universitÉ du quÉbecdepot-e.uqtr.ca/id/eprint/1790/1/000122272.pdf · 2011. 12. 5. ·...
Post on 22-Jan-2021
0 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
UNIVERSITÉ DU QUÉBEC
MÉMOIRE DE RECHERCHE PRÉSENTÉ À
L'UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À TROIS~RIVIÈRES
COMME EXIGENCE PARTIELLE À LA
MAÎTRISE EN BIOPHYSIQUE ET BIOLOGIE CELLULAIRES
PAR
CAROLINE JOLIN
L'INTOXICATION CHRONIQUE À L'ACÉTAMINOPHÈNE INDUIT
L'EXPRESSION DES PROTÉL'NES DE STRESS ET LA RÉORGANISATION
DES PROTÉINES DE FILAMENTS INTERMÉDIAIRES DANS LES
HÉPATOCYTES CENTROLOBULAIRES DE SOURIS
AVRIL 2005
Université du Québec à Trois-Rivières
Service de la bibliothèque
Avertissement
L’auteur de ce mémoire ou de cette thèse a autorisé l’Université du Québec à Trois-Rivières à diffuser, à des fins non lucratives, une copie de son mémoire ou de sa thèse.
Cette diffusion n’entraîne pas une renonciation de la part de l’auteur à ses droits de propriété intellectuelle, incluant le droit d’auteur, sur ce mémoire ou cette thèse. Notamment, la reproduction ou la publication de la totalité ou d’une partie importante de ce mémoire ou de cette thèse requiert son autorisation.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
11
REMERCIEMENTS
tiens tout d'abord à remercier ma directrice de maîtrise, Mme Monique Cadrin, Ph.D.
pour m'avoir permis de travailler sur ce projet ainsi que pour m'avoir permis de
participer et de présenter des résultats au congrès de l'ASeB à Washington en décembre
1999. Ce furent des expériences inoubliables et très enrichissantes. J'aimerais aussi
remercier Mme Hélène Hovington B.Sc., l'assistante de recherche du laboratoire, qui
m'a initié à beaucoup des techniques acquises au cours de ces années. Je tiens
particulièrement à remercier mes collègues de laboratoire, Louis Villeneuve, Luc
English, Michel Fausther et les autres qui ont été de passage, pour leur amitié, leur aide
et les agréables moments passés ensemble.
Je m'en voudrais de passer sous silence l'importance de tous les moments partagés avec
mes amis et collègues, Amélie, Anne, Dominic, Fannie, Guillaume, Jean, Julien, Keith,
Marie-Guylaine, Mélanie, Mylène et tous les autres sans lesquels ces années auraient été
beaucoup moins amusantes et stimulantes.
l'aimerais également remercier ma famine, certains amis et collègues de travail,
particulièrement Vicky et Monique D., pour leurs nombreux encouragements et leur
soutien. Je sais que j'ai du être difficile à vivre par moment ...
Je souhaiterais particulièrement remercier Mylène C. Gagnon qui a pris le temps de lire
mon mémoire à plusieurs reprises, de corriger plusieurs passages et me faire part de ses
commentaires constructifs. Sans ton aide, ce mémoire n'aurait assurément jamais vu le
jour.
Enfin, il me serait impossible de tenniner sans remercier spécialement M. Pierre
Tancrède Ph.D. grâce à qui j'ai pu obtenir le délai me permettant de terminer ma
rédaction et M. Marc Beauregard Ph.D. qui m'a permis d'utiliser ses instanations pour
terminer l'écriture de ce mémoire.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Hi
CONTRIBUTION DES AUTEURS
Caroline JoHn et Monique Cadrin ont participé à la conception du projet d'étude et à la
rédaction de l'article scientifique présenté dans le présent mémoire. Caroline Jolin a
réalisé la totalité des expériences exposées dans le présent travail. Luc English, étudiant
au baccalauréat en Biologie médicale, a contribué à l'obtention de certains résultats dans
la première partie de ce travail. Pour faire suite à ce travail, une étudiante de notre
laboratoire, Anne-Marie Fortier, a récemment réalisé des expériences sur la
phosphorylation des kératines.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
IV
RÉSUMÉ
L'acétaminophène (ACT), un médicament analgésique et antipyrétique largement utilisé
à travers le monde, devient un agent hépatotoxique lorsque utilisé à forte dose. En effet,
l'expression de certaines protéines de stress au niveau du foie, soit celle d'Hsp25 et
d'Hsp70i, est associée à la toxicité induite par cet agent. Récemment, il a été démontré
que K8/K18 ont un rôle à jouer dans la protection des hépatocytes contre les stress
mécaniques et toxiques. Aussi, notre étude a montré que lors de l'administration
d'ACT, le niveau d'expression des kératines 8 et 18 (K8/K18) ainsi que l'organisation
du réseau de filaments intermédiaires (FIs) dans les hépatocytes sont affectés. Dans le
présent travail, nous avons voulu examiner la relation entre l'expression et la distribution
à travers le foie de ces quatre protéines (Hsp25, Hsp70i, K8 et K18) chez des souris
intoxiquées à l'ACT. Pour ce faire, des souris adultes ont été nourries avec une diète
contenant 1 % p/p d'ACT pour une période de 4 mois. Par immunobuvardage de type
Western nous avons étudié le niveau d'expression des Hsps et de K8/K18. Après
seulement un mois de traitement, il a été démontré que le niveau d'expression des Hsps
25 et 70i et de K8 et K18 était supérieur à celui des contrôles. La localisation des Hsps
et des FIs a, pour sa part, été étudiée par immunofluorescence. Après 1 à 3 mois de
traitement, les Hsps 25 et 70i étaient présentes principalement dans les hépatocytes de la
zone centrolobulaire. Dans plusieurs de ces mêmes hépatocytes une réorganisation du
réseau de FIs était observée. Après un traitement de 4 mois, les Hsps 25 et 70i étaient
principalement localisées au niveau de la membrane plasmique et du noyau des
hépatocytes étroitement associés aux veines centrolobulaires. Après cette période de
traitement, une colocalisation entre les Hsps et les FIs dans certaines cenules était aussi
visible. La modification de l'organisation des kératines dans les hépatocytes qui
expriment un haut niveau d'Hsps ainsi que la colocalisation de ces deux types de
protéines, est en accord avec l'hYl'othèse selon laquelle les FIs ont un rôle important à
jouer dans la protection des hépatocytes contre les agents toxiques.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
v
TABLE DES MATIÈRES
~ p •
RESUME 1IlI@@G"'GG0000>$Ge$000041111G1GG000I1l1oa~@œOeeIi&l04111'1Iô.$"e0e0.z.@&4I.Ge 012100GG6ee000G01I4I!illéGG0'H"eel8l<&G00/!1G00GG001i'i1"é$0000G!I!I0000$$$!So0000$000$G IV ,
TABLE DES MA TIERES eG0000$êeGf/01810&GGG000001H!IOSfl&<Il0001!1181&GOf/\!II000000&I?O(ilOe041G&OGGlI2I0&GG00&@GI2>000010G0011l101ll'lll00i1110@G011l100 V
LISTE DES SYMBOLES ET ABRÉVIATIONS ..................................................... lx
1.1 Le cytoquelette ................................................................................................ 2
1.1.1 Les filaments intermédiaires .................................................................. 3
1.1.1.1 Structure et assemblage des filaments intermédiaires ............. 5
1.2 Les kératines ................................................................................................... 8
1.2.1 Les kératines dans le foie ...................................................................... 8
1.3 Maladies associées aux filaments intermédiaires ........................................... 10
1.3.1 Maladies associées aux kératines .......................................................... Il
1.3.1.1 Les maladies de la peau ........................................................... Il
1.3.1.2 Les maladies du foie ................................................................ 14
1.4 Les protéines de stress .................................................................................... 15
1.4.1 La famille des Hsp70 ............................................................................. 17
1.4.2 La famille des petites Hsps .................................................................... 18
1.4.3 Les Hsps et la maladie ........................................................................... 19
1.5 Interactions entre les Hsps et les protéines de filaments intermédiaires ......... 21
1.6 L'acétaminophène ........................................................................................... 24
1.6.1 Structure et fonctions de l'acétaminophène .......................................... 24
1.6.2 Métabolisme .......................................................................................... 26
1.6.3 Intoxication des souris à l'acétaminophène ............. " ............................ 27
1. 7 Objectifs de ce projet de maîtrise .................................................................... 29
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
vi
CHAPITRE 2: ARTICLE SCIENTIFIQUE .......................................................... 30
2.1 Résumé de l'article ......................................................................................... 30
2.2 Article scientifique .......................................................................................... 31
Abstract ........................................................................................................... 32
Introduction ....... , .. , .......................................................................................... 33
Materials and methods .................................................................................... 36
Animals and treatment ........................................................................... 36
Gel electrophoresis and Western blotting .............................................. 36
Fluorescence microscopy ....................................................................... 37
Results ............................................................................................................. 38
Expression of Hsp25, Hsp70i, and K8 in ACT treated mice livers ....... 38
Localization of Hsp25, Hsp70i and K8118 during ACT intoxication .... 38
Discussion ....................................................................................................... 39
Acknowledgements ......................................................................................... 42
References ..................................................... ....... ........................................... 43
Figures legends ............................................................................................... 50
Figures ............................................................................................................ 51
3.1 Discussion ........................................................................................................ 54
3.1.1 Détection de K8, Hsp25 et Hsp70i par immunobuvardage de type
Western ............................................................................................... 54
3.1.2 Localisation de K8, d'Hsp25 et d'Hsp7Oi par immunohistochimie ... 55
3.2 Conclusion ....................................................................................................... 60
3.3 Perspectives de recherche ................................................................................ 60
3.3.1 Traitement à plus long terme .............................................................. 61
3.3.2 Phosphorylation .................................................................................. 62
3.3.3 Apoptose ............................................................................................. 65
3.3.4 Protéines associées aux kératines ....................................................... 65
3.3.5 Études sur un modèle humain ................................................. 66
p p
REFEREN CES 6G$II2>Ge0$G@@e0&e"</IIGGeliUS~@I1!lGHI1I0e0GO$IlI\IHII00ee&&GI!H!,00 &$G0001i'HilIOOfOGI011i0eOeIilG00IiHiœe4t01'<$>lHIli!2>0$&e00IllGl0e&GGilIl2>Gro$$GG0IiHl'$llIeeolli' 67
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
vii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau LI Les protéines des filaments intermédiaires .............................................. 4
Tableau 1.2 Distribution des kératines dans les tissus ................................................. 9
Tableau 1.3 Maladies associées à des mutations de gènes de kératines ...................... 12
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
LISTE DES FIGURES
Figure 1.1 Représentation schématique de la structure commune des protéines de filaments intermédiaires cytoplasmiques ................................................. 6
Figure 1.2 Modèle de l'assemblage des filaments intermédiaires ............................ 7
Figure 1.3 Filaments intermédiaires dans les hépatocytes d'un foie contrôle .......... 10
Figure 1.4 Foie de souris traitée à la griséofulvine et présentant des corps de Mallory ..................................................................................................... 14
Figure 1.5 Structure de l'acétaminophène ............. ....... ............................................. 25
Figure 1.6 Structure du N-acétyl-p-benzoquinone-imine ......................................... 26
Figure 1.7 Métabolisme de l'acétaminophène .......................................................... 27
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Abréviation
ACT
CMs
DDC
EBS
EH
EPPK
FITC
FIs
GF
GFAP
GSH
Hsc70
Hsps
Hsp70i
sHsps
K8
NAPQI
NFs
NF-L
NF-M
NF-H
Ser79
TRITC
LISTE DES SYMBOLES ET ABRÉVIATIONS
Terme
Acétaminophène
Corps de Mallory
3 ,5-diéthoxycarbonyl-l ,4-dihydrocollidine
Épidermolyse bulleuse simple
Hyperkératose épidermolytique
H yperkératose palmoplantaire épidermol ytique
Isothiocyanate de fluorescéine
Filaments intermédiaires
Griséofulvine
Protéine fibrillaire gliale acide
Glutathion
Hsp70 exprimée de façon constitutive
Protéines de choc thermique (heat shock proteins)
Hsp70 inductible
Petites Hsps
Kératine 8
n-acétyl-p-benzoquinone-imine
Neurofilaments
Neurofilaments de faible poids moléculaire
Neurofilaments de poids moléculaire moyen
Neurofilaments de poids moléculaire élevé
Sérine 79
Isothiocyanate de tétraméthyl rhodamine
IX
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
CHAPITRE 1
INTRODUCTION
Les protéines de filaments intermédiaires (FIs), dont font partie les kératines, sont
des protéines ubiquitaires des cellules des mammifères qui contribuent, entre autres, au
maintien de la structure cellulaire. Les protéines de stress (Hsps), sont des protéines
dont l'expression dans les cenules est constitutive, c'est-à-dire qu'elles sont exprimées
dans des conditions normales dans les cellules; cependant, suite à un stress, l'expression
de ces protéines est augmentée. Des modifications au niveau de l'expression de ces
deux types de protéines ont été associées à plusieurs maladies (ex: certaines maladies
de la peau, des maladies du système digestif, des maladies neurodégénératives, des
myopathies, etc.). Au niveau du foie, de tels changements surviennent lors du traitement
de souris avec la griséofulvine (OF), une substance hépatotoxique. La toxicité induite
par la OF provoque une augmentation de l'expression d'Hsp7Oi et des kératines 8 et 18
(K8/K18) ainsi qu'un changement dans l'organisation du réseau de FIs dans les
hépatocytes (Cadrin et al., 2000; Fausther et al., 2004).
L'acétaminophène (ACT), un médicament analgésique et antipyrétique largement
utilisé, est lui aussi un important agent hépatotoxique lorsqu'il est administré à forte
dose. Au cours de la dernière décennie, il a été démontré que la toxicité de l'ACT est
accompagnée par une augmentation des concentrations d'Hsps hépatiques (Salminen et
al., 1997a). Cependant, aucune étude n'avait été réalisée pour déterminer si une
intoxication avec l'ACT entraîne des modifications au niveau des FIs. Le présent travail
avait pour but de déterminer si une relation existait entre l'expression et la distribution
des Hsps (25 et 70i) et des FIs (K8/KI8), dans le foie des souris intoxiquées à l'ACT.
Ce mémoire de maîtrise est présenté sous la forme d'un article scientifique. Dans
l'introduction, qui servira de mise en contexte, une brève revue des notions concernant
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
2
le cytosquelette, les FIs, kératines et les maladies associées à ces protéines sera
effectuée. Les thèmes des Hsps et des maladies impliquant ces protéines y seront aussi
traités. Une attention particulière sera portée aux deux familles d'Hsps qui ont été au
cœur de notre étude, soit Hsp70 et les petites Hsps (sHsps). L'ACT, son métabolisme et
les travaux dans lesquels ce médicament a été utilisé comme agent hépatotoxique y
seront finalement décrits. Les hypothèses de recherche, le matériel et les méthodes ainsi
que les résultats de mes travaux seront exposés au chapitre 2 qui consiste en l'article
scientifique qui sera soumis pour publication dans la revue Hepatology. Ce chapitre sera
suivi d'une conclusion dans laquelle un bref retour sur les résultats, une discussion et les
perspectives d'avenir relatives à ce projet seront présentés.
1.1 LE CYTOSQUELETTE
Le cytosquelette, de toutes les cenules de mammifères, est composé de trois
principaux types de fibres, soit les microtubules, les microfilaments d'actine et les FIs
(Cadrin et al., 1993; Ku et al., 1999). U joue un rôle essentiel dans plusieurs processus
cellulaires comme l'organisation de la membrane plasmique, le maintien de la forme des
cellules, le positionnement des organites dans le cytoplasme des cellules, le transport
intracellulaire, le mouvement des chromosomes lors de la division cellulaire, le
mouvement des cenules, la protection contre certains stress environnementaux ou la
mobilité lors de la différenciation cellulaire et la réparation tissulaire (A vila, 1992;
Fuchs et Weber, 1994; Furukawa et Fechheimer, 1997; Ku et al., 1999; Valiron et al.,
2001).
Chacun des types de fibres du cytosquelette a un rôle particulier à jouer dans
cenule. Les microtubules, qui ont la forme de tubes cylindriques de 25 nm de diamètre
sont composés de protomères de tubuline a et~. Us sont impliqués entre autre, dans le
mouvement des chromosomes au cours de la mitose et de la méiose, dans le transport
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
3
intracellulaire et dans les mouvements cellulaires dépendant des cils et des flagelles.
Les micro filaments d' actine sont formés de protéines globulaires (actine G) qui
polymérisent pour former des filaments (actine F) de 5-8 nm de diamètre. lis sont
principalement impliqués dans la migration cellulaire (agissant comme des
pseudopodes), la contraction musculaire, l'organisation des membranes plasmiques et le
maintien de la forme cellulaire (CarHer, 1991; Ku et al., 1999). Les FIs sont constitués
quant à eux par une grande famille de protéines et forment un réseau de filaments de 10
nm de diamètre. lis sont nommés ainsi car leur taille est intermédiaire entre les deux
autres types de fibres du cytosquelette, soit les microtubules (25 nm) et les
microfilaments d'actine (5-8 nm) (Fuchs et Weber, 1994; Fuchs et Cleveland, 1998;
Herrmann et Aebi, 1998; Ku et al., 1999). Puisque certaines protéines de cette famille
sont à l'étude dans le présent travail, ce type de fibre est décrit plus en détail dans la
section suivante.
1.1.1 Les filaments intermédiaires
Chez l'humain, on reconnaît r existence de plus de 50 gènes codant pour
différentes protéines de FIs qui sont exprimés de façon spécifique dans les différents
types cellulaires de presque tous les tissus (Fuchs et Weber, 1994; Fuchs et Cleveland,
1998; Ku et al., 1999; Herrmann et Aebi, 2000; Yoon et al., 2001). Les FIs constituent
environ 1 % des protéines totales des cellules. Dans certains cas, comme dans les
kératinocytes et les neurones, les FIs comptent pour plus de 85% des protéines totales
(Fuchs et Cleveland, 1998).
Les protéines de sont classées en 6 groupes, soit les types I à VI, d'après
similarité de leur séquence en acides aminés (Tableau 1.1). Contrairement aux
microtubules et aux microfilaments qui sont présents dans toutes les cenules eucaryotes,
les FIs de type l à et de type VI se retrouvent dans le cytoplasme de presque toutes
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
4
les cellules des organismes supérieurs. Les FIs de type V se retrouvent pour leur au
niveau du noyau (Fuchs et Weber, 1994; Fuchs et Cleveland, 1998; Hemnann et Aebi,
1998; Ku et al., 1999; Herrmann et Aebi, 2000; Herrmann et al., 2000; Omary et al.,
2002).
Localisation
Cytoplasmique
Nucléaire
TABLEAU 1.1
Les protéines des filaments intermédiaires
Type
1
II
lU
IV
VI
V
Protéines
Kératines (K9-K23)
Kératines (KI-K8)
Vimentine
GFAP
Desmine
Périphérine
Neurofiflaments (L, M, H)
u-intemexine
Nestine
Lamines
Distribution
Épithélium
Épithélium
Mésenchyme
Cellules gliales! astrocytes
Cellules myogéniques
Neurones périphériques
Neurones
Neurones du SNC
Cenules souches
neuroépithéliales
Tous les types de cellules
(Modifié de Ku et al., 1996)
Les protéines de FIs de types 1 et n, soit les kératines acides et les kératines
neutres-basiques, sont présentes dans toutes les cellules épithéliales (MoU et al., 1982).
Les FIs de type nI comprennent la vimentine, la desrnine, la protéine fibrillaire gliale
acide (GFAP) et la périphérine. La vimentine est typique des cellules d'origine
mésenchymateuse comme les fibroblastes, les adipocytes et les cellules endothéliales
alors que la desmine est retrouvée dans les cellules musculaires. Pour ce qui est de la
GFAP et la périphérine, eUes sont retrouvées dans les cellules gliales et les neurones
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
5
périphériques (Fuchs et Weber, 1994; Ho et Liem, 1996; Fuchs et Cleveland, 1998)0 Les
Fis des cenules des systèmes nerveux central et périphérique sont constitués des Fis de
type IV, soit les 3 sortes de neurofilaments (NF-L, NF-M et NF-H) et l'ex-internexine
(Lee et Cleveland, 1996; AI-Chalabi et Miller, 2003)0 Les Fis de type V, soient les
lamines nucléaires (A, B, C), sont présents au niveau de la surface interne des noyaux
(Fuchs et Weber, 1994; Fuchs et Cleveland, 1998; Herrmann et Aebi, 2000; Herrmann et
al., 2000; Hutchison et al., 2001)0 fis soutiennent la membrane nucléaire et jouent un
rôle dans l'organisation de cette membrane et de la chromatine lors de la formation du
noyau après la mitose (Fuchs et Weber, 1994)0 Les lamines fournissent aussi un point
d'attachement pour les chromosomes et les pores nucléaires dans les cellules en
interphase (Herrmann et Aebi, 2000; Hutcruson et al., 2001)0 La classe de Fis de type
VI contient la nestine, une protéine de Fis retrouvée au niveau des cellules souches
neuroépithéliales (Herrmann et Aebi, 2000). En raison de la structure du gène, la nestine
peut aussi être classifiée avec les neurofilaments (Herrmann et Aebi, 2000).
