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1
THÈSE Présentée pour obtenir le Diplôme de
Doctorat d’Etat Es-Sciences Biologiques
Présentée par
Nom et Prénom : Fassi Fihri Aicha
Discipline : Biologie Spécialité : Biotechnologie Titre :
Collecte et maturation des ovocytes bovins : effet de l’état nutritionnel sur le rendement
et la qualité des ovocytes Soutenue le 28 Mars 2006 Devant le jury, Président : Mr. Benjelloun W. (Doyen, de la la Faculté des Sciences de Rabat) Examinateurs : Mme. Hajji Kh. (Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat) Mr. Derqaoui L. (Professeur à l’Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, Rabat) Mr. Lakhdissi H. (Professeur à l’Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, Rabat) Mme. Kharbach A. (Professeur, Directeur de la maternité du Centre Hospitalier et Universitaire du
Souissi, Rabat) Mr. Tahri-Joutei A. (Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat)
2
Avant Propos Le présent travail a été réalisé sous la codirection de Mme Khadija Hajji,
Professeur au laboratoire de Zoologie et de Biologie Générale de la Faculté des
Sciences de Rabat et de Mr Hassan Lakhdissi, Professeur au Département de
Reproduction Animale, d’Obstétrique et d’Insémination Artificielle de l’Institut
Agronomique et Vétérinaire Hassan II, Rabat.
J’adresse mes vifs remerciements à Mme le Professeur Khadija Hajji de
m’avoir introduit dans ce domaine passionnant. Elle a toujours porté un intérêt
particulier et suivi de près toutes les étapes de réalisation de ce travail.
C’est grâce au projet P.A.R.S. (Biol, 102) qui est sous sa direction que ce
travail a pu être lancé. Qu’il me soit permis de lui exprimer mes sincères et
profondes reconnaissances.
Monsieur le Professeur Hassan Lakhdissi a eu l’amabilité de me proposer ce
sujet et de m’accorder une place au sein du Département de Reproduction
Animale, d’Obstétrique et d’Insémination Artificielle de l’Institut Agronomique
et Vétérinaire Hassan II. Il a suivi pas à pas et avec beaucoup de patience
l’évolution de mon travail, évolution facilitée par ses conseils très utiles, ses
discussions enrichissantes.
Il m’a toujours accordé un encadrement attentionné. Sans son aide, sa
générosité, ses conseils, ses critiques permanentes lors de la rédaction des
articles et de la thèse, ce travail n’aurait pas pu voir le jour.
Je suis sensible au dévouement de Monsieur Lahsen Derqaoui, Professeur au
Département de Reproduction Animale, d’Obstétrique et d’Insémination
Artificielle de l’Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II.
Monsieur le Professeur Lahsen Derqaoui a porté un intérêt particulier pour
cette étude, ses efforts, ses directives et le temps précieux qu’il m’a consacré
pour la réalisation de ce travail malgré ses multiples occupations. Son
3
expérience, sa compétence et ses conseils très enrichissants m’ont énormément
facilité la tache. Qu’il me soit permis de lui exprimer mes sincères et profondes
reconnaissances.
J’adresse mes vifs remerciements au Professeur Wail Benjelloun, Doyen de la
Faculté des Sciences de Rabat, pour avoir accepté de juger ce travail.
Je suis très sensible à l’honneur que vous me faites en acceptant de présider
mon jury de thèse. Veuillez trouver ici, Monsieur le Doyen, l’expression de
notre sincère gratitude.
Je tiens aussi à remercier le Professeur Abderrafih Tahri-Joutei, Professeur à
la Faculté Des Sciences de Rabat pour avoir accepter de juger ce modeste
travail.
Mes remerciements s’adressent aussi au Professeur Aicha Kharbach, Directeur
de la maternité du centre Hospitalier et Universitaire du souissi, Rabat, qui a
accepté d’être parmi les membres de jury de cette thèse.
Ces presque huit ans furent comme toujours longues et courtes à la fois. De
nombreuses personnes ont, à un moment ou à un autre, intervenu dans le cours
des événements qui ont peu à peu conduit à l’élaboration de ce travail.
Un grand merci à Mme Mariam Naciri Professeur au laboratoire de Zoologie
et de Biologie Générale de la Faculté des Sciences de Rabat, puisse ce travail
être le témoignage de notre longue amitié.
J’exprime ma profonde gratitude et mon profond respect à Mr Mohamed El
Hamidi, Professeur au Département d’Histologie et Anatomie pathologique de
l’Institut Agronomique et Vétérinaire Hassane II, pour sa collaboration et sa
générosité.
4
Mes remerciements à Messieurs Zaid Zouagui Professeur au Département de
Pathologie Médicale et Chirurgicale des ruminants et Mr. Abdelouahed Bassir
du même département.
Je remercie tous les membres du Département de Reproduction, d’Obstétrique
et d’insémination artificielle, particulièrement Pr. Mazouz A., Pr. Sghiri A.
Medames Faraj R., El Idrissi N. Messieurs, Zaizaa B., Bennani M. et Bouhila
A.
Un grand merci au professeur Mohamed Oukessou, chef du département de
Physiologie et Thérapeutique à l’IAV Hassan II (Rabat), pour avoir bien voulu
m’accueillir au sein de son département, pour ses conseils et ses directives qui
m’ont été d’un grand intérêt. Je remercie également tous les enseignants du
Département pour leur sympathie particulièrement le Professeur El Guerouali
A., Messieurs Suilah S. et Ablouh.
J’adresse mes vifs remerciements à Mr le Professeur Sefiani, chef du
Laboratoire de Génétique de l’Institut d’Hygiène, qui a bien voulu m’accueillir
au sein de son laboratoire et où j’ai pu faire les premières cultures cellulaires.
Je remercie également tous les chercheurs et les médecins du laboratoire pour
leur sympathie.
Mes remerciements s’adressent également à mes collègues et amies du
Laboratoire de Zoologie et de Biologie Générale de la Faculté des Sciences de
Rabat pour l’aide qu’ils m’ont apportée à divers titres, tout particulièrement,
Mmes Benazzou Touria, Kadiri Zineb, Zouiten habiba, Benmessaoud Fatma,
Kourradi Rhita et Mr Benhoussa Aziz.
5
Je ne saurai terminer ce préliminaire sans évoquer l’appui moral et la
sollicitude que j’ai trouvés auprès de ma mère, mon père, mon mari et mes
enfants, Hassnae, Omar et Zainab. C’est à eux que revient le grand mérite.
6
INTRODUCTION GÉNÉRALE ....................................................................................13
Première Partie : SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I : Caractéristiques de la reproduction chez la vache...................17
I/ Développement embryonnaire des ovaires ...............................................17
1/ Constitution et régulation du stock de follicules
Primordiaux.........................................................................................18
2/ La folliculogenèse................................................................................18
3/ Aspects morphologiques de la croissance folliculaire............................20
3.1/ Les follicules pré-antraux.........................................................21
3.2 / Les follicules à antrum............................................................21
4/ Entrée en méiose.................................................................................24
II / Puberté......................................................................................................................24
III/ Cycle sexuel..............................................................................................................25
1/ Composante anatomique........................................................................28
1.1/ Vagues folliculaires.......................................................................28
1.2/ Croissance et maturation de l’ovocyte........................................... 29
1.2.1/ Croissance de l’ovocyte.......................................................29
1.2.2/ Maturation de l’ovocyte.......................................................30
a/ Aspects cytologiques de la maturation des ovocytes.................31
a.1/ Rupture de la vésicule germinale.........................................31
a.2/ Condensation des chromosomes...........................................31
a.3/ Formation du fuseau chromosomique...................................31
a.4/ Passage et arrêt en métaphase II...........................................31
a.5/ Maturation cytoplasmique....................................................32
b/ Aspects moléculaires de la maturation de l’ovocyte...................32
1.3/ Ovulation........................................................................................ 33
1.4/ Corps jaune......................................................................................34
2/ Composante hormonale............................................................................35
2.1/ Hormones hypothalamiques..............................................................35
2.2/ Gonadotrophines hypophysaires, (FSH et LH)......................………...36
2.3/ Hormones ovariennes........................................................................37
2.4/ Autres hormones...............................................................................37
7
a/ Prostaglandines..............................................................................37
b/ Ocytocine......................................................................................38
2.5/ Régulations hormonales ...................................................................38
a/ Contrôle de la sécrétion de la GnRH.................................................38
b/ Contrôle de la sécrétion de LH et de FSH..........................................39
3/ Composante comportementale...................................................................40
3.1/ Saisonnalité......................................................................................40
3.2/ Œstrus..................................................................................40
Chapitre II : Facteurs de variation de la production des ovocytes et de leur
qualité...........................................................................................42
I/ Facteurs endogènes.........................................................................................42
1/ Race ............................................................................................................42
2/ Age .............................................................................................................42
3/ Etat physiologique........................................................................................43
4/ Phase du cycle..............................................................................................43
II/ Facteurs exogènes :………………………………………………………………...44
A. Nutrition......................................................................................................44
1/ Déficit énergétique.......................................................................................44
1.1/ Mode d’action du déficit énergétique....................................................45
1.2/ Déficit énergétique et établissement de la puberté :
Rôle de la leptine..................................................................................46
1.3/ Déficit énergétique et croissance folliculaire........................................47
1.4/ Déficit énergétique et composante hormonale.......................................48
1.5/ Indicateurs de la modification du statut énergétique..............................51
a/ B.C.S. (Body Condition Score ou note de l’état corporel)................51
b/ Paramètres métaboliques.................................................................52
2/ Excès protéiques..........................................................................................53
2.1. Mode d’action d’un excès protéique.....................................................54
2.2. Indicateurs sériques du métabolisme azoté...........................................55
a/ Les protéines totales........................................................................55
8
b/ L’albumine......................................................................................55
c/ L’urée..............................................................................................55
3/ Vitamines et Minéraux.................................................................................56 a/ Vitamines........................................................................................56
b/ Minéraux........................................................................................57
B. Stress et maladies intercurrentes.................................................................58
Chapitre III : Collecte et maturation des ovocytes.............................................59
I/ Facteurs de variation du rendement de la collecte des
ovocytes...........................................................................................59
1/ Disposition des follicules dans
le cortex ovarien (facteur endogène) ......................................................59
2/ Technique de collecte (facteur exogène) ...................................................59
II/ Maturation des ovocytes in vitro..................................................................60
1/ Le milieu de base.....................................................................................60
2/ Hormones................................................................................................61
Deuxième Partie : MATÉRIEL ET METHODES
I/ Conditions pluviométriques des années 1999 et 2000.....................................63
II/ Animaux de l’étude.......................................................................................63
III/ Protocole expérimental................................................................................66
1/ Détermination de l’âge...............................................................................66
2/ Note de l’état orporel................................................................................66
3/ Prélèvement des ovaires ...........................................................................67
4/ Etude histologique des coupes d’ovaires...................................................67
a. Préparation des coupes histologiques pour
microscopie photonique........................................................................67
b. Méthode d’évaluation de la population folliculaire...............................68
5/ Prélèvements sanguins..............................................................................68
6/ Les méthodes de dosage des Protéines totales, albumine, urée,
β-OH et A.S.A.T......................................................................................69
7/ Ponction des follicules et collecte des ovocytes.........................................69
a. Ponction des follicules…………………………………………………....69
9
b. Collecte des ovocytes……………………………………………………..69
c. Composition du milieu de collecte……………………………………….69
8/ Evaluation morphologique de la qualité des ovocytes ................................69
9/ Maturation des ovocytes In Vitro (M.I.V.)...................................................70
a. Composition du milieu de maturation...................................................70
b. Mise en culture.....................................................................................70
IV/ Analyses statistiques..........................................................................................70
Troisième Partie : RESULTATS
Chapitre I : Population folliculaire et rendement en ovocytes............................73
I/ Population folliculaire ..................................................................................73 II/ Rendement en ovocytes et leur taux de maturation.....................................74
Chapitre II : Exploration histologique de l’ovaire. .............................................77
I/ Structure de l’ovaire....................................................................................77
II/ Evaluation de la population folliculaire......................................................79
Chapitre III : Effet des paramètres génétiques et non génétiques sur la
population folliculaire et le rendement en ovocytes....................81
I/ Résultats descriptifs....................................................................................81
1/ Race, âge et B.C.S......…………………………………………………………81
a/ Race...................................................................................................81
b/ Age....................................................................................................81
c/ Etat corporel (B.C.S.) ........................................................................81
2/ Paramètres sanguins..................................................................................83
3/ Corrélations entre les différents paramètres ..............................................85
a/ B.C.S –Age...........................................................................................85
b/ B.C.S. – Race.......................................................................................85
c/ Race – Age...........................................................................................86
d/ Race – Urémie......................................................................................87
e/ Race- β-OH….......................................................................................87
f/ Les protéines totales..............................................................................90
10
g/ L’albumine...........................................................................................90
h/L’A.S.A.T.............................................................................................................90
II/ Résultats analytiques...........................................................................................92
1/ Nombre de follicules....................................................................................92
1.1/ Effet de la race ..........................................................................93
1.2/ Effet de l’âge .............................................................................93
1.3/ Effet du B.C.S. ..........................................................................93
1.4/ Effet des paramètres biochimiques..............................................96
a/ Taux d’albumine sérique .........................................................96
b/ La protéinémie.........................................................................96
c/ L’urémie..................................................................................96
d/ Taux sérique de β-OH..............................................................97
2/ Rendement en ovocytes..................................................................................98
2.1/ Effet de la race ..........................................................................99
2.2/ Effet de l’âge .............................................................................99
2.3/ Effet B.C.S.................................................................................99
2.4/ Effet des paramètres biochimiques.............................................102
a/ Taux d’albumine sérique .......................................................102
b/ La protéinémie ....................................................................102
c/ L’urémie ..............................................................................102
d/ Taux sérique de β-OH ..........................................................103
3/Qualité des ovocytes........................................................................................................104
3.1/ Effet de la race, de l’âge et de l’état corporel............................104
3.2/ Effet des paramètres biochimiques ...........................................107
a/ Taux d’albumine sérique .....................................................107
b/ La protéinémie ...................................................................108
c/ L’urémie .............................................................................108
d/ Taux sérique de β-OH .........................................................109
Quatrième Partie : DISCUSSION ET CONCLUSION GÉNÉRALE.................112
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................125
11
ANNEXES.........................................................................................................148 TRAVAUX SCIENTIFIQUES…...………………………………………………….162 RÉSUMÉ………………………………………………………………………………..163
12
INTRODUCTION
GENERALE
13
Le secteur de l’élevage constitue l’une des composantes majeures de l’économie
agricole du Maroc. Il participe à 30% de la valeur ajoutée agricole, emploie
pratiquement 20% de la population rurale active et fournit les matières premières (lait,
viande, peaux, laine) à plusieurs secteurs agro-industriels.
Parmi les espèces domestiques exploitées à l’échelle nationale, figurent les bovins qui
participent à plus de 50% dans l’approvisionnement du pays en viande rouge et à
presque 90% dans son ravitaillement en lait. En 1999, les productions des bovins ont
atteint 130 000 tonnes de viande et 1.130 milliards de litres de lait (M.A.D.R.P.M.,
2000).
Cependant, la productivité reste basse malgré la diversité de ses races, du
essentiellement à des problèmes zootechniques, sanitaires et de reproduction qui
demeure une reproduction traditionnelle mal planifiée (M.A.D.R.P.M., 1998).
L’emploi de nouvelles techniques de reproduction : l’Insémination Artificielle (I.A)
(Marquant-LeGuienne, 1986 ; Zakaria, 2001), le Transfert Embryonnaire (T.E.) (El Aidi
et al., 1995) et la Production d’Embryons in Vitro (P.I.V.) (Thibier, 1990; Marquant-Le
Guienne, 1991 ) contribue à l’intensification de l’amélioration génétique du cheptel
bovin, l’I.A. par la voie du male, le T.E et la P.I.V. par la voie de la femelle.
Au Maroc, l’insémination artificielle et le transfert embryonnaire ont constitué un
apport appréciable dans l’amélioration de la structure génétique du cheptel bovin, à
travers l’importation de semences des races performantes (Frisonnes, Holstein,….) et
leur croisement avec le type local (Benlekhal, 1996). Les expériences menées en T.E.
ont été localisées mais très concluantes (El Aidi et al., 1995).
Cependant, la P.I.V. d’embryons bovins qui constitue la troisième génération des
biotechnologies de la reproduction, s’est affirmée et a progressé rapidement ces
dernières années chez les mammifères comme l’atteste le nombre considérable de
publications sur ce sujet n’a jamais été tentée à notre connaissance au Maroc.
En effet, chez les bovins, la P.I.V. d’embryons est très utilisée dans le monde et permet
la production d’embryons à partir d’ovocytes issus d’ovaires prélevés aux abattoirs dans
le but de promouvoir la multiplication de cette espèce (Dauzet et Marquant-LeGuienne,
1994).
Chez les bovins, le premier veau obtenu par Fécondation In Vitro (F.I.V.) d’un ovocyte,
maturé in vivo est né en 1981 (Brackett et al., 1982). Depuis cette date, les processus de
maturation, de fécondation et de culture in vitro ont été considérablement améliorés
(Brachett et al., 1982 ; Marquant-Le Guienne, 1991 ; Brachett et Zuelke, 1993 ;
Coscioni et al., 2001) ; au point que certains auteurs ont envisagé d’utiliser cette
14
nouvelle biotechnologie dans les programmes d’élevage et également le développement
de laboratoires spécialisés dans la production en masse d’embryons produits totalement
in vitro. L’intérêt économique d’une telle source d’embryons est très positif (Dauzet et
Marquant-Le Guienne, 1994).
D’autre part, la fécondation in vitro est une technique qui permet l’étude des
mécanismes biologiques se produisant in vivo (Drion et al., 1996).
De même, le développement embryonnaire in vitro permet de contrôler et de suivre la
croissance des œufs jusqu’au stade compatible avec la transplantation utérine de
l’embryon ou sa congélation.
La production d’embryons bovins in vitro comprend différentes étapes : la maturation
des ovocytes, la capacitation des spermatozoïdes, la fécondation et enfin la culture des
embryons. La possibilité d’intervenir à chacune de ces étapes offre de nombreux
intérêts à la P.I.V.
Cette dernière est une chaîne d’opérations dans laquelle l’ovocyte ou gamète femelle
intervient en amont et détermine la réussite de la technique.
La maturation des ovocytes in vitro est l’étape initiale importante qui détermine la
qualité de cette cellule pour l’obtention d’embryons transférables après fécondation in
vitro. Elle comprend une maturation nucléaire et une maturation cytoplasmique,
nécessaires pour le déroulement normal de la fécondation.
En effet, elles permettent à l’ovocyte d’être reconnu et pénétré par le spermatozoïde,
d’assurer la formation simultanée des pronuclei et leur développement ultérieur
jusqu’au stade morula ou blastocyste (Dieleman et al., 1983 ; Mermillod, 2001).
En outre, la maturation in vitro joue un rôle important pour le clonage. Elle permet
l’obtention d’une source d’ovocytes « receveurs » (en métaphase II) à coût réduit et en
grand nombre (Heyman et al., 1990).
Le taux de réussite de la production d’embryons in vitro rapporté dans la littérature
varie de 19% à 38% selon la méthodologie et les conditions de travail (Carolan et al.,
1996 ; Beker et al., 2002 ; Chian et al., 2002 ; Avery et al., 2003), la proportion
d’ovocytes qui arrivent au stade blastocyste est de 12%, 13%, 23% et 16% quand ils
sont collectés respectivement au 2ème, 3ème, 5ème et 7ème jour de l’émergence de la vague
folliculaire (jour :0) .
Des facteurs intrinsèques et extrinsèques à la donneuse d’ovocytes tels que les aspects
biochimiques, hormonaux et nutritionnels (Kendrick et al., 1999) ont été rapportés
comme étant à l’origine des fluctuations des résultats dans un même laboratoire.
15
Bien que les pourcentages de maturation obtenus in vitro soient encourageants dans
plusieurs laboratoires, cette technique n’a jamais été appliquée sur les ovocytes de la
race locale Marocaine. En l’occurrence, la race Oulmès-Zaer qui a fait l’objet de
plusieurs opérations de production et de transfert d’embryons qui ont eu lieu dans la
région d’Oulmès.
Le taux de réussite de récoltes et transferts d’embryons chez cette race était de 40% (El
Aidi et al., 1995).
Cependant, le transfert d’une technologie doit débuter par une phase d’adaptation aux
conditions spécifiques du nouveau milieu. En effet, le nombre d’embryons qui résulte
de ces opérations varie entre pays, régions, et laboratoires.
Les objectifs de ce travail se résument à:
1/ La maîtrise de la technique : collecte des ovocytes et leur maturation in vitro.
2/ L’exploration Histologique de la fonction ovarienne par l’étude de la population
folliculaire et leur disposition dans le cortex ovarien chez la race locale et ses
produits de croisement avec des races exotiques.
3/ Détermination de l’impact du niveau alimentaire, de l’âge et la race sur la population
folliculaire et le rendement en ovocytes.
16
PREMIERE PARTIE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
17
CHAPITRE I : Caractéristiques de reproduction chez la vache
I/ Développement embryonnaire des ovaires.
L’origine embryologique des ovaires est mixte. Les cellules germinales souches d’abord
extra embryonnaire colonisent, après migration au travers de l’embryon, une zone dense
de tissu mésenchymateux supra-mésonéphrotique recouverte d’épithélium, les corps de
Wolff (Drion et al., 1996).
Les ovaires résultent de la différenciation spontanée des corps de wolff qui recouvrent le
mésonéphros de l’embryon sexuellement indifférencié. Chez les mammifères, cette
différenciation s’opère à partir de la septième semaine de développement embryonnaire,
période à laquelle est accomplie la migration des cellules germinales primordiales dans
l’épithélium cœlomique. Les corps de Wolff prolifèrent et se condensent pour former
une crête longitudinale bilatérale, appelée crête génitale (ou bourrelet germinal), située
en région lombaire (Magre et Vigier, 2001).
Initialement en position postérieure au niveau de la paroi de la vésicule vitelline du
fœtus (Snow et Monk, 1983), les cellules germinales souches migrent activement le long
du mésentère dorsal de l’intestin postérieur pour atteindre la crête génitale (Figure 1).
La fibronectine, présente tout au long de la voie empruntée (Hoffman et al., 1974),
constitue l’inducteur de cette migration. Les réarrangements des tissus en formation
semblent constituer aussi un facteur mécanique de cette migration en conjonction avec
des substances chémotactiques d’origine gonadique (Snow et Monk, 1983).
Au cours de cette migration, et quelques fois après (Derivaux et Ectors, 1989), se
produit une multiplication mitotique des cellules germinales souches.
La survie et la prolifération de ces cellules semblent être en rapport avec une
collaboration entre cellules somatiques et facteurs de croissance.
En effet, deux éléments sont actuellement identifiés (Drion et al., 1996):
- Les genes dominants « white spotting (W) » et « Steel gène (S1) »,
- des facteurs de croissance tel le LIF « Leukemia Inhibitor Factor » et le bFGF « basic
Fibroblast Growth Factor ».
Le gène W code pour un récepteur cellulaire de type tyrosine kinase. Le gène S1 code
pour un facteur de croissance peptidique, le « stem » ou « mast cell growth factor ». Il
est le ligand de ce récepteur. Le produit du gène S1, en interagissant avec le récepteur
du gène W, stimulerait les cellules somatiques pour produire des facteurs de croissance
nécessaires à la multiplication des cellules germinales.
18
1/ Constitution et régulation du stock de follicules primordiaux
Chez les mammifères, la phase de multiplication des ovogonies par mitoses successives
est en général terminée avant ou peu après la naissance. Les singes Lémurs de
Madagascar constituent l’exception à cette règle. Ils présentent une multiplication des
ovogonies qui persiste à l’âge adulte (Drion et al., 1996).
Chez les bovins, la multiplication des ovogonies s’étend du 45ème au 150ème jour de la
vie intra- utérine et engendrent des ovaires à jusqu'à 2 millions d’ovogonies durant la
vie fœtale. Si tôt la phase mitotique terminée, ces dernières entament le processus de
méiose qui s’interrompt en prophase I (stade dictyetène) et deviennent ainsi les ovocytes
I.
La phase de multiplication des ovogonies permet la constitution d’un stock folliculaire
dont l’importance dépend de l’espèce :
160 000 chez la brebis, 235 000 chez la vache, 20 000 chez la rate,
et 1000 000 chez la femme. Le stock dépend aussi de la race, de l’âge, du niveau
hormonal et du statut de reproduction des individus (Driancourt et al., 1991).
Le nombre de follicules primordiaux reste apparemment stable jusqu'à la 4ème année de
vie chez la vache, puis décline pour s’annuler vers la 20ème année (Drion et al., 1996).
Seuls les ovocytes I qui s’entourent de quelques cellules folliculaires et d’une lame
basale (future membrane de slavjanski) persistent pour former les follicules
primordiaux. Ainsi, bien que le nombre d’ovocytes I « culmine » durant la vie utérine, il
n’en reste qu’un petit nombre à la naissance (Drion et al., 1996) .
2/ La folliculogenèse
La folliculogenèse est l’ensemble des phénomènes qui caractérisent l’apparition, la
croissance, et la maturation des follicules. C’est encore la succession des différentes
étapes du développement du follicule depuis le moment où il sort de la réserve jusqu'à
l’ovulation, où au cas le plus fréquent jusqu'à l’atrésie (Driancourt et al., 2001a). En
effet, plus de 99% des follicules sont voués à l’atrésie, ils dégénèrent sans avoir pu
évoluer jusqu’à terme (Drion et al., 1996) .
19
20
Comme chez la plupart des espèces de mammifères, la folliculogenèse chez les bovins
commence pendant le développement fœtal (Maneesh et al., 2000). Les follicules
antraux sont observés dans les ovaires des fœtus vers la fin de la gestation.
La genèse des follicules dans l’ovaire des mammifères résulte d’une interaction
complexe entre prolifération, différenciation et atrésie à l’intérieur des vagues de
follicules en voie de maturation (Greenwald et Roy, 1994).
Les premiers événements détectables dans la transformation des follicules primordiaux
en follicules initiés à la croissance sont :
- l’incorporation de la thymidine tritiée par les cellules folliculeuses
- l’augmentation de la taille de l’ovocyte associée à une synthèse d’ARN et la formation
de la zone pellucide qui est responsable de la spécificité d’espèce pour la reconnaissance
par le spermatozoïde (Scaramuzzi et al., 1993 ; Drion et al., 1996).
Chez les mammifères, il existe deux phases dans la croissance des follicules dont les
mécanismes de régulation sont différents (Driancourt et al., 2001b) :
- La phase de croissance folliculaire basale (du stade primordial au stade pré-antral)
essentiellement dépendante de facteurs de croissance (GDF-9, Steel, IGF-1) ou
endocriniens (insuline) (Canty et al., 2003);
- La phase de croissance terminale c’est à dire du stade cavitaire qui varie en général
chez les mammifères entre 2 et 5mm, en particulier chez la vache : 2 à 3mm à
l’ovulation (Austin et al., 2002). Elle correspond à la durée de la phase folliculaire du
cycle : 4 jours chez la ratte, 2 à 3 jours chez la brebis, 5 jours chez la truie et la vache,
14-17 jours chez les primates.
3/ Aspects morphologiques de la croissance folliculaire
La phase de croissance folliculaire est définie comme l’intervalle entre le moment où le
follicule quitte la réserve et le moment où il atteint l’ovulation. Elle est contemporaine
de la croissance de l’ovocyte que le follicule contient (Driancourt et al., 2001a).
Les premières nomenclatures désignaient les follicules selon le stade de développement :
follicules primordiaux, follicules en croissance et follicules vésiculaires (Hulshof et al.,
1994).
Une nomenclature propre aux follicules en croissance est actuellement en vigueur
(Figures 2, 3) :
- les follicules primordiaux, les follicules primaires et les follicules secondaires
correspondent aux follicules préantraux ;
- les follicules tertiaires représentent les follicules cavitaires ou antraux ;
21
- le terme de follicule de De Graaf ne s’applique qu’au follicule mûr.
3.1/ Les follicules pré-antraux
Quand 2 à 3 couches de cellules folliculeuses sont formées, les cellules thécales se
différencient à partir du stroma et s’orientent en couches concentriques autour de la
membrane basale qui se transforme en membrane de Slavjanski faite de fibres de
collagène type IV, fibronectine, laminine et protéohéparane sulfate.
Ces follicules sont alors formés de deux ou plusieurs couches de cellules de la
granulosa. Leur diamètre est compris entre 0.05 et 0.1 mm.
