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Un modèle de régulation -la répression catabolique
et l’opéron lac chez Escherichia coli
cours de Guennadi SEZONOV
BMC421 - 2009
http://
Les diapos du cours en couleur peuvent être téléchargées sur :
les enseignants de BMC421/2009
Céline Fabret
Pierre-Louis Blaiseau
Claude Gerbaud
Guennadi Sezonov
Céline Fabret
Pierre-Louis Blaiseau
Claude Gerbaud
Guennadi Sezonov
La lecture conseillée
Introduction
de l’adaptation enzymatique au principe de régulation de l’expression des gènes chez les bactéries
J Monod à l’Institut Pasteur
1946-1947 Participe avec A. Lwoff à deux congrès de Cold Spring Harbor qui vont marquer l'orientation de sa carrière. en 1946, où il prend connaissance des travaux de Beadle et Tatum sur la reproduction de Neurospora et de leur hypothèse d'une relation entre gènes et enzymes et,en 1947, le 11th Growth Symposium où il donne une conférence intitulée : The phenomenon of enzymatic adaptation
Le phénomène d’adaptation enzymatique – les bactéries sont intelligentes !!
Certaines enzyme apparaissent dans les cellules seulement en présence de leurs substrats.
Ce phénomène a été baptisé par J. Monod « adaptation enzymatique »
maximumjusqu’à 60.000 molécules par cellule
minimum 5-10 molécules par cellulesans induction « la fuite »
enzyme inductible
Le phénomène de la diauxie – E. coli choisit son sucre
croissance bi-phasiquedans le milieu contenant le glucose et le lactose
Diauxie
1959 – le modèle de l’opéron lactose de F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff
1 – postule l’existence des gènes régulateurs et des gènes de structure;
2 – constate que les gènes peuvent former des unités de régulation et de transcription - OPERONS
3 – explique la nature (protéine) et le principe de l’action du répresseurLacI – notion de l’OPERATEUR; du PROMOTEUR et de l’INDUCTEUR
F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff – Prix Nobel 1965
- opéron- opérateur- promoteur- répresseur- inducteur
Partie 1
l’opéron lac revisité
Opéron – définition du terme et principaux éléments structuraux
A B C D
promoteur
operateur
Opéron – une unité de régulation et de transcription composée de plusieurs gènes placéssous contrôle du même promoteur
Les éléments structuraux d’un opéron incluent :
- un promoteur et un terminateur de transcription- les gènes structuraux- une région régulatrice appelée opérateur
terminateur
Opéron lactose – la position
7,8 min
carte génétique
7,8 min
lacZ lacY lacAlacIséquences régulatrices PlacI
3075 pb 1254 pb 612 pb1083 pb
gènes
Opéron lactose – la position, les gènes
carte génétique
7,8 min
lacY lacAlacIPlacI
3075 pb 1254 pb 612 pb1083 pb
ARNm polycistronique lacZYA- sa demi-vie est de 3 minARNm lacI
ARNm
lacZséquences régulatrices
gènes
Opéron lactose – la position, les gènes , les ARNm
carte génétique
7,8 min
lacY lacAlacIPlacI
3075 pb 1254 pb 612 pb1083 pb
b- galactosidasedemi-vie 5 heures
b-galactoside perméase
b-galactosidetransacétylaserépresseur LacI
protéines
ARNm polycistronique lacZYA- sa demi-vie est de 3 minARNm lacI
