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Institut National Polytechnique de Toulouse (INP Toulouse)
Mécanique, Energétique, Génie civil et Procédés (MEGeP)
Etude des capacités métaoliques de levures fructophiles isolées du Mezcal :
comparaison cinétique et moléculaire
jeudi 15 novembre 2012
Amanda Alejandra OLIVA HERNANDEZ
Génie des procédés et de l'environnement
Anne Christine GSCHAEDLER MATHIS
Amparo M. QUEROL SIMON
Alberto MENDOZA HERRERA
Claudia Patricia LARALDE CORONA
Anne Christine GSCHAEDLER MATHIS
Amparo M. QUEROL SIMON
Patricia TAILLANDIER
Diana RESENDEZ PEREZ
Laboratoire de génie chimique - LGC
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
EVALUACION CINETICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS FRUCTOFÍLICAS
AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO
Por
AMANDA ALEJANDRA OLIVA HERNANDEZ
Como requisito parcial para obtener el Grado de
DOCTOR EN CIENCIAS
Noviembre, 2012
1
EVALUACION CINETICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS FRUCTOFÍLICAS
AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO
Comité de Tesis
Dra. Diana Reséndez Pérez Director interno de la tesis
Dra. Patricia Taillandier Director externo de la tesis
Dra. Claudia Patricia Larralde Corona Secretario
Dra. Cristina Rodríguez Padilla Vocal
Dr. Jorge A. Verduzco Martínez Vocal
Dr. Pablo Zapata Benavides Vocal
2
El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Industrial
del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional bajo la
asesoría de la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona, y en el Laboratorio de
Ingeniería Química del Institut National Polytechnique de Toulouse (Toulouse,
Francia) bajo la dirección de la Dra. Patricia Taillandier, y con el apoyo
económico del proyecto CONACyT-Básica 2006-57576 “Análisis
metagenómico y de levaduras de alta actividad fructofílica durante la
fermentación del mezcal tamaulipeco”, y de los proyectos institucionales
SIP2008-0597 y SIP2009-0613 (Instituto Politécnico Nacional) “Caracterización
cinética y molecular de la capacidad fructofílica de levaduras aisladas del
mezcal tamaulipeco” de Febrero 2008 a Enero del 2010. A.A. Oliva Hernández
agradece el apoyo de la beca nacional (CONACyT) así como el apoyo especial
CONACyT PCP-2006, proyecto 04/06 “Levaduras fructofílicas aisladas de
mezcal: comparación cinética y molecular de los procesos de elaboración del
mezcal y del vino” de Enero del 2007 a Diciembre del 2010, en colaboración
CBG-IPN y el INP-Toulouse (Toulouse, Francia).
3
AGRADECIMIENTOS
Gracias Dios por poner en mi camino todas las cosas bellas que ahora tengo.
Gracias a mi familia querida por respaldarme, soportarme con amor y ser un firme apoyo en
cada una de las decisiones y acciones que emprendo. Gracias mama, Amanda Leticia por
darme tu mano cada vez que lo necesito, con ese incansable amor, estar siempre cerca y
cuidar de mi tesoro más preciado, mis hijos, Arturo, Emiliano y Airam. Gracias a mi esposo
Arturo, a mis hermanos Enrique, Lety y Cynthia por su cariño y apoyo.
Profe Manuel de Jesús Hernández Monreal te quiero entrañablemente y le doy gracias a Dios
por quien eres y porque te tengo, con tú gran cariño, ejemplo y apoyo incondicional has hecho
crecer a los que te rodean. Y en lo personal has sembrado ideales, retos y acciones a seguir,
siempre en el afán de que con un esfuerzo positivo y bien intencionado puedo lograrlo.
Gracias a los Doctores Patricia Larralde, Diana Resendez, Patricia Taillandier, José Narváez
por su trabajo y poner alma de artista en esta noble tarea al dirigir con fuerza misionera y
mano delicada el trabajo que implica el quehacer científico, por contagiarme de ese espíritu de
curiosidad y compromiso en aras de una idea.
Gracias Doctor Felipe Ramón Portugal por tu apoyo y sobre todo tu amistad.
4
TABLA DE CONTENIDO
Sección Página
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................................... 3
LISTA DE TABLAS ......................................................................................................................... 8
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................................... 9
LISTA DE SIMBOLOS .................................................................................................................. 13
RESUMEN ...................................................................................................................................... 16
RÉSUMÉ ......................................................................................................................................... 18
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 20
2 JUSTIFICACION .................................................................................................................... 22
3 HIPOTESIS ............................................................................................................................. 22
4 OBJETIVOS ............................................................................................................................ 22
4.1. Objetivo general ............................................................................................................... 22
4.2. Objetivos particulares ...................................................................................................... 22
5 ANTECEDENTES .................................................................................................................. 23
5.1. Mezcal .............................................................................................................................. 23
5.2. La planta de Agave en Tamaulipas .................................................................................. 25
5.2.1. Tamaulipas región mezcalera, situación geográfica ................................................. 25
5.3. El proceso de elaboración del mezcal .............................................................................. 26
5.3.1. Selección de la planta ................................................................................................ 26
5.3.2. Cocción de las cabezas de agave ............................................................................... 27
5.3.3. Molienda .................................................................................................................... 29
5.3.4. Fermentación ............................................................................................................. 29
5.3.5. Destilación ................................................................................................................. 30
5.3.6. Envasado ................................................................................................................... 32
5
5.4. Microbiología del proceso de fermentación .................................................................... 32
5.4.1. La levadura Saccharomyces cerevisiae ..................................................................... 34
5.4.2. La fermentación alcohólica por S. cerevisiae. ......................................................... 35
5.4.3. Tolerancia al estrés ambiental de S. cerevisiae y la producción de etanol .............. 37
5.5. Transporte de hexosas a través de la membrana celular en S. cerevisiae ....................... 38
5.5.1. Regulación transcripcional en S. cerevisiae: señalización por glucosa .................... 39
5.5.2. El represor transcripcional RGT1 ............................................................................. 40
5.5.3. Las proteínas Grr1, Hxk2 y Reg1 .............................................................................. 41
5.6. La regulación de los genes HXT1 y HXT3 por glucosa/fructosa ..................................... 43
6 MÉTODOS .............................................................................................................................. 48
6.1. Aislamiento de levaduras ................................................................................................. 48
6.1.1. Diseño del estudio y tamaño de la muestra ............................................................... 48
6.1.2. Tratamiento de la muestra ......................................................................................... 48
6.1.3. Clasificación microscópica ....................................................................................... 50
6.2. Identificación molecular .................................................................................................. 50
6.2.1. Extracción de DNA ................................................................................................... 50
6.2.2. Amplificación de los genes ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 y 26S por PCR ............... 52
6.2.3. Digestión enzimática del segmento ribosomal ITS’s ................................................ 52
6.2.4. Amplificación de los genes HXT1 y HXT3 .............................................................. 53
6.2.5. Identificación molecular por secuenciación .............................................................. 54
6.2.6. Construcción de dendogramas .................................................................................. 55
6.3. Fermentaciones ................................................................................................................ 55
6.3.1. Medios de cultivo ...................................................................................................... 55
6.3.2. Cuantificación de la biomasa. ................................................................................... 56
6.3.2.1. Espectrometría .................................................................................................... 56
6.3.2.2. Peso seco .......................................................................................................... 577
6.3.2.3. Cuenta celular ..................................................................................................... 57
6.3.3. Análisis de azúcares .................................................................................................. 57
6.3.3.1. Determinación de glucosa por un método enzimático ....................................... 57
6.3.3.2. Determinación de azucares totales por el método DNS ................................... 588
6.3.3.3. Cromatografía liquida de alta presión (HPLC) .................................................. 58
6.4. Cuantificación del estrés por etanol .............................................................................. 599
6.4.1. Parámetros cinéticos .................................................................................................. 59
6
6.5. Análisis estadístico ........................................................................................................... 60
7 RESULTADOS ....................................................................................................................... 61
7.1. Identificación molecular de las levaduras ....................................................................... 61
7.1.1. Análisis de restricción del segmento ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 (ARDRA) ........... 62
7.1.2. Amplificación del segmento ribosomal 26S ............................................................. 63
7.1.3. Identificación molecular por los segmentos ribosomales ITS’s y 26S ..................... 63
7.2. Caracterización de la productividad de las levaduras .................................................. 688
7.2.1. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en glucosa
(M1) ..................................................................................................................................... 68
7.2.2. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en fructosa
(M2) ................................................................................................................................... 722
7.3. Caracterización cinética de los aislados de S cerevisiae con una alta actividad
fructofílica ............................................................................................................................. 755
7.4. Caracterización de aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructofílica
en medio M3 .......................................................................................................................... 855
7.5. Caracterización de la tolerancia al etanol de los aislamientos Saccharomyces
cerevisiae fructofílicos ............................................................................................................ 91
7.6. Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y
HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos ........................................ 91
8 DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 95
8.1 Identificación molecular de las levaduras ........................................................................ 95
8.2 Caracterización de la productividad de las levaduras ..................................................... 95
8.3 Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y
HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos ........................................ 99
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................... 103
10 APÉNDICES ......................................................................................................................... 104
Apéndice 1. Microfotografías de las levaduras Saccharomyces cerevisiae aisladas
de mosto de mezcal. ............................................................................................................... 104
Apéndice 2. Secuencias 26S de las levaduras aislados de mostos de mezcal. ...................... 106
Apéndice 3. Secuencias ITS’s de las levaduras aisladas de mostos de mezcal .................... 110
Apéndice 4. Comparación de las secuencia de los genes HXT1 de las levaduras
seleccionadas por su fructofilia. ........................................................................................... 115
7
Apéndice 5. Comparación de las secuencia de los genes HXT3 de las levaduras
seleccionadas por su fructofilia. ........................................................................................... 116
11 LITERATURA CITADA ...................................................................................................... 117
12 RESUMEN BIOGRÁFICO .................................................................................................. 135
PRODUCTIVIDAD ............................................................................................................... 135
8
LISTA DE TABLAS
Tabla Página
I. Especificaciones físicas y químicas para la producción de mezcal 25
II. Composición de medios de cultivo 566
III. Parámetros cinéticos 59
IV. Aislados de levaduras con morfología redonda 61
V. Clasificación e identificación molecular de las levaduras aisladas de mostos
de mezcal 64
VI. Parámetros cinéticos de los aislamientos de S. cerevisiae en medio rico en
glucosa (M1). 71
VII. Parámetros cinéticos de los aislados de S. cerevisiae en medio rico en
fructosa (M2) 74
VIII. Evaluación cinética al final de la fermentación de los aislados de S.
cerevisiae en medio M3 (glucosa:fructosa 1:1) 86
IX. Predicción de de la posición de los polimorfismos en HXT1 y HXT3 para
los aislados de mostos de mezcal 94
9
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
Figura 1. (A). Planta silvestre de Agave spp. (B) Piñas de agave 27
Figura 2. Pozos de cocimiento tradicionales: (A) Horno natural recubierto de
piedra. (B) Piñas cocidas 28
Figura 3. Molino o “trapiche” metálico adaptado en forma transversal, accionado
por tracción animal 29
Figura 4. Tinajas de fermentación de mostos de agave 30
Figura 5. Serpentín usado en destilación de mezcal 31
Figura 6. HXT1 Inducción de la transcripción solo por alta concentración (Ozcan et
al., 1995) 44
Figura 7. HXT3 Inducción de la trascripción por glucosa independiente de la
concentración de azúcar (Ozcan et al., 1995) 45
Figura 8. Puntos muestreados en la mezcalería “El Palmar”. A) Piñas en cocción.
B) Trapiche. C) y D) Mostos en fermentación 49
Figura 9. Gel agarosa al 1.5 %, tenido con SyberGold™ 10 X. ADN de aislados de
mostos de mezcal; en la tabla IV se especifica la identificación de las
muestras...18 ADN de cepa control FECHA (Fermichamp) 51
Figura 10. Gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb
(Promega, Estados Unidos). Amplificación del gen HXT1 de aislados de
mostos de mezcal 53
Figura 11. Gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb
(Promega, Estados Unidos). Amplificación del gen HXT3 de aislados de
mostos de mezcal. 1=Oligonucleótidos diseñados por.
10
2=Oligonucleótidos diseñados por el Laboratorio de Biotecnología
Industrial 544
Figura 12. Gel de agarosa al 1.5% tenido con SyberGold™ 10 X. Amplificación de
los segmentos ITS’s aislados con morfología celular redonda. Agua (C-)
control negativo y M: marcador de 100 pb (Promega, Estados Unidos) 622
Figura 13. ARDRA’s de aislados de mostos de mezcal. Gel de agarosa al 2.5%,
teñido con SyberGold™ 10X, marcador 100 pb (Promega, Estados
Unidos) 622
Figura 14. Amplificación de genes ribosomales 26S. Gel de agarosa al 2.5%,
teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados
Unidos) de las levaduras de morfología redonda aisladas de mostos de
mezcal 633
Figura 15. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia
nucleotídica de la región ribosomal 26S. Este árbol está basado en el
método “Neighbor-Joining”, un bootstrap de 1000. La distancia
evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum Composite
Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el
tamaño de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El análisis
filogenético se llevo a cabo en MEGA4 666
Figura 16. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia
nucleotídica de la región ribosomal ITS1-5.8S-ITS2. Este árbol está
basado en el método “Neighbor-Joining”, un bootstrap de 1000. La
distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum
Composite Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio
para el tamaño de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El
análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4 677
Figura 17. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae
aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9) 699
Figura 18. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por levaduras S.
cerevisiae aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa
1:9) 70
11
Figura 19. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae
en el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 733
Figura 20. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por S. cerevisiae en
el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 733
Figura 21. Cinética de fermentación a 30°C de 3D4. A) Medio M1
(fructosa:glucosa 9:1). Medio B) M2 (fructosa:glucosa 1:9) 766
Figura 22. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y2 Cinética. A) Medio M1
(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 77
Figura 23. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y3. A) Medio M1
(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 79
Figura 24. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y4. A) Medio M1
(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 80
Figura 25. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y5. A) Medio M1
(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 82
Figura 26. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y8. A) Medio M1
(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 83
Figura 27. Cinética de fermentación a 30°C de Fermichamp® (FECHA). A) Medio
M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 84
Figura 28. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae A)
3Y3 y B) 3Y5 durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 100:100) 87
Figura 29. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae C)
3Y8 y D) Fermichamp® (FECHA) durante la fermentación en M3
(fructosa:glucosa 1:1) 88
Figura 30. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la
fermentación de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 en M1
(fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa
1:1) 89
Figura 31. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la
fermentación de cepas S. cerevisiae A) 3Y8 y B) Fermichamp®
12
(FECHA) en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3
(fructosa:glucosa 1:1) 90
Figura 32. Pérdida de viabilidad en células de levaduras Saccharomyces aisladas de
mostos de mezcal a 30°C en 25% v/v de etanol. La viabilidad al 100% la
representa el valor de 2 x 106 cfu/mL 91
Figura 33. Predicción de la conformación de los segmentos transmembranales de
las proteínas A) hxt1 y B) hxt3 basada en la secuencia de la cepa
Saccharomyces cerevisiae S288c y la posición de los polimorfismos de
aislados de mostos de mezcal y la Fermichamp® 93
Figura 34. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un
microscopio BX-51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video
Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. A) 3D2; B) 3D3;
C) 3D4; D) 3D5; E) 3D6 104
Figura 35. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un
microscopio BX-51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video
Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. F) 3Y2; G) 3Y3;
H) 3Y4; I) 3Y5; J) 3Y6; K) 3Y8 105
Figura 36. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen HXT1 de
aislados de mostos de mezcal y Fermichamp en referencia a S288c.
Indica residuo de aminoácido idéntico; color rojo indica cambio en el
aminoácido 115
Figura 37. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen hxt3 de
Aislados de Mostos de Mezcal y Fermichamp en referencia a S288c.