Un follicule de 0,1 mm de diamètre comprend 10 000 cellules de granulosa environ chez
la brebis (Scaramuzzi et al., 1993). A ce stade, le développement du follicule se
caractérise par une augmentation de la taille de l’ovocyte associée à une prolifération
active des cellules folliculaires (Mariana et al., 1991). Dès lors, le follicule préantral,
possédant des récepteurs à la LH dans la thèque interne et à FSH dans la granulosa, est
potentiellement capable de répondre à une stimulation gonadotrope (Driancourt et al.,
1991). Chaque follicule comporte une vascularisation thécale, permettant le transport de
régulateur endocrine varié tel les IGF (Insuline-like Growth Factor). Des récepteurs à
IGF1 sont présents sur la thèque et la granulosa du follicule (Gougeon, 1996). Enfin, des
expériences de culture in vitro ont montré qu’il existerait des régulations entre follicules
(régulations paracrines) (Driancourt, 1997).
3.2/ Les follicules à antrum
Des espaces apparaissent entre les cellules de la granulosa des follicules de grande
taille. L’antrum apparaît d’abord, sous forme d’antrum diffus, comblant les espaces
entre les cellules et fusionnant ensuite en une seule cavité (Mariana et Machado, 1976).
Les thèques sont alors différenciées autour du follicule : thèque interne, d’aspect
glandulaire riche en cellules et capillaires et thèque externe riche en fibres de collagène
(Driancourt et al., 2001a) .
Pendant la formation de l’antrum, l’ovocyte atteint sa taille presque définitive (80%). À
partir de ce moment, le follicule s’accroît car la prolifération cellulaire continue mais
surtout, parce que l’antrum s’agrandit (Mariana et al., 1991). Au terme de sa
22
23
24
4/ Entrée en méiose
La date d’entrée en méiose des ovogonies se produit avant la naissance. Elle débute
spontanément, ou plus vraisemblablement, sous l’influence d’un facteur d’origine
mésonéphrotique, le MIS (Meiosis inducing substance) (Westergaard et al., 1985 ;
Dominko et First, 1997).
La substance induisant la méiose (MIS) est produite par les cellules du bord interne de
l’ovaire, dérivées du rete ovarii. C’est à cet endroit qu’a lieu la première rencontre entre
les cellules germinales et les cellules somatiques.
La compétence de l’ovocyte à terminer spontanément sa méiose (maturation nucléaire)
hors du follicule est acquise lorsqu’il est issu d’un follicule de diamètre supérieur à 2
mm. Ensuite, l’acquisition de la compétence au développement (maturation
cytoplasmique) augmente progressivement avec la taille du follicule dont l’ovocyte est
issu (Cognié et Baril, 2002).
In vivo, la compétence au développement (reprise de la méiose) des ovocytes est
influencée par leur environnement folliculaire (Mermillod et al., 1999 a), lui-même
régulé pendant la phase folliculaire du cycle sexuel par le niveau de pulsatilité de LH
(Oussaid et al., 1999).
II / Puberté
C’est le moment où l’individu acquiert la fonction sexuelle c’est à dire devient apte à
produire un gamète fécondant (chez le mâle) ou fécondable (chez la femelle); c’est un
préalable nécessaire à la mise à la reproduction. L’apparition de la puberté est repérée
concrètement dès que les premiers signes de l’activité sexuelle sont visibles : première
chaleur chez la femelle. Le déterminisme de l’apparition de la puberté provient de la
mise en place et du fonctionnement du système hormonal relatif à la reproduction,
impliquant l’hypothalamus, l’hypophyse et les gonades. Ce système contrôle l’apparition
du comportement sexuel, la mise en place de l’évolution des caractères sexuels
primaires et secondaires conduisant à l’existence du dimorphisme sexuel (Bonnes et al.,
1988).
L’âge de la puberté varie en fonction de deux principaux facteurs : le niveau alimentaire
et les facteurs génétiques. Il est de 6 mois à 1 an chez l’espèce bovine (Mc Donald,
1980; Diskin et al., 2003).
Chez les genisses de race locale Marocaine, l’âge à la puberté indiqué par la première
ovulation varie de 13.6 mois (Al Mandri, 1986) à 21.5mois (Hosaini-Hilali, 1986).
Indiqué par le premier œstrus, cet âge varie de 13.4 mois (Al Mandri, 1986) à 23.6mois
25
(Hosaini-Hilali, 1986). Il est de 17.8mois lorsqu’il est indiqué par le premier œstrus
ovulatoire (Dewulf et Lahlou-Kassi, 1983). Quand plus de 50% des génisses sont
cyclées, l’âge à la puberté est de 16.5 mois (Asri, 1984).
III/ Cycle sexuel
Le cycle sexuel peut être défini comme étant l’ensemble des modifications anatomiques
(au niveau de l’ovaire), hormonales (Figure 4) et comportementales qui se succèdent
entre deux œstrus (INRAP, 1988).
La physiologie du cycle sexuel est complexe et fait intervenir le niveau central :
hypothalamus et hypophyse et l’appareil génital par les ovaires et l’utérus. L’ovaire
règle à la fois sa propre production hormonale et la production ou le fonctionnement du
tractus génital. L’activité sur le tractus genital se fait à la fois directement et via l’axe
hypothalamo-hypophysaire (Figure 5).
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28
1. Composante anatomique
Une fois formés, les ovaires sont assimilés à des glandes, situés dans la cavité
abdominale. Chez les mammifères, c’est un organe pair, appendu à la région lombaire et
pourvu d’une double fonction : gamètogène, assurant l’ovogenèse et endocrine, par la
sécrétion des hormones œstrogènes et progestatives (Barone, 1987).
Chez les bovins, ces gonades sont oviformes, légèrement aplaties, de couleur blanc-rosé,
leur grand axe est d’environ 1.5cm et elles présentent des bosselures plus ou moins
apparentes à leur surface qui correspondent à des follicules à des stades avancés de leur
évolution (Derivaux et Ectors, 1989).
1.1/ Vagues folliculaires
La régulation de la croissance folliculaire est complexe chez la vache.
En effet, à partir de la puberté, la croissance folliculaire est permanente, des vagues de
croissance fertile et abortive (atrétique) se succèdent.
En effet, à partir du pool de follicules ovariens, 15 à 30 follicules entament leur
croissance basale chaque jour et quittent donc la réserve. Au bout de 130 jours, certains
atteignent le stade de follicules tertiaires (début de la croissance terminale) et vont
rentrer dans le courant des vagues folliculaires.
Chaque vague consiste chez la vache en l’émergence, tous les 7 à 9 jours environ, de
plusieurs follicules tertiaires antraux (5mm de diamètre au moins), parmi lesquels
apparaît le follicule dominant (Ginther et al., 1989 ; Medan et al., 2005). Le follicule
ovulatoire étant issu de la dernière vague (Hunter et al., 1988 ; Drion et al., 1996).
Dans ce sens, de nombreuses études échographiques confirment la théorie des vagues
selon laquelle le développement folliculaire évolue sous la forme de croissances et de
régressions successives de plusieurs follicules (Sirois et Fortune, 1988 ; Knopf et al.,
1989 ; Taylor et Rajamahendran, 1991).
Trois phénomènes se succédent : recrutement, sélection et dominance (Drion et al., 1996).
- Le recrutement est l’entrée en croissance terminale d’une cohorte de follicules
gonadodépendants (diamètre : 2mm). Ces follicules ont dépassé le stade où
habituellement la plupart des follicules deviennent atrétiques. Le recrutement, est un
phénomène aléatoire, provoqué par l’augmentation transitoire du taux circulant de FSH
(Follicle stimulating Hormone).
- La sélection est l’émergence du (ou des) follicule(s) ovulatoire(s) parmi les
follicules recrutés. Cette sélection est secondaire à la réduction de FSH qui a initié le
recrutement.
29
En effet, le développement du groupe de follicules recrutés s’accompagne d’une
augmentation de la production d’œstradiol, mais également d’inhibine qui a un
rétrocontrôle négatif sur l’hypophyse et diminue la production de FSH. A l’exception du
(ou des) follicule(s) sélectionné(s) capable(s) de se développer en présence de faible
taux de FSH, les autres follicules rentrent en atrésie.
- La dominance fait suite à la sélection. Elle est exercée par le plus gros follicule
présent sur l’un ou l’autre ovaire. Le follicule dominant est le seul qui soit capable de
provoquer la régression de follicules en croissance, ou d’inhiber la croissance d’autres
follicules, et d’ovuler dans un environnement hormonal approprié. La dominance
correspond au blocage du recrutement et à la croissance rapide du volume du (ou des)
follicule(s) ovulatoire(s).
Bien que la FSH diminue, le follicule dominant persiste car il a acquis un mécanisme
d’auto stimulation interne (l’œstradiol qu’il produit amplifie sa synthèse d’IGF-l
(Insuline-like growth factor l) qui stimule sa synthèse d’œstradiol). La suite de
l’évolution du follicule dominant dépend de l’évolution de la progestéronémie.
Si la progestéronémie diminue, c’est à dire s’il y a lutéolyse, alors que le follicule
dominant est en phase de croissance, il ovule. Si, à l’inverse, la progestéronémie se
maintient à un niveau élevé après que le follicule dominant ait atteint sa taille maximale,
il commence sa régression, et une autre vague de croissance apparaît (Drion et al.,
1996).
Ce schéma de croissance folliculaire est également décrit en période pré- pubertaire
(Driancourt et al., 1991), en post partum et durant les 70 premiers jours de la gestation.
En effet, malgré la présence d’un corps jaune, l’émergence de vagues de croissance
folliculaire continue, mais sans phénomènes de sélection ni de dominance (Savio et al.,
1990).
1.2/ Croissance et maturation de l’ovocyte
L’ovocyte est une cellule hautement spécialisée qui doit subir une longue
différenciation le préparant à former avec le gamète mâle la première cellule souche
d’un nouvel être. En l’occurrence, il doit subir une longue évolution cytologique et
moléculaire durant toute la croissance folliculaire (Bevers et al., 1997).
1.2.1/ Croissance de l’ovocyte
Dès la naissance, le cortex ovarien contient un stock de follicules primordiaux
hébergeant des ovocytes bloqués en fin de prophase I méiotique (stade vésicule
germinative) entouré d’une couche squameuse de cellules somatiques.
30
Stimulés par des mécanismes mal élucidés, quelques follicules primordiaux entrent dans
une phase de croissance qui se traduit par la multiplication des cellules folliculaires
mais surtout de la croissance de l’ovocyte (Gosden et al., 1997).
La croissance de l’ovocyte continue et lorsque l’antrum se forme, l’ovocyte atteint
environ 80% de sa taille définitive (Mermillod et al., 1999a). Sa croissance continue de
manière ralentie, tandis que le volume du follicule croît régulièrement jusqu’à la
décharge gonadotrope ovulante. L’ovocyte reste bloqué en fin de prophase I méiotique
pendant toute la croissance folliculaire. Il acquiert d’abord la compétence à reprendre sa
méiose puis la compétence à assurer la fécondation et le développement (Eppig et al.,
1996).
Durant cette croissance de l’ovocyte, une différenciation du cytoplasme a lieu
parallèlement. En effet, les mitochondries s’accumulent dans le cytoplasme, au
voisinage du réticulum endoplasmique rugueux, et migrent dans le cortex durant la
phase finale de la maturation (Velilla et al., 2000). L’appareil de Golgi passe également
par une phase d’activité intense, participant à la formation de la zone pellucide et des
granules corticaux (Velilla et al., 2000). Les granules corticaux sont de petites vésicules
(200-600 nm), en nombre de 5000 dans un ovocyte de souris en fin de croissance. Ils se
positionnent contre la membrane plasmique dans la phase finale de la maturation de
l’ovocyte et jouent un rôle capital dans la fécondation en empêchant la polyspermie
(Guraya, 1983 ; Yoshida et al., 1990 ; Velilla et al., 2000).
Pendant la croissance, l’ovocyte accumule de grandes quantités d’ARN, augmentant
d’environ 300 fois son contenu en ARN total. Les transcriptions, d’abord très intenses,
diminuent lorsque l’ovocyte a atteint environ 80% de sa taille définitive. Elles
deviennent indétectables dès la reprise de méiose ; les 2/3 environ sont des ARN
ribosomaux, reflet de l’intense activité nucléaire observée pendant la période de
croissance de l’ovocyte jusqu’à l’apparition de l’antrum (Mermillod, 2001).
La capacité de synthèse protéique de l’ovocyte de mammifères est d’abord élevée puis
diminue au cours de la croissance. L’accumulation de certaines de ces protéines, très
spécifiques de l’ovocyte, a été bien suivie. C’est le cas de trois glycoprotéines
composant la zone pellucide (ZP1, ZP2 et ZP3), produites tout au long de la phase de
croissance de l’ovocyte et représentant jusqu’à 10% des synthèses protéiques totales de
l’ovocyte (Harrenstien et al., 2004).
1.2.2/ Maturation de l’ovocyte.
31
La maturation ovocytaire recouvre l’ensemble des changements nucléaires et
cytoplasmiques qui interviennent dans l’ovocyte I, à l’intérieur du follicule mûr suite à
la décharge gonadotrope ovulante (décharge de LH) (Mermillod, 2001).
On distingue deux grands événements :
- La reprise de la méiose depuis le stade vésicule gérminative (VG) jusqu’en
métaphase II ;
- la maturation cytoplasmique qui est l’acquisition de l’aptitude à une
fécondation normale et au démarrage du développement.
a. Aspects cytologiques de la maturation des ovocytes
a.1/ Rupture de la vésicule germinale
La rupture de la vésicule germinale se produit dans les heures qui suivent la décharge
gonadotrope ovulante (Mermillod, 2001). Elle commence par un plissement de
l’enveloppe nucléaire, en rapport avec le début de condensation de chromosomes,
attachés à l’enveloppe par une extrémité. Les pores nucléaires disparaissent puis
l’enveloppe se fragmente avant de disparaître elle même rapidement.
a.2/ Condensation des chromosomes
La condensation des chromosomes commence aux premiers signes d’ondulation de
l’enveloppe nucléaire à laquelle ils sont attachés, se poursuit après la rupture de la
vésicule germinative (Mermillod et Marchal, 1999b).
a.3/ Formation du fuseau chromosomique
Dans l’ovocyte, les centrioles disparaissent avant la croissance, dès le stade pachytène
.Il ne subsiste que du matériel péricentriolaire filamenteux dans lequel s’établissent des
MTOC (microtubules organizing center) formant les centrosomes de l’ovocyte. Les
MTOC émettent des microtubules qui rejoignent les kinétochores des chromosomes puis
migrent pour former les deux pôles d’un fuseau aplati, en forme de tonneau (Mermillod,
2001).
a.4/ Passage et arrêt en métaphase II
Chez la souris, la prométaphase (condensation des chromosomes et arrangement en
plaque métaphasique) dure environ 6 heures et la métaphase I dure 4 heures. Cette durée
importante est due sans doute au temps nécessaire à la synthèse et à l’assemblage du
fuseau méiotique. Anaphase et télophase sont visibles après 10 à 13 heures, en même
32
temps qu’une boursouflure de la membrane qui deviendra le premier globule polaire.
Ces deux phases sont rapides, les chromosomes homologues se séparent et migrent aux
pôles du fuseau alors que le corps intermédiaire, une région riche en filaments et tubules
participe à l’étranglement et finalement à l’expulsion du 1er globule polaire (Mermillod,
2001).
a.5/ Maturation cytoplasmique
La migration des granules corticaux (vésicules à contenu dense formées à partir de
l’appareil de golgi dans les ovocytes des follicules pré ovulatoires) est le trait le plus
marquant de la maturation cytoplasmique. Ces granules ont une localisation
cytoplasmique sous corticale diffuse dans l’ovocyte immature et dès la reprise de
méiose, migrent vers la zone corticale en s’associant au cytosquelette.
La migration des granules s’accompagne d’un rassemblement des autres organites
(mitochondries et appareil de Golgie) dans la région périnucléaire, ces déplacements
étant sous la dépendance des microtubules (Velilla et al., 2000).
La membrane des granules corticaux s’attache à la membrane plasmique par des ponts de
calpactine (protéine impliquée dans l’exocytose) et la libération de leur contenu dans
l’espace péri-vitellin au moment de la fécondation, ceci évite la polyspermie (Yoshida et
al., 1993).
La maturation cytoplasmique se traduit donc par l’acquisition d’un facteur de
décondensation de la tête du spermatozoïde après fécondation (Marquant-Leguienne,
1986).
b. Aspects moléculaires de la maturation de l’ovocyte
Parmi les aspects moléculaires qu’on observe au cours de la maturation ovocytaire, il y a
l’expansion du cumulus (Humblot et al., 2005), sur laquelle on peut se baser pour juger
de la maturation des ovocytes.
En effet, comme en attestent les expériences de maturation ovocytaire in vitro, la
présence de cellules de cumulus est importante pour la qualité de la maturation
cytoplasmique (Salustri et al., 1996). Des ovocytes débarrassés de leurs cellules de
cumulus et placés en culture sont capables d’accomplir leur méiose jusqu’en métaphase
II. Cependant, leur fécondation est anormale et ils ne peuvent se développer.
Cette expansion est sous la dépendance de la FSH du fluide folliculaire dont l’action
serait modulée par la LH.
33
In vitro, la FSH, provoque l’expansion du cumulus et pas la LH (Mermillod et Marchal,
1999b). In vivo, l’action de la FSH présente dans le fluide folliculaire avant le pic de
LH pourrait être bloquée par un inhibiteur. La LH lèverait cette inhibition lors du pic
ovulatoire (Cecconi et colonna, 1996).
L’expansion du cumulus pendant la maturation de l’ovocyte, résulte de l’accroissement
des espaces intercellulaires suite à la production par les cellules d’une matrice visco-
élastique abondante, composée d’acide hyaluronique (Mermillod et Marchal, 1999b).
Cette matrice permet à l’ensemble cumulus-ovocyte de conserver son intégrité même
après la dissociation des complexes de jonction. La synthèse d’acide hyaluronique par
les cellules du cumulus est sous la dépendance de la FSH. Certains facteurs de
croissance (EGF, IGF-I) agissent aussi sur l’expansion du cumulus.
En effet, des facteurs originaires de l’ovocyte interviennent dans ce phénomène, c’est
notamment le cas du « cumulus expansion enabling factor » (CEEF) ou facteurs
d’expansion du cumulus, molécule proche du TGF-β, produit du gène GDF-9 de
l’ovocyte.
Le produit de ce gène GDF-9, capable de réguler plusieurs aspects du métabolisme des
cellules somatiques du follicules (prolifération, synthèse des stéroïdes, d’acide
hyaluronique et de prostaglandines) est une illustration du dialogue existant entre
l’ovocyte et son environnement somatique (Elvin et al., 2000).
De leur part, Mermillod et Marchal, 1999b, ont rapporté que le rôle des cellules du
cumulus peut s’exercer par l’apport de métabolites vers l’ovocyte (tel que le gluthation)
et également par la transmission de signaux vers l’ovocyte. Ainsi, la stimulation de la
maturation de l’ovocyte bovin par l’hormone de croissance passe par le cumulus
(Izadyar et al., 1998).
D’un point de vu mécanique, l’expansion du cumulus est également importante
puisqu’elle facilitera le détachement du complexe cumulus oophorus-ovocyte et sa
capture par le pavillon lors de l’ovulation.
1.3/ Ovulation
Arrivé au terme de sa croissance le follicule forme à la surface de l’ovaire une saillie
conique et libère l’ovocyte, en réponse à une forte élévation des gonadotropines ou
décharge ovulante. L’ovulation se produit 11 à 12 heures après la décharge chez la
lapine, 29 à 31 heures chez la vache et 35 à 36 heures chez la femme.
L’ovocyte libéré est accompagné de la corona radiata, d’une partie du cumulus oophorus
et du liquide folliculaire.
34
Pendant le processus de l’ovulation, plusieurs changements structuraux et métaboliques
se produisent et entraînant une désorganisation du follicule et de là sa rupture
(Driancourt et al., 1991). C’est ainsi que :
• La thèque externe devient œdémateuse par diffusion du plasma sanguin.
• Les faisceaux de fibres de collagène de la thèque externe et de l’albuginée se
dissocient.
• Les cellules de la granulosa se détachent de la lame basale, cessent de se diviser
et perdent les jonctions perméables qui les unissent.
• Les cellules du cumulus subissent les mêmes transformations que les cellules de
la granulosa mais comme elles secrètent abondamment de l’acide hyaluronique,
leur dissociation est totale. L’ovocyte pilote cette sécrétion : le cumulus sans
ovocyte ne produit plus d’acide hyaluronique.
• Les cellules péri ovocytaires, dont les prolongements traversent la zone
pellucide, demeurent plus ou moins longtemps attachées à l’ovocyte, formant la
corona radiata. Chez les ruminants cette corona disparaît rapidement, elle ne
joue aucun rôle dans la fécondation.
• Peu avant la rupture du follicule, la lame basale séparant la granulosa de la
thèque interne disparaît par endroits et des vaisseaux sanguins néoformés
pénètrent dans la granulosa entraînant des cellules de cette thèque, préparant
ainsi la formation du corps jaune (Driancourt et al., 2001b).
• Au niveau de l’apex de la saillie conique les changements sont différents :
- les cellules de l’épithélium ovarien s’étirent et s’aplatissent
accompagnant l’extériorisation du follicule à la surface de l’ovaire.
- les cellules sous-jacentes de la granulosa, des thèques et de l’albuginée se
dissocient puis disparaissent par apoptose et nécrose.
- La rupture folliculaire s’achève par la désintégration complète de l’apex.
La pression intrafolliculaire diminue mais persiste entre la décharge de
LH et l’ovulation semble faciliter la rupture. Par contre, l’expulsion de
l’ovocyte et des cellules de la corona radiata résulte bien d’une
contraction du follicule.
1.4/ Corps jaune
Après la rupture du follicule, les cellules de la granulosa, nouvellement vascularisées,
s’hypertrophient et prolifèrent in situ pour former le corps jaune, alors que les cellules
35
de la thèque s’incorporent dans le tissu interstitiel de l’ovaire et participent à la
sécrétion des androgènes ovariens (Hunter, 1980).
Chez la plupart des mammifères, le corps jaune formé après l’ovulation a une durée de
vie limitée entre 4 et 21 jours si la femelle n’a pas été fécondée. Sa régression ou
lutéolyse permet l’apparition d’un nouveau cycle ovulatoire. La gestation induit un
blocage de la lutéolyse et la persistance du corps jaune cyclique en corps jaune gestatif
dont la sécrétion de progestérone est indispensable à l’établissement de gestation
(Leymarie et martal, 2001).
D’autre part, cette lutéinisation qui coïncide avec une augmentation très importante de la
sécrétion de progestérone est accompagnée dans toutes les espèces, sauf les primates, de
la disparition des sécrétions d’androgènes et d’œstrogène (Niswender et al., 2000).
2/ Composante hormonale
Le cycle d’activité de l’ovaire est en étroite relation avec les variations des profils
hormonaux qui se produisent au niveau de l’ovaire d’une part et au niveau du système
nerveux central et de l’axe hypotalamo-hypophysaire d’autre part.
Les sécrétions hormonales de l’hypothalamus, de l’hypophyse et de l’ovaire contrôlent
la succession des événements du cycle (INRAP, 1988).
2.1/ Hormones hypothalamiques
GnRH ou Gonadotropine Releasing Hormone ou gonadolibérine est l’hormone de
décharge ou encore l’hormone de libération (libérins) d’autres hormones (Gruyter,
1988).
Cette hormone est également nommée FSH-RH (Folliculo-Stimuline-Releasing
Hormone) ou LH-RH (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone) (Hafez, 1993).
C’est une hormone protidique responsable de la synthèse et de libération de deux
hormones hypophysaires, les gonadotrophines FSH et LH (Bonnes et al, 1988). En effet,
de nombreuses situations expérimentales visant à supprimer ou à limiter la sécrétion de
la GnRH ont permis de montrer son importance sur la synthèse et la libération de FSH et
LH (Filicori et al., 1994). La GnRH joue manifestement un rôle pivot dans l’initiation,
la régulation et la suppression de la fonction reproductrice.
Elle a une sécrétion pulsatile, chaque pulse est formée de la somme de petites quantités
de GnRH, libérées chacune par un neurone (Caraty et al., 2001). Le pulse peut être
défini comme un épisode bref de libération hormonale dans le sang (Pelletier, 1983), il
36
est caractérisé par une montée rapide des concentrations sanguines suivie d’une
diminution de type exponentiel liée à la demi-vie de l’hormone.
2.2/ Gonadotrophines hypophysaires (FSH et LH)
Au début de l’œstrus, se produit une décharge de gonadotropines qui entraîne
l’ovulation, marquant la fin de la phase folliculaire et le début de la phase lutéale
(Driancourt et Levasseur, 2001c ; Medan et al., 2005).
Les gonadotrophines jouent un rôle central dans la régulation de la fonction de la
reproduction tant chez le mâle que chez la femelle ; elles sont en effet les intermédiaires
essentiels du système nerveux central sur les activités endocrines et gamétogéniques des
gonades (Medan et al., 2005).
La FSH et LH appartiennent à la famille des hormones glycoprotéiques à action directe
et unique sur les gonades chez le mâle et la femelle ; ce sont des hormones gonadotropes
ou gonadotrophines ou gonadostimulines : FSH (Follicule Stimulating Hormone) ou
follitropine ou hormone folliculo-stimulante et LH (Luteinising Hormone) ou lutropine
ou hormone lutéinisante (Bonnes et al., 1988).
La LH et la FSH confèrent à l’hypophyse une fonction de relaie amplificateur dans le
contrôle de la fonction de reproduction :
- par le système nerveux central, principalement sous l’impulsion de la GnRH
(Moenter et al., 1991 ; Bartolome et al., 2005).
- par des hormones périphériques et notamment les stéroïdes sexuels et l’inhibine,
via la circulation générale.
- par divers facteurs produits localement par les cellules folliculaires comme
l’inhibine, l’activine et IGF (facteurs de croissance) ainsi que leurs protéines de liaison
telle que : la follistatine.
D’autre part, la FSH accompagne la croissance du follicule secondaire en follicule
dominant dans les ovaires des mammifères et contrôle le développement des follicules,
elle est l’hormone de la phase folliculaire précoce (Erikson et Danforth, 1995).
Chez les bovins, il ressort que la FSH, joue un rôle important dans l’initiation du
développement folliculaire (Tanaka et al., 2001 ; Stenbak et al., 2001).
Elle stimule l’activation de l’aromatase et accélère la production des œstrogènes (Bao et
al., 1997).
En plus, la prolifération des cellules de la granulosa du follicule est induite par une
action autocrine de l’œstrogène, et stimulée par la FSH (Peters et McNatty, 1980). La
37
sécrétion de FSH se produit par pics, mais d’une façon moins marquée, et est régulée par
la sécrétion d’œstradiol et d’inhibine par les follicules.
Les principales fonctions de la LH sont la stimulation de la croissance folliculaire
(Bartolome et al., 2005), la maturation finale du follicule dominant par la stimulation de
la production d’œstradiol (Stock et Fortune, 1993), l’induction de l’ovulation et la
stimulation de la sécrétion de progestérone par le corps jaune.
En effet, le pic de LH induit par l’effet conjugué d’une hypersensibilité
hypophysaire et d’une sécrétion de GnRH hypothalamique permet la reprise de la méiose
par l’ovocyte, la rupture folliculaire et la lutéinisation des cellules de la granulosa
(Bartolome et al., 2005).
2.3/ Hormones ovariennes
Ce sont la testostérone, les œstrogènes, la progestérone. De nature lipidique, elles sont
fabriquées à partir du cholestérol et sont sécrétées principalement par les gonades mais
aussi par le placenta et les glandes surrénales (Bonnes et al., 1988).
Etymologiquement, œstrogène signifie «qui engendre l’œstrus ». Sécrétés
essentiellement par les follicules de l’ovaire, les œstrogènes ont pour rôle primordial de
provoquer l’œstrus ou chaleurs.
L’augmentation du nombre des jeunes follicules antraux coïncide avec l’accumulation
d’œstradiol dans l’antrum. L’œstradiol, stimule la prolifération des cellules de la
granulosa et la formation de l’antrum (Peters et McNatty, 1980). L’effet lutéolytique de
l’oestradiol a été rapporté par Colazo et al.,(2005) :Une perfusion d’oestradiol induit
l’atrésie folliculaire suite à la baisse du taux circulant de FSH. A partir du moment où la
concentration en oestradiol décline, un redressement du taux de FSH a lieu et une
nouvelle vague folliculaire émerge 24 heures après.
La progestérone signifie « qui permet la gestation ». Sécrétée essentiellement par le
corps jaune de l’ovaire, la progestérone est d’abord l’hormone responsable du maintien
de la gestation (Graham et Clarke, 1997).
La progestérone, exerce un rétrocontrôle négatif sur la production de GnRH, FSH et LH.
