segrégation de marqueurs membranaires au cours de la croissance et de la division...

BIOCHIMIE, 1972, 54, 93-101.

Segrdgation de marqueurs membranaires au cours de la croissance et de la division d'Escherichia coli.

III - Uti l isat ion de marqueurs vari6s : Perm6ases, Phosphotransf6rases, Oxydor6ductases membranaires.

F r a n $ o i s e AUTISSIER et A d a m KEPES.

Laboraloire des Biomembranes, Insti tut de Biologie MolOculaire, Tour ~3 - - 11, place Jussieu Paris 5%

(1/2/1972).

Summary. - - A penicill in technique allows the detection of a heterogeneity with respect to an inducible membrane marker e.g. a t ransport system in an otherwise homogeneous bacterial population.

This method has been uti l ized to demonstrate, that after complete induction of a per- mease a heterogeneity appears after 3 generation t imes under non inducing conditions. This heterogeneity is due to the existence of growing zones in the membrane al ternat ing with resting zones in such a way that the parental membrane is f ragmented into a l imited number of regions which are t ransmit ted to a l imited number uf descendents, this number being 4 in the culture conditions utilized.

In the present article, the method is utilized to detect the segregation of a variety of inducible membrane markers : several well known permeases, one phosphotransferase en- zyme for D-mannitol , one membrane bound oxydoreductase, the anaerobic ni t ra te redue- tase, and some unknown markers probably transport-systems inducible by glueonate and trehalose respectively.

In the discussion, the possible usefulness of the segregation method for the solution of problems other than membrane growth is reviewed.

I N T R O D U C T I O N .

La d6f in i t ion du m o d e de c r o i s s a n c e des m e m - b ranes cenu l a i r e s , et en p a r t i c u l i e r la d6mons t r a - t ion de l ' e x i s t e n c e de zones de c r o i s s a n c e p a r o p p o s i t i o n h des zones de repos , s 'es t l ong teu lps heu r t6e h des diff icult6s. P a r m i cel les-ci , les p lus i m p o r t a n t e s sont l ' o b t e n t i o n d ' u n e espbce de m e m - b r a n e b i en d6finie, m e m b r a n e p l a s m i q u e ou m e m - b r a n e des o rgane l l e s i n t r a c y t o p l a s m i q u e s ; le re- n o u v e l l e m e n t des cons t i t uan t s m e m b r a n a i r e s , p r o - t6ines, l ip ides , etc. ; et enfin l ' e x i s t e n c e p ln t6 t soup~onn6e que p r o u v 6 e de c o u r a n t s de d6 fo rma- t ion dus fi une c e r t a i n e f lu id i t6 de la m e m b r a n e . Tou te s ces diff icul t6s son t absen tes ou r6du i t e s duns le cas des m e m b r a n e s bac t6 r i ennes . En effet, chez les bac t6r ies , G r a m n6gat i fs en p a r t i c u l i e r , seule ex is te une m e m b r a n e p l a smiqne , en tour6e c e p e n d a n t d ' u n e e n v e l o p p e qu i a ce r t a ines p ro - pr i6 t6s m e m b r a n a i r e s . An se in de ce t te m e m b r a n e p l a s m i q u e , le r e n o u v e l l e m e n t des cons t i t uan t s est tr6s mod6r6 , que lques p o u r c e n t p a r t emps de g6n6ra t ion , p o u r les p ro t6 ines et la p h o s p h a t i d y l 6 thano l amine , c o m p o s a n t m a j e u r des p h o s p h o l i - p ides . Enf in , la g6om6t r i e r e l a t i v e m e n t c o n s t a n t e des b~tonne ts , due h l ' e m p r i s o n n e m e n t de la m e m - b r a n e sous une e u v e l o p p e r ig ide , p e r m e t de p e n s e r que les m o u v e m e n t s de c o n v e c t i o n de su r f ace doi- v e n t 6tre l imit6s .

De plus, chez les m i c r o o r g a n i s m e s , des r a i sons p a r t i c u l i 6 r e s p e r m e t t e n t de p e n s e r qu ' i l ex is te des zones de c r o i s s a n c e local is6e. En effet, en l ' a b s e n c e d ' a p p a r e i l m i to t i que , l ' 6 q u i p a r t i t i o n de I 'ADN dans les ce l lu les fi l les apr6s sa r6p l i ca t ion , n6ces- si te une t r a c t i o n m 6 c a n i q u e que seule la m e m b r a n e ce l l u l a i r e s emble c a p a b l e d ' a s s u m e r a ins i que Fon t pos tu l6 JAco~ et coll . [1]. A la su i te de ce t te h y p o - th6se, un g r a n d n o m b r e de t r a v a u x ont appor t6 des a r g u m e n t s en f a v e u r de l ' a t t a c h e m e n t de I 'ADN h la m e m b r a n e , chez p l u s i e u r s esp6ces. [2, 3, 4]. II r e s t a i t h m o n t r e r que la t r a c t i o n m 6 c a n i q u e 6tai t due ~ une c r o i s s a n c e loca l i s6e p lu t6 t qu'h un m o u - v e m e n t de r6g ions m e m b r a n a i r e s p r6ex i s t an tes .

Des t r a v a u x effectu6s sur des bac t6 r i e s g ram- pos i t i f s h l ' a i d e d ' a n t i c o r p s f luorescen t s , on t m o n - tr6 un m o d e de c r o i s s a n c e loca l i s6e de l ' e n v e l o p p e ex te rne , ma i s les m6mes e x p 6 r i e n c e s a v e c les g ram-n6ga t i f s on t donn6 des r6sul ta t s c o n t r a d i c - to i res , en m a j o r i t 6 n6gat i fs [5, 6, 7, 8]. Seul, l ' em- p lo i des r 6 c e p t e u r s de phage T6 [9J 6tai t c o n f o r m e aux p r6v i s ions d ' u n e zone de c r o i s s a n c e loca l i s6e et t o u s l e s t r a v a u x qui s ' a d r e s s a i e n t h des cons t i - tuan t s m e m b r a n a i r e s p r o p r e m e n t dits, soi t ~ l ' a i de de m a r q u a g e s i s o t o p i q u e s [10, 11], soi t ~ l ' a i d e de m a r q u e u r s de dens i t6 [12-13] ont abou t i h des r6sul ta ts n6gatifs . La seule e x c e p t i o n ~ ce t te r6gle fur la d 6 m o n s t r a t i o n de la r 6 p a r t i t i o n non staffs-

94 Francoise Autissier et Adam Kepes.

t i q u e des f lagel les c h e z u n e s o u c h e de B. s u b t i l i s

off la s y n t h 6 s e de ces o r g a n e l l e s 6 ta i t t h e r i n o s e n - s ib le [14]. C o m m e ees f i l a m e n t s s o n t i m p l a n t 6 s dar ts la m e m b r a n e p l u t 6 t que d a n s la p a r o i , l e u r r 6 p a r t i t i o n n o n s t a t i s t i q u e s ign i f i e u n e c r o i s s a n c e m e m b r a n a i r e n o n u n i f o r m e .

