierons si la cohésion des éléments constitutifs au sein de l’assemblage

catanionique en milieux aqueux est réellement obtenue grâce à l’augmentation des effets

hydrophobes. Cette cohésion sera mise en évidence par des études réalisées à l’interface

eau/air.

IV ETUDE DE L’ASSOCIATION DES DENDRIMERES

CATANIONIQUES A L’INTERFACE EAU / AIR

En raison de leur nature amphiphile, les composés catanioniques ont la propriété de

s’adsorber à l’interface eau/air de manière à orienter leur chaînes hydrophobes vers l’air et

leurs têtes hydrophiles vers l’eau. Ils peuvent former une monocouche de molécules à la

surface dont l’analyse pourra donner d’importantes informations concernant les interactions

moléculaires qui existent au sein de ces associations.

Dans cette optique, nous nous sommes intéressés à l’étude du comportement de nos

produits catanioniques à l’interface eau/air afin de confirmer que ces composés, en raison des

interactions attractives entre les têtes polaires de charges opposées, ainsi que des effets

hydrophobes entre les chaînes grasses, se comportent comme des entités à part entière. En

fait, plutôt comme un composé zwitterionique, et non comme un simple mélange de deux

produits distincts : cationique et anionique, pouvant donner lieu à une ségrégation. Pour cette

étude, nous avons analysé les isothermes de compression de ces dérivés catanioniques à l’aide

de la technique de la balance de Langmuir.

Avant de présenter les résultats de nos expériences et leur interprétation nous décrirons

brièvement le principe de la balance de Langmuir.

IV.1 La technique de la balance de Langmuir

Cette technique permet d’étudier les caractéristiques des films formés à l’interface

eau/air par des amphiphiles insolubles ou peu solubles dans l’eau. La monocouche se forme

en déposant à la surface de l’eau (dénommée sous -phase) une faible quantité d’une solution

d’amphiphile à étudier dans un solvant volatil (chloroforme, méthanol ou éther).


84

L’évaporation du solvant disperse les molécules amphiphiles à l’interface, sur toute l’aire

disponible, formant ainsi une monocouche qui pourra par la suite être comprimée par le

déplacement, à la surface de l’eau, d’une barrière mobile en téflon. Tout en diminuant l’aire

de l’interface grâce à la barrière, on mesure la variation de la tension de surface (π, en mN/m)

provoqué par la force exercée par le film des molécules sur le capteur de pression - une lame

de Wilhelmy (en platine ou en papier) placée à l’interface eau/air (Figure 8).

Figure 8: Représentation schématique de la balance de Langmuir

Ainsi, en comprimant à vitesse et température constantes la monocouche amphiphile

on mesure la variation de la tension de surface en fonction de l’aire par molécule (en Å2) afin

de tracer une isotherme de compression ; celle-ci a une allure caractéristique pour chaque

système amphiphile / sous – phase et est dépendante de la température.

Le profil classique d’une isotherme de compression se caractérise par l’existence de

différentes zones (Figure 9) :

Figure 9: Isotherme de compression typique d’un amphiphile insoluble ou peu soluble

dans l’eau

- pour de très grandes aires (hors compression), les molécules se trouvent en phase

gaz, car elles sont très éloignées les unes des autres et n’interagissent pas entre elles. Dans les

Gaz + Liquide

Liquide expansé

Liquide condensé

Solide

Liquide expansé / condensé


85

conditions expérimentales habituelles, dès que la solution est épandue à l’interface eau/air, le

film est dans un état plus dense qu’en phase gazeuse pure, car il y a déjà une coexistence entre

la phase gaz et la phase liquide.

- la phase liquide se caractérise par un rapprochement des molécules, le film devient

plus organisé et les chaînes aliphatiques interagissent par le biais des forces de van der Waals.

L’existence d’un plateau dans le profil de l’isotherme traduit la coexistence de deux phases

liquides : expansée et condensée.

- une phase solide peut aussi se traduire par un changement de pente. Dans cette phase

les molécules sont encore plus compactées et organisées. Les contraintes appliquées au film

étant de plus en plus importantes, la monocouche reste stable jusqu’à une certaine tension de

surface critique.

- en augmentant encore la compaction et la pression de surface, la monocouche se

brise pour former de nouvelles phases (multicouches, agglomérats tridimensionnels ou

dissolution des molécules dans la sous -phase), c’est le "collapse". La pression au "collapse",

qui est la plus grande pression de compression du film de Langmuir, est une valeur importante

caractérisant la stabilité de la monocouche.

IV.2 Etude des monocouches d’amphiphiles catanioniques dendritiques par la technique de la balance de Langmuir

Comme nous l’avons précédemment indiqué, la technique de la balance de Langmuir

n’est applicable qu’aux amphiphiles insolubles ou peu solubles dans l’eau car eux seuls sont

capables de former un film compressible à l’interface eau / air.

Cette condition ne peut être remplie par les aminolactitols constitutifs car ces

composés possèdent une trop grande hydrosolubilité. La famille des catanioniques

dendritiques qui se caractérise par une hydrophobie beaucoup plus importante et donc une

solubilité réduite dans l’eau a pu être étudiée par cette technique.

Les monocouches ont été préparées par injection d’une solution concentrée de

catanioniques dendritiques dans la sous – phase aqueuse de la cuve de Langmuir. Après

adsorption des molécules à l’interface et stabilisation de la valeur de la tension de surface, les

films de tensioactifs catanioniques ont été comprimés à une température de 20°C et à une

vitesse constante. Ce protocole d’obtention des films à l’interface eau/air, ainsi que la solution

aqueuse utilisée (0,15 M NaCl) ont été choisis afin de mieux mimer les conditions


86

expérimentales utilisées pour les tests biologiques de nos produits. Ces précautions sont

nécessaires car une corrélation entre les propriétés physico-chimiques et biologiques sera

ensuite réalisée.

Une première observation intéressante est le fait que les monocouches formées à

l’interface sont des films stables et compressibles. Les isothermes de compressions obtenues

pour ces quatre tensioactifs catanioniques dendritiques ainsi que le sel de sodium du

dendrimère DC3 (12Na+) sont présentées figure 10.

0 2 4 6 8 100

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65 DC

3Na 1,8*10

-8M

L12DC

3 1,8*10

-8M

L16DC

3 1,8*10

-8M

L12DC

10 1,8*10

-8M

L16DC

10 1,8*10

-8M

Aire par molécule, nm2

Press

ion de surface

mN/m

Figure 10: Isotherme de compression des tensioactifs catanioniques dendritiques et du

sel de sodium du dendrimère DC3 à 20°C

Composé Pression de collapse

πC (m/m)

Aire minimale*

(nm2)

DC3 (12Na+) 14 4,33

L12DC3 18 8,00

L16DC3 40 7,80

L12DC10 46 4,06

L16DC10 54 7,93

* valeurs obtenues en considérant que tout le produit est adsorbé à l’interface

Tableau 2: Pressions au collapse et aires minimales des composés dendritiques

A0 A0 A0 A0 A0

πC

πC

πC

πC

πC

DC3Na 1,8*10

-8M

L12DC

3 1,8*10

-8M

L16DC

3 1,8*10

-8M

L12DC

10 1,8*10

-8M

L16DC

10 1,8*10

-8M


87

Comme nous pouvons l’observer sur le graphique (Figure 10), les profils de

compression des deux tensioactifs catanioniques L16DC3 et L12DC3 diffèrent considérablement

de celui du dendrimère DC3 (12Na+), autant par les valeurs des aires minimales par molécule

que par la pression au collapse de la monocouche. La valeur élevée de l’aire par molécule de

ces composés montre clairement la coexistence à l’interface eau / aire du dendrimère DC3 et

des aminolactitols respectivement L16 et L12 grâce aux interactions électrostatiques entre les

têtes polaires. Malgré leur forte hydrosolubilité, ces derniers restent à l’interface grâce aux

effets hydrophobes et aux interactions de van der Waals établis entre leurs chaînes alkyles et

celles du dendrimère DC3. On observe que ces interactions conditionnent la stabilité des

films, car le composé moins hydrophobe L12DC3 se caractérise par une plus faible valeur de

pression de collapse (18mN/m) que celle du catanionique plus hydrophobe L16DC3

(40mN/m), mais au contraire, plus importante que celle du dendrimère DC3 seul (14mN/m)

(Tableau 2).

Il faut également souligner que la ségrégation de ces associations catanioniques dans

les composés constitutifs : anionique et respectivement cationique ne se produit pas, car dans

le profil de compression des deux associations catanioniques dendritiques en C3 nous ne

retrouvons pas l’allure correspondant au dendrimère DC3 pur.

Ces considérations nous permettent d’affirmer que les composés dendritiques L16DC3

et L12DC3 se comportent comme des associations catanioniques, des entités bien distinctes,

possédant des propriétés différentes de celles des constituants individuels. Dans ce cas donc,

la cohésion de l’édifice catanionique est bien maintenue même à de très faibles concentrations

(1,8x10-8 M).

Le sel de sodium du dendrimère DC10 n’a pas permis son utilisation dans les mêmes

conditions en raison de son hydrophobie beaucoup plus importante conduisant à une très

faible solubilité dans l’eau. Néanmoins, les expériences réalisées avec les catanioniques

L16DC10 et L12DC10 ont révélé des courbes de compression bien différentes, avec des valeurs

distinctes pour les aires par molécule ainsi que pour les pressions au collapse (Figure 10 et

Tableau 2).

L’isotherme de compression du tensioactif catanionique L12DC10 est remarquable, car

même si la valeur de la pression au collapse est en accord avec l’hydrophobie du composé,

comme pour tous les autres catanioniques dendritiques, l’aire par molécule pour ce dérivé

(4,06nm2) est plus petite par rapport à celle de son analogue L16DC10 (7,93 nm2). Ce

comportement peut être expliqué de deux façons.


88

Une première hypothèse implique l’existence d’une interaction beaucoup plus

importante[23] entre les éléments constitutifs de l’association catanionique L12DC10 grâce à un

meilleur recouvrement des deux chaînes alkyles [24] de longueurs similaires en C10 et en C12

respectivement, comparativement aux autres tensioactifs catanioniques comportant des

combinaisons de longueurs de chaînes plus dissemblables: C3 – C16, C3 – C12 ou C10 – C16.

Cette interaction plus importante pourrait engendrer donc une plus forte compaction de

l’ensemble catanionique.

Une deuxième hypothèse pourrait être l’adsorption à l’interface eau/air de cette

association catanionique L12DC10 en conformation cylindrique. Si nous supposons que les

trois autres tensioactifs catanioniques s’adsorbent à l’interface en adoptant une conformation

en chou-fleur, l’aire par molécule du composé L12DC10 serait dans ce cas-là diminuée de

moitié. On peut effectivement constater que l’aire par molécule de ce tensioactif (4,06nm2)

correspond à la moitié de l’aire moléculaire des autres entités catanioniques (~ 8 nm2)

(Tableau 2).

L’absence de ségrégation des associations catanioniques L16DC10 et L12DC10 dans les

composés constitutifs est confirmée par l’absence de similarité entre les deux profils de

compression. Une ségrégation aurait provoqué l’apparition dans les deux cas, d’un profil

caractéristique du dendrimère CD10. De plus, l’aire par molécule du composé L16DC10

(7,93nm2) est voisine de celles des tensioactifs catanioniques comportant le squelette

dendritique en DC3 (7,80 et 8,00 nm2 pour L16DC3 et L12DC3

respectivement) qui, comme

nous l’avons démontré, eux ne dissocient pas. Cette similarité des valeurs de l’aire par

molécule de ces composés n’est pas surprenante si l’on considère que les trois tensioactifs

catanioniques possèdent des têtes hydrophiles identiques.

Suivant le même raisonnement que celui appliqué aux catanioniques comportant le

dendrimère DC3, nous pouvons affirmer que grâce aux interactions électrostatiques entre les

têtes polaires ainsi qu’aux effets hydrophobes et aux interactions de van der Waals établis

entre les chaînes alkyles, les associations L16DC3 et L16DC10 se comportent comme des entités

catanioniques bien distinctes.

À partir de l’analyse de l’ensemble des profils de compressions nous pouvons

remarquer que la valeur de la pression au collapse est corrélée aux contributions hydrophobes

et à la cohésion de la monocouche (Figure 10 et Tableau 2).


89

Ayant démontré la bonne cohésion de nos composés catanioniques dendritiques, nous

nous intéresserons par la suite aux propriétés biologiques de ces dérivés.

V PROPRIETES BIOLOGIQUES DE NOUVEAUX CATANIONIQUES DENDRITIQUES ANALOGUES DU GALCER

V.1 Caractéristiques biologiques

Nous avons eu la possibilité de quantifier les propriétés biologiques de nos composés

grâce aux tests antiviraux réalisés in vitro par le Dr. Anne-Marie Aubertin et ses

collaborateurs à l’Institut de Virologie INSERM à Strasbourg.

Avant de présenter les résultats de notre étude une courte description des paramètres

biologiques ainsi que des lignées cellulaires utilisées sera faite.

V.1.1 Paramètres biologiques

Nous redéfinirons les paramètres biologiques déjà présentés dans le premier chapitre

bibliographique, paramètres qui seront utilisés dans cette étude afin de caractériser l’activité

antivirale in vitro de nos associations catanioniques :


minimale en composé nécessaire pour inhiber de 50% l’activité d’un marqueur du virus (ex.

la transcriptase inverse). Plus la valeur de la CI50 est faible, plus le produit est actif.

- la concentration cytotoxique à 50% (CC50) est définie comme la concentration létale

en composé pour 50% des cellules non infectées par le virus. Plus la valeur de la CC50 est

élevée, moins le produit est toxique.

- l’indice thérapeutique (IT) est défini comme le rapport entre la toxicité et l’activité

inhibitrice (CC50 / CI50). Plus la valeur de l’IT est élevée, plus le produit est efficace.


90

V.1.2 Lignées cellulaires et souches virales

La souche de virus VIH utilisée dans cette étude est une souche lymphotropique de

référence VIH-1 Lai (III B). Ce virus est produit en infectant des cellules de la lignée humaine

CEM-SS.

Des cellules lymphocytaires T, CEM-SS (susceptibles de former des syncitia –

cellules géantes multinucléées) ont été utilisées afin de réaliser les tests biologiques in vitro.

Ces lignées de cellules humaines d’origine myéloïde expriment à leur surface le récepteur

CD4 et sont permissives au VIH.

L’utilisation des cellules comportant des récepteurs CD4 à leur surface peut sembler

contradictoire à première vue car les composés synthétisés sont des analogues du GalCer qui

ne sont pas actifs sur ces récepteurs mais sur le virus. Toutefois, comme nous l’avons présenté

dans la partie bibliographique, dû au fait que les analogues du GalCer interagissent avec la

boucle V3 de la glycoprotéine virale gp 120, ils inhibent l’entrée du VIH-1 dans les cellules

CD4+. Cela s’explique par l’impossibilité d’interaction entre la boucle V3, bloquée par ces

analogues du GalCer et le récepteur CD4 ou les corécepteurs (CXCR4 ou CCR5), étapes

essentielles sans lesquelles la fusion du virus avec les cellules CD4+ est impossible. Ces

composés analogues du GalCer ont donc la capacité, par un effet de concurrence, d’empêcher

aussi bien l’entrée du VIH-1 dans les cellules CD4+ que dans les cellules GalCer+.

Les cellules infectées (cellules CEM-SS) par le virus de l’immunodéficience humaine

présentent un effet cytopathogène (ECP) caractérisé par la formation de cellules multinucléées

géantes.

V.1.3 Présentation de la méthode utilisée

Afin d’évaluer l’effet antiviral de nos composés, les cellules CEM-SS ont été infectées

par le virus VIH-1 Lai et mises en culture après l’ajout dans le milieu de différentes doses de

composés à tester. Cinq jours après l’infection, le dosage de la transcriptase inverse dans le

surnageant de culture permet d’évaluer la quantité de virus relargué dans le milieu et de

déterminer la concentration inhibitrice (CI50), calculée par rapport à des cellules infectées non

traitées, maintenues dans les mêmes conditions de culture.

L’effet toxique des composés est mesuré par un test colorimétrique MTT sur les

mêmes lignées de cellules (CEM-SS), cette fois-ci non infectées. La concentration

cytotoxique (CC50) est alors déterminée par rapport à des cellules non infectées, non traitées.


91

L’indice thérapeutique (IT) qui est le rapport de la CC50 sur la CI50, donne une

information importante sur l’efficacité du produit utilisé dans un système cellulaire donné.

V.2 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des dendrimères catanioniques analogues du GalCer

Nous rappellerons que l’intérêt pour cette classe de tensioactifs catanioniques

analogues du GalCer provient de l’effet de multiplicité de sites qui permet d’augmenter

l’affinité entre le leurre et le virus comparativement à la somme des interactions individuelles.

La synthèse de ces nouveaux composés a été réalisée dans le but de diminuer la toxicité

cellulaire des dérivés précédemment synthétisés appartenant à la même classe, toxicité

supposée être due à une partielle dissociation de l’assemblage catanionique. Nous avons donc

adopté, comme stratégie de consolidation de l’association catanionique, le renforcement des

effets hydrophobes entre les chaînes alkyles du dendrimère et de l’aminolactitol.

Les tests anti-VIH des dendrimères catanioniques analogues du GalCer réalisés in

vitro sur cellules CEM-SS ont montré que ces composés présentent de bonnes activités

antivirales caractérisées par des concentrations inhibitrices qui varient entre 0,5 et 4,4 µM

(Tableau 3). Nous pouvons observer que toutes ces associations dendritiques sont plus actives

in vitro que les aminolactitols constitutifs possédant le site de reconnaissance du virus.

Comme nous l’avons déjà présenté, cette différence de concentrations actives peut être liée à

la multiplicité des sites actifs au niveau de l’assemblage catanionique.

Malheureusement, ces bons résultats sont modérés par une cytotoxicité non-

négligeable des produits (valeurs de CC50 comprises dans une gamme de 5,3 à plus de 10

µM), plus importante que celles des aminolactitols de départ (75 et 130 pour L16 et L12

respectivement). De ce fait, ces composés sont peu sélectifs (IT inférieurs ou égal à 10).

Une analyse plus détaillée sera réalisée afin de mieux interpréter ces résultats.


92

Composés CI 50 (µµµµM) RCI 50 (µµµµM)

(*CI 50) CC50 (µµµµM) IT

L16 7,1 ± 1,6 7,1 75 ± 8 10,5

L16DC3 0,5 ± 0,2 6 5,3 ± 1,9 10,6

L16DC10 1,7 ± 0,1 20,4 7,2 ± 0,5 4,2

L12 55,5 ± 23 55,5 130 2,3

L12DC3 2,4 ± 1 28,8 > 10 > 3,7

L12DC10 4,4 ± 0,8 52,8 8 ± 0,2 1,8

2c-G1 0,12 1,44 3,9 32

1c-G2

1,1 13,2 2,9 2,6

N = nombre de sites actifs=12

Tableau 3 : Résultats biologiques des analogues catanioniques multivalents du GalCer

Une comparaison peut également être réalisée entre les activités antivirales de ces

nouveaux composés et celle du composé catanionique dendritique 2c-G1 (ayant les mêmes

caractéristiques structurales: cœur hexafonctionnel, 12 fonctions acides, aminolactitol L16)

précédemment synthétisé et décrit dans la partie introductive du chapitre. Ainsi, nous pouvons

remarquer que le composé L16DC3 présente une activité anti-VIH (CI50=0,5 µM) proche de

l’activité inhibitrice du 2c-G1 (CI50=0,12 µM), tandis que dans le cas du composé L16DC10

(CI50=1,7 µM) nous enregistrons une diminution d’un facteur d’environ 10 de l’efficacité

antivirale. Cela nous indique que le greffage sur le squelette dendritique d’une chaîne alkyle

courte en C3 ne modifie que faiblement l’activité antivirale de cette classe de produits, tandis

que l’ajout d’une chaîne alkyle plus longue, en C10 engendre une diminution significative de

l’activité anti-VIH.

Cette observation est également valable dans le cas des composés catanioniques

dendritiques comportant l’aminolactitol L12. Nous pouvons remarquer (Tableau 3) une perte

d’activité pour le composé L12DC10 comportant une chaîne alkyle en C10 (CI50=4,4 µM), par

rapport à celle du composé L12DC3 (CI50=2,4 µM) qui comporte une chaîne en C3. La perte

d’activité de cette deuxième famille de catanioniques dendritiques par rapport à celle du

composé 2c-G1 (CI50=0,12 µM) ainsi que celles des composés L16DC10 (CI50=1,7 µM) et

L16DC3 (CI50=0,5 µM) peut être attribuée à l’hydrophobie moins importante de l’aminolactitol

L12 comparée à celle du L16. Ceci est confirmé par l’activité anti-VIH réduite du L12

(CI50=55,5 µM) comparée à celle du L16 (CI50=7,1 µM). Ce résultat est en accord avec les


93

travaux précédents qui ont montré qu’une chaîne alkyle en C12 est insuffisante pour une bonne

activité anti-VIH. Toutefois, dans notre cas, nous avions envisagé faire face à cet

inconvénient par l’effet de multiplicité de sites et l’effet coopératif hydrophobe des chaînes

alkyles greffées sur le squelette dendritique.

Une analyse plus précise permet de quantifier l’activité antivirale de chaque site actif

du dendrimère catanionique. Ainsi, dans le cas du composé L16DC3 (CI50=0,5µM) l’activité

anti-VIH rapportée à chaque site actif vaut RCI50=0,5x12=6 µM, valeur qui est comparable à

la concentration inhibitrice de l’aminolactitol constituant L16, RCI50=7µM. Cette situation se

retrouve dans le cas du composé L12DC10, dont la RCI50 est comparable à celle du L12.

L’association catanionique la plus hydrophobe, L16DC10 montre même que l’activité de

chaque site actif est diminuée d’environ un facteur 3 (RCI50=20,4µM) par rapport à la CI50 du

L16. Seule l’association L12DC3, la moins hydrophobe de cette nouvelle famille de composés,

présente un effet de multiplicité de sites exprimé par une augmentation de l’activité antivirale

de chaque site actif (RCI50=28,8µM) d’un facteur 2 par rapport à l’activité antivirale de

l’aminolactitol constitutif L12 (RCI50=55,5µM). Ce résultat modeste mais positif souligne

encore une fois l’importance de l’hydrophobie de ces composés sur les activités biologiques.

Ces résultats indiquent que la consolidation de l’assemblage catanionique par

augmentation des effets hydrophobes doit se faire d’une manière contrôlée car une trop

grande hydrophobie induite par l’utilisation du dendrimère DC10 peut conduire à une

diminution d’activité antivirale par site actif et à la perte d’un réel effet de multivalence. Cela

pourrait s’expliquer par un manque de disponibilité de la chaîne alkyle greffée au dendrimère

pour consolider l’interaction avec la gp120 virale.

À ce stade de l’étude nous pouvons souligner l’équilibre subtil qui existe entre la

nécessité d’une hydrophobie importante, essentielle à la consolidation de l’association

catanionique, et le besoin d’une hydrophobie modérée afin d’éviter le blocage au sein de

l’entité catanionique de la chaîne alkyle greffée au dendrimère, engendrant l’impossibilité de

celle-ci d’interagir avec la gp120.

Ainsi, l’analyse structure – activité anti-VIH de cette nouvelle famille de tensioactifs

catanioniques dendritiques nous permet d’identifier le squelette dendritique ayant une chaîne

alkyle en C3 ainsi que l’aminolactitol le plus hydrophobe L16 comme les éléments clefs qui

permettent l’obtention de meilleurs activités antivirales, comparables à celles obtenus

antérieurement au laboratoire.


94

Concernant la cytotoxicité de ces dendrimères catanioniques (CC50 de 5,3 à plus de 10

µM) nous pouvons remarquer (Tableau 3) que toutes ces associations dendritiques présentent

une toxicité comparable à celle du dérivé catanionique dendritique 2c-G1 (CC50= 3,9 µM),

précédemment synthétisé au laboratoire. Rappelons que la toxicité de ce composé 2c-G1 était

supposée liée à un désassemblage partiel de l’association catanionique. En utilisant la

technique de la balance de Langmuir nous avons démontré que même à des concentrations

bien inférieures (10-8M) aux CC50 (de 5,3 à plus de 10µM), les nouveaux tensioactifs

catanioniques restent associés à l’interface dans des conditions de force ionique similaire à

celle du milieu biologique. Par conséquent, la cytotoxicité de ces produits ne semble pas

provenir d’une dissociation de l’édifice dendritique.

Tous ces éléments présentés ci-dessus auxquels s’ajoute la diminution de l’activité

antivirale par rapport au composé 2c-G1 (Tableau 3) des produits possédant une hydrophobie

plus importante (composés comportant le dendrimère DC10) nous indiquent que probablement

la conformation adoptée par ces associations catanioniques peut être tenue pour responsable

de la baisse d’activité et de la cytotoxicité de ces nouveaux catanioniques dendritiques. Nous

rappellerons qu’une conformation cylindrique de l’assemblage catanionique, telle que celle

adoptée par le composé 2c-G1 peut favoriser une plus grande accessibilité du virus aux sites

actifs par rapport à une conformation en "chou-fleur" (Figure 3). De plus, en raison de son

hydrophobie masquée, cette forme cylindrique devrait être moins toxique que celle en "chou-

fleur".

En tenant compte de ces données, l’activité antivirale réduite ainsi que la toxicité

cellulaire des composés L16DC10 et L12DC10 pourraient être liées à la conformation en "chou-

fleur" adoptée par ces analogues catanioniques dendritiques du GalCer. De plus, leurs

activités antivirales et leurs toxicités cellulaires (Tableau 3) sont plus proches des valeurs

enregistrées pour le composé catanionique dendritique à cœur trifonctionnel 1c-G2 (CI50= 1,1

µM et CC50= 2,9 µM) qui adopte ce type de conformation.

En tenant compte de la structure chimique et des paramètres biologiques très similaires

des composés L16DC3 et 2c-G1, nous serions tentés de croire que l’association catanionique

L16DC3 adopte une conformation cylindrique comme le composé 2c-G1. Pourtant, cela

n’expliquerait pas la toxicité de ce produit qui est comparable à celles des autres composés de

cette nouvelle famille de catanioniques dendritiques.

Nous rappelons que les composés catanioniques dendritiques adoptant une

conformation " en chou-fleur", de par l’arrangement en bouquet des chaînes alkyles


95

hydrophobes, sont plus prédisposés à une interaction et une incorporation dans la membrane

cellulaire par rapport aux dendrimères préférant une forme cylindrique. L’interaction et

l’incorporation de ces tensioactifs catanioniques dendritiques dans les membranes plasmiques,

engendrent par la suite une perturbation des fonctions cellulaires qui pourrait être à l’origine

de leur toxicité cellulaire. Aussi, afin de mieux identifier les facteurs à l’origine de la

cytotoxicité de nos composés, nous étudierons leur influence sur des monocouches de

phospholipides, largement utilisées dans le domaine biophysique comme modèles

bidimensionnels de membranes cellulaires.

Les expériences sur les modèles membranaires ont été réalisées en collaboration avec

le Dr. Gerald Brezesinski et le Prof. Dr. Helmut Möhwald de l’Institut Max Planck, Potsdam,

Allemagne.


96

VI ETUDE DE L’INTERACTION ET DE L’INCORPORATION DES DENDRIMERES CATANIONIQUES VIS-A-VIS D’UN MODELE

MEMBRANAIRE

Les monocouches de phospholipides étalées à l'interface air/liquide sont fréquemment

utilisées comme modèles de membranes cellulaires [15, 25]. Pour notre étude, des monocouches

de DPPC (DiPalmitoyl-Phosphatidyl Choline), un phospholipide classiquement utilisé comme

modèle membranaire, ont été préparées à la surface d’une solution saline (0,15M NaCl) et à

température constante de 20°C (température choisie afin de limiter le processus d’évaporation

de l’eau de la sous -phase). Afin d’étudier les interactions entre la monocouche de

phospholipides et nos dérivés catanioniques injectés dans la sous -phase, nous avons analysé

les isothermes de compression de ces films mixtes à l’aide de la technique de la balance de

Langmuir.

Les profils des courbes des isothermes de compression nous donneront des

informations sur la possible incorporation et l’influence de nos composés sur des membranes

cellulaires. Ainsi, en réalisant ces études sur des modèles membranaires nous espérons trouver

par analogie les réponses concernant la toxicité cellulaire de nos composés.

Les isothermes de compression obtenues pour la DPPC pure et pour chaque mélange

de DPPC – tensioactif catanionique sont présentés en figure 11.

Nous pouvons remarquer qu’à de très faibles concentrations en tensioactifs (1–3x10-9

M) et pour des pressions de surface inférieures à 15mN/m, les profils des isothermes de

compression des mélanges étudiés présentent pratiquement la même allure que la DPPC pure,

mais avec des aires moléculaires plus importantes (∆Å2 allant de 10 à 20). Cette différence

s’explique par l’incorporation du tensioactif au sein de la monocouche de DPPC, ce qui

produit une augmentation de la pression de surface et l’apparition précoce (à des aires par

molécules plus importantes) des transitions de phases. Ainsi, nous remarquons la transition de

la phase gaz vers une phase liquide expansé suivie par la coexistence des phases liquide

expansé - liquide condensé traduite par la présence vers 5 mN/m du même palier

caractéristiques de la DPPC pure. A des pressions de surface supérieures à 15 mN/m le profil

de compression caractéristique d’une phase liquide condensé de la DPPC est perturbé par

l’apparition d’un plateau à une valeur caractéristique pour chaque composé dendritique. On

retrouve ce plateau à la même valeur de pression de surface dans l’isotherme de compression

des catanioniques purs (Figure 11). Il est intéressant d’observer qu’à la suite du palier, donc


97

pour des concentrations très faibles en tensioactif, le profil de l’isotherme de compression

retrouve une allure identique à celle de la DPPC pure (à la même aire par molécule). Le fait

de retrouver le profil de la DPPC pure à la suite du palier traduit l’expulsion des molécules de

tensioactifs de la monocouche et leur solubilisation dans la sous -phase.