2.4/ Autres hormones
a/ Les Prostaglandines
Ensemble de molécules de nature lipidique, synthétisées par de nombreuses cellules
sécrétrices, les prostaglandines sont présentes dans presque tous les tissus de
l’organisme des mammifères, elles exercent des rôles multiples, en général par action
locale ou de voisinage.
38
Les prostaglandines permettant l’éclatement du follicule au moment de l’ovulation.
Elles déclenchent la régression du corps jaune ou lutéolyse. Elles entretiennent les
contractions du myomètre au moment de la mise bas. Les prostaglandines sont
essentiellement d’origine utérine.
b/ Ocytocine
L’ocytocine, appelé aussi oxytocine, est un nanopeptide formé au niveau des noyaux
supra-optiques et paraventriculaires de l’hypothalamus, et transporté puis stocké par la
posthypophyse. Ses principales cibles sont l’utérus et les glandes mammaires. Elle
intervient chez la femelle au moment de la mise bas et de l'éjection du lait.
2.5/ Régulations hormonales
a. Contrôle de la sécrétion de la GnRH
Chez les mammifères, l’initiateur et le régulateur fondamental de la fonction
reproductrice est la GnRH (gonadotrophin releasing hormone ou gonadolibérine), qui est
synthétisée et libérée par les neurones de l’hypothalamus. La GnRH se lie aux récepteurs
spécifiques situés sur les cellules gonadotropes de l’antéhypophyse ce qui provoque la
synthèse et la libération des gonadotropines, l’hormone folliculo-stimulante (FSH) et
l’hormone lutéinisante (LH).
La FSH, à son tour agit spécifiquement sur les petits follicules ovariens pour stimuler
leur croissance, tandis que la LH agit sur le follicule dominant mûr pour provoquer la
maturation finale et l’ovulation qui en résulte (Drion et al., 1996).
La GnRH est secrétée par l’hypothalamus sous forme de décharges ou de manière
épisodique, chaque décharge de GnRH provoquant la décharge de LH par
l’antéhypophyse. La caractéristique fondamentale de la sécrétion des hormones
hypothalamo-hypophysaires (GnRH, FSH, LH) est la pulsatilité; en d’autres termes, leur
sécrétion n’est pas continue mais passe par un maximum très bref, pulsation ou
« pulse », à la suite duquel la concentration plasmatique décroît progressivement jusqu'à
une valeur minimale où elle stagne jusqu'à la prochaine élévation brève.
L’amplitude des pulsations est constante alors que leur fréquence varie, son
augmentation provoquant alors un accroissement de la concentration de l’hormone dans
le sang (Marie, 1996).
La sécrétion de GnRH est régulée par des facteurs internes et externes :
-Facteurs internes : Les principaux facteurs internes qui régulent la sécrétion de
GnRH sont les hormones stéroïdes ovariennes, la progestérone et l’oestradiol. La
39
progestérone agit sur les neurones de la GnRH pour diminuer la sécrétion de GnRH en
abaissant la fréquence des décharges de GnRH, tandis que les effets de l’oestradiol sur
la femelle dépendent de la présence ou de l’absence de concentrations de progestérone
durant la phase lutéinique. Lors de la phase lutéinique où les concentrations de
progestérone sont élevées, l’oestradiol agit en synergie avec la progestérone pour
diminuer la sécrétion de GnRH par l’hypothalamus, c'est-à-dire qu’il y a une rétroaction
négative sur la GnRH (Archbald et al., 1993). Lors de la phase folliculaire, en l’absence
de progestérone et en présence de fortes concentrations de GnRH, l’oestradiol sécrété
par le follicule pré-ovulatoire a une rétroaction positive sur la GnRH, ce qui provoque la
prolongation d’une sécrétion élevée responsable des pics pré-ovulatoires de LH et de
FSH (Drion et al., 1996).
-Facteurs externes : les principaux facteurs externes qui affectent la sécrétion de
GnRH sont : le statut nutritionnel de la vache (Armstrong et al., 2002) et le stimulus
d’allaitement chez la vache allaitante. Le mécanisme selon lequel l’alimentation affecte
la sécrétion de GnRH n’est pas éclairci mais le programme d’alimentation et l’état
corporel réel de l’animal sont tous deux importants.
b. Contrôle de la sécrétion de LH et de FSH.
L’action de la GnRH sur l’antéhypophyse peut également être influencée par des
hormones spécifiques produites par le follicule. La plus intéressante de toutes est
l’inhibine. Cette hormone supprime sélectivement la libération de FSH par
l’antéhypophyse sans affecter la sécrétion de LH (Mermillod et Marchal, 1999b).
L’activine stimule aussi la synthèse de FSH et l’équilibre entre ces deux facteurs peut
déterminer le niveau de sécrétion de FSH.
La libération différentielle de LH et de FSH par la même cellule gonadotrope requiert
des mécanismes de contrôle intracellulaires différents.
Les gonadotropines synthétisées sont stockées dans des granules sécrétoires à l’intérieur
du cytoplasme, et sont secrétées par action différentielle par exocytose (Mermillod et
Marchal, 1999b).
Il apparaît que le stockage de LH se prolonge durant le cycle oestral, mais le stockage de
FSH est de courte durée.
Durant le cycle œstral de la brebis, jusqu’à 50% de FSH est libérée chaque jour, tandis
que seulement 1 à 5% de LH est libérée. Par contre jusqu’à 70% de la LH totale est
libérée durant la montée préovulatoire (Figure 3). Il est à présent évident que la LH est
40
étroitement régulée par la GnRH (Gazal et al., 1998), mais aussi par un contrôle local
via les interactions de l’inhibine et de l’activine (Mermillod et Marchal, 1999b)
Chez la vache, les facteurs qui diminuent la fréquence des décharges de LH et
empêchent par conséquent l’ovulation sont : le déficit énergétique en post partum ou
pendant les périodes de sécheresse (Beam et Butler, 1999), une mauvaise nutrition,
mauvais état corporel, perte supérieure à 10% du poids corporel après le vêlage et une
durée d’allaitement supérieure à 6 semaines après le vêlage.
3/ Composante comportementale
3.1/ Saisonnalité
La plupart des mammifères présentent des cycles annuels de reproduction caractérisés
par la succession d’une période d’activité sexuelle plus ou moins longue appelée saison
sexuelle et d’une période de repos, résultant de la mise en silence de la fonction
gonadotrope, appelée saison d’anœstrus ou anœstrus saisonnier (Martinet et Mondain-
Monval, 1991).
Cependant, une vache post-pubérale non gestante bien nourrie sous des conditions
environnementales ordinaires de domestication est vraiment un animal polyœstrien non
saisonnier.
Bien que la vache n’ait pas une reproduction saisonnière, plusieurs études indiquent que
la vache atteint une fertilité élevée au printemps et basse durant l’hiver et l’été (Mc
Donald, 1980 ; DeRensis et Scaramuzzi, 2003).
En effet, les températures saisonnières élevées provoquent des changements
endocriniens et une altération de la fonction endocrine : diminution de la sécrétion
d’œstradiol, augmentation de la progesteronémie et perturbation des mécanismes de
maturation ovocytaire et d’ovulation (Hochi et al., 1993 ; Berthelot et Bergonier, 1995 ;
Rocha et al., 1998; DeRensis et Scaramuzzi, 2003).
D’autre part, l’équipe de Miettinen et al., (1991) a constaté que l’effet de la saison sur la
fonction ovarienne passe par le pâturage et qu’une balance énergétique négative induite
par un pâturage inadéquat qui affecte négativement les performances de reproduction.
Dans le même sens et dans les conditions de reproduction in vitro, l’effet dépressif de
l’été sur la qualité des ovocytes de la race Holstein est évident, il a été montré, que la
proportion d’ovocytes et d’embryons arrivés au stade blastocyste au bout de huit jours
étaient plus élevées en hiver qu’en été (AL -Katanani et al., 2002).
Le stress thermique altère le développement folliculaire en réduisant la production
d’hormones stéroïdiennes (Wolfensen et al., 1997 ; Wilson et al., 1998). Ces
41
changements dans les concentrations des stéroïdes folliculaires pourraient rompre la
croissance de l’ovocyte.
De même (Badinga et al., 1993) ont montré, que le stress thermique pendant la saison
d’été réduit la croissance du follicule dominant et induit une dominance incomplète.
De cette dominance incomplète résulte la ponte d’ovocytes à partir de follicules âgés qui
hébergent des ovocytes à compétence réduite (Mihm et al., 1999).
Par ailleurs, l’élévation de la température affecte négativement la croissance de
l’ovocyte et la synthèse protéique nécessaire pour le développement embryonnaire (AL
Katanani et al., 2002).
3.2/ Œstrus
L’œstrus (ou chaleurs) est l’événement caractéristique du comportement sexuel de la
femelle. C’est la seule période où la femelle est réceptive.
En dehors de cette période, aucune activité n’est visible (Bonnes et al., 1988).
L’œstrus est le résultat de l’action de l’œstradiol sur le système nerveux central et
amenant jusqu’aux manifestations psychiques de la chaleur. Durant 14 à 18 heures, la
vache est en œstrus, elle est anxieuse et sans repos, son appétit diminue (Bonnes et al.,
1988). A la fin de l’œstrus, le système nerveux de la vache commence la libération
d’œstradiol et les manifestations psychiques de la chaleur cessent. L’œstradiol est libéré,
la LH atteint le pic, cause l’ovulation et aide dans la formation du corps jaune (Mc
Donald, 1980).
Les premières chaleurs peuvent être retardées en cas de déficit énergétique. En effet, des
niveaux faibles de progestérone au milieu du cycle œstral ont été signalés lorsque le
bilan énergétique est faible (Yung et al., 1996 ; Mackey et al., 1999).
42
Chapitre II : Facteurs de variation de la production des ovocytes et de leur qualité
I/ Facteurs endogènes
1/ Race
Les ovocytes issus de vaches à haut niveau génétique donnent après maturation et
fécondation in vitro un taux plus faible de blastocystes par rapport à ceux prélevés de
vaches à niveau génétique moyen (Snijders et al., 2000). Ils concluent que la qualité des
ovocytes contribue probablement à la réduction de fertilité toujours évidente chez les
vaches à haut niveau génétique.
D’autre part, il existe des races telle que la race Buffalo chez laquelle la population
folliculaire visible à la surface des ovaires est très pauvre comparativement à d’autres
races Européennes ou autres (Kumar et al., 1997).
Lucci et al., (2002), ont révélé par exploration histologique que la race Zebu (Bos
indicus) a une population folliculaire en particulier les follicules préantraux
quantitativement similaire à celle rencontrée chez les vaches Bos taurus des pays
tropicaux.
Pour Nibart, (1991), il n’y aurait pas de différences significatives en terme de
production d’embryons après super ovulation entre les trois races laitières Françaises
Frisonne, Normande et Montbelliarde.
2/ Age
Dans les conditions de développement in vitro des ovocytes où leur qualité peut être
jugée par leur aptitude au développement, il ressort de nombreux travaux que l’âge de la
donneuse influe sur cette aptitude.
Ainsi, il a été démontré que le pourcentage d’œufs qui arrivent au stade blastocyste est
plus faible quand les ovocytes sont issus de génisses par rapport à ceux issus de vaches
(Revel et al., 1995; Driancourt et al., 2001b).
En effet, la steroïdogenèse dans des follicules issus de génisses s’est révélée dix fois
plus réduite que celle de follicules issus de vaches (Driancourt et al, 2001b).
Les résultats de Peters et al.(2001) montrent aussi que les ovocytes récoltés de gilts pré
pubères ont des potentialités au développement in vitro inférieurs à ceux récoltés à
partir des gilts adultes.
L’effet de l’âge sur la production des ovocytes résulte en partie de l’altération de
l’expression de la protéase tissu-type plasminogen activator (tPA) (LaPolt et Lu, 2001).
C’est une protéase impliquée dans la rupture folliculaire, elle induit la dissociation des
43
fibres de collagène présentes dans la thèque, l’albuginée et l’épithélium ovarien présent
au niveau de l’apex folliculaire. L’altération de l’expression de la protéase tissu-type
plasminogen activator (tPA) est probablement due à une baisse de sécrétion pulsative de
LH (Drion et al, 1996).
Chez l’espèce équine, l’effet de l’âge sur la production des gamètes est différent des
données précédentes. Ainsi, (Hochi et al, 1993) ont révélé que l’âge de la donneuse
d’ovocytes n’a pas d’effet sur le rendement et la qualité des ovocytes. Il y a donc peut
être une tranche d’âge où le rendement en ovocytes est optimal.
3/ Etat physiologique
D’après plusieurs travaux, l’activité ovarienne dépend de l’état physiologique de la
femelle. Ainsi, les résultats de Abdoon et al., (2001) montrent que le nombre de
follicules antraux diminuent significativement chez les vaches gestantes de la race
Buffalo ; alors qu’il augmente chez les vaches cyclées de la même race et qu’un grand
pourcentage d’ovocytes nus (de qualité non sélectionnée pour la maturation in vitro
(MIV)) est obtenu à partir des ovaires de vaches en anœstrus ou gestantes.
De même, le nombre d’ovocytes ponctionnés chez une dromadaire gestante est
significativement inférieur à celui obtenu à partir d’une femelle non gestante (Torner et
al., 2003). De leur part, Kendrick et al., (1999) montrent que le nombre d’ovocytes
augmente linéairement chez la vache à partir du 30ème au 100ème jour post-partum.
4/ Phase du cycle
Les études visant à savoir si la période du cycle ovarien affectait le rendement en
ovocytes lors de la récolte de ces derniers en vue de leur maturation in vitro ont
démontré que la présence d’un follicule dominant diminuait les résultats (Laizeau,
2003).
En effet, la présence d’un follicule dominant affecte négativement le résultat de la super
ovulation et de la collecte des ovocytes par OPU (ovum pick-up) (Adams et al., 1993), le
nombre de follicules qui s'engagent dans le processus de la folliculognèse reste bas.
Pour remédier à cela, les auteurs préconisent l’élimination du follicule dominant avant
l’injection de la PMSG, (Laizeau, 2003).
Dans le même sens, Machatkova et al., (2004),ont rapporté que le nombre et la qualité
des ovocytes collectés étaient meilleurs en phase de croissance qu’en phase de
dominance du cycle.
44
Les travaux de Machatkova et al., (2000) et de Abdoon, (2001) ont révélé que la période
du cycle œstral affecte la qualité de l’ovocyte destiné à la production d’embryons bovins
in vitro et ont constaté que la présence d’un corps jaune (CL) stimule le développement
d’un grand nombre de follicules qui donnent des ovocytes de bonne qualité.
II/ Facteurs exogènes :
A/ Nutrition
Fonction de luxe, la reproduction est la première touchée par toute erreur alimentaire
quelle qu’elle soit, comme elle est la dernière à subir les effets d’une correction adéquate
(Wolter, 1973). L’animal mal alimenté par rapport à ses besoins cherche à économiser de
l’énergie en mettant en veilleuse son aptitude à la reproduction.
Les conséquences d’une diminution des apports nutritionnels vont selon l’intensité de la
perturbation, d’une diminution du taux d’ovulation, visibles chez les espèces poly-
ovulantes, à une irrégularité des cycles voire un arrêt total de la cyclicité (Chilliard et
al., 1998 ; Monget et al., 2001 ; Diskin et al., 2003).
L’alimentation a une influence sur la reproduction des vaches par différentes
composantes :
- L’équilibre énergétique, l’énergie est un facteur très important dans le maintien
de la fonction de reproduction (Enjalbert, 1998).
- L’apport protéique (Ferguson et Chalupa., 1989).
- Les vitamines dont certaines sont essentielles à la production des gamètes
(Butler et Smith., 1989; Hurley et Doane, 1989).
- Les minéraux (Atherthon, 1994).
1/ Déficit énergétique
La balance énergétique est définie chez les bovins comme l’énergie nette consommée
moins l’énergie requise pour l’entretien et la production. Une ingestion insuffisante
d’énergie, de protéine, de vitamines et de micro et macro- minéraux ont tous été associés à une
faible performance reproductive.
De toutes ces composantes nutritionnelles, l’énergie est probablement le facteur le plus
intimement relié aux faibles performances reproductives des vaches.
En effet, l’alimentation, et en particulier la couverture des apports énergétiques, est un
facteur de variation de la production d’ovocytes (Armstrong et al., 2001).
45
Les performances de reproduction des femelles sont plus fortement perturbées que celles
des mâles lorsque les besoins énergétiques ne sont pas couverts, soit en cas de sous-
alimentation (due à la sécheresse par exemple) ou de malnutrition, soit en cas de forte
augmentation des besoins : allaitement, gestations, (Ferguson,1996; Enjalbert, 1998).
Les bilans énergétique et protéique dans une ration influencent considérablement les
différentes composantes du cycle sexuel de la vache (Fergusson et Chalupa, 1989).
Ainsi, Butler et Smith (1989) ont montré que la durée des intervalles vêlage-1ère
ovulation et vêlage-conception apparaît directement lié au bilan énergétique et à la
vitesse de mobilisation des réserves corporelles.
D’après la littérature, le déficit énergétique est celui dont les conséquences sont les plus
graves : retard d’ovulation, chaleurs silencieuses, baisse du taux de réussite de
l’insémination artificielle (Enjalbert, 1994; Butler, 2000).
De leur part, Boland et al., (2001) rapportent que les vaches dont l’énergie apportée est
réduite, présentent des follicules dominants de petite taille et davantage de cycles
comportant trois vagues folliculaires.
Une alimentation à faible apport énergétique ou mal équilibrée est en élevage bovin une
cause de nombreux troubles de la reproduction, et la cause dominante des anœstrus
anormalement prolongés après vêlage (Atherthon, 1994 ; Butler, 2000).
1.1/ Mode d’action du déficit énergétique
Les mécanismes par lesquels la nutrition affecte la reproduction sont peu connus ou
incertains. Cependant, il a été rapporté que plusieurs hormones du métabolisme, qui sont
sous la dépendance des apports alimentaires influencent la reproduction (Scaramuzzi et
Murray, 1994).
Ryan et al., (1994), ont trouvé une relation entre les concentrations en IGF1 dans le sang
et la note d’état corporel ; les animaux ayant une note d’état trop haute ou trop basse
avaient de plus faibles concentrations en IGF1 que ceux avec une note intermédiaire.
Chez la vache, l’augmentation des concentrations sériques en IGF-1, consécutive à un
traitement par l’hormone de croissance, provoque un doublement de la population des
follicules « sélectionnables » de 3 à 5mm de diamètre, sans conséquences sur les
niveaux sériques en FSH et LH.
L’importance de l’alimentation et du métabolisme énergétique sur la fertilité se
manifeste le mieux au niveau de la régulation de l’activité gonadique par le système
nerveux central.
46
Les hypothèses les plus couramment admises font appel aux rôles de l’insuline et des
IGF1 (Insuline like growth factor) (Butler, 2000 ; Monget et Martin, 1998). Les IGF
sont synthétisés par le foie sous stimulation de la GH, sauf lors de déficit énergétique. Si
le rôle des faibles teneurs circulantes en insuline et IGF est à peu près admis, le site
d’action de ces déficits hormonaux est moins clair. Cependant, ont été constatées :
- une diminution de sécrétion de GnRH par l’hypothalamus (Terqui et al., 1982).
- une baisse de la sécrétion de la LH par l’hypophyse, et surtout une diminution
de la pulsatilité de cette sécrétion de LH (Butler et Smith, 1989).
- un ralentissement de la croissance folliculaire et donc un retard d’ovulation
(Lucy et al., 1991) ;
- une faible sécrétion de progestérone par le corps jaune (Canfield et Butler,
1991).
D’autre part, Spicer et al., (1990) ; ont constaté que seulement 16,7% des premières
ovulations s’accompagnent de chaleurs observables en bilan énergétique négatif, contre
60% sur les vaches en bilan énergétique positif. L’origine de ces désordres est double :
- une altération de la sensibilité de l’ovaire à l’action de la LH.
- une modification de la pulsabilité de sécrétion de la LH (Butler, 2000).
La relation d’interdépendance entre l’énergie et les hormones de reproduction est due au
fait que le métabolisme, le transport et même l’action de ces composés nécessitent de
l’énergie.
De même, O’Collaghan et al., (2000), rapportent qu’une suralimentation ou une sous-
alimentation peuvent altérer les concentrations hormonales dans le fluide folliculaire.
En effet, chez la truie, une restriction alimentaire en fin de phase lutéale et en début de
phase folliculaire induit une diminution du taux d’ovulation et de la sécrétion
d’œstradiol (Cosgrove et al., 1992).
1.2/ Déficit énergétique et établissement de la puberté : rôle de la leptine.
Monget et al., (2001), ont reporté que dans des situations où la masse adipeuse est
réduite (restriction alimentaire, période de sécheresse, déficit énergétique, dépense
métabolique excessive), le niveau de leptine est abaissé et la puberté est retardée.
En effet, la leptine est une hormone sécrétée par les adipocytes qui sert de signal
métabolique aux aires du cerveau commandant la satiété et le métabolisme (Chilliard et
al., 1998 ; Barb et Kraeling, 2004).
Récemment, Liefers et al., (2003) ont suggéré que la leptine pouvait servir de signal
métabolique au système reproducteur via une action directe sur l’ovaire. Les auteurs ont
47
en effet montré que les récepteurs à la leptine étaient exprimés dans les ovaires bovins et
plus particulièrement dans les follicules quelle que soit leur taille (Tartaglia, 1997). Par
contre, les corps jaunes ne présentent pas ces récepteurs (Bocquier et al. 1998).
Un mécanisme possible de régulation de la reproduction par la leptine mettrait en jeu un
transport de la leptine aux neurones à β- endorphine, qui agiraient sur les neurones à
GnRH (Liou et al., 1997). La leptine aurait également un effet local dans l’ovaire, en
régulant la taille des follicules et certainement la qualité des ovocytes (O’Callaghan et
Boland, 1999). Toutefois, le rôle de la leptine dans le fonctionnement ovarien est
complexe et doit être précisé chez les ruminants (Bocquier et al., 1998).
Le taux circulant de leptine est diminué par une réduction de la prise alimentaire, et ceci
est dû, en partie à la baisse de l’insulinémie. Cette hypo-leptinémie pourrait constituer le
signal informant l’organisme d’un état de sous nutrition. La leptine pourrait être un
signal métabolique, dont la diminution stimulerait l’appétit et diminuerait la dépense
énergétique, tout en inhibant la reproduction (Bocquier et al., 1998 ; Delavaud et al.,
2002).
1.3/ Déficit énergétique et croissance folliculaire
L’état nutritionnel des vaches et notamment l’apport énergétique est le facteur clé dans
la régulation de la croissance folliculaire et de la qualité de l’ovocyte. Un régime riche
en énergie augmente la vitesse de croissance folliculaire via le système IGF folliculaire
et diminue la qualité des ovocytes par des urémies élevées (Armstrong et al., 2002).
Il apparaît qu’un déficit énergétique suite à une restriction alimentaire a un effet
immédiat non seulement sur le taux de croissance folliculaire et son diamètre maximal,
mais affecte aussi la capacité du follicule à ovuler (Diskin et al., 2003). En effet, une
déficience énergétique altère la capacité des follicules à produire suffisamment
d’œstradiol pour assurer l’ovulation chez la vache.
Dans le même sens, une faible sécrétion de progestérone par le corps jaune a été notée
lors d’un déficit énergétique (Lucy et al., 1991 ; Reksen et Ropstad, 2002).
D’autre part, les bilans énergétiques négatifs contrarient le développement des
sécrétions pulsatiles de LH nécessaires au développement des follicules ovariens et à
l’ovulation, en particulier la maturation du follicule de De Graff, voire un arrêt
transitoire de l’activité ovarienne (Wolter, 1973).
De même Murphy et al., ( 1991), ont rapporté qu’une alimentation faible ou pauvre en
énergie est à l’origine de la réduction du diamètre du follicule dominant et de sa
persistance dans la vague folliculaire durant le cycle œstral de la vache. Ils rapportent
48
aussi que la restriction alimentaire tend à augmenter la proportion des cycles œstraux à 3
follicules dominants. (Lucy et al., 1991).
Lors du déficit énergétique, la diminution de concentration sérique en IGF1 observée se
traduit par une baisse de la teneur en IGF1 dans le fluide folliculaire des petits follicules
(moins de 7 mm). Seuls les follicules dont le développement aurait démarré après la fin
d’une période de fort déficit énergétique pourraient conduire à une possibilité
d’ovulation, fécondation et nidation normales (Benoit et al., 1996).
D’autre part, le rôle de l’IGF-1 dans la régulation de la folliculogenèse et son lien avec
le niveau d’apport énergétique fournit donc une relation possible entre nutrition et
folliculogenèse au niveau ovarien plus spécialement.
De leur part, Kendrick et al., (1999) ; Burns et al., (1997) ; Reksen et Rospostad.,
(2002), ont signalé que le déficit énergétique est responsable de troubles de l’activité
ovarienne en l’occurrence la folliculogenèse et la sécrétion hormonale : IGFI,
Progestérone, et œstrogène.
Une situation alimentaire favorable (en particulier vis à vis du bilan énergétique)
s’accompagnant de teneurs plasmatiques en IGF-1 élevées serait donc un stimulant de la
croissance folliculaire (Beam et Butler, 1999). De plus, l’IGF-1 augmente la sensibilité
des cellules de la granulosa à la stimulation par FSH (O’Callaghan et Bolland, 1999).
1.4/ Déficit énergétique et composante hormonale
L’apport en énergie influe sur une grande variété de mécanismes endocriniens, neuraux
et métaboliques. Parmi ces effets, il a été mentionné les changements dans la sécrétion
de la FSH, LH et dans la production de la progestérone pendant le cycle œstral, les
variations de la sensibilité de l’hypophyse et de l’hypothalamus aux stéroïdes et les
changements dans l’activité ovarienne tels que mesurés par la sécrétion hormonale, le
développement des follicules et l’ovulation (Short et Adams, 1988).
De leur part, Mackey et al., (1999) rapportent qu’une absence d’ovulation est toujours
associée à une absence de pic pré-ovulatoir de LH et de FSH et pas nécessairement
associée à une absence d’élévation d’œstradiol en
Pré-œstrus. L’augmentation de la concentration d’œstradiol en pré œstrus parait
dépendre de l’intervalle de temps entre le début de la restriction alimentaire et
l’anovulation.
Dans le même sens, il a été souligné que les effets de la nutrition sur la reproduction
sont souvent dus aux altérations de l’axe hypotalamo-hypophyso-ovarien (Chalupa et
Fergusson, 1989 ; De Rensis et Scaramuzzi, 2003).
49
Les insuffisances énergétiques provoquées par la non disponibilité d’aliments
énergiquement concentrés à cause de la sécheresse ou en post-partum par exemple,
induisent la modification des lipides de l’organisme (Baird, 1982 ; Herdt et Emery,
1992) et la perturbation de la sécrétion hormonale dont la progestérone et l’œstrogène
(Butler, 2000).
Un équilibre énergétique négatif agirait probablement de la même manière que la sous-
nutrition et pourrait intervenir dans le retard de l’activité ovarienne en abolissant la
sécrétion pulsative de LH (Butler et Smith, 1989).
Il a été rapporté que lors d’une sous-alimentation des vaches, la progestéronémie est
élevée (Meikle et al., 2004). Ceci pourrait être du à une réduction du catabolisme de la
progestérone par le foie qui se trouve en surcharge rencontré lors de déficit énergétique.
De plus, comme les stéroïdes sont stockés dans les graisses, n’importe quel régime
nutritionnel entraînant une lipomobilisation pourrait provoquer un relargage de
progestérone.
50
51
1.5/ Indicateurs de la modification du statut énergétique
a/ B.C.S. (Body Condition Score ou note de l’état corporel)
Le B.C.S. traduit l’état nutritionnel et l’état d’engraissement de l’animal à travers la
quantité de tissu adipeux accumulée sous la peau.
Busato et al. (2002), ont montré une bonne corrélation entre le B.C.S. et le profil
métabolique et les hormones liées au métabolisme énergétique chez les vaches normales.
Bien que ce soit une méthode subjective pour estimer les réserves corporelles chez la
vache laitière (Bocquier et al., 1999), la note d’état corporel a, de ce fait, été proposée
comme un outil de gestion de la nutrition, de la reproduction et de la santé dans les
élevages laitiers (Wright et Russel, 1984 ; James et al., 1994).
Domecq et al., (1995) ont rapporté que la mesure des graisses sous la peau des vaches
par une ultra sonde est significativement associée avec le B.C.S. Ils suggèrent que les
résultats d’évaluation visuelle des graisses sous la peau des vaches sont les mêmes que
ceux donnés par la technique de l’ultra sonde.