N o u s a v o n s c h o i s i des s y s t 6 m e s de t r a n s p o r t i n d u e t i b l e s c o m m e m a r q u e u r s de m e m b r a n e , et n o u s a v o n s p u m o n t r e r , que la L a c p e r m 6 a s e com- p l 6 t e m e n t i n d u i t e se d i s t r i b u e a u c o u r s de la c r o i s - s a n c e u l t 6 r i e u r e en l ' a b s e n c e d ' i n d u c t e u r , h u n e p a r t i e s e u l e m e n t des d e s c e n d a n t s . L ' h 6 t 6 r o g 6 n 6 i t 6 de la p o p u l a t i o n v i s -h -v i s de la t e n e u r en p e r m 6 a s e , a 6t6 m i s e en 6 v i d e n c e g r a c e h u n e t e c h n i q u e d a n s l a q u e l l e l ' a v a n t a g e s~lect i f , c o n % r ~ p a r la p e r - m 6 a s e a u x b a c t 6 r i e s ra i ses en p r 6 s e n c e de l ac tose , es t t r a n s f o r m 6 e n d 6 s a v a n t a g e p a r u n l o n g t r a i t e - m e n t au c h l o r a m p h 6 n i c 0 1 qu i a b o u t i t h u n e a c c u - m u l a t i o n de << p a r t i c u l e s c h l o r a m p h 6 n i c o l >> ; d a n s u n e s e c o n d e 6 tape , ce d 6 s a v a n t a g e es t r e c o n v e r t i en a v a n t a g e p a r le r e t a r d q u ' i l c a u s e d a n s la lyse de ces b a c t 6 r i e s p a r u n p h a g e k 857 t h e r m o i n d u c - t ib le . D a n s ces c o n d i t i o n s , u n e p o p u l a t i o n de bac - t 6 r i e s h 6 t 6 r o g 6 n e s p o u r la p e r m 6 a s e se lyse en d e u x t e m p s n e t t e m e n t d i s t i n c t s , les d e s c e n d a n t s d ~ p o u r v u s d u m a r q u e u r p a r e n t a l 6 t a n t les p r e - m i e r s lys6s [15].

D a n s u n t r a v a i l u l t 6 r i e u r , n o u s a v o n s a d a p t 6 la t e c h n i q u e & la p 6 n i c i l l i n e p o u r c o n t r e - s 6 1 e c t i o n n e r les b a c t 6 r i e s a y a n t la p e r m 6 a s e p a r e n t a l e . D e p u i s l o n g t e m p s , le p r i n c i p e de ce t t e t e c h n i q u e est l a r - g e m e n t u t i l i s6 en g6n~ t ique . U n p r o b l 6 m e p a r t i -

c 101 oo '--O

~O

+ E D T A

io 2'0

- E D T A

lb 2'0 3'0 ~0 } e m p s mn

FIG. 1. - - Cin~t ique de lgse p a r la pdn ic i l l ine et e f f e t du t r a i t e m e n t par I 'EDTA. U ne cul ture d 'Escher i ch ia coli 3000, cul.tiv6e sur 63 glyc6rolO O, sur 63 glyc6ro] IPTG Z~ ..... Z~ ou u n m6lange & par t i es 6ga,les de ces deux cul tures e - • , ont 6t6 incubus en mi l ieu 63 con- t enan t de la p6nici l l ine 1 000 U / m l et du lactose 5 mM. Une pa r t i e des cul tures a dt6 soumise pr6ala- b l emen t h un t r a i t e m e n t ED,TA (16.). La lyse a 5t6 suivie pa r n~ph~lom6trie.

c u l l e r s ' e s t pos6 d a n s n o t r e cas d u f a i t que l ' o n s61ec t i onne c o n t r e u n c a r a c t ~ r e p h 6 n o t y p i q u e pas - sager , e a r le s u b s t r a t p r 6 s e n t p e n d a n t la s61ect ion 6 t a n t 6 g a l e m e n t i n d u c t e u r , ce c a r a c t 6 r e c h a n g e r a p i d e m e n t . Un p r 6 t r a i t e m e n t p a r I ' E D T A [16] r e n d la lyse p a r la p 6 n i c i l l i n e p l u s r a p i d e [17], de te l le s o r t e que les b a e t 6 r i e s a y a n t la p e r m 6 a s e l o r s de l ' a d d i t i o n de la p 6 n i c i l l i n e , l y s e n t 20 h 30 mi - n u t e s p lu s t6 t que les b a c t 6 r i e s d a n s l e s q u e l l e s l ' i n d u c t i o n de la p e r m 6 a s e d 6 b u t e "~ ce moment - l ' ~ ( f igure 1).

La m 6 m e m 6 t h o d e [18] n o u s a p e r m i s de m e t t r e en 6 v i d e n c e u n e d i s t r i b u t i o n i n 6 g a l e de la m61i- b io se p e r m 6 a s e c h e z u n m u t a n t L a c - p e r m 6 a s e n6- ga t i f ( c a r le m61ib iose est i n d u c t e u r p o u r tes d e u x s y s t 6 m e s L a c et Mel ) . La m61ib iose p e r m 6 a s e p r6 - s e n t e l ' a v a n t a g e s u p p l 6 m e n t a i r e , que sa s y n t h 6 s e es t s e n s i b l e a u x t e m p 6 r a t u r e s 61ev6es ; p a r cons6 - q u e n t , s i la lyse e n p 6 n i c i l l i n e - m 6 1 i b i o s e a l i eu 3,9 °, la p a r t i e de la p o p u l a t i o n qn i a p e r d u la p e r - m 6 a s e p a r e n t a l e n ' e s t p a s i n d u i t e d e n o v o et s u r v i t i n d 6 f i n i m e n t (fig. 2).