40 50 60 70 80 90 100 1100

10

20

30

40

50

60

Aire par molécule, Å2

DPPC + L16DC

3 DPPC

DPPC + L16DC

3 1,3*10

-9M

DPPC + L16DC

3 6,6*10-9M

DPPC + L16DC

3 1,33*10

-8M

Pression de surface

mN/m

40 50 60 70 80 90 100 110

0

10

20

30

40

50

60

70


DPPC

DPPC + L16DC

10 6,6*10

-9M

DPPC + L16DC

10 9*10

-9M

DPPC + L16DC

10 1.33*10

-8M

DPPC + L16DC

10 1.8*10

-8M

DPPC + L16DC

10

Press

ion de surface

mN/m

30 40 50 60 70 80 90 100 110

0

10

20

30

40

50

60


DPPC

DPPC+L12DC

3 1,33*10-9M

DPPC+L12DC

3 6,6*10-9M

DPPC+L12DC

3 1,33*10

-8M

DPPC + L12DC

3

Press

ion de surface

mN/m

30 40 50 60 70 80 90 100 110

0

10

20

30

40

50

60


DPPC

DPPC + L12DC

10 3*10-9M

DPPC + L12DC

10 6,6*10-9M

DPPC + L12DC

10 1,33*10-8M

DPPC + L12DC

10 3,3*10-8M

DPPC + L12DC

10

Press

ion de surface

mN/m

0 200 400 600 800 10000

10

20

30

40

50

60


L12DC

3 1,8*10

-8M

L16DC

3 1,8*10

-8M

L12DC

10 1,8*10

-8M

L16DC

10 1,8*10

-8M

Press

ion de surface

mN/m

Figure 11: Isothermes de compression des tensioactifs catanioniques dendritiques en

présence ou en absence de DPPC à 20°C (0,15M aCl) (A) L16DC3 - DPPC; B) L16DC10 - DPPC ; C) L12DC3 - DPPC; D) L12DC10

- DPPC; E) tensioactifs catanioniques dendritiques sans DPPC)

(*concentrations finales en composé catanionique dendritique dans la sous -phase; conc. en DPPC 1,66*10-7M)

A) *

* *

*

B)

C) D)

E)

*


98

En augmentant la concentration des composés catanioniques dans la sous -phase

(Figure 11 - concentrations supérieures à 6,6x10-9M) nous pouvons observer que l’interaction

DPPC – tensioactif est amplifiée car juste après l’adsorption du catanionique, l’allure de

l’isotherme révèle directement soit l’existence d’un plateau vers 5 mN/m indiquant la

coexistence des phases liquide expansé - liquide condensé soit l’existence d’une phase liquide

condensé. En augmentant la pression par compression nous pouvons remarquer le même

comportement que celui décrit précédemment, à savoir la présence d’un plateau à une valeur

de pression de surface caractéristique à chaque tensioactif catanionique dendritique suivi du

profil de compression de la DPPC pure, mais à des aires par molécules légèrement

supérieures. Ceci indique qu’à des concentrations plus importantes en dérivé dendritique

celui-ci n’est plus totalement expulsé de la monocouche de phospholipide même à de très

hautes pressions de compression. Nous avons donc une persistance des composés dans le film

de DPPC, qui s’accroît avec l’augmentation de la concentration en produits.

Le tensioactif L12DC10 à un comportement singulier (Figure 11D), car même à des

concentrations plus importantes, son isotherme de compression présente toujours un plateau

caractéristique de la coexistence des phases liquide expansé - liquide condensé à 5 mN/m ce

qui indique une adsorption moins importante à l’interface. Ce comportement est en accord

avec l’isotherme de compression du produit pur, présentée antérieurement (reprise en Figure

11E). De plus, c’est le seul composé à être complètement expulsé de la monocouche de

DPPC, même à des concentrations plus importantes.

Un autre aspect révélé par ces isothermes de compression est la présence d’un plateau

à une valeur bien spécifique pour chaque dérivé catanionique dendritique quelle que soit la

concentration, en présence ou en absence de DPPC.

Une comparaison des isothermes de compression de ces composés dendritiques à la

même concentration, en absence et en présence de DPPC est présentée - figure 12. Comme

nous l’avons déjà observé, la pression au collapse est corrélée aux contributions hydrophobes.

Cela s’explique par les forces de cohésion (effets hydrophobes et interactions de van der

Waals) qui existent entre les chaînes alkyles des molécules compactées au niveau de la

monocouche. Cette force de cohésion impose une barrière de désorption des molécules

tensioactives d’autant plus élevée que les composés sont hydrophobes (Tableau 4). Ainsi le

composé le moins hydrophobe, le L12DC3 présente une pression d’expulsion de la


99

monocouche aux alentours de 20mN/m, tandis que le dérivé le plus hydrophobe, le L16DC10,

est resolubilisé dans la sous -phase à une pression beaucoup plus importante de 52 mN/m.

30 40 50 60 70 80 90 100 1100

10

20

30

40

50

60


DPPC

DPPC + L12DC

3 1,33*10-8M

DPPC + L16DC

3 1,33*10-8M

DPPC + L12DC

10 1,33*10-8M

DPPC + L16DC

10 1,33*10-8M

Press

ion de surface

mN/m

0 200 400 600 800 1000

0

10

20

30

40

50

60


L12DC

3 1,8*10

-8M

L16DC

3 1,8*10

-8M

L12DC

10 1,8*10

-8M

L16DC

10 1,8*10

-8M

Press

ion de surface

mN/m

Figure 12: Comparaison entre les isothermes de compression des tensioactifs

catanioniques dendritiques en présence (A) ou en absence (B) de DPPC

à 20°C (0,15M aCl) (*concentrations finales en composé catanionique dendritique dans la sous-phase; rap. molaire LXDCy : DPPC =

1 : 12)

Composé Pression de collapse (avec DPPC)

π (m/m)

Pression de collapse (sans DPPC)

π (m/m)

L12DC3 20 18

L16DC3 40 40

L12DC10 45 46

L16DC10 52 54

Tableau 4 : Valeurs des pressions de collapse des tensioactifs catanioniques dendritiques

en présence ou en absence de DPPC

Tous ces résultats indiquent qu’il y a une forte interaction entre les tensioactifs

dendrimères catanioniques et le modèle membranaire et que l’incorporation et la persistance

dans la monocouche augmentent avec l’hydrophobie des composés. Les profils des

isothermes de compression révèlent aussi que dans les conditions expérimentales, l’expulsion

complète des composés catanioniques de la monocouche a lieu à des pressions de surface

supérieures à 30 mN/m, pression latérale moyenne d’une membrane cellulaire [26, 27].

* * A) B)


100

Afin de mieux comprendre l’influence de l’hydrophobie de tous les éléments

constitutifs des dérivés catanioniques dendritiques nous avons étudié plus en détail la famille

des composés comportant le dendrimère DC3. Le choix de cette famille de produits est justifié

par le fait que ces composés présentent un plus d’intérêt biologique car c’est bien le composé

L16DC3 qui est le plus actif de la série et le composé L12DC3 présente un léger effet de

multiplicité de site. De plus, la possibilité d’analyser le comportement du sel de sodium du

dendrimère DC3 nous permet de réaliser une comparaison complète de l’interaction avec la

DPPC de tous les constituants de cette famille. Ainsi les profils des isothermes de

compression des deux tensioactifs catanioniques L12DC3 et L16DC3 aussi bien que ceux des

deux aminolactitols correspondants et le sel de sodium du dendrimère DC3 ont été enregistrés

(Figure 13).

Les expériences réalisées pour tous les produits à la même concentration en

aminolactitol montrent la faible incorporation et même l’expulsion complète de la

monocouche de DPPC des composés les moins hydrophobes comme l’aminolactitol L12 et le

dendrimère DC3 (Figure 13). Nous pouvons observer aussi une incorporation plus importante

des dendrimères catanioniques L12DC3 et L16DC3 liée à une synergie d’interaction entre les

tensioactifs constitutifs (DC3 et L12, L16 respectivement) et la DPPC.

40 50 60 70 80 90 100 110

0

10

20

30

40

50

60


DPPC

DPPC + L12 1,6*10-7M

DPPC + L16 1,6*10

-7M

DPPC + DC3Na 1,33*10-8M

DPPC + L12DC

3 1,33*10

-8M

DPPC + L16DC

3 1,33*10-8M

Pression de surface

mN/m

Figure 13: Comparaison entre les isothermes de compression des tensioactifs constitutifs

des catanioniques dendritiques L12DC3 et L16DC3 en présence de DPPC à 20°C (0,15M

aCl) (*concentrations finales en composé catanionique dendritique dans la sous -phase; rap. molaire LXDCy : DPPC = 1 : 12)

Afin de vérifier qu’à la pression de collapse il s’agit bien d’un phénomène de

désorption et non pas d’une réorganisation de la monocouche en bi- ou multicouches, avec

expulsion des composés catanioniques vers la phase air, nous avons réalisé des mesures de

*


101

spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) [28] sur les monocouches formées à

l’interface eau/air.

Les spectres IRRAS enregistrés pour le composé L16DC3 en présence et en absence de

DPPC aussi bien que le spectre témoin de la DPPC nous ont aidé à confirmer notre hypothèse

concernant l’expulsion dans la sous -phase des composés catanioniques dendritiques à partir

d’une certaine compression.

Ainsi, en analysant la région caractéristique de la tête polaire nous pouvons observer

qu’à une pression de surface de 30mN/m (Figure 14b-A) la monocouche mixte DPPC -

L16DC3 (formée par l’adsorption du composé catanionique dans une monocouche de DPPC

non comprimée) présente les bandes caractéristiques du dendrimère catanionique – la bande

phosphonate ῡas(PO3-) à 1157 et à 1191 cm-1. À cette pression, les bandes correspondant aux

élongations asymétriques (ῡas(PO2-) à 1227 cm-1) et symétriques (ῡs(PO2

-) 1088 cm-1),

caractéristiques de la DPPC, ne sont pas décelables. Cela n’est pas surprenant car l’isotherme

de compression de cette monocouche mixte à 30mN/m nous indique l’adsorption d’une

importante quantité de composé tensioactif L16DC3 à l’interface (Figure 14a-A).

En comprimant à 40mN /m, l’allure du spectre IRRAS de la monocouche analysée

change (Figure 14b-B), et l’on peut désormais observer les bandes caractéristiques des deux

composés DPPC et L16DC3. En effet, le profil caractéristique du composé catanionique

dendritique L16DC3 s’estompe au profit de celui de la DPPC. Ce comportement, complété par

l’information donnée par l’isotherme de compression (Figure 14a-B) confirme l’expulsion du

dendrimère catanionique vers la sous -phase.

Les spectres IRRAS enregistrés à une pression de compression de 45 mN/m (Figure

14b-C) révèlent le profil caractéristique du DPPC perturbé par la présence de l’association

catanionique L16DC3. Comme nous l’indique aussi l’allure de l’isotherme de compression

(Figure 14a-C), même à une pression de surface aussi élevée, le tensioactif n’est pas

complètement resolubilisé dans la sous -phase et il coexiste à l’interface avec la DPPC.


102

40 50 60 70 80 90 100 1100

10

20

30

40

50

60 DPPC + L16DC

3 1,33*10

-8M

DPPC

Aire par molécule

A2

Pression de surface

mN/m

30 mN/m

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

0,004

0,006

1000110012001300

nombre d'onde (cm-1)

-log(R/R0)

1,11x10-7M L16DC3 equil 30mN/mDPPC comp 30mN/mDPPC inj L16DC3 comp 30mN/m

40 mN/m

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

0,004

0,006

1000110012001300


-log(R/R0)

1,11x10-7M L16DC3 comp 40mN/mDPPC inj L16DC3 comp 40mN/m 66AADPPC comp 40 mN/m

45 mN/m

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

0,004

0,006

1000110012001300


-log(R/R0)

1,11x10-7M L16DC3 comp 40mN/mDPPC inj L16DC3 comp 45mN/m DPPC comp 45 mN/m

Figure 14:

a) Isothermes de compression du DPPC et du tensioactif L16DC3 en présence de DPPC

b) Bandes caractéristiques de la tête polaire des spectres IRRAS du L16DC3 et de la

DPPC enregistrés pour les poins indiqués sur l’isotherme de compression (x – points de mesure en IRRAS, A) à 30mN/m ; B) à 40mN/m ; C) à 45mN/m; conc L16DC3

= 1,33x10-8M ; rap. molaire L16DC3 : DPPC = 1 : 12; T =20°C ; 0,15M NaCl polarisation – p, αi = 40°)

Par analyse des vibrations d’élongation caractéristiques des groupements CH2 qui

apparaissent dans la région 2800-3000 cm-1 nous avons obtenu des informations

supplémentaires. Les bandes des vibrations asymétriques et symétriques des élongations des

CH2 se situent entre 2924 - 2918 et 2855 - 2850 cm–1 respectivement, la fréquence de

vibration étant dépendante de la conformation des chaînes alkyles [29]. Ces valeurs peuvent

donner une estimation du taux de désordre (conformation gauche) ou d’ordre (conformation

trans) au sein des chaînes alkyles. Les spectres IRRAS obtenus pour le dendrimère

catanionique L16DC3 en absence de DPPC, à 30mN/m révèlent des bandes à ῡas(CH2) = 2924

cm-1 et ῡs(CH2)= 2854 cm-1 (Figure 15A) qui indiquent une conformation gauche des chaînes

alkyles, donc un taux important de désordre. En présence de DPPC, ces valeurs sont décalées

ῡ (P=O) 1257

ῡs(PO2-)

1088

ῡas(PO2-)

1157

ῡas(PO2-)

1227

B

ῡas(PO2-)

1227

ῡ (P=O) 1257

ῡas(PO2-)

1157

ῡs(PO2-)

1088

C

ῡs(PO2-)

1088

ῡas(PO2-)

1157

ῡas(PO2-)

1227

ῡas (PO2) 1191

A

b)

B

A x x

x C

x x x

a)



103

à ῡas(CH2) = 2920 cm-1 et ῡs(CH2)= 2850 cm

-1, valeurs caractéristiques aussi pour la DPPC

pure. Cela indique à la fois que les chaînes alkyles sont plus ordonnées, le taux de

conformation trans étant augmenté, et que la présence du tensioactif au sein de la

monocouche de DPPC ne perturbe pas cette conformation spécifique d’une phase condensée.

30 mN/m

-0,01

-0,008

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

28002850290029503000


-log(R/R0)

1,11x10-7M L16DC3 equil 30mN/mDPPC comp 30mN/mDPPC inj L16DC3 comp 30mN/m

40mN/m

-0,012

-0,01

-0,008

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

28002850290029503000


-log(R/R0)

1,11x10-7M L16DC3 comp 40mN/mDPPC inj L16DC3 comp 40mN/m 66AADPPC comp 40 mN/m

c

45 mN/m

-0,012

-0,01

-0,008

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

28002850290029503000


-log(R/R0)

1,11x10-7M L16DC3 comp 40mN/mDPPC inj L16DC3 comp 45mN/m DPPC comp 45 mN/m

Figure 15: Bandes caractéristiques des vibrations d’élongation des groupements CH2 des

spectres IRRAS du L16DC3 et

de la DPPC enregistrés pour les poins indiqués sur

l’isotherme de compression – figure 14a (A) à 30mN/m ; B) à 40mN/m ; C) à 45mN/m; conc L16DC3 = 1,33x10

-8M ; rap. molaire L16DC3 : DPPC = 1 : 12; T =20°C ; 0,15M NaCl ; polarisation – p, αi = 40°)

La diminution de l’intensité des signaux caractéristiques des vibrations d’élongation

des groupements CH2 enregistrés pour le mélange DPPC - L16DC3 par rapport au DPPC seul

(Figure 15A) peut être liée à une augmentation de l’angle d’inclinaison des chaînes alkyles

par rapport à la normale de la surface de l’interface [28]. En augmentant la pression de surface

nous observons que les intensités des deux bandes à 2920 cm-1 et 2850 cm-1 deviennent

équivalentes en intensité (Figure 15B, C) en raison d’une expulsion quasi-totale du composé

L16DC3 vers la sous -phase et d’une meilleure compaction des chaînes alkyles de la DPPC.

Ces résultats montrent qu’il y a une interaction entre le tensioactif L16DC3 et la

monocouche de DPPC et que son incorporation ne modifie pas la conformation trans mais

peut perturber l’angle d’inclinaison des chaînes alkyles de la DPPC.

2924

ῡas(CH2) 2920

ῡs(CH2) 2850

2854

ῡas(CH2) 2920

ῡs(CH2) 2850 ῡas(CH2)

2920

ῡs(CH2) 2850

A B C


104

Toutes ces expériences correspondent à l’adsorption des molécules de tensioactif à

l’interface air/eau où nous avons préalablement étalé une monocouche de DPPC non

comprimée. Afin d’essayer de se rapprocher encore davantage de conditions biologiques,

nous nous sommes intéressés par la suite à l’étude de l’interaction de nos composés

catanioniques sur une monocouche de DPPC comprimée à 30mN/m, la pression latérale

moyenne existante au sein des bicouches membranaires cellulaires.

Ainsi, nous avons enregistré la variation de l’aire par molécule dans le temps, à une

pression constante d’une monocouche de DPPC comprimée à 30mN/m sous laquelle nous

avons injecté des solutions de tensioactifs catanioniques dendritiques L16DC3 et L12DC3.

L’injection des composés dans la sous -phase aqueuse (0,15M NaCl) se fait de manière

homogène et la pression est maintenue à 30mN/m grâce aux barrières mobiles de la cuve de

Langmuir.

Les résultats présentés figure 16 montrent que malgré la pression latérale importante,

les composés tensioactifs arrivent à s’incorporer dans la monocouche de DPPC.

L’incorporation est très faible dans le cas du dendrimère catanionique L12DC3 qui est moins

hydrophobe et qui, comme nous l’avons précédemment montré présente une pression de

désorption de l’interface d’environ 20 mN/m, donc bien inférieure à celle utilisée pour cette

expérience. Par contre, à cette même concentration, l’incorporation du composé dendritique

L16DC3 dans la monocouche phospholipidique est plus importante (Figure 16). De plus, à

cette pression latérale équivalente à celle d’une membrane biologique, le composé L16DC3

n’est pas complètement expulsé de l’interface, même après une période de huit heures.

Afin d’être sûrs que dans les conditions expérimentales employés il n’y a pas

d’incorporation préférentielle dans la monocouche de DPPC d’un des constituants de

l’assemblage catanionique L16DC3, en raison d’une partielle ségrégation, nous avons réalisé le

même type d’expérience en utilisant l’aminolactitol L16. Les résultats montrent qu’en

employant ce composé à une concentration équivalente en L16 à celle de la solution de L16DC3

la perturbation dans la monocouche de phospholipides est moins importante.


105

Figure 16: Incorporation des tensioactifs L16DC3, L16, L12DC3 et L16 dans une

monocouche de DPPC comprimée à 30m/m à 20°C (0,15M aCl) (concentration finale en composé catanionique dendritique dans la sous-phase 2,3x10-8M ; rap. molaire LXDC3 :

DPPC = 1 : 12)

Les spectres IRRAS enregistrés durant ces expériences d’incorporation des composés

catanioniques dendritiques dans les monocouches de DPPC comprimées à 30mN/m sont

similaires à ceux décrits antérieurement (Figure 14b-C et 15C) pour les monocouches non

comprimées. Ainsi, cette interaction catanionique - DPPC ne semble pas avoir un effet

perturbateur sur l’organisation des chaînes alkyles de la DPPC. Cependant, les résultats

obtenus en IRRAS indiquent des perturbations au niveau des têtes hydrophiles de la DPPC,

dues probablement à une redistribution des interactions électrostatiques entre les groupements

phosphate de la DPPC et les groupements phosphoniques des associations catanioniques,

chargés négativement, vis-à-vis des groupements ammonium de la DPPC et de

l’aminolactitol.

Pour résumer, tous ces résultats mettent en évidence les interactions qui existent entre

ces nouveaux composés catanioniques dendritiques et le modèle membranaire, interactions

qui semblent être corrélées à l’hydrophobie des associations catanioniques. Pourtant, ces

interactions ne sont pas spécifiques, car comme nous l’avons montré à l’aide des isothermes

de compression et des mesures spectrométriques IRRAS, en augmentant la pression de

surface, les composés sont expulsés de la monocouche totalement ou partiellement (en

fonction de la concentration en tensioactif) pour au final retrouver le profil caractéristique de

la DPPC pure ou légèrement impure. De plus, nous pouvons affirmer que ces interactions ne

sont pas spécifiques car la pression de resolubilisation des tensioactifs, ayant une valeur


106

précise pour chaque association catanionique, présente la même valeur en présence ou en

absence de DPPC.

Le fait de retrouver sur les isothermes de compression (à des concentrations faibles en

tensioactifs) le profil de la DPPC pure ou légèrement décalé vers des aires par molécule plus

grandes (∆Å2 maximum 7 à 8) (à des concentrations plus importantes en tensioactifs) après

l’expulsion des molécules tensioactives de la monocouche, met en évidence également

l’absence d’effet désorganisateur de nos composés sur le modèle membranaire.

Même si l’hydrophobie de ces composés semble être un facteur décisif du processus

d’incorporation dans le modèle membranaire, il ne peut pas être tenu pour responsable de la

cytotoxicité de nos produits. Cette affirmation est soutenue par le fait que malgré leurs

intensités sensiblement différentes d’interaction, de pénétration et de persistance dans la

monocouche phospholipidique qui sont directement corrélées à leur hydrophobie, ces

composés présentent des toxicités cellulaires comparables (CC50 de 5,3 à plus de 10 µM).

Pour donner un exemple plus précis, le composé L12DC3 qui est le moins hydrophobe de cette

série de catanioniques dendritiques présente une très faible interaction et pénétration dans la

monocouche de DPPC comprimée par rapport à son analogue L16DC3 et pourtant, ces

composés présentent des valeurs de cytotoxicité similaires, CC50 de plus de 10 et 5,3µM

respectivement. De plus, à une concentration équivalente, l’aminolactitol L16 s’incorpore plus

dans le film de DPPC comprimé à 30 mN/m que l’association catanionique L12DC3 et malgré

cela il est moins toxique que celle-ci (CC50 de 75 et à plus de 10 µM respectivement).

L’analyse des spectres IRRAS nous a également permis d’observer que l’incorporation

de ces catanioniques dendritiques dans le modèle membranaire ne perturbe pas l’organisation

des chaînes alkyles de la DPPC. Cependant, ces résultats révèlent des interactions et de faibles

modifications au niveau des têtes hydrophiles de la DPPC.

En conséquence, les résultats de cette étude sur les monocouches de DPPC indiquent

que la toxicité cellulaire de ces tensioactifs catanioniques dendritiques n’est liée ni à leur

hydrophobie ni à leur incorporation dans la membrane plasmique.

Ainsi, nous étudierons par la suite les propriétés physico-chimiques de ces dérivés

catanioniques afin d’essayer d’identifier d’autres facteurs (l’organisation intrinsèque de

l’édifice catanionique, l’agrégation supramoléculaire, la morphologie des agrégats) qui

pourraient être responsables de la toxicité cellulaire.


107

VII PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES CATANIONIQUES

DENDRITIQUES ANALOGUES DU GALCER

Dans un premier temps, nous présenterons l’étude des propriétés tensioactives de ces

composés dendrimères catanioniques. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une

mesure de la distribution de taille ainsi que de la morphologie des agrégats formés dans l’eau

par ces dendrimères catanioniques.

VII.1 Etude des propriétés tensioactives

Les mesures de variation de la tension de surface en fonction de la concentration ont

été réalisées par la méthode de l’anneau selon Du Noüy. Des solutions de différentes

concentrations de ces composés dendritiques, obtenues par dilution d’une solution aqueuse

concentrée dans une solution 0,15M NaCl, ont fait l’objet d’une étude par tensiométrie. Nous

rappelons que cette solution saline a pour rôle d’exercer sur les tensioactifs catanioniques une

force ionique équivalente à celle qui existe en milieu biologique.

De par leur forte hydrophobie ces associations catanioniques dendritiques présentent

une faible solubilité dans l’eau. De ce fait, la stratégie adoptée pour une meilleure

solubilisation des produits dans l’eau a été l’hydratation, par l’utilisation des ultra-sons, de

films obtenus par évaporation sous vide des solutions préparées dans un mélange eau/n-

propan-1-ol (1: 3 volumique). Nous mentionnons que les mesures ont été réalisées à une

température de 25°C et non à 37°C (conditions biologiques) afin de réduire l’évaporation du

solvant.

Les résultats de ces mesures tensiométriques montrent que ces quatre dérivés

dendritiques présentent des propriétés tensioactives car ils abaissent la tension de surface de la

solution aqueuse. L’allure de la variation de la tension superficielle en fonction du logarithme

de la concentration en tensioactif catanionique présente une rupture de pente qui est associée à

une organisation du tensioactif dans l’eau (Figure 17). La solubilité limitée de ces composés

dans l’eau n’a pas permis leur étude à des concentrations supérieures à 10-4 M.


108

35

40

45

50

55

60

65

70

75

-7 -6 -5 -4 -3 -2LogC

Ts (mN/m

)

L16DC3L16DC10L12DC3L12DC10L12L16

Figure 17: Courbes de variation de la tension superficielle en fonction du logarithme de

la concentration des dérivés dendritiques catanioniques et des aminolactitols

correspondants à 25°C dans aCl 0,15M

Composés CAC (µM) TSCAC (m/m)*

L16 96 39

L16DC3 6 47

L16DC10 7 48

L12 460 38

L12DC3 12 45

L12DC10 27 45

* tension de surface à la CAC

Tableau 5 : Valeurs des CAC et TSCAC pour les dérivés dendritiques catanioniques et les

aminolactitols correspondants, L12 et L16 à 25°C dans aCl 0,15M

Les informations obtenues par ces mesures de tensiométrie nous permettent de faire

une comparaison entre les propriétés d’agrégations (CAC) et les propriétés biologiques (CI50

et CC50) de ces composés catanioniques dendritiques. Les résultats rassemblés dans le tableau

6 montrent que toutes les associations dendritiques aussi bien que les aminolactitols

correspondants sont actifs à l’état monomère, car toutes les CI50 sont inférieures à leurs CAC.

En ce qui concerne leur toxicité, nous pouvons remarquer que les composés L12 et L12DC10

deviennent toxiques déjà à l’état non -agrégée car leurs CC50 sont inférieures à leurs CAC.

Nous pouvons également observer que pour les associations catanioniques L16DC3, L16DC10 et

L12DC3 ainsi que pour l’aminolactitol L16, les valeurs de CC50 sont très proches de celles de


109

CAC (Tableau 6). Cela indique que ces composés deviennent toxiques à des concentrations

avoisinant leurs concentrations d’agrégation critique.

Composés CI 50 (µµµµM) CC50 (µµµµM) CAC (µM)

L16 7,1 ± 1,6 75 ± 8 96

L16DC3 0,5 ± 0,2 5,3 ± 1,9 7

L16DC10 1,7 ± 0,1 7,2 ± 0,5 8

L12 55,5 ± 23 130 460

L12DC3 2,4 ± 1 > 10 12

L12DC10 4,4 ± 0,8 8 ± 0,2 27

Tableau 6: Paramètres issus des tests biologiques in vitro et des mesures des tensions de

surface pour les dérivés dendritiques catanioniques et les aminolactitols correspondants,

L12 et L16

Afin de réaliser une corrélation plus précise entre les propriétés biologiques (CI50 et

CC50) et les propriétés d’agrégation dans un milieu aqueux de ces composés catanioniques

dendritiques nous avons représenté sur le même graphique la variation de l’activité

inhibitrice, de la toxicité et de la tension de surface en fonction du logarithme de la

concentration (Figure 18).

Il est intéressant de noter que les composés L16DC3, L16DC10 et L12DC3 présentent une

activité anti-VIH non -négligeable (inhibition virale d’environ 20%) à de très faibles

concentrations (10-10 – 10-9M). Ces tensioactifs catanioniques présentent cependant une

activité antivirale réellement significative à des concentrations supérieures à 10-7M pour le

L16DC3, et même supérieure à 10-6M pour les composés L16DC10, L12DC3 et L12DC3. En ce

qui concerne l’activité inhibitrice des aminolactitols L16 et L12, nous pouvons observer qu’ils

deviennent actifs contre le VIH à des concentrations proches et respectivement supérieures à

10-5 M.

Nous avons ensuite étudié la relation entre la cytotoxicité et la CAC de ces

associations catanioniques dendritiques. Ainsi, nous pouvons observer pour tous les composés

analysés, les aminolactitols inclus, l’absence de toxicité de ces tensioactifs sous forme

monomère, c'est-à-dire non –agrégée. Cependant, il faut souligner une brusque augmentation

de la toxicité cellulaire de ces composés catanioniques pour des concentrations proches de

celles des CAC. Ce comportement indique clairement que le phénomène d’agrégation joue un

rôle déterminant sur la cytotoxicité de ces analogues catanioniques dendritiques.


110

L16

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-10 -8 -6 -4LogC

Ts (mN/m

)

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

Activité (Toxicité)%

Tens.superf. L16 Toxicité Activité

L12

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-10 -8 -6 -4 -2LogC

Ts (mN/m

)

-20

0

20

40

60

80

100

120


Tens.superf. L12 Toxicité Activité

Figure 18: Courbes de variation de la tension superficielle, de l’activité inhibitrice et de

la toxicité en fonction du logarithme de la concentration des dérivés dendritiques

catanioniques et des aminolactitols correspondants

Le composé L12DC10 semble être le seul de cette série de catanioniques dendritiques à

présenter une brusque et importante toxicité cellulaire à des concentrations inférieures à sa

CAC. Ce comportement particulier pourrait être expliqué par la présence du produit plus dans

la sous -phase, sous forme agrégée, qu’à l’interface air/eau (comme nous l’avons

précédemment noté en analysant l’isotherme de compression du produit seul et les résultats

L16DC10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4LogC

Ts (mN/m

)

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120


Tens.superf. L16DC10 Toxicité Activité

L16DC3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

LogC

Ts (mN/m

)

-20

0

20

40

60

80

100

120



L12DC3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

LogC

Ts (mN/m

)

-40

-20

0

20

40

60

80

100



L12DC10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

LogC

Ts (mN/m

)

-60

-40

-20

0

20

40

60

80




111

des mesures de tensiométrie) malgré son hydrophobie plus importante que celle du composé

L12DC3. En effet, ce phénomène pourrait entraîner une agrégation du composé dans la

solution aqueuse à une concentration légèrement inférieure à celle déterminée par les mesures

de tensiométrie. Ainsi, la cytotoxicité du composé L12DC3 pourrait être due, comme dans le

cas des autres tensioactifs catanioniques dendritiques, au processus d’agrégation

supramoléculaire.