Cette méthode, visuelle ou par palpation, permet l’évaluation des matières grasses
corporelles, particulièrement sur les proéminences osseuses de la région pelvienne et
épineuse.
Ces repères anatomiques précis peuvent être évalués selon diverses échelles établies,
avec la note la plus faible attribuée à l’état de cachexie et la note la plus élevée accordée
à un état obèse.
Ainsi, Eaerle (1976) a proposé une échelle de 8 grades ; Pullan (1978) a décrit une
méthode permettant de noter les vaches de race Fulani, au Nigéria, selon une échelle de
0 à 5. De même, un autre système de 10 points a été développé par Grainger et
McGowan (1982).
Edmonson et al. (1989) ont proposé une échelle variant de 1 à 5.
Ces méthodes d’estimation ont l’avantage, tout en restant subjectives, de posséder une
reproductibilité et une répétitivité élevées (Agabriel et al., 1992).
Le B.C.S. a été pris en compte dans des travaux antérieurs qui s’intéressent aux
interactions nutrition production de gamètes (Snijders et al., 2000).
En effet, plusieurs études montrent une relation entre la note de l’état corporel et la
production d’ovocytes, ainsi les résultats de Dominguez, (1995) ; PushPakumara et al.,
(2003), ont montré qu’un B.C.S. faible (< 2) influe négativement à la fois sur le nombre
et la qualité des ovocytes.
De même, (Rind et al., 1989 ; Drion et al., 1996) ont révélé que les vaches à B.C.S.
faible (<2) ont moins de follicules en développement durant la phase lutéale du cycle
52
œstral et tendent à produire moins d’ovocytes pendant la phase folliculaire,
comparativement aux vaches à B.C.S. meilleur (≥ 3) .
Dans le même sens, Britt et Williams, (1992) ont rapporté que la qualité de l’ovocyte
dépend des conditions nutritionnelles sous lesquelles le follicule a commencé son
développement c’est à dire au moment de son recrutement dans la vague folliculaire. La
durée de croissance d’un follicule primaire à un follicule pré ovulatoire est entre 84 à 85
jours chez la vache Holstein, (Al-Katanani et al., 2002).
Ainsi, les follicules qui entament leur croissance sous des conditions nutritionnelles
déficientes hébergent des ovocytes inaptes à poursuivre un développement normal
lorsqu’il est fécondé in vitro.
D’autre part, les meilleures réponses à la super ovulation sont obtenues chez les
femelles en bon état général. Ceci s’explique par le fait que les vaches maigres ont
souvent une fonction ovarienne défectueuse (Laizeau, 2003). Certaines équipes de
transfert embryonnaire ne démarrent un traitement de super ovulation chez les vaches à
« haute production laitière » que lorsque celles-ci ne sont plus en courbe négative de
poids corporel et donc en bon état (note d’état ≥ à 3) (Nibart, 1991).
En relation avec les apports alimentaires à long terme, Ryan et al. (1994), Meikle et al.,
2004, ont trouvé une relation entre la concentration en IGF-1 dans le sang et le B.C.S.
(la note d’état corporel) ; les animaux ayant une note d’état corporel (B.C.S.) trop haute
ou trop basse avaient de plus faibles concentrations en IGF-1 que ceux avec une note
intermédiaire.
Cependant, un état corporel sur-conditionné a été reconnu comme étant un facteur de
risque pour les problèmes de santé chez la vache laitière (James et al., 1994).
La note d’état corporel a de ce fait été proposée comme un outil de gestion de la
nutrition, de la reproduction et de la santé dans les élevages laitiers (Wright et Russel,
1984; James et al., 1994 ; Berry et al., 2003).
b/ Paramètres métaboliques
Il s’agit de la glycémie, des teneurs plasmatiques en Acide Gras Non Estérifié
(A.G.N.E.), le cholestérol et corps cétoniques et plus particulièrement en β-
Hydroxybutyrate (β-OH) (Whitaker et al., 1993 ; Laizeau, 2003).
Lorsque le déficit énergétique augmente, les teneurs plasmatiques en A.G.N.E. et
β-OH augmentent alors que la glycémie diminue (Whitaker et al., 1993).
Si la glycémie représente la disponibilité en substrats énergétiques, les acides gras non
estérifiés et β-Hydroxybuyrate sont en revanche les témoins de la mobilisation des
53
réserves corporelles par l’hydrolyse des triglycérides et libération du glycérol et
A.G.N.E. Les corps cétoniques apparaissent en cas de déficit énergétique important. Ils
peuvent aussi être issus de la mobilisation des acides aminés cétogènes et issus du
métabolisme du butyrate dans la paroi du rumen.
C’est ainsi que l’augmentation des concentrations en A.G.N.E. et en β-OH est d’autant
plus importante que le déficit énergétique et la perte de poids sont marqués (Whitaker et
al., 1993).
Le cholestérol plasmatique apparaît être un bon indicateur du potentiel à la production
d’ovocytes. Il existe une différence significative quant au nombre d’ovocytes récoltés
selon le niveau de la cholestérolémie. Pour Nibart (1991), un niveau bas de cholestérol
total plasmatique (lié au syndrome de la vache grasse) est associé à une faible
production d’embryons viables, et un niveau élevé de cholestérol total plasmatique est
associé à un faible taux de collecte d’ovocytes et à la présence de follicules kystiques.
Ryan et al. (1992) ont constaté une augmentation significative de la cholestérolémie
chez la génisse allaitante sous l’influence d’un régime à teneur élevée en lipides (5.4%
en plus par rapport au témoin). Parallèlement, le nombre de follicules de taille moyenne
en fin de traitement (5.0 à 9.9 mm) était augmenté.
D’autre part, les cellules de la granulosa des follicules pré ovulatoires des vaches
nourries à régime riche en lipides, secrètent 2.1 à 3.5 fois plus de progestérone in vitro
(Wehrman et al., 1991).
2/ Excès protéiques
Les matières azotées sont indispensables à l’entretien et servent à la réparation de
l’usure de l’organisme résultant du fonctionnement des appareils circulatoire,
respiratoire, des sécrétions glandulaires, digestif etc.…..Cette déperdition azotée due au
mécanisme du renouvellement des tissus correspond aux besoins d’entretien, qui sont
proportionnels au poids du corps des animaux. En plus de cette dépense, l’élaboration de
nouveaux tissus qu’imposent les diverses productions animales à fournir (lait et viande)
exige des quantités importantes de matières azotées.
Armstrong et al., 2001, ont remarqué qu’un régime alimentaire riche en protéines induit
des changements dans le système IGF (Insuline Growth Factor) ovarien en l’occurrence
augmente la sensibilité des follicules à la FSH.
Cependant, en élevage bovin, l’excès en protéines cause plus de problèmes que sa
déficience (Hibbit et Haresign, 1988).
54
En effet et contrairement à l’alimentation énergétique, c’est l’excès azoté qui semble le
plus préjudiciable à la reproduction dans les systèmes d’alimentation actuels (Wallace,
1991).
Les éleveurs, cherchant à améliorer la production laitière ont tendance à apporter des
rations excédentaires en protéines, entraînant une augmentation de la concentration
plasmatique en urée (Elrod et Butler, 1993). Il est connu, qu’une alimentation trop riche
en protéines provoque une augmentation de la concentration en urée dans le lait et le
plasma ; cette augmentation est également reliée à une baisse de la fertilité.
En effet, lors d’un déficit énergétique on assiste à une mobilisation des protéines
corporelles qui seront utilisées pour la formation du glucose à partir des acides aminés
(néoglucogenèse). L’ammoniac (NH3) formé suite à cette néoglucogenèse se converti en
urée au niveau du foie puis éliminé par les reins.
2.1. Mode d’action d’un excès protéique
Les apports protéiques touchent la reproduction via des effets directs sur le
fonctionnement du corps jaune (baisse du taux de progestérone) et sur l’environnement
utérin où les déchets toxiques du métabolisme de l’azote, y compris l’ammoniac du
rumen, peuvent être incompatibles avec la survie du sperme, de l’ovule ou de l’embryon
(Greenhalf et Doggory, 1971 ; Jordan et Swanson, 1979 ; Elrod et Butler, 1993). Elles
altèrent aussi la fonction endocrine (Visek, 1984).
D’autre part, lorsqu’il y a excès protéique il y a formation d’ammoniaque, puis d’urée.
Ces produits de dégradation des excès protéiques sont toxiques et leur élimination ou
leur détoxification nécessite de l’énergie. Ce processus entraîne l’utilisation d’énergie et
aggravation du déficit énergétique (installé en post partum) avec ses répercussions sur
les performances de reproduction (Wallace, 1991).
En effet, Papadopoulos et al., (2001) ont émis l’hypothèse selon laquelle les effets
délétères de l’urée sur la qualité des ovocytes et la survie de l’embryon pouvaient être
variables selon l’apport énergétique. Ils ont ainsi montré que des génisses supplémentées
par de l’urée et alimentées par une ration couvrant la moitié des besoins énergétiques
avaient une concentration en urée plasmatique supérieure à celle des génisses dont la
ration couvrait le double des besoins énergétiques. En effet, l’énergie est nécessaire à
l’utilisation de l’urée introduite dans la ration chez les ruminants. Aussi, un déficit
énergétique peut accentuer les effets des excès d’urée. Ceci explique que l’urée soit à la
fois un marqueur de l’apport protéique mais aussi énergétique (Miettinen, 1990).
55
2.2. Indicateurs sériques du métabolisme azoté
Nous envisagerons successivement, les protéines totales, l’albumine et l’urée.
a/ Les protéines totales
Les protéines totales ont comme source les apports protidiques alimentaires chez tous
les mammifères (Diarra, 1994).
Toutefois, les ruminants bénéficient d’une source endogène non moins importante
représentée par les protéines microbiennes synthétisées par les bactéries du rumen à
partir d’ammoniac (provenant des matières azotées) et d’acides aminés en présence
d’énergie (Rivière, 1991).
La protéosynthèse hépatique engendre aussi une importante quantité de protéines,
notamment les protéines sanguines. En effet, parmi les protéines on trouve, les protéines
du sang et les protéines du lait.
Les protéines du sang sont constituées de plusieurs fractions dont l’albumine et les
globulines ; synthétisées par le foie et stockées par ce même organe et par le muscle.
Les bovins peuvent aussi avoir recours lors de besoins élevés ou de malnutrition à leurs
propres protéines corporelles (Chillard et al., 1983).
Les protéines contribuent à l’homéostasie en assurant parallèlement d’autres fonctions :
elles constituent la matière première, jouent le rôle de précurseur dans la synthèse
d’hormones et d’enzymes, assurent le transport des substances endogènes et
interviennent dans la régulation de la pression oncotique (Abdellaoui, 1972).
b/ L’albumine
L’albumine est la plus importante forme d’emmagasinement des protéines. Elle est
synthétisée dans le foie et est catalysée par tous les tissus de l’organisme
métaboliquement actifs (Kaneko, 1989). L’albumine représente en moyenne 50 à 60%
des protéines sériques.
L’albumine pouvant servir de sources d’acides aminés, intervenant dans la régulation de
la pression osmotique, dans le transport des ions, des acides gras, et des hormones
(Kaneko, 1989).
L’albuminémie peut être influencée par plusieurs facteurs notamment l’âge, le stade
physiologique et la saison (Hanton et Tumba, 1985).
c/ L’urée
56
Il existe une relation entre l’urémie et le niveau protéique de la ration. L’urémie est
aussi influencée par la nutrition énergétique et notamment le rapport protéo-énergétique
de la ration (Laizeau, 2003).
Les apports élevés en protéines (50% au delà des besoins) ou à teneurs élevées en
protéines facilement dégradables provoquent l’augmentation de l’urémie et la
diminution de la glycémie (Canfield et al.,1990).
L’urémie augmente linéairement avec la perte de poids au cours d’une épreuve de
restriction alimentaire chez la génisse.
En somme, l’urémie est un paramètre mixte dont les variations doivent être appréciées
en fonction du statut énergétique.
Les protéines et l’énergie sont deux facteurs très importants dans le maintien de la
fonction de reproduction. L’action conjuguée de ces deux facteurs résulte de deux
mécanismes :
- d’un excès protéique, résulte la formation d’ammoniaque, puis d’urée. Ces
produits sont toxiques, leur élimination et détoxification nécessitent de l’énergie et un
déficit énergétique pourrait s’installer.
- Quand le déficit énergétique est déjà installé, il y aurait mobilisation des
protéines et /ou de graisses. Ce processus nécessite de l’énergie et donc aggravation du
déficit énergétique.
Ainsi chez la vache, la situation la plus confortable est celle qui correspondrait à un
équilibre protéo-énergétique puisqu’il y a interdépendance entre énergie et protéine
(Owen, 1979).
3. Vitamines et minéraux a/ Vitamines
Plusieurs recherches rapportent l’importance du rôle de la vitamine E dans l’état de
santé des vaches mais aussi sur leur fertilité (Allison et Laven, 2000 ; LeBlanc et al.,
2002; LeBlanc et al., 2004 ).
De leur part, Tiboni et al., (2004), suggèrent que les vitamines ont une modulation
potentielle et locale du développement folliculaire . Ainsi, une baisse de β- carotène
(antioxidant) dans le fluide folliculaire en réponse à un stress oxydatif imposé par la
cigarette est à l’origine d’une baisse significative du taux de fertilisation des ovocytes
chez les femmes qui fument.
Haliloglu et al., (2002) révèlent que le plus grand niveau de vitamine A dans le plasma
est enregistré en période de grande activité folliculaire : en pro-œstrus et en œstrus.
57
Contrairement à la vitamine A, les concentrations plasmatiques et du fluide folliculaire
en β- carotène, atteignent leur pic pendant la gestation c’est à dire quand la fonction
lutéale est à son maximum.
D’autre part, Bormann et al. (2003) suggèrent que l’addition de vitamines pendant la
maturation des ovocytes in vitro est bénéfique pour le développement au stade
blastocyste et la viabilité de l'embryon.
En effet, ajouter des vitamines dans le milieu de maturation des ovocytes de porc
augmente significativement le taux d’ovocytes qui ont complété la maturation
cytoplasmique et seront donc capables de mener le développement embryonnaire.
b / Minéraux
La nutrition minérale est aussi importante pour la maintenance des processus
reproductifs, le calcium, le phosphore, le magnésium, le potassium, le manganèse, le
sélénium, et l’iode, sont importants pour maintenir le processus de reproduction chez la
vache (Atherthon, 1994 ; Wichtel et al., 2004).
L’infertilité causée par une déficience en phosphore a lieu suite à d’autres signes tel que
perte de poils et baisse de l’appétit (Atherton, 1994). Pour le manque de phosphore, il se
traduit par une irrégularité de l’œstrus et diminution de l’activité ovarienne.
Alderman, (1970) a révélé que l’effet de l’hypophosphorémie sur la fertilité apparaît à
partir 0.16 à 0.20% de phosphore dans la matière sèche ingérée.
La déficience en sélénium chez les vaches est généralement aperçue après les rétentions
placentaires observées chez les vaches recevant des fourrages avec moins de 0.05mg/Kg
de sélénium (Trinder et al., 1969). Hemingway, (2003) a révélé que le Sélénium est
nécessaire et important pour les résultats de super ovulation chez la vache.
Le zinc, le cuivre et le manganèse sont classés parmi les minéraux qui ont un grand
impact sur la reproduction des bétails. Ils sont nécessaires à la croissance, au
développement et à la survie de l’embryon (Hostetler et al., 2003).
Dans le même sens, toute carence en Zinc, entraîne une diminution marquée de la
fertilité et de la fécondité chez la femelle (Lamand, 1975).
De plus, un manque de zinc accroît le risque de kystes folliculaires (Weaver, 1987).
Le cuivre affecte aussi les paramètres de reproduction bovine. Ainsi, à toute carence en
cuivre est associée une diminution de l’activité ovarienne, des mortalités embryonnaires
et des avortements (Hidiroglou, 1979).
58
Atherthon, (1994) a reporté que le complexe cuivre – histidine produit dans
l’hypothalamus est impliqué dans la sécrétion de l’hormone de libération de l’hormone
lutéinisante (LHRH).
B/ Stress et maladies intercurrentes
Le stress est l’une des causes de baisse de fertilité dans les troupeaux. Toutes les
maladies intercurrentes (mammite aiguë, boiterie, parasitisme…..), toutes les
hyperthermies d’origine diverses, sont des formes de stress et exerçant une action
défavorable sur la fonction ovarienne et la qualité des ovocytes ou des embryons
(Nibart, 1991).
Ainsi, tout stress avant et pendant le traitement de super ovulation est néfaste puisqu’il
conduit à la formation d’ACTH, et/ou à empêcher la décharge de LH et favoriser ainsi,
soit la formation de kystes ovariens, soit l’ovulation d’ovocytes de mauvaise qualité
(Nibart, 1991).
Les maladies métaboliques (syndrome vitulaire, affections hépatiques,…..) retentissent
sur la fonction ovarienne.
De même, la présence de kystes ovariens conduit à une activité ovarienne pratiquement
nulle (Nibart, 1991).
Les conséquences d’une contamination par le virus B.V.D. (Bovine Viral Disease) sont
diverses. Bien que le virus B.V.D. soit un agent connu de mortalité embryonnaire, les
conséquences d’une contamination des systèmes de production d’embryons in vitro sur
leur rendement semblent être faibles (Kafi et al., 1997 ; Chastant et Maillard, 1999).
De nombreuses études indiquent que les techniques standard de lavage d’ovocytes après
leur collecte permettent d’éliminer le virus de la surface des cellules. Cependant, la
présence de virus B.V.D. dans les liquides ovariens et oviductaux peut expliquer les
pertes considérables par mortalité embryonnaire observées lorsque les vaches sont
infectées (Chastant et Maillard, 1999).
59
Chapitre III : Collecte et maturation des ovocytes
I/ Facteurs de variation du rendement de la collecte des ovocytes
1/ Disposition des follicules dans le cortex ovarien
(Facteur endogène)
Une coupe d’ovaire permet de visualiser les follicules ovariens qui se présentent depuis
leur stade initial ou follicule primordial jusqu’au stade de follicule mûr ou dominant,
libérant l’ovocyte.
L’apparition de follicules en surface de l’ovaire semble dépendre de la profondeur du
cortex à laquelle ils sont localisés.
En effet, des coupes histologiques de l’ovaire montrent deux régions structurellement
distinctes : une zone centrale ou médulla, par où pénètrent l’innervation et la
vascularisation sanguine et lymphatique (région du hile) et une zone périphérique ou
cortex, comprenant l’épithélium germinatif et le stroma cortical séparés par l’albuginée
dont l’épaisseur est très variable (Ingrid et al. 1996).
Les follicules se développent toujours dans la partie corticale de l’ovaire (Derivaux et
Ectors, 1989). Des études ont révélé une variabilité de leur distribution au sein de cette
zone Ingrid et al. (1996). Ainsi, si chez certaines races ces follicules sont en majorité en
localisation subsuperficielle et donc visibles en surface (à 1 mm de profondeur,
Miyamura et al., 1996). Chez d’autres comme c'est le cas de la race Buffalo, ils sont
distribués à différents niveaux du cortex mais en majorité en profondeur par conséquent
non visibles en surface (Kumar et al., 1997).
2/ Technique de collecte (facteur exogène)
Il existe différentes méthodes de récolte des ovocytes :
- à partir d’ovaires ramenés des abattoirs soit par ponction et aspiration des
follicules de 2 à 8 mm (Kumar et al., 1997) ou encore par le slicing des ovaires (Cognié
et Baril, 2002), cette technique permet de récupérer les ovocytes présents dans tous les
follicules quelque soit leur localisation au niveau du cortex ovarien (Hochi et al., 1993 ;
Ward et al., 2001; Annemarie et al., 2003).
Le rendement en ovocytes varie selon la technique utilisée : 2.35 ovocytes sont collectés
par vache et par session en utilisant l’aspiration directe des follicules apparents. Ce
rendement passe à 3.10 et 6.25 par les techniques respectivement de ponction et le
slicing (Kumar et al., 1997)
60
- Les ovocytes immatures peuvent aussi être ponctionnés à partir des vaches
vivantes, par voie transvaginale à l’aide d’un pistolet muni d’une sonde à ultrasons et
d’une aiguille rétractable reliée à un système d’aspiration. C’est la technique de la
ponction échoguidée ou OPU (Ovum Pick Up). L’image échographique lui permet de
repérer les follicules cavitaires. En moyenne, 3 à 4 complexes ovocyte cumulus (COC)
sont obtenus à chaque séance, mais une importante variabilité est notée entre les
femelles donneuses d’ovocytes (Colleau et al., 1998). L’opération peut être répétée une
à deux fois par semaine pendant plusieurs mois sans affecter apparemment la fertilité
ultérieure des animaux (Nibart et Marquant-Leguienne, 1995).
II/ Maturation des ovocytes in vitro (M.I.V.)
Il existe deux possibilités :
-Obtenir la maturation nucléaire et surtout cytoplasmique des ovocytes ayant déjà
acquis la compétence complète pour reprendre la méiose et provenant de follicule à
antrum ;
-Obtenir la croissance d’ovocytes présents dans de petits follicules primordiaux,
primaires ou secondaire jusqu’à l’acquisition de la compétence nucléaire et ensuite leur
maturation complète in vitro.
1/ Le milieu de base
Tous les milieux de culture classiques (MEM, TCM199, TALP, Waymouth, Ham-F12,
SOF, B2….) ont été utilisés pour la maturation.
Le milieu le plus généralement utilisé pour la maturation est le TCM199, un milieu
tamponné au bicarbonate, contenant des sels minéraux, des sources de carbone et
d’énergie (glucose, glutamine) ainsi que des acides aminés et des vitamines. La présence
d’acides aminés paraît indispensable à la qualité de la maturation, ceci étant
particulièrement vrai pour les acides aminés soufrés (cystine, cystéine) intervenant dans
le métabolisme du glutathion et pour la glutamine, une des principales sources d’énergie
de l’ovocyte. L’albumine sérique bovine (BSA) ainsi que des liquides biologiques
complexes (sérum bovin fœtal, sérum de femelle en œstrus, liquide folliculaire) sont
souvent ajoutés à ce milieu dont l’effet empêche l’adhésion des complexes cumulus
ovocytes entre eux et au support de culture (Mermillod, 2001).
Les conditions physiques utilisées pour la maturation sont généralement celles de la
température centrale de l’espèce (37° pour les primates et les petits rongeurs; 39° pour
les mammifères domestiques), sous une atmosphère d’air contenant 5% de Co2 saturée
61
en humidité, pour une durée de 24 heures (souris, ruminants) à 44 heures (humain, porc)
(Mermillod, 2001).
2/ Hormones
L’effet des hormones gonadotropes (FSH et LH) sur la qualité de la M.I.V. reste très
controversé malgré de nombreuses études (Bevers et al., 1997).
Les divergences des résultats tiennent à la présence ou non de sérum ou de fluide
folliculaire et pouvant masquer ou amplifier leurs actions (Algriany et al., 2004).
Toutefois, la FSH potentialise l’action de facteurs de croissance et stimule l’expression
du récepteur LH qui a une action directe sur le métabolisme ovocytaire, augmentant la
glycolyse et la phosphorylation oxydative. Elles exercent leurs actions via les cellules
du cumulus.
La GH accélère la maturation nucléaire, stimule l’expansion du cumulus et améliore le
taux de développement au stade blastocyste, ceci en absence de sérum et d’hormones
gonadotropes (Izadyar et al., 1998). La GH aurait donc un effet sur la maturation
nucléaire et également sur la maturation cytoplasmique, ce dernier effet résulterait d’une
accélération de la migration des granules corticaux. Cette action de la GH est également
transmise par le cumulus.
62
DEUXIEME PARTIE
MATERIEL ET METHODES
63
Ce travail a été réalisé sur des ovaires de vaches de deux races, une race locale du
Maroc : la race Blonde « Oulmès Zaer » possédant des aptitudes exceptionnelles
d’adaptation au milieu difficile, mais des niveaux de production de lait et de viande
faibles (Boujnane, 2002), une race exotique : la Holstein ou Frisonne et de leur produit
de croisement (Annexe 1).
Cette étude s’est déroulée de 1999 à 2003, les ovaires sont prélevés au niveau des
abattoirs locaux de l’axe : Kenitra- Casablanca qui drainent un nombre important de
d’animaux pour l’abattage.
I/ Conditions pluviométriques des années 1999 et 2000
Les données pluviométriques (M.A.D.R.P.M.) (Annexe 5) montrent que les
précipitations moyennes annuelles calculées sur une période de 9 mois de septembre à
mai des campagnes agricoles : 1998-1999, 1999-2000 et 2000-2001 étaient
respectivement de 210.8 mm, 259.1mm et 320.9 mm. L’année 2000 était donc la période
la plus pluvieuse et que les années 1998 et 1999 étaient jugées comme années à faible
pluviométrie (Figure 6).
Cette étude s’est déroulée de 1999 à 2003, les ovaires sont prélevés au niveau des
abattoirs locaux de l’axe : Kenitra- Casablanca qui drainent un nombre important de
d’animaux pour l’abattage.
II/ Animaux de l’étude
D’après les données du Ministère de l’Agriculture, du Développement Rural et des Pêches
Maritime (Annexe 5), la pluviométrie semble être variable selon les régions du Maroc d’où la
nécessité de considérer la provenance de nos animaux et la pluviométrie enregistrée dans ces
régions (Figure 7).
D’après l’enquête menée aux abattoirs, les vaches considérées dans cette étude
proviennent de régions différentes : Casablanca, Tiflet, Salé, Khmisset et Fkih Bensaleh.
La majorité d’entre elles (38.46%) provient des environs de Salé qui relève de la station
météorologique du Gharb –Zaer et regroupe également les régions de Larache,
S.Slimane, Kenitra et Rabat Salé (tableau 1).
26.92% des vaches proviennent des environs de Casablanca qui appartiennent à la
station de Chaouia- Doukkala et regroupe aussi les villes de Casablanca, El Jadida et
Nouasser.
64
0
20
40
60
80
100
120
140
Septem
bre
Octobr
e
Novem
bre
Décem
bre
Janv
ier
Févrie
r
Mars
Avri l
Mai
Mois
mm
1998-1999
1999-2000
2000-2001
Figure 6 : Evolution des précipitations mensuelles relevées au cours des campagnes
agricoles (1998-2001).
Le reste des vaches proviennent soit de Tiflet (15.38%), de Khmisset (5.76%) ou du
Fkih Bensaleh (13.46%).
Provenance des
vaches
Casablanca Tiflet Salé Khmisset Fkih-
Bensaleh
Effectif et (%) 14(26.92) 8(15.38) 20(38.46) 3(5.76) 7(13.46)
Vaches non
engraissées (%)
13 (92.85) 7 (87.5) 20(100) 2(66.66) 7(100)
Tableau 1 : Provenance et type d’élevage des animaux d’étude.
65
0
100
200
300
400
500
600mm/an
1998-1999 1999-2000 2000-2001
Campagnes
Chaouia-Doukkala Gharb-Zaer
Figure 7 : Evolution des précipitations annuelles entre les campagnes 1998-2001 dans
les régions du Gharb-Zaer et Chaouia – Doukkala.
La présente étude a été effectuée sur 259 vaches, réparties comme suit :
- Les ovaires de 149 vaches ont été prélevés au cours de la période printemps – été
des années 1999 et 2000. Sur ces ovaires ont été déterminés : la population folliculaire
entre 2 et 8 mm, le nombre et la qualité des ovocytes, ainsi que le taux de leur
maturation.
- L’étude histologique qui a été effectuée sur les coupes minces de 30 ovaires (1
ovaire est pris de chaque vache); 15 ovaires de la race locale et 15 ovaires des vaches
croisées à raison de 5 ovaires par tranche d’âge considérée.
- L’effet de facteurs génétiques et non génétiques avec les ovaires de 80 vaches dont
on a relevé la race, l’âge et le B.C.S ont été considérés. Le nombre de follicules de 2 à 8
mm est compté sur les ovaires ainsi que le nombre d’ovocytes récupérés suite à la
ponction de ces follicules.
Des indicateurs du métabolisme énergétique et azoté ont été dosés chez ces vaches.
Les investigations ont été réalisées au niveau des abattoirs de Salé, Bouknadel, Rabat et
Casablanca (axe Kenitra- Casablanca, Maroc).
A noter que depuis la campagne agricole 2000-2001 jusqu’à 2003, les conditions
climatiques d’après les données pluviométriques du M.A.D.R.P.M. étaient homogènes et
semblables.
66
III. Protocole expérimental
1. Détermination de l’âge
L’âge des vaches a été déterminé par l’observation de la dentition, (Tableau 2).