101

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GO

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' ;o io 20 20 I 'emps m n

FI6. 2. - - Sdgr~gat ion de la md l ib io se p e r m ~ a s e trois g~n~rat ions apr~s la dds induc t ion . E. coli 300 P a ~t~ eultivfi s~r 63 glye@ol mfilibiose B1 pendant 6 g6nfira- t ions, et lrans.f@~ sur mi l ieu 63 glye6rol B1 & 30 °. Des aliquo,tes pr61evges 0, l, 2, et 3 temps d.e g6n6rat ion plus ta rd ont gt~ somnises au 'uraitelnent ED.TA et t rans%r~es en mi l ieu 63 m~libiose pdniei l l ine & 39 °. La lyse a dt~ s.uivie pa r lecture, de la densitfi optique. Une cul ture s imi la i re non induit~e a ~t6 soumise au m~me traitemen.t .

D a n s le p r 6 s e n t a r t i c l e , n o u s n o u s p r o p o s o n s d ' e x a l n i n e r la g6n6ra l i t 6 du p h 6 n o m 6 n e de s6gr~- g a t i o n de d i v e r s m a r q u e u r s m e m b r a n a i r e s , t r o i s t e m p s de d o u b l e m e n t a p r 6 s l e u r d ~ s i n d u c t i o n .

BIOCHIMIE, 1 9 7 2 , 54, n ° 1.

M a r q u e u r s m e m b r a n a i r e s au cours du d d v e l o p p e m e n t d'E. coll. 95

MATt~RIEL ET MI~THODES.

Les souches bact6r iennes utilis6es d6rivent

toutes d'E. coil K 12 (Tableau I). Elles sont cul-

tiv6es en mil ieu 63 avec 4 g / l i t r e de glyc6rol et

2 m g / l de thiamine.

La culture en anadrobiose.

Elle s'est effectu6e sous barbotage d 'azote dans le mi l ieu snivant : NazHPO 4, 3,6 g ; KH2PO 4, 1 g ; MgSO 4 7 H20, 0,03 g ; FeSO 4, CaClz, t races ; HeO 1 000 ml. La source d 'azote est soit NOzK, soit

NH4C1 h 0,5 g/1.

T A B L E A U ~[.

Souehe Sexe Ph6notype Constitution g6n6tique Exigence

3 000

3 300

300 P

HFr

HFr

HFr

Lae +

Lae +

L a e -

i + z + y + a*

i- z + y+ a +

i + z + y - a +

B1

B 1

B1

Culture, induction et ddsinduclion.

Pendan t la p6r iode d ' induc t ion qui s '6tend sur au moins 6 temps de g6n6ration, la source de car- bone qui est ajout6e aux concent ra t ions sp6cifi6es dans le texte sert d ' induc teur au systbme de trans- por t examin6. Les bact6ries ainsi indui tes et en croissance exponentiel le , sont centrifug6es, lav6es et remises en cul ture dans du 63 glucose B1 ou occas ionnel lement dans du if3 glyc6rol B1. La croissance est suivie par n6ph61om6trie fi 600 nm et des al iquotes sont pr61ev6es apr6s 0, 1, 2 et 3 doublements de la densit6 opt ique (GO, G1, G2, G3).

Traitement EDTA.

Les aliquotes sont filtr6es sur mil l ipore , r inc6es au tampon Tris HCI 0,12 M pH 7,6 et resuspendues dans le m6me tampon dans un dixi~me du volume initial. On ajoute de I 'EDTA fi la concent ra t ion finale de 1 0 -8 M e t on agite v igoureusement pen- dant 1 minute h 3 7 ° .

Lgse.

Ensuite, l '6chant i l lon est dilu6 au moins dix fois dans du mil ieu 63 contenant de la p6nici l l ine 1 000 U / m l et le substrat de la perm6ase qui a pu 6tre indui te pendan t la pr6culture. La concentra- t ion de ce substrat est indiqu6e dans chaque sec- tion. Elle a 6t6 ajust6e de telle sorte qu 'el le puisse suppor ter une croissance suffisante pour que la p6nici l l ine p rovoque la lyse, mais pas t rop 61ev6e pour que la p6n6trat ion par diffusion dans les bac- t6ries d6pourvues de perm6ase soit mod6r6e. La densit6 de la cul ture est ajust6e au vois inage de D.O.~00 = 1 et la cul ture est incub6e h 37 ° soit dans un e r lenmeyer agit6 dont on pr616ve des 6chant i l lons pour suivre la densit6 optique, soit dans des tubes de cul ture /l parois plan-parall61es adaptables au spectrophotom6tre , que l 'on re t i re du bain pendan t des temps tr~s courts pour me- surer la densit6 optique.

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 1.

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73 G

G3

' 1'o ' io 3 ' o '

t e m p s mn Fie. 3. - - Sdgrdgation de la maltose permdase d'E.

coll. E. coli 3 000 curtly6 sur 63 glyc6rol maltose d6sin- duit sur 63 glucose. Pour d~tails, voir texCe et 16gende de la figure 2.

R1~SULTATS.

A - - Sdgrdgation de sgst~mes de transport con-

l l U 8 .

Le modble de s6gr6gation observ6 dans le cas de la Lac-perm6ase et de la Mel-perm6ase a 6t6 re- trouv6 pour la perm~ase ?t maltose [19] (WIEs- ~tEYER et COHN, 1960) (fig. 3). Pendan t l ' induct ion , le maltose a 6t6 ajout6 au mi l ieu 63 glyc6rol B1 h la concent ra t ion de 6 g/1 ; pendan t la phase de lyse par la p6nici l l ine, le maltose 6tait h la concentra- t ion de 5.10 -a M (1,7 g/ l) .

96 Francoise Autissier et Adam Kepes.

La perm6ase des acides dicarboxgtiques (KAY et KORNBERG, 1971) [20], (fig. 4) a 6t6 indui te par le succinate de Na ou par le mal6ate de Na (4 g/ l ) et la lyse a 6t6 effectu6e en pr6sence de succinate 1 0 -3 M .