ARNm
lacZséquences régulatrices
gènes
Opéron lactose – la position, les gènes , les ARNm et les protéines
carte génétique
La régulation de la transcription de l’opéron lac – vision simplifiée
Deux états de l’opéron lactose sont régulés par le répresseur LacI
Fermé- en l’absence de lactose
Ouvert - en présence du lactose
L’état « fermé » est assuré par LacI en l’absence de lactose
inhibition par LacI de l’initiation de la transcriptionpar l’ARN polymerase
le tétramère LacI, la forme active du répresseur
ARN polymérase
REPRESSION
En présence du lactose le répresseur est inactivé par un inducteur - allolactose
l’opéron est induit
changement de conformation de LacI
inducteur
lac est faiblement exprimé même sans lactose- la « fuite » de l’opéron
entrée du lactoseet induction de l’opéron
opéron lac pleinement induit
il n’y a plus de lactose le répresseur « ferme » l’opéron lac
opéron lacfortement réprimé
lactose devient disponible
Le cycle d’induction et de répression de l’opéron lac
le défaut du modèle lac simple –
le modèle n’explique absolument pas la croissance diauxique
Partie 2
les propriétés des protéines codées par l’opéron lac et le gène lacI
LacZ – b -galactosidaseLacY - b-galactoside perméaseLacA - thiogalactosidetransacétylase
LacI - répresseur transcriptionnel
-réactions enzymatiques-substrats -phénomène de l’a-complémentation
b-galactosidase LacZ
Les réactions enzymatiquesde la b galactosidase
C4C6
– isomérisation du lactose
– clivage en Gal et Glu
La structure de la b-galactosidase: un tétramère portant un ion de Mg2+
Mg2+
monomère tétramère
b-galactosides Substrat Inducteur
lactose,
allolactose+ +
métabolisable
Xgal
(chromogène) + -
IPTG - +non métabolisable
ONPG
(chromogène)+ -
glucose, maltose - -
Résumé:b galactosidase– les substrats et les inducteurs
Inducteur métabolisableallolactose
Inducteur non- métabolisableou « gratuit » - IPTG
Les inducteurs de l’opéron lac
ONPG - dosage enzymatique de la b-galactosidase dans un milieu liquide
ONPG – nitrophényle-galactoside non coloré
galactose +ONP (jaune)
lac-
-LB + Xgal
- MacConkey
- M63 lactose
Les phénotypes Lac+ et Lac- sur différents milieux de croissance
Visualisation de l’activité enzymatique de la b-galactosidasedans un milieu solide contenant X-Gal
X-Galbromo- 5- chloro-4-indolyl- b– D - galactoside
Lac- Lac+ Lac+
peu de colonies beaucoup de colonies
blanches bleues bleues
Réactions chimiques avec le X-Gal produisant la coloration bleue
nécessite l’oxygène
indigo
Le milieu MacConkey: la fermentation qui donne la coloration
Souche lac+
Souches lac-
[MK avec les oligopeptides] +lactose
Souche lac+
un colorant sensible au pH
Le milieu M63 (milieu minimum)+ lactose
une souche Lac+ une souche Lac-
dans ce milieu, le lactose est la seule source de carbone
L’opéron lac et les mutants lacZ-
sauvage lac+
+ + +
mutation non polaire (ex. ponctuelle)
- + +
mutation polaire (insertion d’un Tn)
- - -
effet polaire
La complémentation a
1025 aa
985 aa
40 aa
LacZ+ Lac+
11-40 aaN-terminale Lac-fragment w
N C
40 aa (fragment a) Lac-
985 aa 40 aa+???