La toxicité des aminolactitols à des concentrations proches et supérieures à leur

concentration micellaire critique s’explique par l’effet détergent de ces composés sur les

membranes cellulaires.

Afin de comprendre comment le phénomène d’agrégation pourrait être à l’origine de

la toxicité cellulaire de ces associations catanioniques dendritiques, nous nous intéresserons

par la suite à la morphologie des agrégats formés par ces composés dans l’eau. Cette étude

nous donnera également des indications sur la conformation adoptée par ces entités

catanioniques à l’état monomère au sein des agrégats.

Avant d’analyser la morphologie de ces agrégats, nous présenterons les résultats de

l’étude de distribution de taille et de stabilité dans le temps de ces objets supramoléculaires.

VII.2 Etude de la distribution de taille des agrégats

La diffusion quasi élastique de la lumière permet de déterminer le diamètre

hydrodynamique d’une particule (dans une solution de viscosité donnée et à une température

connue) en fonction de son coefficient de diffusion selon l’équation de Stockes-Einstein [30].

Comme nous l’avons déjà mentionné, les échantillons analysés (c = 80µM, dans l’eau)

ont été préparés par hydratation des films des produits obtenus par évaporation des solutions

préparées dans un mélange eau/propan-1-ol (rapport volumique de 1:3). L’utilisation des

ultra-sons a été nécessaire afin d’obtenir des solutions aqueuses homogènes de ces tensioactifs

catanioniques dendritiques peu solubles dans l’eau.

L’étude par diffusion de la lumière montre que les quatre associations catanioniques

forment des agrégats dans l’eau dont la taille moyenne augmente avec l’hydrophobie de

l’édifice catanionique. Les histogrammes obtenus révèlent des distributions gaussiennes de la

taille des agrégats centrées entre 200 et 600 nm suivant le mélange catanionique (Figure 19).

Les solutions sont stables dans le temps pendant 6 jours; ensuite le mélange précipite.


112

L16DC3 L16DC10

diamètre hydrodynamique moyen = 340 nm indice de polydispersité = 0,44


L12DC3 L12DC10



Figure 19 : Histogrammes représentant la distribution de taille des agrégats formés par

les dérivés dendritiques catanioniques (c = 80µM, T = 25°C)

Afin de pouvoir réaliser une meilleure corrélation entre les propriétés physico-

chimiques et biologiques de ces tensioactifs catanioniques bicaténaires nous avons étudié leur

comportement d’agrégation et de stabilité dans le temps dans un milieu salin (0,15M NaCl)

qui a le rôle d’exercer sur les associations catanioniques une force ionique proche de celle qui

existe en milieu biologique. En essayant le plus possible de reproduire les conditions

Diamètre (nm) Diamètre (nm)


Intensité (%

)

Intensité (%

) Intensité (%

)

Intensité (%

)


113

expérimentales utilisées pour les essais biologiques in vitro, les solutions supplémentaires

analysées en diffusion de la lumière ont été préparées par dilution d’une solution concentrée

(solution mère, c = 80µM, dans l’eau) dans une solution saline (0,15M NaCl), et ont été

conservées et analysées à une température de 37°C. Les résultats obtenus pour ces solutions

(cfinale = 30µM) révèlent que pour les quatre associations catanioniques les agrégats formés

dans l’eau demeurent présents lors de la dilution. Il faut noter que malgré une diminution du

diamètre moyen hydrodynamique (de 40 - 80nm) pour l’ensemble des composés, les résultats

sont similaires à ceux précédemment présentés. Les solutions sont également stables dans le

temps pendant 6 jours; ensuite le mélange précipite.

VII.3 Etude de la morphologie des agrégats

Afin d’étudier la morphologie des agrégats supramoléculaires formés par ces

tensioactifs catanioniques dans l’eau nous avons utilisé la microscopie électronique en

transmission (MET). Cette technique nous permet de visualiser et d’analyser la forme et la

taille des agrégats à une échelle nanométrique. Deux méthodes différentes ont été employées

pour la préparation des échantillons : la méthode par coloration négative et la cryofracture.

Pour la technique par coloration négative, le contrastant choisi est le phosphotungstate

de sodium, ajusté à un pH neutre afin d’éviter toute éventuelle perturbation du système

catanionique.

La cryofracture permet de travailler sans contrastant et de figer la structure des

agrégats en solution et ainsi d’éviter la déshydratation de l’échantillon.

Les expériences de cryofracture ont été réalisées en collaboration avec le Dr. Brigitte

Tiersch et le Prof. Dr. Joachim Kötz de l’Université de Potsdam, Allemagne.

Ces deux méthodes employées pour la préparation des échantillons nous ont permis de

visualiser les agrégats formés par ces dérivés dendritiques dans une solution aqueuse. Les

solutions catanioniques analysées ont été préparées à la même concentration (c = 80µM, dans

l’eau) et de la même manière que celles qui ont été employées pour l’étude de diffusion quasi

élastique de la lumière.


114

L’analyse des micrographies électroniques obtenues avec les deux techniques de MET

révèle la formation de vésicules unilamellaires pour les quatre dérivés dendritiques (Figure 20

et 21). Les résultats obtenus avec ces deux techniques complémentaires sont en accord

puisque à la fois la forme et la taille des vésicules de chaque assemblage catanionique sont

similaires.

Nous pouvons observer que toutes les associations forment des vésicules dont la

distribution de taille est polydisperse allant de 30 ou 40 nm à 260 ou même 380nm de

diamètre, en fonction de l’hydrophobie de l’édifice catanionique dendritique. Dans ce sens,

les composés comportant l’aminolactitol L16 forment des vésicules plus volumineuses que les

composés comportant l’aminolactitol moins hydrophobe L12. Par exemple, les composés

L16DC3 et L16DC10 sont capables de former des agrégats vésiculaires dont le diamètre peut

aller jusqu’à 330 et 380nm respectivement, alors que les composés L12DC3 et L12DC10

forment des vésicules plus petites d’un diamètre maximal d’approximativement 260 et 270nm

respectivement. Cette étude révèle aussi l’existence d’une faible variation de taille (~50 nm)

des agrégats pour les composés L16DC3 et L16DC10 comportant le même aminolactitol mais un

squelette dendritique différent, cette différence étant réduite dans le cas des assemblages

catanioniques L12DC3 - L12DC10. Une explication pourrait être la meilleure compaction au

sein de l’association catanionique L12DC10 en raison de la similarité de longueurs des chaînes

L12 – C10.

Pour les tensioactifs catanioniques comportant le dendrimère DC10 les diamètres

moyens mesurés en microscopie électronique sont inférieurs à ceux qui ont été obtenus en

diffusion quasi élastique de la lumière. Cela pourrait être expliquée par la tendance des

vésicules à s’agglutiner (comme nous pouvons le remarquer sur les micrographies

électroniques – Figure 20B et E), ce qui fausse les valeurs des diamètres hydrodynamiques

moyens obtenus en DLS.


115

A

B

C

D

E

Figure 20 : Micrographies électroniques des vésicules formées par les catanioniques

dendritiques L16DC3 (A, B, C) et L16DC10 (D, E) (Technique de coloration négative A et D; Cryofracture B, C et E)

A

B

C

D

E

Figure 21 : Micrographies électroniques des vésicules formées par les catanioniques

dendritiques L12DC3 (A, B, C) et L12DC10 (D, E) (Technique de coloration négative A et D; Cryofracture B, C et E)


116

En analysant les micrographies électroniques obtenues par la cryofracture nous

pouvons remarquer que les composés comportant le squelette dendritique DC10 (L12DC10 et

L16DC10) forment des vésicules dont les membranes sont fracturables (empreintes rondes dont

l’ombrage n’est pas uniforme, donnant l’impression de bosses et de creux - Figure 20E et

Figure 21E). Cette fracturabilité indique que le tensioactif ne traverse pas la membrane

vésiculaire ce qui nous permet de conclure que la conformation adoptée par l’entité

catanionique dans ces vésicules est une conformation en "chou-fleur". Ainsi, la fracture de

celles-ci se propage selon un plan de faibles interactions qui passe juste au milieu de la

bicouche vésiculaire (Figure 22A).

Figure 22 : Représentation schématique d’une bicouche membranaire fracturable (A) -

conformation en "chou-fleur" et d’une bicouche membranaire non-fracturable (B)

comportant une conformation cylindrique et en "chou-fleur" du tensioactif

En ce qui concerne les composés comportant le squelette dendritique DC3 (L12DC3 et

L16DC3) les micrographies électroniques indiquent que ces tensioactifs catanioniques sont

capables de former à la fois des vésicules dont les membranes sont fracturables (Figure 20B et

conformation cylindrique - le dendrimère traverse l’association catanionique

H2O

A)

Vésicule formée par les catanioniques dendritiques

Bicouche membranaire fracturable

OU

Plan de fracture

Bicouche membranaire non -fracturable

B)

conformation en

"chou-fleur"

Il n’y a pas

de plan

de fracture


117

Figure 21B) ainsi que des vésicules dont les membranes ne sont pas fracturables (empreintes

formant des anneaux - Figure 20C et Figure 21B et C). La non- fracturabilité des agrégats

vésiculaires pourrait être en accord avec la coexistence dans la membrane des deux

conformations possibles : cylindrique et en "chou-fleur" (Figure 22B). C’est en raison de cette

conformation cylindrique qui traverse la membrane vésiculaire que celle-ci n’est pas

fracturable. Pourtant, la seule présence au sein des agrégats d’une conformation cylindrique,

symétrique et rigide, pourrait conduire seulement à la formation des bicouches planes (telles

les phases lamellaires), ce qui ne concorde pas avec la courbure qui existe dans les

membranes vésiculaires. Celle-ci pourrait être apportée par contre, par une coexistence de la

conformation cylindrique avec une conformation en "chou-fleur" qui, par sa forme conique a

la possibilité d’induire une courbure membranaire (Figure 22B).

A la suite de l’étude morphologique des objets supramoléculaires formés par ces

composés catanioniques dendritiques nous pouvons remarquer que la structure du squelette

dendritique a une forte influence sur la conformation adoptée par ces tensioactifs au sein des

vésicules. Ainsi, le dendrimère DC10 favorise une conformation en "chou-fleur" tandis que le

dendrimère DC3 permet aux associations catanionique d’adopter les deux conformations

possibles pour ces tensioactifs : cylindrique et en "chou-fleur".

Afin de confirmer les résultats obtenus en utilisant la diffusion de la lumière à savoir,

la persistance des agrégats formés dans l’eau par ces tensioactifs catanioniques lors d’une

dilution dans une solution saline (0,15M NaCl), nous avons étudié ces échantillons par la

MET. Les solutions ont été préparées par dilution d’une solution concentrée (solution mère, c

= 80µM, dans l’eau) dans une solution saline jusqu’à des concentrations supérieures à leurs

CAC et ont été conservées pour quelques heures à une température de 37°C. Les

micrographies électroniques obtenues révèlent la présence d’agrégats vésiculaires qui sont

similaires à ceux précédemment présentés figures 20 et 21. Ainsi, le processus de dilution à

des concentrations finales supérieures à leurs CAC ne semble pas modifier la morphologie

des agrégats formés par ces associations catanioniques dans l’eau.

Ces données nous permettent d’établir de nouvelles corrélations entre les mesures de

tensiométrie, la morphologie des agrégats formés dans l’eau, la conformation des monomères

au sein des agrégats et les résultats biologiques.


118

Comme nous l’avons observé, les monomères de la famille de composés comportant le

squelette dendritique DC10 adoptent, au sein des agrégats vésiculaires une conformation en

"chou-fleur" tandis que les associations appartenant à la famille de composés du dendrimère

DC3 présentent, à l’état agrégé une coexistence des deux conformations possibles: cylindrique

et en "chou-fleur". Malgré cette différence d’arrangement de l’entité catanionique au sein des

agrégats, les résultats biologiques cumulés avec ceux obtenus à la suite de l’étude par

tensiométrie indiquent une toxicité similaire pour tous ces composés à l’état agrégé. Ceci nous

permet de conclure que la conformation des monomères au sein d’agrégats n’a pas

d’influence notable sur la cytotoxicité de cette classe de tensioactifs catanioniques

dendritiques à l’état agrégée.

Comme nous l’avons mentionné auparavant, la corrélation des courbes de tensiométrie

avec celles qui expriment la toxicité cellulaire de ces associations catanioniques dendritiques

indique que le processus d’agrégation est à l’origine de la toxicité cellulaire de ces composés.

Par la suite, l’étude de la morphologie des agrégats formés par ces tensioactifs catanioniques

dans l’eau nous a révélé que ces agrégats supramoléculaires ont une morphologie vésiculaire.

En conséquence, la toxicité des composés semble être due à la formation et/ou à l’interaction

des agrégats vésiculaires avec les cellules lymphocytaires. Une possible interaction et fixation

des vésicules sur des récepteurs spécifiques de la membrane cellulaire lymphocytaire ou une

agglutination possible des vésicules à la surface cellulaire pourraient engendrer des

disfonctionnements cellulaires et l’apparition d’une toxicité.

Par ailleurs, une étude bibliographique plus affinée sur ce sujet s’appuie sur les

travaux de Pavan A.[31] et ses collaborateurs qui ont étudié l’influence des vésicules chargées

et non chargées (constituées de tensioactifs ioniques et non – ioniques) sur la fixation sur

différentes cellules lymphocytaires humaines. Leurs résultats indiquent une plus grande

affinité de fixation des vésicules chargées négativement sur la membrane plasmique des

lymphocytes, en raison d’une interaction avec certains composants membranaires spécifiques.

Dès lors, il est possible d’établir une corrélation entre leurs observations et notre étude, car les

cellules utilisées pour les tests biologiques sont de nature lymphocytaire et les vésicules

formées par ces tensioactifs catanioniques dendritiques pourraient être chargées négativement.

En raison de l’equimolarité existante entre les fonctions acides dendritiques et les

groupements ammonium des aminolactitols, les agrégats vésiculaires formés par ces

associations catanioniques devrait présenter une charge globale neutre. Toutefois, nous


119

n’avons pas la preuve d’une neutralité uniformément repartie à la surface vésiculaire.

L’existence des microdomaines chargés négativement à la surface vésiculaire pourrait

favoriser l’interaction et la fixation des vésicules avec des récepteurs spécifiques des

membranes cellulaires lymphocytaires, processus qui pourrait, comme nous l’avons expliqué

ci-dessus, engendrer un effet toxique.

Ainsi, ce processus d’interaction entre les vésicules formées par ces catanioniques

dendritiques et les cellules lymphocytaires semble être plus complexe. Des expériences

supplémentaires réalisées en collaboration avec des spécialistes en immunologie pourraient

nous éclaircir sur les causes de la toxicité cellulaire induite par l’agrégation de ces composés

catanioniques dendritiques.


120

VIII CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Les travaux précédemment réalisés au laboratoire des IMRCP ont souligné l’avantage

de la simplicité de synthèse des analogues catanioniques du galactosylcéramide qui peuvent

agir en tant qu’inhibiteurs de l’entrée virale du VIH. De plus, ces travaux ont montré que

l’activité antivirale des composés catanioniques dendritiques comportant une multiplicité de

sites de reconnaissance est nettement supérieure à l’activité additive d’un nombre équivalent

de monomères analogues du GalCer. Pourtant, l’inconvénient majeur de ces composés

catanioniques dendritiques réside dans leur toxicité cellulaire non- négligeable. Comme nous

l’avons vue, cette cytotoxicité pourrait être induite par l’incorporation des composés adoptant

une conformation en "chou-fleur" dans la membrane plasmique ou par un effet détergent de

l’aminolactitol issu d’un désassemblage partiel de l’édifice catanionique.

Notre étude a eu pour but la synthèse de nouveaux assemblages catanioniques

dendritiques possédant une toxicité réduite afin de les utiliser comme leurres multisites pour

le VIH. La stratégie adoptée pour diminuer la cytotoxicité a été de travailler avec des

composés dendritiques à cœur hexafonctionnel, connus pour leur tendance à adopter une

conformation cylindrique, moins toxique. Egalement, afin de prévenir le désassemblage de

l’entité catanionique nous avons réalisé un renforcement des effets hydrophobes entre les

éléments constitutifs : dendrimère – aminolactitol.

Après la synthèse, la caractérisation et les tests de cohésion à l’interface eau/air de ces

nouveaux composés dendrimères catanioniques, les tests biologiques réalisés in vitro nous ont

montrés que la toxicité cellulaire de ces composés reste toujours dans la même gamme

micromolaire que le produit original. Afin de comprendre d’où provenait la toxicité des

composés nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l’incorporation de ces

tensioactifs catanioniques dendritiques dans des modèles de membranes cellulaires.

Ainsi, en utilisant des monocouches de phospholipides comme modèle membranaire

nous avons pu observer un comportement différent d’interaction et d’incorporation pour

chaque composé catanionique. Pourtant, cette importante différence d’incorporation qui est

directement corrélée à l’hydrophobie des composés ne concorde pas avec une toxicité

similaire des tensioactifs. De ce fait, l’hydrophobie et le processus d’incorporation à l’état

monomère des composés dans les monocouches phospholipidiques ne peuvent pas être tenus

pour responsables de la toxicité cellulaire.


121

Par la suite, afin d’identifier les facteurs responsables de la cytotoxicité de ces

nouveaux tensioactifs analogues du GalCer, nous avons étudié leurs propriétés physico-

chimiques.

Les mesures de tensiométrie ont confirmé que ces dérivés sont non -toxiques à l’état

monomérique. De plus, l’analyse de la morphologie des agrégats formés par ces composés

dans l’eau nous a permis d’identifier les conformations possibles des monomères au sein des

agrégats. Ainsi, une conformation en "chou-fleur" semble être induite par la présence du

dendrimère DC10 dans l’association catanionique, tandis que les tensioactifs catanioniques

comportant le dendrimère DC3 sont capables d’adopter les deux conformations possibles :

cylindrique et en "chou-fleur". En sachant donc que pour cette famille de nouveaux

dendrimères catanioniques les deux conformations des monomères peuvent exister à l’état

agrégé, on peut supposer que la cytotoxicité des composés n’est pas liée à la conformation des

monomères au sein des agrégats.

Il est important de mentionner que l’étude concernant l’incorporation de ces nouveaux

tensioactifs catanioniques vis-à-vis des monocouches phospholipidiques n’a été réalisée que

pour les composés sous forme monomérique et non vésiculaire, en raison des contraintes

pratiques imposés par cette technique d’analyse.

Enfin, la corrélation entre les résultats des mesures de tensiométrie avec ceux de

l’analyse de la morphologie des agrégats et ceux des tests biologiques, nous a indiqué que la

cytotoxicité de ces associations catanioniques dendritiques augmente brusquement à des

concentrations avoisinant celles de la CAC, indiquant que la formation des agrégats

vésiculaires déclenche l’apparition d’une toxicité non -négligeable.

En nous appuyant sur des résultats similaires décrits dans la littérature, nous avons

proposé d’associer la toxicité cellulaire de ces composés soit à une interaction et une fixation

des vésicules sur des récepteurs spécifiques de la membrane cellulaire lymphocytaire soit à

une agglutination possible des vésicules à la surface cellulaire, qui pourraient induire une

perturbation des fonctions et/ou des échanges cellulaires.

Une future collaboration avec des spécialistes en immunologie pourrait nous aider à

identifier les causes responsables de la toxicité cellulaire induite par l’agrégation de ces

composés catanioniques dendritiques.


122

Dans les perspectives, l’utilisation de dendrimères de structure similaire mais

comportant un marqueur phosphorescent pourrait nous permettre d’analyser en microscopie

confocale l’interaction entre ces vésicules marquées et des cellules lymphocytaires.

Concernant l’activité antivirale de cette nouvelle famille de composés, notre étude à

montré que le catanionique dendritique L16DC3 réunit les éléments clefs (l’aminolactitol L16 et

le dendrimère DC3) qui lui offrent la meilleure activité anti-VIH de la série. Ces observations

pourraient être utiles pour le design de futurs composés catanioniques dendritiques encore

plus efficaces et non toxiques.


123

IX BIBLIOGRAPHIE

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124

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Chapitre III

Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer

Chapitre III Mise au point de vecteurs catanioniques hybrides analogues du GalCer

127

I ITRODUCTIO..................................................................................... 129

II MISE AU POIT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES TESIOACTIFS MIXTES

FLUORES / HYDROGEES ...................................................................... 131

II.1 Caractéristiques particulières des chaînes alkyles fluorocarbonées................. 131

II.2 Composés covalents mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés dérivés de sucres132

II.3 Composés catanioniques mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés .................... 135

III MISE AU POIT DE VECTEURS CATAIOIQUES HYBRIDES AALOGUES

DU GALCER .......................................................................................... 136

III.1 Tensioactifs catanioniques pour la délivrance de principes actifs .................... 136

III.2 Synthèse d’analogues catanioniques du GalCer de nature hybride fluorocarboné

/ hydrocarboné .................................................................................................. 138

III.3 Analyse structurale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer............. 142

IV PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES COMPOSES CATAIOIQUES

HYBRIDES FLUORES / HYDROGEES..................................................... 145

IV.1 Etude des propriétés tensioactives ..................................................................... 145

IV.2 Etude de distribution de taille des agrégats....................................................... 148

IV.3 Etude de la morphologie des agrégats............................................................... 151

V ETUDE DE L’ITERACTIO ETRE LES COMPOSES CATAIOIQUES ET

DES MOOCOUCHES DE PHOSPHOLIPIDES ........................................... 157

VI EVALUATIO DES PROPRIETES DE VECTORISATIO SUR CELLULES

IFECTEES PAR LE VIH........................................................................ 162

VI.1 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des associations catanioniques hybrides

analogues du GalCer ........................................................................................ 162


........................................................................................................................... 164

VI.3 Formulations de l’AZT avec les tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et

L16F8 .................................................................................................................. 171

VII COCLUSIO ........................................................................................ 174

VIII BIBLIOGRAPHIE.................................................................................... 176


128


129

I INTRODUCTION

Comme nous l’avons montré dans le premier chapitre bibliographique, la polythérapie

est à l’heure actuelle, le seul moyen de diminuer et de contrôler la multiplication du VIH. Les

régimes polythérapeutiques sont constitués de différentes combinaisons de principes actifs qui

ciblent trois étapes clé du cycle de réplication du virus : l’entrée virale, la transcription et la

maturation. Pourtant, cette stratégie se heurte toujours à d’importants inconvénients parmi

lesquels, l’importante toxicité de certains médicaments. Une stratégie qui permet de réduire la

dose de principe actif administrée, tout en améliorant l’efficacité biologique et en diminuant

la toxicité du principe actif [1], consiste en l’emploi d’un système de vectorisation efficace.

Dans le chapitre précédent nous avons présenté l’influence de la multiplicité de sites

actifs sur le processus de reconnaissance du VIH et sur l’activité antivirale des analogues

dendritiques catanioniques du GalCer. Dans ce cas particulier, l’effet de multiplicité de sites

se manifeste de deux façons car il est présent autant sous la forme monomère de l’édifice

catanionique que sous la forme agrégée – vésiculaire. Pour être plus précis, les vésicules

présentent à leur surface de nombreux groupements galactose qui peuvent être considérés

comme des "clusters" de sites actifs. De ce fait, la probabilité d’interaction avec la membrane

virale est augmentée.

Rappelons également que les glycoprotéines virales gp 120 bourgeonnent à la surface

des cellules humaines infectées par le VIH, ce qui transforme la gp120 en une cible précieuse

pour le développement des thérapies anti-VIH spécifiques [2].

Ainsi, les vésicules formées par les analogues catanioniques du GalCer pourraient être

utilisées comme des vecteurs spécifiques de principes actifs anti-VIH. En raison de leur

toxicité cellulaire, les vésicules formées par les catanioniques dendritiques précédemment

présentés ne peuvent pas être envisagées pour une utilisation dans le domaine de la

vectorisation.

Dans ce troisième chapitre, nos recherches seront donc centrées sur la synthèse et

l’étude d’une nouvelle famille de composés catanioniques analogues du GalCer capables de

former spontanément des vésicules et d’agir ainsi comme des transporteurs spécifiques. De

par la multiplicité de sites de reconnaissance des vésicules formées par ces nouveaux

systèmes catanioniques mixtes fluorés/hydrogénés nous espérons augmenter la probabilité

d’interaction avec la protéine virale et, de ce fait, obtenir une bonne reconnaissance et


130

spécificité pour la membrane des cellules infectées. De plus, les produits devront présenter

des toxicités réduites aussi bien sous forme agrégée -vésiculaire que sous forme monomère.

L’ajout d’une chaîne fluorée, qui entraînera une augmentation de l’hydrophobie des

associations catanioniques a pour objectif une amélioration de la stabilité dans le temps des

agrégats vésiculaires formés par ces tensioactifs catanioniques hybrides.

Trois composés mixtes fluorés/hydrogénés, de structures chimiques variées, seront

étudiés afin d’identifier les caractéristiques structurales qui peuvent offrir une meilleure

stabilité des agrégats dans le temps, une toxicité diminuée et une bonne affinité pour le VIH.

Un assemblage catanionique non – fluoré, possédant une hydrophobie proche de celle des

composés catanioniques hybrides sera étudié parallèlement comme système de référence.

Après la synthèse et la caractérisation de ces nouveaux assemblages catanioniques,

leurs propriétés physico-chimiques et biologiques seront décrites et analysées afin d’identifier

le composé le plus adapté à l’application envisagée soit, la vectorisation de principes actifs

anti-VIH. La capacité de ces composés d’agir sous forme monomère en tant que leurres du

VIH sera également étudiée.

Ainsi, l’activité antivirale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer est

envisagée être augmentée par une stratégie de multiciblage : l’utilisation des monomères en

tant qu’inhibiteurs de l’entrée virale du VIH et l’emploi des agrégats supramoléculaires en

tant que système de délivrance spécifique de principes actifs anti-VIH.


131

II MISE AU POINT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES

TENSIOACTIFS MIXTES FLUORES / HYDROGENES

Avant de détailler la synthèse de ces nouveaux composés catanioniques hybrides, une

brève incursion dans le domaine des composés mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés sera

nécessaire afin de mieux cadrer nos recherches dans l’étude de cette famille de produits.

II.1 Caractéristiques particulières des chaînes alkyles fluorocarbonées

La coexistence d’une chaîne fluorée avec une chaîne hydrogénée dans la structure

intrinsèque d’un amphiphile peut totalement modifier les propriétés physico-chimiques du

composé car d’importantes différences structurales [3, 4] existent entre ces chaînes. En raison

de la taille plus grande de l’atome de fluor (rayon de van der Waals 1,47 Å) par rapport à celle

de l’atome de l’hydrogène (1,20 Å), les chaînes fluorées sont plus volumineuses que les

chaînes hydrogénées, avec des sections transversales d’approximativement 30 Å2 contre 20

Å2 pour les hydrogénés. Les volumes moyens des groupements CF2 et CF3 estimés à 38 Å3 et

respectivement 92 Å3 sont beaucoup plus importants que ceux du CH2 (27 Å3) ou du CH3 (54

Å3). Une conséquence de cette plus grande taille de l’atome de fluor par rapport à l’hydrogène

est la plus grande rigidité des chaînes fluorées qui adoptent préférentiellement une

conformation hélicoïdale, "all-trans" [5] (Figure 1).

A B

Figure 1 : Comparaison entre les modèles moléculaires d’un hydrocarbure (C10H22) - (A)

et d’un fluorocarbure (C10F22) - (B)


132

La grande surface des chaînes fluorées et la faible polarisabilité de l’atome de fluor

sont les deux éléments responsables de leur importante hydrophobie; l’effet hydrophobe de la

chaîne étant grossièrement proportionnel à l’aire moléculaire venant au contact de l’eau [6]. De

plus, les forts effets hydrophobes existant entre les chaînes fluorées augmentent leur tendance

à s’auto-organiser dans l’eau et leur adsorption à l’interface, ce qui se traduit par de fortes

activités de surface. Malgré leur fort pouvoir tensioactif, les composés fluorocarbonés ont un

effet détergent (délipidation des membranes) réduit ou même inexistant par rapport aux

amphiphiles complètement hydrogénés [7]. Cette propriété est un véritable atout si l’on

envisage l’utilisation d’amphiphiles fluorées pour des applications biomédicales [8].

Ainsi, la présence d’une chaîne fluorée peut avoir un rôle déterminant sur

l’hydrophobie et la lipophobie des amphiphiles et implicitement, sur les propriétés physico-

chimiques et biologiques des membranes, vésicules ou autres agrégats qu’ils sont capables de

former dans l’eau. En imposant un arrangement plus rigide et plus ordonné dans la structure

intrinsèque des agrégats, la chaîne fluorée peut notamment améliorer la stabilité [9-11], la

fluidité, la rigidité [12], la perméabilité [13] et la capacité d’encapsulation des membranes

vésiculaires [9].

II.2 Composés covalents mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés dérivés de sucres

La recherche bibliographique révèle l’existence d’un nombre impressionnant de

produits covalents hybrides fluorés/ hydrogénés dérivés de polyols ou de sucres,

d’aminoacides, de phosphocholine ou de phosphatidylcholine [14-16].