Dentition Age de la vache
Dents de lait ≤ à 24 mois
Deux dents adultes 2 ans <âge≤ 3 ans
Quatre dents adultes 3 ans <âge≤ 4 ans
Six dents adultes 4 ans <âge≤ 5 ans
Bouche faite > 5 ans
Tableau 2 : Méthode de détermination de l’âge de la vache
2. Note de l’état corporel
La mobilisation des réserves corporelles a été estimée grâce à la mesure de la note de
l’état corporel (body condition score – B.C.S.) de chacune des vaches.
L’état corporel des animaux a été estimé pour chaque vache et par la même personne en
se basant sur l’aspect extérieur de la région lombaire, du bassin et de la croupe ainsi que
de l’attache de la queue (Edmonson et al., 1989) (Annexe 8).
B.C.S. Etat corporel
1-2 Vaches maigres
3 Vaches à réserves corporelles
moyennes
4-5 Vaches avec de grandes
réserves corporelles
Tableau 3 : Note de l’état corporel des vaches
67
Race Locale
(Oulmès - Zaer)
croisée
(Locale x
Exotique)
Exotique
(Frissone,
Holstein)
Age (ans) < 3 3-5 > 5 < 3 3-5 > 5 < 3 3-5 > 5 Total
2 - - 19 - 1 4 - 1 3 28
3 - 2 3 - 8 7 6 5 4 35
4 - 2 - 1 3 - 1 2 2 11
B
C
S
5 - - - 2 2 - 1 1 - 6
Sous total - 4 22 3 14 11 8 9 9 80
Total 26 28 26 80
Tableau 4 : Distribution des vaches de l’étude selon la race, l’âge et le B.C.S.
3. Prélèvement des ovaires.
Les ovaires sont prélevés immédiatement après l’abattage et rincés avec une solution de
chlorure de sodium à 0,9% puis désinfectés avec de l’alcool éthylique à 70%. Ils sont
transportés au laboratoire dans des flacons individuels contenant une solution saline
(0,9%) ou dans du PBS (Annexe 4) et placés dans une bouteille isotherme à une
température de 32 à 35°C dans les deux heures qui suivent l’abattage.
Tous les prélèvements ont eu lieu dans la même période de l’année qui est printemps –
été pour éviter l’effet saison qui a été rapporté par plusieurs auteurs (McDonald, 1980 ;
De Rensis et Scaramuzzi, 2003).
Sur chaque ovaire, les follicules apparents de 2 à 8 mm, mesurés à l’aide de calliper
(Dewit et al.,2001), ont été comptés puis aspirés.
4. Etude Histologique des coupes d’ovaires
Nous avons retenu un seul ovaire par vache pour cette étude car d’après les résultats de
Rajakoski, (1960), la distribution des follicules est globalement homogène dans les deux
ovaires. De sa part, Tanaka et al., (2001) n’a considéré qu’un seul ovaire prélevé de
femelles bovines pour évaluer le nombre de follicules présents dans cet organe.
Ainsi, nous avons utilisé 30 ovaires dont 15 de la race locale Blonde Oulmes-Zaer et 15
de la race croisée.
Les ovaires se répartissent entre les différents âges : 5 ovaires par tranche d'âge de
chaque race.
a. Préparation des coupes histologiques pour microscopie photonique
68
Nous avons utilisé la technique classique : la fixation de l’ovaire entier a été faite au
Bouin de Hollande sublimé (Annexe 2) pendant une période allant de 7 à 10 jours. La
déshydratation est faite dans des bains successifs d’Ethanol de degrés croissants : 70°,
95° et 100° avec 3 bains de 4 heures dans chaque solution, la dilution de l’alcool se fait
selon la table de Gay Lussac (Langeron, 1949). La dernière étape de déshydratation est
le séjour de la pièce dans un bain de toluène ou d’alcool butylique pendant 16 heures.
L'inclusion dans la paraffine, a eu lieu après une imprégnation de la pièce par deux
bains de paraffine (8 heures dans chaque bain). La moitié de chaque ovaire est débitée
en coupes transversales sériées de 5µm d’épaisseur (Blondin et Sirard, 1995 ; Ingrid et
al., 1996). Une coupe sur 5 est montée sur lame histologique puis séchée dans une étuve
à 40 –45°C pendant 24 heures.
Après déparaffinage dans deux bains successifs de toluène de 10 minutes chacun et
réhydratation, les coupes sont colorées.
La coloration utilisée est celle de l’hématoxyline (coloration du noyau) et éosine
(coloration du cytolplasme), (Pearse, 1969) (Annexe 2).
Pour chaque ovaire, 20 coupes choisies de manière régulière dans la série de lames sont
étudiées. La structure du cortex ainsi que la répartition des follicules sont observées à
l'aide d'un microscope.
Les photographies ont été réalisées à l’aide d’un photo microscope muni de camera au
grossissement : x 100.
b. Méthode d’évaluation de la population folliculaire
Afin de rendre compte du pourcentage des aires occupées par les follicules et le stroma,
la surface des follicules est évaluée à partir de la mesure de leur diamètre à l’aide d’un
oculomicromètre, (Kumar et al., 1997), le follicule étant considéré circulaire (Maurasse
et al., 1985). Les surfaces occupées par les follicules sont calculées par l’accumulation
des surfaces des différents follicules observés. Pour chaque lame, 10 à 12 champs ont
été balayés et la surface occupée par les follicules a été estimée et exprimée par rapport
au champ du microscope.
Il est à remarquer que pour les différentes sections, les champs balayés étaient traités de
façon identique.
5. Prélèvements sanguins
Les prélèvements sanguins ont été effectués aux abattoirs par ponction de la veine
jugulaire des vaches. Le sang est récolté dans des tubes héparinés de 10 ml sous vide et
69
étiquetés. Le sang prélevé est conservé sur place dans une glacière portative, puis
transporté au laboratoire pour la centrifugation.
Le sang est centrifugé à 2100 x g pendant 30 min. Les sérums recueillis sont
conditionnés dans des aliquotes puis congelés à –20°C jusqu’au jour de l’analyse.
6. Les méthodes de dosage des protéines totales, albumine, urée,
β-OH et G.O.T. (ou A.S.A.T.) (Annexe 3)
7. Ponction des follicules et collecte des ovocytes.
a. Ponction des follicules
Les follicules de 2 à 8mm (taille folliculaire qui correspond au stade de compétence
méiotique de l’ovocyte) de diamètre, visibles à la surface de l’ovaire sont
ponctionnés à l’aide d’une aiguille de 20-gauge (0.9-1mm de diamètre interne) reliée
à une seringue de 10ml.
b. Collecte des ovocytes
Dans le cas d’estimation du rendement ovocytaire par ovaire, après aspiration
folliculaire, le contenu de la seringue est placé dans une boite de pétrie contenant le
milieu PBS et examinés sous une loupe (x14) : le nombre des ovocytes et leur qualité
sont notés.
Lorsque les ovocytes sont destinés au développement in vitro c'est-à-dire la M.I.V., le
contenu de la seringue est placé dans un tube conique contenant 2,5 ml de milieu de
collecte.
c. Composition du milieu de collecte : (Annexe 4)
8. Evaluation morphologique de la qualité des ovocytes :
Les ovocytes sont recherchés sous une loupe binoculaire (x 14) et jugés selon leur
aspect morphologique puis classés selon la méthode de De-Loos et al., (1989), en tenant
compte de l’homogénéité du cytoplasme et des couches de la granulosa.
- Qualité 1 (Q1) : Cumulus pluristratifié (plus de trois couches) compacté et un
cytoplasme homogène.
- Qualité 2 (Q2) : Cumulus compacté à une ou deux couches et un cytoplasme
homogène.
70
- Qualité 3 (Q3) : Cumuls moins compacté et un cytoplasme moins régulier avec des
zones sombres.
- Qualité 4 (Q4) (mauvaise qualité ou qualité anormale) : sans cumulus, avec un
cytoplasme irrégulier.
Pour chaque vache, le nombre d’ovocytes recueillis a été noté ainsi que leur score.
9. Maturation In Vitro (M.I.V.)
On laisse sédimenter les tubes avec le contenu de la seringue et le milieu de collecte
pendant 20 mn à 39°C. Le culot est prélevé et les ovocytes recherchés sous la loupe
binoculaire. Seuls les ovocytes présentant un cumulus compact et un cytoplasme
uniforme sont sélectionnés pour la maturation (Ovocytes de qualité : Q1, Q2 et Q3).
Ceux-ci sont rincés 2 fois dans le milieu de collecte et une fois dans le milieu de
maturation avant d’être mis à maturer.
a. Composition du milieu de maturation : (Annexe 4)
b. Mise en culture
Les ovocytes à cumulus compact sont incubés 24 à 26 heures à 39°C sous 5% de CO2
dans l’air et dans du milieu de maturation auquel des cellules de granulosa en
suspension ont été rajoutés à raison de 5 106 cellules par millilitre.
Les cellules de la granulosa sont obtenues après 2 centrifugations de 10 mn à 200g des
tubes de collecte (liquide folliculaire obtenu lors de la ponction des follicules et après
avoir pris le culot du fond des tubes) et 1 centrifugation de 5mn à 200g dans le milieu
de maturation.
IV. Analyses statistiques
Les résultats obtenus sont exprimés sous forme de moyennes pondérées accompagnées
d’erreurs standard (X ± ESM). Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de
logiciel SPSS (Statistical data analysis software Package for Social Scientists, version
10.0, 2000 pour Windows). La comparaison des différents paramètres a été effectuée en
utilisant l’analyse de la variance à un seul critère (ANOVA 1).
Afin d’affiner l’analyse, le test de comparaison des moyennes (test t de Student) a été
utilisé au niveau de signification de 5%.
De même, des tests de corrélations ont été effectués entre certains paramètres au niveau
de signification de 5%.
71
Pour évaluer l’importance les liens qui peuvent exister entre les différents paramètres et
la population folliculaire ainsi que le rendement qualitatif et quantitatif en ovocytes
d’une part et d’autre part entre ces paramètres et l’état énergétique de la vache, une
analyse factorielle des correspondances (A.F.C.) a été menée.
Les 12 variables étant observées et mesurées pour chaque vache, nous disposons ainsi
d’un tableau conforme à l’application de l’analyse factorielle des correspondances
(A.F.C.). Cette technique d’analyse, basée sur la métrique du χ2, permet l’estimation de
la consistance des liens existant entre les 12 variables (Annexe 7).
72
TROISIEME PARTIE
RESULTATS
73
Chapitre I : Population folliculaire et rendement en ovocytes
L’étude a porté sur 298 ovaires indépendamment de la race, de l’âge et du B.C.S. des
donneuses, 137 et 161 collectés pendant les printemps et été respectivement des années
1999 et 2000. Les deux années de l’étude étaient caractérisées par des conditions
pluviométriques différentes. La première était à faible pluviométrie à moyenne
annuelle : 259.08mm, la seconde s’est distinguée par une pluviométrie relativement
abondante avec une moyenne annuelle de 320.9 mm.
Seuls les follicules de 2 à 8 mm de diamètre sont considérés en rapport avec l’objectif
de l’étude qui est la sélection d’ovocytes pour développement in vitro car la compétence
de l’ovocyte au développement in vitro est dépendante du stade de développement
folliculaire : les follicules dont le diamètre est supérieur à 2 mm hébergent des ovocytes
capables de maturer in vitro. Chez la vache, c’est seulement à partir de follicules de
taille moyenne supérieure à 2 mm que la reprise de la méiose est possible. La
considération des follicules à diamètre inférieur à 2mm réside également dans le fait que
la dégénérescence de l’ovocyte suite à l’atrésie est plus fréquente à ces stades. Pour le
choix du diamètre des follicules moins de 8 mm, il a été montré que la lutéinistion ou
l’hypertrophie des cellules thécales au moment de l’atrésie arrivent souvent dans les
follicules dont le diamètre est plus de 8 mm (Marion et al., 1968).
I. Population folliculaire
L’évaluation quantitative de la population folliculaire a consisté en un comptage des
follicules de 2 à 8mm de diamètre apparents en surface des ovaires, au cours de la
période printemps-été des deux campagnes agricoles consécutives. Celles ci se
distinguaient par leur pluviométrie annuelle respectivement à tendance sèche et
relativement pluvieuse.
Les résultats des comptages des follicules, le rendement quantitatif et qualitatif en
ovocytes ainsi que leur taux de maturation in vitro sont consignés dans l’annexe 6.
Il ressort de ces résultats que le nombre moyen de follicules par ovaire collecté au cours
des campagnes 1999 et 2000 est de 8.69±3.44. L’analyse de la variance a montré que
l’effet de l’année sur la population folliculaire était hautement significatif (P<0.001). En
effet, la population folliculaire de 2 à 8 mm comptabilisée par ovaire est plus importante
pendant l’année 2000(année pluvieuse) par rapport à son homologue de l’année 1999
(année à tendance sèche). Les nombres moyens de follicules par ovaire sont
respectivement de 11.32±0.67 et de 4.97±2.47 (tableau 5).
74
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Q1-3 Q4
---------------------------------------------- Ovaires Follicules Ovocytes totaux N/ovaire % maturation N/ov /ovaire /ovaire Nombre total
(Année1+Année2) 298 8.69±3.44 0.89±0.49 0.49± 0.20 20.74 0. 36±0.30 *** *** * * ** *
Année 1 a 137 4.97±2.47 0.62±0.27 0.35±0.01 16.32 0.27±0.01 Année 2 b 161 11.32±0.67 0.91±0.26 0.53±0.25 23.25 0.38±0.14
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Tableau 5 : Moyennes et erreurs standard du nombre de follicules et d’ovocytes comptabilisés
d’ovocytes collectés par ovaire a : année à tendance sèche ; b : année relativement pluvieuse * : Significatif (P<0.05) ; ** : Hautement significatif (P<0.01) ; *** : Très hautement
significatif (P<0.001)
II. Rendement en ovocytes et leur taux de maturation
Il s’agit d’ovocytes résultant de la ponction des follicules de 2 à 8 mm de diamètre.
Les ovocytes récupérés se répartissent en 4 groupes ou classes (Q1, Q2, Q3 et Q4) de
qualité décroissante selon les critères usuels à savoir leur morphologie, l’aspect de leur
cytoplasme et de leur cumulus oophorus.
Seuls les ovocytes de qualité Q1, Q2 et Q3 sont communément retenus pour poursuivre le
développement in vitro.
Le nombre moyen d’ovocytes de toutes qualités collectés au cours des campagnes 1999
et 2000 est de 0.89±0.49 (Tableau 5). L’analyse de la variance a montré que l’effet de
l’année sur le rendement en ovocytes était très hautement significatif (P<0.001). En
effet, nous avons collecté 0.91±0.26 par ovaire en 2000, alors que nous n’avons que
0.62±0.27 l’année d’avant.
Il en est de même pour le rendement en ovocytes de bonne qualité (Q1, Q2 et Q3),
habituellement retenus pour la maturation in vitro. Ainsi, le nombre d’ovocytes de bonne
qualité obtenus par ovaire en année relativement pluvieuse (0.53±0.25) est
significativement (P<0.01) supérieur à celui obtenu en année à tendance sèche (0.35±
0.01).
Le rendement moyen en ovocytes de qualité 4 (Q4) pendant les campagnes 1999 et 2000,
est de 0.36±0.30.
75
L’analyse statistique révèle un effet significatif (P<0.05) de l’année sur le rendement en
ovocytes de qualité 4. En effet, nous avons remarqué que les ovocytes de cette qualité
accusent un rendement supérieur pendant l’année relativement pluvieuse (0.38±0.1) par
rapport à celui noté au cours de l’année à tendance sèche (0.27±0.01).
Le taux de maturation des ovocytes de qualité 1, 2 et 3 in vitro jugé par l’expansion des
cellules du cumulus oophorus (Photo 1) pendant les années considérées est de 20.74%.
L’analyse de la variance a montré que l’effet de l’année sur le taux de maturation est
hautement significatif (P<0.01). Ainsi, le taux de maturation des ovocytes au cours de
l’année relativement pluvieuse (23,25%) est significativement plus élevé que celui
obtenu au cours des manipulations de l’année à tendance sèche (16.32%).
Ces résultats laissent penser à un effet de l’alimentation causé par les fluctuations du
pâturage sur la dynamique ovarienne à savoir la population folliculaire et la qualité des
ovocytes en terme d’aptitude à la maturation in vitro.
En effet, il est admis que la fonction de reproduction est contrôlée par différents facteurs
dont ceux inhérents à la femelle, alimentation, environnementaux et autres (voir revue
bibliographique).
76
(a)
(b)
Photo 1 : (a) Image d’un ovocyte de qualité 1 (Grossissement : x14)
(b) Ovocyte avec des cellules du cumulus expansées après maturation
in vitro (Grossissement : x14)
77
Chapitre II : Exploration histologique de l’ovaire
Son importance est en rapport avec l’adaptation d’une technique de collecte pour
optimiser le rendement en ovocytes.
Les ovaires de vaches de race Oulmès Zaers menacée ont été utilisés pour étudier la
population folliculaire et sa répartition au niveau du cortex ovarien comparativement au
produit de croisement de cette même race avec une race exotique (Holstein ou Frisonne
Pie noir).
1. Structure de l’ovaire
Les coupes histologiques des ovaires révèlent une structure à polarité distinguée de la
surface à la medulla, constituée de 5 zones identifiables (photo 2) :
La zone 1: est constituée d’un épithélium uni-stratifié de surface à cellules cubiques
ou allongées parallèlement à la surface de l’ovaire. La matrice extracellulaire est
apparente au bord apical de ces cellules dans certaines régions (Photo 2 : a, b et c).
Les zones 2 et 3 sont respectivement les parties externes et internes de la tunique
albuginée peuplées de cellules somatiques, la matrice entre ces cellules est très riche en
fibres (Photo 2 ; 1b : →).
Dans la zone 2, les cellules sont fréquemment de formes plus ou moins rondes et
généralement parallèles à l’épithélium de la surface ovarienne.
Les cellules dans la zone 3 sont plus rondes et orientées soit de façon aléatoire, soit
perpendiculaires à l’épithélium de la surface ovarienne (Photo 2).
L'épaisseur des zones 2 et 3 est extrêmement variable : ces zones peuvent être épaisses,
(Photo 2 : b et c) ou parfois se réduire à une mince couche (Photo 2 : a). L’hétérogénéité
de l’épaisseur de ces zones peut s’observer même au sein d’une seule coupe histologique
de l’ovaire. D’autre part, la zone : 3 peut être apparemment inexistante (Photo 2).
78
Photo 2. Coupes transversales de l’ovaire de la vache Oulmes-Zaer avec 5 zones dans le
cortex ovarien. Les photos a, b, c, et d montrent l’insertion des follicules
primordiaux et primaires à des profondeurs variables dans le cortex (a,b, et c).
Les follicules antraux se rencontrent dans la 5ème zone du cortex (d).
Grossissement : x100
79
La zone 4 contient des fibres qui semblent être de même densité que celles
observées dans les zones 2 et 3. Cependant, la zone : 4 est plus riches en cellules que les
zones 2 et 3 (Photo 2 : b) et c’est à ce niveau que les follicules sont localisés.
En effet, un grand nombre de follicules primordiaux et primaires (◄), reconnaissables
respectivement par leur nombre faible de cellules folliculaires aplaties et de cellules
cubiques agencées en une couche, se situent dans la région supérieure de la zone 4 et
dans l’interface entre les zones 3 et 4. Les follicules primaires sont plus internes (Photo
2 : b et c). Quelques follicules secondaires (plus d’une couche de cellules de la
granulosa et sans antrum), ainsi que de jeunes follicules antraux sont aussi rencontrés
dans la zone 4 mais, toujours plus profonds dans le cortex ovarien par apport aux
follicules primordiaux (Photo 2).
La distance entre les follicules primordiaux et la surface de l’ovaire est très variable.
Elle dépend de l'épaisseur des zones 2 et 3, mais aussi de la profondeur à laquelle ils
sont insérés dans la zone 4 (Photo 2 : c).
Dans la zone : 5, profonde en contact de la medulla sa structure rappelle celle de la
zone 4 mais lâche. Les cellules du stroma sont moins serrées. On y rencontre les
follicules antraux à un stade plus avancé (Photo 2 : d).
2. Evaluation de la population folliculaire
L’évaluation est faite sur des coupes histologiques d’ovaires par estimation de la surface
occupée par les follicules par rapport à la surface totale.
L’aire ovarienne occupée par les follicules chez les vaches de race locale et son produit
de croisement avec une race exotique de tout âge considéré est de 15 à 16%. L’analyse
de la variance a montré que l’effet de la race et de l’âge sur la population folliculaire
était hautement significatif (P<0.01).
En effet, le pourcentage d’aire ovarienne occupé par les follicules chez la race locale
(Oulmès Zaers) augmente d’une façon significative quand on passe de jeunes vaches aux
vaches adultes : 15% - 17% (P<0.01), puis diminue quand on considère les vaches de
plus de 5 ans : 9.4%, le cortex ovarien est en majorité occupé par des follicules
atrétiques (Figure 8).
Chez les vaches de plus de 5 ans de la race Oulmès-Zaer, la majorité des coupes
histologiques de l’ovaire étaient occupées par du stroma (tissu de connexion) et des
corpus albicans ( 90.6 %).
Pour le produit de croisement entre la race locale et la race exotique, le pourcentage
d’aire ovarienne occupée par les follicules est le même si on considère les tranches
80
d’âges moins de 3 ans et entre 3 et 5 ans : 17%. Alors qu’il diminue significativement
(p<0.01) si l’âge des vaches est supérieur à 5 ans : 9.4%.
La comparaison des deux races par tranche d’âge fait sortir les éléments suivants (Figure
8) :
- Le pourcentage d’aire ovarienne occupé par le tissu folliculaire est plus faible chez la
race locale par rapport à la race croisée à un âge moins de 3 ans (P <0.05).
- Ce pourcentage est pratiquement le même pour les deux races à des âges de 3 à 5 ans et
plus de 5 ans mais à des niveaux différents : 17% et 9.4%.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18%
< 3 ans 3<âge<5ans > 5ans
Age
R.L. R.A.
Figure 8 : Evolution du pourcentage du stroma occupé par les follicules en fonction
de l’âge chez la vache Oulmes Zaer (RL) et ses produits de croisement
avec la Holstein ou la Frissone (RA).
81
Chapitre III : Effet des paramètres génétiques et non génétiques sur la population
folliculaire et le rendement ovocytaire.
Nous avons choisi comme paramètres non génétiques qui rentrent dans le cadre de la
nutrition : l’état corporel (Body Condition Score : B.C.S.), l’âge et le profil métabolique
à travers certains paramètres indicateurs du statut protéo-énergétique.
Pour les paramètres génétiques on traitera l’effet de la race.
Les résultats seront présentés en deux parties : des résultats descriptifs et d’autres
analytiques.
I. Résultats descriptifs
1. Race, âge et B.C.S.
a. Race
La race des vaches a été déterminée la veille de l’abattage selon leur phénotype dont les
caractéristiques sont données en annexe (1). La vache de race locale a été peu
représentée dans les populations abattues par apport aux races exotiques et le produit de
leur croisement, ce qui confirme leur menace d’extinction. Afin d’équilibrer l’effectif
des différentes races considérées nous avons été amenés à multiplier les déplacements
aux abattoirs et ne choisir parfois que la race locale.
Ainsi, 32.5 % du groupe sont des vaches de la race locale (RL), 35% c’est des vaches
issues du croisement entre la race locale et une race exotique et 32.5% sont des vaches
exotiques (Holstein ou Frissone) (Figure 9).
b. Age
L’âge a été déterminé par observation de la dentition des femelles avant l’abattage.
La majorité des femelles (52.5%) avaient plus de 5 ans, 33.75% sont entre 3 et 5 ans et
seulement 13.75% de la population ont moins de 3 ans (Tableau 6).
c. Etat corporel (B.C.S.)
Sur le groupe des 80 vaches, l’évaluation morphologique a révélé que leur B.C.S. va de
2 à 5 correspondant respectivement à des états proches de la cachexie (2) et de l’obésité
(5).
Les vaches à B.C.S. inférieur à 2 n’ont pas été abattues au cours de la période d’étude.
Le B.C.S. moyen des animaux est de 2,94 ± 0,89 (Figure 10).
82
Les animaux en « bon état corporel », (B.C.S. 3) sont les plus représentés (43.75%),
alors que les vaches en très bon état corporel ; c’est à dire à B.C.S. 4 et 5 représentent
respectivement, 13.75% et 7.5% du lot (Figure 10).
0
510
1520
2530
3540%
L ExL E
Races
Figure 9 : Distribution des vaches en fonction du génotype
Tableau 6 : Répartition des vaches en fonction de l’âge
Age Effectif %
moins de 3 ans 11 13.75
de 3 à 5 ans 27 33.75
Plus de 5 ans 42 52.5
83
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50%
2 3 4 5
BCS
Figure 10 : Distribution des vaches selon les conditions corporelles (B.C.S.)
2. Paramètres sanguins
Les composantes sanguines dosées en triplets chez les 80 vaches considérées pour cette
étude sont les protéines totales, l’albumine, l’urée et le β-hydroxybutyrate, de même
qu’un indicateur de l’intégrité hépatique : l’Aspartate Amino-Transférase (A.S.A.T.)
anciennement appelé Transaminase Glutamino-Oxaloacétique (G.O.T.) (Tableau 7).
Les résultats du dosage des protéines totales (77.83g/l ± 0.98), de l’albuminémie (32.40
g/l ± 4.41), de l’urémie (4.43mmol/l ± 0.23), du β-hydroxy butyrate sanguin (β-OH)
(0.83mmol/l ± 0.48) et du G.O.T. sanguin (45.55 UI/l± 11.95) (Tableau 7) montrent des
moyennes qui s’insèrent dans l’intervalle des valeurs usuelles avec peu de variations
entre les individus (Annexe 7).
Ainsi, 80% des individus ont une protéinémie normale, une vache (1.25%) présente une
protéinémie inférieure à la normale et 18.75% des vaches voient leur protéinémie
supérieure à la normale.
Quant à l’urémie, 75% des individus sont normaux, c'est-à-dire à urémie qui s’insère
dans l’intervalle des valeurs usuelles. Seulement 8% des vaches ont une urémie
dépassant les valeurs normales et 12% de la population, leur urémie n’atteint pas les
valeurs habituelles.
Pour l’albuminémie, le pourcentage des individus dont l’albuminémie est en dehors de
l’intervalle des valeurs est plus élevé. Ainsi, 28.75% des individus de la série ont un
84
taux d’albumine inférieure à la normale et 22.50% leur albuminémie est supérieure à la
normale.
Quant aux dosages du β-hydroxybutyrate qui est un indicateur de la mobilisation des
réserves corporelles, ils révèlent que 62.5% des vaches ont une concentration en β-
hydroxybutyrate normale. Seulement 4% des individus sont en dessous des valeurs
usuelles et 32.50% des vaches ont un taux de β-hydroxybutyrate supérieur à l’intervalle
des valeurs habituelles.
Pour la Transaminase Glutamino-Oxaloacétique (G.O.T), qui est un indicateur de la
fonction hépatique, le résultat des dosages montre que toutes les vaches de la série ont
une fonction hépatique normale. En effet, toutes les valeurs obtenues sont incluses dans
l’intervalle des valeurs usuelles.
Paramètres Inférieurs
à la
normale
Normaux
Supérieurs
à la
normale
Intervalles
usuels
M ± ESM
(min-max)
Protéines
totales
(g/l)
1
(1.25%)
64
(80%)
15
(18.75%)
60.85 77.83 ± 0.98
(54-100)
Albumine (g/l) 23
(28.75%)
39
(48.75%)
18
(22.50%)
30.30-35.50 32.40 ± 4.41
(23.53-45.91)
Urée (mmol/l) 12
(15%)
60
(75%)
8
(10%)
2.20-7.40 4.43 ± 0.23
(0.60-8.25)
β-OH (mmol/l) 4
(5%)
50
(62.5%)
26
(32.50%)
0.20-1.00 0.83 ± 0.48
(0.05-2.08)
A.S.A.T. (UI/l) 0 80
(100%)
0 8-93 45.55 ± 11.95
(26.00-87.20)
Tableau 7 : Les moyennes et erreurs standard des paramètres métaboliques des
vaches.
85
3. Corrélations entre les différents paramètres.
Compte tenu de leur nombre important, les données brutes sont représentées en Annexe
7.
La matrice de corrélation des variables phénotypiques et biochimiques est donnée dans
le tableau 8.