La complémentation a
1025 aa
985 aa
40 aa
LacZ+ Lac+
11-40 aaN-terminale Lac-fragment w
N C
40 aa (fragment a) Lac-
Dans un diploïde
plasmide avec le fragment a
Lac+
w
achromosome avec le fragment w
Complémentation a - interaction non covalente entre les deux fragments
fragment w
fragment a
La complémentation a - les vecteurs de clonage
Le gène lacZ comme un gène rapporteur… chez les eucaryotes
Exemple 2: embryogenèse chez la Drosophile
Exemple 1: embryogenèse chez la souris
LacY - b-galactoside perméase -la protéine qui transporte le lactose
LacY – une protéine intégralement transmembranaire
12 hélices transmembranairesde LacY
La fonction de la protéine LacY – une perméase des b galactosides
- transporteur du lactose
-LacY sauvage transporte également le mélibiose (glucose a D-galactoside)
-LacY* - une forme mutée de LacY est capable de transporter le maltose
Le mécanisme de Lactose/H+ symport
b-galactosides transportés
obligatoirement
par LacY
rentrent par
d’autres voies
indépendamment de
LacY
lactose + -
Xgal - +
IPTG - +
glucose - -
mélibiose +
37°C et 43°C
+ à 37°C
- à 43°C
Perméase LacY – les substrats (résumé)
Répresseur transcriptionnel LacI
Le répresseur LacI agit comme tétramère
-domaine de fixation à l’ADN
-domaine de fixation de l’inducteur
domaine d’oligomérisation
une séquence répétée inverséecomme pour beaucoup de protéines régulatrices se fixant à l’ADN
LacI – le site de liaison à l’ADN reconnu dans l’operateur lac
3 séquences opératrices de l’opéron lac
lacZ lacY lacAlacIpromoteur
PlacI
O1+11
O2+412
O3-82
formation d’une boucle d’ADN
O3O1
La répression par LacI nécessite la présence de trois opérateurs
TD1
LacI – un obstacle stérique pour l’ARN pol
~40 molécules de LacIpar cellule =10 tétramères
Le répresseur LacI – l’action de l’inducteur
Un peu de génétique…
les mutations lacI-, lacIS et lacOC
Mutation lacI-
en l’absence de LacI fonctionnelle, l’opéron lac est exprimé de façon constitutive
transcription
c’est une mutation recessive
Mutation lacIS
LacIS ne peut pas se lier à l’inducteur
l’opéron lac est réprimé de façon constitutive
c’est une mutation dominantenegative
Mutation OC
LacI ne se fixe plus sur son operateurl’opéron lac est exprimé de façon constitutive
c’est une mutation dominante
Conclusion:
le phénotype « Lac constitutif » peut êtreobservé à la suite des mutations qui touchent des site distincts
- soit le gène lacI- soit l’operateur o
Réfléchir sur la distinction entre les deux cas
Régulation de l’expression du gène lacI
Comment les ribosomes terminent la traduction de l’ARNm lacI tronqué?
Les principales étapes de la traduction
releasing factors
l’action de SsrA – un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les mARN sans codon STOP
P A
l’action de SsrA – un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les mARN sans codon STOP
P A
La structure de l’ARN SsrA
l’action de SsrA – un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les mARN sans codon STOP
P A
La structure de l’ARN SsrALe rôle de la protéine SmpB
SsrA – un ARN trans-messagerqui sauve la traductiond’un ARNm sans codon STOP
P A
Régulation de l’expression du gène lacI – SsrAtmARN
SsrA tag –AANDENYALAA11 aa peptide
TD3
Partie 3
l’opéron lac et la répression catabolique
pourquoi en présence de lacose+glucose l’opéron lac ne s’exprimera pas??
maximumjusqu’à 60.000 molécules par cellule
minimum 5-10 molécules par cellulesans induction « la fuite »
enzyme inductible
Cette régulation s’explique parfaitement bien par l’action de LacI
??????????????????????????????????
Quelle que soit la proportion entre les deux sucres les bactéries ne se trompent pas
le phénomène de diauxie
La synthèse de la b-galactosidase ne commence que en phase lag apresla consommation du glucose
b-gal
unités de b-galDO
glucose lactose
La répression catabolique (la préférence pour le glucose)
– un phénomène général
Repression Catabolite(glucose)
catabolic operons
LactoseMaltose
Arabinose
Rhamnose
SymbiosisCentral metabolismVirulenceMotilityNitrogen utilizationChemotaxis
5%-10% of all bacterial genes!!!!