1.1.1.1 Structure et assemblage des fIlaments intermédiaires
Les chaînes de toutes les protéines de Fis cytoplasmiques comportent un motif
commun: elles possèdent un domaine central en hélices ex composé d'environ 310
acides aminés, encadré par un domaine amino-terminal (Nt) et un domaine carboxy
terminal (Ct) non-hélicoïdaux de tailles extrêmement variables 0 Parmi les différentes
classes de FIs, le domaine hélicoïdal central est une région très conservée alors que les
domaines N et C terminaux sont très différents tant par leurs tailles que par leurs
séquences (Fuchs et Weber, 1994; Fuchs et Cleveland, 1998; Herrmann et Aebi, 1998,
2000). Le domaine central hautement conservé consiste en un assemblage de quatre
hélices ex: les segments lA (35 acides aminés), lB (lOI acides aminés), 2A (19 acides
aminés) et 2B (121 acides aminés)o Ces hélices sont séparées par trois connecteurs non
hélicoïdaux L2), de longueur variable (8-22 acides aminés) (Figure 1.1)
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
6
(Geisler et Weber, 1982; Fuchs et Weber, 1994; Fuchs et Cleveland, 1998; Herrmann et
Aebi, 1998; IGrfel et ,2003).
Domaine central
Tête
Distribution des mutations
(Modifiée de Coulombe et Omary, 2002)
FIGURE 1.1 Représentation schématique de la structure commune des protéines de filaments intermédiaires cytoplasmiques.
On remarque au centre le domaine central hélicoïdal encadré de chaque côté par un domaine aminoterminal (tête) et un domaine carboxy-terminal (queue) non-hélicoïdaux. Les deux extrémités du domaine central présentent des régions très conservées de 15-20 acides aminés. Plusieurs maladies sont causées par des mutations de ces filaments intermédiaires; les flèches illustrent les sites de mutations fréquents (proportionnel à la taille de la flèche).
Le mode d'assemblage des FIs est encore mal connu. L'hypothèse d'assemblage
la plus acceptée impliquerait la formation de dimères suite à l'assemblage de deux
monomères de FIs en une hélice parallèle (Herrmann et Aebi, 1998; Coulombe et
Omary, 2002; IGrfel et al., 2003). Ces dimères pourraient être homopolymériques,
comme c'est le cas pour desmine et la vimentine, ou hétéropolymériques, comme
c'est le cas pour les kératines (Herrmann et Aebi, 2000). Deux dimères s'accoleraient
ensuite latéralement, de façon antiparallèle pour former un tétramère stable (Herrmann
et Aebi, 1998, 2000; Coulombe et Omary, 2002; IGrfel et al., 2003). Les détails
moléculaires des étapes suivantes de la polymérisation des FIs sont moins bien compris
(IGrfel et al., 2003). L'agglomération de huit tétramères en un filament de 10 nm
d'épaisseur serait l'ultime étape (IGrfel et al., 2003). Bien que ce modèle d'assemblage
des FIs soit un modèle grandement répandu et étudié, jusqu'à maintenant personne n'est
arrivé à le confirmer hors de tout doute (Figure 1.2).
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
~H2 COOH '-,"}
t: '.,~~) .-NH2 eOOH
t'WO tetramers packed together
eight tetramers twisted into a ropeUke filament
(Modifiée de Alberts et al., 2002)
FIGURE 1.2: Modèle €le l'assemblage des filaments intermédiaires
7
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
8
1.2 LES KÉRATINES
Les kératines qui, rappelons-le, font partie des protéines de FIs, représentent une
grande famille de protéines constituée d'au moins 50 membres (Fuchs et Weber, 1994;
Cadrin et Martinoli, 1995; Omary et Ku, 1997; Fuchs et Cleveland, 1998; Ku et al.,
1999; Hemnann et Aebi, 2000; Coulombe et Omary, 2002; Yamada et al., 2002; Kirfel
et al., 2003). Elles sont divisées en deux groupes, soit les kératines acides ou de type I
(pKi variant de 4 à 6) et les kératines neutres-basiques ou de type TI (pKi variant de 6 à
8) (MoU et al., 1982; Omary et al., 1998; Hemnann et Aebi, 2000; Hemnann et al.,
2000; Coulombe et Omary, 2002). Les kératines de type I comprennent les kératines 9 à
23 (K9 à K23) alors que les kératines de type n comprennent les kératines 1 à 8 (KI à
K8) (Fuchs et Weber, 1994; Omary et Ku, 1997; Coulombe et Omary, 2002). Les
kératines de type I et de type n s'associent dans une proportion 1 : 1 pour former des
hétéropolymères obligatoires qui sont exprimés de façon spécifique dans les différents
tissus épithéliaux, suivant les différents stades de développement et de différenciation
cellulaire (Tableau 1.2) (Franke et al., 1982; Fuchs et al., 1987; Phillips J., 1988;
Steinert et Roop, 1988). La principale fonction reconnue pour le réseau de kératine est
la protection des cellules épithéliales contre les stress, qu'ils soient de nature mécanique
ou toxique (Fuchs et Coulombe, 1992; Fuchs et Weber, 1994; Omary et Ku, 1997; Fuchs
et Cleveland, 1998; Toivola et al., 2000; Yoon et al., 2001; Coulombe et Omary, 2002;
Kirfel et al., 2003).
1.2.1 Les kératines dans le foie
Les hépatocytes forment un épithélium simple caractérisé par la présence d'une
kératine de type I, la K18, et d'une kératine de type n, K8, qui s'associent pour former
les FIs (Omary et Ku, 1997; Magin et , 1998; Toivola et al., 1998; Ku et ,1999;
Toivola et al., 2000). Ces kératines forment un réseau cytoplasmique complexe qui
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
9
s'étend de la région péri nucléaire à membrane plasmique et qui est particulièrement
dense autour des canalicules biliaires (Figure 1.3) (Cadrin et Martinoli, 1995; Cadrin et
2000).
TABLEAU 1.2
Distribution des kératines dans les tissus
Distribution des kératines dans les épithéliums digestifs
Hépatocytes
Canaux biliaires
Pancréas (conduits)
Pancréas (acini)
Intestin grêle
Côlon
Œsophage
Estomac
Vésicule biliaire
Distribution des kératines dans d'autres épithéliums
Kératinocytes/couche basale
Kératinocytes/couche suprabasale
Épithélium cicatriciel (hyperprolifératif)
Épithélium de la cornée
* kératines retrouvées en quantité minime
KS/18
K8/l9, K7/18*
K8/19, K7/18*
K8/18119
K8/20, K19, Kl8
K8120, K19, K20
K4/13, K6*
K8118, K19, K20, K7*
K8/IS, K7/19*
KS/14
K1/10
K6116117
K3112
(Modifié de Ku et al., 1999)
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
10
FIGURE 1.3: Filaments intermédiaires dans les hépatocytes d'un foie contrôle
Dans les hépatocytes, les filaments intennédiaires forment un réseau cytoplasmique qui est plus dense au niveau de la membrane plasmique et des canalicules biliaires (flèches). Mise en évidence des filaments intermédiaires par immunofluorescence.
(Archives personelles)
1.3 MALADIES ASSOCIÉES AUX FILAMENTS INTERMÉDIAIRES
Un nombre important de pathologies humaines est associé à des modifications des
protéines de FIs. Par exemple, plusieurs maladies neurodégénératives comme la
sclérose latérale amyotrophique pourraient être la conséquence de défauts d'assemblage
des neurofilaments (NF-H); la formation de cataractes congénitales serait associée à des
problèmes reliés à l'expression des protéines de FIs au niveau du cristallin et des
myopathies seraient causées par des mutations de la desmine (Capetanaki et al., 1989;
Dunia et al., 1990; Carter et al., 1995; Vicart et al., 1998; Quinlan et Van Den Ijssel,
1999). De récentes études ont aussi démontrées que des mutations des lamines
nucléaires A et C seraient responsables de la dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss,
syndrome d'Hutchisson-Gilford, du syndrome de "Verner ou encore du désordre de
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
11
Charcot-Marie-Tooth (Bonne et , 1999; De Sandre-Giovannoli et al., 2002; Chen et
al., 2003; De Sandre-Giovannoli et al., 2003). Finalement, des mutations des kératines
sont reconnues comme étant la cause de plusieurs maladies (Fuchs et Coulombe, 1992;
Fuchs et Weber, 1994; Omary et Ku, 1997; Ku et al., 1999; Coulombe et Omary, 2002).
La suite de cette section traitera des maladies associées aux kératines.
1.3.1 Maladies associées aux kératines
Plusieurs maladies humaines sont causées par des mutations des kératines.
Jusqu'à présent, les mutations d'au moins 18 kératines différentes ont été associées à
diverses maladies (Tableau 1.3) (Ku et al., 1996; Omary et Ku, 1997; Fuchs et
Cleveland, 1998; Ku et al., 1999; Omary et al., 2002). Les défauts des kératines causant
les maladies de la peau et du foie seront décrits plus en détails dans les paragraphes qui
suivent.
1.3.1.1 Les maladies de la peau
Le rôle des kératines dans le développement des maladies a été mis en évidence
pour la première fois par des travaux sur des souris transgéniques exprimant un gène
muté de la K14. Ces souris présentaient des symptômes similaires à ceux observés dans
le cas d'une maladie de la peau retrouvée chez l'humain: l'épidermolyse bulleuse
simple (EBS) (Vassar et al., 1991). Les mutations associées à cette maladie ont par la
suite été retrouvées chez certains patients souffrant d'EBS (Coulombe et al., 1991).
Dans cette maladie génétique autosomique dominante assez rare (environ 1/50000
personne), des mutations sur le gène de la K14 situé sur le chromosome et/ou de la
K5 situé sur le chromosome 12, causent la formation d'agrégats de kératine
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
TABLEAU 1.3
Maladies associées à des mutations de gènes de kératines
Gène de kératine Maladie Distribution
K5, K14
KW
K2e
K9
K16, KI
K6a, K6b,
K16, Kl7
K17
K4, K13
K3, Kl2
K8, K18
Épidermolyse bulleuse simple (EBS) Épiderme (couche basale)
Hyperkératose épidermolytique (EH) Épiderme (couche suprabasale
profonde)
Ichtyose bulleuse de Siemens Épiderme (couche suprabasale
superficielle)
Hyperkératose palmoplantaire Épiderme de la paume des mains
épidermolytique ou
kératoderme palmoplantaire,
variante épidermolytique (EPPK)
Hyperkératose palmoplantaire
non-épidermolytique ou
kératoderme palmoplantaire,
variante non-épidermolytique
Pachyonychia congénitale
Stéatocystome multiplex
Nrevus spongieux oral
Dystrophie cornéenne de Meesman
Prédisposition à développer des
maladies chroniques du foie
et de la plante des pieds uniquement
(couches suprabasales)
Épiderme de la paume des mains
et de la plante des pieds uniquement
(couches suprabasales)
Ongles et autres épithéliums
Stratifiés
Peau
Muqueuse buccale (œsophage,
et muqueuse anogénitale)
Cornée
Épithélium simple
(Tiré de Kirfel et al., 2003)
dans la couche basale des kératinocytes (Coulombe et al., 1991; Fuchs et Coulombe,
1992; Fuchs et al., 1994; Fuchs et Cleveland, 1998). Le phénotype de cette maladie se
traduit par la formation de bulles séreuses lorsque survient un stress mécanique et par
une séparation des couches de peau. Dans les cas sévères d'EBS, les manifestations
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
13
cliniques peuvent aussi se produire au niveau des ongles, de la muqueuse orale, de
cornée et de l' œsophage car ces tissus expriment aussi les K 14 et K5 (Fuchs et
Coulombe, 1992; Fuchs et Weber, 1994; Cadrin et Martinoli, 1995; Fuchs et Cleveland,
1998; Kirfel et al., 2003).
L'hyperkératose épidermolytique (EH) et l'hyperkératose palmoplantaire
épidermolytique (EPPK) sont aussi des maladies autosomiques dominantes de la peau.
Elles sont causées par des mutations ponctuelles au ni veau de certaines kératines
empêchant ainsi la formation d'un réseau fonctionnel de FIs dans les cellules
épithéliales. L'EH se caractérise par l'amincissement des couches cornée et granulaire
de la peau, par la présence d'agrégats de FIs dans la couche suprabasale profonde alors
que la couche basale de l'épiderme est normale, et par la formation de bulles séreuses
sur la surface de l'épiderme. Le phénotype de l'EPPK ressemble beaucoup à celui de
l'EH et il se caractérise aussi par la formation de bulles séreuses mais seulement sous la
plante des pieds et la paume des mains (Fuchs et Coulombe, 1992; Fuchs et al., 1994;
Fuchs et Weber, 1994; Fuchs et Cleveland, 1998).
Les mutations observées pour ces deux maladies se situent sur les kératines KI
(chromosome 12) et KI0 (chromosome 17) pour l'EH et sur la K9 (chromosome 17)
pour l'EPPK (Fuchs et Coulombe, 1992; Fuchs et al., 1994; Fuchs et Weber, 1994). Des
expériences menées sur des souris transgéniques exprimant le gène d'une KlO modifiée
ont démontré que les caractéristiques morphologiques et biochimiques que présentaient
ces souris étaient similaires à celles observées chez l'humain (Fuchs et al., 1994; Fuchs
et Weber, 1994).
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
14
1.3.1.2 Les maladies du foie
Plusieurs pathologies du foie telles l'hépatite alcoolique, la cirrhose amérindienne
infantile, la maladie de Wilson, les hépatocarcinomes, l'obésité morbide et l'intoxication
aux drogues sont associées à une réorganisation des réseaux de FIs contenus dans les
hépatocytes ainsi qu'à la formation de corps de Mallory (CMs), des agrégats contenant
des FIs (Figure 1.4) (French S.W., 1987; Jensen et Gluud, 1994a). Selon certaines
études, la formation des CMs serait la conséquence de l'augmentation de la synthèse de
K8 et/ou de Kl8 et de la saturation de leur mécanisme de dégradation, ce qui entraînerait
leur accumulation dans les hépatocytes (Hutter et al., 1993; Kachl et al., 1993; Cadrin et
al., 1995).
FIGURE 1.4: Foie de souris traitée à la grisoofulvine et présentant des corps de Mallory
Le traitement de souris avec la griséofulvine entraine la formation de corps de Mallory dans les hépatocytes. Les corps de Mallory sont identifiés par les flèches. Mise en évidence des filaments intermédiaires par immunofluorescence.
(Archives du laboratoire)
Chez la souris, la formation de CMs peut être induite expérimentalement par une
intoxication chronique avec des agents hépatotoxiques. Le 3,5-diéthoxycarbonyl-l,4-
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
dihydrocollidine (DDC) et griséofulvine (GF) ont déjà été utilisés à cet effet (Denk et
, 1975; Yokoo et 1982). Les CMs obtenus dans ces deux cas sont
biochimiquement et morphologiquement identiques à ceux retrouvés chez l'humain lors
des pathologies du foie mentionnées précédemment (Franke et al., 1979; Cadrin et al.,
1990). L'intoxication des souris peut ainsi servir de modèle de travail pour l'étude des
phénomènes cellulaires et moléculaires associés à la formation des CMs dans les
hépatocytes.
1.4 LES PROTÉINES DE STRESS
Les protéines de stress (Hsps pour « Heat Shock Proteins » ou protéines de choc
thermique) représentent un groupe de protéines ubiquitaires très conservées à travers les
espèces (Lindquist et Craig, 1988; Schlesinger, 1990; Feder et Hofmann, 1999; Whitley
et al., 1999). Elles ont été découvertes au début des années 60 dans des cellules de
Drosophile exposées à un choc thermique (Ritossa, 1962; Tissieres et al., 1974). Ces
protéines sont retrouvées dans presque tous les types de cenules, incluant les procaryotes
et les eucaryotes (levures, plantes, mammifères) et dans tous les compartiments
cellulaires (Lindquist et Craig, 1988; Schlesinger, 1990; ParseH et Lindquist, 1993;
Morimoto et al., 1997).
Les Hsps sont divisées en plusieurs grandes familles selon leur poids moléculaire
respectif, leur compartiment cellulaire, leur structure et leur fonction. On retrouve 6
principales familles d'Hsps, soit les Hspl00, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 et les petites
Hsps (sHsps), incluant dans ce sous-groupe les protéines a-cristallines et les Hsps de 12
à 30 kDa, plus particulièrement Hsp25 (Lindquist et Craig, 1988; Schlesinger, 1990;
Parsell et Lindquist, 1993; Liang et MacRae, 1997; Morimoto et al., 1997; Agashe et
Harti, 2000). Dans chacune de ces familles d'Hsps, des formes constitutives et des
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
formes induites par le stress sont retrouvées (ParseU et Lindquist, 1993; Whitley et
1999).
16
Les Hsps fonctionnent comme des chaperons moléculaires, c'est-à-dire qu'elles
veillent sur les protéines en se liant à elles (Pelham, 1986; Ellis, 1987). Dans les cellules
normales, les Hsps assurent plusieurs fonctions. En s'associant aux protéines en cours
de synthèse et aux protéines natives, elles les protègent de l'environnement polaire du
milieu cellulaire et facilitent leur repliement. Elles font de même avec les protéines
dénaturées, les aidant à se replier en prévenant l'agrégation de leurs parties hydrophobes
(Parsell et Lindquist, 1993; Hard et Martin, 1995; Agashe et Hartl, 2000; Morange,
2000; Slavotinek et Biesecker, 2001; Walter et Buchner, 2002). Les Hsps coordonnent
également l'assemblage et le transport des protéines vers les différents compartiments
cellulaires, elles contrôlent le passage des protéines d'une conformation active à inactive
et vice-versa et enfin, elles ciblent certaines protéines endommagées et préviennent les
interactions incorrectes qui pourraient se produire parmi ces protéines non natives
(Lindquist et Craig, 1988; Parsell et Lindquist, 1993; Hartl, 1996; Liang et MacRae,
1997; Feder et Hofmann, 1999; Jaattela, 1999; Whidey et al., 1999; Agashe et Hard,
2000; Slavotinek et Biesecker, 2001).
En réponse à un stress environnemental ou physiologique (ex: choc thermique,
infection virale ou bactérienne, ischémie, anoxie, substances toxiques, stress chirurgical,
inflammation, fièvre, cancer, rayons UV, etc.), les formes induites de certaines Hsps
sont surexprimées dans les cellules (Morimoto et al., 1997; Salminen et al., 1997;
Whitley et al., 1999). Le rôle majeur de ces protéines suite à un stress est de catalyser le
repliement des protéines dénaturées. Elles ciblent aussi les protéines trop endommagées
par le stress et les empêchent de se replier afin qu'elles puissent être dégradées (Pelham,
1986; ParseH et Lindquist, 1993; Hayes et Dice, 1996; Whitley et al., 1999; Slavotinek
et Biesecker, 2001; NoUen et Morimoto, 2002). Tous les stress connus, s'ils sont
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
suffisamment intenses, induisent la production d'Hsps (Feder et Hofmann. 1999; Sharp
et al., 1999), d'où leur nom de protéines de stress.
TI a été démontré que le niveau d'expression des Hsps 70 et des petites Hsps dans
les hépatocytes est augmenté chez la souris intoxiquée à l'ACT (Salminen et al., 1997a,
1998; Sumioka et al., 2004). Pour cette raison, ces deux familles de Hsps font l'objet de
la présente étude et seront donc traitées plus en détails dans le reste de cette section.
1.4.1 La famiUe des Hsp70
La famille des Hsp70 est sans doute la famille d'Hsps la mieux conservée au cours
de l'évolution et la plus étudiée (Jaattela, 1999; Whitley et al., 1999). Les protéines de
ce groupe présentent environ 50% d'homologie entre elles et peuvent se retrouver dans
les divers compartiments cellulaires (Parsell et Lindquist, 1993; Agashe et Hartl, 2000).
Certaines des protéines de cette famine sont exprimées dans des conditions normales
dans les cellules, Hsp70 constitutive ou Hsc70, alors que d'autres sont strictement
exprimées lors d'un stress, Hsp70 induite ou Hsp70i (Pars eU et Lindquist, 1993; Liang et
MacRae, 1997; Whitley et al., 1999). Hsp70i, aussi connu sous le nom d'Hsp72, est la
principale Hsp induite (Sharp et al., 1999).
Dans les cellules, Hsp70 se lie aux protéines en cours d'élongation, aux protéines
nouvellement synthétisées, aux protéines qui ont été dirigées vers le mauvais
compartiment cellulaire, à certaines protéines mutées, à certaines sous-unités protéiques
exprimées en l'absence de leur partenaire, à des protéines dénaturées ainsi qu'aux petits
peptides (Parsell et Lindquist, 1993; Martin et Hartl, 1997). Hsp70 est aussi impliquée
dans plusieurs activités cellulaires telles que la translocation membranaire, la
réorganisation des composantes du cytosquelette, le transport des protéines nucléaires,
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
18
l'assemblage des ribosomes et la synthèse de l'ADN (ParseU et Lindquist, 1993;
Salminen et , 1996; Tosi et al., 1997; Jaattela, 1999; Nollen et Morimoto, 2002;
Walter et Buchner, 2002). Lorsque les protéines dénaturées sont altérées de manière
irréversible, Hsp70 a pour rôle de les diriger vers les systèmes de dégradation cellulaire
(Parsell et Lindquist, 1993; Slavotinek et Biesecker, 2001; Nollen et Morimoto, 2002).