Age Race BCS Urée Protéines β-OH A.S.A.T. Albumine
Age 1
Race -0,45 1
BCS -0,59 0,39 1
Urée -0,07 -0,23 0,17 1
Protéines 0,21 -0,07 0,04 -0,02 1
β-OH -0,01 0,31 0,01 0 0,16 1
A.S.A.T. -0,16 0,33 0,12 0,08 -0,02 0,46 1
Albumine -0,21 0 0,08 0,15 0,11 0,21 0,12 1 Tableau 8 : Matrice de corrélations entre les variables phénotypiques
La matrice de corrélation consignée dans le tableau 8 nous permet de souligner les faits
suivants : Une dépendance entre le B.C.S. et l’âge ; le B.C.S. et la race ; la race et
l’âge ; la race et l’urémie et finalement entre le β-OH et la race.
a. B.C.S. -Age
L’analyse révèle une corrélation négative entre l’âge et le B.C.S. (Tableau 9, Figure 11).
En effet, le B.C.S. moyen des individus à âge supérieur à 5 ans est significativement
(P<0.01) inférieur (2.43 ± 0.09) aux B.C.S moyens des individus de moins de 3 ans
(3.73 ± 0.27) et ceux dont l’âge est entre 3 et 5 ans (3.41 ± 0.15), (r = -0.59).
Age Effectif B.C.S (m ± ESM)
< 3 ans 11 3.73 a± 0.27
3- 5 ans 27 3.41 a± 0.15
> 5 ans 42 2.43 b± 0.09
Tableau 9 : Variation du B.C.S en fonction de l’âge.
b. B.C.S. – Race
86
L’A.F.C. révèle une corrélation positive entre la note de l’état corporel (B.C.S.) et le
facteur Race (r = 0.39) (Tableau 10, Figure 11).
Le B.C.S moyen de la race Exotique et celui du produit de croisement de la race Locale
(Oulmès Zaer) avec la race Exotique (respectivement : 3.19 ± 0.16 et 3.25 ± 0.18) est
significativement supérieur (P < 0.01) à celui de la race locale (2.35 ± 0.12).
Race Effectif B.C.S. (m±ESM)
Locale 26 2.35a ± 0.12
Locale x
Exotique
28 3.25b ± 0.18
Exotique 26 3.19b ± 0.16
Tableau 10 : Variation du B.C.S en fonction de la Race
c. Race – Age
L’âge moyen des individus de race Locale (L) (2.85± 0.07), il est significativement
supérieur à celui de la race Exotique (2.04 ± 0.16) et à celui du produit de leur
croisement (2.25 ± 0.12). L’analyse de la variance ainsi que l’A.F.C. a montré qu’il y a
une dépendance significative (P<0.01) entre ces deux paramètres avec un coefficient de
corrélation r = - 0.45 (Tableau 11, Figure 11).
Race Effectif Age (m±ESM)
Locale 26 2.85 ± 0.07
Locale x
Exotique
28 2.25 ± 0.12
Exotique 26 2.04 ± 0.16
Tableau 11 : Age moyen des différentes Races
87
variation du BCS en fonction de la race
P<0.01; r=0.39
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
L LxE ERace
BC
S
Variation du BCS en fonction de l'âge
P<0.01; r=-0.59
00,5
1
1,52
2,53
3,54
<3ans 3-5 ans > 5 ansAge
BC
S
Répartition de l'âge en fonction de la race
P<0.01; r= -0.45
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
L LxE ERace
Age
Figure 11 : Corrélations entre les différents paramètres : âge, race et BCS.
d. Race – Urémie
L’urémie moyenne chez la race Exotique (3,88 mmol/l ± 0,23) et chez le produit de
croisement entre la race Locale et la race Exotique (4,34 mmol/l ± 0,42), est
significativement inférieure (P<0.05) à celle de la race locale (Oulmès Zaer)
(5,08mmol/l ± 0,38). L’analyse statistique révèle une dépendance significative avec un
coefficient de corrélation r=-0.23 (Tableau 12, Figure 12).
e. Race- β-OH
L’analyse par l’A.F.C. de nos données révèle une dépendance entre le β-hydroxybutyrate
(β-OH: Corps cétonique, signe de mobilisation des réserves corporelles) et la race (r =
0.31).
Ainsi, le taux circulant du corps cétonique β-hydroxybutyrate (β-OH) paraît plus élevé
(P< 0.01) chez la race exotique (E) (0.97mmol/l ± 0.05) par rapport à celui de la race
Locale (L) (0.61mmol/l± 0.06). Il est aussi significativement inférieur
88
(P< 0.01) à celui noté chez les vaches issues du croisement entre la race Locale et la
race Exotique (E x L) (0.87mmol/l ± 0.08) (Tableau 12, Figure 12).
Cependant, il n’y a pas de différence statistique entre les moyennes du taux circulant de
β-OH rencontrés chez la race exotique et le produit de croisement (L x E).
Protéines g/l albumine g/l urée mmol/l β-OH mmol/l G.O.T UI/l
Race * *
L 76,65 ± 1,24 31,86 ± 1,20 5,08a ± 0,38 0,61a ± 0,06 41,11 ± 1,48
L x E 81,43 ± 1,82 33,29 ± 1,80 4,34b ± 0,42 0,87b ± 0,08 44,72 ± 1,94
E 75,15 ± 1,73 31,89 ± 1,79 3,88b ± 0,23 0,97b ± 0,05 50,87 ± 2,96
Age
< 3ans 69,73 ± 2,42 34,16 ± 2,00 5,07 ± 0,65 0,81 ± 0,09 49,54 ± 3,77
3 - 5 ans 80,56 ± 1,68 32,84 ± 1,70 4,22 ± 0,42 0,84 ± 0,09 46,44 ± 2,5
> 5 ans 78,21 ± 1,20 31,60 ± 1,30 4,40 ± 0,32 0,81 ± 0,07 43,92 ± 1,69
BCS
2 77,61 ± 1,39 32,22 ± 1,31 4,57 ± 0,41 0,83 ± 0,09 44,46 ± 2,11
3 77,49 ± 1,69 32,06 ± 1,59 3,77 ± 0,35 0,78 ± 0,08 43,95 ± 1,96
4 79,36 ± 1,58 33,37 ± 1,61 5,30 ± 0,56 0,93 ± 0,01 54,94 ± 4,00
5 78,17 ± 5,36 33,06 ± 3,77 6,03 ± 0,65 0,79 ± 0,01 42,70 ± 3,69
Tableau 12 : Variation des paramètres biochimiques en fonction de la race, de
l’âge et du B.C.S.
89
Albumine en fonction des races P > 0.05; r = 0
10
20
30
40
L LxE E
Races
Alb
umin
émie
(g/
l)Protéines en fonction des races
P>0.05; r= -0.07
30
40
50
60
70
80
90
L LxE E
Races
Pro
téin
es(g
/l)
Urémie et Races P<0.05; r=-0.23
0
1
2
3
4
5
6
L LxE E
Races
Uré
mie
(m
mol
/l)
Béta-OH en fonction de la race P<0.01; r= 0.31
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
L LxE E
Races
Bét
a-O
H (
mm
ol/l
)
Albuminémie en fonction de l'âge P>0.05; r= -0.21
10
15
20
25
30
35
40
< 3 3 à 5 > 5Age (ans)
Alb
umin
émie
(m
mol
/l)
Protéinémie en fonction de l'âge P>0.05; r=0.021
30
40
50
60
70
80
90
< 3 3 à 5 > 5Age (ans)
Pro
téin
émie
(g/
l)
Figure 12 : Variations des paramètres biochimiques en fonction de la race et de
l’âge
90
f. Les protéines totales
Les protéines sont nécessaires à l’entretien de la croissance, la lactation et la
reproduction. La demande intense en glucose lors de la lactation ou d’un déficit
énergétique fait appel à la néoglucogenèse. On assiste donc à une mobilisation des
protéines totales corporelles pour la synthèse du glucose à partir des acides aminés.
Suite à cette néoglucogenèse, il y a libération de l’ammoniaque (NH3) qui doit être
convertie en urée au niveau du foie afin d’éliminer son effet toxique.
La dépendance n’est pas admise statistiquement entre les protéines totales et les
paramètres phénotypiques considérés à savoir la race, l’âge et le B.C.S. (P>0.05)
(Figures 12 et 13 ; Tableau 12).
g. L’albumine
Comme c’est mentionné dans la partie bibliographique, l’albumine représente 50 à 60%
des protéines de l’organisme, qui jouent entre autres le rôle de précurseur dans la
synthèse d’hormones.
Les résultats, ne montrent aucune dépendance significative entre le taux d’albumine et les
différents paramètres considérés c'est-à-dire : l’âge, la race et le B.C.S. (P>0.05) (Figures 12 et
13 ; Tableau 12).
h. L’A.S.A.T.
Vu l’implication du foie dans plusieurs fonctions inhérentes à la fertilité de la vache, tel que la
détoxification de l’ammoniac, la protéosynthèse hépatique dont la synthèse de l’albumine et le
catabolisme de la progestérone, il nous a paru nécessaire de tester l’intégrité de cet organe chez
les vaches de la série considérée.
En effet, parmi les nombreux paramètres utilisables pour l’exploration de la fonction et de
l’intégrité hépatique, nous avons opté pour le dosage de l’A.S.A.T. (Aspartate Amino-
Transférase) ou encore appelée G.O.T. (Transaminase Glutamino Oxaloacétique).
Les dosages de cette enzyme révèlent que tous les individus de l’étude ont une fonction hépatique
normale puisque les valeurs du dosage s’insèrent toutes dans l’intervalle des valeurs usuelles.
Ainsi, il n’y a pas de corrélations statistiquement significatives entre le G.O.T. et les paramètres
descriptifs qui sont l’âge, la race et le B.C.S. (Tableau 12).
91
P>0.05; r= -0.07
0
1
2
3
4
5
6
< 3 3 à 5 >5
Age (ans)
Uré
mie
(m
mol
/l)
P>0.05; r= -0.01
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
< 3 3 à 5 >5
Age (ans)
Bét
a-O
H (
mm
ol/l)
P>0.05; r= 0.04
30
40
50
60
70
80
90
2 3 4 5
BCS
Pro
téin
émie
(g/
l)
P>0.05; r = 0.08
202224262830323436
2 3 4 5
BCS
Alb
umin
émie
(g/
l)
P>0.05; r = 0.05
0
1
2
3
4
5
6
7
2 3 4 5
BCS
Uré
mie
(m
mol
/l)
P>0.05; r= 0.01
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,1
2 3 4 5
BCS
Bét
a-O
H (
mm
ol/l)
Figure 13 : Variations des paramètres biochimiques en fonction de l’âge et du B.C.S.
92
II. Résultats analytiques :
La matrice de corrélations des 12 variables étudiées est donnée dans le Tableau 15.
Les deux premiers axes F1 et F2 suffisent pour expliquer nos données, puisqu’ils
totalisent à eux deux 58.11% de l’inertie (Figure 13).
1. Nombre de follicules
Tous les ovaires examinés montrent une croissance folliculaire évidente et apparente.
Nous avons compté 1839 follicules de 2 à 8 mm à la surface de 160 ovaires récoltés
chez 80 vaches de 3 groupes génétiques à différents âges, et B.C.S.
Le nombre moyen de fol l icules comptés sur les deux ovaires était de 22.98 ±
0.94. L’analyse de la variance a montré des effets signi ficati fs (P<0.05) de la
race et de l ’âge et très hautement signi ficati fs (P<0.001) du B.C.S. sur le
nombre moyen de fol l icules de 2 à 8 mm. Les corrélations et les remarques
suivantes ont été retenues :
- Une bonne corrélation positive entre le B.C.S. et le nombre moyen de follicules
(r = 0.65).
- Une corrélation positive entre le nombre moyen de follicules et le rendement en
ovocytes de toute qualité (r = 0.51, P<0.01).
- La dépendance est aussi admise entre le nombre de follicules et le rendement en
ovocytes de bonne qualité (qualité recommandée pour la P.I.V.), (r = 0.53 ; P<0.01).
- Une corrélation négative statistiquement significative (P< 0.01) entre l’âge et le
nombre de follicules (r = -0.40).
- Aucune dépendance n’a pu être détectée entre les protéines totales et le nombre moyen
de follicules (r = -0.03).
- La corrélation n’est pas admise quand il s’agit de l’urée et le nombre de follicules
(r = 0.04) ; l’albumine et le nombre moyen de follicules (r = 0.01), (P>0.05).
- Il n’y a pas de dépendance entre le β-OH et le nombre moyen de follicules
(r =-0.21), (P>0.05). Cependant, le nombre de follicules apparents tend à être supérieur
chez les vaches à β-OH sanguin moins de 0.20mmo/l.
93
1.1. Effet de la race.
Les résultats montrent un effet significatif (P<0.01) de la race sur le nombre moyen de
follicules (2-8 mm) apparents à la surface des ovaires. Ainsi, la race locale (Oulmès des
Zaer) a moins de follicules (18.96 ± 1.3) que la race exotique (25.19 ± 1.63) et le
produit de leur croisement L x E (24.71 ± 1.69) (r = 0.30). Cependant, les individus de
la race Exotique (E) et le produit de croisement (L x E) tendent à avoir le même nombre
de follicules ovariens (Tableau 14, Figure 15).
1.2. Effet de l’âge.
Le nombre moyen de follicules comptés chez les individus de plus de 5 ans est
significativement inférieur (19.74 ± 1.06) à celui des individus de moins de 3 ans (27.25
± 1.93) et de ceux dont l’âge est entre 3 et 5 ans (25.93 ± 1.81), (P<0.05) (Tableau 14,
Figure 15).
De même, les individus de moins de 3 ans ont plus de follicules de 2 à 8 mm (27.25 ±
1.93) par rapport à ceux dont l’âge est entre 3 et 5 ans (25.93 ± 1.81), (P<0.05).
1.3. Effet du B.C.S.
Il ressort de nos résultats qu’il y a une corrélation positive entre le B.C.S. et le nombre
de follicules ovariens apparents de 2 à 8 mm, la corrélation est hautement significative
(P<0.001).
Ainsi les individus à B.C.S. : 5, ont le maximum de follicules (37.83 ± 2.33). Ceux qui
sont à B.C.S : 2 ont le nombre moyen de follicules le plus faible (17.3 ± 0.96) par
rapport aux vaches à B.C.S. meilleurs c'est-à-dire les B.C.S. 2 et 3 (r = 0.65) (Tableau
14, Figure 15).
94
Effet N Moyenne Erreur Standard de la moyenne
Race *
Oulmès-Zaer(L) 26(32.5%) 18.96a 1.30
L x E 28(35%) 24.71b 1.69
Exotique(E) 26(32.5%) 25.19b 1.63
Age *
< 3 ans 11(13.75%) 27.25a 1.93
3 –5 ans 27(33.75%) 25.93b 1.81
> 5ans 42(52.5%) 19.74c 1.06
Note de l’état corporel (B.C.S.) ***
2 28(35%) 17.30a 0.96
3 35(43.75%) 23.80b 1.28
4 11(13.75%) 26.73c 1.58
5 6(6.25%) 37.83d 2.33
Tableau 14 : Effets de la race, de l’âge et du BCS sur le nombre moyen de follicules de
2 à 8 mm de diamètre.
* : Significatif (P<0.05) ; *** : Très hautement significatif (P<0.001) Les moyennes indiquées dans les colonnes avec le même exposant ne diffèrent pas
significativement (a, b, c et d). N (nombre de follicules comptabilisés).
95
P<0.01; r=0.30
0
5
10
15
20
25
30
L LxE E
Races
P<0.01; r=0.40
0
5
10
15
20
25
30
< 3 ans 3 à 5 ans > 5 ans
Age
P<0.01; r = 0.05
0
10
20
30
40
2 3 4 5
BCS
Figure 15 : Population folliculaire (2-8 mm) en fonction de la Race, âge et du B.C.S.
96
1.4. Effet des paramètres biochimiques.
a. Taux d’albumine sérique
Les résultats n’ont pas montré de variations significatives du nombre de follicules chez
les individus à albuminémie au dessous ou au dessus de l’intervalle des valeurs usuelles
par rapport à celui des individus dont l’albuminémie s’insère dans l’intervalle normal
(Tableau 15).
Albuminémie g/l
N Nombre moyen de
follicules
(m ± ESM)
< 30 23 22.86 ± 1.91
30 - 35 37 22.27 ± 1.37
> 35 20 24,45 ± 1,77
Tableau 15 : Le nombre de follicules moyen en fonction du taux d’albumine.
b. La protéinémie
La protéinémie ne semble pas avoir d’effet sur le nombre de follicules comptabilisés
chez les vaches de différents groupes (Tableau 16).
Protéinémie g/l N Nombre moyen de follicules
(m ± ESM)
< 60 1 24
60 - 85 64 22.59 ± 1,00
> 85 15 24,60 ± 2.66
Tableau 16 : Le nombre de follicules moyen en fonction du taux de protéines
c. L’urémie
Il ressort des résultats du tableau 8 et de l’analyse statistique qu’il y a indépendance
entre le taux d’urée et le nombre moyen de follicules (Tableau 17).
97
Urée mmol/l N Nombre moyen de
follicules
(m ± ESM)
< 2.5 16 24,19 ± 1.93
2.5 - 4 19 19.53 ± 1.52
> 4 45 24,02 ± 1.53
Tableau 17: Le nombre de follicules moyens en fonction du taux d’urée.
d. Taux sérique de β-OH
L’analyse de l’A.F.C. ne montre pas de dépendances significatives entre le β-OH et le
nombre moyen de follicules de 2 à 8 mm chez les individus de la série (Tableau 18,
Figure 16). Cependant, les vaches à β-OH supérieur à 1mmol/l tendent à avoir moins de
follicules que les vaches à β-OH inférieure à 1 mmol/l.
β -OH (mmol/l) N Nombre moyen de
follicules
(m ± ESM)
< 0.20 4 25.75 ± 5.31
0.20 - 1 50 23.82 ± 1.25
> 1 26 20.96 ± 1.40
Tableau 18 : Le nombre de follicules moyens en fonction du taux de β-OH
98
P > 0.05; r = -0.01
10
12
14
16
18
20
22
24
26
< 30 30 - 35 > 35Albumines g/l
P>0.05; r = -0.03
10
12
14
16
18
20
22
24
26
<60 60 - 85 > 85Protéines g/l
P>0.05; r= 0.04
0
5
10
15
20
25
30
< 2,5 2,5 - 4 > 4Urée mmol/l
P>0.05; r=-0.21
0
5
10
15
20
25
30
< 0,20 0,20 - 1 > 1B-OH (mmol/l)
Figure 16 : Population folliculaire (2 – 8 mm) en fonction des paramètres
biochimiques
2. Rendement en ovocytes
Sur 160 ovaires récupérés des 80 vaches de l’étude, nous avons ponctionné 1839
follicules de 2 à 8 mm de diamètre à partir desquels nous avons collecté 208 ovocytes,
soit un rendement moyen de 11.3%.
Les ovocytes classés de qualité recommandée pour la P.I.V. (Q1, Q2 et Q3) représentent
79% (164 ovocytes). Ceux de qualité non sélectionnée pour la P.I.V. (Q4) représentent
21% (44 ovocytes).
Le rendement moyen des ovocytes de qualité : Q1, Q2, Q3 a été de 2.05 ± 1.36. Celui des
ovocytes de qualité : 4 (Q4) est de 0.55 ± 0.79.
L’analyse de la variance montre des effets significatifs du génotype, de l’âge et du
B.C.S. sur le rendement en ovocytes de qualité Q1, Q2 et Q3 uniquement.
99
Ainsi, une corrélation a été notée entre :
• Le B.C.S. et le rendement en ovocytes de qualité Q1, Q2 et Q3 choisis pour la
P.I.V. (r = 0.65).
• Le rendement en ovocytes de toute qualité s’est révélé négativement corrélé avec
l’âge de la donneuse (r = -0.28).
• Le rendement en ovocytes dépend aussi de la race de la donneuse
(r= 0.35).
• Cependant, le rendement en ovocytes ne parait pas être influencé par le taux de
protéines de la donneuse (r=0.01).
Il n’est pas significativement influencé significativement par l’albuminémie des
vaches donneuses d’ovocytes (r = 0.11).
Les résultats révèlent, qu’il n’y a pas de dépendance entre le taux circulant de β-
OH et le rendement en ovocytes (r = 0.11).
2.1. Effet de la race.
Comme le montre les résultats du Tableau 19, le rendement en ovocytes chez les races
importée (exotique) et croisée est significativement supérieur (3.23 ± 0.30 et 2.86 ±
0.26) à celui de la race locale (1.93 ± 0.28). (P < 0.05) (Figure 17). Le rendement moyen
en ovocytes est de 2.05 ± 1.36.
2.2. Effet de l’âge.
Les individus âgés de moins de 3 ans ont un rendement en ovocytes significativement
supérieur à celui des individus âgés de plus de 5 ans (P< 0.05) (Tableau 19, Figure 17).
2.3. Effet du B.C.S.
Les analyses statistiques ont montrées une corrélation hautement significative (P<0.001)
entre le B.C.S et le nombre d’ovocytes récupérés de chaque vache. En effet, les vaches à
B.C.S : 5, ont un rendement en ovocytes supérieur (4.50 ± 0.34) à celui des vaches à
B.C.S : 4, 3 et 2 dont le rendement en ovocytes est respectivement de 3.27 ± 0.33 ;
2.91± 0.25 et 1.54 ± 0.22. (Tableau 19, Figure 17).
100
Effet N Moyenne Erreur Standard de la moyenne
Race *
Oulmès-Zaer(L) 26(32.5%) 1.93a 0.28
L x E 28(35%) 2.86b 0.26
Exotique(E) 26(32.5%) 3.23b 0.30
Age *
< 3 ans 11(13.75%) 3.17a 0.26
3 –5 ans 27(33.75%) 3.04b 0.29
> 5ans 42(52.5%) 2.29c 0.24
Note de l’état corporel (B.C.S.)
***
2 28(35%) 1.54a 1.10
3 35(43.75%) 2.91bc 1.60
4 11(13.75%) 3.27c 1.10
5 6(6.25%) 4.5d 0.84
Tableau 19 : Effets de la race, de l’âge et de l’état corporel sur le rendement en
ovocytes Les moyennes du même paramètre avec des exposants identiques ne sont pas
significativement différentes. Le niveau de signification :* : Significatif (P<0.05) ;*** : Très
hautement significatif (P<0.001)
101
P< 0.01; r= 0.35
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
L LxE E
Race
P< 0.05; r = -0.28
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
< 3 3 à 5 > 5
Age (ans)
P<0.01; r= 0.56
0
1
2
3
4
5
2 3 4 5
BCS
Figure 17 : Rendement en ovocytes en fonction de la race, âge et B.C.S.
102
2.4. Effet des paramètres biochimiques.
a. Taux d’Albumine sérique.
Bien que l’analyse statistique n’ait pas montré de différence significative entre
l’albuminémie et le rendement en ovocytes, les individus ayant une albuminémie
supérieure à 35 g/l tendent à avoir un rendement supérieur à ceux dont l’albuminémie est
inférieure à 35 g/l, (P= 0.07) (Tableau 20, Figure 18).
Albuminémie
(g/l)
N Nombre moyen
d’ovocytes
m ± ESM
< 30 23 2.48 ± 0.29
30 - 35 37 2.41 ± 0.23
> 35 20 3.10 ± 0.41
Tableau 20 : Le rendement en ovocytes en fonction du taux d’albumine.
b. La protéinémie
Il ressort du tableau 21 que le nombre d’ovocytes est plus élevé chez les individus à
protéinémie inférieure à 60 g/l comparativement à ceux ayant une protéinémie supérieur
à 60 g/l . Cependant la différence est statistiquement non significative (P>0.05) (Tableau
21, Figure 18).
Protéinémie
g/l
N Nombre moyen
d’ovocytes
m ± ESM
< 60 1 3
60 - 85 64 2.61 ± 0.18
> 85 15 2.53 ± 0.48
Tableau 21: Le rendement en ovocytes en fonction du taux de protéines sériques
c. L’urémie.
L’analyse statistique des résultats du tableau 13 ne révèle pas de dépendance entre
l’urémie et le rendement en ovocytes (P>0.05) (Tableau 22, Figure 18).
103
Urée
(mmol/l)
N Nombre moyen
d’ovocytes
m ± ESM
< 2.5 16 2.25 ± 0.23
2.5 -4 19 2.42 ± 0.43
>4 45 2.80 ± 0.23
Tableau 22 : Le rendement en ovocytes en fonction du taux d’urée
d. Taux sérique de β-OH.
Les analyses statistiques ne montrent pas de dépendances entre le rendement en ovocytes
et le taux sériques en β–hydroxybutyrate sérique. Le nombre d’ovocytes recueillis chez
les individus à β-OH s’insérant dans l’intervalle normal ou en dehors de cet intervalle,
ne diffère pas statistiquement (Tableau 23, Figure 18).
β -OH
(mmol/l)
N
Nombre moyen
d’ovocytes
m ± ESM
< 0.20 4 2.75 ± 0.25
0.20 - 1 50 2.46 ± 0.21
> 1 26 2.85 ± 0.35
Tableau 23 : Le rendement en ovocytes en fonction du taux de β-OH.
104
P>0.05; r= 0.01
0
1
2
3
4
<60 60 - 85 >85
Protéinémie (g/l)
P>0.05; r=0.12
0
1
2
3
4
<30 30 -35 > 35
Albuminémie (g/l)
P>0.05; r=0.11
0
1
2
3
4
<2 2,5 - 4 > 4
Urémie (mmol/l)
P>0.05; r=0.11
0
1
2
3
4
<0,20 0,20 - 1 > 1
Béta-OH(mmol/l)
Figure 18 : Rendements en ovocytes en fonction des paramètres biochimiques
3/ Qualité des ovocytes
Sur les 208 ovocytes recueillis à partir des 1839 follicules ponctionnés :
-164 (79%) ovocytes ont été jugés de bonne qualité qui pourront être
sélectionnés pour la maturation in vitro : Q1, Q2 et Q3.
- 44 (21%) ovocytes ont été jugé de mauvaise qualité et ne peuvent pas être
sélectionnés pour les processus de la maturation in vitro : Q4.
Le rendement moyen en ovocytes était de 2.03 ± 0.15 et 0.54 ± 0.08 respectivement pour
les ovocytes de qualité : Q1, Q2, Q3 et les ovocytes de qualité : Q4.
Une corrélation positive hautement significative entre le rendement en ovocytes de toute
qualité et le rendement en ovocytes de bonne qualité est notée sur le tableau de
corrélations (r = 0.86, P<0.001).
3.1. Effet de la race, de l’âge et de l’état corporel
L’effet race sur le rendement en ovocytes de qualité Q1, Q2 et Q3, est prononcé
(p<0.05), alors qu’il n’y a pas de corrélation entre le rendement en ovocytes de qualité
Q4 et le facteur race (p>0.05).
105
Ainsi, les races exotiques et le produit de croisement entre cette race et la race Oulmès
des Zaers (L x E) offrent plus d’ovocytes de qualité Q1, Q2 et Q3 , que la race locale
(Oulmès des Zaers: L).
Pour ce qui est effet âge, l’analyse statistique avec l’ANOVA 1 révèle que les individus
âgés de moins de 3 ans ont un rendement en ovocytes Q1, Q2 et Q3 , supérieur à celui des
individus âgés de plus de 5 ans, (p<0.05).
La corrélation entre le rendement en ovocytes de qualité Q1, Q2 et Q3 et l’état corporel
(B.C.S.) est hautement significative. L’A.F.C., donne un coefficient de corrélation de :
0.65, (P< 0.001).
Ainsi, les individus à B.C.S. : 5 offrent significativement plus d’ovocytes de bonne
qualité : Q1, Q2 et Q3, que ceux à B.C.S. plus faible ou qui sont moins bien portantes.
Cependant, il n’ y a pas d’effet B.C.S. sur le rendement et la qualité des ovocytes de
qualité non sélectionnable pour la maturation in vitro : Q4,
(r = -0.04) (P>0.05) (Tableau 24, Figure 19).
106
Effet N Moyenne de Q1-3 ± ESM
Moyenne de Q4 ± ESM
Race * *
Oulmès-Zaer(L) 26(32.5%) 1.44 ± 0.24a 0.48 ± 0.1 5
L x E 28(35%) 2.39 ± 0.24b 0.46 ± 0.12
Exotique(E) 26(32.5%) 3.54 ± 0.26b 0.69 ± 0.19
Age * *
< 3 ans 11(13.75%) 2.67 ± 0.28a 0.50 ± 0.25
3 –5 ans 27(33.75%) 2.74 ± 0.28b 0.29 ± 0.10
> 5ans 42(52.5%) 1.57 ± 0.17c 0.71 ± 0.14 Note de l’état
corporel (B.C.S.) *** ***
2 28(35%) 1.07 ± 0.18a 0.47 ± 0.15
3 35(43.75%) 2.39 ± 0.18bc 0.67 ± 0.14
4 11(13.75%) 2.73 ± 0.33c 0.55 ± 0.25
5 6(6.25%) 4.30 ± 0.42d 0.17 ± 0.43
Tableau 24 : Effet de la race, de l’âge et du B.C.S. sur le rendement et la qualité des
ovocytes.