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~ e m p s mn

Fla. 4. -- Sdgr@gatlon de la permdase d acide diearbo- xglique en C~. E. Coli 3 000 c~lti'v6 su.r 6.3 succinate d6sinduit sur 63 glucose. (Pour d6'tails voir texte et l~ge~de fig. 2).

La D-glucuronate perm6ase (ffIMENO et STOEBER) [21, 22] (figure 5) a 6t6 indui te par le g lucuronate de K 2' g/1 et la lyse a 6t6 effectu6e en pr6sence de g lucuronate & la m6me concentra t ion.

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~ e m p s mn

Fro. 5. - - S@gr@gation du glucuronate permdase. E. coli 3 0i{){) cu~tiv6 sur 63 gluconate d6sinduff sur 63 glu- cose. (Pour dgtails, voir texte et 16gende fig. 2).

Si le galacturonate est utilis6 au l ieu du glucu- ronate pendan t la p6riode de lyse, les r6sultats observ6s sont ident iques. Le galac turonate est connu comme source de carbone chez E. coli grace

un syst~me induct ib le et aussi comme un comp6- t i teur du glucuronate pour le syst6me de t ranspor t de ce dernier . La r6par t i t ion du galacturonate per- m6ase dans les descendants au cours de la d6sin- duct ion du glucuronate perm6ase permet d'affir- mer que les deux sucres sont substrats de la m~me perm6ase.

L'hexose 6 phosphate permdase [Fraenkel , 19.64] [23] capable de t r anspor te r le glucose-6P, le fruc- tose-6P et le mannose-6P (WINKLER, 1~966) [24] a 6t6 indui te pa r du glucose.@P 4 g/1 et la lyse a 6t6 effectu6e en pr6sence du mSme substrat h 2 g/1. Le mod61e de s6gr6gation est le mSme que pr6c6- demment (fig. 6).

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106

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' 1'0 ' 2'0 ' 3'0 ' 4'0 ' '

~emps mn

FIG. 6. -- Sdgrdgation de l'hexose 6-phosphate per- mdase. E. coli 3 000 culliv~ sur 63~ glucose-6-P dSsin- duit sur glucose. (Pour d~tai'ls, voir ~exte et 16gende fig. 2).

Pa rmi les syst6mes de t ranspor t d6crits il existe une classe bien d6finie dont le m6canisme biochi- mique a 6t6 identifi6, c 'est la classe des phospho- transf6rases. L ' enzyme cl6 de ces syst~mes, nora- m6 enzyme II, est fo r tement Ii6 & la membrane , et ex6cute la r6act ion suivante : Hpr ,~ P + hexose

Enz I I ( e x o g 6 n e ) - - - - ~ hexose-P (int.) + Hpr.

Hpr est une prot6ine de pet i t poids mol6culaire , susceptible d 'e t re phosphoryl6e sur un r6sidu his- t id ine pour donner P ~ Hpr, aux d6pens du phos- pho6nol pyruvate . Cette phosphory la t ion est cata-

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 1.

Marqueurs membrana i res au cours du ddve loppement d'E. coli.

lys6e p a r u n e n z y m e c y t o p l a s m i q u e d 6 s i g n 6 E n z y m e I. Chez E. col i , i l ex i s t e u n c e r t a i n n o m b r e d ' e n z y l n e s II a g i s s a n t en p a r t i c u l i e r s u r le g lucose , le f r u c t o s e , le m a n n o s e , le m a n n i t o l , etc... L e s t r o i s p r e m i e r s s o n t c o n s t i t u t i f s et n e p e u v e n t d o n c se r - v i r de m a r q u e u r s p o u r la s 6 g r 6 g a t i o n de la m e m - b r a n e . N o u s a v o n s v~r i f i6 q u ' e f f e c t i v e m e n t , la p r6 - c u l t - r e su r ces s u c r e s , s u i v i e de c u l t u r e s u r g lyc6-

97

r o l p e n d a n t t r o i s t e m p s de d o u b l e m e n t et d ' u n e i n c u b a t i o n avec la p 6 n i c i l l i n e h n o u v e a u e n p r6 - s e n c e du s u c r e << i n d u c t e u r >> d o n n e l i eu ~ u n e lyse r a p i d e e n u n e s eu l e 6 tape . P a r c o n t r e , la m 6 m e e x p 6 r i e n c e a v e c le m a n n i t o l u t i l i s6 '// 2 g/1 aus s i b i e n p e n d a n t la p h a s e de p r 6 i n d u c t i o n que p e n - d a n t la p h a s e de lyse d o n n e les r + s u l t a t s r e p r 6 s e n -

t6s su r la f igure 7.

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emps m n

Fro. 7. - - Sdgr~gation de l 'enzgme 11 de la phospho- transfdrase D-manni to l . E. coli 3 300 cultiv6 su.r 63 manu i to l d6s indui t sur 63 glucose. (Pour d6tails, voir textc et ldgeude fig. 2).

B - - S 4 g r @ a t i o n de s y s t ~ m e s de t r a n s p o r t in-

c o n I l H S .