Des composés mixtes fluorés/ hydrogénés comportant comme partie hydrophile un

sucre (lactose [17, 18], glucose [19], mannose ou galactose [20]) ont été synthétisés et étudiés pour

leur propriétés physico-chimiques et biologiques (Figure 2). Ces produits se sont révélés

capables de former dans l’eau des agrégats d’une grande variété morphologique: des

hélices[18] , des tubules [21], des membranes [22], des vésicules [12]. En raison de la formation

de vésicules d’une stabilité supérieure [9, 10] dans le temps comparativement aux produits

totalement hydrogénés, ces systèmes hybrides représentent une bonne alternative pour

l’encapsulation et la vectorisation spécifique de principes actifs [16].


133

O

OH

HO

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

Z

O

Z [NHCH2C(O)]pNHCH(CH2)2RF

(CH2)8R

Z NH(CH2)4CH

NHC(O)(CH2)2C8F17

C(O)NH(CH2)9CH3

Z NHCH2C(O)NHCH

(CH2)2S(CH2)2C6F13

(CH2)2C6H13

p=1; R=CH3; RF=C6F13, C8F17

p=1; R=CH=CH2; RF=C6F13, C8F17

p=2; R=CH3; RF=C6F13

O

OH

HO

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

N CnH2nCOO-Na+

COC2H4C8F17

n=10; n=11

O

OH

HO

O

OH

OH

CHOP(O)-2

RF(CH2)2

CH3(CH2)8

RF=C6F13; C8F17

O

OP(O)-2OCH

HO

OH OH OH

RF=C6F13; C8F17

(CH2)2RF

(CH2)8CH3 O

OP(O)-2-X-CH

HO

OH

OH

OH

X=O; RF=C6F13; C8F17X=(CH2)5O; RF= C8F17

(CH2)2RF

(CH2)8CH3

Figure 2 : Structures chimiques de quelques composés covalents mixtes fluorocarbonés /

hydrocarbonés dérivés de sucres

Riess et ses collaborateurs [5] ont représenté la structure membranaire de vésicules

formées par ce type de composés mixtes fluorés/ hydrogénés comme une bicouche

discontinue (Figure 3). Ce schéma met en évidence la ségrégation partielle des chaînes

fluorocarbonées et hydrocarbonées avec la formation de domaines différents en raison de la

faible affinité qui existante entre ces deux types de chaînes. Les études ont montré que la

présence de ces domaines fluorés dans la membrane vésiculaire engendre une augmentation

de la durée d’encapsulation de la carboxyfluorescéine dans les vésicules formées par les

composés hybrides par rapport aux vésicules formées par les composés totalement

hydrogénés[5].

Figure 3: Représentation schématique de la structure d’une membrane vésiculaire

partiellement fluorée [5]

Fn C

m

Cm

H2O

Tête polaire

Espaceur

Chaînes hydrogénées

Chaîne fluorée

Bicouche mixte

fluorée / hydrogénée

Vésicule fluorée

H2O

Dérivés du lactose

Dérivés du glucose Dérivés du mannose Dérivés du galactose


134

Nous trouvons encore plus de similitude avec notre étude dans les travaux de Fantini

et de Vierling, car leurs recherches portent sur l’activité anti-VIH d’analogues covalents

mixtes fluorocarbonés/hydrocarbonés du GalCer. Les composés [F8C7][C16]AEGal,

[FxCy][FqCz]SerGal et HO[C24][F6C5]Gal incorporés dans des liposomes conventionnels

(phospholipide : cholestérol - 2 :1 ) en raison de leur solubilité extrêmement faible dans l’eau,

présentent une activité anti-VIH [2] sur des cellules GalCer(+)HT-29 supérieure à celle de

l’analogue monocaténaire fluoré [F6C11]SerGal (Figure 4) [23]. De plus, les analogues

hydrogénés des dérivés SerGal et du HO[C24][F6C5]Gal se sont révélés inactifs contre ce

même virus. Ces résultats semblent indiquer que la glycoprotéine virale gp 120 se fixe

préférentiellement ou exclusivement sur les domaines riches en glycolipides existants dans la

bicouche liposomale, leur formation étant favorisée par la ségrégation des chaînes des

composés fluorés [15].

Figure 4: Structures chimiques des analogues fluorés / hydrogénés du GalCer Les inconvénients majeurs de ces amphiphiles fluorés sont leur complexité de

synthèse et de purification ainsi que leur solubilité réduite dans l’eau, ce qui rend la

formulation plus laborieuse.

Les produits dont nous allons faire l’étude, les amphiphiles catanioniques hybrides

fluorocarbonés / hydrocarbonés analogues du GalCer, présentent trois avantages importants

comparativement aux analogues covalents du GalCer précédemment cités, soit : une grande

simplicité de synthèse, une excellente hydrosolubilité et la capacité d’auto-association dans

l’eau.


135

II.3 Composés catanioniques mixtes fluorocarbonés / hydrocarbonés

Les tensioactifs catanioniques représentent depuis quelques années un sujet fascinant

de recherche, car ces mélanges de tensioactifs anioniques et cationiques possèdent des

propriétés physico-chimiques inédites [24]. Nous mentionnerons la diversité morphologique

dictée par la force des interactions intra- et intermoléculaires, le rapport stoechiométrique

entre les deux tensioactifs, la géométrie des molécules, etc. [25] . Parmi les morphologies des

agrégats formés par les tensioactifs catanioniques, les vésicules ont reçu un intérêt tout

particulier en raison de leur formation spontanée [26] et aux applications qui en découle.

Dix huit ans après que le groupe de Kaler [26] eut développé cette nouvelle méthode de

préparation de vésicules spontanées, en mélangeant dans l’eau deux tensioactifs

monocaténaires de charges opposées, la littérature scientifique abonde d’exemples de

composés catanioniques [27]. Des catanioniques bi- [28, 29], tri-, tétra- et pentacaténaires [30], des

dérivés gémini [31, 32] ou dendritiques [33, 34], portant une grande variété de têtes polaires (le

plus souvent ammonium [35], pour le cation et carboxylate [36], sulfate ou sulfonate [37] pour

l’anion), ont vu le jour et ont fait l’objet de nombreuses études physico-chimiques.

Concernant les composés hybrides fluorocarbonés / hydrocarbonés catanioniques, la

littérature n’offre que peu d’exemples comparativement aux composés complètement

hydrogénés. Les travaux de référence dans le domaine, réalisés par les groupes de Kaler [38] et

de Hoffmann [39] sur différents systèmes mixtes fluorés / hydrogénés (C16TAB / FC5 ,

respectivement C14DMAO /C6F13CH2COOH) (Figure 5) portent surtout sur l’étude des

propriétés auto-associatives dans l’eau et sur l’étude des diagrammes de phases à différents

rapports molaires entre les deux amphiphiles.

N

COOF

F

F

F F

F F

F F

F F + NaBr

F

F

F

F F

F F

F F

F F

FF

COO

N

OH

C14DMAO/ C6F13CH2COOH

C16TAB/ FC5

Figure 5 : Structures chimiques de tensioactifs catanioniques mixtes fluorocarbonés /

hydrocarbonés


136

Des travaux récents réalisés au laboratoire des IMRCP [22] ont mis l’accent sur la

synthèse et l’étude physico-chimique d’une nouvelle famille de tensioactifs mixtes

fluorocarbonés / hydrocarbonés catanioniques à tête sucre (Figure 6). Ces études ont mis en

évidence le fait que la présence d’une chaîne fluorée en C10 conduit, par sa forte hydrophobie,

à la formation d’agrégats rigides tels que des membranes enroulées ou des structures

lamellaires plutôt que des vésicules. Par contre, une chaîne fluorée en C8 favorise la formation

spontanée de vésicules.

Figure 6 : Structures chimiques de tensioactifs catanioniques mixtes fluorocarbonés /

hydrocarbonés dérivés du lactose

Dans cette étude nous allons exploiter cette tendance des systèmes catanioniques

comportant un segment fluoré en C8 pour induire la formation d’agrégats vésiculaires.

III MISE AU POINT DE VECTEURS CATANIONIQUES HYBRIDES

ANALOGUES DU GALCER

III.1 Tensioactifs catanioniques pour la délivrance de principes actifs

Le but de l’étude courante sera de synthétiser et d’étudier la capacité de nouveaux

tensioactifs catanioniques analogues du GalCer, notamment des dérivés bicaténaires mixtes

fluorés/ hydrogénés, d’être utilisés en tant que systèmes vectoriels de principes actifs anti-

VIH.

Des études récentes réalisées au laboratoire des IMRCP ont mis en avant le grand

potentiel des associations catanioniques à être utilisées dans le domaine de la délivrance de

principes actifs. Une première approche a porté sur la délivrance par voie cutanée d’un


137

principe actif anti-inflammatoire associé à un tensioactif dérivé de sucre (Figure 7). Cette

association engendre une importante amélioration de l’activité anti-inflammatoire du principe

actif car la nouvelle entité catanionique de par sa capacité à former spontanément dans l’eau

des agrégats vésiculaires offre au principe actif une très bonne solubilité dans l’eau, une

délivrance contrôlée et prolongée à travers la peau ainsi qu’une protection contre l’irradiation

solaire [40, 41]. Dans ce cas précis, le principe actif participe à sa propre formulation.

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

9

CO

O

N

O

O

Cl

Figure 7 : Structure chimique d’une association catanionique réalisée entre un anti-

inflammatoire et un tensioactif dérivé de sucre

Une approche différente a été l’utilisation d’une association catanionique tricaténaire

(Figure 8), afin de construire un système de vectorisation polyvalent, capable d’assurer le

transport de principes actifs hydrophobes (dans la bicouche membranaire vésiculaire) et/ou de

principes actifs hydrophiles (dans le cœur aqueux des vésicules). Ce système catanionique

tricaténaire [42] doit la bonne stabilité au cours du temps des vésicules formées spontanément

dans l’eau, à la présence d’une troisième chaîne alkyle. Ainsi, l’augmentation de

l’hydrophobie permet l’obtention d’une entité catanionique comme système de vectorisation

efficace. En effet, les vésicules formées spontanément se sont montrées capables d’encapsuler

une quantité importante de substances actives hydrophiles, de garder cette charge pour une

période de temps supérieure à 30 heures et de la délivrer par fusion avec la membrane

cellulaire.

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

12

P

O

O9

9

OH

OH

Figure 8 : Structure chimique d’une association catanionique tricaténaire


138

En nous appuyant sur cette expérience, la stratégie adoptée pour l’amélioration de la

stabilité au cours du temps des agrégats vésiculaires, sera d’augmenter l’hydrophobie de

l’ensemble catanionique par l’ajout d’une chaîne fluorée. Caractérisée par une meilleure

hydrophobie et une plus grande rigidité, la partie fluorocarbonée devrait transférer ces

propriétés à la membrane vésiculaire, conduisant ainsi à une meilleure stabilité des agrégats

dans le temps et à une meilleure compaction ainsi qu’une faible perméabilité [9]. En

conséquence, les vésicules formées spontanément par ces catanioniques hybrides fluorés/

hydrogénés qui de plus, comporteront à leur surface des sites de reconnaissance de la gp 120

pourraient s’avérer très utiles en tant que transporteurs spécifiques de principes actifs anti-

VIH.

Trois composés mixtes fluorés/hydrogénés, de structures chimiques variées, seront

étudiés afin d’identifier les caractéristiques structurales qui peuvent offrir une meilleure

stabilité des agrégats dans le temps et une toxicité diminuée.

III.2 Synthèse d’analogues catanioniques du GalCer de nature hybride fluorocarboné / hydrocarboné

L’étude de cette nouvelle famille de produits a eu pour objectif l’identification des

éléments structuraux qui peuvent apporter à ces composés catanioniques à la fois de

meilleures propriétés physico-chimiques, comme la formation d’agrégats supramoléculaires

stables dans le temps et capables d’encapsuler des principes actifs, ainsi que de meilleures

caractéristiques biologiques (activité anti-VIH renforcée et toxicité réduite). Une bonne

activité antivirale se traduira par une forte reconnaissance et une forte interaction de ces

produits avec le virus. Ces propriétés sont essentielles pour une future utilisation des

composés étudiés en tant que systèmes de vectorisation de principes actifs anti-VIH.

Afin de maintenir l’affinité des ces nouveaux tensioactifs catanioniques hybrides avec

la membrane virale du VIH, le précurseur cationique, l’aminolactitol, a été conservé car c’est

lui qui permet la reconnaissance avec la gp120 (le motif D-galactose lié par une liaison β-O-

glycosidique), la longue chaîne hydrogénée permettant le renfort de l’interaction. Les

modifications structurales seront réalisées donc, seulement au niveau de l’acide gras, qui lui

sera fluoré.


139

Au vu des études antérieures sur l’influence de l’hydrophobie du précurseur cationique

sur les propriétés physico-chimiques et biologiques de l’assemblage catanionique, nous avons

choisi de travailler avec le N-hexadécylamino-1-déoxylactitol (L16) (Figure 9) qui semble

avoir la longueur de chaîne optimale pour une bonne affinité pour la gp120 [43, 44].

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH

12

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

12

C

O

O

CF26

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

12

C

O

O

CF2 CF37

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

12

C

O

O

CF2 CF37

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

12

C

O

O

9

H2O, Température ambiante

HOOCCF2 CF3

7

HOOCCF2

6

HOOC CF2 CF37

HOOC

9

+

+

+

+

H2O, Température ambiante

agitation magnétique, 2 jours

L16

L16H4F8

L16H2F6H4

L16H13

L16F8

H2O, 35 °C



Figure 9 : Synthèse d’analogues catanioniques du GalCer mixtes fluorés/ hydrogénés

Afin de tester l’influence de la longueur et de la position de la chaîne fluorocarbonée

de l’acide gras sur l’auto-association, la stabilité des agrégats dans le temps et l’affinité pour

le VIH nous avons utilisé trois acides carboxyliques fluorés de structures différentes (Figure 9

et 10). Le choix des deux acides mixtes comportant une partie fluorée en C8 a été fait en

raison des résultats antérieurs obtenus dans le groupe d'Isabelle Rico-Lattes qui ont montré

que la présence d’une chaîne fluorée en C8 (Figure 6) au sein de l’édifice catanionique

favorise la formation des agrégats d’une structure vésiculaire [22]. Pour les mêmes acides, la

présence ou l’absence d’un espaceur hydrogéné (en C4) entre la partie fluorée et la fonction

acide est justifiée par notre intérêt d’étudier son rôle sur les effets hydrophobes entre la chaîne

d’acide gras et la chaîne alkyle de l’aminolactitol et implicitement sur le processus d’auto-

organisation. De par sa présence, nous envisageons d’augmenter l’affinité entre les deux

chaînes fluorée – hydrogénée et donc de renforcer la consolidation des agrégats formés par


140

ces tensioactifs catanioniques. Dans le même but, nous avons employé un troisième type

d’acide mixte fluoré/hydrogéné qui comporte une partie fluorée plus courte (en C6),

positionnée entre deux segments hydrogénés. Dans ce cas, les effets hydrophobes au sein de

l’édifice catanionique devraient encore être renforcés par la présence des deux segments

hydrogénés situés aux extrémités de la chaîne alkyle de l’acide. La partie fluorée plus courte,

en C6, a été choisie afin de compenser l’ajout des groupements CH2 et ainsi maintenir une

hydrophobie globale de l’ensemble catanionique proche de celle des deux autres tensioactifs

catanioniques comportant une partie fluorée en C8.

Comme système de référence nous avons choisi un dérivé totalement hydrogéné, qui

est également un analogue catanionique du GalCer. Celui-ci comporte le N-hexadécylamino-

1-déoxylactitol comme base, et comme acide, l’acide myristique (Figure 9 et 10). La longueur

de la chaîne de l’acide (C14) a été choisie afin d’obtenir un tensioactif catanionique ayant une

hydrophobie équivalente ou proche de celle des dérivés mixtes fluorés / hydrogénés étudiés.

Sachant que l’hydrophobie d’un groupement CF2 est considérée comme équivalent à 1,6

motifs CH2 [45], [46], nous pouvons constater que les tensioactifs catanioniques L16F8 et L16H13

possèdent une hydrophobie équivalente.

L16H4F8 L16H2F6H4

L16H13L16F8

+

-RF8RH4

RH16

+

-RFxRHn

RHm

+

-RF6RH2

RH16

RH4

+

-RF8

RH16

+

-

RH16

RH13

Figure 10: Représentation schématique de la structure hybride de nouveaux

catanioniques fluorés/hydrogénés et du catanionique de référence non-fluoré

Tête polaire 1-déoxylactitol Chaînes hydrogénées

(effet hydrophobe)

Chaîne fluorée


141

Les acides correspondants aux catanioniques L16H4F8 et L16H2F6H4 ont été synthétisés

au laboratoire de Chimie Bioorganique et des Systèmes Moléculaires Vectoriels, de

l’Université d’Avignon dans l’équipe du Prof. Bernard Pucci, les deux autres acides étant

commerciaux.

Ainsi, ces nouveaux tensioactifs catanioniques mixtes ont été synthétisés par simple

mélange équimolaire dans l’eau à température ambiante, du N-hexadécylamino-1-

déoxylactitol (L16) avec l’acide gras correspondant (Figure 9). L’avancement de la réaction

étant suivi par la disparition de l’acide gras insoluble dans l’eau et par pH-métrie.

Après réaction acido-basique et élimination de l’eau par lyophilisation, les tensioactifs

catanioniques ont été isolés avec des rendements quantitatifs. Tous ces tensioactifs

catanioniques présentent une bonne solubilité dans l’eau à température ambiante.

L’étape suivante de l’étude a été la caractérisation structurale de ces nouveaux

tensioactifs catanioniques analogues du GalCer.


142

III.3 Analyse structurale de nouveaux analogues catanioniques du GalCer

Pour confirmer la structure de ces nouveaux analogues catanioniques du GalCer, et

notamment vérifier la formation des paires d’ions, nous avons employé les méthodes de

caractérisation suivantes : la résonance magnétique nucléaire, la spectroscopie infrarouge et la

pH-métrie.

La RM 13C nous a permis de prouver le déplacement total de la réaction acido-

basique vers la formation des paires d’ions. L’analyse des spectres 13C RMN montre que le

signal à 176,58 ppm, caractéristique de l’acide carboxylique de départ a disparu, alors que le

signal de résonance du carboxylate apparaît à 181,49 ppm. Ainsi, la transformation de l’acide

carboxylique vers sa forme carboxylate est totale (Figure 11).

Figure 11: Détail des spectres RM du 13C qui met en évidence la transformation

complète de l’acide sous sa forme carboxylate (exemplifié sur le catanionique L16H13)

L’analyse structurale par résonance magnétique nucléaire a été complétée par une

étude en spectroscopie infrarouge.

COOH acide myristique

COO-

Catanionique L16H13

ppm


143

Une preuve supplémentaire de la transformation totale des deux composés constitutifs,

aminolactitol et acide, en tensioactifs catanioniques a été apportée par l’analyse des spectres

réalisés en infrarouge (IR). Pour ces composés bicaténaires catanioniques la conversion totale

de l’acide carboxylique vers la forme carboxylate a été mise en évidence par le déplacement

de la bande correspondant au groupement carboxyle. A titre indicatif, sur le composé

catanionique L16H13 nous pouvons observer la disparition de la bande caractéristique de

l’acide (ῡC=O) à 1701 cm-1 au profit des bandes du carboxylate à 1549 cm-1 (asymétrique) et

1406 cm-1 (symétrique) (Figure 12).

Figure 12: Spectre IR du tensioactif catanionique L16H13 comparé à celui de l’acide

myristique de départ (pastille KBr)

ῡC=O , acide myristique

A

cm-1

Acide myristique

ῡasC=O , Catanionique L16H13

ῡsyC=O , Catanionique L16H13

cm-1

A

Catanionique L16H13


144

Ces valeurs varient légèrement en fonction de la structure de l’acide utilisé. Le tableau

1 présenté ci-dessous indique ces valeurs pour chacun des dérivés catanioniques.

Tableau 1 : Déplacements de la bande correspondante à la fonction C=O en IR

Ainsi, l’interprétation des spectres IR a permis de confirmer les résultats obtenus par

RMN, à savoir que l’équilibre acido-basique a été totalement déplacé vers la formation des

paires d’ions catanioniques.

Comme les assemblages catanioniques ont été obtenus par une réaction acido-basique

dans l’eau, le suivi de la réaction par pH-métrie nous informe sur l’évolution de la réaction.

Les acides carboxyliques utilisés présentent une faible solubilité dans l’eau en raison

de leur forte hydrophobie. En conséquence, la transformation des acides en carboxylates peut

être suivie même visuellement car la suspension solide des acides ajoutés à la solution

aqueuse d’aminolactitol disparaît progressivement au cours de la réaction. Cette solubilisation

s’explique par la formation du carboxylate d’ammonium beaucoup plus soluble dans l’eau à

la suite de l’échange de proton entre l’acide et l’aminolactitol. Cette explication est validée

par la variation du pH d’une valeur caractéristique d’un milieu basique de 9,5 à une valeur

finale proche de la neutralité qui varie de 7 à 7,5 en fonction de l’acidité du précurseur utilisé.

Après la synthèse et la caractérisation de ces nouveaux composés bicaténaires

catanioniques, une étude physico-chimique sera réalisée afin d’identifier le meilleur

assemblage catanionique capable d’être utilisé en tant que système de vectorisation des

principes actifs anti-VIH. L’étude sera centrée sur l’identification des caractéristiques

structurales de ces tensioactifs catanioniques ayant une influence sur la formation d’agrégats

supramoléculaires stables dans le temps, tout en gardant une bonne activité anti-VIH et une

faible toxicité.

ῡC=O du carboxylate cm

-1

ῡC=O carboxyle cm

-1

Composé

catanionique (Asymétrique)

(Symétrique) (de l’acide correspondant)

L16H4F8 1567 1404 1711

L16H2F6H4 1568 1402 1715

L16F8 1681 1399 1758

L16H13 1561 1406 1701


145

IV PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES COMPOSES

CATANIONIQUES HYBRIDES FLUORES / HYDROGENES

Dans un premier temps, nous présenterons l’étude des propriétés tensioactives suivie

d’une étude de distribution de taille des agrégats formés dans l’eau par ces composés

catanioniques mixtes.

IV.1 Etude des propriétés tensioactives

Les mesures de variation de la tension de surface en fonction de la concentration ont

été réalisées par la méthode de la lame de Wilhelmy. Des solutions de différentes

concentrations de ces composés catanioniques hybrides, obtenues par solubilisation du

produit dans l’eau ont fait l’objet d’une étude par tensiométrie.

Les résultats obtenus montrent que les quatre dérivés catanioniques présentent des

propriétés tensioactives car ils abaissent la tension de surface de la solution aqueuse. Comme

nous pouvons le remarquer sur le graphique (Figure 13) la capacité des composés

catanioniques mixtes à abaisser la tension superficielle est beaucoup plus importante que dans

le cas du composé non fluoré, L16H13. Ce comportement est classique pour les composés

fluorés qui sont plus hydrophobes que leurs analogues hydrogénés, et donc plus présents à

l’interface eau/air. Cependant, la présence d’un premier plateau à des concentrations très

basses (3 - 4,5 x 10-5M), enregistrée seulement pour les tensioactifs catanioniques hybrides,

est peu conventionnelle. Ceci indique la formation d’agrégats supramoléculaires dans la

solution aqueuse à de très faibles concentrations (aux alentour de 10-5M), phénomène qui

pourrait être expliqué par la présence des chaînes fluorées, fortement hydrophobes.

Pourtant, il semble que cette organisation dans la sous– phase apparaisse avant la saturation

en composé amphiphile à l’interface eau /air car, en augmentant la concentration en

tensioactif hybride nous pouvons observer un abaissement important de la tension de surface

jusqu’à une valeur constante qui marque la présence d’un nouveau plateau. Ce comportement

pourrait éventuellement être relié à l’existence d’une transition de phases entre les deux

paliers [47] ou par une réorganisation des chaînes alkyles fluorés/ hydrogénées à l’interface

eau/air, due à la forte lipophobie des segments fluorés. Cette étude sera approfondie par la

suite dans la partie dédiée à l’étude de la morphologie des agrégats formés spontanément dans

l’eau par ces composés mixtes fluorés / hydrogénés.


146

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

-6,5 -5,5 -4,5 -3,5 -2,5 -1,5

LogC

Ts(m

N/m

)

L16H4F8

L16H2F6H4

L16F8

L16H13

Figure 13: Courbes de variation de la tension superficielle en fonction du

logarithme de la concentration des tensioactifs catanioniques bicaténaires à 25°C

En analysant la figure 13 et les données répertoriées dans le tableau 2, nous pouvons

observer que la diminution des valeurs de tensions de surfaces sur les plateaux correspond à

une augmentation de l’hydrophobie des associations catanioniques, ce qui s’inscrit dans le

comportement classique d’adsorption des tensioactifs à l’interface eau/air. Ainsi, le composé

mixte le moins hydrophobe (L16F8) abaisse la tension de surface de l’eau jusqu’à une valeur

de 31,9 ± 0,6 mN/m, tandis que les solutions concentrées du catanionique (L16H4F8), le

composé le plus hydrophobe de la série, présente une tension minimale de surface de

seulement 22,7 ± 0,2 mN/m.

Concentration (M) TS* palier (m/m) Composés

(hydrophobie décroissante)

organisation

réorganisation organisation réorganisation

L16H4F8 4,6 x 10-5 10-2 36,2 ± 1,2 22,7 ± 0,2

L16H2F6H4 5 x 10-5 5 x 10-3 40,4 ± 0,9 27,1 ± 0,3

L16F8 10-4 10-3 37,8 ± 0,5 31,9 ± 0,6

L16H13 2 x 10-4 - 37,3 ± 0,5 -

L16 3,5 x 10-4 - 38,4 ± 0,3 -

* tension de surface aux paliers

Tableau 2 : Valeurs des concentrations aux paliers et TS palier pour les dérivés

catanioniques bicaténaires à 25°C


147

En ce qui concerne le processus d’agrégation, les concentrations obtenues sur le

premier plateau pour les trois associations catanioniques hybrides sont similaires (de 3 à

4,6x10-5M – Tableau 2). Pourtant, les valeurs des concentrations de réorganisation

enregistrées sur le deuxième plateau contredisent les principes de la thermodynamique qui

gouvernent l’auto-organisation des molécules tensioactives et qui prévoient une diminution de

la CAC avec une augmentation de l’hydrophobie du produit. Ainsi, en analysant les valeurs

des concentrations aux paliers présentées dans le tableau 2, nous pouvons remarquer que le

produit le plus hydrophobe (L16H4F8) possède la concentration de réorganisation la plus

élevée (10-2M) tandis que le composé le moins hydrophobe (L16F8) a lui la concentration de

réorganisation la plus basse (10-3 M). Ce comportement sera également discuté par la suite

dans la partie dédiée à l’étude de la morphologie des agrégats formés spontanément dans l’eau

par ces tensioactifs catanioniques hybrides.

Nous pouvons remarquer que malgré une hydrophobie équivalente pour les

tensioactifs catanioniques L16F8 et L16H13, ces composés ont des aptitudes différentes à

abaisser la tension superficielle de l’eau (31,9±0,6 et 37,3±0,5 mN/m respectivement) ainsi

que des valeurs différentes de concentrations de réorganisation et d’organisation

respectivement (10-3 et 2 x 10-4M respectivement). Pourtant, nous pouvons observer la

similitude entre les caractéristiques tensioactives des deux composés en analysant avec plus

d’attention le premier point d’inflexion du profil du catanionique L16F8 (conc. 10-4 M et TSmin

de 37,8±0,5mN/m). Cela signifie que l’association catanionique mixte L16F8 présente pour de

faibles concentrations un comportement proche de celui de son analogue non –fluoré L16H13.

Cependant, à des concentrations plus importantes, l’organisation de ce composé dans l’eau

ainsi qu’à l’interface eau/air est plus complexe. Nous verrons par la suite que la présence

d’une chaîne fluorée à la fois très hydrophobe et lipophobe peut être à l’origine de ce

comportement.

Les études de tensiométrie nous ont permis de comparer les propriétés tensioactives

dans l’eau pour chacune des associations catanioniques bicaténaires. Par la suite, en utilisant

des solutions aqueuses à des concentrations intermédiaires des deux plateaux, nous nous

sommes intéressés à une étude d’agrégation en utilisant la diffusion quasi-élastique de la

lumière et la microscopie à transmission afin de vérifier laquelle des deux concentrations

(d’organisation ou de réorganisation) pourrait être identifiée à la concentration d’agrégation

critique (CAC).


148

IV.2 Etude de distribution de taille des agrégats

Comme dans le cas des tensioactifs catanioniques dendritiques nous avons utilisé la

technique de la diffusion quasi-élastique de la lumière afin de déterminer le diamètre

hydrodynamique des agrégats formés spontanément dans l’eau. Nous rappellerons que le

diamètre hydrodynamique d’une particule dépend (dans une solution de viscosité donnée et à

une température connue) de son coefficient de diffusion selon l’équation de Stockes-Einstein.

Les résultats obtenus indiquent que les quatre associations catanioniques forment des

agrégats dans l’eau à des concentrations de 10-3M. Les histogrammes enregistrés ont révélé

des distributions gaussiennes de taille des agrégats allant de 40-60 nm jusqu’à 1000-1500 nm

avec un maximum de population centré aux alentours de 300-600 nm suivant le mélange

catanionique (Figure 14). Nous pouvons remarquer que les composés mixtes

fluorés/hydrogénés aussi bien que le composé de référence non -fluoré, s’auto-organisent

spontanément dans l’eau en formant des agrégats dont la taille est similaire malgré leur

structure chimique différente. Pourtant, nous enregistrons une différence au niveau de la

polydispersité des agrégats. Ainsi, les résultats indiquent que le composé non- fluoré (L16H13)

forme des agrégats supramoléculaires d’une plus grande homogénéité de taille, caractérisés

par un indice de polydispersité de 0,76 tandis que les composés catanioniques mixtes

présentent une valeur de polydispersité d’approximativement 0,34-0,38.

