plate-forme de cytogénétique moléculaire végétale (axe bio ... · virginie huteau et olivier...

Virginie HUTEAU et Olivier CORITON

UMR 1349 IGEPP INRA – LE RHEUolivier.coriton@inra.fr

Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale (Axe Bio -imagerie)

� Offre actuelle,

� Contour de la PF,

� Projets développés

Cytogénétique Moléculaire ?

Qu’est ce que la Cytogénétique Moléculaire ?

L’outil principal est l’Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur préparation chromosomique permet une :

« Analyse fine de la structure des chromosomes »

«Biologie moléculaire » et «Cytogénétique traditionnelle»

née de la rencontre

FISH

Les outils de cytogénétique moléculaire permettent de développer des projets scientifiques d’études des génomes pour : :

5 Mb

1 kb

FISH

• Caractérisation cytogénétique du matériel végétal impliquant des hybrides interspécifiques ou des espèces polyploïdes : identification respectivement des introgressions ou chromosomes parentaux,

• Evolution structurale des génomes chez des espèces polyploïdes,

• Caractérisation des translocations chromosomiques par liaison entre la cartographie génétique et physique,

• Cartographie physique fine sur chromosomes en permettant la caractérisation fine de l’ordre du kb

Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes

� Chromosomes en Mitose

� Chromosomes en Méiose

Accès aux chromosomes de plantes ?

Préparation des lames

� Chromosomes en Mitose :

A partir de pointesde racines

Sélection des lames au DAPI

Le DAPI ou 4',6'-diamidino-2-phénylindole est une molécule fluorescente capable de se lier fortement aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN

Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes

4X38 chrs

3X33 chrs

2X24 chrs

4X, 28 chrs

6X, 42 chrs 8X56 chrs

2X38 chrs

2X44 chrs

2X18 chrs

# Niveau de Polyploïdie

Taille de 2-10 µm

Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes Multi-espèces

Préparation des lames

� Chromosomes en Méiose :

Anthères

Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes

Anthère (Tomate)

Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes

Leptotène Zygotène Pachytène Diplotène Diacinèse Métaphase I Anaphase I Anaphase I

Métaphase II Anaphase II Télophase II Tétrade

• Stade pachytène (les chromosomes sontappariés sur toutes leurs longueurs)

Résolution x 15

• Stade métaphase I

Quelles sont les prestations proposées

par la Plate -Forme?

1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides

2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)

3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH)

4- Caryotype : Comptage chromosomique

Quelles sont les prestations proposées

par la Plate -Forme?

1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides

2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)

3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH)

4- Caryotype : Comptage chromosomique

Prestations proposées par la plate-forme

1- L’hybridation génomique in situ (GISH) :

Polyploïdeset

Hybrides interspécifiques ?

A-genome

B-genomeD-genome

?

(2n=6X=42, AABBDD genome)

0,5 MYA

10000 YA

Ae. speltoides

T. urartu

Exemple 1 :

Technique GISH chez un polyploïdeLe blé tendre, Hexaploide (6X)

chromosomes « cible »

A-probe-biotine

B-genome

D-probe-digoxgénine

Mix sondes ADN Génomiqueparentaux

Anti-dig-Fluorescéine

Avidin- Texas red

Détection Anti-corps Fluo

Hybridation

Exemple 1 :

Technique GISH chez un polyploïde

A-genome

B-genomeD-genome

?

Filtre DAPI Filtre Fluorescein Filtre Texas Red

Exemple 1 :

Technique GISH chez un polyploïde

Translocation4A/7B

Translocation4A/7B

Exemple 1 :

Technique GISH chez un polyploïde

Technique GISH-like : Le COLZA, Allotétraploide

B. rapaAA, 2n=20

B. oleraceaCC, 2n=18

B. napusAACC, 2n=38

2000 YA

Exemple 2 :

B. rapaAA, 2n=20

B. napusAACC, 2n=38

Sonde ADN répétée spécifique du génome C

B. oleraceaCC, 2n=18

Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide

Exemple 2 :

Quelles sont les prestations proposées

par la Plate -Forme?

1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides

2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'A DN répétées (FISH)

3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH)

4- Caryotype : Comptage chromosomique

Prestations proposées par la plate-forme

6Sv5Sv5U1U

Télomérique CentromériqueADN ribosomique

(45 S rDNA + 5S rDNA)Seq rep spécifique

de génome

Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées ( FISH)

Quelles sont les prestations proposées

par la Plate -Forme?

1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides

2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)

3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC- FISH)

4- Caryotype : Comptage chromosomique

Prestations proposées par la plate-forme

Remaniements structuraux : localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et e n méiose

(BAC- FISH)

ADN Génomique

Fragmentation par sonication ~ 150 kb

Caractérisation de délétion, translocation

Banque BAC

Banque BAC inserts ~ 100-150 kb

Quelles sont les prestations proposées

par la Plate -Forme?

