prrsv tra diagnosi e vaccinazione quale la perfetta sequenza...• novembre 2010 un caso di prrs...

PRRStradiagnosievaccinazione:qualelasequenzavincente?

MicheleDrigo

UniversitàdegliStudidiPadova

Dipar5mentodiMedicinaAnimale,ProduzionieSalute

Non-structural proteins Structural proteins

1a1b

23

45

67

GP2 & 2b GP4 M

GP5GP3 N

Ivirus:PRRSV-1&PRRSV-2

•  PRRSV-1:PaesiBassi,Lelystadvirus(Wensvoortetal.1991)

•  PRRSV-2:USA,VR-2332(Collinsetal.1992)•  EnvelopedssRNAvirus•  Mininidoviridaefamiglia

–  Betaminidovirusgenere

•  Specie:betaminidovirussuid1(PRRSV-1)

•  Species:betaminidovirussuid2(PRRSV-2)

(n=12)

(ca.80%delgenoma)

Mininidoviridae(Arteriviridae)tassonomia

In2012 In2016

Qualeilprossimo?

Faabergetal.2012,FamilyArteriviridae. Kuhnetal.ArchVirol.161,2016

11simianarterivirusaltamentedivergen5indiversiprima5Africani;1nuovoarterivirusnelAfricanforestgiantpouchedrat,1nuovoarterivirusnelbrushtails(possum)comuneinNewZealand

0.03

PRRSV-2

PRRSV-1

PRRSV-1 and PRRSV-2 sono due specie virali diverse che causano una malattia - PRRS

DendrogrammadaJuanAbrahante,UniversityofMinnesota.

>50%

PerchèilsequenziamentoèuElenellostudiareilvirusdellaPRRS?

•  IlgenomadiPRRSVèaltamentepredispostoamutare•  La sequenza dell’acido nucleico (l’ordine dei nucleo5di) diogni s5pite virale è unica (quindi la sequenza è comeun’improntadigitale!)

•  DiscriminaretralespeciediPRRSV(geno5pi)èfaciletramitePCR(ilorogenidifferisconodel40-50%!!)

•  Madiscriminaretras5pi5richiedeilsequenziamento

1 aggctggtaacttac 3 tcacgctggtaacttac 4 caggctggtatctt 5 agagt---aacttac =

DNAsequenziamentoeanalisi

EstrazioneRNA CorsadiPCRCampione

Sangue(manonsolo)

Amplifica5messinelSequenziatore

1 aggctggtaacttac 3 tcacgctggtaacttac 4 caggctggtatctt 5 agagt---aacttac vac1

vac2vac33

41

257

8910

111213

1714

1516

Ada>atodaM.P.Murtaugh

Cos’èlafilogenesi?

L’obiegvo del la filogenesi ( ingenerale) è quello di cogliere lerelazionievolu5vetraspeciediverse!(coglierelerelazionitras.pi.viralinelnostrocaso!)

•  Laricostruzionediunalberofilogene5co(cioè lerelazioni)èuna PROCEDURA di STIMA in cui la storia evolu5va vienefahasullabasediINFORMAZIONIINCOMPLETE

•  Cagvaqualitàdellesequenze,oimpropriaselezionedelsetdireferenzapossonoportareaconclusionierrate

ATTENZIONE:moltospessolastoriaevoluEvadiPRRSVèricostruitasullabasedisequenzanucleoEdichediunafrazionemoltopiccoladelgenomaintero!![menodi1000nucleoEdi(ORF5+ORF7)su15000(interogenoma)]

Non-structural proteins Structural proteins

1a1b

23

45

67

GP2 & 2b GP4 M

GP5GP3 N

Phylogenetic analysis of ORF5 and ORF7 sequences ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)

from PRRS-positive Italian farms: A showcase for PRRSVepidemiology and its consequences on farm management§

Patrizia Pesente a,*, Valeria Rebonato b, Gianpietro Sandri c,Davide Giovanardi a, Luigi Sperati Ruffoni a, Sandra Torriani b

a Laboratorio Tre Valli, Corte Pellegrina, San Martino Buon Albergo, 37036 Verona, Italyb Dipartimento Scientifico e Tecnologico, Universita degli Studi di Verona, Strada Le Grazie 15, 37134 Verona, Italy

c Montorsi Francesco & Figli S.p.A., Magreta di Formigine, 41010 Modena, Italy

Received 28 June 2005; received in revised form 10 November 2005; accepted 15 November 2005