Il est important de souligner que l’analyse par cette technique des solutions de faibles

concentrations (5x10-4M – 5x10-5M – limite inférieure de détection de l’appareil) de ces

tensioactifs catanioniques hybrides nous indique la présence d’agrégats supramoléculaires.

Ces observations confirment le fait que l’agrégation spontanée de ces tensioactifs dans l’eau a

lieu à des concentrations basses (10-4 - 10-5 M, en fonction du produit) donc, bien avant

l’apparition du plateau final (concentrations supérieures à 10-3 M) présent sur les graphiques

de tensiométrie (Figure 13). Ainsi, ces résultats corroborent l’existence des CAC à des

concentrations de 10-4 - 10-5 M, ce qui correspond au premier palier identifié sur le profil de la

variation de la tension superficielle en fonction du logarithme de la concentration en

tensioactif (Figure 13).

La technique de la diffusion quasi-élastique de la lumière nous a également permis de

suivre la stabilité des agrégats dans le temps pour ces mêmes solutions ayant une

concentration de 10-3M. Ainsi, nous avons pu constater une stabilité d’approximativement 7


149

jours pour les solutions de tensioactifs catanioniques hybrides tandis que, la stabilité des

solutions du composé catanionique complètement hydrogéné n’est pas supérieure à 12 heures

dans les conditions expérimentales (10-3M et 25°C).

L16H4F8 L16H2F6H4



L16F8 L16H13



Figure 14 : Histogrammes représentant la distribution de taille des agrégats formés

spontanément par les dérivés catanioniques bicaténaires (c = 10-3M, T = 25°C)


Intensité (%

)

Intensité (%

)


Intensité (%

)

Intensité (%

)


150

Afin d’améliorer la stabilité des solutions dans le temps et d’homogénéiser la

distribution de la taille des agrégats nous avons soumis les échantillons aux ultrasons (en

utilisant un bain et non une sonde à ultra-sons) pendant une courte période de temps

(approximativement 10 minutes). Ainsi, les histogrammes obtenus montrent toujours une

distribution gaussienne de la taille des agrégats, mais la variation des diamètres

hydrodynamiques est moins importante, allant de 40 nm jusqu’à 200-280 nm avec des

populations majoritaires centrées aux alentours de 100-150 nm suivant le mélange

catanionique.

Nous exemplifierons en présentant les histogrammes obtenus pour le tensioactif

catanionique L16H4F8 (Figure 15). Afin d’affiner notre étude nous avons suivi la stabilité dans

le temps de ces solutions à 25 et à 37°C. Comme nous pouvons le remarquer en analysant les

données répertoriées au-dessous des histogrammes (Figure 15), la variation de la taille des

agrégats due à l’augmentation de la température est très faible. En effet, les agrégats des

solutions conservés à 37°C possèdent des diamètres hydrodynamiques plus faibles d’une

dizaine de nm (~ 20 nm pour le composé L16H4F8) par rapport aux agrégats des solutions

conservées à 25°C.

L16H4F8 à 25°C L16H4F8 à 37°C


populations : 125 nm (34%) ; 157 (38%) ; 198 nm (15%)


populations : 105 nm (28%) ; 140 (53%) ; 184 nm (18%)

Figure 15 : Histogrammes représentant la distribution de taille des agrégats formés par

le dérivé catanionique mixte L16H4F8 dans l’eau après l’action des ultra-sons (c = 10-3M)


Intensité (%

)

Intensité (%

)


151

A la suite de l’utilisation des ultra-sons nous avons observé une augmentation de la

stabilité dans le temps des solutions de catanioniques mixtes jusqu’à 11 jours. Cependant, la

stabilité dans le temps du composé non- fluoré L16H13 n’a pas été améliorée, restant dans une

gamme inférieure à 12 heures.

La stabilité nettement supérieure dans le temps des agrégats moléculaires formés par

les composés tensioactifs hybrides par rapport à ceux formés par le composé non- fluoré nous

permet d’affirmer que ces catanioniques mixtes sont plus appropriés à une utilisation en tant

que vecteurs. A ce stade de l’étude, nous n’avons pas décelé de différence de comportement

physico-chimique entre les composés fluorés/hydrogénés qui pourrait nous permettre choisir

le système catanionique le plus adapté à l’application envisagée.

IV.3 Etude de la morphologie des agrégats

Comme nous l’avons présenté dans le chapitre précédent, la technique de microscopie

électronique en transmission (MET) est une méthode couramment utilisée pour l’analyse de la

structure des agrégats supramoléculaires. Deux méthodes différentes ont été employées pour

la préparation des échantillons, la méthode de coloration négative et la cryofracture.

L’analyse des micrographies électroniques obtenues avec ces deux techniques de MET

révèle la formation spontanée de vésicules pour les quatre dérivés catanioniques bicaténaires

(Figure 16 et 17). Les résultats obtenus avec ces deux techniques complémentaires sont en

accord, car à la fois la forme et la taille des vésicules de chaque assemblage catanionique sont

similaires.

Nous pouvons observer que toutes les associations catanioniques présentent une

population de vésicules dont la distribution de taille est extrêmement polydisperse allant de 40

- 60 nm à plus de 1 ou 2µm de diamètre, en fonction de l’hydrophobie du composé (Figure 16

et 17). Ainsi, l’association catanionique non- fluoré (L16H13), la moins hydrophobe de cette

famille de composés, se caractérise par la formation d’une population de vésicules d’un

diamètre d’approximativement 40nm, la présence de vésicules d’un diamètre supérieur à 1µm

étant moins importante. Tandis que les trois associations catanioniques fluorés / hydrogénés

forment des vésicules dont la population majoritaire est centrée aux alentours de 500nm de

diamètre. De plus, la présence de vésicules dont le diamètre est supérieur à 1µm est plus

importante par rapport au composé de référence non- fluoré. Le composé le plus hydrophobe,


152

L16H4F8, a même la capacité de former spontanément dans l’eau des vésicules dont le

diamètre dépasse 2µm. La formation d’agrégats moléculaires dont la taille est beaucoup plus

importante est un comportement habituel pour les composés fluorés qui peut être expliqué par

la plus grande rigidité et le volume de la chaîne fluorée.

Figure 16 : Micrographies électroniques (cryofracture (A) et technique par coloration

négative (B et C)) des vésicules formées par le tensioactif catanionique L16H13 (10-2M)

L16H4F8 L16H2F6H4 L16F8

Figure 17 : Micrographies électroniques (cryofracture) des vésicules formées par les

tensioactifs catanioniques hybrides fluorés/hydrogénés (10-2M)

A 2000 nm B 500 nm C 1000 nm

A 100 nm

B 100 nm

C 500 nm


153

L’analyse détaillée de la morphologie des ces vésicules "géantes" nous a permis

d’observer leur structure multilamellaire, de type "oignon" avec une structure en multi-

couches (Figure 17C et Figure 18 - exemplifié pour le catanionique mixte L16F8).

Figure 18 : Micrographies électroniques (cryofracture) des vésicules formées par le

catanionique hybride L16F8 (10-2M)

A des concentrations plus importantes en tensioactif (10-3 - 10-2M) nous avons

également observé dans le cas des catanioniques hybrides la coexistence de vésicules et de

filaments (Figure 17A et Figure 19) d’une longueur de quelques centaines de nm et d’une

largeur d’approximativement 10 nm. Ces filaments peuvent provenir d’une partielle

ségrégation des chaînes alkyles hydrogénées de l’aminolactitol et des chaînes fluorées de

l’acide carboxylique. Cette nouvelle forme d’agrégation pourrait être à l’origine de la

présence du palier final observé sur les courbes de tensiométrie. Le fait que la tension de

surface sur le deuxième palier des catanioniques hybrides soit beaucoup plus basse (de 23 à

32 mN/m, en fonction du composé mixte) que celle de l’aminolactitol L16 constitutif (38

mN/m), indique une présence plus importante de la chaîne fluorée à l’interface eau/air.

Figure 19 : Micrographies électroniques (A – cryofracture, B - technique par coloration

négative) des vésicules et des filaments formés par le catanionique hybride

L16F8 (2x10-3M)

300 nm

A 350 nm B 100 nm


154

De plus, cette partielle ségrégation pourrait également expliquer l’existence du

deuxième palier enregistré sur les courbes de tensiométrie pour ces trois associations

catanioniques. Nous rappelons que les valeurs de concentrations de réorganisation (10-2,

5x10-3 et 10-3 M) enregistrées sont inversement proportionnelles à l’hydrophobie des

composés (L16H4F8, L16H2F6H4 et L16F8 respectivement). Comme nous l’avons déjà noté, ce

comportement s’oppose aux principes de la thermodynamique qui gouvernent l’auto-

organisation des molécules tensioactives et qui prévoient une diminution de la CAC pour une

augmentation de l’hydrophobie du produit. Nous pouvons en déduire que d’autres facteurs,

comme la ségrégation partielle peuvent être responsables de ce comportement peu

conventionnel.

Ainsi, en analysant la structure des associations catanioniques, leurs valeurs de

concentrations de réorganisation et en tenant compte du phénomène de ségrégation partielle

nous pouvons faire les observations suivantes. Le composé L16F8 n’ayant pas de partie

hydrogénée dans la structure de l’acide carboxylique (qui pourrait renforcer l’interaction avec

la chaîne hydrogénée du L16) a une tendance plus prononcée à la ségrégation car sa

concentration de réorganisation est de seulement 10-3M. De la même façon, nous observons

que dans le cas de l’association catanionique L16H2F6H4, la cohésion des deux chaînes

fluorée / hydrogénée semble être renforcée par la présence des segments hydrocarbonés dans

la structure de l’acide, engendrant une transition à des concentrations supérieures (5x10-3M)

au composé L16F8. Enfin, le tensioactif catanionique L16H4F8 comportant un espaceur

hydrocarboné en C4 entre le groupement acide et la chaîne fluorée en C8 semble présenter une

cohésion plus importante car la ségrégation partielle a lieu à des concentrations encore plus

importantes (10-2 M).

Ces hypothèses pourraient expliquer les valeurs de concentrations de réorganisation

obtenues pour les trois tensioactifs catanioniques hybrides. Nous insisterons sur le fait que les

filaments ont été décelables seulement à des concentrations supérieures aux valeurs de

concentrations de réorganisation caractéristiques pour chaque association hybride fluorée /

hydrogénée. Pourtant, la présence de vésicules a été observée même à des concentrations

inférieures à ces valeurs de concentrations de réorganisation. Cela confirme que la CAC de

ces tensioactifs catanioniques mixtes est caractérisée par l’apparition du premier plateau sur

les courbes de tensiométrie. Ainsi, la diminution de la tension de surface avec l’augmentation

de la concentration en produit pourrait être expliquée par une transition de phases des agrégats

vésiculaires (premier plateau) vers la coexistence de vésicules et de filaments à des


155

concentrations plus importantes (>10-3M), correspondant au deuxième plateau sur les courbes

de tensiométrie.

Ces résultats ont mis en lumière l’importance de la présence d’une partie

hydrocarbonée dans la structure de l’acide carboxylique qui peut offrir une meilleure cohésion

et miscibilité aux agrégats supramoléculaires formés spontanément par ces tensioactifs

catanioniques mixtes fluorés / hydrogénés.

Les études de la diffusion de la lumière nous ont montré que la stabilité dans le temps

ainsi que la distribution de taille des agrégats formés par ces tensioactifs catanioniques

hybrides peuvent être modifiées suite à l’action des ultra-sons. Afin de confirmer ces résultats

nous avons analysé en MET les échantillons préparés dans les mêmes conditions d’utilisation

des ultra-sons que celles employées auparavant pour la préparation des solutions étudiées en

diffusion de la lumière (solutions concentrées (10-3M) préparées dans l’eau et soumises aux

ultrasons dans un bain à ultra-sons pour une période de temps d’environ 10 min.). Les

micrographies obtenues révèlent la formation principalement de trois populations de vésicules

unilamellaires dont le diamètre varie de 50 à 200 nm (exemplifié sur le composé L16F8 –

Figure 20). Ainsi, nous observons que les vésicules multilamellaires formées spontanément

par les trois associations catanioniques hybrides et dont les tailles varient entre 300 et 1000

nm sont transformées par l’utilisation des ultra-sons en vésicules unilamellaires d’un diamètre

inférieur à 200nm.

Figure 20 : Micrographies électroniques (cryofracture) des vésicules formées par le

catanionique hybride L16F8 (10-3M) après l’action des ultra-sons

250 nm


156

Nous mentionnerons également que par l’utilisation des ultrasons, la formation de

filaments à des concentrations supérieures aux concentrations de réorganisation est diminuée,

l’apport d’énergie favorisant la formation d’agrégats vésiculaires.

Les résultats de MET corroborent donc les résultats obtenus en diffusion de la lumière

au niveau de la taille des objets formés par ces nouveaux catanioniques bicaténaires.

La formation spontanée dans l’eau de vésicules, dont la taille et la stabilité dans le

temps peuvent être contrôlées et améliorées par l’action des ultra-sons, nous permet de

considérer cette nouvelle famille de composés catanioniques fluorés / hydrogénés comme

possédant les propriétés de base pour un système de transport d’un principe actif.

De par la présence de l’espaceur butyle au sein du tensioactif catanionique L16H4F8,

cette association semble se distinguer parmi les trois composés hybrides en raison d’une plus

importante cohésion des chaînes fluorées / hydrogénées ce qui se traduit par une ségrégation

partielle à des concentrations supérieures à 10-2M.

Etant donné que nous envisageons l’utilisation de ces tensioactifs catanioniques

hybrides en tant que transporteurs spécifiques de principes actifs anti-VIH, nous nous

intéresserons par la suite à l’étude de leur interaction avec un modèle membranaire

bidimensionnel constitué d’une monocouche de phospholipides. Le comportement de nos

tensioactifs vis-à-vis de ce modèle membranaire nous donnera par analogie, une indication de

leur influence sur les membranes cellulaires.


157

V ETUDE DE L’INTERACTION ENTRE LES COMPOSES

CATANIONIQUES ET DES MONOCOUCHES DE PHOSPHOLIPIDES

Afin d’étudier l’incorporation et la persistance de ces tensioactifs catanioniques mixtes

sur les membranes cellulaires, nous nous sommes intéressés à l’analyse des interactions entre

ces associations catanioniques hybrides avec une monocouche de DPPC (DiPalmitoyl-

Phosphatidyl Choline). Ce modèle membranaire sera utilisé comprimé à 30mN/m - pression

latérale moyenne existant au sein des membranes cellulaires.

Comme nous l’avons déjà présenté dans le chapitre précédent, les monocouches de

DPPC ont été préparées à la surface d’une solution saline (0,15M NaCl) à la température

constante de 20°C et maintenues à une pression de 30mN/m grâce aux barrières mobiles de la

cuve de Langmuir. L’injection des composés tensioactifs (5x10-3M dans l’eau) a été faite de

manière homogène dans la sous-phase aqueuse (0,15M NaCl) et nous avons enregistré les

variations de l’aire moléculaire au cours du temps.

Nous devons souligner que ces expériences ont été réalisées à des rapports molaires

composé tensioactif : DPPC de 1 :1, qui est loin d’une situation réelle dans un milieu

biologique, mais qui a été choisi afin d’obtenir par un effet de "zoom" un meilleur aperçu des

interactions entre les composés catanioniques étudiés et les monocouches de DPPC.

Toutefois, les concentrations finales en tensioactifs restent largement inférieures (2,7 x 10-7M)

à leurs CAC.

Les résultats présentés figure 21A montrent que malgré la pression latérale importante,

les composés tensioactifs s’incorporent dans la monocouche de DPPC. Nous remarquons une

importante variation de l’aire moléculaire dans le cas des tensioactifs catanioniques

comportant une chaîne fluorée en C8, ce qui traduit la pénétration des ces composés dans la

monocouche. Le composé L16H2F6H4 présente une incorporation moins intense que les deux

autres tensioactifs hybrides (L16H4F8 et L16F8). Les isothermes enregistrées (Figure 21B)

confirment la présence moins importante de ce produit à une interface sur laquelle il y a déjà

une monocouche de DPPC, cette fois-ci non comprimée.

En ce qui concerne le tensioactif catanionique non –fluoré L16H13 et l’aminolactitol L16

constituant, nous observons une variation plus faible de l’aire moléculaire. Cela pourrait

s’expliquer par une incorporation moins importante de ces produits dans la monocouche

condensée de DPPC ou par le volume plus réduit des chaînes alkyles hydrocarbonées


158

rapportées à celles qui sont fluorées. Nous rappelons que les chaînes fluorées sont plus

volumineuses que les chaînes hydrogénées, ayant des sections transversales

d’approximativement 30 Å2 contre 20 Å2.

30 40 50 60 70 80 90 100 110

0

10

20

30

40

50

60

Pression de surface

mN/m


DPPC

DPPC+ L16H2F6H4 1,66*10

-8M

DPPC+ L16H13 1,66*10

-8M

DPPC+ L16F8 1,66*10

-8M

DPPC+ L16H4F8 1,66*10

-8M

Figure 21: Incorporation des tensioactifs catanioniques bicaténaires dans une

monocouche de DPPC comprimée à 30m/m (A) ; isothermes de compression des

monocouches mixtes DPPC – tensioactif catanionique (B)

(0,15M aCl, 20°C)

Ces expériences nous ont également permis de suivre dans le temps l’interaction entre

les tensioactifs étudiés et la monocouche de DPPC. Comme nous pouvons le remarquer sur la

figure 21A, l’association catanionique non- fluorée ainsi que l’aminosucre L16 persistent dans

le film phospholipidique même après un intervalle de temps supérieur à 8 heures. La

différence d’aire par molécule pour la DPPC avant et après l’insertion du catanionique L16H13

étant d’environ 10 Å2.

Les tensioactifs catanioniques hybrides par contre, présentent un comportement

différent car juste après un maximum d’incorporation, nous observons le déclenchement d’un

processus d’expulsion du composé de la monocouche de DPPC. Comme il s’agit d’un

processus significativement plus lent que le processus d’adsorption, l’expulsion complète des

tensioactifs mixtes de la couche monomoléculaire de phospholipides se réalise après une

période de temps supérieure à 6 heures. Au final, la différence d’aire par molécule pour le

DPPC avant et après l’insertion – l’expulsion des catanioniques hybrides est négligeable

(d’environ 3 Å2).

Afin de mieux comprendre les changements provoqués au sein de la monocouche de

DPPC par la pénétration des tensioactifs étudiés, nous avons réalisé des mesures de

spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) sur les films, dont les courbes

viennent d’être présentés (Figure 21A).

A) B)


159

Les spectres IRRAS enregistrés pour les monocouches de DPPC en absence et en

présence de composés tensioactifs ainsi que les spectres témoins des tensioactifs hybrides

seront présentés et analysés par la suite.

En analysant la région caractéristique des vibrations d’élongation des groupements

méthylène (Figure 22) qui apparaissent dans la région spectrale 2800-3000 cm-1, nous

pouvons observer que l’incorporation ou l’expulsion des tensioactifs provoquent des

changements mineurs dans la monocouche de DPPC. Ainsi, les spectres obtenus révèlent la

présence des bandes de vibrations asymétriques et symétriques d’élongations des

groupements CH2 (ῡas(CH2) = 2920 cm-1 et ῡs(CH2)= 2850 cm

-1) caractéristiques de la DPPC

pure comprimée à 30mN/m. Ces valeurs indiquent que le degré d’ordre (conformation trans)

au sein des chaînes alkyles de la DPPC n’est pas perturbé lors du processus d’incorporation

et/ou d’expulsion des tensioactifs catanioniques. Ces observations sont valables même dans le

cas de l’incorporation des composés catanioniques hybrides.

30 mN/m

-0,01

-0,006

-0,002

0,002

0,006

0,01

28002850290029503000


-log(R

/R0)

DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16 DPPC 30 inj L16 - 1h DPPC 30 inj L16 - 6hL16 30mN/m

30 mN/m

-0,012

-0,007

-0,002

0,003

0,008

28002850290029503000


-log(R

/R0)

DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16H13

DPPC 30 inj L16H13 - 1h DPPC 30 inj L16H13 - 6h

30 mN/m

-0,01

-0,008

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

28002850290029503000


-log(R

/R0)

DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16H2F6H4DPPC 30 inj L16H2F6H4 - 1h DPPC 30 inj L16H2F6H4 - 6hL16H2F6H4 30mN/m

30 mN/m

-0,012

-0,007

-0,002

0,003

0,008

28002850290029503000nombre d'onde (cm-1)

-log(R

/R0)

DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16F8DPPC 30 inj L16F8 - 1h DPPC 30 inj L16F8 - 6h L16F8 30mN/m

Figure 22: Bandes caractéristiques des vibrations d’élongation des groupements CH2 des

spectres IRRAS du DPPC avant et après injection des composés tensioactifs – suivi dans

le temps (A)- L16 ; B)- L16H13; C)- L16H2F6H4 ; D)- L16F8)

(polarisation – p, αi = 40°, T = 20°C, pression de compression 30 mN/m)

ῡs(CH2) 2850

ῡas(CH2) 2920

2854 2924

A)

ῡas(CH2) 2920

ῡs(CH2) 2850

B)

2854 2923

ῡas(CH2) 2920

ῡs(CH2) 2850

C)

2854 2923

ῡas(CH2) 2920

ῡs(CH2) 2850

D)


160

Les spectres enregistrés pour les composés mixtes L16H2F6H4, L16F8 ainsi que pour

l’aminolactitol L16 en absence de DPPC mettent en évidence la présence des bandes de faible

intensité des vibrations d’élongation des groupements méthylène à ῡas(CH2) = 2923 cm-1 et

ῡs(CH2)= 2854 cm-1 (Figure 22C, D et A respectivement). Ces valeurs indiquent une

conformation gauche des chaînes alkyles hydrocarbonées, donc un degré important de

désordre. La faible intensité des bandes peut être due soit à une faible concentration des

chaînes alkyles hydrocarbonées dispersées parmi les chaînes fluorées, beaucoup plus

volumineuses, soit à un angle d’inclinaison plus important. Cette même explication peut

justifier également la diminution d’intensité des bandes CH2 de la DPPC engendrée par

l’incorporation des tensioactifs catanioniques mixtes dans la monocouche phospholipidique.

D'ailleurs, nous observons qu’après 6 heures, le spectre de la DPPC retrouve le profil

initial enregistré avant l’injection des composés tensioactifs mixtes dans la sous – phase

(Figure 21A et Figure 22C et D). Cela indique à la fois, l’expulsion complète des associations

catanioniques hybrides de la monocouche vers la sous - phase aqueuse ainsi que l’absence

d’un effet désorganisateur de la monocouche phospolipidique.

La persistance des tensioactifs non – fluorés (L16 et L16H13) dans la monocouche de

phospholipides ne modifie pas le profil spectral de la DPPC ce qui révèle le manque de

modifications majeures au niveau des chaînes alkyles (Figure 22A et B).

Par la suite, nous avons analysé la région caractéristique de la tête polaire du DPPC

afin d’identifier les modifications provoquées par la pénétration, la persistance et

respectivement l’expulsion des tensioactifs catanioniques de la monocouche.

Nous pouvons observer que l’incorporation et la persistance de l’aminolactitol L16

dans le modèle membranaire ne produit pas de modifications au niveau des groupements

phosphates du DPPC (Figure 23A). Les mêmes observations sont valables pour le

catanionique non- fluoré L16H13 jusqu’à une période de temps limitée à 6 heures, après

laquelle nous pouvons remarquer (Figure 23B) de faibles perturbations au niveau des

groupements PO2-.

En ce qui concerne les tensioactifs catanioniques mixtes, nous pouvons observer

(Figure 23C et D) que la forte incorporation des composés dans le modèle membranaire est

mise en évidence par l’apparition des bandes de vibrations d’élongation asymétriques et

symétriques [48] des groupements CF2 ( ῡas(CF2) = 1241 et 1195cm-1; ῡs(CF2)= 1153 et 1141

cm-1 pour les composés L16F8 et L16H2F6H4 respectivement). Il est intéressant d’observer


161

qu’après 6 heures, le composé L16F8 est complètement expulsé de la monocouche de DPPC,

tandis que le composé L16H2F6H4 y est toujours présent. Il faut mentionner que l’association

catanionique L16H4F8 a un comportement identique au composé L16F8.

30 mN/m

-0,004

0

0,004

1000110012001300nombre d'onde (cm-1)

-log(R/R

0)

DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16 DPPC 30 inj L16 - 1h DPPC 30 inj L16 - 6hL16 30mN/m

30 mN/m

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

0,004

0,006

1000110012001300


-log(R/R0)

DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16H13

DPPC 30 inj L16H13 - 1h DPPC 30 inj L16H13 - 6h

30 mN/m

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

0,004

0,006

1000110012001300


-log(R

/R0)

DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16H2F6H4DPPC 30 inj L16H2F6H4 - 1h DPPC 30 inj L16H2F6H4 - 6hL16H2F6H4 30mN/m

30 mN/m

-0,008

-0,006

-0,004

-0,002

0

0,002

0,004

0,006

0,008

1000110012001300nombre d'onde (cm-1)

-log(R/R0)

DPPC 30 mN/m DPPC 30 inj L16F8DPPC 30 inj L16F8 - 1h DPPC 30 inj L16F8 - 6h L16F8 30mN/m

Figure 23: Bandes caractéristiques de la tête polaire des spectres IRRAS du DPPC avant

et après injection des composés tensioactifs – suivi dans le temps

(A)- L16 ; B)- L16H13; C)- L16H2F6H4 ; D)- L16F8) (polarisation – p, αi = 40°, T = 20°C, pression de compression 30 mN/m)

Ces résultats montrent que les composés L16H13 et L16H2F6H4 ont une plus grande

affinité pour le modèle membranaire de DPPC, le premier par une persistance et une absence

d’expulsion hors de la monocouche phospholipidique et le deuxième par une expulsion

incomplète et très lente. Il est important de noter ce comportement afin de le corréler par la

suite avec les résultats des tests biologiques réalisés sur des cultures cellulaires.

ῡas(PO2-)

1227 ῡs(PO2

-) 1088

A)

ῡas(PO2-)

1227 ῡs(PO2

-) 1088

B)

ῡas(PO2-)

1227

ῡs(PO2-)

1088

ῡas(CF2) 1195

ῡs(CF2) 1141

C)

ῡas(PO2-)

1227

ῡs(PO2-)

1088

δ(CCC)F 1207

ῡs(CF2) 1153

ῡas(CF2) 1241

D)


162

Soulignons que l’importante interaction entre ces composés et les molécules de DPPC

ne doit pas être interprétée comme un effet négatif car elle a été volontairement provoquée par

les conditions expérimentales utilisées (un rapport molaire composé : DPPC de 1 :1). Comme

nous l’avons déjà noté, ceci a été réalisé afin de pouvoir faire une meilleure différenciation

entre le comportement des composés utilisés vis-à-vis des monocouches de DPPC et ce dans

les limites de sensibilités imposées par l’analyse IRRAS.

Les deux associations catanioniques hybrides L16H4F8 et L16F8, malgré leur taux

important d’incorporation et de variation de l’aire moléculaire, sont complètement exclues de

la monocouche de DPPC et resolubilisées dans la sous - phase aqueuse. De plus, en se

resolubilisant, ces tensioactifs hybrides ne désorganisent pas la monocouche de DPPC. La

force motrice de ce processus d’expulsion des composés catanioniques mixtes est constituée

par le fort caractère lipophobe du segment fluorocarboné, qui engendre la ségrégation des

chaînes alkyles hydrocarbonées du DPPC. L’aminolactitol L16 semble participer également à

ce processus d’expulsion de la monocouche de DPPC, mais une ségrégation partielle entre les

constituants de l’association catanionique n’est pas impossible.

Ayant mis en évidence l’absence de perturbations majeures du modèle membranaire

suite à l’interaction avec ces tensioactifs catanionique hybrides étudiés, nous nous sommes

intéressés par la suite à l’analyse des résultats des tests biologiques obtenus in vitro afin de

déterminer leur spécificité et leur viabilité cellulaire.

VI EVALUATION DES PROPRIETES DE VECTORISATION SUR CELLULES INFECTEES PAR LE VIH

VI.1 Activité anti-VIH et viabilité cellulaire des associations catanioniques hybrides analogues du GalCer

Comme nous l’avons mentionné dans le chapitre précédent, les tests antiviraux ont été

réalisés in vitro par le Dr. Anne-Marie Aubertin et ses collaborateurs au laboratoire de

l’Institut de Virologie INSERM à Strasbourg. Nous rappelons que les tests impliquent

l’utilisation des cellules lymphocytaires T, CEM-SS, exprimant à leur surface le récepteur


163

CD4 et étant permissives au VIH, la souche lymphotropique de référence étant le VIH-1 Lai

(III B).

Nous nous intéresserons à l’activité anti-VIH de ces nouveaux composés

catanioniques bicaténaires analogues du GalCer afin de quantifier leur spécificité pour le

virus, tout en vérifiant leur toxicité cellulaire. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le

tableau 3.

Composés CI 50 (µµµµM) CC50 (µµµµM) IT L16 7,1 ± 1,6 75 ± 8 10

L16H4F8 4,2 ± 1,3 55,5 ± 7,5 13

L16H2F6H4 11,3 ± 2,7 37,5 ± 7,5 3

L16F8 4,4 ± 0,2 52,5 ± 0,5 12

L16H13 8,2 ± 1 > 10 > 1

Tableau 3 : Résultats biologiques des catanioniques bicaténaires analogues du GalCer

Les tests anti-VIH des catanioniques bicaténaires ont montré que ces composés

présentent des activités antivirales qui varient de 4,2 à 11,3 µM (Tableau 3). Comme nous

pouvons l’observer, les deux associations catanioniques comportant une partie fluorée en C8

(L16H4F8 et L16F8) présentent les meilleures activités antivirales (4,2 et 4,4 µM

respectivement) de cette famille de composés. Comparativement à l’activité antivirale de

l’aminolactitol constituant L16 (7,1 µM) ces résultats sont plutôt modestes car leur activité est

améliorée seulement d’un facteur 1,6. Cependant, ces valeurs de concentrations inhibitrices

du VIH sont tout à fait positives car elles mettent en valeur une bonne reconnaissance

spécifique entre ces deux composés catanioniques hybrides et le virus.