1.4.2 La famille des petites Hsps
Les petites Hsps (sHsps) sont des protéines de moins de 30 kDa et de composition
en acides aminés très variable (Parsell et Lindquist, 1993; Pemg et al., 1999a). Cette
famine d'Hsps est la moins bien conservée à travers les espèces (Michaud et Tanguay,
2003). Au moins 10 sHsps sont connues chez l'humain (Kappe et al., 2001; Kappe et
al., 2003). Celles-ci sont généralement exprimées de façon constitutive et parfois même
à des niveaux assez élevés (Kato et al., 1991; Iwaki et al., 1994; Nichon et Quinlan,
1994; Wisruewski et Goldman, 1998). Parmi toutes les sHsps, seulement deux, soit
l'Hsp27 (Hsp25 chez la souris) et l'aB-cristalline, sont inductibles par le stress (Kato et
al., 2002; Mounier et Arrigo, 2002).
Contrairement aux protéines de la famille des Hsp70, les sHsps ne veillent pas au
repliement des protéines dénaturées; elles les protègent de l'agrégation en se liant à eUes
jusqu'à ce que les conditions soient favorables pour que d'autres chaperons puissent le
faire (Slavotinek et Biesecker, 2001; Giese et Vierling, 2004). Le niveau cellulaire des
sHsps augmente particulièrement lors de la méiose, lors de la croissance cellulaire, lors
de la différenciation et lors de la transcription (Pemg et al., 1999a; Quinlan et Van Den
Ijssel, 1999; van den Ijssel et al., 1999; Michaud et Tanguay, 2003). Les sHsps sont
également impliquées dans la protection du cytosquelette et la modulation des processus
apoptotiques (Lavoie et al., 1993; Bruey et 2000; Charette et al., 2000; Mounier et
Arrigo, 2002).
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
19
1.4.3 Les Hsps et maladie
Étant donné que l'expression des Hsps est induite lors de stress, il est facile
d'imaginer qu'elles ont un rôle important dans plusieurs processus pathologiques
(Slavotinek et Biesecker, 2001). Habituellement, les taux d'Hsps s'élèvent en réponse à
une accumulation de protéines de structure anormale ayant tendance à s'agréger,
lesquelles sont souvent la cause ou la conséquence de maladies (Morange, 2000). Des
niveaux élevés d'Hsps ont effectivement été trouvés dans un grand nombre de
pathologies dont l'athérosclérose, les maladies neurodégénératives, dont celles causées
par des répétitions de polyglutamine, certaines maladies cardiaques et les cancers
(Morimoto et al., 1997; Whitley et al., 1999).
La pathogenèse des maladies neurodégénératives (telles la maladie d'Alzheimer, la
maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie d'Alexander, les
maladies à prions et les maladies caractérisées par des répétitions de polyglutamine dans
certaines protéines, par exemple la maladie d'Huntington et l'ataxie spinocérébeUeuse)
résulterait d'un mauvais repliement de certaines protéines, ce qui causerait un
réarrangement conformationnel et leur agrégation. L'agrégation des protéines serait
suivie par leur dépôt dans les tissus et par une dégénérescence cellulaire (Kakizuka,
1998; Chan et al., 2000; Kazemi-Esfrujani et Benzer, 2000). L'expression des Hsps au
cours de ces pathologies permettrait de minimiser la formation d'agrégats et de stabiliser
les protéines dénaturées, ce qui réduirait la toxicité cellulaire reliée à leur précipitation
(Cummings et al., 1998).
Dans le processus cancéreux, le rôle des Hsps s'explique par le fait qu'elles
assurent un grand nombre de fonctions dans le développement cellulaire (Jaattela, 1999;
Kawanishi et , 1999). Si on les compare avec des cellules normales, les cenules qui
ont perdu leur habilité à réguler la croissance cellulaire, comme les cellules tumorales,
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
20
expriment souvent de hauts niveaux d'Hsps (Jaattela, 1999). Parmi les 6 familles
d'Hsps, il a été démontré qu'Hsp27 et Hsp70, exprimées préférentiellement et
abondamment dans les tumeurs malignes, sont très étroitement associées à ce processus
cancéreux (Jaattela, 1999; Kawanishi et al., 1999). Malgré le faÏt que l'on puisse croire
que les Hsps auraient dans ce cas-ci une fonction protectrice en inhibant la propagation
du cancer, c'est l'inverse qui semble se produire. effet, certaines études suggèrent
qu'Hsp70 et qu'Hsp27 augmentent le potentiel de tumorigénèse des cellules de rongeurs
syngéniques, et ce, probablement à cause de leur capacité d'inhiber les processus de
mort cellulaire en limitant l'accumulation de protéines anormales dans les cenules
(Jaattela, 1995; Garrido et al., 1998; Jaattela, 1999). Les cellules tumorales n'étant pas
détruites, la tumeur continue à se développer.
Les Hsps sont aussi impliquées dans le développement de maladies auto-immunes
(Winfield, 1989). Effectivement, des anticorps contre les Hsps ont été détectés chez des
patients souffrant de maladies auto-immunes comme l'arthrite rhumatoïde et le lupus
érythémateux (Minota et al., 1988a; Minota et al., 1988b; Tsoulfa et al., 198913.; Tsoulfa
et al., 1989b). Dans les deux cas, une réponse immunitaire serait engagée par un
mimétisme moléculaire entre les Hsps microbiennes, plus spécifiquement entre une
Hsp65 présente chez l'espèce Mycobacterium, et celles des patients; les Hsps humaines
étant considérées par les cenules T comme des antigènes (Bahr et al., 1988a; Bahr et al.,
1988b; Minota et al., 198813.; Minota et al., 1988b; Tsoulfa et al., 198913.; Tsoulfa et al.,
1989b).
Dans d'autres cas, par contre, il semblerait que des défauts au niveau même des
Hsps soient la cause, ou une des causes, de la pathologie. En effet, certaines maladies
comme la cataracte congénitale, la myopathie dite à surcharge en desmine et la maladie
de Charcot-Marie-Tooth, semblent directement ou en partie causées par des mutations
sur les Hsps (Litt et al., 1998; Vicart et al., 1998; Evgrafov et al., 2004). Une mutation
sur l'aA-cristaHine ou l'aB-cristalline, deux sHsps, serait associée à cataracte chez
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
21
l'humain (Carter et al., 1995; et al., 1998); une 'UY,UUJLVU sur l'aB-cristalline serait la
cause de certaines myopathies, comme celle avec surcharge en desmine (Vicart et al.,
1998); finalement, une mutation sur le gène d'Hsp27 causerait la maladie de Charcot
Marie-Tooth, une maladie neurologique évolutive des nerfs périphériques (Evgrafov et
2004). Dans les deux derniers cas, des mutations sur des protéines de FIs sont
impliquées, parallèlement avec celles des Hsps, dans la maladie (Carter et 1995;
Vic art et al., 1998; Quinlan et Van Den Ijssel, 1999; De Sandre-Giovannoli et al., 2002;
Evgrafov et al., 2004). Ces mutations, des Hsps ainsi que des protéines de FIs, font que
l'intégrité du réseau de FIs n'est pas maintenue dans les cellules, ce qui cause la
formation d'agrégats qui eux, conduisent éventuellement à la mort cellulaire (Quinlan et
Van Den Ijssel, 1999).
Les connaissances actuelles nous permettent difficilement de déterminer hors de
tout doute, si l'activité des Hsps dans les cellules au cours du processus pathologique est
la cause ou la conséquence des maladies. Néanmoins, il est clair que ces protéines sont
très importantes pour le maintien de l'intégrité cellulaire (Liang et MacRae, 1997).
Puisqu'il s'avère que les Hsps sont exprimées de façon plus importante lors d'un stress
et qu'il est reconnu que la conformation des réseaux protéiques de FIs, une des trois
composantes du cytosquelette, subit des remaniements dans les cellules lors de
conditions pathologiques, il pourrait être intéressant d'établir une relation entre
l'expression et la distribution de ces protéines lors d'une affection donnée. Dans la
section qui suit, les interactions connues entre l'expression des Hsps et celle des FIs lors
de diverses maladies seront exposées.
1.5 INTERACTIONS ENTRE LES HSPS ET LES PROTÉINES DE FILAMENTS INTERMÉDIAIRES
Les Hsps de plusieurs famines semblent pouvoir interagir avec les différentes
protéines composant le cytosquelette (Leicht et al., 1986; Fostinis et al., 1992; NichoU et
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
22
Quinlan, 1994; Czar et 1996). Par exemple, des études démontrent qu'Hsp90 et
qu'Hsp100 s'associent avec les microfi1aments d'actine (Koyasu et , 1986); qu'Hsp70
se lie et stabilise les microfilaments d'actine et qu'eUe semble avoir une affinité
particulière pour les microtubules (Weller, 1988; Macejak et Luftig, 1991); et que les
membres de la famille des sHsps exercent probablement une plus grande influence sur
les microfilaments d'actine que les autres chaperons moléculaires (Liao et al., 1995a).
Comme ce travail de recherche se concentre sur les kératines, des protéines de FIs, le
reste de cette section sera consacrée à leurs interactions possibles avec les Hsps.
L'uA-cristalline et l'aB-cristalline sont des protéines abondamment exprimées
dans le cristallin. Contrairement à l'aA-cristalline, raB-cristalline est aussi exprimée
dans plusieurs autres tissus, particulièrement dans les muscles squelettiques (Litt et al.,
1998). Dans la protéine M-cristalline, la substitution d'une arginine par une cystéine à
la position 116 est la cause d'une cataracte congénitale. La substitution d'une arginine
par une glycine à la position 120 de la protéine aB-cristalline peut aussi causer une
cataracte; cependant, cette mutation est principalement la cause d'une myopathie avec
surcharge en desmine (Vicart et al., 1998; van den Ijssel et al., 1999). Toutefois, comme
mentionné dans la section 1.3, ces deux maladies peuvent aussi être causées par des
défauts des protéines de FIs. Les cataractes congénitales sont associées à des problèmes
d'expression ou des mutations de la vimentine, de la filensine ou de la protéine CP49,
des protéines apparentées aux protéines de FIs (Capetanaki et al., 1989; Dunia et al.,
1990; Alizadeh et al., 2004). Les myopathies avec surcharge en desmine pourraient
quant à elles être causées par la mutation de cette protéine (Vicart et al., 1998). Ces
HH'.«.<"",':,",,, se
ou (Goebel et Bornemann, 1993; Perng et al., 1999b). Des biopsies
musculaires de patients atteints de myopathies avec une surcharge en desmine révèlent
la présence d'aB-cristalline dans les agrégats de desmine (van den Ijssel et al., 1999).
Ces observations confirment des données antérieures montrant que les sHsps
interagissent avec les FIs, dans des conditions normales et dans des conditions
pathologiques (Goldfarb et al., 1998; Munoz-Marmol et al., 1998). Ces résultats
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
23
semblent identifier les FIs comme une cible physiologique pour l'activité des sHsps
(Sugiyama et al., 2000).
En plus des myopathies liées à une surcharge en desmine et des cataractes
congénitales, d'autres maladies telles que la maladie d'Alexander (Iwaki et al., 1989) et
les hépatites induites par des drogues (Lowe et al., 1992) sont caractérisées par la
présence d'agrégats de FIs. Ces agrégats sont typiquement co-associés avec l'aB
cristalline en dépit du fait qu'ils impliquent des protéines de FIs différentes, soit la
protéine fibrillaire GF AP et la vimentine pour la maladie d'Alexander et les kératines et
Hsp27 pour les maladies hépatiques (Pemg et al., 1999a; Quinlan et Van Den Ijssel,
1999). Ces études suggèrent donc que l'association de l'aB-cristalline avec les agrégats
de FIs est indépendante du type de protéines de FIs. Cette association pourrait, entre
autre, se produire en réponse à un réarrangement pathologique des FIs. Cependant, le
mécanisme de l'agrégation des FIs et le rôle des sHsps dans ce processus est encore à
élucider (Goldfarb et al., 1998; Munoz-Marmol et al., 1998).
Les études énumérées ci-haut tendent à prouver que les Hsps et les FIs sont des
protéines qui agissent en collaboration. Lors de ces érudes, il a été prouvé que dans des
conditions de stress pathologiques les Hsps colocalisaient avec les réseaux de FIs dans
les cellules. Dans le présent travail de recherche, la relation entre les Hsps et les FIs
dans le cadre d'un stress toxique, soit par l'administration chronique d'ACT à des souris,
sera érudiée. La dernière partie de cette introduction traitera donc de cette molécule, de
son métabolisme et des travaux dans lesquels ce médicament a été utilisé comme agent
hépatotoxique.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
24
1.6 L'ACÉTA1\UNOPHÈNE
Au cours des dernières années, notre laboratoire a acquis une expertise dans
l'étude des effets d'une intoxication chronique des hépatocytes de souris (Cadrin et al.,
2000; Fausther et 2004). Les récents travaux de recherche de Michel Fausther,
M.Sc. consistaient, entre autres, à étudier l'expression des Hsp70 parallèlement aux
changements d'organisation et d'expression des FIs dans le foie suite au traitement de
souris avec la GF (Fausther et al., 2004). Les résultats de ces travaux nous ont permis
de confinuer que la GF induit la production d'Hsp70 tout en provoquant la formation de
CMs. En plus de la GF, plusieurs autres agents hépatotoxiques, tels le bromobenzène, la
cocaïne et l'ACT, sont reconnus pour leur capacité à induire l'expression d'Hsps au
niveau du foie (Maruyama et Williams, 1988; Krahenbuhl, 1999; Draganov et al., 2000;
Farrell, 2002; Association des pharmaciens du Canada, 2003). Cependant, la relation
entre l'expression des Hsps et les changements au niveau des FIs lors de telles
intoxications n'a pas été établie. La démonstration des effets combinés d'une
intoxication à la GF sur les Hsps et les FIs nous a amenés à se demander si l'intoxication
par cet hépatotoxique était un cas isolé ou si des résultats comparables pouvaient être
obtenus lors d'autres types d'intoxications. Dans le présent travail, l'ACT a été utilisé
pour étudier l'éventuelle relation entre l'expression et la distribution des Hsps (25 et 70)
hépatiques et la conformation des FIs, soit les K8 et K18, chez les souris intoxiquées.
Dans les sections suivantes, les fonctions de cette substance hépatotoxique, son
métabolisme et une revue de son effet sur la souris seront exposés.
1.6.1 Structure et fonctions de l'acétaminophène
L'ACT est une molécule de poids moléculaire de 151,16 g/mole ayant la formule
suivante: CgH9N02 (figure 1.5). Aussi connu sous le nom de paracétamol,
4-hydroxyacétylanilide, N-acétyl-p-hydroxyacétylanilide et n-acétyl-p-arninophénol,
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
l'ACT est un médicament utilisé à travers monde comme analgésique et
antipyrétique pour le traitement de douleurs légères à modérées et de la fièvre (Lefebvre,
1999; Association des pharmaciens du Canada, 2003). Ce médicament, disponible sans
ordonnance depuis 1960, ne possède aucune propriété anti-inflammatoire contrairement
à l'acide acétylsalicylique (AspirineMD) ou à l'ibuprofène (AdvilMD
) (Davidson et
Eastham, 1966; PrescoU et al., 1971; Association des pharmaciens du Canada, 2003). À
des concentrations thérapeutiques, l'ACT est généralement dépourvu d'effets
secondaires; par contre, à forte dose, ce médicament est hépatotoxique (Lefebvre, 1999;
Farrell, 2002). L'ACT est un des médicaments les plus souvent associé à des
empoisonnements, accidentels ou volontaires, tant au Canada qu'aux États-Unis; les
conséquences d'une hépatotoxicité due à l'ACT peuvent même être fatales (Farrell, 2002;
Association des pharmaciens du Canada, 2003). Les doses thérapeutiques maximales
d'ACT sont de 4 gljour chez l'adulte et de 2,6 g/jour ou 65 mglkg chez l'enfant
(Krahenbuhl, 1999; Draganov et al., 2000; Farrell, 2002; Zhao et Slattery, 2002;
Association des pharmaciens du Canada, 2003). La dose toxique est de 150 mg . kg-1 •
24 heures-1 ou approximativement 7 g chez l'adulte; toutefois la quantité nécessaire pour
induire une toxicité chez les personnes alcooliques, souffrant de maladies hépatiques ou
sous-alimentées est moindre puisque l'induction de certaines enzymes provoquée lors de
ces conditions pathologiques nuit au métabolisme normal de l'ACT (Reicks et al., 1988;
Chen et al., 1990; Lores Amaiz et al., 1995; Bergman et al., 1996; Krahenbuhl, 1999;
Farrell, 2002; Association des pharmaciens du Canada, 2003; Morimitsu et al., 2004).
FIGURE 1.5: Structure de l'acétaminophène
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
26
1.6.2 Métabolisme
L'ACT est métabolisé à 95% par les enzymes hépatiques glucoronosyltransférase
et sulfotransférase en 2 métabolites inactifs: l'acétaminophène glucoronide et
1'acétaminophène sulfate. Le 5% restant est métabolisé grâce au cytochrome p450
dépendant du glutathion en N-acétyl-p-benzoquinone-imine ou NAPQI, un métabolite
extrêmement toxique (figure 1.6) (Association des pharmaciens du Canada, 2003).
FIGURE 1.6: Structure du N-acétyl-p-benzoquinone=imine
Normalement, lorsque l'ACT est administré à une dose thérapeutique, le
glutathion se conjugue rapidement au NAPQI et l'inactive (Figure 1.7) (Farrell, 2002).
Lorsque la dose recommandée est dépassée, la réserve cellulaire de glutathion s'épuise
rapidement et le NAPQI se fixe alors à d'autres protéines et à la bicouche de lipides des
hépatocytes (Bartolone et al., 1992; Pumford et al., 1992; Bulera et al., 1995; Halmes et
al., 1996; Pumford et al., 1997; Salminen et al., 1997a). Bien qu'il semble exister de
nombreuses cibles pour le NAPQI, la liaison de ce dernier avec des protéines
particulières semble jouer un rôle dans la mort cellulaire. Les« acetaminophen binding
liver proteins » de 44 kDa et de 58 kDa, la « selenium binding protein » de 56 kDa et la
glutamate deshydrogénase sont des exemples de protéines auxquelles le NAPQI
s'associerait de façon nuisible (Reicks et Hathcock, 1984; Krahenbuhl, 1999; Farrell,
2002; Sumioka et al., 2004). En effet, la fixation du NAPQI à ces protéines entraîne
leur dénaturation, ce qui conduit à une nécrose hépatique centro-lobulaire et finalement,
à une insuffisance hépatique (Salminen et al., 1997a, 1997b, 1998).
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
OH
o Il
HN=
27
(Tirée de Krahenbuhl,1999)
FIGURE 1.7: Métabolisme de l'acétaminophène
1.6.3 Intoxication des souris à l'acétaminophène
De récentes études ont montré que l'administration de substances hépatotoxiques
comme la cocaïne, le tétrachlorure de carbone, le bromobenzène, le cadmium et
l'halothane, entraîne une augmentation de l'expression des Hsps dans les hépatocytes de
souris (Salminen et al., 1997a, 1997b, 1998). Des études de Salminen et de ses
collaborateurs (Salminen et al., 1997a) ont établi que l'ACT entraîne lui aussi une
augmentation de l'expression hépatique de certaines Hsps (Hsp25 et 70i) sans toutefois
produire de changements détectables dans les concentrations hépatiques d' Hsp60,
d'Hsc70 et d'Hsp90. Ces résultats ont été obtenus par des immunobuvardage de type
Western effectués sur les protéines totales du foie de souris traitées avec une dose
unique de 200 mglkg (Lp.) d'ACT sur une période allant jusqu'à 24h; durée pour
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
28
laquelle l'accumulation des Hsps 25 et 701 était maximale. Des analyses par immuno
fluorescence ont confirmé ces données tout en mettant en évidence la distribution de ces
protéines dans le foie. À tous les temps de traitement, soit après 3h, 6h et 24h, une
accumulation d'Hsp701 est remarquée dans les hépatocytes de la région centrolobulaire
et des zones nécrosées. Un patron d'expression similaire est obtenu pour ce qui est
d'Hsp25 après 3h et 6h. Néanmoins, après 24h de traitement, une différence importante
est observable en ce qui concerne la distribution de ces deux Hsps. En effet,
l'accumulation d'Hsp25 est minimale au niveau des hépatocytes de la région
centrolobulaire et beaucoup plus forte dans les cenules en périphérie et environnant les
zones de nécrose, contrairement à ce qui est remarqué pour Hsp70i. En superposant les
résultats des études d'immunofluorescence ayant pour but de détecter les Hsps et de
détecter l'ACT et ses métabolites, les auteurs ont constaté qu'une accumulation des
métabolites de l'ACT coïncide avec l'augmentation de l'expression des Hsps 25 et 70i.