flux de phosphates
le transportdes glucidesest couplé à leur phosphorylation
non spécifique
spécifique
histidineprotèine
enzyme I
La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose
-la forme non phosphorylée de EIIA-Glu est majeure -si le glucose est présent
- la forme phosphorylée de EIIA-Glu s’accumule si le glucose est absent
La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose
-la forme non phosphorylée de EIIA-Glu est majeure si le glucose est présent et transporté
-Cette forme bloque l’activité du transporteur LacY. -Le lactose ne rentre pas – c’est « l’exclusion de l’inducteur »-l’opéron lac reste réprimé par le répresseur LacI
X
lactose
La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose
-la forme phosphorylée de EIIA-Glu est majeure si le glucose est absent
-lactose est transporté par LacY
-la répression par LacI est levée mais l’opéron lac s’exprime seulement siune autre protéine , CRP, est présente et activée
X lactose
La protéine EIIAGlu est le senseur principal de la présence du glucose
X lactose
adenylatecyclase
catabolite répresseur protéine
opéron lactosed’autres gènes régulés par la répression catabolique
Les deux conformations de CRP – activateur transcriptionneml
se fixe à l’ADN en présence de l’AMPc
incapable de se lier à l’ADN sans soneffecteur AMPc
L’adénylatcyclase catalyse la synthèse de l’AMP cyclique (AMPc) à partir de l’ATP
l’adénylatecyclase est codée par le gène cyaA
sans AMPc
avec AMPc
en présence de glucosel’adenylate cyclase n’est pas activée
X
lactose
adenylatecyclase
catabolite répresseur protéine
XX
X lactose
adenylatecyclase
catabolite répresseur protéine CRP
opéron lactose???? quel cible?
en l’absence de glucosel’adenylate cyclase est activéeet la forme active CRP est presente
AMPc
CRP activée
transcription par RNApol
répresseur LacI inactif
promoteur lac
operateur lac libresite de fixationde CRP
La double régulation de l’opéron lac– activation par CRP et répression par LacI
en présence du lactose et en l’absence de glucoseCAP+AMPc active la transcription de l’opéron lac
La position du site de fixation de CAP dans le promoteur de l’opéron lac
Quel est le rôle de CRP dans la régulation de l’opéron lac?
1 - c’est un activateur transcriptionnel
2 – son rôle n’est pas accessoire, sans CRP l’opéron lac n’est pas transcrit
Le mécanisme d’action de CAP
promoteur canonique-35 -10
TTGACA TATAAT
promoteur lacTTTACA TATGTT
promoteur lacUV5 indépendant de CAPTATAAT
sans CAP le complexe ouvert ADN/ARNpol n’est pas stable
T69T79G61A56C54A54 -- 161717431817 -- T77A76T60A61A56T82
-61 +1
opérons lactose, arabinose opéron galactose-50
ARNPol.alfa
4 états de l’opéron lac - état 1
4 états de l’opéron lac - état 2
4 états de l’opéron lac - état 3
Double verrouillage en l’absence de lactose et en l’absence de glucose
CAP favorise la formation d’uneboucle de 93pb
-82 +11
LacItétramère
CAP
4 états de l’opéron lac - état 4
Comment le glucose activela répression catabolique?
Modèle 1 – inhibition de l ’activité de l’AMP cyclique par EIIA-Glu
variation de la concentration de l’AMPc
Modèle 2 – inhibition de l ’activité de la lactose perméase (exclusion de l’inducteur) par le système PTS
X
TD4
TD5
EIIBC
sans action de CRP sur le gène ptsGil n’a pas de répression catabolique
TD6
Inhibition de l’entrée du lactose… par le lactose lui-même
Troisième clef de la régulation???
TD7
Comment EIIA-Glu agit sur l’adénylate cyclase
Partie 4
X opéron lactose
Combien de gènes lacZ chez E. coli ?
étalerlacZlacY+ lacA+ sur milieu minimum+lactose
pas d’activitéb-gal autre que codée par lacZ
il existe une autreactivité b-gal
soit soit
http://genolist.pasteur.fr/Colibri/
ebgA– « evolved » beta galactosidase
l’opéron lac est faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur – LA FUITE
Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?
La fuite transcriptionnelle de l’opéron lac ou le paradoxe d’une régulation parfaite
avec la fuite
-après une longue absence le lactoseest ajouté dans le milieu
- les bactéries possèdent toujours quelques molécules de LacY et LacZpour transporter le lactose et produirel’inducteur - allolactose
- l’induction du système est donc possible;l’opéron lac s’exprime; le lactose estmassivement transporté et consommé
opéron lacest faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur
Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?