Les moyennes indiquées dans les colonnes avec un même exposant ne diffèrent pas
significativement.
* : Significatif (P<0.05) ;*** : Très hautement significatif (P<0.001)
107
P<0.01; r=0.34 (Q1-3)P>0.05; r=0.10 (Q4)
0
1
2
3
4
L LxE E
Races
Q1-3 Q4
P<0.01; r=-0.40 (Q1-3) P>0.05; r=0.15 (Q4)
0
1
2
3
4
<3 3 à 5 >5
Age (ans)
Q1-3 Q4
P<0.01; r=0.65 (Q1-3)
P>0.05; r=-0.04 (Q4)
0
1
2
3
4
5
2 3 4 5
BCS
Q1-3 Q4
Figure 19 : Rendement selon la qualité des ovocytes en fonction de la Race, âge et du B.C.S.
3.2. Effet des paramètres biochimiques
a. Taux sérique d’Albumine.
108
Statistiquement il n’y a pas de dépendance entre le rendement qualitatif des ovocytes et
le taux d’albumine chez la donneuse (P>0.05). Cependant, les individus dont le taux
d’albumine est supérieur à 35 g/l tendent à donner plus d’ovocytes de qualités Q1, Q2 et
Q3, comparativement à ceux dont l’albuminémie est de 30 à 35 g/l (intervalle des valeurs
usuelles) et à ceux dont l’albuminémie est inférieure à 30 g/l (Tableau 25, Figure 20).
Albuminémie
(g/l)
N Moyenne de
Q1-3 ± ESM
Moyenne de
Q4 ± ESM
<30 23 1.78 ± 0.27 0.70 ± 0.19
30 - 35 35 1.91 ± 0.23 0.49 ± 0.13
>35 22 2.55 ± 0.30 0.50 ± 0.16
Tableau 25 : Le rendement qualitatif des ovocytes en fonction de l’albuminémie.
b. La protéinémie
Les résultats ne montrent pas d’effet significatif du taux de protéines circulant sur le
taux d’ovocytes de qualités Q1, Q2 et Q3. Le même résultat est noté pour les ovocytes de
qualité : 4, (p > 0.05) (Tableau 26, Figure 20).
Protéinémie
(g/l)
N Moyenne de
Q1-3 ± ESM
Moyenne de
Q4 ± ESM
< 60 1 2.00 1.00
60 - 85 64 2.09 ± 0.17 0.52 ± 0.09
> 85 15 1.87 ± 0.35 0.64 ± 0.25
Tableau 26 : Le rendement et la qualité des ovocytes en fonction de la protéinémie
c. L’urémie.
Il n’y a pas de dépendance entre le taux d’urée et le rendement qualitatif en ovocytes, (P
> 0.05). Chez toutes les vaches de l’étude, le nombre d’ovocytes de qualités Q1-3, est
plus élevé que celui de qualité Q4.
Une bonne corrélation positive est notée entre le nombre total des ovocytes et celui des
ovocytes de qualités : Q1, Q2 et Q3, (r=0.86). (Tableau 27, Figure 20).
109
Urée
(mmol/l)
N Moyenne de
Q1-3 ± ESM
Moyenne
de Q4 ± ESM
< 2.5
16 1.56 ±0.18 0.69 ± 0.22
2.5 - 4 19 2.00 ± 0.32 0.42 ± 0.19
> 4 45 2.24 ± 0.22 0.56 ± 0.11
Tableau 27 : Le rendement et la qualité d’ovocytes en
fonction du taux d’urée.
d. Taux sérique de β-OH.
Il n’y a pas de dépendance entre le taux de β –OH circulant et le rendement ainsi que la
qualité des ovocytes. (P > 0.05). Chez toutes les vaches de l’étude, le rendement en
ovocytes de qualité Q1-3 est plus élevé que le rendement en ovocytes de qualité Q4,
quelque soit la concentration de β –OH (Tableau 28, Figure 20).
β -OH
(mmol/l)
N Moyenne de
Q1-3 ± ESM
Moyenne de
Q4 ± ESM
< 0.20 4 1.50 ± 0.65 1.25 ± 0.48
0.20 - 1 50 1.96 ± 0.19 0.50 ± 0.10
> 1 26 2.31 ± 0.26 0.54 ± 0.17
Tableau 28 : Le rendement et la qualité d’ovocytes en fonction du taux circulant de β
–OH.
110
P>0.05; r=0.16 (Q1-3)P>0.05; r=-0.06 (Q4)
0
1
2
3
<30 30 - 35 >35
Albuminémie (g/l)
Q1-3 Q4
P>0.05; r=-0.01 (Q1-3) P>0.05; r=0.03 (Q4)
0
1
2
3
<60 60 - 85 >85
Protéinémie (g/l)
Q1-3 Q4
P>0.05; r=0.14 (Q1-3) P>0.05; r=-0.05 (Q4)
0
1
2
3
<2,5 2,5 - 4 >4
Urémie (mmol/l)
Q1-3 Q4
P>0.05; r=0.12 (Q1-3)P>0.05; r=0.01 (Q4)
0
1
2
3
<0,20 0,20 - 1 >1
Béta-OH (mmol/l)
Q1-3 Q4
Figure 20: Rendement qualitatif et quantitatif en ovocytes en fonction des paramètres
biochimiques. Q1-3 : Ovocytes de qualité 1, 2 et 3. Q4 : Ovocytes de qualité 4.
111
QUATRIEME PARTIE
DISCUSSION
ET
CONCLUSION GENERALE
112
I/ Relation entre pluviométrie, pâturage et dynamique ovarienne
Dans cette étude, les résultats révèlent que pendant l’année à tendance sèche, la
population folliculaire entre 2 et 8 mm de diamètre est plus faible que celle
comptabilisée chez les vaches prises pendant l’année pluvieuse.
Le nombre moyen de follicules repérés sur un ovaire de vache ayant vécu une période à
tendance sèche avant l’abattage est de 4.94± 2.47.
Ce nombre, passe à 11.32±0.67 par ovaire chez les vaches qui ont bénéficié d’une
période pluvieuse (3 à 4 mois) avant l’abattage.
La même constatation peut être faite pour le nombre d’ovocytes récupérés par collecte et
par ovaire pendant les deux années. Il était de 0.62± 0.27 et de 0.92± 0.26
respectivement pendant l’année à tendance sèche et l’année humide (P< 0.05).
La population folliculaire et le rendement en ovocytes accusent une augmentation
importante pendant l’année qui a connu une pluviométrie abondante. Cette augmentation
pourrait être expliquée par un pâturage disponible suite aux conditions climatiques
favorables et donc à une alimentation adéquate des vaches aux cours des 3 à 4 mois qui
précèdent l’abattage.
Donc, à la différence de l’année pluvieuse où le nombre de follicules comptabilisés, le
rendement en ovocytes et le taux de maturation augmentent, l’année à tendance sèche se
caractérise par une dynamique ovarienne diminuée.
De nombreuses études soulignent les effets de la sécheresse en l’occurrence d’une sous
alimentation des vaches en élevage extensif, elles ont mis en évidence la sensibilité de la
fonction de reproduction à l’état nutritionnel de la femelle (Diskin et al., 2003). Delà on
peut imaginer une croissance folliculaire altérée, des ovocytes modifiés en conséquence
dans les semaines qui suivent la période de restriction alimentaire (Butler, 2000; Diskin
et al., 2003 ; Butler et al., 2003).
En effet, un changement dans l’état nutritionnel et une perte de poids sont incriminés
dans l’altération du niveau de plusieurs hormones et facteurs de croissance dans le sang
tel que l’insuline, les glucocorticoïdes, l’hormone de croissance et l’insulin-like growth
factor-I (IGF-I) tous impliqués dans la croissance folliculaire (Drion et al., 1996).
L’effet de la nutrition est soit par action directe à travers ses effets sur la libération de
GnRH par l’hypothalamus ou celle des hormones gonadotrophines par la glande
pituitaire ou indirect via les hormones de croissance : IGF, GH et insuline.
Bolland et al., (2001), rapportent que l’alimentation, sans tenir compte de tout
changement radical, a un impact limité sur les concentrations hormonales chez les
113
ruminants. Ceci contraste avec les observations faites chez le porc et les primates, chez
qui des changements nutritionnels limités conduisent à une altération manifeste de la
dynamique hormonale.
En outre, la restriction alimentaire, ne modifiait aucunement les concentrations
plasmatiques en progestérone et œstrogène (Mackey et al., 2000).
En comparaison, Richards et al., (1995) observèrent une réduction de la progestéronémie
chez des femelles multipares en conséquence à une restriction alimentaire.
Nous sommes face à des résultats contradictoires qui soulignent la difficulté à
interpréter des expériences très différentes (paramètres climatiques,
environnementales….) et la complexité des liens entre les acteurs d’une restriction
alimentaire.
Diskin et al., (2003), soulignent qu’il n’y a pas de nutriments spécifiquement
recommandés pour la fonction de reproduction et ne sont pas nécessaires pour les autres
fonctions physiologiques normales de l’organisme. Ainsi, il serait difficile de déterminer
une fonction spécifique ou un mécanisme par lequel la nutrition affecterait la fonction
de reproduction.
D’autre part, Les effets de la nutri t ion sur la capacité reproductrice s'observent à
différentes phases de la vie productive de la femelle : dès son jeune âge via ses
effets sur le moment d'apparit ion de la puberté, puis chez les femelles adultes
par son impact sur le taux de fert i l i té (et sur la prol i fici té) et donc sur le rythme
de reproduction (Ferguson, 2005).
114
115
II/ Exploration histologique de la population folliculaire chez la race locale et le
produit de ses croisements.
L’apparition de follicules en surface de l’ovaire semble dépendre de la profondeur du
cortex à laquelle ils sont localisés. En effet, notre exploration de la structure des
ovaires a révélé que l’épaisseur du cortex correspond à une stratification avec une
variation de l’épaisseur des différentes couches constitutives, ceci conformément à des
observations faites par ailleurs chez des races bovines d’Australie et d’Amérique
(Ingrid et al., 1996 ; Vigne et al., 1994) ; les follicules étant logés en majorité dans les
couches les plus internes (zones 4 et 5).
Tanaka et al., (2001), ont rapporté que les follicules primaires sont rencontrés dans les
couches profondes du cortex ovarien et que les follicules secondaires apparaissent dans
les couches superficielles de la medulla.
Cette disposition jointe à l’architecture générale du cortex peut être responsable de la
non exposition de certains follicules en surface au niveau des zones sus-jacentes les
plus épaisses.
En ce qui concerne les follicules visibles en surface, les images de l’histologie laissent
penser à un phénomène « d’émergence » de ces follicules au cours de leur
développement en direction de la surface, aux niveaux de couverture moindre en terme
d’épaisseur des zones superficielles 2 et 3.
La coïncidence des follicules en développement avec ces niveaux semble être au hasard,
car le stock de follicules est distribué de façon hétérogène dans la zone 4 d’après nos
résultats, et décrite par Sforza et al. (2003) à laquelle s’ajoute l’hétérogénéité de
l’épaisseur des couches sub- superficielles 2 et 3.
Le découpage structural du cortex en couches superposées mis en évidence dans cette
étude a été rapporté chez la race bovine d’Australie (Ingrid et al., 1996). Il se vérifie sur
le plan biologique : ainsi la zone 1 ou épithélium unistratifié, sa particularité se traduit
sur le plan pathologique. En effet, il a été rapporté que plus de 95% des cancers de
l’ovaire trouvent leur origine dans cette enveloppe de l’ovaire (Jeff et al., 2000 ; Choi et
Auersperg, 2003).
D’autre part, en ce qui concerne les zones 2 et 3 dont la structure est différente de celle
de la couche 1, une étude menée pour déterminer leurs propriétés fonctionnelles a
conclu à une activité sécrétrice de protéines spécifiques distinctes de celles de la zone 1
qui élabore une protéine à 28-KDa et une autre à 40-KDa comme une protéine de
croissance, l’insulin-like growth factor (IGF) binding protein-2 (IGFBP2) (Vigne et al.,
116
1994). En plus, les couches 2 et 3 se caractérisent par un aspect particulier des cellules
différentes de celui des zones sous jacentes 4 et 5 (Ingrid et al., 1996). Dans la zone 4
où les follicules commencent à apparaître, le stroma est riche en fibres de collagène, non
vascularisée ; les follicules préantraux y sont à différentes orientations (Ingrid et al.,
1996). La non vascularisation de cette zone 4 à prédominance de follicules primordiaux
(Sforza et al., 2003), serait compatible avec le fait que l’activation des follicules
primordiaux semble être non hormono- dépendant, (Wezel et al., 1995) et que ces
follicules étant quiescents, requièrent un minimum d’oxygène et d’énergie. Quant à la
zone 5 la plus profonde, elle se distingue par sa vascularisation développée (Zheng et
al., 1993) et son hébergement de follicules antraux. Cette configuration se confirme par
les échanges qui s’établissent normalement entre ce type de follicules et le sang.
Cette distribution spatiale hétérogène des follicules au sein du cortex ovarien a été
reportée également chez l’espèce humaine (Sforza et al., 2003). En effet, cette
disposition serait une conséquence de migration des follicules pendant la phase finale
d’histogenèse de l’ovaire normal, acquise au stade précoce de la morphogenèse
ovarienne (voir partie bibliographique).
Une analogie de ce point de vue entre les espèces humaine et bovine a été rapportée
également par (Vigne et al., 1994).
Sur le plan quantitatif, l’exploration histologique nous a permis aussi de révéler une
variation de la population folliculaire en fonction de l’âge : les femelles âgées de plus
de 5 ans ont le taux le plus bas en follicules. Il est à noter qu’au sein de la tranche d’âge
inférieure à 3 ans, les follicules primordiaux prédominent.
De sa part, Schmidt et al. (2003) à partir de biopsies ovariennes destinées à la
cryoconservation, ont observé que le stock de follicules est plus faible dans les
fragments prélevés chez les individus plus âgés.
D’autre part, la race locale accuse un stock de follicules primordiaux moins important
que chez la race améliorée à un âge inférieur à 3 ans.
Ce résultat se confirme par l’estimation du pourcentage des aires occupées par les
follicules et le stroma ovarien qui a révélé une diminution progressive nette de la
population folliculaire chez les vaches hors âge de la race locale du Maroc. Ceci est en
accord avec les résultats de Kumar et al. (1997) chez le Buffle.
D’autre part, l’âge des génisses de la race locale à la 1ère saillie fécondante est
relativement tardif et témoigne d’un manque de précocité évidente de la race locale
(Dewulf et Lahlou-Kassi, 1983). Ce résultat peut être en relation avec le taux de
117
follicules jugés plus faible chez la race Blonde d’Oulmes-Zaer à un âge inférieur à 3 ans
par rapport à celui de la race croisée.
Sur le plan pratique, il ressort de notre étude sur la race locale Marocaine, à l’instar de
celle menée chez le Buffle (Kumar et al., 1997) que les ovaires sont dotés d’une
population folliculaire totale nettement plus importante que celle exploitée par la
technique d’aspiration et de ponction des follicules visibles en surface. Une technique
plus agressive (Slicing) permettrait l’accès aux follicules les plus profonds non visibles
en surface mais qui peuvent constituer une source d’ovocytes pour la production
d’embryons bovins in vitro (Miyamura et al., 1996).
III / Les effets génétiques et autres sur la population folliculaire et le rendement
ovocytaire chez la race locale et exotique ainsi que le produit de leur
croisement.
Le nombre moyen de follicules par individu dans cette étude a été de (22.98± 8.41). Il
est supérieur à celui rapporté par (Kumar et al., 1997) qui est de 5,20 par vache de la
race Buffalo, mais du même ordre de ce qu’a observé Maneesh et al., (2000) qui est de
23 follicules en moyenne par vache. Et est inférieur à celui rapporté par Takaji et al.,
(1992) ;
32 follicules détectés sur les ovaires d’une vache élevée au Japon. Ce qui laisse penser à
un effet race (Humblot et al., 2005) et/ou de gestion du troupeau (Takaji et al., 1992).
Nos résultats varient beaucoup d’un individu à un autre dans un intervalle (de 2 à 60)
pour les follicules comptés sur la surface des ovaires. Les valeurs des erreurs standards
sont voisines de celles rapportées par Takaji et al., (1992).
Les variations élevées enregistrées dans cette étude soulignent la variabilité individuelle
pour ce qui est du rendement folliculaire. Cette importante variation individuelle est
aussi rapportée par, Humblot et al., (2005) suggérant que l’effet animal sur le nombre de
follicules est probablement un effet capital. Ainsi, il a été souligné que la parité
(nombre de mise bas) et la race de la vache pourraient être à l’origine de cette variation
de la dynamique ovarienne (Rhodes et al., 1995 ; Edde et al., 1999).
Le rendement en ovocytes chez les vaches de race locale, le produit de croisement entre
la race locale x exotique et exotique pure est de (2.59±1.53) ovocytes par vache. Il est
plus bas que ce qui a été rapporté en bibliographie (Nibart et Marquant- Leguienne,
1995).
118
Le rendement en ovocytes dans cette étude a été de 2 à 3 ovocytes par vache et par
collecte, il est inférieur à ce qui est rapporté en bibliographie qui est de 5 à 6 ovocytes
par collecte et par donneuse (Nibart et Marquant- Leguienne, 1995).
Mermillod et al., (1992), révèlent un résultat de 14.1 ovocytes par vache et par collecte
en moyenne.
L’aspiration du contenu folliculaire sous faible dépression sur des ovaires de chèvre
prélevés à l’abattoir permet d’obtenir en moyenne de 1 à 2 complexes ovocyte-cumulus
utilisables par ovaire (Cognié et Baril, 2002).
Plusieurs facteurs, particulièrement, la nutrition (Kruip-Tam et al., 1996 ; Kendrich et
al. 1999; Montiel et Ahuja, 2005) et/ou la technique de récupération des ovocytes
peuvent avoir un impact sur ces résultats.
En effet, Cognié et Baril, (2002) ont remarqué qu’un supplément de 4 à 5 ovocytes peut
être obtenu après découpage de l’ovaire en fines lames (slicing) à l’aide d’une lame de
rasoir.
Humblot et al., (2005), rapportent un rendement de 19 ovocytes par vache et par collecte
par la technique de l’OPU (Ovum Pick Up) et après super ovulation des vaches.
En utilisant la technique d’aspiration directe des follicules apparents en surface, le
rendement en ovocytes était de 2.59 ovocytes par femelle, et qui est similaire à celui
observé chez la race Buffalo : 2.35 (Kumar et al., 1997). Cependant, la ponction des
follicules ou le slicing des ovaires a donné respectivement un rendement de 3.10 et 6.25
ovocytes par vache. Cette amélioration du rendement est probablement due au fait que
les follicules superficiels et profonds sont exploités par la dissection de l’ovaire.
La récolte des ovocytes par la technique de slicing permet de récupérer même les
ovocytes contenus dans les petits follicules. Cependant, ces ovocytes sont moins aptes à
se développer après la fécondation in vitro (Cognié et Baril, 2002).
La différence du rendement en ovocytes par aspiration ou ponction pourrait résulter
partiellement de la pression négative appliquée aux follicules au moment de la collecte
des ovocytes.
Une pression négative de 50 mm Hg pourrait affecter le nombre et la qualité des
ovocytes (Ward et al., 2000). En effet, la variation des facteurs mécaniques en rapport
avec la procédure d’aspiration peut affecter aussi bien le rendement en ovocytes que
l’intégrité du complexe ovocyte - cumulus ainsi que leur potentiel du développement
119
dans les conditions de culture in vitro (Bols et al., 1996 ; Hashimoto et al., 1999 ; Ward
et al., 2000).
La différence entre le rendement par aspiration manuelle des follicules et leur aspiration
à l’aide d’une seringue reliée à une pompe sous vide, peut être attribué aux manœuvres
différentes, la première est contrôlée manuellement alors que l’utilisation de la pompe
dans la ponction permet une maîtrise meilleure de la pression utilisée pour l’opération.
Le fait que le B.C.S. a un effet significatif sur le nombre de follicules, le rendement en
ovocytes ainsi que sur leur qualité (Rhind et al., 1989 ; Dominguez, 1995 ; Kumar et al.,
1997) supporte l’effet de la nutrition sur les processus de la reproduction ; en
l’occurrence au niveau ovarien.
En effet, les vaches maigres à faible état corporel (B.C.S. = 1 – 2) ont moins de
follicules ovariens durant la phase lutéale et tendent à donner moins de follicules et
d’ovocytes au cours de la phase folliculaire (Rhind et al., 1989). Aussi, le nombre de
follicules qui quittent chaque jour la réserve est dépendant du B.C.S. individuel (Drion
et al., 1996).
D’autre part, la différence des résultats entre la race locale, le produit de croisement : la
race locale x la race exotique et la race exotique pure pourrait résulter de la méthode
d’évaluation du B.C.S. qui se fait sur une échelle qui n’est peut être pas adapté à la race
Marocaine.
Néanmoins, il a été rapporté que le B.C.S. n’est pas corrélé de façon significative à
l’activité métabolique (Zarco, 1993). Cependant, la balance énergétique, hormones
spécifiques et métabolites sont des indicateurs beaucoup plus précis.
Dans cette étude, le faible rendement en ovocytes des vaches à B.C.S. : 2, pourrait être
en relation avec le niveau énergétique de l’alimentation et la saison.
Les changements métaboliques et hormonaux liés aux apports alimentaires n’affectent
pas seulement la croissance et le développement folliculaire mais aussi la qualité des
ovocytes (Dominguez, 1995). Ainsi, le nombre d’ovocyte obtenu par aspiration des
follicules est significativement supérieur (1.53) chez les vaches recevant un régime
riche en énergie par rapport à celles recevant une ration faible en énergie (1.37)
(Kendrick et al., 1999).
En effet, L’énergie exerce une action cruciale sur la production d’hormones reliées à la
reproduction. Une balance énergétique positive stimule la production de toutes les hormones
reliées au développement folliculaire, à l’ovulation et à l’apparition des chaleurs.
120
Le rôle du bilan énergétique et la mobilisation des réserves adipeuses sur la fonction de
reproduction en l’occurrence sur la dynamique ovarienne ont clairement été démontrés (Butler,
2000).
Les relations entre l'état nutritionnel de la femelle et la fonction de reproduction sont très
particulières car les besoins énergétiques pour la reproduction stricto sensu, c'est-à-dire
l'ovulation et la fécondation, sont pratiquement négligeables. En revanche, l'initialisation d'une
gestation est lourde de conséquences pour la survie de la femelle si les apports nutritionnels et/ou
si ses réserves corporelles sont insuffisantes. En effet, ses besoins vont s'accroître au cours de la
gestation et surtout, après l'enclenchement de la lactation. Les régulations de la reproduction par
l'état nutritionnel supposent donc à un moment donné, la mise en œuvre de mécanismes
particuliers d'évaluation simultanée du bilan énergétique et de l'état des réserves adipeuses. Une
telle évaluation, à des phases clés du processus reproductif (jours suivant le vêlage chez la vache
laitière), pourrait constituer un moyen de remettre en cause l'engagement de la femelle dans une
nouvelle gestation et de limiter ainsi le risque associé à la reproduction (Chilliard et al., 2000 ;
Butler, 2003), mécanismes physiologiques en jeu impliquent un effet mémoire, sont très
complexes et demeurent encore mal connus (Butler, 2003). La leptinémie (et d'autres signaux
venant des tissus adipeux) intervient probablement dans cet effet mémoire, car elle est liée à la
fois au niveau des réserves et à l'état nutritionnel présent et elle semble pouvoir limiter la
reproduction lorsqu'elle est inférieure à un seuil d'environ 4 à 5 ng/ml (Liefers et al., 2003,
Meikle et al., 2004).
Pour l’effet saison, Dewulf et Lahlou-Kassi (1983), révèlent que l’activité sexuelle chez la race
locale est fortement élevée (plus de 90% des femelles en œstrus) aux mois de juin, juillet, août et
janvier. A l’opposé, elle est fortement réduite aux mois de mars et avril où 50% des femelles sont
en anœstrus, ce qui pourrait expliquer en partie le rendement en ovocytes noté chez la race locale
par rapport à la race exotique et le produit de leur croisement.
Dans notre étude, les ovocytes nus c'est-à-dire sans cumulus sont considérés comme des
ovocytes anormaux. Des ovocytes de la même qualité ont été maturés, fertilisés in vitro
et ont aboutit au stade d’embryons viables (Moreno et al., 1992). Ceci laisse suggérer
que certains ovocytes perdent partiellement leur cumulus durant l’aspiration des
follicules tout en restant viables.
Un complexe cumulus ovocyte (CoC) isolé d’un follicule non atrétique garantie un taux
élevé de formation de blastocyste et serait à l’origine d’un embryon de bonne qualité
(Wurth et Kruip, 1992).
121
En effet, la compétence de l’ovocyte à se développer in vitro ou in vivo s’acquière
graduellement et augmente avec le développement du follicule qui le contient.
L’ovocyte qui a déjà reçu les instructions du follicule avant d’être collecté devrait être
utilisé pour la P.I.V. (Gandolfi et Gandolfi, 2001).
La capacité de l’ovocyte à se développer en embryon dépend des informations
spécifiques et suffisantes qu’il a eues sous forme de RNAm ou protéines du follicule,
(Sirard, 2001). Si ces informations sont insuffisantes, la maturation nucléaire et/ou
cytoplasmique serait affectée et perturberait le développement in vitro.
L’état nutritionnel de nos animaux a été jugé par : les protéines totales, l’albumine, urée
et le β-hydroxybutyrate et l’A.S.A.T. Le dosage de ces paramètres montre que 78% des
vaches ont une protéinémie s’insérant dans l’intervalle des valeurs usuelles (60 à 85g/l)
(Fontaine et Cadore, 1995), 48.75% ont une albuminémie normale (30.3 à 35.5g/l)
(Kaneko, 1989). Les valeurs de l’urée et du β-hydroxybutyrate sont dans l’intervalle des
valeurs normales pour la majorité des vaches (Fontaine et Cadore, 1995 ; Dargel, 1987).
100% des vaches ont une A.S.A.T. normale (Fontaine et Cadore, 1995) suggérant une
intégrité hépatique de ces animaux.
Cependant, l’urémie chez la race Exotique (E) (3,88 mmol/l ± 0,23) et chez le produit de
croisement entre la race Locale avec la race Exotique (LxE) (4,34 mmol/l ± 0,42), est
significativement inférieure (P<0.05) à celle de la race locale (Blonde Oulmès des Zaer)
(5,08mmol/l ± 0,38). Ce résultat pourrait être en lien avec la dynamique ovarienne notée
inférieure chez la race Locale par rapport à la race exotique et le produit de leur
croisement.
En effet, Fergusson et Chalupa, (1989) ont observé que le taux de réussite de l’IA
(Insémination Artificielle) est 3 fois plus faible chez les vaches dont l’urémie était
supérieure à 0,43 g/l comparativement aux vaches à urémie normale. En effet, l’urée est
toxique pour le sperme et l’ovocyte (Greenhalf et Doggory, 1971). Ceci pourrait
expliquer la baisse du taux de réussite à l’I.A. et les mortalités embryonnaires.
De sa part, Butler (1998) révèle l’effet négatif de l’urée sur la fonction ovarienne et la
fertilité de la vache en agissant sur le pH utérin. Une concentration en urée plasmatique
supérieure à 19 mg/dl est associée à une altération du pH utérin et réduction de la fertilité
chez la vache. Le pH utérin de façon dynamique est inversement corrélé avec la concentration
plasmatique en urée.
122
Parmi les mécanismes impliqués dans la réduction de la fertilité, la balance énergétique négative
en relation avec l’excès protéique.
En effet, Butler (2003), montre qu’une balance énergétique négative retarde l’ovulation en
inhibant la fréquence des pulses de LH, induit une diminution de glycémie, d’insuline plasmatique
et de l’insuline growth factor-I (IGF-I) qui réduisent la production d’œstrogène par le follicule
dominant.
Le dosage du β- hydroxybutyrate (β-OH) qui est un indicateur de la mobilisation des réserves
corporelles montre que ce corps cétonique est plus élevé chez la race exotique par rapport aux
autres races (race locale et le produit de croisement de la race locale et la race exotique). Ceci
signifie que la race exotique est moins adaptée aux conditions climatiques et environnementales
locales.
Ceci signifierait aussi que ces animaux sont plus exposés au déficit énergétique car donnent plus
de lait et ne reçoivent pas suffisamment de concentré après le part.
Pour la race locale, elle profite plus des pâturages et donc a un accès plus important à l’azote
quand les conditions climatiques le permettent bien entendu.