De plus, un gonflement de ces mêmes cellules a été observé sur les tissus analysés.
Récemment, une autre équipe de recherche a utilisé l'ACT lors d'une autre étude
d'hépatotoxicité (Sumioka et al., 2004). Dans cette nouvelle étude, la dose d'ACT a été
administrée par voie orale et était plus importante que dans l'étude présentée
précédemment, soit de 500 mglkg. De plus, la période d'observation du traitement a été
augmentée à 48h, comparativement à 24h pour la première étude. Les résultats de cette
nouvelle étude ont démontré que l'expression d'Hsp7Oi dans le foie commence à
augmenter 1 heure après l'administration de la substance hépatotoxique. Le niveau
d'expression de cette Hsp augmente de façon marquante jusqu'à 9h, puis se stabilise et
reste sensiblement le même après 24h et 48h. Contrairement aux résultats obtenus pour
Hsp70i, aucune augmentation significative d'Hsp25 dans les hépatocytes n'a été
observée dans les 9 premières heures suivant l'administration de l'ACT. Le niveau
d'expression d'Hsp25 était par contre très augmenté 24h et 48h après le traitement
(Sumioka et al., 2004).
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Les résultats de ces deux études suggèrent un rôle des Hsps 25 et 70i dans
protection des hépatocytes contre la toxicité de l'ACT. Puisque l'expression d'Hsp7Oi
est induite avant celle d'Hsp25, elle semble faire partie de la première ligne de défense
des hépatocytes lors de lésions induites par l'ACT. Dans les premières heures suivant le
traitement à l'ACT, Hsp70i en association avec Hsp25 pourrait servir de cible pour le
NAPQI l'empêchant ainsi de détruire d'autres protéines en s'y associant. Ces Hsps
auraient aussi pour fonction de réparer les protéines endommagées par le NAPQI dans
les zones de nécrose (Sumioka et al., 2004). Hsp25, qui semble exprimée plus
tardivement qu'Hsp70i, pourrait quant à elle agir comme dispositif de protection en
limitant la propagation de l'inflammation parmi les cenules atteintes; cela aurait pour
effet de réduire le taux de nécrose des cellules et permettrait incidemment la survie des
souris (Salminen et al., 1996, 1997a; Sumioka et al., 2004). Vraisemblablement,
l'induction des Hsps 25 et 70i représenterait un important mécanisme de défense
cellulaire au niveau du foie, procurant une cytoprotection contre certains agents
hépatotoxiques (Agashe et HartI, 2000; Morange, 2000; Slavotinek et Biesecker, 2001)
1.7 OBJECTIFS DE CE PROJET DE MAÎTRISE
Ainsi, ce projet de recherche se voulait une étude de l'effet hépatotoxique d'une
administration chronique d'ACT à des souris pendant quatre semaines. Ce médicament
a été utilisé afin de déterminer s'il existe une relation entre l'expression et la distribution
des Hsp25 et 70 et l'expression et la distribution des K8/K18 dans les hépatocytes de
souris soumises à cet agent hépatotoxique. Les résultats de cette étude sont présentés
sous la forme d'un article scientifique dans la section suivante.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
CHAPITRE 2
ARTICLE SCIENTIFIQUE
2.1 RÉSUMÉ DE L'ARTICLE
L'acétaminophène (ACT) est, à fortes doses, un agent hépatotoxique. La toxicité
de ce médicament est associée à l'expression de protéines de stress (Hsps), soit Hsp25 et
70i. Dans la présente étude, nous avons examiné la relation entre l'expression et la
distribution dans le foie des Hsps (25 et 70i) et des kératines (K8/l8), soit une classe de
filaments intermédiaires, chez des souris soumises à un traitement chronique à
l'acétaminophène. Des souris adultes ont été nourries avec une diète contrôle ou une
diète contenant 1 % p/p d'ACT pour une période de 4 mois. Les immunobuvardage de
type Western ont montré que les niveaux d'Hsps (25 et 70i) sont augmentés après
seulement 1 mois de traitement. Des sections de foie ont été traitées par
immunofluorescence pour la détection des Hsps (25 et 70i) et de la K8. Après 1 à 3
mois de traitement, nous pouvons observer qu'Hsp7Oi et Hsp25 sont distribuées
principalement dans les hépatocytes de la zone centrolobulaire. Une réorganisation des
kératines est observée dans plusieurs de ces cenules. Après 4 mois de ce traitement,
Hsps 25 et 70i sont localisées au niveau de la membrane plasmique et du noyau des
hépatocytes étroitement associés aux veines centrales. La réorganisation du réseau de
filaments intermédiaires affecte une large étendue de cenules. La modification du
réseau de kératine dans les hépatocytes exprimant de hauts niveaux d'Hsps suggère un
rôle pour ces kératines dans la protection des hépatocytes contre les agents toxiques.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
31
2.2 ARTICLE SCIENTIFIQUE
CHRome INTOXICATION OF MICE WITH ACETAi\1INOPHEN INDUCES HEAT SHOCK PROTEINS
EXPRESSION AND REORGANISATION OF KERATIN INTERMEDIATE FILAMENTS IN
CENTRILOBULAR HEPATOCYTES
JoHn Caroline, Fortier Anne-Marie, English Luc, Cadrin Monique
Département de Chimie-Biologie, Université du Québec à Trois-Rivières, 3351
Boulevard des Forges, c.p, 500, Trois-Rivières, Québec, Canada, G9A 5H7.
Corresponding author's name :
Monique Cadrin
Département de Chimie-Biologie, Université du Québec à Trois-Rivières, 3351
Boulevard des Forges, c.P. 500, Trois-Rivières, Québec, Canada, G9A 5H7.
Tel.: (819) 376-5011 poste 3891 Fax: (819) 376-5084
Email: Monique_Cadrin@uqtr.ca
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
32
ABSTRACT
Acetaminophen is, at high doses, a hepatotoxic agent. Acetaminophen toxicity is
associated with expression of heat shock proteins, Hsps 25 and 70i. In the present study
we examined the relationship between expression and liver distribution of Hsps (25 and
70i) and keratin (K8/K18) intermediate filaments in acetaminophen fed mice livers.
Adult mice were fed a control diet or a diet containing acetaminophen (l,0% W /W) for
up to 4 months. Western blotting showed that the levels of Hsps 70i and 25 were
increased after 1 month of treatment. Liver sections were stained for the detection of
Hsp70i, Hsp25 and keratin intermediate filaments, K8. After 1 to 3 months of treatment,
Hsps 70i and 25 were diffusely distributed in centrilobular hepatocytes. Reorganisation
of keratin intermediate filaments was observed in most of these hepatocytes. After 4
months of treatment, Hsps 25 and 70i were localised at the plasma membrane and in the
nuclei of hepatocytes closely associated with central veins. The reorganisation of keratin
intermediate filaments was observed in these hepatocytes and in sorne surrounding
hepatocytes. The modification of keratin cytoskeleton in hepatocytes expressing high
levels of Hsps suggests a role for keratin intermediate filaments in the protection of
hepatocytes against toxic agents.
Keywords : liver, hepatocytes, intermediate filaments, acetaminophen, Hsps (heat
shock proteins), Hsp25, Hsp70i, K8, K18, keratins.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
33
INTRODUCTION
Intermediate filaments (IFs) constitute a complex family of proteins present in
nearly aU animal cells. They are classified into six groups based on sequence similarities
(Fuchs and Weber, 1994; Herrmann and Aebi, 1998,2000; Yoon et al., 2001). Types
I-N and type VI are present in the cytoplasm as part of the cytoskeleton while type V
corresponds to nuclear lamins (type A, B or C), which are ubiquitous to all ceUs (Fuchs
and Weber, 1994; Fuchs and Cleveland, 1998; Herrmann and Aebi, 1998, 2000;
Herrmann et al., 2000).
Types 1 and II are, respectively, the acidic and neutral-basic keratins present in all
epithelial ceUs (Mon et al., 1982) and represent the largest and most complex group of
IF proteins (Fuchs and Weber, 1994; Coulombe and Omary, 2002; Kirfel et al., 2003).
They represent a large family of more than 50 proteins (Fuchs and Weber, 1994; Omary
and Ku, 1997; Fuchs and Cleveland, 1998; Ku et al., 1999; Coulombe and Omary, 2002;
Kirfel et al., 2003). Type 1 and type II keratins are obligate heteropolymers express
differentially in predictable pairs in differents epithelial tissues at various stages of
development and differenciation (Franke et al., 1982; Fuchs et al., 1987; Phillips J.,
1988; Steinert and Roop, 1988). AU epithelial ceUs express at least one type 1 and one
type II keratin (Omary et al., 2002). One weU established keratin function in the skin,
comea, and liver is to maintain cellular integrity upon mechanical and toxic stresses
(Fuchs and Coulombe, 1992; Omary and Ku, 1997; Fuchs and Cleveland, 1998; Toivola
et 2000; Yoon et ,2001; Coulombe and Omary, 2002; Kirfel et al., 2003).
The IF network of hepatocytes is composed of one keratin of type I, K18, and one
of type II, K8 (Omary and Ku, 1997; Magin et al., 1998; Toivola et al., 1998; Ku et al.,
1999; Toivola et , 2000). In hepatocytes, IFs form a complex cytoplasmic network
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
34
Is denser at the ceIl plasma membrane spedally around the bile canaliculi (Cadrin
and Martinoli, 1995; Chou and Goldman, 2000; Omary et al., 2002). Hepatocytes
K8/K18 filament network is believe to play a cytoprotective role, since in their absence
or disruption in mice, hepatocytes become markedly fragile and susceptible to stress or
toxin induced liver injury. For instance, hepatocytes from mice carrying these
modifications become more susceptible to exposure to griseofulvin, acetaminophen,
pentobarbital, microcystin or partial hepatectomy (Ku et al., 1995; Ku et al., 1996;
Omary and Ku, 1997; Toivola et al., 1998; Toivola et al., 2000). In human, K8 and K18
mutations predispose to the development of liver disease and likely account for some
cases of cryptogenic liver disease (Ku et al., 1997; Ku et al., 2001; Omary et al., 2002).
Acetaminophen (ACT), is an analgesic and antipyretic agent widely used for the
treatment of mild to moderate pain and fever when an anti-inflammatory effect is not
necessary (Davidson and Eastham, 1966; Prescott et al., 1971). At high doses ACT is
known to be a severe hepatotoxic agent. ACT ls largely metabolized (95%) by
conjugation with glucoronic add and sulfate, converted to acetaminophen sulfate and
acetaminophen glucoronide and excreted. The remaining 5% lS metabolized by
Cytochrome p-450-dependent glutathione (GSH) conjugation and leads to the formation
of a highly active metabolite, N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) that react with
GSH. When GSH is exhausted, NAPQI binds to cellular proteins which lead to cellular
death (Black, 1984; Maruyama and Williams, 1988; Reicks et al., 1988; Krahenbuhl,
1999).
mouse hepatocytes, ACT toxidty is associated with increased expression of the
stress indudble heat shock proteins (Hspi), Hsp25 and Hsp70i, in hepatocytes containing
the active ACT metabolite NAPQI (Salminen et al., 1997a, 1997b, 1998b; Sumioka et
, 2004). Hsps are ubiquitous proteins, highly conserved throughout evolution and are
present all type of cells (Lindquist and Craig, 1988; Schlesinger, 1990; Parsell and
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
35
Lindquist, 1993; Liang and MacRae, 1997; Morimoto et al., 1997). They can be divided
into 6 main famiHies, Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 and the small Hsps,
according to their molecular weights, structure and function (Lindquist and Craig, 1988;
Parsell and Lindquist, 1993; Whitley et al., 1999). Several famUies indude members
that are constitutively expressed as weIl as members whose synthe sis is induced by heat
stress and by a variety of others adverse stimuli (Salminen et al., 1997). For example,
Hsp90, Hsc70 and Hsp60 are expressed constitutively at appreciable levels in ceUs while
levels of Hsp70i are relatively low and Hsp25 is virtuaUy undetectable (Feder and
Hofmann, 1999). However, not aU Hsps are stress-inducible (Pelham, 1986; Ellis,
1987).
Hsps function as molecular chaperones (Parsell and Lindquist, 1993; Frydman and
Hohfeld, 1997; Liang and MacRae, 1997; Feder and Hofmann, 1999; Jaattela, 1999;
Kaufman, 1999; Whitley et al., 1999). A molecular chaperone is a protein that bind to
and stabilizes an otherwise unstable conformer of a protein and, by controlled binding
and release of the substrate protein, facilitates Ïts correct fate in vivo: folding,
oligomeric assembling, transporting to a particular subcellular compartment, controlling
switching between active/inactive conformations, incorrect aggregation of exposed
hydrophobic regions or facihtating the de gradation of irreversibly damaged proteins
(Ellis and HartI, 1999). The expression of the stress inducible forms of Hsps is enhanced
by the presence of non-native proteins causes by a variety of enviromental or metabolic
stresses that indude the following: heat shock, ischemia, anoxia, heavy metal ion,
ethanol, surgical stress, virallbacterial agents, UV light, toxic chemical, cocaine,
pharmacologically active molecules, aging, cancer etc. (Lowry et al., 1951; Sandermann
and Strominger, 1972).
Since keratins IFs have been proposed to play a role in protection hepatocytes
against toxic stress, the aim of the present study was to determine if a relationship exists
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
36
between expression liver distribution of the stress proteins Hsps70i and Hsp25
induced by the presence of NAPQI foHowing ACT intoxication and K8/K18
intermediate filaments expression and organisation in acetarninophen intoxicated mice.
MATERIALS AND METHODS
Animais and treatments
Adult male C3H mice (Charles River Canada, St-Constant, QC) were fed ad
libitum a serni-synthetic complete diet (Teklad test diet, Madison, WB containing 1 %
(w/w) ACT for periods ranging from 1 month to 4 months. Control rnice were fed the
same diet without ACT. Mice were separated in 5 groups; 6 rnice were in control group
and 20 other rnice were distributed equally in four group, for each treatrnent time. Mice
were sacrificed by cervical dislocation and livers were kept frozen at -SO°C in 2-
methylbutane until used. AU experimentations was performed 3 times.
Gel electrophoresis and Western blotting
Total liver proteins were prepared by homogenisation of 400 mg of control and
treated rnice liver in sarnple buffer (Tris-HCI 62.5 mM, pH 6.8 containing SDS 0.5%,
PMSF 0.4 mM, DTT 0.1 mM). Protein concentration was deterrnine by a modified
Lowry' s method for the presence of SDS (Lowry et al., 1951) and equal amounts of
proteins were loaded on each weIl (5jlg). Protein from each sarnple were separated on a
12.5% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylarnide gel electrophoresis)
according to Laemmli' s procedure (Laemmli, 1970). Gels were stained with 0.1 %
Coomasie Blue to ensure that equal arnounts of proteins were loaded, or transfered to
supported nitrocellulose membrane (Bio-Rad Laboratories Canada, Mississauga, ON)
(Towbin et al., 1979) stained with Ponceau S red to monitor the transfer, washed in
TTBS (TBS with 0.5% TWEEN 20®) and probed for 1 hour at 37°C with a rat IgG
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
37
monoclonal ami-mouse K8, TROMA l (KernIer et 1981; BoUer et ,1987) and a
rabbit polydonal anti-Hsp7Oi (Stressgen, Victoria, BC) or Hsp25 (Stressgen, Victoria,
BC). The membranes were then washed and incubated for 1 hour at room temperature
with the appropriate secondary antibody; a biotinylated goat anti-rabbit or a biotin
conjugated goat anti-rat (Jackson Immunoresearch, Bio/Can Scientific, Missisauga, ON).
When biotinylated secondary antibodies were used, membranes were washed with PBS
Tween 20 and incubated with streptavidin conjugated with horseradish peroxydase
(Jackson Immunoresearch, Bio/Can Scientific, Mississauga, ON) for 30 min and washed
with PBS-Tween 20. The chemiluminescent horseradish peroxydase substrate Luminol
(Amersham Pharmacia Biotech, OakviHe, ON) was added to the membranes according
to recommendations of the company, and membranes were exposed to Blue X-Omat X
ray film sheets (Mandel Scientific Company, Guelph, ON) to localize antibodies
binding.
Fluorescence microscopy
Double labelling for the detection of Hsps 25, 70i, and keratins, K8, was
performed as follows. Cryosections, 4 f.lm of fresh livers were fixed in 4%
paraformaldehyde in PBS (pH 7.2) for 10 minutes at room temperature and rinsed in
TBS (Tris-buffer saline, pH 7.4). For heat shock proteins staining, liver sections were
incubated in TBS containing SDS 1 %, to retrieve antigen sites, rinsed in TBS, incubated
with a rabbit polyclonal anti-Hsp7Oi or anti-Hsp25 (l : 100) (Stressgen, Victoria, BC)
for 1 hour at 37°C, rinsed in TBS and incubated for 1 hour at room temperature with the
secondary antibody donkey anti-rabbit conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC)
: 50) (Jackson Immunoresearch, Bio/Can Scientific, Missisauga, ON). For the
detection of K8, sections were incubated with a rat IgG monoclonal anti-mouse K8,
TROMA l (KernIer et al., 1981; BoUer et al., 1987), for 45 minutes at room temperature,
rinsed in PBS (sodium phosphate buffer, pH 7.2) and incubated with secondary antibody,
a goat anti-rat IgG conjugated to tetramethyl rhodamine isothyocyanate (TRITC) (1 : 50)
for 30 minutes at mom temperature (Jackson Immunoresearch, Bio/Can Scientific,
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
38
Missisauga, ON). The tissues were mounted in 0.1 % P-phenylene-diamine 50%
glycerolJPBS and observed under an Olympus® BX60 photomicroscope.
RESULTS
Expression of Hsp25, Hsp70i, and K8 in A CT treated mice Uvers
Modifications in the amount of Hsp70i, Hsp25 and K8 were analyzed by Western
Blotting of total proteins from control and ACT-treated C3H mice livers (1 to 4 months)
(Fig 1). Our results showed that ACT intoxication induces modifications in Hsp70i,
Hsp25 and keratin expression. Hsp70i, which is present in controllivers, was increased
at aU time points treatment (Fig. lA). The maximum increase for Hsp70i was observed
at 1 month treatment but its expression was higher that control value for the whole
treatment. Contrary to Hsp70i, Hsp25 was not observed in controlliver but was present
after ACT treatment (Fig lA). As for Hsp70i the maximum increase was observed at 1
month treatment but was detected during the whole treatment. An important increase in
K8 level also took place during ACT treatment (Fig. lB). The amount of K8 was
increased after 1 month of treatment and remained higher than control value for the
entire treatment. Fig. lC shows a representative gel of totalliver proteins separated on
12,5% SDS-PAGE and stained with Coomasie blue indicating that the same amount of
proteins was loaded on in each weU of the gel.
LocaUzation of Hsp25, Hsp70i and K8/18 during ACT intoxication
We analyzed by performing double immunofluorescence staining, the distribution
of Hsp70i, Hsp25 and keratin IFs on liver sections of control and ACT-treated C3H mice
livers. In control hepatocytes, IFs formed a complex cytoplasmic network that was
denser at the œIl membrane and particularly around the bile canaliculi (Fig. 2A). Our
biochemical analysis showed that Hsp70i was present in control hepatocytes. However,
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
39
by immunofluorescence we did not detect the presence of Hsp70i in cells (Fig. 2B).
After ACT treatment an increase in keratin IFs was observed hepatocytes located in
the proximity of the central vein in comparison with other hepatocytes. Interestingly
after l and 2 months of ACT treatment, Hsp70i (Fig 2 D, F) was present in hepatocytes
that show increased amount of keratin IFs. At 3 months and 4 months of treatment, the
zone containing dense cytoplasmic keratin IF network occupied a larger area than the
zone that contained Hsp70i. Hsp70i was present in hepatocytes in close proximity of the
central veln of hepatic lobules. At the cellular level, Hsp70is was distributed evenly in
the cytoplasm of hepatocytes from livers treated for 1 to 3 months. After 4 months of
treatment, the protein relocalized at the plasma membrane and a puntate cytoplasmic and
nuclear staining was observed. In some hepatocytes there was colocalization between
Hsp70i and keratin IFs.
In agreement with our biochemical analysis, Hsp25 was not present in control
hepatocytes (Fig 3B). Mer ACT treatment Hsp25 was increased in hepatocytes located
in proximity of central veins. As observed for Hsp70i, at one and two months
treatments, Hsp25 was present in hepatocytes that contained a dense keratin IF network.
Following longer treatment, Hsp25 was present in fewer hepatocytes in close proximity
with the central vein. At the cellular level, Hsp25 was localized at the plasma membrane
with a punctuate patern in the cytoplasm of hepatocytes. It is important to note that the
cytoplasmic staimng of Hsp25 colocalized with keratin IF network.