Abstract

We investigated the dynamics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) variability in a range ofswine PRRS-positive farms located in Northern Italy, to provide insights into the epidemiology and diffusion of the virus,particularly throughout the entire swine production chain. In this context, we also examined the effectiveness and the criticalpoints of a recently developed gilts acclimatization program in swine breeder farms. To achieve these aims, we designed newprimers and determined 64 complete open reading frame 5 (ORF5) sequences, representing Italian PRRSV field strains and theEuropean vaccine Porcilis strain (Intervet); in addition, the more conserved ORF7 of 11 PRRSV strains were sequenced. Thedomains’ prediction of their putative protein sequences was performed as well. Based on these sequences, phylogenetic treeswere inferred which revealed a high degree of variability among the PRRSV Italian strains. The outcomes of the phylogeneticanalysis showed that the most frequent source of infection in PRRS-positive farms (sow herds, nursery sites, fattening units) wasthe introduction of animals carrying a new variant and not the modification of already present variants; moreover, the integrationof data from phylogenetic analysis and from the clinical and serological status of the swine herds suggested that theacclimatization program could be a valid tool to stabilize the PRRS clinical picture in farms, only when applied in combinationwith rigorous bio-security routine management and avoid the incoming of new PRRSV variants.# 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

Keywords: PRRSV; ORF’s PCR; Epidemiology; Acclimatization strategies

www.elsevier.com/locate/vetmicVeterinary Microbiology 114 (2006) 214–224

§ GenBank accession no. of sequences reported in this paper are: AY730551, AY739958–AY740012, AY743931–AY743937, AY749417–

AY749428.

* Corresponding author. Tel.: +39 045 8794319; fax: +39 045 8794329.

E-mail address: patrizia.pesente@aia-spa.it (P. Pesente).

0378-1135/$ – see front matter # 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

doi:10.1016/j.vetmic.2005.11.061

Filogenesi=strumentoepidemiologicoedimanagement (valutazionedellabiosicurezza)

ORF5tree ORF7tree

La5pizzazionegene5cadeiPRRSVèunostrumentomoltoimportantepertracciare

epidemiologicamente(raggruppare)ivirusdellaPRRS

ma…

ilnumerodisequenzedisponibiliinEuropaèlimitato

cosi…

iden5ficarelefon5diunos5pitediPRRSVèspessononpossibile!

Alcuneesperienzeitalianealivelloglobaleelocale….

DueCladesprincipalibendisEnE!

ORF7ORF5

CladeA

CladeBsubtypeII

subtypeI

Drigoetal,2014,JVirolMethods,(97sequenze)+

SequenzedaGenBank(Forsberg-2002;Pesente-2006;Stadejek-2008;Toplak-2012)

Inter-clade(12%)Intra-clade(8,3%/4,1%)

Inter-clade(15,3%)Intra-clade(12,4%/8,8%)

CosacomportaunaampiavariabilitàgeneEca?

1) Differen5 dinamiche delle diverse popolazioni virali nel tempo e nellospazio

2) Possibiliripercussionisuperformancesdiagnos5che(PCR)-“mismatches”

3) Possibiliripercussionisulrapportovirus-ospite

CosacomportanoDUEClade?

1)  Differentedinamicadipopolazioneviralenel

tempoperorigine,trend,evoluzione

2)PossibiliripercussionisuperformancesdiagnosEche(PCR)–“mismatches”

EndpointRT-PCRprimers

ProbesEU1/EU2

qRT-PCRprimers

CladeA

Drigoetal,2014,JVirolMethods

3/62(-)

5/62(-)

EndpointRT-PCRprimers

ProbesEU1/EU2qRT-PCR

primers

NecessitàdiaggiornamentoprobesperlaCladeB(inrossolesequenzedicampionifalsamentenega5viallametodicaconprobe;inbluquellefalsamentenega5veadunKITcommercialesempreconProbe)

CladeB

Drigoetal,2014,JVirolMethods

22/31(-)

1/31(-)

Allevamento dello stesso

proprietario

PRRSV-1

Aborto Italiane

Allevamento

PRRSV-2 Albero filogenetico ORF7

24gruppidiscrofehe(7kg), acclimatate conesposizione naturale,m o n i t o r a g g i olongitudinale e cross-sec5onal dello s5pitec i r c o l a n t e e s u adivers ificazione neltempo;Un episodio di PRRSreproduc5ve!