Indica residuo de aminoácido idéntico; color rojo indica cambio en el
aminoácido 116
13
LISTA DE SIMBOLOS
C Grados centígrados
l Microlitro
M Micromolar
A260 Absorbancia a 260 nm
A280 Absorbancia a 280 nm
ADN Ácido desoxiribonucléico
ACP Análisis de Componentes Principales
ADNg Ácido desoxiribonucléico genómico
Als, A Alanina
AMOVA Análisis de Varianza Molecular
Arg, R Arginina
ARN Ácido ribonucléico
ARNasas Ácido ribonucleasas
ARNm Ácido ribonucléico mensajero
Asn, N Asparragina
Pro, P Prolina
Asp, D Aspártico
C/N Relación carbono-nitrógeno
CFU Unidades formadoras de colonia
Cis, C Cisiteina
CO2 Dióxido de carbono
CV Coeficiente de variación
dNTPs Desoxirribonucleósidos trifosfatados
DO550 Densidad óptica a 550 nm
EDTA Ácido etilendiaminotetracético
G Gramo
Gln, Q Glutamina
14
Glu, E Glutámico
Gly, G Glicina
h Hora
His, H Histidina
HXT Genes transportadores de hexosas
Ile, I Isoleucina
kb Kilobase
L Litro
LB Luria Bertani
Leu, L Leucina
Lys, K Lisina
M Molar
M Marcador de peso molecular.
Mb Megapares de bases
Met, M Metionina
mg Miligramos
min Minuto
ml Mililitro
mM Milimolar
ng μL-1 nanogramos por microlitro
nm Nanómetros
ORF Marco de lectura abierta
pb Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PDA Agar papa dextrosa
pH Potencial de hidrógeno
Phe, F Fenilalanina
rARN Ácido ribonucleico ribosomal
rpm Revoluciones por minuto
s Segundos
Ser, S Serina
Thr, T Treonina
Taq ADN polimerasa de Thermus aquaticus.
TGY Medio de cultivo de Triptona-Glucosa-Extracto de levadura
15
Trp, W Triptófano
Tyr, Y Tirosina
TM Región transmembranal
U Unidades
U μL-1 unidades por microlitro
UPGMA Unweighted paired gropuing method with arithmethic average
UV Ultravioleta
V voltios
v/v Volumen a volumen
Val, V Valina
X Veces de la concentración
g Microgramo
l Microlitro
16
RESUMEN
Tamaulipas tiene las expectativas de figurar como uno de los estados productores de
mezcal más importantes, este producto mexicano puede contribuir a la economía del campo
tamaulipeco provocando una derrama económica importante comparado con otros destilados
de agave ya que además es una bebida que conserva la tradición de fabricación en empresas
pequeñas con tradición, cultura e historia fomentando el arraigo de las comunidades.
A diferencia de la micoflora que interviene en el proceso de producción de otras bebidas
alcohólicas, la micoflora responsable de la fermentación alcohólica del mezcal no ha sido
completamente identificada ni caracterizada metabólicamente, es de gran interés industrial
conocer si las levaduras nativas involucradas en la fermentación de mostos de agave poseen,
en primer lugar, una fuerte naturaleza fructofílica (inducida por a la composición natural del
mosto), y en segundo lugar, caracterizar a nivel cinético y molecular el tipo de transportadores
involucrados en el consumo de la fructosa en estas cepa, ya que los estudios de la utilización
de hexosas por Saccharomyces cerevisiae se han concentrado casi exclusivamente en la
glucosa, y no se ha observado que los transportadores discriminen entre la glucosa y la
fructosa.
En este trabajo la población a estudiar fueron 17 aislamientos (de 103 originalmente
aislados) obtenidos de la mezcalería “El Palmar” del Sr. Emilio Lozoya, situada en San Carlos
(Tamaulipas, México). La toma de muestra se efectuó en el horno de cocimiento; el trapiche
(molino) y en las diversas etapas de los mostos en fermentación. Como control se utilizó la
cepa Fermichamp ® (DSM) una cepa de vino industrial con capacidad fructofílica. Se
identificaron molecularmente por la secuencia ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 y 26S cinco grupos
de microorganismos, 10 aislados de Saccharomyces cerevisiae, uno Zygosaccharomyces
bailii, tres de Torulaspora delbrueckii, dos de Kluyveromyces marxianus y uno de Pichia
mexicana. Se evaluaron cepas identificadas como S. cerevisiae en tres medios diferentes M1
(fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (glucosa:fructosa 1:1). Las cepas
destacadas en el consumo de azucares en M1 fueron 3Y4, 3Y8 y Fermichamp®; en M2 los
mejores fueron 3Y2, 3Y4 y 3Y8; en M3 fueron 3Y3, 3Y5 y 3Y8. Además se evaluó la
17
resistencia a etanol encontrándose que la cepa con que presento mayor porcentaje de
viabilidad fue la cepa 3Y8.
El análisis de las secuencias de los trasportadores de hexosas de Hxt1 demostró que los
segmentos transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de
mezcal y Fermichamp® con la secuencia de la clona S228c. El análisis de Hxt3 mostro que en
TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en S207L (cambio de un aminoácido no
polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c. TM7 de Hxt1, los aminoácidos Q275, G279 y
D280 están conservados para todas las cepas, sin embargo en Fermichamp®, 3D6, 3Y2, 2Y3,
2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el polimorfismo K278T. En Hxt1 se encontraron entre
la región TM9, en el rizo externo y en la TM10 cambios de aminoácidos en la posición 418-
420 y 431, en Hxt3 se localizaron los polimorfismos en la posición 418 y 419 solo para
Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las sustituciones Y402L y C401S; otro cambio
ocurrió solo en la cepa 3D3 que presentó los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la
región transmembranal 9. En Hxt1 del segmento TM10 está presente el polimorfismo L377F,
para 3Y8 cerca de la posición F380. Por otra parte en la cepa 3D3 se encontraron los
polimorfismos F406S; G408A; G411A en Hxt1. En el transportador Hxt1 está presente el
polimorfismo L439M en el TM12, en la cepa 3D3. Se considera que los polimorfismos que se
presenten en estos segmentos transmembranales pudieran modificar el tamaño del poro y la
forma de señalización de la proteína con el azucar, evidenciando su importancia en la
formación de la cadena. Por lo que se pudiera conisderar que estas modificaciones
distorsionarian la conformacion de la estructural exofacial provocando alteraciones entre los
sitios alostéricos de la proteina, propiciando una diferente afinidad con las moleculas de
hexosas, provocando cambios en la funcionalidad del transportador. Los resultados
obtenidos en este estudio sugieren la necesidad de realizar un análisis integral para determinar
las capacidades fructofílicas y de producción de etanol en una cepa de S. cerevisiae; ya que
los cambios observados en la tasas de consumo de azucares y producción de etanol para estas
cepas no están relacionados solo con la expresión y/o actividad de estos genes.
18
RÉSUMÉ
L’état de Tamaulipas au Mexique a pour objectif de devenir l'un des plus grands
producteurs de mezcal. En effet ce produit mexicain peut contribuer à l'économie rurale et
prendre un essor économique important par rapport à d'autres distillats d'agave. C’est aussi
une boisson qui maintient la tradition de fabrication dans les petites entreprises conformément
à la culture et l'histoire en faisant appel aux racines des communautés.
Contrairement à la mycoflore impliquée dans le processus de production des autres
boissons alcoolisées, la mycoflore responsable de la fermentation alcoolique du mezcal n'a
pas été pleinement identifiée ou caractérisée métaboliquement. Il est tout d’abord d'un grand
intérêt industriel de savoir si les levures indigènes impliquées dans la fermentation de moûts
agave ont une forte nature fructophilique (induite par la composition naturelle du moût). Par
ailleurs les caractérisations cinétique et niveau moléculaire des transporteurs impliqués dans
la consommation de fructose dans cette flore seraient pertinentes étant donné que des études
sur l'utilisation des hexoses par Saccharomyces cerevisiae ont porté presque exclusivement
sur le glucose, et qu’il n'a pas été observé que ces transporteurs discriminaient le glucose et le
fructose.
Dans ce travail la population étudiée était de 17 isolats sur 103 levures initialement isolés
d’une mezcalerie, la "El Palmar" Lozoya M. Emilio, situé à San Carlos (Tamaulipas,
Mexique). L'échantillonnage a eu lieu dans la cuisson au four, au moulin et à différents stades
de moûts en fermentation. Comme souche de contrôle la Fermichamp ® (DSM) a été utilisée.
Il s’agit d’une souche industrielle de vin à capacité fructophilique. Cinq groupes de micro-
organismes ont été identifiés par la séquence-ribosomiques ITS1 et ITS2 5,8 S-26S : 10
Saccharomyces cerevisiae, 1 Zygosaccharomyces bailii, 3 Torulaspora delbrueckii, 2
Kluyveromyces marxianus et 1 Pichia mexicana. Les souches identifiées comme S. cerevisiae
ont été évaluées dans trois milieux différents : M1 (glucose: fructose 9:1), M2 (glucose:
fructose 1:9) et M3 (glucose: fructose 1:1). Les souches prédominantes pour la consommation
de sucres dans M1 étaient 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8. Dans M2 la meilleure était FECHA
suivie de 3D5, 3Y8, 3D3, 3Y2 et 3Y4; dans M3 c’était 3Y3, 3Y5 et 3Y8. En outre la
19
résistance à l'éthanol a été évaluée et nous avons constaté que la souche témoin Fermichamp
®, conservait la meilleure suivie de 3Y5 et 3Y8.
L'analyse des séquences des transporteurs d'hexoses de Hxt1 ont montré que les segments
transmembranaires TM3, TM5 et TM6 sont conservés dans les isolats du mezcal et dans
Fermichamp ® par rapport à la séquence du S228c cloné. L’analyse Hxt3 montre que dans le
segment transmebranaire TM5, les souches de mezcal présentent un polymorphisme dans
S207L (changement d'un acide aminé non polaire à une autre polaire) par rapport à la souche
S228c. Pour le segment TM7 de Hxt1, les acides aminés Q275, G279 et D280 sont conservés
pour toutes les souches, mais dans Fermichamp ®, 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 et 3Y8 on
rencontre le polymorphisme K278T. Dans Hxt1 entre TM9, région de la boucle extérieure, et
TM10 des changements d'acides aminés à la position 418 à 420 et 431 ont été trouvés. Dans
Hxt3 les polymorphismes étaient situés à la position 418 et 419 seulement pour Fermichamp ;
les isolats du mezcal présentent les substitutions Y402L et C401S, un autre changement a eu
lieu seulement dans la souche 3D3 qui présentent les polymorphismes Y405A, A406F, S407L
dans la région 9 transmembranaire. Dans Hxt1 dans le segment TM10 le polymorphisme
L377F est présent, à proximité de la position 3Y8 F380. En outre, pour cette souche on trouve
aussi le polymorphismes dans les F406, G408A, G411A dans Hxt1. Sur le trnasporteur Hxt1
le polymorphisme L439M est présent dans le TM12. On considère que les polymorphismes
survenant dans les segments transmembranaires peuvent modifier la taille des pores et la
forme de signalisation de la protéine par du sucre, démontrant son importance dans la
formation de la chaîne. Comme ces changements pourraient modifier la conformation
structurelle exofaciale, provoquant entre des altérations des sites allostériques de la protéine,
ils peuvent conduire à une modification de l’affinité pour les hexoses différents et donc à des
changements dans la fonctionnalité du tranporteur.
Les résultats obtenus dans cette étude suggèrent la nécessité d'une analyse approfondie afin
de déterminer les capacités à la fructophilie et à la production d'éthanol des souches de S.
cerevisiae. Les changements observés dans les taux de consommation de sucre et de
production d'éthanol pour ces souches ne seraient pas liés uniquement à l'expression et / ou
l'activité de ces gènes.
20
1. INTRODUCCIÓN
La fuente principal de carbono en el mosto de agave está compuesta principalmente de
azúcares fermentables (glucosa y fructosa) aproximadamente en una relación de 1 molécula
de glucosa por 7 moléculas de fructosa, a priori podemos pensar que las levaduras
predominantes durante el proceso de elaboración del mezcal tendrán una tendencia
fructofílica (fuerte capacidad de asimilación de la fructosa). La especie de Agave que se
utilice en el proceso va a determinar el tipo y contenido de azúcares, con lo cual se observan
variaciones en el rendimiento del producto, que generalmente son más bajas que el estimado
teórico, debido a deficiencias en la etapa de cocción, extracción de azúcares, de la
fermentación y de la destilación, dado el poco control que se tiene en cada etapa por lo
artesanal del proceso. El mosto de agave contiene además una baja concentración de
nitrógeno asimilable para la levadura.
Las levaduras son el factor más importante durante el proceso de fermentación, pues
además de etanol, producen alcoholes superiores, enzimas extracelulares, precursores de
aromas y compuestos de alto peso molecular que constituyen o participan en el aroma
característico de los productos refinados.
Dentro de la amplia gama de carbohidratos presentes en la naturaleza, y que son utilizables
en el metabolismo, las hexosas ocupan un lugar predominante de importancia, y entre ellas, la
glucosa es la más importante. Para que las hexosas puedan ser utilizadas deber ser en primer
lugar traslocadas a través de la membrana celular, para lo cual se ha observado que existe todo
una serie de proteínas transportadoras, de afinidad variable y modulable, y las cuales son
reguladas tanto a nivel transcripcional como post-traduccional. Los estudios de la utilización
de hexosas por S. cerevisiae se han concentrado casi exclusivamente en la glucosa, y no se ha
observado que los transportadores discriminen entre la glucosa y la fructosa. El que una
levadura posea una naturaleza fructofílica, es decir, que consuma a mayor velocidad la
fructosa que la glucosa a altas concentraciones, le confiere una mayor capacidad de utilizar
21
una fuente de carbono que la mayoría de los microorganismos no utilizan como primera
opción.
Hasta la fecha no se conoce en detalle la micoflora que interviene en el proceso de
conversión del mosto del Agave en mezcal tamaulipeco, así como tampoco se ha
caracterizado cinéticamente el transporte y aprovechamiento de azúcares, que son la materia
prima fundamental del proceso de obtención de mezcal. A nivel científico el conocimiento de
las levaduras nativas del mezcal, así como las características de transporte de azúcares (y otras
actividades bioquímicas en este sistema de fermentación) sería de gran importancia, y en
particular, en lo que se refiere a la utilización de la fructosa, que es el azúcar principal de los
mostos, y sus posibles consecuencias a nivel de la caracterización y mejoramiento de la
producción del mezcal.
22
2 JUSTIFICACION
El conocimiento de las características de transporte de azúcares en las levaduras nativas del
mezcal tamaulipeco, y en particular, en lo que se refiere a la utilización de la fructosa, tendría
un impacto positivo en el conocimiento básico y mejoramiento de la producción del mezcal.
3 HIPOTESIS
Dada la alta concentración de fructosa presente en los mostos de mezcal se pueden aislar
levaduras nativas que expresan transportadores con una alta afinidad hacia este azúcar.
4 OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Caracterizar a nivel cinético y molecular el consumo de la fructosa en cepas productivas de
alcohol aisladas de mostos de mezcal tamaulipeco.
4.2. Objetivos particulares
Aislar y caracterizar cinéticamente las levaduras con una alta actividad fructofílica.
Caracterizar la productividad de etanol de las levaduras Saccharomyces cerevisiae
fructofílicas bajo diferentes relaciones fructosa:glucosa.
Caracterizar la tolerancia al etanol de las levaduras Saccharomyces cerevisiae fructofílicas.
Caracterizar genéticamente los genes HXT1 y HXT3 del sistema de transportadores de
azúcares de las levaduras Saccharomyces cerevisiae fructofílicas seleccionadas de la
micoflora nativa del mezcal.