DISCUSSION
Acute intoxication with ACT is known to cause severe hepatotoxicity that leads to
liver failure. The aim of the present study was to determine the effect of chromc ACT
intoxication on the liver. We investigated Hsps expression and distribution in
hepatocytes and attended to determine if there was a link between Hsps and keratin
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
expression in hepatocytes exposed to the toxicant This study present from our
knowledge the first evidence that chronic intoxication with ACT induces an increased
expression in keratins and a modification in their organisation. The stress proteins
Hsp25 and 70i were increased during ACT treatment We noticed that Hsps70i was
present in a constitutive manner in hepatocytes since it 1S present in control hepatocytes.
Hsp25 was not detected control hepatocytes. Our results showed that ACT induced an
increase in K8 expression hepatocytes during the first month of treatment and that the
increase was maintained for the entire treatment. The stress proteins Hsp25 and 70i
were also increased during ACT treatment. Our results are consistent with the findings
of Salminen et al.; who showed that the level of Hsp70i 1S relatively low, and Hsp25 is
virtuaUy undetectable in the liver of naive mice (Salminen et al., 1997). After a rapid
increase in Hsps expression following the beginning of the treatment, there was a
constant reduction in the quantity of Hsps from the 2nd month until the end of the
treatment (4 months). However, the quantity remains higher than the control value.
Consistent with the Western blot analyses, immunofluorescence staining showed an
increase in Hsp25 and Hsp70i levels at 1, 2 and 3 months treatment. After 4 months of
treatment, there was a reduction of the quantity of Hsps and its location was different.
However, the amount remains higher than control value. The Hsps were detected in
hepatocytes located in dose vieinity of the central vein.
Chronic intoxication of mice with ACT induces modifications in keratin
expression and organisation in hepatocytes located in centrilobular zones. In fact, we
noticed that during the first three months of the intoxication, there seems to be an
accumulation of IFs in the hepatocytes located around the centrilobular veins ln
comparison with hepatocytes located in the middle or in proximity of the portal area. In
liver from control animals, IFs are distributed uniform1y in aU hepatocytes. We also
notice the centrilobular distribution of Hsp25 and Hsp70i during the first 3 months of the
treatment. Salminen et al. a1so noticed this distribution of the Hsps in the hepatocytes
during ACT treatments (Salminen et al., 1997a, 1997b, 1998b). In the 4 months
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
treatrnents, we can also find ihis centrilobular distribution. However, we ruso find Hsps
in the nucleus of cens, which are elsewhere than in the centrilobular zone.
Sorne hepatotoxic agent, like griseofulvine (GF), alcool, or okadaic acid, induce
the formation of IF aggregates in hepatocytes called Mallory Bodies (MBs) (Denk et al.,
1975; Ornary and Ku, 1997; Ku et al., 1999; Cadrin et al., 2000). Many studies
demonstrated that the MSs contain K8 and K18 as main constituents (Jensen and Gluud,
1994a; Cadrin and Martinoli, 1995). Formation of MSs would be a consequence of the
increase of the synthesis and the saturation of the mechanism of degradation of keratins
through the ubiquitin pathway, which would lead to the accumulation of K8 and K18 in
hepatocytes (Hutter et al., 1993; Kachi et al., 1993; Cadrin et al., 1995). Chronical
intoxication of mouse with a diet containing GF leads to the formation of MBs which are
biochemically and morphologically indentical to those developped in human liver
pathologies like alcoolic hepatitis, North American Indian childhood cirrhosis or
Wilson's disease (Franke et al., 1979; French S.W., 1987; Jensen and Gluud, 1994a;
Cadrin et al., 1995).
Overdose of ACT 1S known to cause severe hepatotoxicity that leads to liver
failure. A number of observations suggest that stress induction of Hsps expression is
mediated by the presence of non-native proteins (Salminen et al., 1997a; Salminen et al.,
1998a). It has been proposed that Hsps bind non-native proteins and help them to either
refold or enhance their degradation, thereby helping ceil survival (ParseU and Lindquist
1994). Hsp70i, after treatment with ACT, has been shown to be present in hepatocytes,
confined to the centrilobular region and containing the toxic metabolite of the drug
(Salminen et al., 1997a). Therefore Hsps rnost likely play a cytoprotective role in these
hepatocytes (Huot et al., 1991; Jaattela and Wissing, 1992; Salminen et al., 1997a). Our
results shown that many hepatocytes containing increased Hsp70i and Hsp25 contain a
denser IF network. Moreover, there is a colocalization between the IF network and the
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Hsps in the se hepatocytes. These results are aggrement with the findings of Perng et
al. showing eolocalization between Hsp27 or aB-crystallin, both member of the smaU
heat shock proteins family (sHsps), and GFAP (glial fribrillar acid protein) or vimentine
IFs in astroeytoma cells (Perng et al., 1999; Quinlan and Van Den Ijssel, 1999). These
results suggest that Hsps could proteet IF keratins during chrome stress and help the ceU
maintaining its integrity. The association between sHsps chaperones and IFs eould
proteet their structural integrity and prevent their aggregation in the form of MBs during
ACT treatment (Salminen et al., 1997; Salminen et al., 1997a, 1997b). Our work does
not totaUy exclude the possibility that longer treatment could lead to the appearance of
MBs.
In conclusion, ACT intoxication of mice lead to increased levels of Hsp25 and
Hsp70i in the hepatocytes. The increase in IFs in these hepatocytes supports a role for
keratin in the protection of hepatocytes against hepatotoxins. The colocalization Hsps
and IFs suggest that maintainance of an intact IF network is necessary to play there
protective roie.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors are most grateful to Dr N. Marceau from the Centre de recherche de
l'Hôtel-Dieu de Québec (CHUQ), Québec, for providing TROMA 1. This work was
supported by a grant from NSERC to MC.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
43
RÉFÉRENCES
Black, M. 1984. Acetaminophen hepatotoxicity. Annu Rev Med, 35: 577-93
BolIer, K., Kemler, R., Baribault, H. and Doetschman, T. 1987. Differential distribution of cytokeratins after microinjection of anti-cytokeratin monoclonal antibodies. Eut" J Cell Biol, 43: 459-68
Cadrin, M., Anderson, N. M., Aasheim, L. H., Kawahara, H., Franks, D. J. and French, S. W. 1995. Modifications in cytokeratin and actin in cultured liver cells derived from griseofulvin-fed mice. Lab mvest, 72: 453-60
Cadrin, M., Hovington, H., Marceau, N. and McFarlane-Anderson, N. 2000. Early perturbations in keratin and actin gene expression and fibrillar organisation in griseofulvin-fed mouse liver. J Hepatol, 33: 199-207
Cadrin, M. and Martinoli, M. G. 1995. Alterations of intermediate filaments in various histopathological conditions. Biochem CeU Biol, 73: 627-34
Chou, Y. H. and Goldman, R. D. 2000. mtermediate filaments on the move. J CeU Biol, 150: F101-6
Coulombe, P. A. and Omary, M. B. 2002. 'Hard' and 'soft' principles defining the structure, function and regulation of keratin intermediate filaments. CUIT Opin Cell Biol, 14: 110-22
Davidson, D. G. and Eastham, W. N. 1966. Acute liver necrosis following overdose of paracetamol. Br Med J, 5512: 497-9
Denk, Gschnait, F. and Wolff, 1975. Hepatocellar hyalin (Manory bodies) in long term griseofulvin-treated miœ: a new experimental model for the study of hyalin formation. Lab mvest, 32: 773-6
Ellis, J. 1987. Proteins as molecular chaperones. Nature, 328: 378-9
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
44
EUis, R. J< and Hartl, U. 1999. Prineiples of protein folding ln the cellular envirornnel1t. CUIT Opin Struct Biol, 9: 102-10
Feder, M. E. and Hofmanl1, G. E. 1999. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecologieal physiology. Annu Rev Phvsiol, 61: 243-82
Franke, W. W., Denk, Schmid, E., Osborn, M. and Weber, K. 1979. Ultrastructural, biochemical, and immunologie characterization of Manory bodies in livers of griseofulvin-treated mice. Fimbriated rods of filaments containing prekeratin-like polypeptides. Lab mvest, 40: 207-20
Franke, W. W., Schmid, E., Schiller, D. Lo, Winter, S., Jarasch, E. D., Moll, R., Denk, H., Jackson, B. W. and lllmensee, K. 1982. Differentiation-related patterns of expression of proteins of intermediate-size filaments in tissues and cultured cens. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 46 Pt 1: 431-53
French S.W., O. T., Swierenga S.H.H., Marceau N., 1987, The cytoskeleton of hepatocytes in health and disease, in Edited by Faber E, ed., Pathogenesis of liver disease: Baltimore, Williams & Wilkins., Phillips MJ., p. 95-112.
Frydman, J. and Hohfeld, J. 1997. Chaperones get in touch: the Hip-Hop connection. Trends Biochem Sei, 22: 87-92
Fuchs, E. and Cleveland, D. W. 1998. A structural scaffolding of intermediate filaments in health and disease. Science, 279: 514-9
Fuchs, E. and Coulombe, P. A. 1992. Of mice and men: genetic skin diseases of keratin. Cell, 69: 899-902
Fuchs, E., Tyner, A. Lo, Giudice, G. J., Marchuk, D., RayChaudhury, A. and Rosenberg, M. 1987. The human keratin genes and their differential expression. CUIT Top Dev Biol, 22: 5-34
Fuchs, E. and Weber, K. 1994. mtermediate filaments: structure, dynamics, ful1ction, and disease. Annu Rev Biochem, 63: 345-82
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Herrmann, H. and Aebi, 1998. Structure, assembly, and dynamics intermediate filaments. Subcell Biochem, 31: 319-62
Herrmann, H. and Aebi, U. 2000. mtermediate filaments and their associates: multitalented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. CUIT Opin CeU Biol, 12: 79-90
Herrmann, H., Strelkov, S. V., Feja, B., Rogers, K. R, Brettel, M., Lustig, A., Haner, M., Parry. D. A., Steinert, P. M., Burkhard, P. and Aebi, U. 2000. The intermediate filament protein consensus motif of helix 2B: its atomic structure and contribution to assembly. J Mol Biol, 298: 817-32
Huot, J., Roy, G., Lambert, H., Chretien, P. and Landry, J. 1991. mcreased survival after treatffients with anticancer agents of Chinese hamster cens expressing the human Mr 27,000 heat shock protein. Cancer Res, 51: 5245-52
Hutter, H., Zatloukal, K, Winter, G., Stumptner, C. and Denk, H. 1993. Disturbance of keratin homeostasis in griseofulvin-intoxicated mouse liver. Lab mvest, 69: 576-82
Jaattela, M. 1999. Heat shock proteins as cellular lifeguards. Ann Med, 31: 261-71
Jaattela, M. and Wissing, D. 1992. Emerging ro1e of heat shock proteins in biology and medicine. Ann Med, 24: 249-58
Jensen, K. and Gluud, C. 1994a. The MaUory body: morphological, clinical and experimental studies (Part 1 of a literature survey). Hepatology, 20: 1061-77
Kachi, K., Cadrin, M. and French, S. W. 1993. Synthesis of Mallory body, intermediate filament, and microfilament proteins in liver cell primary cultures. An electron microscopie autoradiography assay. Lab Invest, 68: 71-81
Kaufman, R J. 1999. Molecular chaperones and the heat shock response. Sponsored by Cold Spring Harbor Laboratory, 6-10 May 1998. Biochlm Biophys Acta, 1423: R13-27
Kemler, R, Brulet, P., Schnebelen, M. T., Gaillard, J. and Jacob, F. 1981. Reactivityof monoclonal antibodies against intermediate filament proteins during embryonic development. J Embryol Exp Morphol, 64: 45-60
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Kirfel, J., Magin, T. M. and Reichelt, J. 2003. Keratins: a structural scaffold emerging functions. CeU Mol Life Sei, 60: 56-71
Krahenbuhl, S. 1999. Acarbose and acetarninophen--a dangerous combination? Hepatology, 29: 285-7
Ku, N. O., Gish, R, Wright, T. L. and Omary, M. B. 2001. Keratin 8 mutations in patients with cryptogenic liver disease. N Engl J Med, 344: 1580-7
Ku, N. O., Michie, S., Oshima, R G. and Omary, M. B. 1995. Chromc hepatitis, hepatocyte fragility, and increased soluble phosphoglycokeratins in transgemc rnice expressing a keratin 18 conserved arginine mutant. J Cell Biol, 131: 1303-14
Ku, N. O., Michie, S. A., Soetikno, R M., Resurreccion, E. Z., Broome, R L., Oshima, R. G. and Omary, M. B. 1996. SusceptibiHty to hepatotoxicity in transgenic rnice that express a dominant-negative human keratin 18 mutant. J Clin mvest, 98: 1034-46
Ku, N. O., Wright, T. L., Terrault, N. A., Gish, R. and Omary, M. B. 1997. Mutation of human keratin 18 in association with cryptogemc cirrhosis. J Clin mvest, 99: 19-23
Ku, N. O., Zhou, X., Toivola, D. M. and Omary, M. B. 1999. The cytoskeleton of digestive epithelia in health and disease. Am J Physiol, 277: GI108-37
Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-5
Liang, P. and MacRae, T. H. 1997. Molecular chaperones and the cytoskeleton. J CeU Sci, 110 (Pt 13): 1431-40
Lindquist, S. and Craig, E. A. 1988. The heat-shock proteins. Armu Rev Genet, 22: 631-77
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem, 193: 265-75
Magin, T. M., Schroder, R., Leitgeb, S., Wanninger, p., Zatloukal, K., Grund, C. and Melton, D. W. 1998. Lessons from keratin 18 knockout mice: formation of novel keratin
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
47
filaments, 8econdary 1088 of keratin 7 and accumulation of liver-spedfic keratin 8-positive aggregates. J CeU Biol, 140: 1441-51
Maruyama, H. and Williams, G. M. 1988. Hepatotoxieity of chronic high dose administration of acetaminophen to nuce. A critical review and implications for hazard assessment Arch Toxicol, 62: 465-9
Moll, R, Franke, W. W., Schiller, D. L., Geiger, B. and Krepler, R 1982. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell, 31: 11-24
Morimoto, R 1., Kline, M. P., Bimston, D. N. and Cotto, J. J. 1997. The heat-shock response: regulation and functÏon of heat-shock proteins and molecu1ar chaperones. Essays Biochem, 32: 17-29
Omary, M. B. and Ku, N. O. 1997. Intermediate filament proteins of the liver: emerging disease association and functÏons. Hepatology, 25: 1043-8
Omary, M. B., Ku, N. O. and Toivola, D. M. 2002. Keratins: guardians of the liver. Hepatology, 35: 251-7
ParseH, D. A. and Lindquist, S. 1993. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Annu Rev Genet, 27: 437-96
Pelham, H. R 1986. Speculations on the functions of the major heat shock and glucoseregulated proteins. CeU, 46: 959-61
Pemg, M. D., Cairns, L., van den, 1. P., Prescott, A., Hutcheson, A. M. and Quinlan, R A. 1999. Intermediate filament interactions can he altered hy HSP27 and alphaBcrystallin. J Cell Sei, 112 (Pt 13): 2099-112
Phillips J., S. P., 1988, The eytosqueleton oUhe hepatoeyte: organisation, relationships, and pathology., in J. W. Edited by Arias Thi, Popper H, Schaehter D, Shafritz DA., ed., The liver: Biology and pathobiology: New York, Raven press, Ud., p. 11-27.
PreseoU, L. P., Roseoe, P., Wright, N. and Brown, S. S. 1971. Plasma-paracetamol halflife and hepatic neerosis patients with paracetamol overdosage. Lancet, 1: 519-22
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
48
Quinlan, R and Van Den Ijssel, P. 1999. Fatal attraction: when chaperone tums harlot. Nat Med, 5: 25-6
Reicks, M., Calvert, R. J. and Hathcock, J. N. 1988. Effects of prolonged acetaminophen ingestion and dietary methionine on mouse liver glutathione. Drug Nutr Interact, 5: 35 63
Salminen, W. F., Jr., Roberts, S. M., Fenna, M. and Voellmy, R 1997. Heat shock protein induction in murine liver after acute treatment with cocaïne. Hepatology, 25: 1147-53
Salminen, W. F., Jr., Roberts, S. M., Pumford, N. R. and Hinson, J. A. 1998a. Immunochemicai comparison of 3'-hydroxyacetanilide and acetaminophen binding mouse liver. Drug Metab Dispos, 26: 267-71
Salminen, W. F., Jr., VoeUmy, R. and Roberts, S. M. 1997a. Differentiai heat shock protein induction by acetaminophen and a nonhepatotoxic regioisomer, 3'hydroxyacetanilide, in mouse liver. J Pharmacol Exp Ther, 282: 1533-40
Salminen, W. F., Jr., Voellmy, R. and Roberts, S. M. 1997b. Protection against hepatotoxicity by a single dose of amphetamine: the potentiai role of heat shock protein induction. Toxicol Appt Pharmacol, 147: 247-58
Salminen, W. F., Jr., Voellmy, R. and Roberts, S. M. 1998b. Effect of N-acetylcysteine on heat shock protein induction by acetaminophen in mouse liver. J Pharmacol Exp Ther, 286: 519-24
Sandermann, H., Jr. and Strominger, J. L. 1972. Purification and properties of C 55 -isoprenoid alcohol phosphokinase from Staphylococcus aureus. J Biol Chem, 247: 5123-31
Schlesinger, M. J. 1990. Heat shock proteins. J Biol Chem, 265: 12111-4
Steinert, P. M. and Roop, D. R 1988. Molecular and cellular biology of intermediate filaments. Annu Rev Biochem, 57: 593-625
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
49
Sumioka, Matsura, T., Kai, and Yamada, 2004. Potential roies of hepatic heat shock protein 25 and protection of mice against acetaminophen-induced injury. Life Sei, 74: 2551-61
Toivola, D. M., Baribault, H., Magin, T., Michie, S. A. and Omary, M. R 2000. Simple epithelial keratins are dispensable for cytoprotection in two pancreatitis models. Physiol Gastrointest Liver Physiol, 279: G1343-54
Toivola, D. M., Omary, M. R, Ku, N. O., Peltola, O., Baribault, H. and Eriksson, J. E. 1998. Protein phosphatase inhibition in normal and keratin 8/18 assembly-incompetent mouse strains supports a functional role of keratin intermediate filaments in preserving hepatocyte integrity. Hepatology, 28: 116-28
Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proe Nad Acad Sei USA, 76: 4350-4
Whitley, D., Goldberg, S. P. and Jordan, W. D. 1999. Heat shock proteins: a review of the moleeular ehaperones. J Vase Surg, 29: 748-51
Yoon, K. H., Yoon, M., Moir, R. D., Khuon, S., Flitney, F. W. and Goldman, R. D. 2001. Insights into the dynarnic properties of keratin intermediate filaments in living epithelial ceHs. J CeH Biol, 153: 503-16
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
50
FIGURES LEGE~'DS
FIGURE 1 - Biochemical analysis. A) Western blotting of total proteins with anti
Hsps70i and anti-Hsp25 showed that the level of both proteins is increased during the
treatment. There is an increase in Hsps70i expression after 1 month of treatment. After
4 months of treatment, the Hsps70i level decreased but is still higher than the control
value. After 1 month of treatment, Hsp25 level increased and slowly decreased after
longer treatment periods. B) Western blotting of total proteins with TROMA J. The
amount of K8 is increased mer ACT treatment. C) Total liver proteins separated on
12,5% SDS-PAGE and stained with Coomasie blue.
FIGURE 2 - Effee! of ACT on IF network and Hsp70i expression in hepatocytes
from C3H mice. A, C, E, G, I Detection of keratin IF network. B, D, F, H, J Detection
of Hsp70i. A, B Controllivers; C, D 1 month treatment; E, F 2 months treatment; G,
H 3 months treatment; I, J 4 month treatment. After 1 to 3 months treatment, the keratin
IF network was reorganised in a large number of hepatocytes located in centrilobular
zones. Hsp70i was present in hepatocytes located in centrilobular zones after 1 to 3
month of treatment. After 4 months of treatment, Hsp70i was localised in the plasma
membrane and in the nuclei of hepatocytes closely associated with central veins.
FIGURE 3 - Erfee! of ACT on IF network and Hsp25 expression in hepatocytes
from C3H mice. A, C, G, I Detection of keratin IF network. B, D, F, H, J Detection
of Hsp25. A, B Controllivers; C, D 1 month treatment; E, F 2 months treatment; G, H
3 months treatment; l, J 4 months treatment The keratin IF network was reorganised
a large number of hepatocytes located around the centrilobular zones. Between 1 to 3
months treatment, Hsp25 was present in hepatocytes located in centrilobular zones.
After 4 months of treatment, Hsp25 was localised in the plasma membrane and in the
nuclei of hepatocytes closely associated with central veins.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
51
1
u 1 Iii
I l: ,
1
1 s f"'! , S f't
t' s 1
5, ", -, W
U
~
1 s .. !li! 1 ~
!li! t ~
1 1 1 - ..c u e
•• ~ g, ~ N 1$-r--. ~
~ Q"
~ M
== ==
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
ACT lm
ACT 2m
ACT 3m
ACT 4m
Figure 2
52
Kg Hsp10i
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
ACT lm
ACT 2m
ACT 3m
ACT 4m
Figure 3
K8 fIsp25
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
3.1 DISCUSSION
CHAPITRE 3
CONCLUSION
Le but de ce projet de maîtrise était de permettre l'étude de l'effet d'une
intoxication à long terme à l'ACT sur le niveau d'expression et la distribution des
protéines de FIs (K8 et K18) et des Hsps (Hsp25 et 701) dans les hépatocytes de souris.