<1%in24mesi

StudioalivelloLOCALE…

>8%

S5pi5diPRRSV-1possonoricombinareS5pi5diPRRSV-2possonoricombinare

LaricombinazionetraPRRSV-1ePRRSV-2

nonèmaistataevidenziata

Laricombinazionetradues5pi5èpossibilesoloseinfehanocontemporaneamenteunacellulaospiteallo

stessotempo(coinfezione)

LaricombinazionegeneEcaaumentaladiversitàgeneEcadiPRRSV?

‘’6delle66sequenzeconcatenate(ORF5+ORF7)eranoricombinan.”‘’Lalimitatadiffusionespaziotemporaledeglis.pi.ricombinan.deponeafavorediunalimitatafitnessdeiricombinan.rispeIoaglis.pi.parentaliequindianchediunruoloepidemiologicomarginalediquestofenomeno”

StudioalivelloGLOBALE…

•  Allevamentofrancesechestavaseguendounprogrammadistabilizzazione,primausandoUNISTRAIN(HIPRA)epoiconPorcilisPRRS(MSD)

•  Allafinedel2013unabandadi500suinegèstatavaccinatapersbaglioconentrambiivacciniapochesegmanedidistanza.

•  Los5pitePRRS-FR-2014-56-11-1fuisolatodalsierodisuinegsaniraccoltonel2014•  3even5diricombinazionesonosta5evidenzia5traUNISTRAIN(parentemaggiore)eilPorcilis

PRRS(parenteminore)inORF1

•  Nessunsegnoclinicoosservatoinallevamento!

LecaranerisEchegeneEchediunosEpitedeterminanolasuapatogenicità?

ApparentementeSI…

Bor,Bielorussia

Ili,Russia

18794,Denmark

SU-1BelLena

ORF5albero

Los5piteBielorussoPRRSV-1BOR59(group3)erasignifica5vamentepiùpatogenodialtris5pi5impiega5nell’esperimentoLos5piteRussoPRRSV-1ILI6(group2)appenapiùpatogenodellos5pitedanese18794(group1)

[cortesiadiStadejeck]

LarispostaèSI,manonsappiamoesanamentedoveguardare!

NonsonostaEancoraidenEficaEiMarkerdi

Virulenza!

…epoiPRRSVnonagiscedasolo…

LecaranerisEchegeneEchediunosEpitedeterminanolasuapatogenicità?

•  Novembre2010uncasodiPRRSmoltograve(severe)avvenutoinciclochiusodelloJutland(DK)

•  Mortalitàpre-svezzamentofinoal50%•  Finoal.70%dife5mummifica5•  Campionisonorisulta5posi5viperPRRSV-2,enega5viperPCV2,

PPV,leptospira

•  Leperditetotaliperladuratadel’episodiodi15segmanesonostatedel30%

•  Leperditemedieinsalapartodel9.3%

•  E’entratounnuovosEpitealtamentepatogenoinDanimarca??

Infezionesperimentale

•  Los5pitediPRRSV-2isolatodalcasoclinicoeramoltosimileaglialtris5pi5danesi

–  ‘’IngelvacPRRSMLVrelated”

•  LosEpitediPRRSV-2isolatodalcasoclinicohafallito nell’indurre segni clinici, lesionipatologicheealElivellidiviremia

QUINDI:

•  Lagravitàclinicaincampodeveessere stata causata da altrifanori rispeno o in aggiunta aPRRSV

•  I segni clinici in campo, nonsonosempreaffidabiliindicatoridellavirulenzadiPRRSV!

•  Suinegdi4segmanenega5vidapatogenispecifici(Mhyo,PRRSV,App1,2,3,4,5,6,7,9,10)

•  VaccinazioneconIngelvacPRRSMLVechallengeconl’isolatodalcasoclinicodelloJutland

PerchèeComefarediagnosidiPRRS?

•  PerdiagnosEcarelaformaclinica(riproduqvaorespiratoria)– RilievotramitePCRdiPRRSVinfe5,polmoni

•  PerdiagnosEcarelaformasub-clinica(performanceridone)– RilievotramitePCRdiPRRSVealtrifahoriingruppichestannoperformandomale

– RilievodellasieroconversionetramiteELISAingruppichestannoperformandomale

PerchèeComefarediagnosidiPRRS?