23
5 ANTECEDENTES
5.1. Mezcal
La palabra mezcal tiene su origen en vocablos de la lengua náhuatl, algunos sostienen que
deriva de “mexcalli” (“metl” o “meztl”, maguey, y de “ixcalli”, cocer), la traducción sería
entonces “maguey cocido” (Gómez, 2004; Colunga et al., 2007). La planta del maguey desde
tiempo prehispánico era utilizada por los indígenas en todo Mesoamérica obteniendo de él
aguamiel y pulque (Parsons et al., 1990); pero no fue sino hasta la llegada de los españoles en
el siglo XVIII, quienes controlaron su producción, que se introdujo por a las costas de Colima
y Jalisco el proceso de destilación proveniente originalmente de los filipinos (Parsons et al.,
2000; Colunga et al., 2007; Zizumbo et al., 2008). Ciertamente la fabricación del vino mezcal
tuvo un comienzo modesto, su consumo fue a lo largo de los siglos XVI y XVII estrictamente
local, sin embargo, para fines del siglo XVIII y como consecuencia de su vinculación a los
centros mineros, experimentó un fuerte impulso ya que este emergente mercado vino a
sumarse al tradicional mercado rural y al recién conquistado mercado urbano, articulándose
así una fuerte comercialización del producto. En Tamaulipas, existen registros de que los
indígenas Janambres, en el invierno consumían “mezcal de agave haciendo en barbacoa la
piña del quiote del maguey y la lechuguilla”, fueron de verdad los indios más temidos antes
de y durante la conquista. (Mirafuentes, 1993). Durante la colonia, el auge mezcalero de la
región llegó a su punto máximo gracias a las actividades mineras en la sierra de San Carlos,
pero pasada la corta bonanza minera en la Sierra de Tamaulipa Nueva y empobrecidos sus
habitantes por la grave dislocación económica que generó en todo el Noreste la guerra de
Independencia, las minas fueron abandonadas y sus habitantes obligados a buscar otro medio
de subsistencia (Delay, 2007).
El nombre mezcal se utiliza como genérico para bebidas destiladas a partir de diversas
especies de maguey, fabricadas a partir de variados procesos tradicionales, con una
denominación de origen que emplea el nombre mezcal para agrupar, sin reconocer sus
diferencias, a variadas especies, bebidas, regiones y procesos de siete estados que son los
únicos que ahora pueden usar el nombre en la comercialización de sus productos.
24
Actualmente de acuerdo a la NORMA Oficial Mexicana NOM-070-SCFI-1994 Bebidas
Alcohólicas-Mezcal Especificaciones, (Tabla I) el mezcal “es la bebida alcohólica obtenida
por destilación de mostos preparados con los azúcares extraídos del tallo y base de las hojas
de los agaves mencionados, sometidos previamente a fermentación alcohólica con levaduras,
permitiéndose adicionar hasta un 20% de otros azúcares en la preparación de dichos mostos,
siempre y cuando no se eliminen los componentes que le dan las características a este
producto.” (Bebidas Alcohólicas-Mezcal Especificaciones). A petición de los productores de
maguey, el Instituto de la Propiedad Industrial gestionó ante la Organización Mundial de la
Propiedad Intelectual, la denominación de Origen para el Mezcal, misma que obtuvo su
registro en 1994 para los estados de Oaxaca, Guerrero, San Luís Potosí, Durango y Zacatecas;
en 2001 para el municipio de San Felipe, Guanajuato, y en 2003 se incorporaron 11
municipios de Tamaulipas entre los que se encuentran Bustamante, Tula, Miquihuana de
Canales, Palmillas, así como de los de San Carlos Arteaga, San Nicolás de Degollado y
Burgos, existiendo en estos últimos el mayor número de fábricas de elaboración de la bebida
alcohólica denominada “Mezcal” ( Norma Oficial Mexicana 2006). En Tamaulipas el mezcal
se elabora de manera artesanal en pequeñas fábricas en donde los campesinos elaboran la
bebida para su propio consumo, las fiestas comunitarias y familiares y para ayudar su
economía familiar mediante la venta. Actualmente el gobierno de Tamaulipas impulsa la
agroindustria del mezcal en el proceso de fortalecimiento en acciones dirigidas a la
modernización y terminación de las fábricas de mezcal existentes, la certificación de las
mismas, promoción y comercialización del mezcal para así lograr el posicionamiento nacional
e internacional (COMERCAM; Gaceta parlamentaria, 2008).
Considerando la ubicación geográfica, la infraestructura de las vías de comunicación, la
cercanía con el mercado más grande del mundo y gran consumidor del tequila y mezcal, como
lo es Estados Unidos, Tamaulipas tiene las expectativas de figurar como uno de los estados
productores de mezcal más importantes y este producto mexicano puede tener una derrama
económica muy importante, ya que aunque incipiente, posee amplias perspectivas con
impacto social y económico para las entidades rurales comparado con otros destilados de
agave, este es una bebida que conserva la tradición de fabricación en empresas pequeñas con
tradición, cultura e historia fomentando el arraigo de las comunidades.
25
Tabla I.
Especificaciones físicas y químicas para la producción de mezcal
Especificaciones
Mínimo Máximo
Porcentaje de alcohol en el volumen a 20° C. 36.0 55.0
Extracto seco g/l 0.2 10.0
Miligramos por 100 centímetros cúbicos referidos a alcohol anhídrido
Acidez total (como ácido acético) 170.0
Alcoholes superiores mg/100 ml 100.0 400.0
Metanol mg/100 ml 100.0 300.0
Se pueden utilizar los aditivos permitidos y en la dosis que establezcan las disposiciones legales correspondientes. NOM-070-SCFI-1994.
5.2. La planta de Agave en Tamaulipas
En el estado de Tamaulipas la denominación de origen enlista para producción de mezcal a
Agave esperrima jacobi Amarilidáceas (“maguey de cerro, bruto o cenizo”), A. angustifolia
Haw (“maguey espadín”), A. weberi cela, Amarilidáceas (“maguey de mezcal”), A.
potatorum, Amarilidáceas (maguey de mezcal) A. salmiana Otto Ex Salm SSP Cassispina
(Trel) Gentry (“maguey verde” o “mezcalero”); en la literatura menciona también se
menciona a A. americana L subsp. Protamericana Gentry (“mezcal” o “maguey cenizo”), A
lophiana, A univittata Haw., y Agave funkiana K. Koch Bouché (Ambas conocidas como
“lechuguilla” o “amole”); Agave montium-santicaroli (Jarcia) (NOM-070-SCFI-1994;
CONABIO 2002; García, 2003; García-Mendoza et al., 2007).
En Tamaulipas se encuentran establecidas 1600 hectáreas con agaves, sin embargo se
tienen plantas silvestres distribuidas en los 22 mil kilómetros cuadrados de los municipios
protegidos, específicamente en la región de San Carlos conformada por los municipios de San
Carlos, San Nicolás parte de Cruillas y Burgos (Jaques et al., 2003).
5.2.1. Tamaulipas región mezcalera, situación geográfica
El Estado de Tamaulipas se ubica al noreste de la República Mexicana, geográficamente se
ubica entre los paralelos 22° 12’ 31’’ y 27° 40’ 52’’ de latitud norte, y los meridianos 97° 08’
26
38’’ y 100° 08’ 51’’ de longitud oeste. Específicamente la Sierra de San Carlos en donde se
encuentra delimitada la actividad mezcalera, es una unidad orográfica asilada dentro de la
planicie costera del Golfo Norte de México sobre la cota de los 400 metros sobre el nivel del
mar (msnm); se localiza en la porción centro-oeste del estado de Tamaulipas, entre los 24° 07’
y los 24° 45’de latitud norte y los 99° 05’y los 98° 42’de longitud oeste. En esta región se
presentan climas que van de los templados subhúmedo a semicálidos secos con lluvias en
verano y largos periodos de sequía, siendo la precipitación mayor parte de la sierra son del
tipo rendzina, estos presentan una capa superficial rica en materia orgánica que descansa
sobre roca caliza y ocupan un 76 % del área, suelos profundos del grupo Chernozem, ocupan
un 10 % de la superficie; también están presentes suelos como los vertisoles y litosoles en
menor proporción. En cuanto a su orografía la parte norte de la sierra pertenece a las
subcuencas del rio Conchos y de los arroyos Chorreras y Camacho, pertenecientes a la cuenca
del Rio San Fernando y el sur de la sierra a las subcuencas de los ríos Pilón, San Carlos y el
arroyo La Zanja, pertenecientes a la cuenca del Rio Soto la Marina; no existen corrientes
perennes dentro de la sierra (Treviño et al., 2002).
5.3. El proceso de elaboración del mezcal
5.3.1. Selección de la planta
El agave tarda entre 8 y 10 años en madurar y es cuando se cortan o “jiman” las pencas y
las raíces hasta dejar el centro del maguey al descubierto, a esta forma de maguey se le
conoce comúnmente como piña, dependiendo del tipo de Agave y la forma de corte, cada una
llega a pesar cien o más kilos (Figura 1).
Es necesario observar ciertas características tales como coloración verde-amarillenta en la
base de las pencas y parda en la base del Agave, así como la presencia de pencas secas en esta
zona. Desde el punto de vista bioquímico, el estado de madurez apropiado lo marca un alto
contenido de azúcares que puedan ser aprovechados por los microorganismos para la
generación de alcohol (Jaques et al., 2004; Ramales et al., 2002; Salvatierra, 2003).
27
Figura 1. (A). Planta silvestre de Agave spp. (B) Piñas
de agave
5.3.2. Cocción de las cabezas de agave
En Tamaulipas el proceso de elaboración de mezcal es rustico, en la cocción de las piñas
de agave se usan pozos cónicos de piedra y tierra construidos para trabajar 800 kg
aproximadamente (Gómez et al., 2004). El proceso inicia haciendo una oquedad en el suelo,
en donde se coloca leña y se recubre con piedras refractarias al calor, se hacen llegar al rojo
vivo (800 a 1000 °C aproximadamente), después se colocan las piñas, se cubren con costales
y tierra (Figura 2). Es importante cuidar la temperatura y el tiempo de tapado ya que
repercuten en el sabor de mezcal, quemado en caso de estar muy caliente el horno o ahumado
en caso de un mal tapado. La temperatura óptima del horno se define en base a la experiencia
del procesador, apoyada en el tiempo de combustión de la leña. El horneado tiene una
A
B
B
28
duración aproximada de tres días, esto es cuando la piña cambia del color blanco a color
caramelo.
Figura 2. Pozos de cocimiento tradicionales: (A) Horno
natural recubierto de piedra. (B) Piñas cocidas.
Con este proceso se logra la hidrólisis de los fructanos, principal producto fotosintético
en la planta de Agave, estos son polímeros solubles de fructosa con generalmente una glucosa
por molécula. Esta reportado que existe más de una estructura en la familia Agavácea (Sims et
al., 2001), en el Agave tequilana y el Agave americana la principal fuente de almacenamiento
de carbohidratos es la inulina (Sánchez et al., 1953). La molécula de inulina es un fructano
con un enlace tipo ß (2 1) compuesta por más de 30 unidades de D-fructosa unidas por
enlaces glucosídicos; su hidrólisis produce además de fructosa (100 a 140 g/L dependiendo de
la especie) 5 a 6 % de moléculas de glucosa; la inulina se hidroliza por los ácidos y por la
B
A
B
29
enzima, es soluble en agua, levógira, no da color con el yodo y no tiene poder reductor.
(Babor and Aznárez, 1977; Gómez et al., 2004; Aguilar et al., 2007).
5.3.3. Molienda
En la siguiente fase los pedazos de cabezas se desmenuzan y pasan a la molienda, usando
un molino o “trapiche” vertical metálico accionados por tracción animal o mecánico (Figura
3). El mosto obtenido se coloca en tinas de fermentación, a través de canaletas ubicadas
generalmente al ras del suelo.
Figura 3. Molino o “trapiche” metálico adaptado en
forma transversal, accionado por tracción animal.
5.3.4. Fermentación
En la fermentación del mosto se usa como inóculo residuos de fermentaciones anteriores,
se lleva a cabo en tinajas de madera o metálicas (Figura 4) donde fermenta en forma natural y
a la intemperie durante cinco a nueve días (dependiendo de la temperatura ambiente, la cual
oscila entre los 25°C y 42°C). Los procesadores dan por terminado el proceso cuando cesa la
generación de espuma. En la fermentación natural del mosto de agave participan e
interaccionan secuencialmente un complejo grupo de microorganismos. En lo que se refiere a
las levaduras, el origen de estos microorganismos puede ser la superficie de los agaves o el
ambiente de las tinajas de fermentación, hasta las moscas que rondan la molienda sin ningún
30
tipo de inoculación externa; esta situación causa que las fermentaciones no sean producto de
una sola especie o cepa de levadura, sino de una biodiversidad de especies y cepas diferentes
a lo largo del proceso. Se tiene la certeza de que en la etapa final invariablemente dominan las
levaduras resistentes a altas concentraciones de alcohol comúnmente Saccharomyces
cerevisiae. Es indudable que la calidad del mezcal está directamente relacionada con la
microflora típica nativa del proceso fermentativo.
Figura 4. Tinajas de fermentación de mostos de agave
5.3.5. Destilación
Al terminar el proceso de fermentación los mostos cocidos se pasan hacia los alambiques
de destilación (Figura 5). Aquí la mezcla se calienta en el alambique evaporándose y
condensándose lentamente a través de un serpentín que deposita su contenido en un
recipiente; el producto de la fermentación es destilado en tres partes, la cabeza y la intermedia
A
B
31
son generalmente redestiladas, obteniéndose así un producto con mayor porcentaje de alcohol
(aproximadamente 55 % en volumen) y una tercera parte llamada “cola” es desechada.
Empíricamente para conocer el grado alcohólico los productores usan un carrizo y una jícara
donde vierten el mezcal, cuando se forman burbujas se entiende que el mezcal es de calidad.
Este proceso ha sido muy poco estudiado, considerando que es el último paso que define la
calidad de la bebida.
La Norma NOM-070-SCFI-1994 para el mezcal establece los límites máximos y mínimos
de concentración permitidos en la bebida (Tabla I), pero en estudios anteriores se observó que
existe una gran variedad de componentes volátiles en el mezcal, sin embargo, solamente
algunos de ellos están bajo regulación oficial. Como es esperado, el etanol es el componente
de mayor abundancia en el mezcal, ya que este compuesto es el resultado de la
biotransformación de la azúcar por los microorganismos durante la fermentación (Salmon,
2005; Suarez et al., 2006; Arrizon et al., 2006).
Figura 5. Serpentín usado en destilación de mezcal
Análisis realizados en mezcal por micro extracción de fase solida- cromatografía de gases-
espectrometría de masas (SPME-GC-MS) mostraron la presencia de alcoholes como metanol,
el cual es producido durante la fermentación alcohólica a por la biodegradación de la pectina
y la lignina de la pared de las células vegetales; asimismo se encontraron etanol, metanol, n-
propanol, 2-butanol, 2-metilpropanol y mezcla de 2/3 metil-1-butanol, producidos por el
catabolismo de los amino ácidos (Lachenmeier et al., 2006; De León-Rodríguez et al 2006).
Del mismo modo fueron identificado nueve clases de terpenos (α-phellandrene, α -terpineno,
p-cimeno, limoneno, α -trans-ocimene, linalool, 4-terpineol, geraniol, and trans-nerolidol) se
32
ha reportado que estos terpenos son liberados por las β-glucosidasas por las levaduras durante
el proceso de la fermentación. Asimismo ha sido detectado furfural y 5-metilfurfuraldehído, al
igual que la presencia de ésteres en su mayoría de etilo, los cuales son los responsables del
aroma afrutado en bebidas alcohólicas, como el caso de hexanoato de etilo y octanoato de
etilo (olor a manzana). Igualmente se observó la presencia de alcoholes aromáticos
importantes como el feniletanol, que confiere un aroma floral (Escalante et al., 2006;
Lachenmeier, 2006, Molina et al., 2007) otro compuesto que también se encuentra en los
mezcales son el acido acético, acetato de etilo y etil-2-hidroxipropanato (León et al., 2006,
Vera et al., 2009). La presencia de componentes minoritarios juega un papel muy importante
en la bebida ya que le confiere propiedades organolépticas específicas que varían
notablemente con la edad de maduración. Cabe mencionar que la concentración de metanol en
conjunto con los alcoholes superiores es un indicativo de que la bebida no se encuentre
diluida o adulterada (Lachenmeier, 2006).