1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides

2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)

3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC- FISH)

4- Caryotype

Prestations proposées par la plate-forme

Caryotype : Comptage chromosomique

Iris Spartine Rose

Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale

• Equipement / Personnel• Conditions d’accès• Cout des prestations• Formations• Démarche Qualité

Plate-Forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale

INRA - UMR 1349 « Institut de Génétique, Environnement et Protection des

Plantes » (IGEPP) - 35653 LE RHEU

1- Équipements

• Laboratoire de Cytogénétique Moléculaire

• Microscopie

• Système d'imagerie

� Caméra refroidie (Photometrics Cool SNAP HQ)

� Logiciel d'acquisition (METAVUE et ZEN)

� Deux microscopes à Epifluorescence Zeiss

2- Personnel Permanent

2000

2015

La plate-forme étant ouverte à 50% de sa capacité vers les équipes de recherche extérieures

Site web - Un appel d’offre accompagné d’une plaquette de présentation

3- Accès

Pour la prise en charge des prestations en fonction des demandes,nous avons deux niveaux d’engagement :

� soit nous répondons à une prestation complète,

� soit nous accueillons du personnel des unités demandeuses.

http://www6.rennes.inra.fr/igepp/L-IGEPP/Plateformes/Cytogenetique-moleculaire

• Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétée (FISH)= 40 Euros/lame

• Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation des chromosomes parentaux = 45 Euros/lame

• Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences sur fibre d'ADN peignées (BAC Fiber-FISH) = 40 Euros/lame

• Localisation physique de clones BAC sur les chromosomes (BAC-FISH)sur chromosomes en mitose et en méiose (stade pachytène)

= 40 Euros/lame

4- Cout des prestations

� Forfait Semaine 500 € HT

La plate-forme a également une mission de formation et d'information auprès des chercheurs, techniciens et stagiaires pour un transfert de technologie.

� Sur Bananier - Afin de caractériser des translocations, le BAC-FISH a été mis au point sur la plate-forme de cytogénétique de Montpellier

-> optimiser les techniques de marquage des clones BAC et de détection

� Sur Caféier diploïde ( C. canephora ), nous avons pu mettre au point et former du personnel à la technique du BAC-FISH

5- Formations

Exemples :

6- Qualité

La PF est adossée à la démarche qualité mise en place par l’unité sous l’animation de deux groupes de travail « AQR » et « Métrologie » en lien avec un animateur qualité suivant le référentiel INRA (ISO 9001).

Les principales actions « qualités » mises en œuvre sur la PF ont été :

(1) Mise en place des cahiers de laboratoires,

(2) Rédaction des Modes Opératoires,

(3) Document unique OPPI (Outil de Pilotage de la Prévention à l’INRA),

(4) Métrologie : Contrôle des températures (Frigo, Congélateur, Etuve) (OCEASOFT)Contrôle des balancesContrôle annuel des micropipettes METTLER TOLEDO

Apport de la Cytogénétique Moléculaire aux programmes de séquençage des génomes

chez les Plantes (1) :Identification de réarrangements structuraux

Equipe - Biodiversité et Polyploïdie

Décrire et structurer la diversité génétique, l’exploitervia la recombinaison homologue et homéologue

Plate forme de cytogénétiqueMoléculaire

50%

Mathieu Rousseau, Anne-Marie Chèvre

(AACC, 2n=4X=38)

Espèces diploïdes

Espèces Tétrapolyploïdes

Stratégies :

Synthétiques

[1] COLZA : Quels sont les mécanismes de spéciation ?

� Suivi des modifications structurales qui interviennent dans les génomes lors du choc génomique d’espèces allopolyploïdes

4X4X

1+1=2 ?

2000 ans

Science. 2014 Aug 22;345(6199):950-3.

Quelles sont les différences entre un colza synthéti que et un colza naturel ?

B. Rapa (Navet)AA, 2n=2X=20

B. Oleracea (choux)CC, 2n=2X=18

AACC, 2n=4X=38

B. Napus (colza)

S0

1- Modifications structurales : Le GISH-like a montré d’des irrégularités méiotiques avec des appariementsentre les chromosomes (homologues et homeologues) desgénomes A et C permettant la formation de translocations.

x

AA

CC

AA

CCAA

CC

AA

CCAA

CC

AACC

CC

CC

AA AA

ACAC

AA

Faible stabilité méiotique (6-50% des cellules avec

univalents ou multivalents)

Quelles sont les différences entre un colza synthéti que et un colza naturel ?