Les deux autres tensioactifs catanioniques (L16H2F6H4 et L16H13) sont moins actifs

contre le VIH (CI50 de 11,3 et 8,2 µM respectivement) par rapport aux composés sélectionnés

antérieurement (L16H4F8 et L16F8), l’aminolactitol L16 inclus. De plus, ces deux composés

(L16H2F6H4 et L16H13) possèdent les valeurs les plus basses de CC50, ce qui montre qu’ils sont

également les associations les plus toxiques de cette série de catanioniques. En conséquence,

ces associations catanioniques sont très peu sélectives (IT de respectivement 3 et >1).

La toxicité des composés L16H4F8 et L16F8 est légèrement augmentée par rapport à

l’aminolactitol L16 mais, ces tensioactifs catanioniques arrivent à conserver une valeur de

l’indice thérapeutique supérieure à 10 (13 et 12 respectivement).


164

Malgré la similitude des propriétés physico-chimiques entre les trois tensioactifs

catanioniques hybrides, comme nous l’avons précédemment présenté, le composé L16H13H4

présente une toxicité supérieure et une activité biologique inférieure aux composés mixtes

comportant une chaîne fluorée en C8 (Tableau 3). L’intérêt thérapeutique de ce produit ainsi

que du composé totalement hydrogéné L16H13 étant limité, nous n’avons pas réalisé d’études

physico-chimiques supplémentaires pour ceux-ci.

Ainsi, à la suite de l’interprétation de ces résultats, les meilleurs candidats pour

l’application envisagée sont les associations catanioniques comportant une partie fluorée en

C8 : L16H4F8 et L16F8.

Afin de déterminer l’état d’agrégation (forme monomère ou agrégée) à la CI50 et CC50

nous avons étudié les propriétés tensioactives et d’agrégation de ces tensioactifs catanioniques

bicaténaires hybrides dans un milieu proche du milieu biologique.

L’ensemble de ces résultats nous permettra de réaliser une analyse plus précise de la

relation structure – organisation – activité biologique de ces composés.


Afin de déterminer une corrélation entre les propriétés physico-chimiques et

biologiques de ces tensioactifs catanioniques bicaténaires nous avons étudié leur

comportement d’agrégation et de stabilité dans le temps dans un milieu proche du milieu

biologique, tout en essayant le plus possible de reproduire les conditions expérimentales

utilisées pour les essais biologiques in vitro.

Ainsi, en utilisant des solutions aqueuses concentrées (5x10-3M), soumises aux

ultrasons, de ces tensioactifs catanioniques bicaténaires nous avons préparé par dilution dans

une solution saline (0,15M NaCl) des solutions de différentes concentrations qui ont fait

l’objet d’une étude par tensiométrie, d’une étude par MET et en diffusion de la lumière. De

plus, la solution saline permet d’exercer sur les tensioactifs catanioniques une force ionique

équivalente à celle qui existe en milieu biologique.


165

Les résultats des mesures de tensiométrie obtenus pour ces solutions salines révèlent

des courbes de tension de surface (Figure 24) similaires à celles précédemment obtenues pour

les solutions préparées directement dans l’eau. Nous observons toujours, dans le cas des

tensioactifs hybrides, la présence de deux paliers, le premier marquant une organisation et le

deuxième une possible réorganisation des molécules de tensioactifs. Nous mentionnons

également que les mesures ont été réalisées à une température de 25°C et non à 37°C

(conditions biologiques) afin de réduire l’évaporation du solvant. Les données obtenues sont

répertoriées dans le tableau 4.

15

25

35

45

55

65

-6,5 -5,5 -4,5 -3,5 -2,5

Log C

Ts (mN/m

)

L16F8

L16H4F8

Figure 24: Courbes de variation de la tension superficielle en fonction du logarithme de

la concentration des tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et L16F8 (0,15M NaCl, 25°C)

Concentration (µµµµM) TS palier (m/m)

Composés CAC réorganisation CAC réorganisation

CI 50 (µµµµM)

CC50 (µµµµM)

L16H4F8 8 384 37,2± 0,8 23,9± 0,4 4,2 ± 1,3 55,5 ± 7,5

L16F8 16 740 37,1± 1,1 31,9± 0,6 4,4 ± 0,2 52,5 ± 0,5

Tableau 4 : Valeurs des CAC et de réorganisation, TS et paramètres biologiques des

dérivés catanioniques hybrides L16H4F8 et L16F8 (0,15M NaCl, 25°C)


166

En utilisant la diffusion de la lumière nous avons pu observer la persistance des

agrégats supramoléculaires formés par ces tensioactifs dans l’eau lors d’un processus de

dilution dans une solution saline (solutions préparées comme décrit précédemment). Nous

exemplifierons avec les histogrammes obtenus pour les tensioactifs L16H4F8 et L16F8 à 37°C

(Figure 25), en mentionnant que les résultats obtenus à la suite des mesures réalisées à 25°C

sont très similaires, les diamètres hydrodynamiques étant légèrement augmentés (~ 20nm).

Le suivi au cours du temps de ces solutions nous à révélé une stabilité jusqu’à 6 jours, quelle

que soit la température de conservation 25 ou 37°C.

L16H4F8 L16F8



Figure 25: Histogrammes représentant la distribution de taille des agrégats des

tensioactifs L16H4F8 et L16H4F8 après dilution dans une solution aCl

(cfinale = 10-3M, 37°C)

La présence d’agrégats vésiculaires dans les solutions étudiées en diffusion de la

lumière a été confirmée par l’analyse des micrographies électroniques obtenues en TEM en

utilisant la technique du contrastant (Figure 26).


Intensité (%

)

Intensité (%

)


167

Figure 26 : Micrographies électroniques (technique du contrastant) des vésicules

existantes dans une solution diluée du tensioactif L16F8 (cfinale = 10-3M, 37°C))

Afin d’avoir la confirmation qu’à des concentrations correspondant aux concentrations

actives et non toxiques, les vésicules sont toujours présentes dans la solution aqueuse après

dilution, nous avons utilisé la MET. Ainsi, les solutions de tensioactifs catanioniques mixtes

étudiées ont été préparées à des concentrations (20µM) légèrement supérieures à leur CAC (8

et 16 µM respectivement) par dilution d’une solution aqueuse concentrée (5x10-3M) soumise

aux ultrasons, dans une solution de NaCl 0,15M. Avant d’être analysés, ces échantillons ont

été maintenus à une température de 37°C pour une période de temps d’environ 6 heures afin

de leur permettre d’atteindre l’équilibre.

Les micrographies obtenues (Figure 27) nous ont permis de visualiser la présence de

vésicules dont la taille varie entre 40 et 120 nm de diamètre.

Figure 27 : Micrographies électroniques (méthode du contrastant) des vésicules formées

par les catanioniques hybrides L16H4F8 (A) et L16F8 (B) (20µM)

A de si basses concentrations (20µM), l’utilisation de la diffusion de la lumière n’a pas

été possible, le signal détecté par l’appareil étant trop faible.

Ces études physico-chimiques ont été réalisées à une température de 37 °C et dans une

solution de NaCl 0,15M afin de mimer le mieux possible les conditions expérimentales des

tests biologiques in vitro et de vérifier qu’à cette température et à des concentrations

600 nm

B

300 nm

A

200 nm


168

supérieures à celles de CAC (déterminés à 25°C pour des contraintes d’évaporation) il y a

toujours le phénomène d’agrégation vésiculaire.

Ces données supplémentaires nous permettent de mettre en valeur les observations

suivantes.

Dans un premier temps, nous pouvons souligner la stabilité des vésicules formées par

ces catanioniques lors d’un processus de dilution dans un milieu dont la force ionique est

équivalente à celle du milieu biologique ; condition primordiale pour un système de

vectorisation. Ensuite, nous pouvons observer (Figure 28) que pour les deux tensioactifs

catanioniques, il y a une gamme de concentration dans laquelle ces agrégats vésiculaires sont

actifs et non toxiques (concentrations supérieures à la CI50 et inférieures à la CC50). Dans cette

optique, le catanionique L16H4F8 semble être le meilleur candidat car, en raison d’une plus

importante hydrophobie, il possède une valeur de CAC (8 µM) encore plus éloignée de celle

de sa CC50 (55,5µM), lui offrant une marge de sécurité plus importante. De plus, rappelons

que les résultats précédemment décrits (sous-chapitre IV.1) indiquent le composé L16H4F8

comme ayant la plus faible probabilité de ségrégation partielle. Ce comportement est

probablement dû à la présence de l’espaceur hydrocarboné dans la structure de l’acide qui

augmente l’affinité entre la chaîne fluorée et celle hydrogénée de l’aminolactitol.

Enfin, nous pouvons remarquer que pour les deux tensioactifs catanioniques hybrides

les CAC ont des valeurs supérieures à leur CI50, ce qui signifie que les vésicules formées

présentent également une bonne reconnaissance pour le VIH.

0

10

20

30

40

50

60

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

LogC

Ts (mN/m

)

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

Activité(Toxicité)%

Tens. superf. L16H4F8 Toxicité Activité

L16H4F8 Concentration µM

B)

A)

8

CAC CI50

4,2 20 55,5

CC50 agrégats vésiculaires


169

0

10

20

30

40

50

60

-10 -8 -6 -4 -2

LogCTs (mN/m

)

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

Activité(Toxicité)%

Tens. superf. L16F8 Toxicité Activité

Figure 28 : Corrélation (et représentation schématique) entre les caractéristiques

biologiques et physico-chimiques des associations catanioniques mixtes hybrides L16H4F8

(A, B) et L16F8 (C, D)

Toutes les caractéristiques énoncées mettent en évidence l’aptitude de ces deux

systèmes catanioniques hybrides (L16H4F8 et L16F8) à être utilisés comme systèmes

spécifiques de transport de principes actifs anti-VIH.

De par leur activité antivirale à l’état non agrégé, ces deux composés sont encore plus

intéressants car ils peuvent également agir en tant que leurres, inhibant ainsi l’entrée du VIH

dans les cellules.

En ce qui concerne leur toxicité cellulaire, en analysant les figures 28A et 28C, nous

pouvons remarquer que ces composés deviennent toxiques à des concentrations proches ou

légèrement inférieures à des concentrations précédant la transition des phases, marquée par

une descente abrupte du profil de tensiométrie. Cette perturbation du système catanionique

enregistrée par la tensiométrie semble être à l’origine d’une augmentation brusque et

importante de la cytotoxicité des produits. Une explication pourrait être la formation des

filaments qui, comme nous l’avons vu auparavant (sous-chapitre IV.3) représentent une

deuxième forme d’agrégation possible pour ces tensioactifs catanioniques mixtes. Pourtant,

l’étude par TEM des solutions des deux tensioactifs, préparées par dilution (NaCl, 0,15M) à

L16F8 Concentration µM

CC50

52,5

CAC

20

CI50

4,4 16

D)

C)

agrégats vésiculaires


170

des concentrations (57µM) proches de celles de CC50 (55 et 52µM respectivement) a indiqué

juste la présence des vésicules, les filaments n’étant pas décelables. Toutefois, le mode de

préparation de l’échantillon pour la TEM (déshydratation partielle) pourrait dans certains cas

perturber ce mode d’agrégation.

L’étude de cette nouvelle famille de tensioactifs catanioniques analogues du GalCer

nous a permis d’identifier les deux composés catanioniques comportant une chaîne fluorée en

C8 (L16H4F8 et L16F8) comme les meilleurs systèmes de la série adaptés à une utilisation (dans

une certaine gamme de concentration) en tant que transporteurs spécifiques de principes actifs

anti-VIH.

Par la suite, nous avons réalisé une étude préliminaire de formulations avec ces deux

composés hybrides (les tensioactifs L16H4F8 et L16F8) et un principe actif anti-VIH (AZT – un

des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH les plus utilisés) sur des

cultures cellulaires. Cette étude nous permettra d’évaluer la compatibilité des deux composés

(tensioactifs - AZT) au niveau cellulaire et de quantifier une potentielle synergie d’activité

antivirale.


171

VI.3 Formulations de l’AZT avec les tensioactifs catanioniques hybrides L16H4F8 et L16F8

En préalable à la mise au point d’un protocole d’encapsulation d’un principe actif anti-

VIH dans des vésicules formées par les deux tensioactifs catanioniques hybrides (L16H4F8 et

L16F8), notre étude a consisté en une analyse préliminaire des propriétés biologiques (activité

antivirale et cytotoxicité) de formulations de l’AZT avec chacun des deux tensioactifs

catanioniques. Le but de cette étude est donc de quantifier l’influence du tensioactif à l’état

monomère sur l’activité antivirale de l’AZT et vice et versa. Une comparaison sera faite entre

l’effet inhibiteur et la toxicité cellulaire de ces formulations avec ceux des produits testés

individuellement.

L’expérience antérieure du groupe I. Rico-Lattes [49] dans ce domaine à déjà révélé

pour d’autres dérivés, que la réalisation de formulations aux deux rapports molaires,

tensioactif catanionique : AZT de 500 :1 et 100 :1, peut apporter des informations importantes

sur l’influence des deux composés dans ces formulations et sur une éventuelle synergie

d’activités. En effet, ces études précédentes ont mis en évidence un effet synergique important

in vitro entre un tensioactif catanionique gémini [49] (composé Gem16 présenté dans le

chapitre bibliographique IV.1.1.2) et l’AZT.

Ainsi, en utilisant les mêmes rapports molaires entre ces nouveaux tensioactifs

catanioniques hybrides et l’AZT, il sera intéressant de rechercher une synergie d’activités

entre ces deux différents principes actifs anti-VIH. Rappelons que chacun des deux

constituants sont des inhibiteurs anti-VIH dont le mode d’action est différent: l’AZT, inhibe le

cycle de réplication virale en bloquant l’activité de la transcriptase inverse tandis que le

tensioactif analogue du GalCer agit en bloquant les récepteurs viraux gp120 et ainsi l’entrée

du virus dans les cellules. Suite à un effet synergique, les formulations pourraient présenter

des activités antivirales supérieures aux deux composés pris individuellement.

En utilisant chacun des deux tensioactifs, nous avons réalisé quatre formulations

différentes dans des rapports molaires tensioactif : AZT de 100 : 1 et de 500 :1. Les résultats

des tests biologiques réalisés in vitro, accompagnés de ceux des produits pris

individuellement sont répertoriés dans le tableau 5.


172

Formulation

/composé CI 50 (µµµµM) [AZT]

(µM) à CI 50 CC 50 (µµµµM) IT

L16H4F8 : AZT (100 : 1) 1,7 0,017 20 12

L16H4F8 : AZT (500 : 1) 0,025 0,00005 34 1360

L16H4F8 4,2 ± 1,3 - 55,5 ± 7,5 13

AZT 0,0028 0,0028 > 1 > 350

L16F8 4,4 ± 0,2 - 52,5 ± 0,5 12

L16F8 : AZT (100 : 1) 0,066 0,00066 30 450

L16F8 : AZT (500 : 1) 0,33 0,00066 26 80

Tableau 5 : Résultats biologiques des formulations tensioactifs hybrides - AZT et des composés testés individuellement (les flèches expriment le facteur d’amélioration de l’activité antivirale des formulations par rapport aux produits pris indépendamment)

En analysant les résultats obtenus pour la formulation L16H4F8 : AZT (100 : 1) nous

pouvons observer une amélioration de l’activité inhibitrice (CI50 = 1,7 µM) d’un facteur 2 par

rapport à l’activité du composé L16H4F8 seul (CI50 = 4,2 ± 1,3 µM). Pourtant, en examinant la

concentration en AZT à cette CI50 nous pouvons voir que cet effet est du à la présence de

l’AZT à une concentration supérieure (0,017 µM) à celle de la CI50 (0,0028µM) de l’AZT

seul. Ainsi cette formulation ne présente pas d’intérêt thérapeutique.

Les formulations du composé L16F8 avec l’AZT sont plus intéressantes car pour les

deux formulations nous pouvons remarquer une augmentation de l’activité antivirale par

rapport aux produits testés individuellement. Ainsi, cette activité inhibitrice est multipliée par

des facteurs 67 et 13 respectivement (Tableau 5) pour des rapports molaires de 100 :1 et de

500 :1 respectivement. Il est intéressant d’observer que pour les CI50 de ces formulations, la

concentration en AZT (0,00066 µM) est diminuée d’un facteur 4 par rapport à sa

concentration active (CI50=0,0028µM), quel que soit le rapport molaire des composés. Ces

résultats mettent en évidence un effet synergique modéré entre ces deux produits actifs.

La formulation la plus intéressante s’est révélée être celle du tensioactif L16H4F8 avec

l’AZT dont le rapport molaire est de 500 : 1 (Tableau 5). Celle-ci présente le meilleur effet

synergique de la série, son activité inhibitrice (CI50 = 0,025 µM) étant 168 fois supérieure à

celle du composé L16H4F8 seul (CI50 = 4,2 ± 1,3 µM). De plus, la concentration en AZT

(0,00005µM) à cette CI50 est diminuée de 56 fois par rapport à la CI50 (0,0028µM) de l’AZT.

L’effet contraire des deux formulations du même tensioactif L16H4F8, l’une qui ne

présente pas d’intérêt thérapeutique et l’autre qui est très efficace met en évidence le fait que

x 56 x 168

4 x

67 x

x 13 x 4


173

le rapport molaire entre les deux composés (tensioactif catanionique : AZT) joue un rôle

crucial pour l’activité antivirale et la synergie de la formulation.

En ce qui concerne la toxicité des formulations, nous observons que celle-ci est

légèrement accrue (Tableau 5), sans trop s’éloigner de la gamme des concentrations

cytotoxiques des tensioactifs utilisés individuellement. Malgré cela, grâce à l’amélioration des

activités antivirales, les indices thérapeutiques des formulations (sauf dans le cas de la

formulation L16H4F8 : AZT = 100 : 1) sont considérablement augmentés par rapport à ceux

des composés tensioactifs pris séparément. Comme nous l’avons déjà mentionné, plus cette

valeur est élevée, plus le produit est efficace. Ainsi, les valeurs des indices thérapeutiques

enregistrés dans le tableau 5 font ressortir la formulation L16F8 : AZT (100 : 1) caractérisée

par un IT de 450, mais encore plus celle du tensioactif L16H4F8 avec l’AZT dans un rapport

molaire de 500 : 1 dont l’IT est de 1360.

Ces résultats très prometteurs sur l’effet synergique des activités inhibitrices

soulignent le bon potentiel d’utilisation dans la polythérapie anti-VIH de ces tensioactifs

catanioniques hybrides, tout particulièrement pour le composé L16H4F8.

Rappelons que cette même association catanionique L16H4F8 s’est également

distinguée comme le meilleur système de vectorisation spécifique de la série. Ainsi, de par

cette double activité anti-VIH : transporteur spécifique de principes actifs (à l’état agrégé -

vésiculaire) et inhibiteur d’entrée virale (à l’état monomère) manifestant une très importante

synergie d’activités avec l’AZT, ce système catanionique hybride est encore plus prometteur.

De futures études de vectorisation de l’AZT pourraient confirmer ce double et grand potentiel

thérapeutique du composé L16H4F8.


174

VII CONCLUSION

Dans ce chapitre, nous avons mis au point une nouvelle famille de tensioactifs mixtes

fluorés/ hydrogénés catanioniques analogues du GalCer afin de les utiliser en tant que

transporteurs spécifiques de principes actifs anti-VIH. La stratégie adoptée a été la

consolidation et l’amélioration de la stabilité dans le temps des agrégats vésiculaires formés

par ces tensioactifs catanioniques en augmentant l’hydrophobie de l’ensemble catanionique

par l’ajout d’une chaîne fluorée.

En adoptant une stratégie de multiciblage, l’utilisation de ces composés en tant que

leurres du VIH a été également étudiée.

L’emploi d’une méthode de préparation polyvalente nous a permis de moduler la

structure chimique de cette nouvelle série de tensioactifs catanioniques, nous permettant ainsi

de modifier la longueur et la position d’un segment fluoré au sein de l’association

catanionique. Ainsi, l’étude s’est centrée sur l’identification des caractéristiques structurales

qui peuvent offrir à cette famille de composés une meilleure stabilité des agrégats dans le

temps, une bonne activité antivirale et une toxicité diminuée.

Après la préparation et l’analyse structurale de ces nouveaux composés, nous nous

sommes intéressés à l’étude de leurs propriétés physico-chimiques et biologiques. Ainsi nous

avons pu identifier deux composés mixtes comme candidats potentiels pour l’application

envisagée. De par leur caractère catanionique et la présence d’une partie fluorée en C8, les

associations L16H4F8 et L16F8 se sont avérées capables de former spontanément dans l’eau des

vésicules plus stables dans le temps qu’un composé de référence non fluoré L16H13, ayant une

hydrophobie équivalente. De plus, grâce à l’action des ultra-sons, ces vésicules possèdent une

bonne stabilité au cours du temps et résistent à la dilution dans un milieu dont la force ionique

est équivalente à celle qui existe en milieu biologique. Ces résultats, corroborés par les

propriétés biologiques de ces deux tensioactifs catanioniques ont mis en évidence l’existence

d’une gamme de concentration dans laquelle les agrégats vésiculaires présentent une bonne

reconnaissance pour le VIH et ne sont pas toxiques (concentrations inférieures à la CC50).

Dans ce domaine, le système catanionique L16H4F8 semble être encore plus prometteur car, en

raison d’une plus importante hydrophobie et une meilleure cohésion des deux chaînes fluorées

/ hydrogénées, il possède une valeur de CAC légèrement plus éloignée de celle de la CC50, lui

offrant ainsi une plus grande marge de sécurité quant à son utilisation.

Toutes ces caractéristiques auxquelles s’ajoute l’absence de perturbations majeures

vis-à-vis des monocouches de phospholipides nous permettent d’affirmer que ces deux


175

associations catanioniques hybrides (L16H4F8 et L16F8) peuvent être envisagées pour une

utilisation en tant que transporteurs spécifiques de principes actifs anti-VIH.

Il faut également souligner que cette étude a révélé l’activité antivirale à l’état

monomérique des deux tensioactifs catanioniques hybrides (L16H4F8 et L16F8), activité qui

peut être améliorée d’une manière très importante par association avec un inhibiteur du VIH

dont le mode d’action est différent. Ainsi, les formulations de ces composés avec l’AZT ont

permis la découverte d’un fort effet synergique des activités inhibitrices pour la formulation

L16H4F8 : AZT dont le rapport molaire est de 500 : 1. En conséquence, le composé L16H4F8

semble être plus adapté à une utilisation thérapeutique à la fois pour sa bonne activité anti-

VIH, sa forte synergie (sous forme monomérique) avec l’AZT et pour sa capacité à agir (sous

forme agrégée) en tant que système de vectorisation spécifique.

La suite de cette évaluation devra comprendre des tests d’encapsulation d’une sonde

hydrophile dont le taux d’encapsulation sera suivi dans le temps, afin d’évaluer la

perméabilité de la membrane vésiculaire et la capacité de stockage des vésicules. L’obtention

de résultats favorables permettra de réaliser par la suite des tests d’encapsulation et de

vectorisation de l’AZT.


176

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[35] Fukuda H., Kawata K., Okuda H., Regen S.L., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1635.

[36] Bhattacharya S., De S., Langmuir 1999, 15, 3400.

[37] Jokela P., Jonsson B., Khan A., J.Phys.Chem. 1987, 91, 3291.

[38] Iampietro D.J., Kaler E.W., Langmuir 1999, 15, 8590.

[39] Hao J., Hoffmann H., Horbaschek K., Langmuir 2001, 17, 4151.

[40] Consola S., Blanzat M., Perez E., Garriguess J.C., Bordat P., Rico-Lattes I., Chem Eur

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[42] Soussan E., Conception de vésicules catanioniques dérivées de sucre et étude de leur

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III (Toulouse), 2007.

[43] Blanzat M., Perez E., Rico-Lattes I., Lattes A., Gulik A., Chem. Commun. 2003, 244.


178

[44] Rico-Lattes I., Gouzy M.-F., Andre-Barres C., Guidetti B., Lattes A., <ew J. Chem.

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[45] Riess J.G., Tetrahedron 2002, 58, 4113.

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[48] Ren Y., Iimura K., Kato T., Jurnal of Chemical Physics 2000, 113, 1162.

[49] Blanzat M., Premiers nouveaux catanioniques du Galactosylcéramide. Synthèse ciblée

et évaluation de leurs propriétés anti-VIH thesis, Université Paul Sabatier Toulouse III

(Toulouse), 2000.

Conclusion générale


181

CONCLUSION GENERALE

Le VIH, virus qui attaque, affaiblit et détruit le système immunitaire humain, rendant

l’organisme vulnérable ou sans protection vis-à-vis de tous les agents pathogènes, est étudié

depuis plus de vingt ans en vue de trouver une thérapie efficace. Même si les moyens de

l’éradiquer font toujours défaut, un important progrès a été réalisé dans la mise au point de

régimes polythérapeutiques capables de prolonger et d’améliorer considérablement la qualité

de vie des personnes infectées par le VIH.

Le rôle indispensable des inhibiteurs de l’entrée virale pour les régimes

polythérapeutiques, le nombre réduit de composés de cette famille agréés pour une utilisation

cliniques (seulement 2 produits : l’enfuvirtide et le maraviroc) qui de plus, présentent des

inconvénients non-négligeables (faible biodisponibilité, effets secondaires, prix élevé de

fabrication) soulignent la nécessité de développer de nouveaux composés agissant au niveau

des étapes précoces de l’infection par le VIH.

Afin de répondre à cette exigence, les travaux qui ont fait l’objet de cette thèse ont eu

pour but l’amélioration de l’activité antivirale de nouveaux systèmes catanioniques analogues

du GalactosylCéramide (GalCer – récepteur alternatif du VIH). Cette classe d’inhibiteurs de

l’entrée virale réunit des composés dont la synthèse simple et à faible coût a été

précédemment mise au point au laboratoire et qui se sont montrés des leurres efficaces du

VIH.

L’étude a été conduite en suivant deux approches différentes. Dans un premier temps,

nous nous sommes intéressés à l’effet de multiplicité de sites actifs ainsi qu’à l’origine de la

toxicité cellulaire de nouveaux analogues du GalCer multivalents. Tandis que, dans un

deuxième temps, une stratégie de multiciblage a été mise en place afin d’améliorer l’activité

antivirale de nouveaux analogues catanioniques hybrides du GalCer.

En conséquence, dans une première partie, la stratégie adoptée afin de prévenir une

éventuelle dissociation de l’entité catanionique, supposée responsable de la toxicité cellulaire

de ce type de composés, a été de renforcer l’effet hydrophobe entre les éléments constitutifs

par ajout de chaînes alkyles sur le dendrimère.

Ainsi, une nouvelle famille d’associations catanioniques dendritiques à cœur

hexafonctionnel, comportant 12 sites actifs en surface a été synthétisée et étudiée. Plus


182

précisément, quatre composés ont été obtenus par une association acido-basique des

aminolactitols (respectivement L12 et L16, comportant les sites de reconnaissance du VIH)

avec deux dendrimères comportant en surface des groupements acides phosphoniques et des

chaînes alkyles de longueurs différentes (en C3 et en C10 respectivement).

Les résultats des tests biologiques réalisés in vitro ont révélé que ces nouvelles

associations catanioniques dendritiques sont des leurres efficaces du VIH. Une analyse

structure – activité antivirale nous a permis d’identifier le dendrimère DC3 et l’aminolactitol

L16 comme les éléments clefs qui permettent d’obtenir les meilleures activités anti-VIH pour

cette famille de composés. Toutefois, l’étude a montré que l’utilisation du dendrimère DC10

induit une trop importante hydrophobie au niveau de l’entité catanionique conduisant à une

impossibilité des chaînes alkyles dendritiques de renforcer l’attachement avec le virus et ainsi

à une perte de l’effet de multiplicité de sites.

Bien que la cohésion de l’entité catanionique ait été assurée, les tests biologiques ont

montré que la toxicité cellulaire de ces nouveaux composés restait toujours de l’ordre du

micromolaire comme dans le cas des produits analogues, antérieurement synthétisés au

laboratoire. De ce fait, l’identification des éléments responsables de la cytotoxicité de ces

tensioactifs catanioniques dendritiques est devenue le nouvel objectif de l’étude.

Ainsi, les résultats des études par tensiométrie et d’incorporation de ces produits à

l’état monomérique dans des modèles membranaires corrélés avec les résultats des tests

biologiques ont indiqué que ces composés ne sont pas toxiques à l’état monomérique. Ainsi,

des facteurs tels que l’hydrophobie et l’incorporation de ces produits à l’état monomérique

dans les modèles membranaires ne sont pas déterminants pour la cytotoxicité de ces nouvelles

associations catanioniques.

Cependant, les résultats obtenus montrent que l’agrégation de ces composés

catanioniques dendritiques sous forme de vésicules déclenche l’apparition d’une toxicité

cellulaire non- négligeable. Une interprétation possible de ce phénomène peut être une

interaction entre ces entités catanioniques et certains récepteurs membranaires ou bien une

agglutination des vésicules à la surface de la membrane cellulaire, qui pourraient provoquer

une perturbation de ces fonctions vitales.

Cette hypothèse pourrait être confirmée par de futures expériences réalisées en

collaboration avec des spécialistes en immunologie.

Dans une deuxième partie de l’étude, nous avons profité de la présence de la gp120 à

la surface membranaire virale ainsi qu’à la surface des cellules infectées par le VIH afin de


183

mettre au point une stratégie de multiciblage. Ainsi, en mettant à profit l’affinité de nouveaux

analogues du GalCer en forme non- agrégée ou agrégée pour la gp120, l’objectif a été

l’obtention à la fois des chimères efficaces du VIH ainsi que des vecteurs spécifiques pouvant

délivrer des principes actifs anti-VIH. Pour cela, une nouvelle famille d’analogues

catanioniques du GalCer a été synthétisée, soit des dérivés bicaténaires mixtes fluorés/

hydrogénés. La stratégie adoptée cette fois-ci a été la consolidation et l’amélioration de la

stabilité au cours du temps des vésicules formées par les tensioactifs catanioniques en

augmentant l’hydrophobie de l’ensemble catanionique par ajout d’une chaîne fluorée.