Des souris C3H ont ainsi été soumises à un traitement chronique à l'ACT pour une durée
allant de 1 à 4 mois. Suite à ce traitement, des analyses d'immunobuvardage de type
Western et des expériences d' immunohistochimie ont été effectuées sur les hépatocytes
de souris contrôles ainsi que sur les hépatocytes de souris traitées à l'ACT pour
différentes périodes de temps.
3.1.1 Détection de K8, Hsp25 et Hsp70i par immunobuvardage de type Western
Nos travaux ont permis de montrer pour la première fois qu'un traitement
chronique avec l'ACT entraîne une augmentation de l'expression des kératines dans les
hépatocytes dès le premier mois de traitement. Cette augmentation est maintenue tout
au long du traitement. Nos résultats montrent aussi que les niveaux d'expression
d'Hsp25 et d'Hsp701 sont augmentés au cours de ce même traitement. Une importante
augmentation de l'expression d'Hsp25 et, d'une façon encore plus marquée, d'Hsp701,
est visible dès le premier mois, ce qui est en accord avec des études antérieures réalisées
par Salminen et (Salminen et al., 1997a). A partir du deuxième mois et jusqu'à la fin
du traitement, une diminution de l'expression de ces protéines est toutefois observable,
par rapport au premier mois, en demeurant néanmoins plus élevée que dans les
hépatocytes des souris contrôles. Il est aussi à noter que la diminution d'Hsp701
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
55
observée est moins importante que cene d'Hsp25. Cette hausse dans
l'expression de ces deux types de protéines dans les hépatocytes lors du traitement est
sans aucun doute attribuable à l'accumulation de métabolites toxiques de l'ACT dans les
cenules (Salminen et al., 1997a, 1997b, 1998). L'augmentation de l'expression des
protéines de FIs, comme cene des Hsps, pourrait faire partie des mécanismes de
protection contre les effets toxiques du NAPQI, un métabolite de l'ACT, en protégeant
les protéines et les structures importantes au maintien de l'intégrité des hépatocytes tout
en évitant la destruction de ces derniers. Des études antérieures utilisant des souris
déficientes en K8 et des souris transgéniques portant une mutation sur la K18 (Arg89 ~
Cys) ont montré que les hépatocytes de ces souris étaient plus sensibles aux stress
toxiques induits par la GF et l'ACT. Notre étude est donc en accord avec les études
précédentes montrant que les kératines K8/K18 jouent un rôle de protection dans les
cellules exposées à des agents hépatotoxiques (Ku et al., 1995; Ku et al., 1996; Loranger
et al., 1997; Cadrin et al., 2000; Fausther et al., 2004).
3.1.2 Localisation de K8, d'Hsp25 et d'Hsp7Oi par immunohistochimie
Les résultats obtenus lors des expériences d'immunohistochimie confirment les
analyses biochimiques réalisées par immunobuvardage de type Western exposées
précédemment En effet, l'immunofluorescence permet de voir que l'expression
d'Hsp25 et d'Hsp70i est augmenté dans les hépatocytes suite au traitement à l'ACT.
Tout comme les résultats obtenus avec les immunobuvardages de type Western, la
quantité d'Hsps détectée au 4ème mois semble légèrement inférieure à celle des premiers
mois de traitement mais tout de même plus élevée que dans les hépatocytes contrôles.
De plus, après cette période de traitement, la localisation des Hsps dans les hépatocytes
de souris ne correspond plus tout à fait à cene des trois premiers mois.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
56
augmentation de d'Hsps dans les hépatocytes localisés au niveau de
la veine centrolobulaire est causée par une arrivée massive de l'ACT au foie par les
vaisseaux sanguins. L'ACT sera métabolisé causant ainsi une accumulation de
métabolites toxiques dans les hépatocytes de cette zone (Salminen et al., 1997a).
Comme les cellules du foie ont pour rôle de filtrer et de détoxifier le sang, les premières
cellules à être affectées par les substances toxiques sont celles situées autour des
vaisseaux sanguins dont les veines centrolobulaires. Ainsi, on peut observer une
augmentation des Hsps et de la K81K18 dans ces zones dans les trois premiers mois du
traitement. Cette arrivée massive de substances toxiques au niveau du foie pourrait aussi
être la cause du gonflement des hépatocytes observé sur les coupes en
immunofluorescence. En effet, lors de la comparaison des foies de souris contrôles et
des foies de souris traitées à l'ACT, on peut remarquer que la taille des cenules est
augmentée dans ceux des souris traitées. Au quatrième mois de traitement, le niveau
d'expression de la K8/K18 semble continuer à augmenter alors que celui des Hsps
diminue. L'hypothèse que nous proposons soutient que vers la fin du traitement les
cellules pourraient être capables de faire face au stress suite à l'augmentation de
l'expression des K8/K18. Ces dernières pourraient agir comme des molécules
protectrices pour les hépatocytes en cas de choc toxique. Cette interprétation est en
accord avec les résultats d'autres chercheurs (Ku et al., 1996). En effet, l'équipe de Ku
a montré que des souris transgéniques mutantes pour la Kl8 étaient plus susceptibles
lors d'une administration d'ACT (400 mglkg) ou lors de l'ingestion chronique de GF
(1,25% p/p). Cette prédisposition à l'hépatotoxicité découlait directement de la mutation
de la Kl8 car les souris normales étaient plus résistantes à l'agression (Ku et al., 1996).
Ceci vient donc appuyer nos conclusions.
Chez les souris contrôles, les niveaux d'Hsp7Oi et d'Hsp25 sont très peu élevés
dans les hépatocytes; les Hsps sont même pratiquement indétectables (Salminen et al.,
1997). Les hépatocytes montrent une forme polygonale typique et les FIs sont distribués
uniformément dans toutes les cellules (Cadrin et Martinoli, 1995). Nos résultats
montrent toutefois que lors de l'intoxication chronique des souris par l'ACT, des
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
modifications importantes se produisent dans l'organisation des kératines ainsi que dans
la distribution des Hsps dans les hépatocytes. Effectivement, lors des trois premiers
mois d'intoxication, la présence presque exclusive des Hsp25 et Hsp70i est remarquée
dans les hépatocytes localisés au niveau des zones centrolobulaires. Cette distribution
des Hsps dans les hépatocytes de la zone centrolobulaire a aussi été observée par
Salminen et al. lors de traitements à l'ACT (200 mglkg i.p., 3-24 heures) (Salminen et
, 1997a). Dans le cas d'Hsp70i, les protéines sont distribuées dans tout le cytoplasme
des cellules, alors que dans celui d'Hsp25, les protéines sont plutôt localisées à la
périphérie des hépatocytes, près de la membrane plasmique, là ou se produit
l'accumulation des métabolites toxiques de l'ACT (Salminen et al., 1997a). Nos travaux
montrent que durant les trois premiers mois de traitement, le réseau de FIs est réorganisé
dans un grand nombre d'hépatocytes localisés dans la zone centrolobulaire où
l'accumulation des FIs semble concorder avec l'expression des Hsp70i et des Hsp25
alors que dans le foie des animaux contrôles, les FIs sont distribués de façon uniforme
dans toutes les cenules. La réorganisation du réseau de kératine dans les mêmes zones
que celles contenant Hsp25 et Hsp70i confirme que les Hsps ont un rôle à jouer dans la
protection des hépatocytes contre les effets toxiques de l'ACT, ce qui est en accord avec
les conclusions de Pemg et ses collaborateurs. En effet, ces derniers ont observé
qu'après un traitement avec l'ACT, Hsp70i est localisé dans les hépatocytes de la région
centrolobulaire contenant les métabolites toxiques de la drogue (Pemg et al., 1999a).
Lorsque la localisation des Hsps dans les hépatocytes des souris traitées pendant 4
mois est comparée avec cene des hépatocytes de souris traitées de 1 à 3 mois, une
importante différence est observée. La distribution centrolobulaire des Hsps et des FIs,
remarquée au cours des 3 premiers mois, est toujours présente après 4 mois de
traitement. Cependant, au lieu d'être uniquement distribuées dans le cytoplasme comme
précédemment, les Hsp25 et 70i sont surtout localisées au niveau des noyaux ainsi que
de la membrane plasmique des cellules étroitement associées à la veine centrale. De
plus, certains hépatocytes situés à la périphérie cette zone centrolobulaire présentent
aussi un marquage identique des noyaux et de la membrane plasmique; cependant, celui-
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
ci est beaucoup moins prononcé. Une des hypothèses envisagées pour expliquer cette
nouvelle localisation des Hsps serait que suite à l'accumulation des métabolites toxiques
de l'ACT, les hépatocytes de la zone centrolobulaire n'arriveraient plus à circonscrire
l'intoxication (Salminen et al., 1997a). Ceux-ci et les hépatocytes en périphérie
tenteraient donc, par la production d'Hsps, de stabiliser leur ADN et leur membrane
plasmique, des composantes importantes pour le maintien de l'intégrité cellulaire, afin
d'éviter que les cenules ne soient trop endommagées par la substance toxique et qu'elles
n'entrent en apoptose.
Nos résultats montrent qu'une colocalisation existe entre K8/K18 et Hsp25 ou
Hsp70i dans les hépatocytes d'animaux traités. Cette colocalisation est surtout visible
lors des 2ème, 3ème et 4ème mois de traitement. Certains travaux réalisés par une autre
équipe de chercheurs sur des cenules astrocytaires et des cellules humaines de
carcinome (cancer du sein) en culture ont aussi montré une colocalisation entre les Hsps
et les FIs (Pemg et al., 1999a). Ceux-ci ont pu démontrer qu'Hsp27 et l'aB-cristalline
colocalisaient avec la GF AP et la vimentine dans une lignée de cellules astrocytaires;
qu'Hsc70 et la GFAP colocalisaient aussi dans le même type de cellules; et finalement
qu'Hsp27 et la protéine de FIs K18 colocalisaient dans les cellules de carcinome. Ces
résultats ont été obtenus autant chez les cellules saines que chez les cenules soumises à
un stress (choc thermique et cytochalasine D); ils montrent que les Hsps peuvent
s'associer avec les protéines de FIs de type J, TI et même TIl, ce qui suggère que ces
interactions sont très importantes pour les protéines de FIs. En effet, selon les auteurs de
ces études, ces interactions empêcheraient les FIs de perdre leur fonction et protègeraient
ceux-ci des interactions non souhaitées résultant de leur proximité (Pemg et al., 1999a).
Rappelons que certaines études ont démontré qu'une intoxication chronique par
des substances hépatotoxiques comme GF et le DDC causent 1'agrégation de FIs et la
formation de CMs (Denk et al., 1975; Yokoo et al., 1982). Ces CMs sont
biochimiquement et morphologiquement identiques à ceux développés chez l'humain
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
59
lors de pathologies associées au foie comme l'hépatite alcoolique, cirrhose
amérindienne infantile ou la maladie de Wilson (Franke et al., 1979; Cadrin et al.,
1990). Plusieurs études ont démontré que les CMs contiennent des K8 et K18 comme
principaux constituants (Franke et al., 1979; French, 1981; Kimoff et Huang, 1981;
Denk et al., 1982; Ohta et al., 1988; Cadrin et al., 1990; Jensen et Gluud, 1994a).
Contrairement à ce qui a été observé avec la GF dans une autre étude effectuée par
notre laboratoire (Fausther et al., 2004), malgré une augmentation marquée de
l'expression de la K8, le traitement à l'ACT ne semble pas induire la formation de CMs
dans les hépatocytes. Par conséquent, une augmentation de l'expression de K8/K18
n'entraîne pas directement la formation des CMs. Une importante différence dans la
réponse au stress entre la présente étude et celle où la GF a été utilisée est que, dans le
cas du traitement à l'ACT, Hsp25 et Hsp70i ont été surexprimées dans les cellules tandis
que dans le cas du traitement à la GF, seule l'expression d'Hsp7Oi a été augmentée. La
colocalisation qui suggère une association entre les FIs et Hsp70i est probablement aussi
importante au cours de ce phénomène que l'augmentation d'Hsp7Oi elle-même. Ces
résultats sont en accord avec les hypothèses de l'équipe de Quinlan qui suggéraient que
les sHsps permettraient aux FIs de conserver leur intégrité structurale et préviendraient
leur agrégation (Pemg et al., 1999a; Quinlan et Van Den Ijssel, 1999). Hsp25 étant une
sHsps, l'importante augmentation de son expression notée dans cette étude laisse
supposer qu'elle pourrait avoir un rôle important à jouer dans la prévention de la
formation des CMs aux temps de traitement étudiés. Par contre, il est possible qu'un
traitement à plus long terme conduise à l'apparition de CMs dans les hépatocytes, les
sHsps n'étant pas parvenues à freiner l'intoxication ou encore n'accomplissant pas cette
fonction.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
60
3.2 CONCLUSION
Les résultats obtenus supportent l'hypothèse selon laquelle l'augmentation des
Hsp25 et Hsp70i dans les hépatocytes est un mécanisme de protection mis en place par
les cellules en vue d'enrayer les effets de l'exposition à certaines substances toxiques.
La réorganisation du réseau de Fis dans les mêmes zones contenant Hsp25 et Hsp70i
suggère que K81K18 jouent aussi un rôle dans la protection des hépatocytes contre les
effets toxiques de l'ACT. L'augmentation continue de la K81K18 pendant tout le
traitement ferait en sorte que les cenules soient capables de faire face au stress bien que
l'expression des Hsps diminue graduellement après le premier mois suivant
l'intoxication. TI s'agirait peut être d'un mécanisme d'adaptation au stress. La
colocalisation de la K81K18 et des Hsps dans les hépatocytes suggère que l'interaction
entre ces protéines est très importante. Ainsi, les Hsps aideraient au maintien de
l'intégrité du réseau de FIs lors de situations pathologiques (Perng et al., 1999a; Quinlan
et Van Den Ijssel, 1999). Le fait qu'il n'y ait pas apparition de CMs dans les
hépatocytes lors du présent traitement pourrait être la conséquence de l'augmentation de
l'expression d'Hsp25 dans les cenules. En effet, puisque cette dernière Hsps n'est pas
retrouvée dans l'étude effectuée par Michel Fausther avec la GF (Fausther et al., 2004),
il est tentant de croire que cette sHsps pourrait jouer un rôle important dans la prévention
de la formation des CMs aux temps de traitement étudiés.
3.3 PERSPECTIV"ES DE RECHER.CHE
Suite à notre étude, plusieurs perspectives de recherche s'ouvrent à nous.
Éventuellement nous pourrions réaliser un traitement à plus long terme avec l'ACT pour
tenter d'induire la formation de CMs dans les hépatocytes de souris. Aussi, puisque
d'autres études effectuées dans notre laboratoire ont démontré qu'une phosphorylation
sur certains sites spécifiques des kératines se produit lors d'une intoxication à GF,
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
61
nous poumons essayer de vérifier y a phosphorylation dam: le cas d'un traitement à
l'ACT. L'étude de l'apoptose dans le foie pourrait également être une avenue
intéressante car certains résultats obtenus récemment dans notre laboratoire laissent
entrevoir que la phosphorylation des kératines pOUl Tait précéder ou être associée à
l'apoptose des hépatocytes (données non publiées). Puisqu'une colocalisation des
kératines et des Hsps est visible dans les hépatocytes par immunofluorescence, il serait
aussi intéressant de vérifier si ces protéines sont véritablement associées physiquement
dans les cenules. Une immunoprécipitation des kératines permettrait de s'assurer que
les Hsps et les kératines coimmunoprécipitent.
3.3.1 Traitement à plus long terme
Lors de notre étude, les temps de traitement utilisés allaient de 1 à 4 mois. Après 4
mois de traitement, bien que le patron d'expression pour Hsp25, Hsp70i et K81K18 soit
différent des 3 premiers mois, il n'y avait toujours pas apparition de CMs dans les
hépatocytes comme dans le cas d'une intoxication à la GF ou certaines autres substances
hépatotoxiques. Comme mentionné précédemment, on ne peut exclure la possibilité
d'une apparition de ces agrégats lors d'un traitement plus long ou à plus forte dose, car
tout comme pour la GF, une modification de la K81K18 dans les cellules était observée.
Un traitement à plus long terme ou à plus forte dose serait donc envisageable pour
infirmer ou confirmer cette possibilité.
De plus, un traitement à plus long terme avec l'ACT nous pem1ettrait aussi de voir
si les hépatocytes entrent dans une phase de récupération après quelques mois comme
c'est le cas lors d'un traitement à GE En effet, après un traitement de 3 mois à GF,
on remarque que les cenules entrent dans une phase de récupération partielle (Cadrin et
al., 2000). Pendant cette phase, on peut voir que les hépatocytes retrouvent leur aspect
initial, que la distribution de K8/K18 à l'intérieur des cellules ressemble à ce qui est
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
62
observé dans foie des souris contrôles et que niveau de K8 demeure élevé alors que
celui d'Hsp7Oi diminue légèrement (Cadrin et al., 2000; Fausther et al., 2004).
3.3.2 Phosphorylation
L'étude de la phosphorylation sur les hépatocytes de souris traitées à!' ACT était
jusqu'à maintenant une perspective d'avenir intéressante. Cependant, il ne peut plus être
question de perspective d'avenir présentement car ces expériences ont été réalisées
dernièrement par une étudiante travaillant dans notre laboratoire, Anne-Marie Fortier.
La phosphorylation joue un rôle régulateur important au niveau de diverses
protéines impliquées dans des mécanismes cellulaires essentiels. Les protéines de FIs
sont également affectées par cette modification post-traductionnelle (Celis et al., 1985;
Chou et al., 1992; Ku et Omary, 1994; Omary et al., 1998; Hemnann et al., 2003). La
phosphorylation serait aussi un moyen de défense employé par les cellules contre le
stress. En effet, la phosphorylation de K8 sur les sites sérine 79 (Ser79) et Ser436 chez
la souris, qui correspondent respectivement aux Ser73 et Ser431 des K8 humaines, a été
associée à divers processus tels la mitose, l'apoptose, la réorganisation des FIs et la
protection des cellules en situation de stress in vivo et in vitro (Chou et al., 1992; Liao et
al., 1995b; Liao et al., 1997; Omary et al., 1998; Ku et al., 2002; Toivola et al., 2002).
Ainsi, on peut penser que l'assemblage et la réorganisation du réseau de Fis dans les
cenules sont influencés par des modifications dans le niveau de phosphorylation et dans
les sites de phosphorylation des kératines.
Une des hypothèses avancées suite à des études effectuées dans notre laboratoire
par Michel Fausther est qu'une modulation de phosphorylation des kératines pourrait
jouer un rôle au cours du développement de maladies hépatiques et être associée à
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
63
formation des CMs dans les hépatocytes (Fausther et 2004). Ces travaux ont montré
qu'une augmentation de la phosphorylation des K8/K18 se produit dans les hépatocytes
suite à un traitement à la GF Au niveau de la K8 on pouvait noter une augmentation de
la phosphorylation au niveau de 2 sites spécifiques, soit Ser73 (la plus grande
augmentation) et Ser431 alors que pour la 8, on observait une augmentation de la
phosphorylation au site de la Ser33. Ces mêmes sites de phosphorylation ont été étudiés
sur des foies de souris ayant été traitées à 1'ACT.
Des résultats préliminaires intéressants ont été obtenus lors d'expériences réalisées
à l'été 2004. L'utilisation d'un anticorps monoclonal reconnaissant la K8 phosphorylée
au site Ser73, soit U4, a démontré que les contrôles présentaient quelques cellules
marquées qui étaient isolées. Ces cenules sont possiblement des cellules en mitose.
Après 1 mois de traitement, le marquage est très augmenté et retrouvé au niveau du
cytoplasme. Les cellules marquées sont souvent en doublet ou en amas. La présence de
doublet suggère que ces cenules sont en cours de mitose. Pour les autres temps de
traitement, le marquage diminue progressivement pour laisser seulement quelques
cenules isolées. Cependant, à ces temps de traitement, le marquage ressemble tout de
même à ce que l'on peut voir après 1 mois de traitement. Un second anticorps
monoclonal pour la K8 reconnaissant le site de la Ser431 phosphorylé, soit 5B3, a été
utilisé. Les résultats obtenus avec cet anticorps montraient que cet épitope n'est pas
présent dans les hépatocytes et ce, pour tous les temps de traitement ainsi que pour les
contrôles. La même intensité de marquage était observée sur toutes les coupes de tissu.
Aucune cenule présentant un marquage au niveau du cytoplasme n'a pu être observée.