123
Conclusion
L’impact d’une restriction alimentaire sur la reproduction des mammifères est admis.
Chez la vache, elle implique de nombreuses perturbations du profil hormonal, et de
l’activité ovarienne, en raison essentiellement du disfonctionnement de l’axe
hypotalamo-hypophysaire. En conséquence, la stéroïdogenèse est altérée, la dominance
folliculaire modifiée, une dépression de la compétence ovocytaire et donc une altération
de l’aptitude au développement in vitro.
L’interaction entre la nutrition et la reproduction repose sur plusieurs liens complexes. D’un point
de vue nutritionnel, l’énergie, les protéines, les minéraux et les vitamines affectent tous la
reproduction à leur façon.
Sur le plan pratique, cela mène à tenir compte du fragile équilibre qui existe entre la nutrition et la
reproduction pour maîtriser la reproduction des vaches face à la régie alimentaire afin de produire
au moins un veau vivant en santé par année.
D’autre part, les résultats de notre étude préliminaire pour la pratique de P.I.V. d’embryons in
vitro ont permis de conclure que :
1/ La nutrition a un effet sur la population folliculaire, le rendement en ovocytes ainsi
que leur qualité. En rapport avec ce dernier point, le taux de maturation des ovocytes collectés
pendant une année à tendance sèche est significativement plus bas que celui des ovocytes issus de
vaches ayant bénéficié d’une année humide et donc un pâturage abondant.
2/ La mesure du score des conditions corporelles de la donneuse de gamètes est un bon
outil pour le choix des femelles donneuses d’ovocytes. Le BCS de la vache a révélé un effet sur
la folliculogenèse, le rendement en ovocytes et aussi leur qualité.
3/ L’âge des donneuses doit être pris en considération : Pour notre étude, plus de la moitié
des vaches considérées abattues dans les abattoirs de l’axe Kenitra-Casablanca sont âgées de plus
de 5 ans, tranche d’âge où la population folliculaire et le rendement en ovocytes déclinent
significativement par rapport aux âges plus jeunes : inférieurs à 5 ans.
124
4/ L’exploration histologique des ovaires de la race Oulmès Zaer a montré une répartition et
une population folliculaire comparables à celles du produit de croisement entre cette dernière et
une race exotique : Pie noire ou Holstein, chez les femelles âgées de 3 ans et plus.
A jeune âge (moins de 3 ans), la race locale Oulmès Zaer présente une population folliculaire
significativement moins importante que celle du produit du croisent de la vache Oulmès- Zaer
avec la vache Pie noire ou la Holstein.
L’épaisseur des couches externes du cortex ovarien (la tunique albuginée) contribue également à
cacher les follicules sous jacents.
L’importance de ce résultat réside dans la nécessité d’utiliser la technique appropriée à cette
structure qui permet l’accès aux follicules indépendamment de leur localisation dans le cortex
afin d’optimiser la quantité de matériel recherché.
5/ Par ce travail, qui constitue les premiers essais de la technologie de production d’embryons
bovins in vitro dans notre pays, on peut considérer qu’elle est en phase d’expérimentation.
A l’issu de cette étude, nous pouvons affirmer qu’un certain nombre de problèmes doivent être
reconsidérés, il s’agit de :
� l’optimisation de la récupération d’ovocytes à partir de femelles à haut niveau
génétique.
� l’importante variabilité de la qualité et la quantité d’ovocytes entre donneuses.
� le jugement de la qualité de la maturation cytoplasmique de l’ovocyte.
� l’efficacité des systèmes de culture in vitro qui constituent une étape à problèmes en
rapport avec l’acquisition des ingrédients et le fonctionnement de l’appareillage.
Nos perspectives,
1/ Essayer de réaliser toutes les étapes restantes de la technique de P.I.V. d’embryons: la
capacitation des spermatozoïdes, la fécondation des ovocytes maturés in vitro et le
développement des œufs jusqu’au stade blastocyste.
2/ Utiliser cette technique pour promouvoir les races Marocaines en voie d’extinction.
3/ Instaurer cette technique dans l’enseignement pratique (niveau Master).
4/ Tenter d’appliquer la technique à des espèces domestiques ou sauvages en voie
d’extinction.
125
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148
ANNEXES
149
Annexe 1
Description des races considérées
A. Description de la race locale : Blonde d’Oulmès-Zaer.
La race Blonde d’ Oulmès-Zaer est l ’une des principales races bovines locales
Marocaines. D’après Lamire (1952), el le a des aptitudes mixtes. alors que
Nait lho (1973), Bensalah Zemrani et Oukassou(1978) la quali fient de race
bouchère.
1. Réparti t ion géographique :
Il y a quelques décennies, le berceau de la race Oulmès-Zaer englobait les
plateaux des Zaer (Romani) et la part ie montagneuse des Zemmour ayant Oulmès
pour centre et débordait quelque peu sur la région des Zaians (Mrirt). La race
s’était même répandue un peu dans le Nord du pays, essentiel lement dans la
région du Gharb (Girard et Sail lard, 1938; Bernard et Fournier, 1955).
D’après l ’arrêté du Ministère de l ’Agriculture, du développement rurale et de la
pêche marit ime n° 1064-84 du 15 safar1405 (9 novembre1984) établissant la
l iste des zones dites « Berceaux des races » pour les espèces bovines, ovine et
équine, la race Blonde d’Oulmès Zaer est dans la région de Khmisset (Oulmès),
plateau de Romani, plateau de Kenitra et la préfecture de Salé, avec 70% de la
population et sur le plateau de la Maamora.
Selon les statist iques du Ministère de l ’Agriculture et de la Réforme Agraire,
l ’effecti f de la race Blonde d’ Oulmès-Zaer est estimé à 80 000 têtes
(Benlekhal, 1996).
2. Description phénotypique
Le bovin de race Blonde d’Oulmès-Zaer a une tête assez longue, un front large
et convexe, un chignon légèrement sail lant, des arcades orbitaires peu
proéminentes, des orei l les larges dirigées vers l ’arrière et fortement garnies de
poils longs, des cornes bien plantées, de grandeur moyenne, partant d’abord
horizontalement pour se diriger vers le haut puis en avant, de couleur claire à
extrémités foncées.
150
A la naissance, certains sujets ont des muqueuses foncées qui s’éclaircissent au
cours des premières années, passant d’abord par une couleur marbrée, gris et
rose pour devenir complètement dépigmentées par la suite.
Le tronc présente une poitr ine bien descendue. Les côtes sont longues. La l igne
dorsolombaire est droite. Le bassin est assez large. Les membres sont à canons
assez forts. La couleur de la robe est acajou chez le taureau, foncé chez la
vache. Elle s’éclaircit avec l ’âge.
La tai l le des bovins de race Blonde Oulmès-Zaer varie généralement de 120 à
135 cm. Le poids moyen est de 300 à 325 kg pour la vache (Karamat, 1975).
Cependant, les critères les plus importants qui forment les caractérist iques d’une
sélection primaire de la race Blonde Oulmès-Zaer sont la couleur de la robe
(claire non tachetée), des muqueuses, des cornes et des ongles.
3. Performances de reproduction
a. âge à la puberté
L’âge à la puberté di ffère selon la définit ion qui lui est donnée. Ainsi, chez les
génisses de race locale, l ’âge à la puberté indiqué par la première ovulation
varie de 13.6 mois (Almandri, 1986) à 21.5mois (Hossaini-Hilal i , 1986). Indiqué
par le premier œstrus, cet âge varie de 13,4 mois (Almandri, 1986) à 23.6 mois
(Hossaini-Hilal i , 1986). Il est de 17.8 mois lorsqu’i l est indiqué par le premier
œstrus ovulatoire (Dewulf et Lahlou-Kassi, 1983).
L’âge à la puberté est influencé par le régime alimentaire pendant la phase de
croissance de la génisse. Ainsi, 80% des génisses atteignent la puberté avant
l ’âge de 15 mois lorsque les condit ions al imentaires sont favorables (Al Mandri ,
1986).
b. âge à la 1 è re sai l l ie fécondante
Chez les génisses de race locale, la première sail lie fécondante survient à 22,2
mois en moyenne (16 à 26.1mois) et à un poids moyen de 242.3 Kg (Hossaini-
Hilal i , 1986).
Chez la race brune de l ’Atlas, l ’âge à la première sail l ie fécondante est de 19,3
mois (Le Stum, 1974). Chez la race Tidi l i , l ’âge à la première sail l ie fécondante
est de 24,6 mois (El Hazzab, 1997). Il est de 29,0 mois chez la race Blonde
Oulmès-Zaer (Bounab, 1970).
4. Réparti t ion saisonnière de l ’activ ité sexuelle
151
Chez les vaches de race locale, les vêlages sont étalés sur toute l ’année. Il y a
20% des naissances en octobre- novembre- décembre, 60% en janvier - février-
mars, 20% en avri l pratiquement 0% en période de sécheresse de jui l let- août-
septembre.
A l ’échelle nationale, 81% des vêlages de vaches de race locale ont l ieu de
janvier à avri l . Ceci indique que la période des sail l is fécondantes se situe entre
les mois d’avri l et jui l let (Enquête Elevage, 1977). Dewulf et Lahlou-Kassi
(1983), révèlent que l ’activité sexuelle est fortement élevée (plus de 90% des
femelles en œstrus) aux mois de juin, jui l let, août et janvier. A l ’opposé, el le est
fortement réduite aux mois de mars et avri l où 50% des femelles sont en
anœstrus.
Chez les vaches de race locale dont les cycles sont réguliers, la durée du cycle
œstral est en moyenne de 21 jours (Dewulf et Lahlou-Kassi, 1983).
B. Description et performances de reproduction des races
Pie-noire et Holstein
La race Pie noire représente 85% des bovins importés (Boujnane, 2002).
Les études entreprises ont souligné la modestie des performances réalisées par
ces races dans les condit ions Marocaines vu leur potentiel génétique (Boujnane
et al. , 2000).
La tai l le de la vache bretonne de Cornouail le est donc peu élevée : el le varie
entre 1 mètre et 1.40mètre.
Comme physionomie, l 'aspect de la Bretonne est des plus séduisants. La tête est
finement sculptée et portée assez haut par une encolure souple et émaciée. Les
yeux sont t rès mobiles. La face est eff i lée vers la base avec un mufle plutôt
étroit. Le profi l est très nettement recti l igne et la tête est du type
dolichocéphale, c 'est à dire que la distance des yeux dépasse comme dimension
la largeur du front aux cornes. Celles-ci sont plantées dans la l igne du chignon
et se recourbent gracieusement vers l 'avant pour se relever ensuite vert icalement
en une haute lyre ou un beau croissant dont la pointe s' incurve en arrière.
Le tronc est porté par des membres d'apparence délicate, mais qui rachètent leur
manque d'épaisseur par une grande solidité, avec des onglons petits et très durs.
Il faut souligner la grande souplesse de la peau et la finesse du poil court et
soyeux, la couleur est noire et blanche. Le plus souvent, la tête est noire avec
152
l 'étoi le au front : le mufle est également pigmenté, de même que le bord des
paupières, les cornes (sauf à la base) et les onglons.
Dans le type pur de la race, le manteau recouvrant l 'encolure et le dos est noir
avec une écharpe blanche sur les épaules et aussi sur les hanches descendant,
dans la majorité des cas, jusqu'au ventre qui est presque entièrement blanc ainsi
que les jambes et le fouet.
L’âge à la puberté, indiqué par la première ovulation, des génisses de la race
Pie-noire élevée au Maroc est de 14,8 mois (Al Mandri , 1986). En revanche,
lorsqu’i l est indiqué par le 1er œstrus, cet âge varie de 10,1 à 16,6 mois (Al
Mandri, 1986).
L’âge à la puberté est influencé par le niveau de nutri t ion des génisses pendant
la période d’élevage. Chez les génisses de race pie-noire soumises à un régime
alimentaire pauvre, l ’âge de la première ovulation est de 18,4 mois. L’âge au
premier œstrus est de 21.3mois (Hossaini-Hilal i , 1986).
L’âge à la première sail l ie fécondante des génisses de la race Pie-noire est en
moyenne de 20,8 mois (Hossaini-Hilal i , 1986).
La gestation de la vache Holstein dure environ neuf mois.
Bien que certaines vaches vivent considérablement plus longtemps, la période
normale de productivi té d'une Holstein est de six ans.
153
ANNEXE 2 1/ Composition de Boin Holland Sublimé Acétate de cuivre______________________________________________2,5 g Acide Picrique________________________________________________4 g Formol______________________________________________________10 ml Acide Acétique_______________________________________________1,5 ml Eau distillée_________________________________________________100 ml Au moment de l’emploi du Boin Holland, 10 g de Hgcl2 (Sublime) dissoute dans 100 ml d’eau distillée est ajouté au Boin. 2/ Composition du colorant : Hematoxyline Eosine
• Hématoxyline de Harris : Hématoxyline de Harris _________________________________________19 g Alcool méthylique____________________________________________ 10 ml Alur de Potasse ________________________________________________20 g Eau Distillée________________________________________________ 200 ml Oxyde jaune de Mercure _______________________________________0,5 g Acide Acétique glocial _________________________________________4 ml
• Eosine 10% de la solution mère
154
ANNEXE 3
Techniques de dosages des paramètres biochimiques considérés
1. Dosage des protéines totales
La mesure des protéines totales a été effectuée directement à l’aide d’un réfractomètre
clinique de type ERMA (série 13776, Tokyo, Japon).
La technique repose sur une lecture directe au niveau de l’oculaire de réfractomètre où
on observe des graduations allant de 0 à 120. Après le réglage du 0 de l’appareil avec
l’eau distillée, on fait passer successivement les échantillons de sérum. Un rinçage
régulier, avec l’eau distillée, après chaque mesure a été effectué. Les valeurs sont
converties en g/l.
2. Dosage de l’Albumine
a/ Principe
A pH : 4.2, le 3,3’, 5,5’-tétrabromo-m crésol sulphonphthaléïne (vert de bromocrésol) se
fixe sélectivement sur l’albumine sérique formant un complexe albumine-Vert de
Bromocrésol qui absorbe à 578 nm en donnant une coloration bleue. L’addition de
Brij 35 augmente la sensibilité de la réaction. L’intensité de l’absorbance est
directement proportionnelle à la concentration en albumine dans l’échantillon.
b/ Réactifs (RANDOX)
-Vert de bromocrésol concentré
Tampon succinate ……………………75 mmol/l ; pH 4,2
Vert de bromocrésol ……………………. 0.15 mmol/l
Brij 35…………………………………. Traces
Conservateur……………………………. ----
- Etalon
Albumine sérique humain…………………………… 45 g/l
Tampon Tris…………………………100 mmol/l : pH 7,3
• Préparation des solutions
- Dans 3 tubes à essais, on introduit :
Blanc Réactif Etalon Echantillon
155
Eau distillée
Etalon
Sérum
Réactif
0.01 ml
--
--
3.00 ml
--
0.01 ml
--
3.00 ml
--
--
0.01 ml
3.00 ml
- Le mélange est incubé 5 minutes à 20 – 25°C. La longueur d’onde utilisée est de 630
nm (600-650 nm). La cuvette de mesure en quartz est de 1 cm de trajet optique. La
mesure se fait dans un spectrophotomètre UV-Visible. La lecture de l’absorbance de
l’échantillon (A échantillon) et de l’étalon (A étalon) contre le blanc réactif a été effectuée.
c/ Résultats
La concentration en albumine de l’échantillon est obtenue par la formule suivante :
3. Dosage de l’urée
Le dosage de l’urée sérique a été effectué par la méthode à l’uréase.
a/ Principe :
L’urée est hydrolysée par l’uréase en produisant de l’ammonium et du dioxyde de
carbone. Les ions ammoniums réagissent en milieu alcalin avec le salicylate et
l’hypochlorite, en présence de la nitroprusside pour former un complexe coloré, le vert
d’indophénol. L’intensité de la coloration formée est proportionnelle à la concentration
de l’urée présente dans l’échantillon.
b/ Réactifs (Linear Chemicals)
� Réactif 1
� Tampon phosphate pH 6.7………………… 50 mmol/l
� Salycilate …………………………………… 60 mmol/l
� Nitroprusside …………………………………3.2 mmol/l
� EDTA…………………………………………. 2 mmol/l
� Réactif 2
� Hypochlorite de sodium…………………...….140 mmol/l
A échantillon
Concentration en albumine = ------------------- x Concentration de l’étalon (g/l ou g/dl) A étalon
156
� NaOH…………………………………………..150 mmol/l
• Réactif 3
� Uréase….…………………………….……….. 30.000 U/l
� Etalon : Urée à 50 g/l (0,50 g/dl)
c/ Préparation des solutions
- Dans 3 tubes à essais, on introduit :
Blanc Etalon Echantillon
Etalon
Sérum
Réactif 1 + 3
--
--
1.00 ml
0.01 ml
--
1.00 ml
--
0.01 ml
1.00 ml
- Le mélange est incubé 5 minutes à 37°C (ou 10 minutes à 15 –
25°C).
- Ensuite on ajoute le réactif 2, à raison de 1ml par tube
- Lecture de l’absorbance de l’échantillon (A échantillon) et de l’étalon (A étalon) contre le
blanc réactif.
- La longueur d’onde utilisée est de 580 nm. La cuvette de mesure en quartz est de 1cm de
trajet optique. La mesure se fait dans un spectrophotomètre UV-Visible.
d/ Résultats
La concentration en urée de l’échantillon est obtenue par la formule
suivante :
4/ Dosage du β- hydroxybutyrate (Ranbut)
- a/ Principe
A échantillon Concentration en albumine = ------------------- x Concentration de l’étalon
(mg/dl ou mmol/l) A étalon
157
Le dosage du β-hydroxybutyrate sérique est réalisé grâce à la méthode cinétique
enzymatique. Cette technique est basée sur l’oxydation du β-hydroxybutyrate en
acétoacétate. Cette réaction est catalysée par l’enzyme 3-hydroxybutyrate
déshydrogénase. Durant cette oxydation, le cofacteur NAD+ est réduit en NADH
s’accompagnant ainsi d’un changement d’absorbance corrélée directement à la
concentration du β-hydroxybutyrate présente dans l’échantillon.
- b/ Réactifs (RANDOX)
• Tampon
� Tampon tris…………..……………100 mmol/l, pH 8,5
� EDTA………………………………………… 2 mmol/l
� Acide oxalique…………………………………20 mmol/l
• Enzyme/Coenzyme
� NAD+ …………….……………….………… 2,5 mmol/l
� 3-HBDH…………………………………………0.12 U/ml
• Etalon
� β-3-Hydroxybutyrate….………………………1 mmol/l
• Etalon
• β -3-Hydroxybutyrate….……………………… 4 mmol/l
c/ Préparation des solutions
Dans 3 tubes à essai, on introduit :
Etalon Blanc Réactif Echantillon
Etalon
Sérum
Eau distillée
Réactif
75 µ l
--
--
3.00 ml
--
--
75 µ l
3.00 ml
--
75 µ l
--
3.00 ml
Le mélange a été incubé 30 secondes à 37° C puis la première lecture est effectuée. Puis
une 2ème lecture à nouveau après 1, 2 et 3 minutes pour déterminer la ∆A/min moyen
pour les calculs ultérieurs.
La cuvette de mesure en quartz est de 1 cm de trajet optique. La mesure se fait dans un
spectrophotomètre UV-Visible.
d/ Résultat
∆A échantillon
Concentration en β-hydroxybutyrate = ------------------- x Concentration de l’étalon (mmol/l) ∆A étalon
158
5/ Dosage de la G.O.T
a/ Principe
La Glutamique-Oxaloacétique Transaminase est déterminée en suivant la concentration
de l’oxaloacétate hydrazone formé à partir de 2,4-dinitrophényl-hydrazine. La réaction
est comme suit :
GOT
α-Oxoglutarate + L-aspartate � L-glutamate + oxaloacétate
* Réactifs (RANDOX)
-Tampon
� Tamponphosphate………..…………100 mmol/l, pH 7.4
� L-aspartate……………………………………100 mmol/l
� α-oxoglutarate……………………………… 2 mmol/l
-2,4-dinitrophénylhydrazine……….……………….… 2 mmol/l
-Hydroxyde de sodium….…………………………… 0,4 mmol/l
b/ Préparation des solutions
Mesure contre le blanc réactif :
Blanc Réactif Echantillon
Sérum
Solution 1
--
0,5 ml
0,1 ml
0,5 ml
Après avoir mélanger la solution 2 à raison de 0.5ml par tube, on attend exactement 30
minutes à 37°C.
L’incubation dure exactement 20 minutes à 20 - 25°C. L’hdroxyde de sodium est ajouté
aux tubes (0.5/tube).
Puis la lecture de l’absorbance de l’échantillon contre le blanc réactif
après 5 minutes.
La longueur d’onde utilisée est de 546 nm (530-550 nm). La cuvette de mesure en quartz
est de 1 cm de chemin optique. La mesure se fait dans un spectrophotomètre UV-
Visible.
c/ Résultats
L’activité du G.O.T. sérique est obtenue par la table suivante :
159
Absorbance U/l Absorbance U/l
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
7
10
13
16
19
23
27
31
0,100
0,110
0,120
0,130
0,140
0,150
0,160
0,170
36
41
47
52
59
67
76
89
A partir des valeurs de référence données, on établie une droite de régression
pour déterminer la fonction linéaire :
Y = a + bx (a et b sont des constantes).
Droite de régression de l'évolution de la GOT
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
00,
010,
020,
030,
040,
050,
060,
070,
080,
09 0,1
0,11
0,12
0,13
0,14
0,15
0,16
0,17
0,18
Absorbance
[U/l]
D’après le calcul, on établie les valeurs de a et b.
a= -10.1235 b= 509.8529
Connaissant les valeurs des constantes a et b et les valeurs des absorbances [X], on
détermine alors les concentrations [Y] de nos échantillons.
160
Annexe 4
1. Composition du milieu de collecte
• 45 ml milieu 199 avec 25 mM Hepes
• 5 ml sérum de vache en œstrus (SVE)
• 500 µl gentamycine stock
• 50 µl peni-strepto stock
• filtrer sur filtre 0.22 µm stérile dans un flacon
2. Composition du milieu de maturation
• 8.5 ml 199 Hepes
• 1.5 ml sérum de veau fœtal
• 100 µl gentamycine stock
• 10 µl E2 17 β
• 100 µl FSH / LH
• filtrer sur filtre 0.22 µm stérile puis mettre à gazer dans l’étuve 5% CO2.
3. Composition du PBS de Dulbecco (Whittingham, 1971).
(PH : 4.2 à 7.4 Osmolarité : 290 à 320 milli – osmoles).
161
Pour un litre de solution
Eau déionisée
CaCl2, 2H2O
MgCl2, 6H2O
200 ml
0.200 g
0.0823 g
Eau déionisée
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
Pyruvate de Na
Glucose anhydre
Pénicilline G
Dihydrostreptomycine Sulfate
Albumine bovine lyophilisée (BSA)
800ml
8.000g
0.200g
1.1485g
0.200g
0.036g
1.000g
100.000 U.I.
62.5 mg
2.000 g
162
Travaux Scientifiques
Publications :
Fassi Fihri A., Hajji Kh. et Lakhdissi H. (2004).
Histological exploration of follicular population of the Moroccan bovine
(Oulmes Zaer) breed.
African Journal of Biotechnology, 3(5): 294-298.
Fassi Fihri A., Lakhdissi H., Derquaoui L., Hajji K H., Naciri M. et Goumari A.
(2005).
Genetic and nongenetic effects on the number of ovarian follicles and oocytes
yield and quality in the bovine local (Oulmes Zaer), exotic breeds and their
crosses in Morocco.
African Journal of Biotechnology, 4(1): 9-13.
Communication :
Fassi Fihri A., Hajji KH., Lakhdissi H., Kherrati B . et El Aidi L. (2002).
Niveau alimentaire et capacité des ovocytes bovins au développement in vitro.
Colloque international, « Les Biotechnologies : Quelles opportunités pour le
Maroc ». Regroupement des Biologistes Marocains au Canada, 3 – 5 Juin 2002,
Faculté des Sciences de Rabat.
163
Résumé de la Thèse
Au Maroc, l’élevage des bovins occupe une place importante dans le système agropastoral et représente une spéculation animale très importante, la productivité reste basse malgré la diversité de ses races. Jusqu’à présent, les seules biotechnologies pratiquées au Maroc sont l’I.A et le T.E.. Cependant, le transfert d’une technologie doit débuter par une phase d’adaptation aux conditions spécifiques du nouveau milieu. Les méthodes de reproduction assistée : Insémination Artificielle (I.A.), Transfert Embryonnaire (T.E.) et surtout la Production d’Embryons in Vitro (P.I.V.) constituent des moyens très efficaces pour accroître la population d’animaux d’intérêt économique ou en voix d’extinction. L’objet de cette étude est d’évaluer la quantité et la qualité morphologique des ovocytes issus de femelles locales et leur aptitude à maturer in vitro ; avec une exploration histologique des ovaires de cette race d’une part et d’autre part, l’impact du niveau alimentaire sur ce type de cellules ou gamètes. Cette étude a été menée pendant deux années successives qui se distinguaient par une pluviométrie différente : respectivement très faible et abondante, et de là, un pâturage différent. Les ovaires prélevés sur 259 vaches appartenant à 3 races : une locale (Oulmes-Zaer), une exotique (Frissone ou Pie Noir) et des vaches issues de leur croisement. Les ovaires sont prélevés de vaches abattues aux abattoirs de l’axe Kenitra-Casablanca. Lors des examens anté mortem, les femelles sont alors identifiées et marquées, les informations suivantes sont relevées : l’âge, la race, la note de l’état corporel (body condition score-B.C.S.) et leur provenance.Une prise de sang est effectuée pour le dosage ultérieur de certains paramètres indicateurs du métabolisme protéo-énergétique. Les ovaires sont ramenés au laboratoire dans du liquide physiologique à 0.9% et à une température de 32 à 35°C et dans les deux heures qui suivent l’abattage. Sur chaque ovaire, les follicules apparents de 2 à 8mm ont été comptés et aspirés à l’aide d’une seringue de 2 ml reliée à une aiguille de 20 G. Après l’aspiration folliculaire, les ovocytes et le liquide folliculaire sont placés dans des boites de pétri contenant le milieu P.B.S. (Phosphate Buffered Saline). Les ovocytes sont recherchés et examinés sous une loupe binoculaire puis classés selon leur aspect morphologique. Les ovocytes de qualité 1, 2 et 3 ont été sélectionnés pour la maturation in vitro ; les ovocytes matures présentaient un cumulus expansé. Pour l’exploration histologique, un ovaire de chaque vache (15 locales et 15 exotiques) a été considéré. La préparation des lames histologiques pour microscopie photonique a obéit à la technique classique. Les résultats ont montré que : 1- la population folliculaire de 2 à 8mm des ovaires prélevés aux abattoirs est plus importante pendant l’année 2000(année pluvieuse) que l’année précédente (année à tendance sèche). 2- Le rendement en ovocytes est plus important pendant l’année pluvieuse par rapport à l’année à tendance sèche. Le taux de maturation des ovocytes in vitro pendant l’année pluvieuse est plus élevé que celui obtenu au cours de l’année à tendance sèche. 3- Le B.C.S. moyen est de 2,94 ± 0,89; 52.5% de la population a plus de 5 ans. 4- Les résultats du dosage des protéines totales (77.83±0.98g/l), de l’albuminémie (32.40±4.41g/l), de l’urémie (4.43±0.23mmol/l), du β-hydroxy butyrate sanguin (0.83±0.48mmol/l) et du GOT sanguin (45.55±11.95UI/l) montrent des moyennes qui s’insèrent dans l’intervalle des valeurs usuelles. 5- Le nombre de follicules est plus élevé chez les vaches à B.C.S. 4 et 5 ; de race exotique et à âge moins de 3 ans. Le même résultat est révélé pour le rendement en ovocytes. 6- aucun effet significatif des paramètres dosés indicateurs de l’état nutritionnel n’a été détecté sur le nombre de follicules ni sur le rendements en ovocytes. 7- Les follicules sont observés dans la zone 4 du cortex ovarien. Les zones 1, 2 et 3 ont des épaisseurs variables. 8- Le pourcentage d’aire ovarienne occupé par le tissu folliculaire est plus faible chez la race locale par rapport à la race croisée à un âge moins de 3 ans. Ce pourcentage est pratiquement le même pour les deux races à des âges de 3 à 5 ans et plus de 5 ans mais à des niveaux différents : 17% et 9.4%. Au terme de cette étude, on peut conclure qu’il existe une relation évidente entre la race, le B.C.S., l’âge et la fonction ovarienne des vaches. Mots clés : vache– race- âge - profil métabolique – population folliculaire – rendement en
ovocytes – note de l’état corporel – histologie de l’ovaire.
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