5.3.6. Envasado
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana sobre bebidas alcohólicas, los mezcales se
clasifican en tres tipos basados en el tiempo de maduración después de la destilación. Los
mezcales jóvenes son embotellados justo después de la destilación, los reposados permanecen
de 2 a 6 meses en barricas para su estabilización, mientras que los añejos son sujetos a un
proceso de maduración de por lo menos 1 año. Durante este tiempo el mezcal adquiere color
ámbar y sabor característico.
5.4. Microbiología del proceso de fermentación
Bioquímicamente en la fermentación los azúcares son transformados a etanol y otros
compuestos como alcoholes con tres o más átomos de carbono y ésteres. En general las
propiedades organolépticas de una bebida alcohólica son determinadas por la composición de
una mezcla de alcoholes, ésteres, y otros compuestos como terpenos provenientes de la planta.
Es decir, la variedad de compuestos organolépticos generados en la fermentación, depende del
tipo de microorganismo, de la materia prima y de las condiciones de fermentación (Berry et
al., 1987; Lachenmeier et al., 2006).
33
A diferencia del mezcal, la dinámica de la flora responsable del proceso fermentativo del
mosto en bebidas como el tequila (Arrizon et al., 2002, 2007), pulque (Estrada et al., 2001), y
vinos de mesa ha sido objeto de numerosos estudios (Pretorius, 2001; Abdel et al., 1999). En
tequila la identificación de levaduras nativas se encontró que en el agave fresco la microbiota
estaba dominada por Clavispora lusitaniae y especies endémicas como Merschnikowia
agavaveae, en Drosophila spp encontradas alrededor o dentro de la destilería se identificó
Hanseniaspora spp., Pichia kluyveri y Candida krusei., en melazas Schizosaccharomyces
pombe, en agave cocido y mostos una considerable diversidad de especies incluida
Saccharomyces cerevisiae, en mostos fermentados se encontró baja la heterogeneidad de
especies, encontrando al inicio de la fermentación a Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces
marxianus y Hanseniaspora spp, progresivamente en el tiempo se encontró a S. cerevisiae,
Zygosaccharomyces bailii, Candida milleri y Brettanomyces spp., concluyendo que la
principal fuente de inóculo para el proceso de fermentación son los tanques de fermentación
(Arrizon et al., 2002).
En pulque, han sido aisladas las levaduras Candida lusitaneae, Kluyveromyces marxianus
var. Bulgaricus, Saccharomyces cerevisiae (capensis), C. valida, S. cerevisiae (chevalieri) y
K. marxianus (lactis) (Estrada et al., 2001).
En la fermentación espontánea del mezcal se han encontrado microorganismos como
Candida spp., C. magnolia, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum, H. vinae, K.
marxianus, P. membranifaciens, T. delbrueckii, Candida parapsilosis, Clavispora lusitaniae,
Debaryomyces hansenii, Pichia caribbica, P. guilliermondii, y S. cerevisiae (Jaques et al.,
2005; Oliva, 2007; Cáceres et al., 2008).
En vino blanco, elaborados a partir de la variedad de uva “Rovello bianco” se encontraron
levaduras nativas del genero de S. cerevisiae, Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia spp.,
Candida, Pichia, Torulaspora y especies de Cryptococcus flavescens (Francesca et al., 2009).
En otro estudio, se aislaron levaduras nativas de una fermentación alcohólica se encontraron
microorganismos del genero S. cerevisiae, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum,
Issatchenkia orientalis, Pichia anómala y Kluyveromyces thermotolerans (Clavijo et al.,
2011). En vinos espumosos, se han realizado estudios sobre la influencia de cepas de
Saccharomyces cerevisiae en la formación de compuestos volátiles en la fermentación
(Pretorius, 2001; Abdel et al., 1999). Para optimizar la producción de vino y otras bebidas
34
fermentadas se han manipulado genéticamente cepas de Saccharomyces cerevisiae, se sabe
que esta levadura interviene en la fermentación y calidad; de tal forma que se han introducido
o eliminado características genéticas con la finalidad de que la cepa intervenga en el proceso
de fermentación afectando de manera deseable la producción del vino (influyendo en los
cambios de acidez volátil, sabores y olores agradables), no obstante este tipo de levaduras
están prohibidas en Europa y en Australia, sin embargo, en Canadá o Estados Unidos están
totalmente permitidas (Querol et al., 1990; Pérez et al., 1999; Pretorius, 2001).
5.4.1. La levadura Saccharomyces cerevisiae
Las levaduras del género Saccharomyces pertenecen al phylum Ascomycota, clase
Hemiascomycetes, orden Saccharomycetales y familia Saccharomycetaceae. El género de
Saccharomyces está compuesto por las especies S. cerevisiae, S. arboricola, S. bayanus, S.
cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus y un hibrido S. pastorianus (Naumov et
al., 2000, 2003; Kurtzman et al., 2003; Wang et al., 2008, Scanell et al., 2011).
Particularmente la especie Saccharomyces cerevisiae constituye el microorganismo
eucariota más estudiado por su importancia en la elaboración de alimentos, como en la
panificación y bebidas como vinos (Barnett, 2000). La palabra Saccharomyces proviene del
latín saccharum (azúcar) y mykes (hongo), mientras que cerevisiae de cerevisia (cerveza) y es
un hongo levaduriforme que presenta células alargadas globosas, elipsoidales con gemación o
blastoconidios multilaterales, con ascos con hasta cuatro ascosporas esféricas o elipsoides y
de pared lisa en su interior. Las colonias crecidas en PDA (Agar papa dextrosa) son cremosas
y blandas (Barnett, 2000). El crecimiento vegetativo es la forma principal de reproducción de
S. cerevisiae, este tipo de reproducción asexual se lleva a cabo por gemación y envuelve la
división mitótica de núcleos haploides. La reproducción sexual es una alternativa de cuando
faltan nutrientes, la levadura es inducida a esporular y finalmente a propagarse por la
segregación de cuatro esporas haploides (Saba et al., 1997).
La levadura S. cerevisiae posee un genoma pequeño, esto simplifica de manera importante
el análisis genético y molecular del mismo (Dujon, 1996). A diferencia de los genomas de
organismos multicelulares, el genoma de la levadura es muy compacto, dado que el 72% de la
secuencia corresponde a secuencias codificantes. El tamaño promedio de los genes de
35
levadura es de 1.45 kb, o 483 codones, y solamente el 3.8% de los ORFs contienen intrones.
Aproximadamente el 30% de los genes se han caracterizado experimentalmente; y del 70%
restante, cuya función no se conoce, aproximadamente la mitad contiene al menos un motivo
de algún tipo de proteínas ya caracterizadas, o corresponden a genes que codifican para
proteínas estructuralmente relacionadas con productos génicos ya caracterizados en levadura
o en otros organismos (Pandey y Mann, 2000). En S. cerevisiae el ARN ribosomal se
encuentra codificado por 120 copias repetidas y arregladas en tándem en el cromosoma, en
tanto que existen 262 genes que codifican para ARNs de transferencia, 80 de los cuales
poseen intrones. Los cromosomas contienen elementos movibles, retrotransposones, que
varían en número y posición en las diferentes cepas de S. cerevisiae, aún cuando la mayoría
de las cepas de laboratorio poseen aproximadamente 30 elementos (Pandey y Mann, 2000).
En el ADN ribosomal tanto en S. cerevisiae, como en las demás especies de levaduras y
hongos, hay cuatro genes, el gen 5S, 5.8S, 18S y 26S, estos se encuentran agrupados en
repeticiones a lo largo del cromosoma XII y son regiones altamente conservadas en todas las
especies de levaduras. Los genes 18S y el 26S se encuentran separados uno de otro por
espacios transcritos internos (ITS) y espacios íntergénicos (IGS). Las secuencias de ITS e IGS
pueden ser fácilmente amplificadas por PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) usando
oligonucleótidos homólogos a estas. En S. cerevisiae al igual que en otras especies de
levaduras, estas secuencias han sido ya obtenidas, de manera tal que estos estudios son en
gran medida útiles para identificación, hacer análisis de filogenia y diversidad genética entre
las especies de levaduras (Montrocher et al., 1998; Esteve et al., 1999; Hauser et al., 2001;
Naumova et al., 2003). La digestión de los segmentos ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 con
enzimas de restricción, es una importante herramienta en la diferenciación de especies de
levaduras S. cerevisiae a otros géneros presentes en una fermentación espontanea, no obstante
la comparación entre un perfil y otro obtenido de la misma especie requiere de análisis
bioquímicos y moleculares más puntuales para diferenciarlas entre sí (Hierro et al., 2005;
Nisiotou et al., 2007).
5.4.2. La fermentación alcohólica por S. cerevisiae.
En la fermentación alcohólica espontanea tradicional, participa un complejo grupo de
microorganismos nativos o autóctonos que interaccionan entre sí a lo largo del proceso, la
levadura S. cerevisiae tiene un rol central dentro de este proceso; generalmente se obtiene una
36
bebida alcohólica con características particulares de los insumos usados, la mano de obra que
lo procesa, las condiciones climáticas y geográficas de la región; atribuyéndole una gran
variabilidad organoléptica y química entre una fermentación y otra.
La levadura Saccharomyces sp. ha sido seleccionada por su habilidad de fermentar rápida
y eficientemente los mostos de uva los cuales contienen altas concentraciones de azúcar, por
su resistencia a alta concentraciones de etanol y al dióxido de sulfuro y la capacidad de
supervivencia a elevadas temperaturas durante las fermentaciones produciendo así
fermentaciones controladas mejorando la calidad y composición química del vino (Puig et al.,
2000; Querol et al., 2001; Serra et al., 2006).
Las levaduras presentan la tendencia a utilizar iones de amonio como única fuente de
nitrógeno por lo que el amoniaco y sales amónicas, parecen ser las fuentes más adecuadas de
nitrógeno por su fácil disponibilidad y bajo precio (Prescott et al., 1962). El (NH4)2SO4 es la
fuente más favorable ya que provee un beneficio nutricional adicional, como una fuente de
azufre (Pinal et al., 1997; Taillander et al., 2006). Sánchez et al., (1953) recomendaron el uso
de sulfato de amonio como una fuente de nitrógeno, en la fermentación del agave para la
producción de tequila para favorecer la producción de alcohol. En otro estudio se observo el
efecto de la concentración del ion amonio en la producción de alcohol, y encontraron que la
producción de etanol fue alta cuando el sulfato de amonio estuvo presente a concentraciones
equivalentes de 750 a 1000 mg N/L (Terán et al., 2002). En agaves o magueyes el contenido
de nitrógeno es bajo, con promedio de 0.02% a 0.03%, en el caso del A. tequilana Weber
variedad azul (Sánchez, et al., 1953), y mayor de 0.37% en el caso del A. angustifolia Haw
(Sánchez, 1985), por lo cual, los niveles de nitrógeno pueden ser críticos durante la
fermentación. La falta de nutrientes para la levadura especialmente, la deficiencia en
nitrógeno, provoca fermentaciones lentas (Casey et al., 1984).
Uno de los factores de mayor impacto en una fermentación espontanea es la alta
variabilidad en las poblaciones de S. cerevisiae (Martínez et al., 1989; Esteve et al., 2001;
Suarez et al., 2006), los resultados genéticos sugieren que las diferentes cepas derivan unas de
otras por mutación, como lo son los rearreglos cromosomales adquiridos por las numerosas
divisiones mitóticas; todo esto tiene lugar debido al proceso gradual de adaptación a las
condiciones de vinificación (Naumov et al., 1996; Polsinelli et al., 1996; Puig et al., 2000;
Fleet et al., 2003).
37
Desde 1930 han sido utilizados los cultivos líquidos de levadura vínica (Instituto Laclaire,
Francia), mientras que las levaduras vínicas secas no se originaron hasta mediados de los años
cincuenta utilizándose como inoculo en fermentaciones dirigidas (Rainieri et al., 1998;
Querol et al., 2001).
5.4.3. Tolerancia al estrés ambiental de S. cerevisiae y la producción de etanol
Las habilidades de las células de levadura para detectar y responder a las condiciones
ambientales de estrés son importantes ya que estas afectan directamente la viabilidad de la
célula, los mecanismos de respuesta al estrés responden a moléculas sensoras y señales en las
rutas de transducción las cuales determinan cambios en los niveles de mRNA para cerca de
900 genes (Bauer y Pretorius, 2000; Estruch, 2000; Gasch et al., 2000; Hohmann y Mager,
2003). Como un factor de estrés para la sobrevivencia y el crecimiento de las levaduras,
pueden considerarse el estrés osmótico debido a las altas concentraciones de azúcar al inicio
de una fermentación (glucosa y fructosa en los mostos de uva varía entre 125 y 250 g/L)
(Carrasco et al., 2001), un pH bajo (3.5 a 3), de acuerdo al progreso de la fermentación la
acumulación en las concentraciones de alcohol y acetaldehídos, la temperatura alta o baja ya
que la tasa de crecimiento en las levaduras decrece rápidamente dañando la membrana celular
y desnaturalizando ciertas enzimas (Beloch, 2008; Cardona et al., 2007; Salvado et al.,
2008), así como la limitación de nutrientes, y el estrés oxidativo debido al metabolismo
respiratorio.
En una fermentación vinícola, el mosto es preparado con uvas maduras, consecuentemente
con una alta concentración de azúcar. Estas concentraciones de azúcar producen vinos con
altos niveles de etanol, algunas veces por encima del 15% (v/v) (De Barros et al., 2003). En
las fermentaciones espontaneas las levaduras que participan presentan un patrón progresivo de
crecimiento hasta el estado estacionario cuando los niveles de etanol son de 3-4% (Fleet el al.,
1993), pero los estados finales de una fermentación natural invariablemente son dominados
por especies de levaduras alcohol tolerantes como la S. cerevisiae (Campbell, 2003;
Zuzuarregui et al., 2004).
38
5.5. Transporte de hexosas a través de la membrana celular en S. cerevisiae
La plasticidad en la expresión de un gen es determinante en la adaptabilidad; una de las
manifestaciones fundamentales de esta capacidad es la habilidad de las células a usar
diferentes fuentes de carbono. Esto es consecuencia de un complejo grupo de sensores y rutas
de señalización que lideran la expresión de transportadores y enzimas metabólicas.
En la naturaleza S. cerevisiae tiene la capacidad de adaptarse un amplio rango de fuentes
fermentables y no fermentables de carbono (L-azucares, etanol, acetato, glicerol, etc.). La
glucosa es la fuente de energía más utilizada en las células; en respuesta a esta fuente de
carbono existe una matriz compleja en las rutas de las señales de transducción coordinadas
con diversas respuestas metabólicas, como por ejemplo la glucólisis, la disminución de la
actividad respiratoria, el incremento de la biogénesis de los ribosomas, además de la
regulación en el crecimiento y desarrollo.
El primer paso en el catabolismo exógeno de la fuente de carbono es usualmente el
transporte de la molécula a través de la membrana celular; los genes HXT (transportadores de
hexosas) son los encargados de la expresión de las proteínas que facilitan la difusión de
glucosa, fructosa y otros azucares a través de la membrana (Yin et al., 2003; Flick et al.,
2003). Las proteínas HXT pertenecen a la súper familia de facilitadores MFS, se ha
encontrado que para S. cerevisiae existen 17 familias potenciales, estas proteínas son capaces
de transportar pequeñas cantidades de solutos a través gradientes quimiostáticos, asimismo de
equilibrar los sustratos a través de la membrana en ambas direcciones (Nelissen et al., 1997;
Saier et al., 2000; Bannam et al., 2004).