La détection de la K18 phosphorylée au site de la Ser33 a été effectuée grâce à un
anticorps polydonal, l'anticorps 8250. Dans le foie des animaux contrôles, aucune
cenule marquée n'est observée. Après 1 mois de traitement, beaucoup d'hépatocytes
sont marqués et ce marquage est observable au niveau du cytoplasme. Les cellules
marquées par cet anticorps délimitent très bien les vaisseaux sanguins et les canaux
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
64
biliaires. Après 2 mois traitement, le marquage est beaucoup moins et même
parfois absent. Les cellules marquées sont surtout des hépatocytes isolés. Après 3 et 4
mois de traitement à l'ACT, on peut observer que le marquage s'est déplacé au niveau
du noyau de certaines cellules et qu'il a disparu du cytoplasme; ce type de marquage est
non-spécifique.
Les résultats obtenus dans cette dernière étude ne sont pas tout à fait semblables à
ceux obtenus lors d'études antérieures (Stumptner et al., 2000; Fausther et al., 2004).
Toutefois, comme montré précédemment, une intoxication des souris à l'ACT est
associée à une augmentation générale de la phosphorylation de K8 et K18 sur certains
sites spécifiques. Ces modifications de la phosphorylation observées dans les
hépatocytes influencent sans aucun doute l'assemblage ainsi que la réorganisation du
réseau de FIs dans les cellules en vue de protéger celles-ci suite à un stress. Pour
compléter l'étude impliquant l'A CT, il serait possible de tenter d'étudier la
phosphorylation des kératines à d'autres sites particuliers. En effet, chez l'humain, cinq
sites de phosphorylation ont été caractérisés au niveau des hépatocytes, soit Ser23, Ser73
et Ser431 pour la K8 et Ser 33 et Ser52 pour la K18 (Omary et al., 1998) alors que
l'étude effectuée n'en a testé que trois (Ser73, Ser431 et Ser33). n existe
potentiellement 61 sites de phosphorylation sur la K8 et 37 sites sur la K18 chez la
souris (Omary et al., 1998), il serait donc intéressant de pousser cette étude de la
phosphorylation plus loin. De plus, bien que la sérine soit le résidu majoritairement
phosphorylé au niveau des kératines, on peut aussi retrouver de la phosphorylation au
niveau d'autres résidus comme la thréonine ou la tyrosine (Oshima, 1982; Steinert,
1988; Omary et al., 1998; Feng et al., 1999). Ainsi, ces sites potentiels de
phosphorylation pourraient être des pistes intéressantes à explorer pour comprendre
comment les kératines protègent les hépatocytes contre les stress toxiques.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
65
3.3.3 Apoptose
Une étude vivo réalisée, par la méthode TUNEL, sur des lignées de souris
FYB/n, déficientes en K8, a montré la présence d'Hsp7Oi en grande quantité dans les
hépatocytes en apoptose (données non-publiées). Les résultats obtenus lors de la
présente étude montraient une importante augmentation d'Hsp7Oi dans les hépatocytes
de souris traitées à l'ACT. n serait donc intéressant de déterminer si une relation existe
entre Hsp70i et l'apoptose dans ce système.
3.3.4 Protéines associées aux kératines
Dans la poursuite de ce travail, des analyses biochimiques par
immunoprécipitation seraient envisageables puisque les résultats obtenus lors de la
présente étude montraient une colocalisation de certaines Hsps et de la K8/K18 par
immunofluorescence. L'immunoprécipitation est une technique permettant, grâce à un
anticorps approprié, de faire précipiter une protéine d'intérêt ainsi que toutes les
protéines qui lui sont associées. Ainsi, en faisant précipiter la K8 il serait possible
d'évaluer l'association de certaines protéines avec les FIs. Comme la régulation de la
fonction des kératines semble liée à leur association avec d'autres protéines,
l'immunoprécipitation permettrait de déterminer si les kératines et les Hsps sont
réellement associées physiquement dans les hépatocytes. Nous pourrions aussi
déterminer si des protéines qui jouent un rôle dans l' apoptose sont directement associées
aux kératines dans le foie. De plus, ce type d'expérience pourrait aussi faire en sorte de
détecter d'autres types de protéines associées à la K8 ou aux Hsps telles que des
protéines impliquées dans les mécanismes de détoxification.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
66
3.3.5 Études vivo sur un modèle humain
Finalement, des études in vivo chez l'être humain pourraient aussi être réaHsées.
En obtenant des biopsies hépatiques de patients intoxiqués à l'ACT il serait possible de
vérifier les hypothèses soulevées par la présente étude. Si les résultats sont positifs, ils
pennettraient éventuellement de développer des tests pennettant de révéler de façon plus
générale la toxicité de composés suspectés être hépatotoxiques.
Les connaissances actuelles concernant le fonctionnement des FIs sont encore très
sommaires. Plus les recherches apporteront de nouvelles données, plus il sera possible
d'améliorer nos connaissances à propos de la compréhension du fonctionnement des
kératines et, à plus grande échelle, des protéines de FIs dans la cenule. Ainsi, ces
connaissances pennettront peut être, dans un avenir plus ou moins rapproché, d'offrir de
nouvelles thérapies efficaces pour plusieurs maladies hépatiques impliquant les FIs.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
67
RÉFÉRENCES
Agashe, V. R. et Hard, U. 2000. Roles of molecular chaperones in cytoplasrnic protein folding. Sernin CeH Dev Biol, Il: 15-25.
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., et Walter, P. 2002. Molecular Biology orthe CeH (4ème édition ed.). NY, USA: Garland Science.
AI-Chalabi, A. et Miller, C. C. 2003. Neurofilaments and neurological disease. Bioessays, 25: 346-55.
Alizadeh, A., Clark, J., Seeberger, T., Hess, J., Blankenship, T., et FitzGerald, P. G. 2004. Characterization of a mutation in the lens-specifie CP49 in the 129 strain of mouse. mvest Ophthalmol Vis Sci, 45: 884-91.
Association des pharmaciens du Canada (Ed.). 2003. Compendium des produits et spécialités pharmaceutigues: L'Asociation des pharmaciens du Canada.
Avila, J. 1992. Microtubule functions. Life Sci, 50: 327-34.
Bahr, G. M., Rook, G. A., al-Saffar, M., Van Embden, J., Stanford, J. L., et Behbehani, K. 1988a. Antibody levels to mycobacteria in relation to HLA type: evidence for nonHLA-linked high levels of antibody to the 65 kD heat shock protein of M. bovis in rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol, 74: 211-5.
Bahr, G. M., Rook, G. A., Shahin, A., Stanford, J. L., Saltar, M. 1., et Behbehani, K. 1988b. HLA-DR-associated isotype-specific regulation of antibody levels to mycobacteria in rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol, 72: 26-31.
Bartolone, J. B., Birge, R. B., Bulera, S. J., Bruno, M. K., Nishanian, E. V., Cohen, S. D., et Khairallah, E. A. 1992. Purification, antibody production, and partial amino acid sequence of the 58-kDa acetarninophen-binding liver proteins. Toxicol Appt Pharmacol, 113: 19-29.
Bergman, K., Muller, et Teigen, S. W. 1996. Series: CUITent issues mutagenesis and carcinogenesis, No. 65. The genotoxicity and carcinogenicity of paracetamol: a regulatory (re)view. Muta! Res, 349: 263-88.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Bonne, G., Di Barletta, R., Varnous, S., Becane, H. M., Ha:mmouda, H., Merliill, L., Muntoni, F., Greenberg, C. R, Gary, F., Urtizberea, J. A., Duboc, D., Fardeau, M., Toillolo, D., et Schwartz, K. 1999. Mutations in the gene encoding larnin AlC cause autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy. Nat Genet, 21: 285-8.
Bruey, J. M., Ducasse, C, Bonniaud, P., Ravagnan, L., Susin, S. A., Diaz-Latoud, C, Gurbuxani, S., Arrigo, A. P., Kroemer, G., Solary, E., et Garrido, C. 2000. Hsp27 negatively regulates ceH death by interacting with cytochrome c. Nat Cell Biol, 2: 645-52.
Bulera, S. J., Birge, R B., Cohen, S. D., et Khairallah, E. A. 1995. Identification of the mouse liver 44-kDa acetaminophen-binding protein as a subunit of glutamine synthetase. Toxicol Appl Pharmacol, 134: 313-20.
Cadrin, M., Anderson, N. M., Aasheim, L. H., Kawahara, H., Franks, D. J., et French, S. W. 1995. Modifications in cytokeratin and actin in cultured liver cells derived from griseofulvin-fed mice. Lab mvest, 72: 453-60.
Cadrin, M., Brown, D. L., et Reuhl, K. R 1993. Effect of environmental toxicants on the cytoskeleton. In A. Press (Ed.), Handbook of Hazardous Materials: 233-239.
Cadrin, M., Hovington, H., Marceau, N., et McFarlane-Anderson, N. 2000. Early perturbations in keratin and actin gene expression and fibrillar organisation in griseofulvin-fed mouse liver. J Hepatol, 33: 199-207.
Cadrin, M., Kawahara, H., Ohta, M., Katsuma, Y., Marceau, N., et French, S. W. 1990. MaUory bodies in hepatomas and hyperplastic nodules: in vitro and in vivo studies. Prog Clin Biol Res, 331: 231-48.
Cadrin, M. et Martinoli, M. G. 1995. Alterations of intermediate filaments in various histopathological conditions. Biochem Cell Biol, 73: 627-34.
Capetanaki, Y., Smith, S., et Heath, J. 1989. Overexpression of the vimentin gene in transgenic miœ inhibits normallens œIl differentiation. J CeH Biol, 109: 1653-64.
Carlier, M. F. 1991. Actin: protein structure and filament dynamics. J Biol Chem, 266: 1-4.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
69
Carter, J. M., Hutcheson, A. M., et Quinlan, 1995. vitro studies on the assembly properties of the lens proteins CP49, CP115: coassembly with alpha-crystallin but not with vimentin. Exp Eye Res, 60: 181-92.
Celis, J. E., Fey, S. J., Larsen, P. M., et Celis, A. 1985. Preferential phosphorylation of keratins and vimentin during mitosis in normal and transformed human arnnion cells. Ann N Y Acad Sci, 455: 268-81.
Chan, H. Y., Warrick, J. M., Gray-Board, G. L., Paulson, H. L., et Bonini, N. M. 2000. Mechanisms of chaperone suppression of polyglutamine disease: selectivity, synergy and modulation of protein solubility in Drosophila. Hum Mol Genet, 9: 2811-20.
Charette, S. J., Lavoie, J. N., Lambert, H., et Landry, J. 2000. Inhibition of Daxxmediated apoptosis by heat shock protein 27. Mol Cell Biol, 20: 7602-12.
Chen, L., Lee, L., Kudlow, B. A., Dos Santos, H. G., Sletvold, O., Shafeghati, Y., Botha, E. G., Garg, A., Hanson, N. B., Martin, G. M., Mian, 1. S., Kennedy, B. K., et Oshima, J. 2003. LMNA mutations in atypical Wemer's syndrome. Lancet, 362: 440-5.
Chen, T. S., Richie, J. P., Jr., et Lang, C. A. 1990. Life span profiles of glutathione and acetaminophen detoxification. Drug Metab Dispos, 18: 882-7.
Chou, C. F., Smith, A. J., et Omary, M. B. 1992. Characterization and dynamics of 0-linked glycosylation ofhuman cytokeratin 8 and 18. J Biol Chem, 267: 3901-6.
Coulombe, P. A., Hutton, M. E., Letai, A., Hebert, A., Palier, A. S., et Fuchs, E. 1991. Point mutations in human keratin 14 genes of epidermolysis buHosa simplex patients: genetic and functional analyses. Cell, 66: 1301-11.
Coulombe, P. A. et Omary, M. B. 2002. 'Hard' and 'soft' principles defining the structure, function and regulation of keratin intermediate filaments. Curr Opin Cell Biol, 14: 110-22.
Cummings, C. J., Mancini, M. A., Antalffy, B., DeFranco, D. B., Orr, H. T., et Zoghbi, H. Y. 1998. Chaperone suppression of aggregation and altered subceUular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1. Nat Genet, 19: 148-54.
Czar, M. J., Welsh, J., et Pratt, W. B. 1996. Immunofluorescence localization of the 90-kDa heat-shock protein to cytoskeleton. Eur J CeH Biol, 70: 322-30.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
70
Davidson, et Eastham, W. 1966. Acute liver necrosis foHowing overdose of paracetamoL =-::;...;==,5512: 497-9.
De Sandre-Giovannoli, A., Bernard, R., Cau, P., Navarro, c., Amiel, J., Boccaccio, Lyonnet, S., Stewart, C. L., Munnich, A., Le Merrer, M., et Levy, N. 2003. Lamin a truncation in Hutchinson-Gilford progeria. Science, 300: 2055.
De Sandre-Giovannoli, A., Chaouch, M., Kozlov, S., VaUat, J. M., Tazir, M., Kassouri, N., Szepetowski, P., Hammadouche, T., Vandenberghe, A., Stewart, C. L., Grid, D., et Levy, N. 2002. Homozygous defects in LMNA, encoding lamin NC nuclear-envelope proteins, cause autosomal recessive axonal neuropathy in human (Charcot-Marie-Tooth disorder type 2) and mouse. Am J Hum Genet, 70: 726-36.
Denk, H., Gschnait, P., et Wolff, K 1975. Hepatocellar hyalin (Mallory bodies) in long term griseofulvin-treated mice: a new experimental model for the study of hyalin formation. Lab mvest, 32: 773-6.
Denk, H., Krepler, R, Lackinger, E., Artlieb, U., et Franke, W. W. 1982. Immunological and biochemical characterization of the keratin-related component of Manory bodies: a pathological pattern ofhepatocytic cytokeratins. Liver, 2: 165-75.
Draganov, P., Durrence, H., Cox, c., et Reuben, A. 2000. Alcohol-acetaminophen syndrome. Even moderate social drinkers are at risk. Postgrad Med, 107: 189-95.
Dunia, 1., Pieper, P., Manenti, S., van de Kemp, A., Devilliers, G., Benedetti, E. L., et Bloemendal, H. 1990. Plasma membrane-cytoskeleton damage in eye lenses of transgenic mice expressing desmin. Eur J CeU Biol, 53: 59-74.
Ellis, J. 1987. Proteins as molecular chaperones. Nature, 328: 378-9.
Evgrafov, O. V., Mersiyanova, 1., Irobi, J., Van Den Bosch, L., Dierick, 1., Leung, C. L., Schagina, O., Verpoorten, N., Van Impe, K, Fedotov, V., Dadali, E., Auer-Grumbach, M., Windpassinger, c., Wagner, Mitrovic, Hilton-Jones, D., Talbot, K, Martin, J. J., Vasserman, N., Tverskaya, S., Polyakov, A., Liem, R K, Gettemans, J., Robberecht, W., De Jonghe, P., et Timmerman, V. 2004. Mutant smaH heat-shock protein 27 causes axonal Charcot-Marie-Tooth disease and distal hereditary motor neuropathy. Nat Genet, 36: 602-6.
Farrell, S. E.; "Toxicity, Acetaminophen"; www.emedecine.com. (2002).
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
71
Fausther, M., Villeneuve, et Cadrin, M. 2004. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvinintoxicated rnice. Comp Hepatol, 3: 5.
Feder, M. E. et Hofmann, G. E. 1999. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and eeological physiology. Annu Rev Physiol, 61: 243-82.
Feng, L., Zhou, X., Liao, J., et Omary, M. B. 1999. Pervanadate-mediated tyrosine phosphorylation of keratins 8 and 19 via a p38 rnitogen-activated protein kinasedependent pathway. J CeU Sci, 112 (Pt 13): 2081-90.
Fostinis, Y., Theodoropoulos, P. A., Gravanis, A., et Stournaras, C. 1992. Heat shoek protein HSP90 and Hs association with the eytoskeleton: a morphologieal study. Bioehem CeU Biol, 70: 779-86.
Franke, W. W., Denk, H., Sehmid, E., Osborn, M., et Weber, K. 1979. Ultrastruetural, biochemical, and immunologie charaeterization of Mallory bodies in livers of griseofulvin-treated rnice. Fimbriated rods of filaments containing prekeratin-like polypeptides. Lab mvest, 40: 207-20.
Franke, W. W., Schmid, E., Schiller, D. L., Winter, S., Jarasch, E. D., MoU, R., Denk, H., Jackson, B. W., et lllmensee, K. 1982. Differentiation-related patterns of expression of proteins of intermediate-size filaments in tissues and cultured cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 46 Pt 1: 431-53.
French S.W., O. T., Swierenga S.H.H., Marceau N. 1987. The cytoskeleton of hepatocytes in health and disease. In Edited by Faber E (Ed.), Pathogenesis of liver disease: 95-112. Baltimore, Williams & Wilkins.: Phillips Ml
French, S. W. 1981. The Manory body: structure, composition, and pathogenesis. Hepatology, 1: 76-83.
Fuchs, E. et Cleveland, D. W. 1998. A structural scaffolding of intermediate filaments in health and disease. Science, 279: 514-9.
Fuchs, E., Coulombe, P., Cheng, J., Chan, Y. M., Hutton, E., Syder, A., Degenstein, L., Yu, Q. C., Letai, A., et Vassar, R. 1994. Genetic bases of epidermolysis bullosa simplex and epidermolytic hyperkeratosis. J mvest Dermatol, 103: 25S-30S.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
72
Fuchs, E. et Coulombe, P. A. 1992. Of mice and men: genetic skin diseases of keratin. CeU, 69: 899-902.
Fuchs, E., Tyner, A. L., Giudice, G. J., Marchuk, D., RayChaudhury, A., et Rosenberg, M. 1987. The human keratin genes and their differential expression. CUIT Top Dev Biol, 22: 5-34.
Fuchs, E. et Weber, K. 1994. Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease. Annu Rev Biochem, 63: 345-82.
Furukawa, R. et Fechheimer, M. 1997. The structure, function, and assembly of actin filament bundles. Int Rev Cytol, 175: 29-90.
Garrido, c., Fromentin, A., Bonnotte, B., Favre, N., Moutet, M., Arrigo, A. P., Mehlen, P., et Solary, E. 1998. Heat shock protein 27 enhances the tumorigenicity of immunogenic rat colon carcinoma ceU clones. Cancer Res, 58: 5495-9.
Geisler, N. et Weber, K. 1982. The amino acid sequence of chicken muscle desmin provides a common structural model for intermediate filament proteins. Embo J, 1: 1649-56.
Giese, K. C. et Vierling, E. 2004. Mutants in a smaH heat shock protein that affect the oligomeric state: analysis and allele-specifie suppression. J Biol Chem.
Goebel, H. H. et Bomemann, A. 1993. Desmin pathology in neuromuscular diseases. Virchows Areh B CeU Pathol Incl Mol Pathol, 64: 127-35.
Goldfarb, L. G., Park, K. Y., Cervenakova, L., Gorokhova, S., Lee, H. S., Vasconcelos, O., Nagle, J. W., Semino-Mora, C., Sivakumar, K., et Dalakas, M. C. 1998. Missense mutations in desmin associated with familial cardiae and skeletal myopathy. Nat Genet, 19: 402-3.
Halmes, N. c., Hinson, J. A., Martin, B. M., et Pumford, N. R. 1996. Glutamate dehydrogenase covalently binds to a reactive metabolite of acetaminophen. Chem Res Toxicol, 9: 541-6.
Hard, F. U. 1996. Molecular chaperones in cellular prote in folding. Nature, 381: 571-9.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Hartl, F. U. et Martin, J. 1995. Molecular chaperones in cellular protein folding. Opin Struct Biol, 5: 92-102.
Hayes, S. A. et Dice, J. F. 1996. Roles ofmolecular chaperones protein degradation.1. Cell Biol, 132: 255-8.
Herrmann, H. et Aebi, U 1998. Structure, assembly, and dynamics of intennediate filaments. SubceH Biochem, 31: 319-62.
Herrmann, H. et Aebi, U 2000. Intennediate filaments and their associates: multitalented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. CUIT Opin CeU Biol, 12: 79-90.
Herrmann, H., Hesse, M., ReichenzeUer, M., Aebi, U., et Magin, T. M. 2003. Functional complexity of intennediate filament cytoskeletons: from structure to assembly to gene ablation. fut Rev Cytol, 223: 83-175.
Herrmann, H., Strelkov, S. V., Feja, R, Rogers, K R, Brettel, M., Lustig, A., Haner, M., Parry, D. A., Steinert, P. M., Burkhard, P., et Aebi, U. 2000. The intennediate filament protein consensus motif of helix 2B: its atomic structure and contribution to assembly. J Mol Biol, 298: 817-32.
Ho, C. L et Liem, R K 1996. Intennediate filaments ln the nervous system: implications in cancer. Cancer Metastasis Rev, 15: 483-97.
Hutchison, C. J., Alvarez-Reyes, M., et Vaughan, O. A. 2001. Larnins in disease: why do ubiquitously expressed nuclear envelope proteins give rise to tissue-specifie disease phenotypes? J Cell Sei, 114: 9-19.
Hutter, H., Zatloukal, K, Winter, G., Stumptner, c., et Denk, H. 1993. Disturbance of keratin homeostasis in griseofulvin-intoxieated mouse liver. Lab Invest, 69: 576-82.