L’emploi d’une méthode de préparation simple, fondée sur une réaction acido-basique

entre l’aminolactitol L16 (comportant le site actif pour le VIH) et trois acides gras (H4F8,

H2F6H4 et F8) différant par la longueur et la position d’un segment fluoré, nous a permis

l’obtention de nouveaux analogues catanioniques mixtes du GalCer. Une quatrième

association catanionique non fluorée, d’une hydrophobie proche à celle des composés

hybrides, a été également préparée en tant que système de référence.

Suite à une étude des propriétés d’agrégation dans l’eau, de la morphologie et de la

stabilité au cours du temps des agrégats supramoléculaires, des interactions avec un modèle

membranaire, des propriétés tensioactives et des tests biologiques in vitro, nous avons pu

réaliser une corrélation entre la structure, les propriétés physico-chimiques et l’activité anti-

VIH de ces composés. Ainsi, deux composés hybrides ont été identifiés comme candidats

potentiels pour l’application envisagée. De par leur caractère catanionique et la présence

d’une partie fluorée en C8, les associations L16H4F8 et L16F8 se sont avérées capables de

former spontanément dans l’eau des vésicules plus stables dans le temps que le composé de

référence non fluoré L16H13, ayant une hydrophobie équivalente. De plus, suite à l’action des

ultra-sons, ces vésicules ont montré une bonne stabilité au cours du temps et une bonne

résistance à la dilution dans un milieu dont la force ionique est équivalente à celle qui existe

en milieu biologique. Ces résultats, corroborés par les propriétés biologiques de ces deux

tensioactifs catanioniques ont mis en évidence l’existence d’une gamme de concentration

dans laquelle les agrégats vésiculaires présentent une bonne activité anti-VIH et ne sont pas

toxiques. Le système catanionique L16H4F8 semble être encore plus prometteur car, en raison

d’une plus importante hydrophobie et une meilleure cohésion des deux chaînes fluorées /

hydrogénées, il possède une valeur de CAC légèrement plus éloignée de celle de la CC50, lui

offrant ainsi une plus grande marge de sécurité quant à son utilisation.

Cette étude a également mis en évidence l’activité antivirale à l’état monomérique de

ces deux tensioactifs catanioniques hybrides (L16H4F8 et L16F8), et donc leur capacité à agir en


184

tant que leurres du VIH. De plus, les formulations de ces deux analogues hybrides du GalCer

avec l’AZT, un inhibiteur de la transcriptase inverse du VIH, ont permis la découverte d’un

fort effet synergique des activités inhibitrices pour la formulation L16H4F8 : AZT dont le

rapport molaire est de 500 : 1. Ainsi, le composé L16H4F8 semble être encore plus adapté à une

utilisation thérapeutique à la fois pour sa bonne activité de leurre du VIH, sa forte synergie

(sous forme monomérique) avec l’AZT et pour sa capacité d’agir (sous forme agrégée) en tant

que système de vectorisation spécifique.

Il reste cependant à mener une étude de l’encapsulation de l’AZT dans des vésicules

formées par cette association catanionique hybride L16H4F8, après élimination de l’AZT libre

non encapsulé, pour ensuite confirmer in vitro leur rôle de transporteurs spécifiques.

Partie expérimentale


187

I PRODUITS COMMERCIAUX UTILISES ...................................................... 189

I.1 Réactifs ............................................................................................................... 189

I.2 Solvants .............................................................................................................. 189

II TECHIQUES DE CARACTERISATIO STRUCTURALE ............................. 190

II.1 RM ................................................................................................................... 190

II.2 Infrarouge........................................................................................................... 190

II.3 Spectrométrie de masse...................................................................................... 190

II.4 Analyses centésimales ........................................................................................ 191

III SYTHESE ............................................................................................... 191

III.1 -dodécylamino-1-désoxylactitol - L12 ............................................................. 191

III.2 -hexadécylamino-1-désoxylactitol - L16.......................................................... 193

III.3 Dendrimères catanioniques analogues du GalCer ............................................ 195

III.3.1 Mélanges catanioniques comportant le N-hexadécylamino-1-désoxylactitol : L16DC3 et L16DC10 ................................................................................................................. 195

Mélange catanionique L16DC3 ........................................................................................... 195 Mélange catanionique L16DC10 .......................................................................................... 196

III.3.2 Mélanges catanioniques comportant le N-dodécylamino-1-désoxylactitol : L12DC3 et L12DC10...................................................................................................................... 197

Mélange catanionique L12DC3 ........................................................................................... 197 Mélange catanionique L12DC10 .......................................................................................... 198

III.4 Associations catanioniques bicaténaires analogues du GalCer ........................ 199

III.4.1 Association catanionique L16H4F8 ............................................................................. 199 III.4.2 Association catanionique L16H2F6H4 ......................................................................... 200 III.4.3 Association catanionique L16F8 ................................................................................. 201 III.4.4 Association catanionique L16H13 ............................................................................... 202

IV TECHIQUES DE CARACTERISATIO PHYSICO - CHIMIQUE................... 203

IV.1 Préparation des solutions de catanioniques ...................................................... 203

IV.2 Mesure de tension de surface ............................................................................. 203

IV.3 Evaluation de la taille et de la distribution de taille des agrégats - Diffusion

quasi-élastique de la lumière (DLS).................................................................. 204

IV.4 Caractérisation des agrégats ............................................................................. 205

IV.4.1 Microscopie électronique par transmission............................................................... 205 IV.4.2 Cryofracture .............................................................................................................. 206

IV.5 Isothermes de compression ................................................................................ 209

IV.6 Spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) .............................. 210

V TESTS BIOLOGIQUES ............................................................................... 212

V.1 Conditions expérimentales d’infection des cellules CEM-SS ............................ 212

V.2 Evaluation de l’activité anti – VIH : incorporation d’uridine tritiée ([3H]-

uridine) .............................................................................................................. 213

V.3 Evaluation de la cytotoxicité : test MTT ............................................................ 213


188


189

I PRODUITS COMMERCIAUX UTILISES

I.1 Réactifs

Nom du produit CAS Fournisseur pureté

α – D – Lactose monohydraté 5989-81-1 Sigma-Aldrich > 98%

Hexadécylamine 143-27-1 Aldrich 98%

Dodécylamine 124-22-1 Fluka ≥ 98%

AZT (3′-Azido-3′-déoxythymidine) 30516-87-1 Sigma > 98%

Borohydrure de sodium 16940-66-2 Sigma-Aldrich > 98%

Acide tétradécanoïque (acide myristique) 544-63-8 Aldrich ≥ 98%

Acide Perfluorononanoϊque 375-95-1 Sigma-Aldrich 97%

1,2-Dipalmitoyl-sn-glycéro-3-

phosphocholine

Dipalmitoyl-phosphatidyl choline

63-89-8 Avanti Polar-

Lipids

> 99%

Phosphotungstate de sodium 12501-23-4 Sigma-Aldrich 99,995%

Chlorure de sodium 7647-14-5 Sigma-Aldrich ≥ 99,5

Hydroxyde de sodium 1310-73-2 Sigma-Aldrich 98%

Acide chlorhydrique 7647-01-0 SDS 37%

Acide sulfurique 7664-93-9 Normapur 98%

I.2 Solvants

Nom du solvant CAS Fournisseur pureté

Chloroforme chromanorm 67-66-3 Prolabo ≥ 99,5

Ethanol absolu normapur 64-17-5 Prolabo ≥ 99,8

Méthanol 67-56-1 SDS ≥ 99,8

Propan – 2 – ol rectapur 67-63-0 Prolabo ≥ 99

Propan – 1 – ol rectapur 71-23-8 Prolabo ≥ 99

H2O deutéré (0,75 mL) 7789-20-0 Euriso-top 100 %D

Méthanol deutéré 811-98-3 Euriso-top 99,8 %D

Chloroforme deutéré 865-49-6 Euriso-top 99,8 %D


190

II TECHNIQUES DE CARACTERISATION STRUCTURALE

II.1 RMN

Les spectres de résonance magnétique nucléaire ont été enregistrés sur des

spectromètres Brüker Avance 300, Avance 400 et Avance 500 dont les fréquences de

précession du proton et du carbone sont respectivement de 300 MHz et 75 MHz, 400 MHz et

100 MHz, et 500 MHz et 125 MHz. Les fréquences de précession du fluor et du phosphore

sont respectivement de 376 MHz et 121 MHz. Les déplacements chimiques δ sont exprimés

en partie par million (ppm) par rapport au déplacement chimique de référence du

tétraméthylsilane (TMS) pour la RMN du 1H et du 13C, de l’acide phosphorique à 85% dans

l’eau pour la RMN du 31P et de l’acide trifluoroacétique dans l’eau pour la RMN du 19F. La

calibration a été réalisée par rapport au déplacement chimique du solvant deutéré (signal

résiduel non deutéré). Les fréquences des constantes de couplages sont exprimées en Hz. Les

spectres 13C ont été enregistrés grâce à une séquence J modulée. Les paramètres des

séquences d’impulsions sont ceux fournis par Brüker.

II.2 Infrarouge

Les spectres de vibration infrarouge ont été réalisés grâce à un spectromètre PERKIN-

ELMER IR FT 1760-X. Les spectres ont été réalisés sur des pastilles de KBr à une

concentration de 0,5% en masse de produit.

II.3 Spectrométrie de masse

Les spectres de masse Electrospray ont été enregistrés sur un appareil Perkin Elmer

Sciex API – 365 ou sur un appareil Applied Biosystems Q Trap pour les N-alkylamino -1-

désoxylactitols qui ont été analysés dans un mélange eau/méthanol à une concentration de

10µg/ml. Le voltage du capillaire est de 5kV, le potentiel de dissociation est optimisé pour

chaque échantillon pour une valeur comprise entre 0 et 150V.

Les spectres ont été enregistrés en mode positif, la source d’ionisation chimique étant

NH3.


191

II.4 Analyses centésimales

Ces analyses ont été effectuées par le service d’analyse du Laboratoire de Chimie de

Coordination (LCC) pour le carbone, l’hydrogène et l’azote et par le Service central d’analyse

du département d’analyse élémentaire du CNRS de Vernaison pour le bore, le sodium et le

chlore.

III SYNTHESE

III.1 N-dodécylamino-1-désoxylactitol - L12

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH

123

45

6

1'2'3'

4'5'

6'

α

β

χ

δ

ε

φ

γ

η

ι

ϕ

κ

Une solution de 3,019g (16 mmol) de dodécylamine solubilisés dans 35 mL de

méthanol est ajoutée à une solution de 3,599 g (10 mmol) de α−D-lactose monohydrate

solubilisés dans 20 mL d’eau distillée. Après 24 heures d’agitation magnétique à température

ambiante, le mélange réactionnel est chauffé à 60°C pendant 30 minutes. Les solvants sont

évaporés sous pression réduite (10 mmHg).

Le solide blanc obtenu est repris dans 200 mL de méthanol et 537 mg (14 mmol) de

NaBH4 sont ajoutés par petites fractions à la solution à température ambiante. Le mélange

réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 24 heures puis il est

chauffé à 60°C pendant 10 heures. Après retour à température ambiante, le mélange

réactionnel est à nouveau laissé sous agitation pendant 12 heures. Les solvants sont ensuite

évaporés sous pression réduite (10 mmHg) pour conduire à un solide blanc.

Le solide est repris dans 150 mL de chloroforme et chauffé à 40°C pendant 15

minutes. La suspension est ensuite filtrée à chaud sur fritté (porosité n° 4) afin d’éliminer

l’amine résiduelle. Cette opération est répétée trois fois.

Le solide sec est ensuite solubilisé dans un minimum d’eau (environ 20 mL pour 5g).

20 mL d’éthanol sont ajoutés pour faire précipiter le produit. La solution est filtrée sur fritté.

Le solide est récupéré et la même opération est répétée une seconde fois.

Le solide est alors repris dans un minimum d’eau et la solution aqueuse est acidifiée

avec de l’acide chlorhydrique (1M) jusqu’à un pH = 3 afin d’hydrolyser les complexes formés


192

entre le sucre et les sels de bore. Ensuite, les borates vont être éliminés du système sous forme

d’esters d’éthyle par évaporation. 400 mL d’éthanol sont ajoutés par petites fractions et la

solution de tensioactif est évaporée à sec sous pression réduite et à 40°C.

Le tensioactif est repris dans un minimum d’eau et la solution est traitée avec une

solution aqueuse de NaOH jusqu’à un pH = 11. Ensuite, le produit est reprécipité en ajoutant

500 mL d’éthanol. La solution est laissée au réfrigérateur quelques heures pour une meilleure

précipitation. Le solide blanc est récupéré par filtration sur fritté. Le produit est séché par

lyophilisation.

Pour obtenir un produit pur, dépourvu des sels inorganiques, le tensioactif est extrait

plusieurs fois dans 100 mL d’acétone anhydre à 40°C pendant 30 minutes.

Après l’évaporation du solvant et lyophilisation 1,5 g d’une poudre blanche de N-

dodécylamino-1-désoxylactitol est obtenue.

Rendement : 30 %

Le produit est hygroscopique.

RM 1H (300 MHz, D2O :CD3COOD = 6: 1) δ δ δ δ ppm : 4,04 (d, JHH = 9 Hz, 1H, H

anomérique); 3,8 – 3,05 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 2,83 – 2,56 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);

1,21 (m, 2H, NH2-CH2-CH2) ; 0,82 (sl, 18H, CH2) ; 0,36 (t, JHH= 9 Hz, 3H, CH3).

RM 13C-1H (75 MHz, D2O) δ δ δ δ ppm : 102,96 (s, C1, anomérique); 79 – 68,02 (m,

CH sucre); 61,93 (s, C6); 61,37 (s, C6’) ; 50 (s, C1); 48,08 (s, Cα); 31,82 – 22,55 (s, CH2

chaîne) ; 13,81 (s, CH3).

Electrospray, m/z : 534,5 [M-Na+] ; 512,4 [M-H+]; 350,3 [MH+ - GalOH]

Analyse élémentaire: Calculé pour C24H49NO10 , 2H2O : C, 52,63%; H, 9,75%; N,

2,56%. Expérimentale: C, 52,56%; H, 9,25%; N, 2,58; B, 270 ppm; Na, 430 ppm; Cl, < 200

ppm.


193

III.2 N-hexadécylamino-1-désoxylactitol - L16

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH

123

45

6

1'2'3'

4'5'

6'

α

β

χ

δ

ε

φ

γ

η

ι

ϕ

κ

λ

µ

ν

ο

Une solution de 4,172g (17 mmol) d’hexadécylamine solubilisés dans 35 mL de

propan-2-ol est ajoutée à une solution de 3,614 g (10 mmol) de α−D-lactose monohydrate

solubilisé dans 20 mL d’eau distillée. Après 24 heures d’agitation magnétique à température

ambiante, le mélange réactionnel est chauffé à 60°C pendant 30 minutes. Les solvants sont

évaporés sous pression réduite (10 mmHg).

Le solide blanc obtenu est repris dans 200 mL de méthanol et 565 mg (15 mmol) de

NaBH4 sont ajoutés par petites fractions à la solution à température ambiante. Le mélange

réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 24 heures puis il est

chauffé à 60°C pendant 10 heures. Après retour à température ambiante, le mélange

réactionnel est à nouveau laissé sous agitation pendant 12 heures. Les solvants sont ensuite

évaporés sous pression réduite (10 mmHg) pour conduire à un solide blanc.

Le solide est repris dans 150 mL de propan-2-ol et chauffé à 40°C pendant 15 minutes.

La suspension est ensuite filtrée à chaud sur fritté (porosité n° 4) afin d’éliminer l’amine

résiduelle. Cette opération est répétée trois fois.

Le solide sec est ensuite solubilisé dans un minimum d’eau (environ 20 mL pour 5g).

20 mL de méthanol sont ajoutés pour faire précipiter le produit. La solution est filtrée sur

fritté. Le solide est récupéré et la même opération est répétée une seconde fois.

Le solide est alors repris dans un minimum d’eau et la solution aqueuse est acidifiée

avec de l’acide chlorhydrique (1M) jusqu’à un pH = 3 afin d’hydrolyser les complexes formés

entre le sucre et les sels de bore. Ensuite, les borates vont être éliminés du system sous forme

d’esters d’éthyle par évaporation. 400 mL d’éthanol sont ajoutés par petites fractions et la

solution de tensioactif est évaporée à sec sous pression réduite.

Le tensioactif est repris dans un minimum d’eau et la solution est traitée avec une

solution aqueuse de NaOH jusqu’à un pH = 11. Ensuite le produit est reprécipité en ajoutant

500 mL d’éthanol. La solution est laissée au réfrigérateur quelques heures pour une meilleure

précipitation. Le produit solide et blanc est récupéré par filtration sur fritté. Le produit est

séché par lyophilisation.


194

Pour obtenir un produit pur, dépourvu des sels inorganiques, le tensioactif est extrait

plusieurs fois dans 100 mL de propan-2-ol à 40°C pendant 30 minutes.

Après l’évaporation du solvant et lyophilisation 1,2 g d’une poudre blanche de N-

dodécylamino-1-désoxylactitol est obtenue.

Rendement : 21 %

Le produit est hygroscopique.

RM 1H (300 MHz, D2O :CD3COOD = 6: 1) δ δ δ δ ppm : 4,24 (d, JHH = 9Hz, 1H, H


1,42 (m, 2H, NH2-CH2-CH2) ; 0,99 (sl, 26H, CH2) ; 0,59 (t, 3H, CH3).

RM 13C-1H (75 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 103,48 (s, C1,

anomérique); 79,9 – 69,09 (m, CH sucre); 62,22 (s, C6); 61,24 (s, C6’) ; 51,79 (s, C1); 49,56 (s,

Cα); 31,69 – 22,41 (s, CH2 chaîne) ; 13,44 (s, CH3).

Electrospray, m/z : 590,5 [M-Na+] ; 568,5 [M-H+]; 406,5 [MH+ - GalOH]

Analyse élémentaire: Calculé pour C28H57NO10: C, 59,23%; H, 10,12%; N, 2,47%.

Expérimentale: C, 59,6%; H, 10,30%; N, 2,50; B, 167 ppm; Na, 944 ppm;


195

III.3 Dendrimères catanioniques analogues du GalCer

III.3.1 Mélanges catanioniques comportant le N-hexadécylamino-1-désoxylactitol : L16DC3 et L16DC10

Procédure générale :

30 mg de DC3 ou DC10 (6 et 4,85 µmol respectivement) et 41,4 mg ou 33,5 mg L16 (72

et 58,2 µmol respectivement) sont ajoutés dans 16 ml d’un mélange d’eau distillée : propan-1-

ol (rapport volumique 1 : 3). Après 2 jours d’agitation magnétique à température ambiante, on

obtient une solution homogène, qui conduit de façon quantitative après évaporation et

lyophilisation aux produits L16DC3 et L16DC10 respectivement. Les produits se présentent sous

forme des poudres blanches – jaunâtres.

Mélange catanionique L16DC3

N3P3 O C01

C02 C0

3

C04

N N

Me

P

S

O C11

C12 C1

3

C14

NH

O

P

O

OH

O

C3H72

x 12

O

OH

OHHO

HOHO

OHHO

HO

ONH2

1 23

45

6

1' 2'3'

4'5'

6'

α

6

RM 1H (500 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 7,81 – 7,7 (m, 14 au lieu

de18H C03H et CH=N); 7,32 – 6,82 (m, 54H au lieu de 60H, C0

2H, C12H et C1

3H); 4,28 (s, 4H

au lieu de 12H, H anomérique); 3,86 – 3,46 (m, 126H au lieu de 144H, CH et CH2 sucre);

3,31 – 3,06 (m, 80 au lieu de 90, NH-CH2, CH2-NH2-CH2, N-CH3); 2,74 – 2,59 (m, 40H au

lieu de 36H, Ar-CH2, P-CH); 1,92 (m, 26H au lieu de 24H, CH-CH2) ; 1,44 – 1,29 (m, 346H

au lieu de 360H, CH2 et NH2-CH2-CH2); 0,92 (t, 40H au lieu de 36H, CH3); 0,86 (t, 36H,

CH3).

RM 13C-1H (125 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 170,9 (s, CONH);

152,31 ( s, C01); 149,2 (s, C1

1); 139,12 (s, CH=N ); 136,8 (s, C14); 133 (s, C0

4); 130,45 (s,

C13); 128,4 (s, C0

3); 121,56 – 121 (s, C12 et C0

2); 103,42 (s, C1, anomérique); 77,9 – 67,9 (m,

CH sucre); 61,9 (s, C6); 61,47 (s, C6’) ; 49 (s, C1); 47,7 (s, Cα); 43,81 (s, P-CΗ); 42,16 (s, NH-

CΗ2); 34,6 (s, Ar-CH2); 33,56 (s, N-CH3); 32,05 – 22,7 (m, CH2 chaîne) ; 13,84 (s, CH3).

RM 31P-1H (121 MHz, D2O : Propan-1-ol = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 62,72 (s, P=S); 17,27 (s,

P(OH)O-); 9,3 (s, N3P3).


196


N3P3 O C01

C02 C0

3

C04

N N

Me

P

S

O C11

C12 C1

3

C14

NH

O

P

O

OH

O

C10H21

2

x 12

O

OH

OHHO

HOHO

OHHO

HO

ONH2

1 23

45

6

1' 2'3'

4'5'

6'

α

6

RM 1H (500 MHz, D2O :CD3C(OD)CD3 = 1: 3) δ δ δ δ ppm : 7,72 – 7,63 (m, 13H au

lieu de 18, C03H et CH=N); 7,27 – 6,79 (m, 55 au lieu de 60H, C0

2H, C12H et C1

3H); 3,97 –

3,58 (m, 144H, CH et CH2 sucre); 3,39 – 3,36 (m, 20H au lieu de 24, NH-CH2); 3,22 – 3,11

(m, 49H, CH2-NH2-CH2) ; 2,84 – 2,82 (m, 25H, Ar-CH2); 2,69 (m, 18H, N-CH3); 2,26 (t,

11H, P-CH); 2,09 – 2,08 (m, 24H, CH-CH2) ; 1,8 (m, 48H, NH2-CH2-CH2); 1,3 (m, 520H au

lieu de 504, CH2) ; 0,93 (t, 39H au lieu de 36H, CH3); 0,86 (t, 36H, CH3) .


149,17 ( C01 et C1

1); 136,9 – 136,7 (m, CH=N et C14); 134,23 (s, C0

4); 129,7 (s, C13); 128,04

(s, C03); 121,08 – 119,4 (s, C1

2 et C02); 103,104 (s, C1, anomérique); 78,9 – 70,7 (m, CH

sucre); 62,11 (s, C6); 61,44 (s, C6’) ; 49,9 (s, C1); 48,1 (s, Cα); 43,53 (s, P-CΗ); 40,62 (s, NH-

CΗ2); 34,53 (s, Ar-CH2); 34,03 (s, N-CH3); 31,71 – 19,16 (m, CH2 chaîne) ; 13,67 (s, CH3).


P(OH)O-); 9,24 (s, N3P3).


197

III.3.2 Mélanges catanioniques comportant le N-dodécylamino-1-désoxylactitol : L12DC3 et L12DC10


30 mg de DC3 ou DC10 (6 et 4,85 µmol respectivement) et 39,1 mg ou 31,6 mg L12 (72

et 58,2 µmol respectivement) sont ajoutés dans 16 ml d’un mélange d’eau distillée : propan-1-

ol (rapport volumique 1 : 3). Après 2 jours d’agitation magnétique à température ambiante, on

obtient une solution homogène, qui conduit de façon quantitative après évaporation et

lyophilisation aux produits L12DC3 et L12DC10 respectivement. Les produits se présentent sous

forme des poudres blanches – jaunâtres.


N3P3 O C01

C02 C0

3

C04

N N

Me

P

S

O C11

C12 C1

3

C14

NH

O

P

O

OH

O

C3H72

x 12

O

OH

OHHO

HOHO

OHHO

HO

ONH2

1 23

45

6

1' 2'3'

4'5'

6'

α

6



2H, C12H et C1

3H); 4,31 (s, 3H



lieu de 36H, Ar-CH2, P-CH); 1,8 (m, 26H au lieu de 24H, CH-CH2) ; 1,42 – 1,26 (m, 252H au

lieu de 264H, CH2 et NH2-CH2-CH2); 0,94 (t, 39H au lieu de 36H, CH3); 0,89 (t, 36H, CH3).


151,6 ( s, C01); 149,32 (s, C1

1); 138,8 (s, CH=N ); 137,4 (s, C14); 133,4 (s, C0

4); 130,2 (s, C13);

129,42 (s, C03); 121,3 – 121,72 (s, C1

2 et C02); 103,54 (s, C1, anomérique); 77,87 – 67,9 (m,

CH sucre); 62,3 (s, C6); 61,51 (s, C6’) ; 49,71 (s, C1); 48,03 (s, Cα); 43,2 (s, P-CΗ); 41,02 (s,

NH-CΗ2); 35,76 (s, Ar-CH2); 33,13 (s, N-CH3); 32,1 – 22,34 (m, CH2 chaîne) ; 13,82 (s,

CH3).


P(OH)O-); 9,33 (s, N3P3).


198


N3P3 O C01

C02 C0

3

C04

N N

Me

P

S

O C11

C12 C1

3

C14

NH

O

P

O

OH

O

C10H21

2

x 12

O

OH

OHHO

HOHO

OHHO

HO

ONH2

1 23

45

6

1' 2'3'

4'5'

6'

α

6



2H, C12H et C1

3H); 4,31 (s, 3H



lieu de 36H, Ar-CH2, P-CH); 1,81 (m, 26H au lieu de 24H, CH-CH2) ; 1,42 – 1,26 (m, 418H

au lieu de 432H, CH2 et NH2-CH2-CH2); 0,954 (t, 42H au lieu de 36H, CH3); 0,904 (t, 36H,

CH3).


151 ( s, C01); 149,16 (s, C1

1); 139 (s, CH=N ); 136,54 (s, C14); 133 (s, C0

4); 129,78 (s, C13);

128,24 (s, C03); 121,43 – 121,12 (s, C1

2 et C02); 103,117 (s, C1, anomérique); 78,74 – 67,89

(m, CH sucre); 62,13 (s, C6); 61,51 (s, C6’) ; 49,93 (s, C1); 48,05 (s, Cα); 43,24 (s, P-CΗ);

41,07 (s, NH-CΗ2); 34,68 (s, Ar-CH2); 32,97 (s, N-CH3); 31,9 – 22,44 (m, CH2 chaîne) ;

13,74 (s, CH3).


P(OH)O-); 9,27 (s, N3P3).


199

III.4 Associations catanioniques bicaténaires analogues du GalCer


A 80 mg L16 (139 mmol) dans 100 ml d’eau distillée, on ajoute 139 mmol d'acide

carboxylique (soit 72,28 mg H4F8 ou 59,77 mg H2F6H4 ou 64,5 mg F8 ou 31,69 mg acide

myristique). Après 2 jours d’agitation magnétique à température ambiante (à 35°C pour

l’association de l’acide myristique), on obtient une solution homogène, qui conduit de façon

quantitative après lyophilisation aux associations catanioniques bicaténaires L16H4F8,

L16H2F6H4, L16F8 et L16H13 respectivement. Les produits se présentent sous forme des poudres

blanches.

III.4.1 Association catanionique L16H4F8

C

O

O

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

123

45

6

1'2'3'

4'5'

6'

α

F

F F

F F

F F

F F

F F

F F

F F

F F

RM 1H (400 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 4,42 (d, JHH = 6Hz,

1H, H anomérique); 4,2 – 3,49 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 3,1 – 2,9 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);

2,16 (t, JHH = 9Hz, 2H, CH2–COO-); 2,15- 2,08 (m, 2H, CH2–CF2); 1,6 (m, 6H, NH2-CH2-

CH2 et (CH2)2-CH2-CF2) ; 1,2 (sl, 26H, CH2) ; 0,81 (t, 6H, JHH = 6Hz, CH3).

RM 13C-1H (100 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm:180,66 (s, COO-);

118,62-108,46 (m, CF2 et CF3); 103,19 (s, C1, anomérique); 78,8 – 67,8 (m, CH sucre); 62,02

(s, C6); 61,45 (s, C6’) ; 51,5 (s, C1); 49,93 (s, Cα); 36,9 (s, CH2-COO-); 31,66 (s, CH2-CF2);

30,41 – 19,89 (m, CH2 chaînes) ; 13,5 (s, CH3).

RM 19F (376 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : -126,74 (CF2-CF3); -

124,01, -123,44, -122,51 ((CF2)5 CF2-CF3); -114,86 (CF2-CH2); -81,66 (CF3).

IR (KBr) cm-1: 1567 (ῡCOO- asymétrique), 1404 (ῡCOO- symétrique).


200

III.4.2 Association catanionique L16H2F6H4

C

O

O

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

123

45

6

1'2'3'

4'5'

6'

α

F F

F F

F F

F F

F F

F F

RM 1H (500 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 4,5 (d, JHH = 6Hz, 1H,

H anomérique); 4,2 – 3,52 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 3,2 – 2,9 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);

2,41(t, JHH = 7Hz, 2H, CH2–COO-); 2,22- 2,1 (m, 4H, CH2–(CF2)6–CH2); 1,67 (m, 6H, NH2-

CH2-CH2 et (CH2)2-CH2-CF2) ; 1,28 (sl, 26H, CH2) ; 1,152 (t, 3H, JHH = 7,5Hz, CF2-(CH2)3-

CH3) ; 0,89 (t, 3H, JHH = 7Hz, CH3).