L ' e n s e m b l e de ces r 6 s u l t a t s c o n c o r d a n t s n o u s a e n c o u r a g 6 h u t i l i s e r le t e s t de s 6 g r 6 g a t i o n a v e c u n e s6 r i e de c o m p o s 6 s c o n n u s c o m m e s o u r c e s de ca r - b o n e u t i l i s a b l e s p a r E. col i , m a i s d o n t le s y s t ~ m e de t r a n s p o r t n ' a pa s 6t6 6 tud i6 ou d 6 c r i t p r 6 a l a - b l e m e n t . Le t e s t p o u v a i t d ' a i l l e u r s n e p a s 6 t re r e l a t i f e x c l u s i v e m e n t h u n s y s t 6 m e de t r a n s p o r t , m a i s h u n c o m p o s a n t m e m b r a n a i r e q u e l c o n q u e , p o u r v u que sa s y n t h 6 s e ffit i n d u c t i b l e et que sa p r 6 s e n c e ffit le f a c t e u r l i m i t a n [ p o u r l ' u t i l i s a t i o n d u m 6 t a b o l i t e c o n s i d 6 r 6 . Les r 6 s u l t a t s de ce t t e p r o s p e c t i o n s o n t r 6 s u m 6 s dar ts le t a b l e a u II. On vo l t que des f a c t e u r s m e m b r a n a i r e s l i m i f a n t s p o u r l ' u t i l i s a t i o n d u t r 6 h a l o s e et d u g l u c o n a t e d i s p a - r a i s s e n t de la m o i t i 6 des d e s c e n d a n t s de t r o i s i 6 m e g 6 n 6 r a t i o n . P o u r le g lyc6ro l , les t r a v a u x de LIN et coll . [25] on t c o n c l u qu ' i l n ' y a v a i t p a s de t r a n s - p o r t ac t i f . On d e v a i t d o n c s ' a t t e n d r e ~ n e p a s t r o u - v e t de s 6 g r 6 g a t i o n de c o m p o s a n t s m e m b r a n a i r e s . P o u r le xy lose , le r i b o s e , l ' a r a b i n o s e , le c e l l o b i o s e et le p y r u v a t e , les c u l t u r e s i n d u i t e s ou n o n i n d u i t e s l y s e n t r a p i d e m e n t , d 'of i o n p e u t i n f 6 r e r que les c o m p o s a n t s i n d u c t i b l e s de l e u r s vo l e s m 6 t a b o - l i q u e s r e s p e c t i v e s y c o m p r i s l ' 6 v e n t u e l l e p e r m 6 a s e , s o n t i n d u i t s t r o p r a p i d e m e n t et d e v i e n n e n t v i l e n o n l i l n i t a n t s p o u r l e u r u t i l i s a t i o n . P o u r le D- lac - t a t e u n e s 6 g r 6 g a t i o n est o b s e r v 6 e a p r 6 s t r o i s g6n$- r a t i o n s de d 6 s i n d u c t i o n , m a i s le p l a t e a u e n t r e les d e u x p h a s e s de lyse est p e u m a r q u 6 . D a n s ce cas,

T A B L E A U I I .

Substrats utilis6s

D-xylose . . . . . . . . . . . . . . . . D - r i b o s e . . . . . . . . . . . . . . . . Cellobiose . . . . . . . . . . . . . . . Pyruvate de sodium . . . . . .

Glyedrol . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tr6halose . . . . . . . . . . . . . . . . D-glueonate de K . . . . . . . . D - l a c t a t e de Ca . . . . . . . . . .

D61ais de lyse

Non induits

prficoce I

tardif

tardif ))

semi-tardif

laduits

pr~coce

pr~coce

pr~coee

H6t6rog6n6it6 apr~s 3 g6nerations

de d6sinduction

+ +

interm~diaire

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98 Francoise Autissier et Adam Kepes.

i l p o u r r a i t s ' a g i r so i t d ' u n s y s t b m e de t r a n s p o r t , so i t de la d 6 s h y d r o g 6 n a s e qu i es t u n s y s t 6 m e com- p l e x e m e m b r a n a i r e c o m p r e n a n t f l a v o p r o t 6 i n e et c y t o c h r o m e B2, so i t des d e u x s y s t 6 m e s s i m u l t a - n 6 m e n t .

C - - S d g r ~ g a t i o n d ' u n e n z y m e d ' o x g d o r d d u c t i o n .

I1 6 ta i t i n t @ e s s a n t de t e s t e r u n m a r q u e u r m e m - b r a n a i r e c l a i r e m e n t d i s t i n c t des s y s t ~ m e s de t r a n s - p o r t . La n i t r a t e r 6 d u c t a s e A, i n d u c f i b l e en a n a 6 r o - b i 0 s e p a r le n i t r a t e et p e r m e t t a n t l ' u t i l i s a t i o n d u n i t r a t e c o m m e a c c e p t e u r d ' 61ec t ron a n a 6 r o b i e et c o m m e s o u r c e d ' a zo t e , s e m b l a i t a p p r o p r i 6 e c o m m e m a r q u e u r [26].

Ira l o c a l i s a t i o n m e m b r a n a i r e de ce t e n z y m e , c o n f o r m e ~ sa p a r t i c i p a t i o n d a n s la c h a i n e r e s p i - r a t o i r e , a 6t6 m o n t r 6 e in v i t ro s u r des p r 6 p a r a t i o n s de m e m b r a n e [27]. On sa i t d ' a u t r e p a r t que les m u t a n t s d 6 f i c i e n t s en n i t r a t e r 6 d u c t a s e a p p a r a i s - s e n t c o m m e c h l o r a t e - r 6 s i s t a n t s . E n effet, le ch lo - ra te , a n a l o g u e s t r u c t u r a l d u n i t r a t e , es t r 6 d u i t p a r l ' e n z y m e en c h l o r i t e t ox ique . Cet te p r o p r i 6 t 6 p e r - m e t de d i s p o s e r d ' u n p r o c 6 d 6 de s61ect ion a d d i - t i o n n e l c o m p l 6 m e n t a i r e h la m 6 t h o d e h la p 6 n i c i l - l i n e - n i t r a t e .

La n i t r a t e r 6 d u c t a s e a 6t6 i n d u i t e p a r c r o i s s a n c e e n a n a 6 r o b i o s e e n m i l i e u m i n 6 r a l g lucos6 a v e c du n i t r a t e c o m m e s o u r c e d ' azo te . La d 6 s i n d u c t i o n a

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Fit . 8. - - S@grdgation de la ni trate r@ductase chez E. coli cnltiv@ en anadrobiose. Les mi l i eux ut i l isds pour l ' indue t ion et la d~s:induetion son{ d6crits dans << Matdriel e t m6thodes >>. Les popula t ions ddsindui tes pendan t 0, 1, 2, 3 temps de doublement , ont 6t$ trai t~es par FEDTA et ineub~es darts le mi l ieu ana6ro.bie con- t enan t dn ehlm'ure d 'Ammo.nium eomme source d 'azote, du chlora te de po tass ium I mM et de la p6nicHline 1 000 U / m l .