La secuencia y los análisis bioquímicas de diversas MFS sugieren que están compuestos de
12 segmentos transmembranales (TMs) de estructura tipo α-hélice, seis hélices están
localizadas fuera de la membrana citoplasmática y 6 hélices dentro, formando un canal que
facilita el transporte bidireccional del sustrato (Hirai et al., 2002). Las proteínas HXT son
similares en su secuencia amino terminal y trabajan independientemente, facilitando los
mecanismos de difusión y exhibiendo diferentes afinidades por los diferentes sustratos
(glucosa, fructosa, manosa y/o galactosa). La modulación de la afinidad de los transportadores
de hexosas HXT por una u otra fuente de carbono y a interacción entre ellos puede contribuir
a la habilidad de adaptación a las diferentes concentraciones del azúcar por las células de
39
levadura (Saloheimo et al., 2007). En S. cerevisiae la expresión de los genes HXT se regula a
través del balance de dos rutas opuestas, represión e inducción las cuales son reguladas o
inhibidas respectivamente por glucosa. Existen 18 genes que codifican para proteínas
transportadoras de hexosas HXT1 a HXT17, GAL2 (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001;
Ferrer et al., 2004). En S. cerevisiae hay dos sistemas de transporte, uno constitutivo que es
un sistema de baja afinidad (Km 15 a 20 mM) y uno represivo de glucosa que es un sistema
de alta afinidad (Km 1 a 2 mM).
En investigaciones realizadas encontraron que una cepa mutada en los genes HXT1 al
HXT7 no fue apta para crecer en glucosa, fructosa ni manosa y no presento flujo glucolítico.
Con estos estudios determinaron que HXT2, HXT6 y HXT7 son genes que expresan proteínas
transportadoras de hexosas de alta afinidad la presencia de cualquiera de estos genes es
suficiente para que la cepa mutante crezca en una baja concentración de glucosa (0.1%). Los
genes HXT1, HXT3 y HXT4 son genes que codifican para transportadores de baja afinidad, y
su presencia es suficiente para que la cepa mutante crezca en altas concentraciones de glucosa
(más del 1%). Los genes HXT8 al HXT17 codifican para proteínas que son incapaces de
transportar glucosa (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001; Yin et al., 2003).
5.5.1. Regulación transcripcional en S. cerevisiae: señalización por glucosa
La regulación de la concentración de hexosas en las células de levadura, es mediante la
expresión de los genes HXT vía señalización desde receptores de baja y alta afinidad de
glucosa (Ozcan et al., 1999, 2002; Flick et al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006). El gen
SNF3 codifica una proteína situada en la membrana citoplasmática (Snf3p) que censa bajas
concentraciones de sustrato, en cuanto a hexosas se refiere, esta activa la inducción de un
grupo de transportadores de hexosas de alta afinidad, la deficiencia de la proteína lleva a una
pérdida de los transportadores. Snf3p es requerida para la inducción de los genes HXT2,
HXT3 Y HXT4 (Flick et al., 2003; Ozcan et al., 1999). El gen RGT2 codifica Rgt2p (proteína
censora de altas concentraciones de glucosa) está situado en la membrana citoplasmática, este
requerido para la expresión máxima de la inducción del gene HXT1 (Ozcan, 1996, 1999).
El alto grado de similitud entre Snf3 y Rgt2 sugiere que ambas proteínas censan glucosa de
una forma similar y pueden actuar sobre las mismas proteínas o similares para transmitir la
señal de glucosa. Tanto Rgt2p como Snf3p, tienen un 70% de homología entre ellos y un 30%
40
con otros miembros de la familia HXT. Como se menciono anteriormente, no transportan
glucosa pero sirven como sensores extracelulares de glucosa, fructosa y manosa generando
una señal intracelular de inducción que no requiere del transporte o metabolismo de la
glucosa para la expresión de HXT (Dietvorst et al., 2009). Ambas proteínas, están
constituidas por dos diferentes dominios: 12 dominios transportadores transmembranales y un
dominio C-terminal la cual se predice esta en el citoplasma; Snf3 tiene dos secuencias de 25
aminoácidos y Rgt2p solo una, aparentemente esta terminación es la responsable en la
generación de la señal de la expresión de los genes HXT. Se ha sugerido que el cambio
conformacional inducido por la unión de la glucosa al dominio transmembranal, afecta el
dominio C-terminal y la forma en cómo interacciona con otros componentes se sugiere que
probablemente sirve como un dominio de señalización que interactúa con los componentes
cercanos en la ruta de la señal de transducción (Ozcan et al., 1996, 1999; Lafuente et al.,
2000).
5.5.2. El represor transcripcional RGT1
El controlador final en la ruta de traducción en la señal de glucosa es RGT1, ruta la cual
inicia con el sensado en la superficie de la membrana y termina en el núcleo, regulando la
expresión de los transportadores de glucosa. RGT1 pertenece a la familia GAL4 de factores
de transcripción, es requerido para la represión transcripcional de HXT1-HXT4 en ausencia
de glucosa; este gen codifica para un represor transcripcional, Rgt1p, una proteína que
contiene un grupo Zn2Cys6 responsable de la unión al ADN, la cual reconoce varios sitios de
unión a los promotores de los genes HXT ya que un solo sitio de unión no es suficiente para
una represión significativa (Ozcan et al., 1999; Kim et al., 2003; Flick et al., 2003). La
función de Rgt1p es regulada por una interacción intramolecular entre la región-N terminal y
la región media de RGT1, se sugiere que esto inhibe la unión al DNA con el dominio de
RGT1 (Dombek et al., 2004). RGT1 sirve también como activador transcripcional y es
requerido para la completa expresión del gen HXT1 cuando los niveles de glucosa son altos,
aunque la forma en cómo se convierte de represor transcripcional a un activador no es clara
aun. Lo cierto es que el nivel de glucosa determina el estado de fosforilación de Rgt1p; esta
hipofosforilado en ausencia de glucosa e hiperfosforilado cuando los niveles de glucosa son
altos (Lafuente et al., 2000; Kim et al., 2006).
41
En ausencia de glucosa Rgt1p, en conjunto con Mth1, un regulador negativo en la
señalización de glucosa y Std1p una proteína involucrada en el control de la regulación de
glucosa, se une a los promotores de los genes HXT y a los correpresores transcripcionales
Ssn6 y Tup1, esto estabiliza el dominio represivo en la cromatina e inhibe directamente a la
RNA polimerasa reprimiendo la expresión de los genes HXT (Lafuente et al., 2000; Flick et
al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006).
En presencia de glucosa, cuando la señal es generada por Snf3 y Rgt2, es transmitida a
Rgt1 a través de Grr1, inhibiendo la represión transcripcional de Rgt1, aunado a la
degradación inducida por glucosa de Mth1 y Std1, permitiendo que los genes HXT se
expresen (Kim et al 2003, 2006; Ramakirshnan et al., 2006). En la activación por glucosa la
PKA (cAMP-proteinquinasa) cataliza la fosforilación de Rgt1 inhibiéndolo, permitiendo la
expresión de los genes HXT. La PKA está involucrada en diversos procesos celulares, entre
los que se encuentra el crecimiento celular, resistencia al estrés y en el metabolismo en
general. Diversos estudios han demostrado que las células de levaduras deficientes en PKA no
son capaces de expresar los genes HXT1 y HXT3 en presencia de glucosa (Lafuente et al.,
2000; Polish et al., 2005; Kim et al., 2006; Belinchon et al., 2006).
5.5.3. Las proteínas Grr1, Hxk2 y Reg1
La represión en la expresión de los genes HXT en presencia de glucosa requiere de la
proteína Grr1p, una proteína que se expresa constitutivamente a muy bajos niveles y
pertenece al complejo SCF (Skp1/cullin/F-box) cada una de las cuales poseen diferentes
componentes F-box. La naturaleza de la proteína F-box determina la especificidad de la
interacción con el complejo de enzimas de ubiquitinación (Ubcs) y su blanco. Grr1 se une a
los sustratos en la proteólisis mediante ubiquitinación, esta incluye un motivo carboxilo
terminal capaz de interaccionar proteína-proteína, unido así Rgt1 con Grr1 se elimina la
interacción con el correpresor dando lugar a una activación transcripcional (Hsiung et al.,
2001; Flick et al., 1991, 2003; Vallier et al., 1994). En ausencia de glucosa, Rgt1 está
presente en la forma no-ubiquinada y actúa como represor al unirse a Ssn6 y Tup1, proteínas
que forman un complejo correpresor que reprime la transcripción de algunos genes
interaccionando directamente con las histonas H3 y H4 (Watson et al., 2000; Davie et al.,
2003; Zhang et al., 2004; Fagerstrom-Billai et al., 2007).
42
La levadura S. cerevisiae es capaz de detectar los niveles extracelulares de glucosa y
generar señales intracelulares que resultan en respuestas adecuadas a las variaciones en la
composición del medio; la mayoría de estas respuestas involucran alteraciones en la expresión
de los genes, una parte de estas alteraciones ocurren por los niveles de trascripción del
mARN, por la represión o activación en la trascripción de diversos genes implicados en la
codificación de enzimas en el metabolismo de carbono; entre estas se encuentra una
isoenzima hexoquinasa 2 (Hxk2). Cuando las células de la levadura están creciendo en un
medio fermentable compuesto por glucosa, fructuosa o manosa como fuente de carbono, el
gen HXK2 codifica la enzima Hxk2p, la cual cataliza la fosforilación de glucosa en el carbón
6 en el citosol. Se encontró que la interrupción del gen HXK2 tuvo un profundo efecto en las
transcripciones de genes relacionados con el ciclo TCA (Ciclo de los ácidos tricarboxílicos o
de Krebs), al igual que en la tasa de respiración, y en la síntesis de ATP. Al realizar la cinética
de producción de etanol con la mutante hxk2-delta presentó una menor producción que la
cepa que no tenía interrumpido el gen HXK2. Hxt2p juega un rol específico durante la
señalización de glucosa ya que es requerida para la represión de algunos genes por glucosa, es
específicamente requerida para una fuerte inducción de HXT1 por altas concentraciones de
glucosa y para HXT4 en bajas concentraciones (Belinchon et al., 2006; Westergaard et al.,
2007). Hxk2 depende de la cantidad de Mig1 presente en el núcleo, Moreno et al. (2005)
analizaron la interacción tanto in vivo como in vitro de Hxk2-Mig1; encontraron que el
complejo es necesario para la translocación de Mig1 al núcleo. Dilucidaron que el mayor
funcionamiento de Mig1 en inhibir la función de la proteinkinasa Snf1 cuando la bloquea por
fosforilación. Mig1 en un factor involucrado en la represión transcripcional de glucosa, que
tiene una secuencia especifica de unión al ADN y es regulado por SNF1 (serinproteína/treonin
quinasa) y GLC7 fosfatasa (Nehlin et al., 1990; Verma et al., 2005). De la Cera et al. (2002)
demostraron que HXK2 Y MED8 están asociados fisiológicamente ya que ambas proteínas
Hxk2p y Med8p se encuentras interaccionando juntas en las uniones con los segmentos de
DNA que contienen los sitios MED8, concluyeron que Hk2p opera a través del sitio MED8
por interacción con Med8p, en la traducción en la ruta de señalización de glucosa en
Saccharomyces cerevisiae. MED8 es una subunidad mediadora del complejo de la ARN
polimerasa II cuando actúa como represor previene que la polimerasa se una al promotor,
cuando actúa como activador se une a la polimerasa e incrementa la afinidad con el promotor
o simula la transición de cerrado a abierto complejo promotor-polimerasa (en la burbuja de
trascripción en la cual la doble hélice de ADN se une para facilitar el inicio de la trascripción)
(Kornberg et al., 2005; Westergaard et al., 2007). Otra proteína que participa en el proceso
43
inhibidor de los genes represivos es Reg1p, una proteína magnesio dependiente serin-treonina
fosfatasa (AMD fosfatasa) contiene una subunidad catalítica de 38 kDa y una subunidad
moduladora de 23KDa, tiene actividad fosfatasa. Reg1p interacciona fuertemente con Glc7p,
una proteinfosfatasa tipo-1 que participa en diferentes procesos que incluyen represión de
glucosa, crecimiento celular y acumulación de glicógeno. Reg1 interacciona a través de Glc7p
con el dominio kinasa de Snf1p resultando la desfosforilación e inactivación de Snf1p y de
algunos genes involucrados en la represión de glucosa. Esta interacción juega un rol
importante en el transporte de Fbp1p (fructosa 1-6 bifosfatasa) como intermediario de
importación y degradación de las vesículas a las vacuolas durante la inducción de glucosa
(Tung et al., 1992; Cui et al., 2004; Kenneth et al., 2004).
5.6. La regulación de los genes HXT1 y HXT3 por glucosa/fructosa
La forma en la que los genes HXT son regulados transcripcionalmente, esto es por
proteínas que se unen a secuencias reguladoras de ADN, en respuesta a glucosa es consistente
con su función de alta o baja afinidad. (Ozcan et al., 1999; Reifenberger et al., 1997.). Estos
genes exhiben diferentes tipos de regulación por glucosa: El gen HXT1, localizado en el
cromosoma VIII, (Figura 6) se expresa en concentraciones mayores al 1% de glucosa o
fructosa; la expresión máxima de este gen es durante la fase lag y la fase temprana-
exponencial de crecimiento de la levadura (Ozcan et al., 1995; Greatrix et al., 2006). La
pérdida del gen HXT1 resulta en la disminución del transporte de glucosa y manosa pero no
de fructosa, sugiere que esta proteína puede ser específica para las aldohexosas. Se sabe que
Hxt1p funciona como transportador de baja afinidad para xilosa, cerca de 10 veces más que
para glucosa (Lewis et al., 1991; Saloheimo et al., 2007). La secuencia de HXT1 es de 1,707
nucleótidos, posee un marco de lectura abierto que codifica para 569 aminoácidos y una
proteína de 64,044 Da. La proteína Hxt1 es altamente hidrofóbica (de acuerdo al análisis de
hidrofobicidad de Kyte-Doolittle) contiene dos grupos de seis dominios hidrofóbicos
separados por un giro de 68 aminoácidos hidrofóbicos, una región con 59 aminoácidos
hidrofilicos N-terminal y 58 aminoácidos del dominio C-terminal (Lewis et al., 1991), esta
proteína es la única que tiene 200 sitios de glucosilación, cuatro sitios hipotéticos de
glucosilación están situados en la región N-terminal Asn2,14,36,42 y uno más en TM5 Asn277.
Esta proteína no contiene motivos PEST (sitios potenciales proteolíticos de unión,
Szkutnickaet al., 1989; Lewis et al., 1991). Como se muestra en la figura 6, Rgt1 es represor
de la expresión de HXT1 en ausencia de glucosa. En presencia de glucosa Rgt1 es
44
hiperfosforilado y disociado del complejo represor formado por las proteínas Ssn6p y Tup1p,
esto requiere de la presencia de la proteína Grr1p (Ozcan et al., 1999; Flick et al., 2003;
Ferrer et al., 2004). Igualmente en presencia de glucosa por un mecanismo aun desconocido la
proteína Hxk2 interacciona con la proteína Reg1p produciendo una fuerte inducción del gen
HXT1 (Ozcan et al., 1999; Belinchon et al., 2006; Westergaard et al., 2007). HXT3 es un
gen que induce un transportador de glucosa de baja afinidad Hxt3p inducido por bajas o altas
concentraciones de glucosa. La presencia de glucosa por si sola induce la expresión de HXT3
cerca de 10 veces con un valor de Km de 28.65 a 6.8 mM. Está reportado que la expresión de
HXT3 es máxima cuando las células están en fase estacionaria (Ozcan et al., 1995, 1999;
Maier et al., 2002). HXT3 codifica por una proteína de 567 aminoácidos con una masa
molecular de 62 KDa; tiene cuatro secuencias TATA (-111, -177, -265 y -280); el análisis de
hidrofobicidad de la proteína predice que contiene 12 dominios transmembranales; una región
hidrofílica entre TM6 y TM7 de 68 aminoácidos (Ko et al,. 1993).
Figura 6. HXT1 Inducción de la transcripción solo por
alta concentración (Ozcan et al., 1995).
45
Como se muestra en la Figura 7, Rgt1 inhibe la expresión de los genes HXT en ausencia
de glucosa. La proteína Grr1p es requerida para la inhibición de la función de Rgt1. La señal
de glucosa intracelular generada por Snf3 (alta concentración de glucosa) y Rgt2 (baja
concentración de glucosa) es responsable de la inhibición de Rgt1 por Grr1, además de la
inducción y la expresión de HXT3 (Ozcan et al., 1995, 1999). Ko et al. (1993) encontraron
que al restaurar los genes HXT1 y HXT3 en células mutadas fueron capaces de crecer en
condiciones extracelulares bajas en potasio (7mM). En una fermentación alcohólica por S.
cerevisiae la glucosa tiene una tasa mayor de consumo que la fructosa, como en la mayoría de
las levaduras industriales usadas en vinicultura, quedando una alta discrepancia entre el
consumo de las cantidades de las dos azucares, por lo que la habilidad de la levadura para
fermentar la fructosa es de importancia crítica para mantener la fermentación hasta el final del
proceso (Bertheles et al., 2004; Guillaume et al., 2007).