118,68-111,26 (m, CF2 et CF3); 103,19 (s, C1, anomérique); 78,83 – 67,88 (m, CH sucre);

62,01 (s, C6); 61,47 (s, C6’); 49,91 (s, Cα); 36,97 (s, CH2-COO-); 31,67 (s, CH2-CF2); 30,52 –

22,39 (m, CH2 chaînes); 19,94 (s, CF2-(CH2)3-CH3); 13,44 (s, CH3).

RM 19F (376 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : -124,27 (-CF2-CF2-

(CF2)2-CF2-CF2); -122,53 (-CF2-CF2- (CF2)2-CF2-CF2); -116, 93 ((-CF2-(CH2)3-CH3); -114,93

(CF2-(CH2)2-COO-).



201

III.4.3 Association catanionique L16F8

C

O

O

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

123

45

6

1'2'3'

4'5'

6'

α

F

F F

F F

F F

F F

F F

F F

F F

F F

RM 1H (400 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 4,5 (d, JHH = 7,6Hz,

1H, H anomérique); 4,2 – 3,5 (m, 12H, CH et CH2 sucre); 3,1 – 2,9 (m, 4H, CH2-NH2-CH2);

1,72 (m, 2H, NH2-CH2-CH2) ; 1,27 (sl, 26H, CH2) ; 0,88 (t, 3H, JHH = 6,8Hz, CH3).


117,07-108,38 (m, CF2 et CF3); 103,18 (s, C1, anomérique); 78,8 – 67,8 (m, CH sucre); 62,01

(s, C6); 61,45 (s, C6’) ; 49,8 (s, Cα); 31,64 – 22,36 (m, CH2 chaînes) ; 13,4 (s, CH3).

RM 19F (376 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : -126,71 (CF2-CF3); -

123,29 - - 122,29 ((CF2)5 CF2-CF3); -117,56 (CF2-COO-); -81,62 (CF3).



202

III.4.4 Association catanionique L16H13

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

123

45

6

1'2'3'

4'5'

6'

α

C

O

O

RM 1H (300 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 3 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 4,33 (d, 1H, H


2,10 (t, JHH = 9Hz, 2H, CH2–COO-); 1,65 (sl, 2H, NH2-CH2-CH2) ; 1,51 (m, 2H, CH2-CH2–

COO-) ; 1,2 (sl, 46H, CH2) ; 0,82 (t, 6H, JHH = 6Hz, CH3).

RM 13C-1H (75 MHz, CD3OD : D2O : CDCl3= 2,67 : 1: 1) δ δ δ δ ppm : 181,49 (s,

COO-); 103,48 (s, C1, anomérique); 79,9 – 69,09 (m, CH sucre); 62,22 (s, C6); 61,21 (s, C6’) ;

51,79 (s, C1); 49,56 (s, Cα); 37,51 (s, CH2-COO-); 31,81 – 22,54 (m, CH2 chaînes) ; 13,5 (s,

CH3).



203

IV TECHNIQUES DE CARACTERISATION PHYSICO - CHIMIQUE

IV.1 Préparation des solutions de catanioniques

Les solutions aqueuses de tensioactifs catanioniques dendritiques ont été préparées

selon le mode opératoire suivant. Dans un tube à essais 1mg de produit a été pesé et solubilisé

dans 0,5 ml d’un mélange eau : n-propanol = 1 : 3. Après l’évaporation des solvants sous

pression réduite (10 mbar), afin d’assurer l’évaporation complète des solvants, le tube à essai

a été soumis pendant une heure à un vide poussé (10-2 mbar). Un film transparent de produit

se forme à l’intérieur du tube. Une quantité précise d’eau ultra pure à été ajoutée afin

d’obtenir, pour chaque association catanionique dendritique, une solution aqueuse d’une

concentration maximale de 10-4 M. La solution a été homogénéisée en la soumettant aux

ultra-sons durant 10 min à une température de 45°C. Après repos, des quantités précises de

cette solution aqueuse ont été diluées, à température ambiante, avec différentes quantités

d’une solution aqueuse NaCl 0,15M.

En ayant une solubilité supérieure à celles des associations catanioniques dendritiques,

les tensioactifs catanioniques mixtes fluorés/hydrogénés n’ont pas eu besoin pour la

préparation des solutions aqueuses d’un protocole opératoire impliquant la formation d’un

film de produits. Ainsi, les solutions ont été préparées par simple solubilisation dans l’eau

ultra pure de différentes quantités de tensioactifs afin d’obtenir une concentration finale de

5x10-3M. Après solubilisation à une température de 45°C, les solutions ont été soumises aux

ultra-sons à la même température pendant 10 minutes. Après repos, des quantités précises de

cette solution aqueuse ont été diluées, à température ambiante, avec différentes quantités

d’une solution aqueuse NaCl 0,15M. La précision des concentrations des solutions préparées

étant de ± 1%.

Les solutions de tensioactifs ont été soumises aux ultra-sons en utilisant un bain à ultra-

sons Elmasonic S 30 (37kHz) avec régulation de température.

IV.2 Mesure de tension de surface

Les mesures de tension de surfaces ont été réalisées avec un tensiomètre VWR TD1

Lauda par la méthode de la lame mouillable selon Wilhelmy ou la méthode de l’anneau selon

Du Noüy. La technique consiste à déformer l’interface air-eau et à mesurer la force nécessaire


204

à la rupture du film de surface. Les solutions ont été étudiées dans une cuve de téflon et la

lame ou l’anneau utilisé était composé de platine et d’iridium.

La force capillaire F du liquide est exprimée par l’équation 1:

F = 2γl

Équation 1

Où γ est la tension superficielle et l la longueur du fil de platine de l’étrier. L’équation

permet à l’appareil de fournir la valeur de la tension superficielle, qui représente l’énergie

interfaciale.

Les solutions dans l’eau ultrapure ont été préparées par pesée. Les prises de mesure

ont été réalisées à l’équilibre soit après 4 ou 24 heures. Les solutions salines (NaCl 0,15M)

ont été préparées par dilutions successives d’une solution mère aqueuse (10-4M et 5x10-3M

pour les associations catanioniques dendritiques et hybrides respectivement) avec une solution

aqueuse NaCl 0,15M. Les prises de mesure ont également été réalisées à l’équilibre.

Pour les mesures des systèmes présentant un plateau intermédiaire, des solutions

supplémentaires ont été préparées afin de vérifier la validité de ces points.

Pour la méthode de l’anneau selon Du Noüy les valeurs ont été corrigées en utilisant le

tableau de correction Harkins – Jordan 1.

IV.3 Evaluation de la taille et de la distribution de taille des agrégats - Diffusion quasi-élastique de la lumière (DLS)

Les études de diffusion quasi-élastique de la lumière ont été réalisées à l’aide d’un

appareil Malvern Instrument Zetasizer 3000HSA à un angle de 90° à 298K ou 310K.

L’appareil est muni d’un laser He – Ne qui émet une lumière monochromatique d’une

longueur d’onde de 633 nm. La gamme de tailles pouvant être étudiée par cet appareil est

comprise entre 5 nm et 10µm. La température est régulée par une plaque à effet Pelletier à ±

0,1°C. Afin d’obtenir la distribution en taille des agrégats, le modèle Contin a été employé.

L’adéquation entre le modèle utilisé et les données expérimentales (fonction

d’autocorrélation) a été vérifiée par la présence d’une distribution régulière des résiduels. La

précision des mesures est de ± 5 nm.

N.B. Les indices de polydispersité ont été obtenus en utilisant un modèle monomodal.


205

La lumière émise par le laser, lors de l’interaction avec des particules en mouvement

(mouvement brownien), est diffusée dans toutes les directions. Pour des objets sphériques, la

diffusion est maximale pour un angle de 90° avec la lumière incidente. Au cours de la

diffusion, la lumière réémise par les objets subit une modification de sa fréquence en raison

d’un effet Doppler, et est donc dépendante de la vitesse de diffusion des particules. La

relation de Stockes-Einstein (1905), relie le rayon hydrodynamique rH des particules à leurs

coefficients de diffusion DT (Equation 2, où k est la constante de Boltzmann, T la température

absolue, et η la viscosité du milieu).

rH = kT / 3πηDT

Équation 2

Par ailleurs, l’intensité diffusée est dépendante du nombre de particules diffusantes. En

tenant compte de cela, et en appliquant un modèle statistique, une distribution de la taille des

particules peut être déterminée.

Les échantillons ont été préparés à différentes concentrations supérieures à la CAC et

préalablement filtrés sur un filtre pour seringue Sartorius dont la taille des pores est de 1,20

µm. La solubilisation des tensioactifs est assurée par chauffage doux et agitation modérée de

la solution afin de ne pas induire des forces de cisaillement (pour une partie des études

réalisées sur les tensioactifs catanioniques hybrides) ou par l’utilisation des ultra-sons (voir

section IV.1 pour la préparation des échantillons). Les solutions préparées sont laissées à

stabiliser pendant une période de temps variable (de 4 à 24 heures) en fonction des conditions

expérimentales et des produits.

IV.4 Caractérisation des agrégats

IV.4.1 Microscopie électronique par transmission

La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour déterminer la

morphologie des agrégats formés spontanément ou par l’utilisation des ultra-sons en solution

aqueuse.

Les solutions aqueuses d’objets préparés à des concentrations supérieures à la CAC ont

été déposées sur une grille de cuivre (Formvar) recouverte d’un film de carbone. L’excès de

solution est enlevé par capillarité (papier filtre) et le solvant est évaporé. La grille est ensuite


206

déposée dans une goutte de contrastant (phosphotungstate de sodium 2% m/m neutralisé à

pH=7), dont l’excès est également retiré par capillarité, puis laissé sécher à l’air libre.

Les études ont été réalisées au Service Commun de Microscopie Electronique de

l’Université Paul Sabatier (TEMSCAN), en utilisant un microscope de type JEOL 200 CX qui

opère à 200 kV.

Le principe de l’observation est basé sur l’effet d’écran que peut produire un réseau de

molécules organisées, tel qu’au sein des agrégats. En effet, l’échantillon est soumis à un

faisceau d’électrons cohérent et les zones de l’échantillon de haute densité moléculaire vont

s’opposer au passage des électrons en raison d’une densité électronique plus importante et

permettre ainsi l’apparition d’un effet de contraste. L’agent contrastant ajouté est un métal

lourd, qui a une bonne affinité pour les zones polaires, et qui renforce ainsi cet effet.

La nécessité d’une étape de déshydratation ainsi que la présence d’un agent contrastant

sont souvent à l’origine d’artéfacts. C’est pour cela que les observations ont été répétées au

moins deux fois.

IV.4.2 Cryofracture

La technique de la cryofracture permet de s’affranchir de l’utilisation d’un agent

chimique de contraste car elle permet d’obtenir une réplique de la surface fracturée d’un

échantillon cryofixé.

Un très faible volume de l'échantillon (environ 1µL) est posé sur une plaquette porte-

objet en cuivre (d'une surface d'environ 1 mm2). Une plaquette identique est alors disposée sur

cette goutte d'échantillon de façon à créer un « sandwich » d'échantillon d'une épaisseur de

l'ordre de 20 micromètres (Figure 1.1 et 1.2). Les plaquettes sont préalablement traitées pour

que l'échantillon mouille correctement la surface. Cet ensemble est ensuite plongé

brusquement dans un bain de propane liquide (de température environ égale à -200°C)

refroidi par l’azote liquide (Figure 1.3). Cette congélation ultrarapide permet en principe de

préserver l'organisation interne de l'échantillon, les molécules constituant la phase fluide

n'ayant, normalement, pas le temps de cristalliser comme elles le feraient si la température

était diminuée progressivement. Le but recherché est une vitrification de l'échantillon.

L'ensemble plaquettes/échantillon est ensuite introduit dans la table porte-échantillon, dans

l'enceinte de l'appareil de cryofracture BAF 400 (Balzers, Liechtenstein) maintenue à une

pression très faible (environ 10-6 mBar) et à une température de -120°C (ou -150°C). Les deux


207

plaquettes de cuivre sont alors séparées de manière mécanique comme schématisée sur la

figure 1.4. La table porte-échantillon s'ouvre, séparant les deux plaquettes de cuivre : la

plaquette supérieure est imbriquée dans la partie mobile du porte-échantillon et la plaquette

inférieure est maintenue dans la partie fixe.

L'échantillon est alors fracturé. La ligne de fracture passe par les zones de moindre

résistance, séparant l'échantillon en deux parties. Ces zones de faibles cohésions sont, par

exemple, la zone hydrophobe d'une couche lipidique dans le cas d'une membrane ou bien la

surface de contact entre les particules colloïdales et le solvant environnant (Figure 1.5).

Une réplique de la surface fracturée est effectuée, par un ombrage de la surface par des

vapeurs de métaux lourds (Pt) à l'aide d'un canon à électron incliné de 45° par rapport à la

surface. Ainsi, le métal se dépose avec une épaisseur caractéristique qui varie selon le relief

de la surface (Figure 1.5). Un deuxième canon dépose une couche uniforme de carbone, avec

un angle de 90°, afin d'augmenter la résistance mécanique de la réplique de la surface

fracturée (Figure 1.5).

L'ensemble constitué de l'échantillon couvert de sa réplique de platine et de carbone est

ensuite ramené à température et pression ambiante, nettoyé dans un solvant adapté (H2O ou

une solution concentré de H2SO4) et déposé sur une grille de microscopie électronique. La

réplique ainsi préparée, est observée au microscope électronique en transmission (Figure 2).

La finesse des grains de platine fixe la résolution de l'image.

L'image de la surface est obtenue grâce à un faisceau d'électrons projeté verticalement

sur la réplique. Le carbone est traversé par les électrons alors que le platine les arrête de façon

plus ou moins totale selon l'épaisseur rencontrée par le faisceau. Un film photographique situé

sous l'échantillon, permet de retranscrire les informations sur le relief en contraste de gris : les

zones de la réplique où le platine s'est accumulé apparaissent en noir, les zones sans platine

sont blanches et les zones sans relief sont grises car le platine s'y est réparti uniformément

(Figure 2). L'analyse précise de l'image est parfois complexe car il s'agit ici d'une coupe

bidimensionnelle dans un échantillon tridimensionnel. Cependant dans bien des cas, elle

permet d'obtenir de précieuses informations sur la structure de l'échantillon.


208

Figure 1 : Représentation schématique de la préparation des échantillons obtenus par cryofracture

L’observation de la réplique a été effectuée sur un microscope électronique à

transmission EM 902 (Zeiss) qui opère à 90 kV et les images ont été enregistrées par une

caméra CCD (Charge Coupled Device camera(TRS)).

Figure 2 : Schéma de l'étape d'observation au microscope électronique en transmission http://www.crpp.u-bordeaux.fr/transform/competences/cryofracture.html

http://www.lps.ens.fr/recherche/surfaces-moleculaires/taulier/Experiences-cryo.html

table porte-échantillon

ligne de fracture


209

IV.5 Isothermes de compression

Les isothermes de compression (pression de surface / aire par molécule (π/A)) ont été

enregistrées en utilisant une balance de Langmuir R&K GmbH (Potsdam, Germany) ayant

une aire de surface de 307,8 cm² et équipée d’un système Wilhelmy de mesure de la pression

de surface qui utilise une lame en papier. La cuve en téflon a été thermostatée à une

température de 20°C en utilisant un bain thermostaté avec une circulation d’eau. La

compression du film a été faite par une barrière mobile.

La cuve est remplie avec une solution aqueuse (0,15mM NaCl) obtenue à partir d’eau

ultra pure (eau Milipore Q-grade de résistivité supérieure à 18 MΩ.cm). Pour la mesure de

tension superficielle on plonge la plaque de Wilhelmy préalablement mouillée. On procède

ensuite au nettoyage de la surface par aspiration avec une trompe à eau pour éliminer toute

traces d’impuretés. On épand la solution du phospholipide (50µl, 1mM en chloroforme) avec

une micro-seringue, en faisant tomber la solution goutte à goutte à la surface aqueuse. On

attend environ 10 minutes que le solvant s’évapore et on injecte dans la sous-phase d’une

manière homogène des faibles quantités (d’ordre de microlitres) d’une solution aqueuse

concentrée (10-4 M et 5x10-3 M pour les associations catanioniques dendritiques et

bicaténaires respectivement – pour la préparation des échantillons voir la section IV.1) du

composé catanionique étudié. Après une période d’approximativement 30 minutes

d’équilibration du système et d’adsorption du tensioactif à l’interface eau - air, le film est

comprimé en déplaçant la barrière à une vitesse de 5 Å2/ molécule/ min. La variation de la

tension superficielle est mesurée par la microbalance équipée d’une lame de Wilhelmy en

papier qui est immergée dans la sous-phase.

Le même protocole est respecté dans le cas des mesures des isothermes de compression

sans DPPC réalisées pour les composés catanioniques dendritiques sauf que l’interface n’est

plus occupée par les molécules de phospholipide.

Chaque mesure a été réalisée au moins deux fois.


210

IV.6 Spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS)

Les mesures de spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS) ont été

réalisées sur les monocouches formées à l’interface eau/air en utilisant une balance de

Langmuir (180,09 cm²) équipée d’un système Wilhelmy de mesure de la pression de surface

qui utilise une lame en papier. La cuve en téflon a été thermostatée à une température de 20°C

en utilisant un bain thermostaté avec une circulation d’eau. La compression du film a été faite

symétriquement par deux barrières mobiles.

Les monocouches de DPPC ont été préparées comme présenté précédemment pour les

isothermes de compression (quantité utilisée : 25µl, sol. 1mM en CHCl3), la sous – phase

étant toujours une solution aqueuse saline (0,15mM NaCl) obtenue à partir de l’eau ultra pure

(eau Milipore Q-grade de résistivité supérieure à 18 MΩ.cm).

Pour les mesures réalisées à une pression de compression constante, le film de DPPC a

été comprimé à une pression de 30mN/m avant qu’on injecte dans la sous – phase (d’une

manière homogène et derrière les barrières) des faibles quantités (microlitres) d’une solution

concentrée (10-4 M et 5x10-3 M dans l’eau pour les associations catanioniques dendritiques et

bicaténaires respectivement, solutions préparées comme décrit dans la section IV.1) du

composé catanionique étudié. Pendant l’expérience, la pression de compression est maintenue

constante à 30mN/m par les deux barrières mobiles. Ainsi, l’insertion du tensioactif dans la

monocouche de DPPC provoque un écartement des barrières par rapport à la position initiale

(DPPC comprimé à 30mN/m) pendant que l’expulsion du composé de la monocouche

engendre un rapprochement des barrières.

Des spectres IRRAS ont été enregistrés pour le DPPC pur et ensuite à chaque demi-

heure après l’injection du tensioactif dans la sous – phase pour une période de temps de 8

heures.

Dans la technique de spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption (IRRAS)

chaque spectre infrarouge est une combinaison de deux mesures separées de reflection (Figure

3). Le signal obtenu, en unités de réflexion-absorption (RA), est le rapport de lumière

réfléchie des deux surfaces liquides: RA = -log[(réflexion de l’echantillon)/( réflexion de la

référence)] = -log (R/ R0).

Ces mesures ont été réalisées en utilisant un spectromètre Vertex 70 (Bruker Optik

GmbH) ayant un détecteur de mercure – cadmium – tellure (MCT) fixé à une unité externe de


211

réflexion disposant d’une cuve de Langmuir (XA – 511, Bruker). Le détecteur est refroidi

avec de l’azote liquide. Un mécanisme coulissant déplace alternativement la cuve de référence

et celle de l’échantillon dans le faisceau infrarouge, permettant l’acquisition alternative des

interférogrammes. Les deux cuves sont connectées afin d’assurer la même hauteur de surface

des deux cotées. Pour toutes les mesures nous avons utilisé un angle d’incidence de 40° et une

lumière p – polarisée. Les spectres représentent la moyenne de 400 scans enregistrés à une

vitesse du scanner de 20kHz et une résolution de 8 cm-1. La lumière réfléchie est collectée au

même angle que l’angle d’incidence.

Le faisceau infrarouge incident a été polarisé en utilisant une grille de polarisation

KRS-5. L’assemble des instruments est enfermée dans une enceint en polymère transparent

afin de réduire les fluctuations d’humidité.

Figure 3 : Schéma du principe de mesure en IRRAS


212

V TESTS BIOLOGIQUES

La lignée cellulaire CEM-SS est cultivée dans un milieu RPMI 1640 (Sigma -Aldrich)

– milieu biologique mis au point par Moore et ses collaborateurs en 1966 à " Roswell Park

Memorial Institute ", d’où le nom de RPMI. Le milieu contient : 100UI/ml de pénicilline,

100µg/ml de streptomycine, 2 mM de glutamine et il est additionné de 10% serum de veau

fœtal préalablement décomplémenté 30 minutes à 56°C. Les cultures cellulaires sont

maintenues à 37 °C sous 5% CO2 et repiquées 3 fois par semaine.

V.1 Conditions expérimentales d’infection des cellules CEM-SS

Le virus VIH-1 Lai, normalement conservé à une température de -80°C, est décongelé

en présence de sérum pendant 5 minutes à 37°C. Puis, des aliquotes de virus sont incubés

avec des cellules CEM-SS 1heure, à 37°C. Après cette période de temps, les virus qui n’ont

pas pénétrés dans les cellules sont éliminés du système analysé par trois lavages successifs

dans le RPMI 1640. Par la suite, ces cultures cellulaires partiellement infectées (quelques %)

par le VIH sont remisées dans un milieu de RPMI et sont traitées avec des solutions des

produits à tester (solutions de différentes concentrations obtenus par dilution d’une solution

mère soniquée (10-4M et 5x10-3M des tensioactifs catanioniques dendritiques et tensioactifs

catanioniques hybrides respectivement – solutions préparées comme décrit dans la section

IV.1)) dans le RPMI. Ces cultures cellulaires sont maintenues à 37 °C sous 5% CO2 pendant 5

jours. Des cultures cellulaires infectées et traitées avec un anti-VIH de référence (AZT) ainsi

que des cultures cellulaires infectées et non traitées et des cultures cellulaires non infectées

(traitées et non traitées) sont maintenues dans les mêmes conditions expérimentales.

Après les 5 jours d’incubation des tests d’évaluation de l’activité anti-VIH et de la

cytotoxicité des tensioactifs catanioniques sont réalisés.


213

V.2 Evaluation de l’activité anti – VIH : incorporation d’uridine tritiée ([3H]- uridine)

La mesure de l’incorporation d’uridine radioactive permet d’apprécier l’activité de la

transcriptase inverse du VIH. Une quantité précise d’[3H] – uridine est additionnée à un

volume minimal de milieu de culture frais puis les cellules sont incubées pendant 6h. Elles

sont ensuite lysées avec 1% SDS (dodecyl sulfate de sodium); les lysées sont déposés sur des

carrés de papier Whatman puis les ARN sont précipités en présence de 10% d’acide

trichloracétique (TCA) pendant 20mn à 4°C. Après 2 lavages avec 5% TCA et 2 lavages avec

70% éthanol, la radioactivité incorporée est mesurée à l’aide d’un compteur à scintillation

(Beckman, LS 1800).

Le pourcentage d’inhibition de la transcriptase inverse est déterminé par rapport aux

cellules infectées non traitées.

Rad des cellules infectées traitées - Rad des cellules non infectées non traitées

Rad des cellules infectées non traitées - Rad des cellules non infectées non traitées

Rad = Radioactivité

V.3 Evaluation de la cytotoxicité : test MTT

Ce test est basé sur la capacité des déshydrogénases mitochondriales de cellules

métaboliquement actives à réduire le 3-(4,5-diméthylthiazol-2yl)-2,5-diphényl tétrazolium

bromide (MTT) de couleur jaune, en formazan de couleur bleu-violet (Figure 4), qui précipite

sous forme de cristaux dans les cellules.

S

NN N

NN

Br

déshydrogénases mitochondriales

S

NN N

NHN

3-(4,5-diméthylthiazol-2yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide (MTT) jaune

formazan bleu-violet

Figure 4 : Schéma de la réaction de réduction du MTT en formazan

Puis, les cristaux de formazan sont solubilisés par addition d’isopropanol contenant

0,04N HCl et 10% Triton – X100. Après la solubilisation, la quantité de formazan produite est

% d'inhibition = 100 - de la réplication virale

x 100


214

évaluée par mesure de sa densité optique à 540nm (DO540), nous permettant ainsi de déduire

le nombre de cellules vivantes.

Le pourcentage de toxicité est calculé par rapport aux cellules témoin, non infectées et

non traitées avec les composés anti-VIH testés.

DO540 des cellules non infectées traitées

DO540 des cellules non infectées non traitées

(1) Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Am. Chem. Soc., 1930, 52, 1751.

Cytotoxicité % = 100 - x 100

Liste des produits

Liste des produits

217

LISTE DES PRODUITS

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH

n

L12: n = 8

L16: n = 12

N3P3 O

N N

Me

P

S

O

NH

O

P

O

OH

O

C3H72

x 12

O

OH

OHHO

HOHO

OHHO

HO

ONH2

6

L12 DC3

N3P3 O

N N

Me

P

S

O

NH

O

P

O

OH

O

C3H72

x 12

O

OH

OHHO

HOHO

OHHO

HO

ONH2

6

L16 DC3

N3P3 O

N N

Me

P

S

O

NH

O

P

O

OH

O

C10H21

2

x 12

O

OH

OHHO

HOHO

OHHO

HO

ONH2

6

L12 DC10

N3P3 O

N N

Me

P

S

O

NH

O

P

O

OH

O

C10H21

2

x 12

O

OH

OHHO

HOHO

OHHO

HO

ONH2

6

L16 DC10

Liste des produits

218

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

12

C

O

O

CF2

CF3

7

L16H4F8

O

OH

HO OH

OH

OH

HO OH

OH

O NH2

12

C

O

O

CF2 6

L16H2F6H4

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

12

C

O

O

CF2

CF3

7L16F8

O

OH

HO OH

OHOH

HO OH

OH

O NH2

12

C

O

O

9

L16H13

Ana-Maria Cristina BOLOLOI

ew catanionic amphiphiles analogues of Galactosylceramide: structure, physico-

chemical properties and anti-HIV activity relationship

Abstract

The research work presented in this thesis was focused on the development of new

catanionic surfactants analogues of GalCer (an alternative cellular receptor of the HIV) for the

anti-HIV therapy.

The first part of the study was dedicated to the synthesis and the study of new

dendritic catanionic associations having a reduced toxicity and which were intended to be

used as multisite chimeras for the HIV. In order to prevent the possible partial dissociation of

the catanionic entity, supposed responsible for the toxicity of this class of compounds, we

reinforced the hydrophobic interactions between the constituents by grafting supplementary

alkyl chains on the dendrimers. The “in vitro” biological tests, the study of the physico-

chemical properties and of the interaction of these compounds with a membrane model

allowed us to establish a relationship between the structure, the hydrophoby, the conformation

and the biological activity of these dendritic catanionic associations.

The aim of the second part of the study was to build up a specific anti-HIV drug

delivery system. For this purpose new hybrid (fluorinated/hydrogenated) catanionic analogues

of GalCer were synthesised and investigated. These compounds are able to spontaneously

form vesicles in water, which have a good stability in time, due to the presence of a rigid and

hydrophobic segment. Due to his good anti-HIV activity, the good stability in time of the

vesicles and his strong synergy with another anti-HIV drug, the AZT, a very promising

catanionic association was identified for the delivery of anti-HIV drugs to the infected cells.

Keywords : HIV, catanionic surfactant, hybrid surfactant, galactosylceramide analogs,

dendrimers, vesicle, multisite, drug delivery, formulation, AZT.

Auteur : Ana-Maria Cristina BOLOLOI

ouveaux amphiphiles catanioniques analogues du galactosylcéramide : corrélation

structure, propriétés physico-chimiques et activité anti-VIH

Directeur de thèse : Isabelle RICO-LATTES et Sorin Ioan ROSCA

Lieu et date de soutenance : Université Paul Sabatier, Toulouse le 19 mai 2008

Résumé

Les travaux présentés dans cette thèse portent sur la mise au point de systèmes

catanioniques analogues du GalCer (récepteur cellulaire alternatif du VIH) pour la thérapie

anti-VIH.

Dans une première partie, nous nous sommes concentrés sur la synthèse et l’étude de

nouveaux assemblages catanioniques dendritiques possédant une toxicité réduite et destinés à

être utilisés comme leurres multisites pour le VIH. Afin de prévenir l’éventuelle dissociation

de l’entité catanionique, responsable de la toxicité, nous avons renforcé les interactions

hydrophobes entre les éléments constitutifs par ajout de chaînes alkyles sur le dendrimère. Les

tests biologiques réalisés in vitro, l’étude des propriétés physico-chimiques ainsi que l’étude

des interactions et de l’incorporation de ces composés dendritiques catanioniques dans des

modèles membranaires nous ont permis d’établir une corrélation entre la structure,

l’hydrophobie, la conformation et l’activité biologique de ces produits.

Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à la mise au point de vecteurs

spécifiques pouvant délivrer des principes actifs anti-VIH. Dans ce but nous avons synthétisé

une nouvelle famille d’analogues catanioniques du GalCer - des dérivés bicaténaires mixtes

fluorés/ hydrogénés. Ces composés sont capables de s’auto-organiser spontanément dans l’eau

en formant des vésicules qui possèdent une grande stabilité dans le temps de par la présence

d’une partie fluorocarbonée très rigide et hydrophobe. Un candidat très prometteur pour le

transport de principes actifs anti-VIH a pu être identifié, pour sa bonne activité anti-VIH, sa

faible toxicité, la longue stabilité dans le temps des vésicules qu’il forme et sa forte synergie

avec un autre principe actif anti-VIH, l’AZT.

Mots clés : VIH, tensioactif catanionique, tensioactif hybride, analogues du

galactosylcéramide, dendrimères, vésicule, multivalence, vectorisation.

Discipline : Chimie macromoléculaire et supramoléculaire

Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique,

Université Paul Sabatier – Bât. 2R1, 118 route de &arbonne, 31062 Toulouse Cedex 04

ana-maria cristina bololoi a alogues du...

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