6t6 e f fec tu6e d a n s le m 6 m e m i l i e u a v e c d u ch lo - Pure d ' a m m o n i u m c o m m e s o u r c e d ' a zo t e . Les p o p u l a t i o n s , a p r 6 s 0, 1, 2 et 3 t e m p s de d o u b l e - m e n t , o n t 6t6 s o u m i s e s aux d e u x t e s t s de lyse p a r la p 6 n i c i l l i n e , so i t en p r 6 s e n c e de n i t r a t e c o m m e seu le s o u r c e d ' a zo t e , so i t e n p r 6 s e n c e de c h l o r a t e et de c h l o r u r e d ' a m m o n i u m c o m m e s o u r c e d ' a zo t e . D a n s les d e u x c o n d i t i o n s , l ' h 6 t 6 r o g 6 n 6 i t 6 n ' a p p a - r a i t q u ' a p r 6 s t r o i s t e m p s de g 6 n 6 r a t i o n sous f o r m e d ' u n e f r a c t i o n p 6 n i c i l l i n e r 6 s i s t a n t e d a n s le p r e - m i e r test , sous f o r l n e d ' u n e f r a c t i o n p 6 n i e i l l i n e s e n s i b l e d a n s le s e c o n d (fig. 8).

101

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FIG. 8 his. - - Les m~mes po.pulations indu i tes et dds indui tes pou.r la n i t r a t e r4ductase, incub6es dans le mil ieu ana6robi.e avec du n i t r a t e comme source d 'azote et de la p6nici l l ine 1 000 U/ml .

DISCUSSION.

Ires r 6 s u l t a t s r a p p o r t 6 s d a n s le p r 6 s e n t a r t i c l e ne p e u v e n t g u 6 r e a v o i r q u ' u n e seu le i n t e r p r 6 t a t i o n c o h 6 r e n t e . L es m a r q u e u r s m e m b r a n a i r e s , i n c o r p o - r6s d a n s u n e m e m b r a n e p a r e n t a l e , se t r o u v e n t p a r la su i t e d i s t r i b u 6 s d a n s u n n o m b r e r e s t r e i n t de r 6 g i o n s m e m b r a n a i r e s p a r i n t e r c a l a t i o n d a n s la m e m b r a n e p a r e n t a l e d ' u n e ou d ' u n p e t i t n o m b r e de z o n e s de c r o i s s a n c e l o n g i t u d i n a l e s ou de z o n e s f o r m a t r i c e s de s e p t u m ; e t p a r c o n s 6 q u e n t , seu l s u n p e t i t n o m b r e de d e s c e n d a n t s , n o m b r e v o i s i n de q u a t r e dar t s t ous les e x e m p l e s ic i 6 n u m 6 r 6 s , p e u v e n t h 6 r i t e r de la m e m b r a n e p a r e n t a l e .

N o u s ne d i s c u t e r o n s p a s ic i des d i f f 6 r e n t s mod61es de c r o i s s a n c e p o s s i b l e s et c o m p a t i b l e s a v e c ces r6su l t a t s , n i de la l o c a l i s a t i o n e x a c t e de

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Marqueurs m e m b r a n a i r e s au cours du d~ve loppement d'E. coll.

la zone de croissance qui n6cessite l 'emploi de m6thodes morphologiques, ni de la variabi l i t6 de la g6om6trie des zones de croissanee avec les souches et les condi t ions de cul ture que nous avons pu constater dans quelques cas part icul iers .

Nous nous proposons de cent rer la pr6sente dis- cussion sur l 'emploi de la s6gr6gation des mar- queurs membrana i re s en tant que m6thode pour la solution d 'autres probl~mes que la croissance de la membrane .

D~tection de marqueurs membranaires incon- n t i S .

C'est ainsi que la m6thode peut servir ~ ident i- fier de nouveaux marqueurs membrana i re s ou d'61iminer des marqueurs hypoth6tiques.

Deux marqueurs jusqne lS non d6crits ont pu 6tre identifi6s, induct ib les par le tr6halose et le gluconate respect ivement et faisant par t ie selon toute probabil i t6 de syst6mes de t ransport .

I1 est tr~s difficile d ' ident i f ier u n syst6me de t ransport , si on ne dispose pas soit de mutants ineapables de m6taboliser un substrat, soit d 'un analogue de substrat non m6tabolisable de pr6f6- rence marqu6 isotopiquement. Les mutants d6fi- cients pour le t ranspor t sont dans ces cas le seul reeours, ~ condi t ion qu 'on puisse d6montrer qu' i ls poss6dent tout l '6quipement en enzymes m6tabo- liques.

Le fait remarquable au cours de la s6gr6gation d 'un marqueur membrana i r e est la d is t r ibut ion 6galitaire des enzymes solubles indui t s dans les m~nles condi t ions. Les s6gr6gants sont donc des imita t ions ph6notypiques d 'un mutan t d6ficient en marqueur membrana i re . I1 est doric possible que des t ranspor ts effectu6s par des enzymes m6tabo- liques comme la phosphotransf6rase ou d 'autres dont l ' a t tachement ~ la membrane a pu 6chapper l 'observat ion du fait d 'art6facts de p r6para t ion (voir l 'exemple PRPP transf6rase, STADTMANN) [28] soient d6tect6s comme marqueurs membrana i res par la m6thode de s6gr6gation.

Syst~mes de transport passif.

La totalit6 des syst~mes de t ranspor t actuelle- ment connus effectuent un t ranspor t actif contre un gradient de concen t ra t ion ou un t ranspor t phosphorylat i f . S'il existe des syst6mes de trans- port s implement 6quil ibrants , leur d6tection par les m~thodes classiques est encore plus al6atoire, et le cas du glyc6rol en est une i l lustrat ion. I1 a pu 6tre montr6 sans ambiguit6 que le glyc6rol n '~tait pas t ransport6 activement, mais un doute restait exprim6 sur l 'exis tence possible d 'un t ranspor t

99

6qui l ibrant [29]. Nos r6sultats permet tent d'ex- clure qu 'un syst6me m~me 6qui l ib ran t soit un fac- teur l imi tan t pour la p6n6tra t ion du glyc6rol.

Syst~mes de transport multienzgmatiques et l'dtat physique des prot~ines p~riplasmiqnes.