Iwaki, T., Iwaki, A., Tateishi, J., et Goldman, 1. E. 1994. Sense and antisense modification of glial alpha B-crystaUin production results in alterations of stress fiber fonnation and thennoresistance. J CeU Biol, 125: 1385-93.
Iwaki, T., Kume-Iwaki, A., Liem, R K, et Goldman, J. E. 1989. Alpha B-crystallin 1S expressed in non-lentieular tissues and accumulates in Alexander's disease brain. CeH, 57: 71-8.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
74
M. 1995. Over-expression of hsp70 confers tumorigenicity to mou se fibrosarcoma cells. mt J Cancer, 60: 689-93.
Jaattela, M. 1999. Heat shock proteins as cellular lifeguards. Ann Med, 31: 261-71.
Jensen, K. et Gluud, C 1994a. The MaHory body: morphological, dinical and experimental studies (Part 1 of a literature survey). Hepatology, 20: 1061-77.
Kachi, K., Cadrin, M., et French, S. W. 1993. Synthesis of Mallory body, intermediate filament, and microfilament proteins in liver cell primary cultures. An electron microscopie autoradiography assay. Lab mvest, 68: 71-81.
Kakizuka, A. 1998. Protein precipitation: a common etiology in neurodegenerative disorders? Trends Genet, 14: 396-402.
Kappe, G., Franck, E., Verschuure, P., Boelens, W. C, Leunissen, J. A., et de Jong, W. W. 2003. The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related smaU heat shock proteins: HspBI-lO. Cell Stress Chaperones, 8: 53-61.
Kappe, G., Verschuure, P., Philipsen, R. L., Staalduinen, A. A., Van de Boogaart, P., Boelens, W. C, et De Jong, W. W. 2001. Characterization of two novel human smaU heat shock proteins: protein kinase-related HspB8 and testis-specific HspB9. Biochim Biophys Acta, 1520: 1-6.
Kato, K., Ito, H., et Inaguma, Y. 2002. Expression and phosphorylation of mammalian small heat shock proteins. Prog Mol SubceH Biol, 28: 129-50.
Kato, K, Shinohara, H., Kurobe, N., Goto, S., Inaguma, Y., et Ohshima, K 1991. Immunoreactive alpha A crystallin in rat non-lenticular tissues detected with a sensitive immunoassay method. Biochim Biophys Acta, 1080: 173-80.
Kawanishi, K, Shiozaki, H., Doki, Y., Sakita, I., moue, M., Yano, M., Tsujinaka, T., Shamma, A, et Monden, M. 1999. Prognostic significance of heat shock proteins 27 and 70 in patients with squamous ceIl carcinoma of the esophagus. Cancer, 85: 1649-57.
Kazemi-Esfarjani, P. et Benzer, S. 2000. Genetic suppression of polyglutamine toxicity in Drosophila. Science, 287: 1837-40.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Kimoff, J. et Huang, 1981. Immunocytochemical and immunoelectron microscopie studies on Manory bodies. Lab Invest, 45: 491-503.
Kirfel, J., Magin, T. M., et Reiehelt, J. 2003. Keratins: a structural scaffold with emerging functions. Cell Mol Life Sei, 60: 56-71.
Koyasu, S., Nishida, E., Kadowaki, T., Matsuzaki, p., Iida, K., Harada, F., Kasuga, M., Sakai, H., et Yahara, I. 1986. Two mammalian heat shock proteins, HSP90 and HSP100, are actin-binding proteins. Proc Nad Acad Sei USA, 83: 8054-8.
Krahenbuhl, S. 1999. Acarbose and acetaminophen--a dangerous combination? Hepatology, 29: 285-7.
Ku, N. O., Azhar, S., et Omary, M. B. 2002. Keratin 8 phosphorylation by p38 kinase regulates cellular keratin filament reorgamzation: modulation by a keratin l-like disease causing mutation. J Biol Chem, 277: 10775-82.
Ku, N. O., Michie, S., Oshima, R. G., et Omary, M. B. 1995. Chromc hepatitis, hepatocyte fragility, and increased soluble phosphoglycokeratins in transgenic mice expressing a keratin 18 conserved arginine mutant. J Cell Biol, 131: 1303-14.
Ku, N. O., Miehie, S. A., Soetikno, R. M., Resurreceion, E. Z., Broome, R. L., Oshima, R. G., et Omary, M. B. 1996. Susceptibility to hepatotoxieity in transgenic mice that express a dominant-negative human keratin 18 mutant. J Clin Invest, 98: 1034-46.
Ku, N. O. et Omary, M. B. 1994. Expression, glycosylation, and phosphorylation of human keratins 8 and 18 in insect cens. Exp CeU Res, 211: 24-35.
Ku, N. O., Zhou, X., Toivola, D. M., et Omary, M. B. 1999. The cytoskeleton of digestive epithelia in health and disease. Am J Physiol, 277: GI108-37.
Lavoie, J. N., Gingras-Breton, G., Tanguay, R. M., et Landry, J. 1993. Induction of Chinese hamster HSP27 gene expression in mouse ceUs confers resistance to heat shock. HSP27 stabilization of the microfilament organization. J Biol Chem, 268: 3420-9.
Lee, M. K. et Cleveland, D. W. 1996. Neuronal intermediate filaments. Annu Rev Neurosci, 19: 187-217.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
76
Leicht, B. G., Biessmann, H., Palter, K. B., et Bonner, J. J. 1986. sman heat shock proteins of Drosophila assoeiate with the cytoskeleton. Proc Nad Acad Sei USA, 83: 90-4.
Liang, P. et MacRae, T. H. 1997. Molecular chaperones and the cytoskeleton. J Cell Sei, 110 (Pt 13): 1431-40.
Liao, J., Ku, N. O., et Omary, M. B. 1997. Stress, apoptosis, and mitosis induce phosphorylation of human keratin 8 ai Ser-73 in tissues and cultured cens. J Biol Chem, 272: 17565-73.
Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., et Omary, M. B. 1995a. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. l Biol Chem, 270: 915-22.
Liao, J., Lowthert, L. A., Ku, N. O., Fernandez, R., et Omary, M. B. 1995b. Dynamics of human keratin 18 phosphorylation: polarized distribution of phosphorylated keratins in simple epithelial tissues. J Cell Biol, 131: 1291-301.
Lindquist, S. et Craig, E. A. 1988. The heat-shock proteins. Annu Rev Genet, 22: 631-77.
Litt, M., Kramer, P., LaMorticella, D. M., Murphey, W., Lovrien, E. W., et Weleber, R. G. 1998. Autosomal dominant congenital cataract assoeiated with a missense mutation in the human alpha crystallin gene CRYAA. Hum Mol Genet, 7: 471-4.
Loranger, A., Duclos, S., Grenier, A., Price, J., Wilson-Heiner, M., Baribault, H., et Marceau, N. 1997. Simple epithelium keratins are required for maintenance of hepatocyte integrity. Am J Pathol, 151: 1673-83.
Lores Arnaiz, S., Llesuy, S., Cutrin, J. c., et Boveris, A. 1995. Oxidative stress by acute acetaminophen administration in mouse liver. Free Radie Biol Med, 19: 303-10.
Lowe, J., McDermott, H., Pike, 1, Spendlove, 1., Landon, M., et Mayer, R. J. 1992. alpha B crystallin expression in non-lentieular tissues and selective presence in ubiquitinated inclusion bodies in human disease. J Pathol, 166: 61-8.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Macejak, D. et Luftig, R. R 1991. Stabilization of actin filaments at early times after adenoviru8 infection and heat-shoeked cens. Virus Res, 19: 31-45.
Magin, T. M., Schroder, R., Leitgeb, S., Wanninger, F., Zatloukal, K., Grund, c., et Melton, D. W. 1998. Lessons from keratin 18 knockout mice: formation of novel keratin filaments, 8econdary 1088 of keratin 7 and accumulation of liver-specifie keratin 8-positive aggregates. J Cell Biol, 140: 1441-51.
Martin, J. et HartI, F. U. 1997. Chaperone-assisted protein folding. CUIT Opin Struct Biol, 7: 41-52.
Maruyama, H. et Williams, G. M. 1988. Hepatotoxicity of chronie high dose administration of acetaminophen to mice. A critical review and implications for hazard assessment. Arch Toxicol, 62: 465-9.
Michaud, S. et Tanguay, R. M. 2003. Expression of the Hsp23 chaperone during Drosophila embryogenesis: association to distinct neural and gliallineages. BMC Dev Biol, 3: 9.
Minota, S., Cameron, B., Welch, W. J., et Winfield, J. B. 1988a. Autoantibodies to the constitutive 73-kD member of the hsp70 family of heat shock proteins in systemic lupus erythematosus. J Exp Med, 168: 1475-80.
Minota, S., Koyasu, S., Yahara, I., et Winfield, J. 1988b. Autoantibodies to the heatshock protein hsp90 in systemic lupus erythematosus. J Clin mvest, 81: 106-9.
MoU, R., Franke, W. W., Schiller, D. L., Geiger, B., et Krepler, R. 1982. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured ceUs. CeH, 31: 11-24.
Morange, M. 2000. Protéines chaperons. Médecine/Sciences, 16: 630-634.
Morimitsu, Y., Sugihara, N., et Furuno, 2004. mhibitory effect of flavonoids on sulfo- and glucurono-eonjugation of acetaminophen in rat cultured hepatocytes and liver subceUular preparations. Biol Pharm Bull, 27: 714-7,
Morimoto, R. I., Kline, M. P., Bimston, D. N., et CoUo, J. J. 1997. The heat-shock response: regulation and function of heat-shock proteins and molecular chaperones. Essays Biochem, 32: 17-29.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
78
Mounier, N. et Arrigo, A. P. 2002. Actin cytoskeleton and small heat shock proteins: how do they interact? Cell Stress Chaperones, 167-76.
Munoz-Marmol, A. M., Strasser, G., Isamat, M., Coulombe, P. A., Yang, Y., Roca, X., Vela, E., Mate, J. L., Coll, J., Fernandez-Figueras, M. T., Navas-Palacios, J. J., Ariza, A., et Fuchs, E. 1998. A dysfunctional desmin mutation in a patient with severe generalized myopathy. Proc Nat! Acad Sei USA, 95: 11312-7.
Nicholl, 1. D. et Quinlan, R. A. 1994. Chaperone activity of alpha-crystallins modulates intermediate filament assembly. Embo J, 13: 945-53.
Nollen, E. A. et Morimoto, R. I. 2002. Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins. J CeU Sei, 115: 2809-16.
Ohta, M., Marceau, N., Perry, G., Manetto, V., Gambetti, P., Autilio-Gambetti, L., Metuzals, J., Kawahara, H., Cadrin, M., et French, S. W. 1988. Ubiquitin 1S present on the cytokeratin intermediate filaments and Manory bodies of hepatocytes. Lab mvest, 59: 848-56.
Omary, M. B. et Ku, N. O. 1997. mtermediate filament proteins of the liver: emerging disease association and functions. Hepatology, 25: 1043-8.
Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., et Price, D. 1998. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro. SubceU Biochem, 31: 105-40.
Omary, M. B., Ku, N. O., et Toivola, D. M. 2002. Keratins: guardians of the liver. Hepatology, 35: 251-7.
Oshima, R. G. 1982. Developmental expression of murine extra-embryonic endodermal cytoskeletal proteins. J Biol Chem, 257: 3414-21.
ParseU, D. A. et Lindquist, S. 1993. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: de gradation and reactivation of damaged proteins. Annu Rev Genet, 27: 437-96.
Pelham, H. R. 1986. Speculations on the functions of the major heat shock and glucoseregulated proteins. CeH, 46: 959-61.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
Pemg, M. Caims, van den, 1. P., PreseoU, A., Hutcheson, A. M., et Quinlan, R. 1999a. mtermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaBcrystallin. J CeU Sei, 112 (Pt 13): 2099-112.
Pemg, M. D., Muehowski, P. J., van Den, 1. P., Wu, G. J., Huteheson, A. M., Clark, J. 1., et Quinlan, R A. 1999b. The cardiomyopathy and lens cataract mutation in alphaBerystallin alters its protein structure, chaperone activity, and interaction with intermediate filaments in vitro. J Biol Chem, 274: 33235-43.
Phillips J., S. P. 1988. The cytosqueleton of the hepatocyte: organisation, relationships, and pathology. In J. W. Edited by Arias lM, Popper H, Schachter D, Shafritz DA. (Ed.), The liver: Biologyand pathobiology: 11-27. New York: Raven press, Ud.
PreseoU, L. E, Roseoe, P., Wright, N., et Brown, S. S. 1971. Plasma-paracetamol halfhfe and hepatic necrosis in patients with paracetamol overdosage. Lancet, 1: 519-22.
Pumford, N. R., Haimes, N. c., Martin, B. M., Cook, R J., Wagner, c., et Hinson, J. A. 1997. Covalent binding of acetaminophen to N-lO-formyltetrahydrofolate dehydrogenase in mice. J Pharmacol Exp Ther, 280: 501-5.
Pumford, N. R, Martin, B. M., et Hinson, J. A. 1992. A metabolite of acetaminophen covalently binds to the 56 kDa selenium binding protein. Biochem Biophys Res Commun, 182: 1348-55.
Quinlan, R et Van Den Ijssel, P. 1999. Fatal attraction: when chaperone tums harlot. Nat Med, 5: 25-6.
Reicks, M., Calvert, R J., et Hatheoek, J. N. 1988. Effects of prolonged acetaminophen ingestion and dietary methionine on mouse liver glutathione. Drug Nutr Interact, 5: 351-63.
Reicks, M. M. et Hathcock, J. N. 1984. Effects of dietary methionine and ethanol on acetaminophen hepatotoxicity in mice. Drug Nutr Interaet, 3: 43-51.
Ritossa, F. 1962. A new puffing pattem induced by temperature shock and DNP in Drosophila. Experimentia, 18: 571-573.
Salminen, W. E, Jr., Roberts, S. M., Fenna, M., et Voellmy, R 1997. Heat shock protein induction in mmine liver after aeute treatment with cocaïne. Hepatology, 25: 1147-53.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
80
Salminen, W. Po, Jr., VoeHmy, R., et Roberts, S. M. 1996. Induction ofhsp 70 in HepG2 cens in response to hepatotoxicants. Toxicol Appt Pharmacol, 141: 117-23.
Salminen, W. Po, Jr., VoeHmy, R., et Roberts, S. M. 1997a. DifferentiaI heat shock protein induction by acetaminophen and a nonhepatotoxic regioisomer, 3'hydroxyacetanilide, in mouse liver. J Pharmacol Exp Ther, 282: 1533-40.
Salminen, W. F., Jr., VoeHmy, R., et Roberts, S. M. 1997b. Protection against hepatotoxicity by a single dose of amphetamine: the potential role of heat shock protein induction. Toxicol Appl Pharmacol, 147: 247-58.
Salminen, W. Po, Jr., Voellmy, R., et Roberts, S. M. 1998. Effect of N-acetylcysteine on heat shock protein induction by acetaminophen in mouse liver. J Pharmacol Exp Ther, 286: 519-24.
Schlesinger, M. J. 1990. Heat shock proteins. J Biol Chem, 265: 12111-4.
Sharp, Po R., Massa, S. M., et Swanson, R. A. 1999. Heat-shock prote in protection. Trends Neurosci, 22: 97-9.
Slavotinek, A. M. et Biesecker, L. G. 2001. Unfolding the role of chaperones and chaperonins in human disease. Trends Genet, 17: 528-35.
Steinert, P. M. 1988. The dynamic phosphorylation of the human intermediate filament keratin 1 chain. J Biol Chem, 263: 13333-9.
Steinert, P. M. et Roop, D. R. 1988. Molecular and cellular bio1ogy of intermediate filaments. Annu Rev Biochem, 57: 593-625.
Stumptner, c., Omary, M. B., Fickert, P., Denk, H., et Zatloukal, K. 2000. Hepatocyte cytokeratins are hyperphosphorylated at multiple sites in human alcoholic hepatitis and in a maUory body mouse model. Am J Pathol, 156: 77-90.
Sugiyama, Y., Suzuki, A., Kishikawa, M., Akutsu, R., Hirose, T., Waye, M., Tsui, S. K., y oshida, S., et 0000, S. 2000. Muscle develops a specifie form of smaH heat shock protein complex composed of MKBPIHSPB2 and HSPB3 during myogenic differentiation. J Biol Chem, 275: 1095-104.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
81
Sumioka, 1., Matsura, T., Kai, M., et Yamada, K 2004. Potential roles of hepatic heat shock protein 25 and 70i in protection of mice against acetaminophen-induced in jury. Lite Sei, 74: 2551-61.
Tissieres, A., Mitchell, H. K, et Tracy, U. M. 1974. Protein synthesis in salivary glands of Drosophlla melanogaster: relation to chromosome puffs. J Mol Biol, 84: 389-98.
Toivola, D. M., Baribault, H., Magin, T., Michle, S. A., et Omary, M. B. 2000. Simple epithelial keratins are dispensable for cytoprotection in two pancreatitis models. Am J rhysiol Gastrointest Liver Physiol, 279: G1343-54.
Toivola, D. M., Omary, M. B., Ku, N. O., Peltola, O., Baribault, H., et Eriksson, J. E. 1998. Protein phosphatase inhibition in normal and keratin 8/18 assembly-incompetent mouse strains supports a functional role of keratin intermediate filaments in preserving hepatocyte integrity. Hepatology, 28: 116-28.
Toivola, D. M., Zhou, Q., English, L. S., et Omary, M. B. 2002. Type II keratins are phosphorylated on a unique motif during stress and mitosis in tissues and cultured cens. Mol Biol CeH, 13: 1857-70.
Tosi, P., Visani, G., Ottaviani, E., GibeHini, D., PeUacani, A., et Tura, S. 1997. Reduction of heat-shock protein-70 after prolonged treatment with retinoids: biological and clinical implications. Am J Hematol, 56: 143-50.
Tsoulfa, G., Rook, G. A, Bahr, G. M., Sattar, M. A., Behbehani, K, Young, D. B., Mehlert, A, Van-Embden, J. D., Hay, E c., Isenberg, D. A., et et al. 1989a. Elevated IgG antibody levels to the mycobacterial 65-kDa heat shock protein are characteristic of patients with rheumatoid arthritis. Scand J Immunol, 30: 519-27.
Tsoulfa, G., Rook, G. A, Van-Embden, J. D., Young, D. B., Mehlert, A., Isenberg, D. A, Hay, E c., et Lydyard, P. M. 1989b. Raised serum IgG and IgA antibodies to mycobacterial antigens in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 48: 118-23.
Valiron, O., Caudron, N., et Job, D. 2001. Microtubule dynamics. Cell Mol Life Sei, 58: 2069-84.
van den Ijssel, P., Norman, D. G., et Quinlan, R. A. 1999. Molecular chaperones: smaU heat shock proteins in the limelight CUIT Biol, 9: R103-5.
Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.
82
Vassar, R., Coulombe, P. A., Degenstein, L, Albers, K, et Fuchs, E. 1991. Mutant keratin expression transgenic mice causes marked abnormalities resembling a human genetic skin disease. CeU, 64: 365-80.
Vicart, P., Caron, A., Guicheney, P., Z., Prevost, M. C., Faure, Chateau, D., Chapon, F., Tome, F., Dupret, J. M., Paulin, D., et Fardeau, M. 1998. A missense mutation in the alphaB-crystallin chaperone gene causes a desmin-related myopathy. Nat Genet, 20: 92-5.
Walter, S. et Buchner, J. 2002. Molecular ehaperones--cellular machines for protein folding. Angew Chem In! Ed Engl, 41: 1098-113.
Weller, N. K 1988. A 70 kDa mierorubule-associated protein in NIL8 cells comigrates with the 70 kDa heat shock protein. Biol Cell, 63: 307-17.
Whitley, D., Goldberg, S. P., et Jordan, W. D. 1999. Heat shoek proteins: a review of the moleeular chaperones. J Vase Surg, 29: 748-51.
Winfield, J. B. 1989. Stress proteins, arthritis, and autoimmunity. Arthritis Rheum, 32: 1497-504.
Wismewski, T. et Goldman, J. E. 1998. Alpha B-crystallin 1S associated with intermediate filaments in astrocytoma cells. Neurochem Res, 23: 385-92.
Yamada, S., Wirtz, D., et Coulombe, P. A. 2002. Pairwise assembly determines the intrinsic potential for self-organization and mechanical properties of keratin filaments. Mol Biol Cell, 13: 382-91.
Yokoo, H., Harwood, T. R, Racker, D., et Arak, S. 1982. Experimental production of Mallory bodies in mice by diet containing 3,5-diethoxycarbonyl-l,4-dihydrocollidine. Gastroenterology, 83: 109-13.
Yoon, K H., Yoon, M., Moir, R. D., Khuon, S., Flitney, F. W., et Goldman, R. D. 2001. Insights into the dynamic properties of keratin intermeruate filaments in living epithelial cells. J Cell Biol, 153: 503-16.
Zhao, P. et Slattery, J. 2002. Effects of ethanol dose and ethanol withdrawal on rat liver mitoehondrial glutathione: implication of potentiated acetaminophen toxicity in alcoholics. Drug Metab Dispos, 30: 1413-7.
top related