•  Perpianificareemonitorareglieffeqdiprogrammidicontrollo– PCRperilrilievodiPRRSVinsuinegsvezza5duranteilprogrammadistabilizzazione

– ELISAperconfermarel’esposizionedellescrofehe(neiprotocollidiacclimatamento)

– DNAsequenziamentoperiden5ficarecambiamen5neglis5pi5circolan5

ConsiderazionisuiMetodidiagnos5ci•  Laselezionedel(i)metodo(i),edelcampionamento

dipendedall’obieqvofinale.•  Piùambiziosoèl’obieqvo,piùcomplessoilprotocollo

diagnosEcodeveessere–  SuinoInfehoononinfeho?–  PerchèilprogrammadicontrollodellaPRRSnonfunziona?

•  SensibilitàoSpecificità?–  NONsipossonomassimizzareentrambe,sipuòsoloogmizzarle–  Quale/cosasacrificare?

•  Nessunmetodoèperfeno,quindimegliosesierologia,PCResequenziamentovengonocombinaEinmodosistemaEcoemanieralogica.

ELISA

PRO•  Elevatorendimento•  Veloce•  Pococostosa•  Abbastanzafaciledaeseguire•  AmpiaspecificitàperdiversevarianE

CONTRO•  Ritardodirilievodell’infezione•  Confermadiesposizione(odi

immunitàpassiva),nondistatodiinfezioneedistatoimmunitario

•  U5leperdiagnosidipopolazionenonperdiagnosisusingolo

•  Dovrebbecontenereentrambiigeno5piperunasensibilitàogmale

•  LadiscriminazionedeigenoEpièdifficile

•  PossibileproblemadisingolifalsiposiEvi(scrofe!-IDEXXX3100%Sp!)

(RT-)PCRPRO•  Permehediindividuaresingoliinfeg•  DiscriminaPRRSV-1daPRRSV-2•  Campionidipopolazionepossono

essereesegui5inpool(conminimaperditadisensibilità)

•  Puòessereimpiegatasuunampiorangedimatrici,inclusiifluidioralieilseme

CONTRO•  Inclineallacross-contaminazione•  LaSensibilitàèinfluenzatadalla

variabilitàgene5ca•  LaSpecificitàèinfluenzatada

reagen5esonde(‘’lateraisers”)…importanzadelCtvalue…

•  20s5pi5,differen5diluizioni•  Type1,sonoEpi2,3,4•  Type2,inclusiHP-PRRS•  8KitcommercialiReal-TimePCR

•  Ikithannotrovatodal50al95%deicampioni•  Solo3kits(I,VIIandVIII)hannotrovatotuq

glisEpiEdiPRRSV•  IlkitIIInonhatrovatonessunodeglisEpiE

sonoEpo3

QUINDI:molBdeikitdisponibiliincommerciodirealBmeRT-PCRnonsonoingradodirinvenireiso>oBpi

esteuropeidiPRRSVType1[PRRSSymposium,Gent2015]

EvoluzionePRRSVediagnosEca:

1.  NonesisteunaPCRchevadabenepertugisoho5piealcunimetodirisentonoanchedell’influenzadelClade!Quindiinsituazionipar5colari,accoppiarepiùtest!

2.  Diagnos5cabiomolecolarevacon5nuamentesaggiatae

aggiornata!(ringtesteconfrontoinsilicoconsequenze).

3.  Necessitàdisequenziaredipiùeancheporzionidiverseda

ORF5eORF7,condividendoleinformazioni!

Riassumendoalcuniconceg(1)

•  IvirusdellaPRRSsonoviruscon5nuamenteerapidamenteevolu5vi

•  L’emergenza locale di varian5 diverse diPRRSV sono molto più probabili comeintroduzionidaaltrove indicatoridibio(in)sicurezza– Movimentazione di suini, camion, persone, vaccinivivimodifica5…

Riassumendoalcuniconceg(2)•  LacomplessanaturadellaPRRSrichiedeprotocollidiagnos5ci solidi e strumenE propriamentevalidaEma allo stesso tempo anche strategie dicontrollocomplesseebasatesulleevidenze[IDEXXX3ELISArimaneilgoldstandardperla diagnosisierologicaeilmonitoraggiodelleaziendesuinicole]

•  L’analisigeneEcanonpermenedipredirrelavirulenzadiunosEpitediPRRSVol’efficaciavaccinale ma è un essenziale strumento dimonitoraggio della biosicurezza e di tracingepidemiologico!

Relaxnow…