Une men t ion par t icul i6re doit 6tre faite pour les syst6mes de t ranspor t ayant des composants pro- t6iques non membrana i res . Dans le cas de sys- t6mes de phosphotransf6rase les deux const i tuants prot6iques non membrana i re s Hpr et enzyme I sont constitutifs. I1 est donc clair que le consti- tuan t l imi tant pour ru t i l i sa t ion du substrat, dans le cas du manni to l , est l ' enzyme II membrana i re .

La s i tuat ion est moins claire dans le cas de sys- t6mes de t ranspor t met tant en oeuvre une prot6ine p6r iplasmique ayant une haute affinit6 pour le substrat. Ces prot6ines p6riplasmiques sont induc- tibles darts le cas du galactose comme darts le cas de l 'arabinose. Ce sont des prot6ines parfa i tement hydrosolubles quand elles sont lib6r6es par le choc selon NEU et HEPPEL [30], mats leur 6tat in vivo dans l 'hypoth6t ique espace p6r iplasmique et en par t icu l ie r leur degr6 de mobili t6 d 'une r6gion de la bact6rie vers l 'autre est inconnu . II est possible que leur mobili t6 soit faible comme on peut en inf6rer par l 'observat ion que plusieurs enzymes p6riplasmiques sont plus abondants dans la r6gion des p61es [317. II est 6galement possible que ces prot6ines soient diffusibles le long de la bact6rie dans l 'espace p6riplasmique. Darts ce cas, la s6gr6- gation ne devrait pas 6tre observ6e, ~ moths qu 'un autre const i tuant , membrana i re , soit le facteur l imi tant du syst~me de t ransport . Dans tous les systbmes de t ranspor t de cette classe il semble exister d 'autres const i tuants essentiels mis en 6vi- dence par des techniques g6n6tiques, mats la nature, le r61e et la localisat ion de ces autres cons- t i tuants n 'on t pas encore 6t6 61ucid6s. I1 semble cependan t difficile de supposer qu 'un au moins des const i tuants d 'un syst~me de t ranspor t ne soit i n t imement li6 ~ la membrane . Or, clans le cas de l 'arabinose, la cin6tique d ' induc t ion du t ranspor t pr6sente une par t icular i t6 : elle est tr6s rapide au d6but et at teint une activit6 sp6cifique maximale en moths d 'une g6n6ration. Ceci pourra i t 6tre interpr6t6 par l 'exis tence d 'un composant consti- tut if autre que la prot6ine p6riplasmique, cette derni6re 6tant induct ib le serait facteur l imi tant du t ranspor t pendan t les toutes premibres minutes de l ' induc t ion , mats darts une seconde phase le com- posant const i tut if deviendra i t l imitant . Cette inter- pr6tat ion expl iquerai t h e l l e seule l 'absence de s6gr6gation darts nos exp6riences. Celle-ci pour ra i t 6tre due aussi bien A la diffusion de la prot6ine

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100 Fran9oise Autissier et Adam Kepes.

p ~ r i p l a s m i q u e qu 'f i sa s u r a b o n d a n c e p a r r a p p o r t au c o m p o s a n t m e m b r a n a i r e t r~s t 6 t a p r ~ s le d ~ b u t de l ' i n d u c t i o n qu i a l i eu p e n d a n t la p h a s e de t r a i - t e m e n t fi la p ~ n i c i l l i n e .

P a r c o n t r e , d a n s le cas d u m a l t o s e off u n e p r o - t ~ i n e p ~ r i p l a s m i q u e v i e n t d ' e t r e d ~ c o u v e r t e [35] et d a n s le c a s d u g a l a c t o s e o n n e s a l t r i e n de s c o m p o s a n t s d u s y s t ~ m e de t r a n s p o r t a u t r e s que la p r o t ~ i n e p 6 r i p l a s m i q u e . D a n s la m e s u r e off la s ~ g r ~ g a t i o n es t o b s e r v ~ e o n p e u t d o n c s 6 1 e c t i o n n e r les s ~ g r d g a n t s n ~ g a t i f s e t on p o u r r a i t d ~ t e r m i n e r l e u r t e n e u r e n p r o t ~ i n e s p ~ r i p l a s m i q u e s . S ' i l s e n s o n t d ~ p o u r v u s c ' e s t que ce t t e p r o t ~ i n e n ' a p a s de l i b e r t ~ de d i f f u s i o n in sitm S ' i l s la c o n t i e n n e n t a u m ~ i n e t a u x que la p o p u l a t i o n a v a n t la lyse , c ' e s t que le c o n s t i t u a n t i n c o n n u es t m e m b r a n a i r e et i n d u c t i b l e . D a n s la m ~ m e h y p o t h ~ s e u n r e n s e i g n e - m e n t a n a l o g u e p e u t ~t re o b t e n u s u r le c o n s t i t u a n t n o n iden t i f i~ d u s y s t ~ m e de c h i m i o t a x i e ~34j.

Renouvel lement des consti tuants membranaires.

U n a u t r e e m p l o i de la s ~ g r ~ g a t i o n des m a r - q u e u r s m e m b r a n a i r e s c o m m e m 6 t h o d e d ' a p p r o c h e d ' a u t r e s p r o b l b m e s a v u le j o u r au c o u r s d ' exp~- r i e n c e s de m a r q u a g e i s o t o p i q u e de s p h o s p h o l i - p i d e s (sous p r e s s e ) . U t i l i s a u t u n d o u b l e m a r q u a g e p a r ZH o l6a te e t p a r z~p n o u s a v o n s c o n s t a t 6 q u e l ' i s o t o p e zzP s u i v a i t le m a r q u e u r s61eetif , l a p e r - iu6ase au c o u r s de la s 6 g r 6 g a t i o n , a l o r s que l ' a c i d e o l6 ique m a r q u 6 s ' e s t r 6 p a r t i u n i f o r m 6 m e n t e n t r e les d e s c e n d a n t s . On p e u t d 6 d u i r e q u ' i l ex i s t e u n r e n o u v e l l e m e n t des a c i d e s g r a s s u r le s q u e l e t t e gly- c 6 r o p h o s p h a t e des p h o s p h o l i p i d e s i n t 6 g r 6 s d a n s la m e m b r a n e , p r o b a b l e m e n t p a r d 6 s a c y l a t i o n - r 6 a c y - l a t i on , c e t t e r 6 a c t i o n 6 t a i t c o n t r o v e r s 6 e s u r la b a s e d ' e x p 6 r i e n c e s ou des a c i d e s g r a s c h i m i q u e m e n t m o d i f i 6 s ( rami f i6s ) o n t s e r v i de m a r q u e u r , c a r i l s p e r m e t t a i e n t u n e s 6 p a r a t i o n c h r o m a t o g r a p h i q u e u l t 6 r i e u r e des p h o s p h o l i p i d e s . V r a i s e m b l a b l e m e n t , les a c i d e s g r a s r a m i f i 6 s s o n t de m a u v a i s s u b s t r a t s p o u r la d 6 s a c y l a t i o n et la r 6 a c y l a t i o n . D a n s n o t r e e x p 6 r i e n c e , a v e c u n s i m p l e m a r q u a g e i s o t o p i q u e , la s ~ p a r a t i o n p h y s i q u e des p h o s p h o l i p i d e s p a r e n - t a u x 6 ta i t f a i t e g r h c e au m a r q u e u r s~lect i f , l a p e r - m6ase , p a r les b a c t 6 r i e s e l l e s -m6mes , ce q u ' u n ch i - m i s t e n ' a u r a i t p a s p u fa i re .