- Puces Illumina (SNP)

- NGS DNA Seq

BAC 43F18 (A9/C8) : 4 signaux

• Translocation A/C (hétérozygote) : non visible avec

les puces SNP

18 chrs C-genome

Caractérisation des réarrangements par BAC- FISH

Données :

Identification de réarrangements structuraux importants chez les colzas synthétiques : jusqu’à 4% du génome remanié en 3 générations

Identification de réarrangements structuraux importants chez les colzas synthétiques : jusqu’à 4% du génome remanié en 3 générations

Pour la caractérisation des réarrangements chromosomiques par BAC-FISH chez le Colza : 15 BAC permettent d’identifier les 38 chrs

Quelles sont les différences entre un colza synthéti que et un colza naturel ?

Publications :

G3 (Bethesda). 2017 Feb 9;7(2):705-717.

Collaboration : INRA MOULONIJPB-VERSAILLES URGV-EVRY, BRNO-CZECH REPUBLIC

Ann Bot. 2017 Jan;119(1):13-26.

Apport de la Cytogénétique Moléculaire aux programmes de séquençage des génomes

chez les Plantes (2) :Identification de réarrangements structuraux

EquipePlate forme de cytogénétique

Moléculaire

50%

Guillaume Martin , Franc-Christophe Baurens, Paco Derouault, Gaëtan Droc, Mathieu Rouard, Angélique D’Hont

Objectif est de mieux comprendre la structure et l’ organisation de génomes complexes en particulier polyploïdes, le ba nanier.

Identification de réarrangements structuraux par BAC-FISH : Chromosomes transloqués

(chr01-chr04)?

Nature. 2012 Aug 9;488(7410):213-7

BMC Genomics. 2016 Mar 16;17:243

Quelques exemples de projets développés en collaboration

avec des équipes extérieures

Cytogénétique Moléculaire chez les plantes?

La plate-forme est ouverte à 50% de sa capacité pour des projets extérieurs :

INRA- EvryMUSEUM- ParisINRA- Versailles

INRA, CNRSUniv- Rennes INRA- Colmar

INRA- Angers

INRA- Bordeaux

INRA- Clermont-Fd

INRACIRADIRD Montpellier

INRA- Toulouse

INRA- Lusignan

A. Mason, M. Nelson University of Queensland Brisbane – AUSTRALIA

G. King, C. Ryder– Univ Warwick - UK

A. Kovarik, Academy of Sciences, Brno – CZECH REPUBLIC

R. Freuda-Agyeman, H. Rahman - University of AlbertaCANADA

PFMCV

R. Snowdon , A. Stein University Giessen, - ALLEMAGNE

PROJETS : Structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes ?

Projets : Etude des mécanismes de stabilisation d’un polyploide,

Brachypodium à partir de synthétiques

UR Génomique Végétale (URGV) - EVRY (B. CHALHOUB et Vinh Ha DINH THI PHD student )

PLoS One. 2016 Dec 9;11(12):e0167171

Projet 1: Evaluation de l’implication des rétrotransposons dans la variation de la taille des génomes chez des espèces de lupins écologiquement divergentes

UMR CNRS 6553 Ecobio « Evolution des Genomes et Spec iation – RENNES

(Malika AINOUCHE)

Projet 2 : Detect the different copies in the ribosomal RNA gene family in the hexaploid grass Spartina maritima from next-generation sequencing (Roche-454) reads

PROJETS : Dynamique des génomes chez des espèces polyploïdes- Eléments Transposables

G3 (Bethesda). 2015 Nov 3;6(1):29-40

• Les remaniements chromosomiques observés chez les Téléostéens notothénioïdes impliquent-ils une mobilisation des DIRS et des Gypsy, deux types de rétrotransposons, lors de stress environnementaux ?

PROJETS : Evolution structurale des génomes chez de s espèces polyploïdes- Eléments Transposables

« Painting probe »

Microdissection de chromosomes

UMR 7138, IBPS, UPMC/CNRS Laboratoire « Evolution d es génomes Eucaryotes» et service de Cytogénomique Paris (D. HIGUET, C. OZOUF)

Thèse en cours J. AUVINET

PROJETS : Cartographie physique fine de locus sur chromosomes

Projet : Localisation par BAC-FISH des gènes codants pour les cytochromes P450 chez le Panais

UMR1121 INRA- NANCY (Sandro ROSELLI, Fréderic BOURGAUD, Alain HEH N)

Plant J. 2017 Mar;89(6):1119-1132

Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire

Végétale ( )

http://www.biogenouest.org/contenu/plates-formes/bio-imagerie/cytogenetique

olivier.coriton@inra.fr

http://www6.rennes.inra.fr/igepp/L-IGEPP/Plateformes/Cytogenetique-moleculaire