Figura 7. HXT3 Inducción de la trascripción por
glucosa independiente de la concentración de azúcar
(Ozcan et al., 1995).
46
Luyten et al. (2002) encontraron que Hxtp1 y Hxtp3 tienen un rol predominante en las
condiciones enológicas debido a los altos contenidos de glucosa y fructosa, Hxt1p tiene una
función importante durante el inicio de la fermentación, mientras que ha sido evidenciado que
Hxt3 es el único transportador que asegura el perfil normal de fermentación, a demás se
expresa durante todas las fases y presuntivamente responsable de la capacidad de algunas
levaduras de consumir fructosa. Estudios en la levadura Fermichamp, caracterizada como
fructofílica ya que la diferencia entre el consumo de glucosa y fructosa es mucho más
pequeño, revelaron que en el gen HXT3 existen 38 mutaciones en la región codificante, 10 de
los cuales son resultado de sustituciones, encontrando que estas se encuentran en la región
transmembranal nueve y diez (TM9 y TM10) (Guillaume et al., 2007). El flujo metabólico en
la fermentación de la fructosa es muy similar al de la glucosa como lo hemos mencionado
anteriormente y el transporte del azúcar a través de la membrana es el primer factor en la
diferencia de fermentación entre las dos azucares; la segunda causa de discrepancia son los
pasos de fosforilación ya que la glucosa después del transporte es fosforilada por tres enzimas,
la glucoquinasa, la hexoquinasa 1 y la hexoquinasa 2 mientras que la fructosa solo es
fosforilada por la hexoquinasa 1 y la hexoquinasa 2; otro factor importante en el transporte
son las propiedades fisicoquímicas de los azucares, la glucosa es transportada en forma de
piranosa y la fructosa en forma de furanosa (Colville et al., 1993; Bertheles et al., 2004).
En conclusión, la habilidad de degradar el azúcar a etanol y dióxido de carbono (CO2) de
la levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada por los humanos desde
hace miles de años en la fermentación de bebidas alcohólicas. A diferencia de la micoflora
que interviene en el proceso de producción de vino, las levaduras responsables de la
fermentación alcohólica del mezcal no han sido completamente identificadas ni caracterizadas
metabólicamente, ya que el proceso es más bien artesanal; sin embargo, se sabe que la especie
S. cerevisiae, al igual que en el proceso de vinificación, es la más productiva. A nivel
científico y genético la complejidad del sistema de transporte de azúcares no ha sido
estudiado durante la obtención de mezcal, por lo tanto tampoco sus consecuencias a nivel del
proceso de elaboración, mejoramiento y optimización de los procesos de producción, para
realizar la búsqueda de cepas de levaduras con capacidades metabólicas interesantes desde el
punto de vista de utilización y aprovechamiento de residuos agroindustriales.
47
El presente trabajo propone analizar en detalle el proceso de fermentación y obtención del
mezcal, poniendo énfasis, en primer lugar, en la caracterización de los perfiles metabólicos de
las levaduras responsables de la producción de alcohol y metabolitos que le confieren sus
características organolépticas singulares a éste producto; y en segundo lugar, se analizaría
desde el punto de vista molecular la expresión y regulación de los transportadores de hexosas
involucrados en la asimilación de la fructosa, que se sabe es el azúcar principal de los mostos
de agave, y cuya utilización completa determina una mayor productividad del proceso.
La importancia de este trabajo es, en primer lugar, la información científica que se
generaría en cuanto al conocimiento microbiológico (metabólico y molecular) de la
producción de mezcal, el cual es casi inexistente. En segundo lugar, la industria mezcalera
tamaulipeca se beneficiaría, en el corto plazo, con la caracterización precisa del componente
biológico presente en sus procesos, lo cual les permitiría tener un mayor control e
implementar esquemas de optimización y seguimiento de sus procesos. A mediano y largo
plazo podrían contar con un inóculo preciso y único que les garantice la calidad de su
producto, además de la posible aplicación de cepas específicas en la utilización del agave y
otros subproductos agrícolas con una alta concentración de fructosa.
48
6 MÉTODOS
6.1. Aislamiento de levaduras
6.1.1. Diseño del estudio y tamaño de la muestra
La población a estudiar fueron 17 aislamientos (de 103 originalmente aislados) obtenidos
de la mezcalería “El Palmar” del Sr. Emilio Lozoya, situada en San Carlos (Tamaulipas,
México), que se ubica a una altitud 609 m y con coordenadas N 24˚ 43.241’ y W 98˚ 52.934’.
La toma de muestra se efectuó en el horno de cocimiento, directamente de la pared del equipo
y agave cocido; el trapiche (molino) al área de molienda, mostos y bagazo de agave; y en las
diversas etapas de los mostos en fermentación (Figura 8). Como control se utilizó la cepa
Fermichamp ® (DSM) una cepa de vino industrial con capacidad fructofílica.
6.1.2. Tratamiento de la muestra
En cada punto (Figura 8) las muestras fueron homogeneizadas; en el caso de la muestra de
consistencia solida se suspendieron 10 g en 10 mL de solución salina al 0.9%, en las muestras
liquidas se analizaron 15 mL. En ambos casos se realizaron diluciones seriadas con el mismo
diluyente y fueron sembradas en medio AN (Agar nutritivo, DIFCO, Francia), YEPD
(Extracto de levadura 5 g/L; peptona 3 g/L; glucosa 20 g/L; agar 20 g/L con antibiótico
(Kanamicina de SIGMA, Alemania). Los aislados obtenidos fueron cultivaron en medio
YEPD y conservadas en glicerol al 86% manteniéndose a -70 °C.
49
Figura 8. Puntos muestreados en la mezcalería “El
Palmar”. A) Piñas en cocción. B) Trapiche. C) y D)
Mostos en fermentación.
50
6.1.3. Clasificación microscópica
Se realizaron frotis en fresco de los aislados de mostos de mezcal con el fin de observar la
morfología celular. La observación se realizo primero con el objetivo 40X y posteriormente se
tomaron imágenes de las células con campo claro con el objetivo ocular 100X, en un
microscopio BX-51 (Olympus, Japón), y se adquirieron con una cámara de video Hitachi
KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. Las células fueron clasificadas y agrupadas por
su morfología redonda u ovalada.
6.2. Identificación molecular
6.2.1. Extracción de DNA
Se utilizó el protocolo modificado de extracción de ADN propuesto por Raeder y Broda
(1985). Se recolectaron 50-80 mg de células de levadura en un tubo Eppendorf® estéril de 1.5
mL, se sumergieron en nitrógeno liquido por 20 min y se maceraron con pistilos plásticos por
5 min. Fueron agregados 500 µL de buffer de extracción (200 mM Tris HCL pH 8.5; 250 mM
NaCl 25 mM EDTA, 0.5 % SDS) se homogeneizó la muestra e incubó por 5 min a
temperatura ambiente. Para la separación de las fases acuosa, interfase y orgánica se le añadió
500 µL de fenol-cloroformo (50:50 v/v a 4 °C) y se mezcló en el vortex a máxima velocidad
por 5 min. La muestra se centrifugó a 13000 rpm por 30 min y la fase acuosa se transfirió a un
tubo Eppendorf® limpio, donde se adicionaron 400 mL de cloroformo (4 °C), se mezcló
minuto en vortex y se centrifugó durante 5 min. Se recuperó el sobrenadante en un tubo
Eppendorf® estéril y se trató con 8µL de RNAasa (PROMEGA, Estados Unidos) se incubó
por 30 minutos a 37 °C en un block caliente. Posteriormente se le adicionaron 500 mL de
isopropanol frío (-20 ºC). Para ayudar a la precipitación de los ácidos nucleicos la muestra se
colocó a -20 ºC durante 1 h. Los ácidos nucleicos se recuperaron centrifugando a 10,000 rpm
durante 10 min y se colocaron en un tubo Eppendorf®, realizando un lavados con etanol 70
%. La pastilla se suspendió en 50 μL de agua mili-Q estéril. El DNA obtenido se visualizó en
un gel de agarosa al 1.0 %, teñido con SyberGold™ 10 X (Figura 9). Este se conservó a -20
°C, para su uso en las amplificaciones de PCR.
51
Figura 9. Gel agarosa al 1.5 %, tenido con SyberGold™
10 X. ADN de aislados de mostos de mezcal; en la tabla
IV se especifica la identificación de las muestras. 18
ADN de cepa control FECHA (Fermichamp®).
La cantidad de ADN obtenida se determinó por su absorbancia a 260 nm en un espectrómetro
GBC (Cintra 10e.), y aplicando la fórmula siguiente:
[ADN] = 50 * A260nm * FD [μg/ml]
Donde el factor de dilución se calculó como:
FD = (Vol. Agua miliQ) + (Vol.de la muestra) / Vol. de la muestra
La calidad del ADN se cuantificó mediante el valor de la relación de absorbancia a 260 y
280 nm de acuerdo a la siguiente fórmula:
Calidad de ADN= A260 / A280
Donde un valor entre 1.8 y 2 indica que la solución está libre de proteína, por lo que se
tiene una buena calidad de ADN. El ADN se visualizó en un gel de agarosa por 1 h. El ADN
obtenido fue suspendido en 100 μl de TE 1X. y fue conservado a 4 °C, para su empleo en las
amplificaciones por PCR.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
52
6.2.2. Amplificación de los genes ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 y 26S por PCR
En la reacción de PCR para la amplificación de los segmentos ITS’s se utilizaron los
oligonucleótidos reportados por White et al. (1990), ITS1 (5´
TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (5´ TCCTCCGCTTATTGATATGC); esta se realizó
en un volumen final de 25 µL, utilizándose 1µL de ADNg (50 ng), 2.5 µL de Buffer (10 X),
1.5 µL de cloruro de magnesio (50m µL), 1 µL de cada uno de los oligonucleótidos (10 µM),
0.5 μL de dNTPs (10 mM), 0.5 μL de la enzima Taq DNA polimerasa (5 U/μL) y
completando el volumen a 25 μL con agua MiliQ estéril. El programa en el termociclador
incluyó un ciclo inicial de 5 min a 94 ºC y 35 ciclos con temperaturas de desnaturalización
(94 ºC/ 30 seg), alineación (59 ºC / 30 seg) y alargamiento (72 ºC/ 30 seg). Finalmente se dio
un paso de extensión final de 7 min a 72 ºC. El producto amplificado fue procesado mediante
electroforesis en gel. El segmento ribosomal 26S se amplificó con los oligonucleótidos NL1-
(5´ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) y NL4 (5´ GGTCCGTGTTTCAAGACGG);
esta se realizó en un volumen final de 25 µL, utilizándose 1 µL de ADNg (50 ng), 2.5 µL de
Buffer (10 X), 1.5 µL de cloruro de magnesio (50m µL), 1 µL de cada uno de los
oligonucleótidos (10 µM), 0.5 μl de dNTPs (10 mM), 0.5 µL de la enzima Taq DNA
polimerasa (5 U/µL) y completando el volumen a 25 µL con agua MiliQ estéril. El programa
en el termociclador incluyó un ciclo inicial de 5 min a 94 ºC y 35 ciclos con temperaturas de
desnaturalización (94 ºC/ 30 seg), alineación (63 ºC/ 30 seg) y alargamient0 (72 ºC/ 30 seg).
Finalmente se dio un paso de extensión final a 7 min a 72 ºC. El producto amplificado fue
procesado mediante electroforesis en gel.
6.2.3. Digestión enzimática del segmento ribosomal ITS’s
Los segmentos ITS’s amplificados fueron sometidos a un proceso de restricción con las
enzimas EcoRI (Promega). A 10 μL de la reacción de PCR le agregó 12 u de enzima, a lo cual
se le adicionó el buffer 10 x correspondiente a la enzima en una concentración final de 1 x; la
mezcla de reacción fue ajustada a 20 µL con agua MiliQ estéril. Se centrifugó 15 segundos y
se mezcló suavemente. Finalmente se incubó por 6 horas a 37 ºC. El producto de la digestión
se visualizó en un gel de agarosa al 2.5 %. El gel fue fotografiado y los patrones de restricción
comparados entre si. Los productos amplificados fueron procesados mediante una
electroforesis en gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 1 X, en regulador Tris-
borato-EDTA 1% (para un litro, 108 g trizma-base, 55 g ácido bórico, 40 mL EDTA 0.5 M
53
pH 8) a 100 V por 45 min. Los geles se documentaron en fotografías bajo luz UV a 320 nm
con un digitalizador de imágenes Gel Doc (Kodak, Estados Unidos).
6.2.4. Amplificación de los genes HXT1 y HXT3
En la amplificación del gen HXT1 (Figura 10) se usaron oligonucleótidos reportados por
Ramakrishnan et al. (2006), HXT1F (5´ GTGAAAGTCAAGTGCAACCC) y HXT1R (5´
CGGTCAACGGTGTACGAG) además los oligonucleótidos diseñados en nuestro laboratorio
JAHXT1F (5´ ATGAGAGCCGCTGGTACTGCATCT) y JAHXT1R (5´
CTATTTCCTGCTAAACAAACTCTTG).
Figura 10. Gel de agarosa al 1 %, teñido con
SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados
Unidos). Amplificación del gen HXT1 de aislados de
mostos de mezcal.
Para la obtención del gen HXT3 (Figura 11) se utilizaron los oligonucleótidos HXT3F (5´
GATTTCCAAGCTGAGGCCG) y HXT3R (5´ ACATGGCCGGCTTACCAGTG)
(Ramakrishnan et al., 2006); además de un par de oligonucleótidos diseñados en este trabajo,
FHXT3J (5´-ATTTCTGAAGTCGCTCCTAAGG) y RHXT3J (5´ -
ACATAACAGCAGACCATACC).
54
Figura 11. Gel de agarosa al 1 %, teñido con
SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados
Unidos). Amplificación del gen HXT3 de aislados de
mostos de mezcal. 1=Oligonucleótidos diseñados por.
2=Oligonucleótidos diseñados por el Laboratorio de
Biotecnología Industrial.
La reacción de amplificación para los cuatro pares de oligonucleótidos se realizó en un
volumen final de 25 µL, utilizándose 1µL de ADNg (50 ng), 2.5 µL de Buffer (10 X), 1.5 µL
de cloruro de magnesio (50m µL), 1 µL de cada uno de los oligonucleótidos (10 µM), 0.5 μl
de dNTPs (10 mM), 0.5 μL de la enzima Taq DNA polimerasa (5 U/μL) y completando el
volumen a 25 μL con agua MiliQ estéril. El programa que se utilizó consistió de 1 ciclo de 5
min a 94 ºC y 35 ciclos de 30 seg a 94 ºC, 30 seg a 63 ºC y 30 seg a 72 ºC. Finalmente se dio
un paso de extensión final a 7 min a 72 ºC. Los productos de la amplificación fueron
visualizados en gel de agarosa al 1 %.
La reacción de PCR obtenida fue purificada por columnas con el kit Wizard SV Gel and
PCR for Clean-up System (PROMEGA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del
fabricante. La secuenciación se realizo con el kit Sequence BigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing (Applied Biosystems, Estados Unidos). La reacción de PCR de secuenciación fue
purificada con el kit Big Dye® XTerminatorTM Purification (Applied Biosystems, Estados
Unidos).