E n c o n c l u s i o n , la m 6 t h o d e de s ~ g r 6 g a t i o n p e r - m e t de r e c h e r c h e r et d ' ~ t a b l i r l ' e x i s t e n c e de c o n s - t i t u a n t s m e m b r a n a i r e s s u p p o s e s , de r e c h e r c h e r et d 6 m o n t r e r la l o c a l i s a t i o n m e m b r a n a i r e de sys- t 6 m e s r e c o n n u s p a r l e u r s f o n c t i o n s , d ' a n a l y s e r des s y s t b m e s a y a n t des c o m p o s a n t s m e m b r a n a i r e s et n o n m e m b r a n a i r e s et de s u i v r e la s t a b i l i t 6 topo- g r a p h i q u e ou la s t a b i l i t 6 m 6 t a b o l i q u e de c o n s t i -

t u a n t s m e m b r a n a i r e s ou a y a n t des r a p p o r t s de voi - s i n a g e avec ]a m e m b r a n e .

Remerciements.

Ce t rava i l a bSn~fici~ de l ' a ide de la Ddl~gation G~nS- ra le ~t la Recherche Seientifique e~ Technique, et du Commissar i 'a t h l 'Energie Atomique.

P e n d a n t ce t t ava i l , Mademoisel le Fran~oise AUTISSlEn a b6n6fici6 d 'une bourse de la Fonda t i6n pour la Re- cherche M~dicale Frangaise.

R~.su~.

Grfice h une technique de lyse h la p~nicil l ine, on peut d~'tecter dans une popu la t ion bac t~r ienne une h~t~rog6n~it~ re la t ive h u n m a r q u e u r m e m b r a n a l r e inductible, pa r exemple un syst~me de t r anspor t .

La m~thode a ~t~ employde pour d~mont~er qu 'apr~s induct ion comp.l~te d 'une perm~ase dans une popula- t ion, au cours de la d~sinduction, il appara l t une h~t~- rog~n6K~ apr~s t rois temps de g~n~ration. L'h~t~ro- g~n~it5 est due h l 'exis tence de zones de crois.sance m e m b r a n a i r e s a l t e r n a n t avec des zones de repos de telle sorte que ]a m e m b r a n e paren~tale est f ragment~e en un n.ombrc ]imit~ de r~gions qui son.t t r a n s m i s fi un n o m b r e l imitd de descendants , qua t re dans nos condi- t ions de culture.

Dans le present art icle, la m~thode est employSe pour d~tecter la s~gr6gation d 'un grand hombre de mar- queurs m e m b r a n a i r e s inductibles , des perm~ases, con- nues, une phospho t rans f~rase : l ' enzyme I I du D-man- nitol, une oxydor~ductase, Ia n i t ra te - r~duc tase anadro- bie, et quelques m a r q u e u r s incernnus, l~robablement des syst~mes de t ranspor t , induc t ib les pa r le g luconate e¢ par le ' tr~halose et ind ispensables pour leur u t i l i sa t ion .

Darts la discussion, l ' emploi possible de la s~gr~ga- t ion comine m6thode pour aborder d ' au t re s probl~mes es~t pass~ en revue.

ZUSAMMENFASSUNG.

Dank eider Lyse technik mi t Pen ic i l l in k a n n man in einer Bak te r i enpopu la t ion eine Heterogenit~it gegeniiber e inem in die Membran induz ie rba ren Markiere.r wie zum Beispiel ein Transportsys: tem, fests tel len.

Diese Methode wurde verwe~det, u m zu zeigen, dass naeh e iner vollstf indigen Induk t ion e iner Pe rmease in einer Popu la t ion eine Heterogenit~it nach drei Gene- r a t ionen auf t r i t t . Dicse Heterogenit~it ist der Exis tenz yon Wachs iumszonen in der Membran zt~zuschreiben, die mi t den Ruhezonen ab~vechseln, so dass die urspr i ingl iche Membran in eine begrenzte Anzah l von Gebieten zersti iekelt wird, die e iner gegrenzten Anzahl yon Nachkommen vere rb t werden, vier im Fal le unse re r Bak te r i enku l tu r .

In dem vor l iegenden Art ikel wi rd diese Methode angewandt , um die Aufspa l tung e ther grossen Anzahl von in die Membran i nduz i e rba ren Markierern , den b e k a n n t e n Permeasen, e iner Phospho t r ans f e r a se (des Enzymes II des D-Mannitols) e iner Oxydoxeduktase, der anaerober~ Ni t ra t -Reduktase , und einigen u n b e k a n n t e n Markierern , wahrsche in l i ch Transpor t sys temen , die durch das Glukonat bzw. die Treha]ose induz ie r t wer- den, zu entdecken.

BIOCH1MIE, 1972, 54, n ° 1.

Marqueurs membranaires au cours du ddveloppement d'E. coli. 101

In d e r D i s k u s s i o n w i r d die m T g l i e h e V e r w e n d u n g d i e s e r Methode , u m a n a n d e r e P r o b l e m e h e r a n z u t r e t e n gepr i i f t .

R E F E R E N C E S .

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