sans fuite
La fuite transcriptionnelle de l’opéron lac ou le paradoxe d’une régulation parfaite
avec la fuite
-après une longue absence, le lactoseest ajouté dans le milieu
- les bactéries possèdent toujours quelques molécules de LacY et LacZpour transporter le lactose et produirel’inducteur - allolactose
- l’induction du système est donc possible;l’opéron lac s’exprime; le lactose estmassivement transporté et consommé
lac est faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur
Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?
sans fuite
-aucune molécule LacY n’est présente dans la bactérie;
-le lactose ne rentre pas -l’opéron lac n’est pas induit
-pire encore, l’opéron lac ne peut jamais être induit
- E. coli meurt de faim en baignant dans le lactose
-après une longue absence le lactoseest ajouté dans le milieu
La fuite transcriptionnelle de l’opéron lac ou le paradoxe d’une régulation parfaite
Et le gène lacA?
Acetyl-CoA
Thiogalactosidetransacetylaseest capable d’acétyler des b-galactosides non métabolisables pour les détoxifier et de les éliminer des cellules. Ses substrats naturels sont inconnus.
Acetyl-CoA + isopropylb-D-thiogalactoside
CoA + acetylatedisopropylb-D-thiogalactoside
L’opéron lactose est-t-il là pour assurer la dégradation du lactose?
- peu de lactose dans le tract digestif des adultes
- le lactose n’est pas l’inducteur direct de l’opéron lac
- beaucoup de b-galactosides sont libérés pendant la digestion des plantesLes membranes des chloroplastes contiennent beaucoup de b-galactosyl-glycérol
-b-galactosyl-glycérol est à la fois un substrat de la b-galactosidase et un très fort inducteur de l’opéron lac
le gènes lac ont été transférés dansle génome d’E. coli par le transfert horizontal
les gènes lacI et lacZ n’ont pas le même% de GC que lacYA.L’opéron lac à été rassemblé des sources différentes.
Partie 5
Travaux pratiques BMC421: les principales expériences
Les principaux buts de ces TP
- identifier les génotypes d’une collection de mutants par les approchesphénotypiques, par le dosage de la b-galactosidase et par l’analyse à l’aide dela PCR
les gènes visés - lacZ, lacY, lacA, lacI, cya, crp
- lacA – a –t –il un rôle dans la catabolisme du lactose?
- le mutant cya, peut il être sauvé par l’ajout de l’AMPc exogène?
-peut on « sauver » ces mutants cya- par un milieu de culture d’une souche lac+(bio feeding)?
- la fuite de l’opéron lac en l’absence de lactose, existe-t- il vraiment?
Les principaux buts de ces TP
- construire par la transduction avec le bactériophage P1 et à partir de simplesmutants lacI-::CmR et cyaA::Km un double mutant lacI::Cm cyaA-.
Question posée – quel sera le phénotype de ce mutant en l’absence à la fois de larégulation positive et de la régulation négative
AMPc
CRP activée
transcription par RNApol
répresseur LacI inactif
operateur lac libresite de fixationde CRP
X
X
Les principaux buts de ces TP
construire par l’approche de génétique inverse les mutants knock-out pour les gènescrr, ptsG, ptsH, cya ou crp. Analyse moléculaire de ce mutants.
- étudier par le dosage de l’activité de la b galactosidase le phénotype de ces mutants pour déterminer si l’effet de glucose est toujours observable et si le rôle de crp et de cya est vraiment important
ptsG
crr
ptsH
crp
cya
Délétion propre par la recombinaison homologue avec un fragment linéaire
courte région de homologuel’extrémité 5’ du gène
5’ 3’cassette de remplacement
recombinaison homologue
mutant lacA::KmR
lacY lacA cynX
KmR
lacY cynX
X X
courte région de homologuel’extrémité 3’ du gène
lacA::KmR
TD7
Les principaux buts de ces TP
-- analyser directement la quantité de l’ARMm produit dans le mutant dérépriméLacI- et comparé avec la souche sauvage (RT-PCR)
Les principaux buts de ces TP
La lecture critique et la discussion de 7 articles scientifiques pour
-mieux comprendre le sujet-comparer vos résultats avec les résultats publiés par des chercheurs chevronnés
TD1TD2
TD3TD4
TD5TD6
TD7
fin
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