6.2.5. Identificación molecular por secuenciación
La reacción de PCR obtenida en la amplificación de los genes ITS’s, 26S, HXT1 y HXT3
fue purificada por columnas con el kit Wizard SV Gel and PCR for Clean-up System
(PROMEGA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación se
55
realizó con el kit Sequence BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied
Biosystems, Estados Unidos). La reacción de PCR de secuenciación fue purificada con el kit
Big Dye® XTerminatorTM Purification (Applied Biosystems, Estados Unidos). Se utilizo el
equipo secuenciador ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Estados Unidos). Las
secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa BioEdit Sequence Aligment Editor
(Hall, 1999) y comparadas en la base de datos depositadas en el NCBI usando el BLAST
(Basic local alignment search tool).
6.2.6. Construcción de dendogramas
En el análisis filogenético de las secuencias 26S e ITS’s obtenidas se utilizó el método de
agrupamiento promedio de “Neighbor-Joining” con un “Bootstrap” de 1000 repeticiones y
para las distancias de evolución se utilizó el modelo “Nucleotide Maximum Composite
Likelihood” máxima similitud, con el objeto de ver las relaciones entre aislamientos.
6.3. Fermentaciones
6.3.1. Medios de cultivo
Con el fin de disminuir la fase de adaptación del microorganismo al medio en el inicio de
la fermentación, las levaduras se activaron en un pre-cultivo (Taillander et al., 2006). Esta
etapa se realizó en matraz erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 100 mL de medio (Tabla II), el
pH se ajustó a 5 con una solución de ácido ortofosfórico el medio fue esterilizado en
autoclave a 120 °C durante 20 minutos. El microorganismo se incubó a 250 rpm a 30 °C por
12 horas. Se cuantificó el número de células con el fin de determinar el volumen necesario
para iniciar la cinética a 3x106 células por mililitro.
56
Tabla II.
Composición de medios de cultivo
Reactivo Precultivo Medio 1 Medio 2 Medio 3
(g/L)
Extracto de levadura 1.0 1.0 1.0 1.0
KH2PO4 5.0 5.0 5.0 5.0
MgSO4(H2O)7 0.4 0.4 0.4 0.4
(NH4)2S04 2.0 2.0 2.0 2.0
Glucosa 20.0 90.0 10.0 100.0
Fructosa 0.0 10.0 90.0 100.0
Los aislados fueron evaluadas en los medios uno y dos con la composición indicada en las
Tabla II (Taillander et al 2006). Los aislados con mejores características en consumo de
azúcar y producción de etanol fueron evaluados en el medio 3 (Tabla II). En todos los casos
ajustando el pH a 5.
Las condiciones de la cinética de crecimiento se llevo a cabo en matraz Erlenmeyer® de
500mL conteniendo 300 mL de medio a 30 °C y 125 rpm. La cinética de fermentación se
realizó en matraces de 1 L con 500 mL de medio de cultivo y un inóculo inicial de 3 X106
células /mL, a una temperatura de 30°C.
6.3.2. Cuantificación de la biomasa.
6.3.2.1. Espectrometría
La densidad óptica (DO) fue evaluada a 600 nm en un espectrofotómetro modelo Hitachi*
U-2000TM equipo monocromático Seya-Namioka®. Las medidas se realizaron en cubetas de
2 mm de trayecto óptico; se efectuaran diluciones a partir de DO> 0.8 con el fin de mantener
la tendencia lineal.
57
6.3.2.2. Peso seco
La concentración celular en g/L fue determinada por el método de peso seco, esta técnica
permite la estimación de la biomasa total. Consistió en tomar un volumen conocido de la
muestra para centrifugarlo a 13000 rpm, por 10 minutos a 10 °C. El paquete celular fue
lavado dos veces con agua desionizada para eliminar restos del medio de cultivo,
posteriormente se llevó peso constante utilizando un analizador de humedad (modelo HA60;
Precisa, Zurich, Suiza). Este método se llevó en paralelo con el de espectrometría, con el fin
de obtener la correlación entre DO600nm y concentración en biomasa (peso seco).
6.3.2.3. Cuenta celular
Este método consiste en la determinación de la concentración celular utilizando un
hematocímetro (cámara de Neubauer o d Thoma) visualizando en el objetivo 40X de un
microscópico (BH-2 Olympus, Japón).
6.3.3. Análisis de azúcares
6.3.3.1. Determinación de glucosa por un método enzimático
El método utilizado por el instrumento YSI (YSI Life sciences, Estados Unidos) consiste
en la determinación de glucosa por medio de la enzima glucosa-oxidasa inmovilizada entre
dos membranas, una de policarbonato y otra de celulosa acetato. El sustrato es oxidado al
entrar en contacto con la enzima produciendo peróxido de hidrógeno, el cual pasa a través de
la membrana de celulosa acetato hacia el electrodo de platino. El resultado es la cuantificación
de la concentración en el sustrato de acuerdo a la siguiente reacción:
D-glucosa+O2 glucosa oxidasa D-glucono-δ-lactona+H2O2.
58
6.3.3.2. Determinación de azucares totales por el método DNS
El método DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) se realizó comparando los resultados con una
curva patrón de glucosa, con el objeto de obtener la curva correspondiente para determinar los
equivalentes de azucares reductores. La solución DNS fue compuesta por 8 g de sodio; 5 g de
ácido dinitrosalicílico; 150 g de tartrato de sodio y potasio; completando a 500 mL de agua y
evitando su exposición a la luz; el reactivo puede ser utilizado después de 15 horas de su
preparación. El análisis se efectuó en un tubo de ensayo conteniendo 1 mL de reactivo DNS y
1 mL de la muestra a analizar, previamente diluida a la concentración de la gama patrón (A
partir de una gama de soluciones patrón de glucosa y fructosa equivalente a 0-2 g/L), fue
incubada a 100 °C durante 10 minutos; enfriada por 10 minutos en hielo y determinó DO570nm,
se diluyó convenientemente con agua destilada, mientras que si fue demasiado pequeña, se
repitió el ensayo pero con una mayor cantidad de solución de glucosa (por ejemplo 0.2 a 0.3
mL). El método ácido 3,5-dinitrosalicílico se basa en la reducción del DNS (de color
amarillo) por el azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo), cuya
presencia puede detectarse por lectura de absorbancia en la zona de 540-570 nm (Montreuil et
al., 1986).
6.3.3.3. Cromatografía liquida de alta presión (HPLC)
La cromatografía liquida de alta presión es una técnica analítica, utilizada para separar e
identificar compuestos mediante intercambio iónico, basada en la atracción electrostática
entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. El equipo utiliza
una columna de intercambio iónico Aminex HPX-87 C de 30 cm de longitud precedida de una
precolumna con un gradiente de interacción GC 801. Las sustancias resultantes del
metabolismo de la levadura en el proceso de fermentación en glucosa y fructosa, como
glicerol, ácido acético, ácido cítrico, ácido succínico y etanol fueron evaluadas por HPLC.
Para llevar a cabo el análisis por HPLC se utilizó una fase móvil preparada con agua miliQ y
acido sulfúrico (H2SO4 0.005 M). Las muestras a analizar se centrifugaron a 13000 rpm a
10°C y fueron filtradas. La curva de calibración para los análisis fue obtenida utilizando la
ecuación lineal de la recta obtenida con el área contra la concentración del compuesto a
analizar, y para todos ellos el cuadrado de coeficiente de correlación de Person (r2) no fue ser
mayor a 0.98.
59
6.4. Cuantificación del estrés por etanol
Se inocularon 50 mL de medio rico en fructosa (Medio 2) con células precultivadas con a
una DO660nm=1 (aproximadamente a las 12 horas), se incubaron por 24 horas a 125 rpm y 30
°C. De las células cultivadas bajo estas condiciones, 25 mL fueron centrifugados a 3000 rpm
(Allegra 6G Centrifugue Beckman Coulter, Japón) por 10 min., se recolectaron y
suspendieron en 25 mL del medio líquido YM (25% Etanol v/v; y en g/L: extracto de malta 3;
extracto de levadura 3; peptona 5; glucosa 10 y agar 20). Se tomó 1 mL de muestra a los 0.5,
1.5, 3 y 5 min, cada mililitro se diluyo en 9 mL de solución Ringer (cada 100 mL contiene
NaCl 0.85g, KCl2 0.04g, CaCl2 2H2O 0.034 g) las diluciones seriadas de cada muestra se
sembraron por duplicado en YM agar e incubaron por 72 horas a 28 °C. (Pina et al., 2003).
Para el control se tomaron 25 mL de células, estas fueron centrifugadas, recolectadas y
suspendidas en 25 mL del medio líquido YM sin etanol, 1 mL de muestra se diluyo en 9 mL
de solución Ringer, se hicieron diluciones seriadas y se sembraron por duplicado en YM agar
e incubaron por 72 horas a 28 °C. Se usó el conteo de UFC (Unidades Formadoras de
Colonias) como índice de viabilidad.
6.4.1. Parámetros cinéticos
Los valores experimentales obtenidos fueron evaluados en general para cada tratamiento
analizándose los parámetros indicados en la tabla III.
Tabla III.
Parámetros cinéticos
Parámetro Unidades
Velocidades
Velocidades de producción de biomasa (g/L/h): rx dX/dt
Velocidades de consumo de substrato (g/L/h): rs dS/dt
Rendimientos
Rendimientos de producción de biomasa por sustrato consumido Yx/s (g/g)
Rendimiento de sustrato Yp/s (g/g)
60
6.5. Análisis estadístico
Los datos cinéticos obtenidos de los tratamientos fueron evaluados estadísticamente por
ANOVA.
61
7 RESULTADOS
De 103 aislamientos iniciales, y basado en su imagen microscópica y macroscópica se
seleccionaron 17 cepas (Tabla IV) con morfología celular presuntiva de S. cerevisiae.
Tabla IV.
Aislados de levaduras con morfología redonda
Aislado Observaciones
AN2, 1Y1, 1Y9, AN1, 1Y14,
AN5
Aislamiento realizado a los dos días de inicio
de la fermentación. Los mostos presentaron
una concentración de 13.2° Brix.
3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6,
3Y1, 3Y2, 3Y3, 3Y4,3Y5,
3Y8
El aislamiento se realizó al sexto día de
inicio de la fermentación. Los mostos
presentaron una concentración de 10° Brix.
7.1. Identificación molecular de las levaduras
Los aislados se concentraron en cuatro grupos diferentes de acuerdo al patrón de
amplificación de los segmentos ITS’s, A) integrado por 3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y3,
3Y4, 3Y5, 3Y8 y 1AN5 con 750 pares de bases (pb) aproximadamente; B) grupo compuesto
por 3Y1, 1AN2, y 1AN1 con 700 pb aproximadamente; el C) formado por 1Y1, 1Y9 con 650
pb y D) constituido por 1Y14 con cerca de 600 pb (Fig. 12).
62
Figura 12. Gel de agarosa al 1.5% tenido con
SyberGold™ 10 X. Amplificación de los segmentos
ITS’s aislados con morfología celular redonda. Agua (C-
) control negativo y M: marcador de 100 pb (Promega,
Estados Unidos).
7.1.1. Análisis de restricción del segmento ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 (ARDRA)
Los productos de amplificación ITS’s de todos los aislados fueron sometidos a un proceso
de restricción con la enzima EcoRI; se encontró que los aislados se agruparon en cinco
ARDRA’s diferentes (Fig. 13), constituidos por I) 3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4,
3Y5, 3Y8 y FECHA; perfil II) 3Y1; el III) 1AN2, 1AN1, 1AN5; el IV) 1Y1 Y 1Y9; el V)
1Y14.
Figura 13. ARDRA’s de aislados de mostos de mezcal.
Gel de agarosa al 2.5%, teñido con SyberGold™ 10X,
marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos).
63
7.1.2. Amplificación del segmento ribosomal 26S
La amplificación del segmento 26S (Figura 14) fue para todos de 750 pb
aproximadamente.
Figura 14. Amplificación de genes ribosomales 26S.
Gel de agarosa al 2.5%, teñido con SyberGold™ 10 X,
marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos) de las
levaduras de morfología redonda aisladas de mostos de
mezcal.
7.1.3. Identificación molecular por los segmentos ribosomales ITS’s y 26S
En el análisis de la secuencia se identificaron cinco grupos de microorganismos, 10
aislados de Saccharomyces cerevisiae, uno Zygosaccharomyces bailii, tres de Torulaspora
delbrueckii, dos de Kluyveromyces marxianus y uno de Pichia mexicana (Tabla V); de los
aislados 3D6 y AN1 solo se obtuvo la secuencia del segmento 26S.
64
Tabla V.
Clasificación e identificación molecular de las levaduras aisladas de mostos de mezcal
Aislado Especie Accesión*1 Identidad
(%) Accesión *2
Identidad
(%)
3D2 Saccharomyces cerevisiae JQ824871 100 EF457564.1 99
3D3 Saccharomyces cerevisiae JQ824873 100 AB212257.1 89
3D4 Saccharomyces cerevisiae AB279746 100 AB279746.1 96
3D5 Saccharomyces cerevisiae AF321540 100 AF321540.1 87
3D6 Saccharomyces cerevisiae JQ824876 100 ----------------
3Y2 Saccharomyces cerevisiae JQ824877 100 EF151450.1 98
3Y3 Saccharomyces cerevisiae JQ824872 100 EF457565.1 98
3Y4 Saccharomyces cerevisiae JQ824875 100 AM900396.1 98
3Y5 Saccharomyces cerevisiae JQ824869 100 EU145764.1 97
3Y8 Saccharomyces cerevisiae JQ824874 100 FJ231432.1 99
3Y1 Zygosaccharomyces bailii FM201320.1 99 X84640.1 93
1AN1 Torulaspora delbrueckii FJ468458.1 97 ----------------
1AN5 Torulaspora delbrueckii GQ179981.1 99 FN401197.1 100
1AN2 Torulaspora delbrueckii GQ179981.1 98 AB469378.1 99
1Y1 Kluyveromyces marxianus FJ896140.1 99 FN401197.1 99
1Y9 *3,1Torulaspora delbrueckii
*3,2Kluyveromyces marxianus GQ121696.1 97 AY046214.1 98
1Y14 Pichia mexicana EF042032.1 99 EM199966.1 98
*1. 26S. *2. ITS1-5.8S-ITS2. *3.1 por 26S y *3.2 por ITS1-5.8S-ITS2.
65
Al realizar la comparación por secuencia en el gen 26S el dendrograma (Fig. 15) agrupó
genotipos iguales, es decir organismos del mismo género y especie destacando la similitud
alcanzada para la unión de 99% para los cinco grupos formados, A) S. cerevisiae, B) T.
delbrueckii, C) Z. bailii, D) K. marxianus, F) y G) P. mexicana.
El análisis de comparación por secuencia del segmento ITS1-5-8S-ITS2 (Fig. 16) el
dendrograma agrupó A) con una similitud de unión de 81% a los aislados identificados como S.
cerevisiae; B) con 84% de similitud a los aislados identificados como Z. bailii; C) con un 88%
unió a 1AN2 con T. delbrueckii; D) en un clado separó al aislado 1Y9 y lo colocó en medio de
los grupos “C y E”; E) 91% de similitud agrupó a los aislados identificados como T. delbrueckii
(AN5) y K. marxianus (1Y1); y F) con 97% de similitud a P. mexicana (1Y14).
Cabe mencionar que en el dendrograma se expresan las diferencias entre clases o grupos con
un intervalo de cero a uno, por lo que para la interpretación de los resultados se calculó el
complemento (la similitud) y se expresó en porcentaje, es decir, se analizó la homología
molecular detectada entre y dentro de genotipos.
66
Figura 15. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotídica
de la región ribosomal 26S. Este árbol está basado en el método “Neighbor-Joining”, un
bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum Composite
Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el tamaño de los clados. El
grupo de salida fue P. mexicana. El análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4.
3D2
3Y4
3Y8
3Y3
3D5
3D4
3D3
3D6
3Y5
3Y2
S. cerevisiae (GU080049)
S. cerevisiae (FJ972215)
S. cerevisiae EF192587)
S. cerevisiae (HM191656)
S. cerevisiae (HM191650)
S. cerevisiae (FN393977)
1AN2
1AN1
1AN5
T. delbrueckii (FN393992)
T. delbrueckii (GU373796)
T. delbrueckii (FR691642)
T. delbrueckii (GQ121628)
3Y1
Z. bailii (GU080052)
Z. bailii (AJ966343)
Z. bailii (FM201320)
Z. bailii (AJ966522)
1Y1
1Y9
K. marxianus (GU565207)
K. marxianus (FJ896140)
K. marxianus (EU439450)
K. marxianus (EU669470)
P. mexicana (EF042031)
1Y14
P. mexicana (DQ409143)
P. mexicana (FM180550)
Pichia sp (AM911003)
66
74
99
99
99
93
50
9972
92
99
67
Figura 16. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotídica
de la región ribosomal ITS1-5.8S-ITS2. Este árbol está basado en el método “Neighbor-Joining”,
un bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum
Composite Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el tamaño de los
clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4.
3D3
S. cerevisiae (FN393995)
S. cerevisiae (GQ376091)
S. cerevisiae (AB279744)
S. cerevisiae (FM199962)
S. cerevisiae (EU145764)
3D5
3D4
3Y2
3Y3
3D2
3Y4
3Y5
3Y8
Z. baili (X84732)
Z. bailii (FJ914883)
Z. bailii (AY796194)
3Y1
Z. bailii (DQ872858)
Z. bailii (X84640.1)
Z. bailii (AY046191)
T. delbrueckii (AB469378)
1AN2
1Y9
T. delbrueckii (DQ249191)
1AN5
K. marxianus (EU019227)
1Y1
T. delbrueckii (FM173070)
K. marxianus (AB480229)
K. marxianus (EF568057)
T. delbrueckii (AY939806)
T. delbrueckii (AB480229)
P. mexicana (FM199966)
P. mexicana (EF568069)
P. mexicana (FM199966)
P. mexicana (AB054110)
1Y14
54
77
97
88
91
74
96
55
69
84
54
81
51
68
7.2. Caracterización de la productividad de las levaduras
En la primera evaluación se seleccionaron y caracterizaron 11 microorganismos de acuerdo a
la imagen micro, macroscópica y perfiles de ARDRA, este análisis se dividió en dos grupos, 1)
aislados no Saccharomyces y 2) aislados Saccharomyces cerevisiae. Se evaluaron los aislados
identificados como S. cerevisiae cinéticamente evaluando crecimiento y consumo de azucares
reductores en dos medios sintéticos, uno rico en glucosa M1 (glucosa:fructosa 9:1) y el otro rico
en fructosa M2 (glucosa:fructosa 1:9). Posteriormente se evaluaron solo al inicio y al final de la
fermentación las características productivas de todos los aislados identificados como S. cerevisiae
con el fin de seleccionar los microorganismos S. cerevisiae con una alta actividad fructofílica.
7.2.1. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en glucosa (M1)
Los microorganismos identificados como S. cerevisiae (Fig. 17) fueron caracterizados en el
medio M1 (fructosa:glucosa 1:9), se encontró que los aislamientos 3Y2, 3Y4 y 3Y8 presentaron
mayor crecimiento a las 72 horas, 3D6 y 3D3 fueron las que menor crecimiento tuvieron.
En el consumo de azúcares reductores (Fig. 18) se observaron tres patrones de
comportamiento, los aislamientos 3Y4 y 3Y8 a las 72 horas fueron los que menos azúcar residual
dejaron (5 g/L de azúcar residual en el medio aproximadamente), seguidos por FECHA, 3Y2 y
3Y6 (23 -29 g/L de azúcar residual aproximadamente) y 3Y5, 3D4 y 3D2 (58-059 g/L
aproximadamente). Al final de la fermentación (120 horas) en M1 (Tabla VI), los que mayor
rendimiento presentaron en cuanto a consumo de sustrato fueron Fermichamp®, 3Y2, 3Y8 y
3Y4; las cepas que terminaron la fermentación 3Y8, 3Y4 y Fermichamp® ya que dejaron una
concentración menor a 2 g/L de azúcar residual, el resto de las cepas si fermentaron la glucosa
pero dejaron una alta residualidad (menor del 50%) en el medio.
En cuanto a los parámetros cinéticos (Tabla VI), 3Y4, 3Y8 y FECHA tuvieron la mayor
velocidad de consumo de sustrato en M1; los que mayor velocidad en la producción de biomasa
fueron 3Y4 y 3D2, pero 3D3, 3D6 y 3D5 fueron las que más biomasa produjeron al final de la
fermentación (2.9 a 3.71 g/L). En cuanto a etanol 3D4, 3Y3 y 3Y5 presentaron mayor
69
rendimiento pero 3Y3, 3Y4 y Fermichamp® fueron las que más g/L produjeron. La mayor
producción de acido acético la tuvieron 3Y8 y 3D2; 3D4 y 3D6 mayor concentración de glicerol;
3D4 y Fermichamp® mayor concentración de acido láctico.
Figura 17. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae aisladas de
mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9).
0
2
4
6
0 24 48 72
DO
600 n
m
Tiempo (h)
3D2 3D3 3D6 3Y2 3Y4 3Y8 FCHA
70
Figura 18. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por levaduras S. cerevisiae
aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9).
0
20
40
60
80
100
0 12 24 36 48 60 72
Porc
enta
je (
%)
de
azú
car
resi
du
al
Tiempo (h)
3D2 3D4 3D6 3Y2 3Y3 3Y4 3Y5 3Y8 FCHA
71
Tabla VI.
Parámetros cinéticos de los aislamientos de S. cerevisiae en medio rico en glucosa (M1) a las 120 horas
Aislado
Velocidad de
consumo de
azúcares
Velocidad de
producción de
biomasa
YEtanol/azúcar Biomasa Azúcar residual
Etanol Acido acético Glicerol Acido
láctico
g/L*h g/L*h g/g g/L
3D2 0.67+0.00 0.09+0.00 0.40+0.00 2.78+0.45 19.70+1.60 31.72+0.10 0.83+0.00 5.34+0.24 0.75+0.10
3D3 0.76+0.00 0.01+0.00 0.40+0.00 3.71+0.09 9.10+1.40 36.42+0.90 0.47+0.03 4.86+0.25 0.59+0.01
3D4 0.57+0.00 0.03+0.00 0.48+0.00 2.88+0.29 31.36+1.40 36.89+2.20 0.73+0.15 7.61+2.08 1.39+0.36
3D5 0.64+0.00 0.00+0.00 0.42+0.00 3.30+0.00 22.91+1.20 32.20+1.60 0.46+0.01 4.27+1.22 0.57+0.01
3D6 0.75+0.00 0.02+0.00 0.40+0.00 3.34+0.01 10.00+1.60 35.56+1.30 0.62+0.02 5.82+0.40 0.47+0.06
3Y2 0.70+0.00 0.01+0.00 0.36+0.00 2.89+0.16 15.83+1.20 35.38+0.00 0.70+0.32 4.07+0.48 0.67+0.52
3Y3 0.57+0.01 0.03+0.01 0.46+0.01 2.63+0.03 31.36+3.10 39.86+0.20 0.82+0.01 4.03+1010 0.79+0.18
3Y4 0.82+0.00 0.04+0.00 0.44+0.00 2.80+0.00 1.52+1.40 43.90+5.20 0.74+0.03 3.59+0.32 0.00+0.00
3Y5 0.43+0.01 0.03+0.01 0.45+0.01 2.90+0.03 45.95+1.90 34.64+3.20 0.47+0.00 1.70+0.53 0.76+0.00
3Y8 0.82+0.00 0.03+0.00 0.32+0.00 2.10+0.10 1.41+1.20 31.83+1.90 1.26+0.64 3.50+0.12 0.52+0.06
FECHA 0.81+0.00 0.01+0.00 0.42+0.00 2.89+0.04 1.68+1.20 42.31+0.00 0.46+0.00 3.85+0.00 1.33+0.09
FECHA: Cepa de referencia Fermichamp®
72
7.2.2. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en fructosa (M2)
Los microorganismos identificados como S. cerevisiae fueron caracterizados en el medio M2
(fructosa:glucosa 9:1) De los aislados evaluados los que tuvieron mayor crecimiento fueron 3Y2,
3Y4 y 3Y8 (Fig. 19) y los que tuvieron menor crecimiento en este medio fueron 3D2 y Fecha.
En el consumo del sustrato a las 72 horas (Fig. 20) se observaron tres tipos de
comportamiento, los aislamientos 3Y8, 3Y4 a las 72 horas fueron los que menos azúcar residual
dejaron (5g/L aproximadamente), seguidas por FECHA, 3D6 y 3Y2 (50 g/L aproximadamente)
y las que mayor residualidad dejaron fueron 3Y5, 3D4 y 3D2 (más de 60 g/L).
En M2 (Tabla VII) los aislados con mayor velocidad de consumo de sustrato 3Y8, 3D5 y
3D3; pero las que dejaron menor concentración de azúcar fueron 3D3, 3Y4 y 3Y8 (menos de 2
g/L aproximadamente). El aislado que mayor velocidad en la producción de biomasa tuvo fue
3Y5 y las que más biomasa produjeron al final de la fermentación fueron 3D3, 3D5 y 3Y4 (3.06
a 3.78 g/L). Los aislados que rendimiento en producción de etanol fueron 3Y3, 3Y5 y FECHA y
además fueron los que produjeron la mayor concentración (38.72 a 42.84 g/L). La mayor
producción de acido acético la tuvieron 3D3; 3D5 y 3D6 (5.66 a6.50 g/L); mayor concentración
de glicerol; 3Y5 y 3Y8 (4.21- 4.37g/L) la mayor concentración de acido láctico.3Y5 y FECHA
(1.02-1.32 g/L).
73
Figura 19. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae en el medio
M2 (fructosa:glucosa 9:1).
Figura 20. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por S. cerevisiae en el medio M2
(fructosa:glucosa 9:1).
0
2
4
6
0 24 48 72
DO
600 n
m
Tiempo (h)
3D2 3D3 3D6 3Y2 3Y4 3Y8 FCHA
0
20
40
60
80
100
0 12 24 36 48 60 72
Porc
enta
je (
%)
de
azú
car
resi
du
al
Tiempo (h)
3D2 3D4 3D6 3Y2 3Y3 3Y4 3Y5 3Y8 FCHA
74
Tabla VII.
Parámetros cinéticos de los aislados de S. cerevisiae en medio rico en fructosa (M2) a las 120 h
Aislado
Velocidad de
consumo de
azúcares
Velocidad de
producción de
biomasa
YEtanol/azúcar Biomasa Azúcar residual
Etanol Acido acético Glicerol Acido
láctico
g/L*h g/L*h g/g g/L
3D2 0.80+0.01 0.02+0.01 0.2+0.01 2.94+0.14 5.05+2.80 22.47+0.10 3.74+0.01 0.75+0.27 0.75+0.27
3D3 0.82+0.03 0.02+0.00 0.34+0.02 3.78+0.05 1.17+1.80 33.80+0.10 6.14+0.80 0.58+0.08 0.57+0.07
3D4 0.56+0.06 0.01+0.01 0.33+0.02 2.68+0.02 32.01+1.70 31.74+1.30 3.69+0.00 0.98+0.00 0.98+0.00
3D5 0.83+0.00 0.01+0.00 0.34+0.01 3.06+0.31 52.17+1.50 33.38+1.40 5.66+1.05 0.52+0.06 0.52+0.06
3D6 0.74+0.01 0.02+0.00 0.38+0.01 3.34+0.19 11.05+1.50 33.60+0.40 6.50+0.91 0.73+0.11 0.73+0.11
3Y2 0.68+0.03 0.03+0.00 0.29+0.00 2.66+0.19 18.26+1.20 28.58+5.20 0.64+0.03 3.13+0.38 0.00+0.00
3Y3 0.57+0.00 0.03+0.00 0.41+0.01 2.68+0.02 32.01+1.40 39.28+0.10 0.58+0.44 2.96+0.55 0.00+0.00
3Y4 0.82+0.00 0.03+0.00 0.34+0.00 3.30+0.10 1.71+2.10 32.71+0.90 0.70+0.01 3.38+0.06 0.38+0.01
3Y5 0.44+0.04 0.04+0.00 0.49+0.02 2.73+0.03 36.43+1.70 33.65+0.50 1.00+0.02 4.37+0.03 1.02+0.16
3Y8 0.83+0.00 0.01+0.00 0.39+0.15 2.25+0.15 1.00+0.81 38.72+4.41 0.77+0.03 4.21+0.12 0.77+0.00
FECHA 0.68+0.02 0.01+0.00 0.43+0.00 2.35+0.13 18.92+1.30 42.87+4.30 0.54+0.01 3.31+0.12 1.32+0.06
FECHA: Cepa de referencia Fermichamp®
75
7.3. Caracterización cinética de los aislados de S cerevisiae con una alta actividad
fructofílica
Fueron evaluadas las características cinéticas de producción de etanol, glicerol biomasa y
consumo de azucares residuales de 3D4, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5 y 3Y8 identificados
molecularmente como S. cerevisiae usando como control la cepa Fermichamp®.
La levadura 3D4 (Figura 21 A y B) tuvo crecimiento similar en M1 y M2 (2.26-2.88 g/L) al
final de la fermentación. En cuanto al comportamiento en la cinética de fermentación se observó
tanto en M1 como en M2 de las 72 a las 100 horas una fase estacionario en el consumo del azúcar
de mayor concentración, al igual se observa como la producción de etanol se encuentra en fase
log hasta las 72 horas en ambos medios. Al final de la fermentación en ambos medios tuvieron un
producción similar de glicerol (2.30 g/L aproximadamente)
La levadura 3Y2 (Fig. 22 A y B) se observo tanto en M1 como en M2 una fase de
crecimiento hasta las 48 horas, la levadura tuvo poca diferencia en la producción de biomasa al
final de la fermentación en ambos medios (2.14- 2.70 g/L). En relación a la producción de
etanol, glicerol y consumo de azucares reductores tanto en glucosa como en fructosa
aproximadamente a 36 horas inicia la etapa estacionaria. En M1 tanto el etanol como el glicerol
tienen una fase log de producción hasta las 36 horas aproximadamente; en M2 el etanol sigue
produciéndose hasta el final de la fermentación, la producción máxima de glicerol se da hacia las
60 horas.
76
Figura 21. Cinética de fermentación a 30°C de 3D4. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 9:1). Medio
B) M2 (fructosa:glucosa 1:9).
0
10
20
30
40
50
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96 120
Eta
nol,
Gli
cero
l, P
eso
sec
o
(g//
L)
Glu
cosa
, F
ruct
osa
(g/L
)
Tiempo (h)
A
0
10
20
30
40
50
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96 120
Eta
nol,
Gli
cero
l , P
eso s
eco (
g//
L)
Glu
cosa
, F
ruct
osa
(g/L
)
Tiempo (h)
B
FRUCTOSA GLUCOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO
77
Figura 22. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y2 Cinética. A) Medio M1 (fructosa:glucosa
1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
0
10
20
30
40
50
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96 120
Eta
nol,
Gli
cero
l, P
eso s
eco
(g//
L)
Glu
cosa
, F
ruct
osa
(g/L
)
Tiempo (h)
A
0
10
20
30
40
50
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96 120
Eta
nol,
Gli
cero
, P
eso s
eco
(g//
L)
Glu
cosa
, F
ruct
osa
(g/L
)
Tiempo (h)
B
FRUCTOSA GLUCOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO
78
La cepa 3Y3 presento un patrón de crecimiento similar en los dos medios (Fig. 23 A y B), la
etapa estacionaria inició aproximadamente a las 32 horas exhibiendo en esta etapa el crecimiento
máximo para la cepa en los dos medios, al final de la fermentación en ambos medios esta cepa
tuvo una producción final de biomasa de 2.44 g/L aproximadamente; en la cinética de
fermentación la cepa dejo una alta concentración del azúcar con mayor concentración, en M1
(glucosa) y M2 (fructosa) al final de la fermentación (mayor a 48g/L aproximadamente), en
cuanto el azúcar de menor concentración en M1 (fructosa) a las 72 h fue totalmente consumida y
en M2 (glucosa) hasta las 120 h fue consumida en su totalidad; 3Y3 tuvo una producción similar
en M1 y M2 (2.5 g/L aproximadamente); en cuanto a la producción de etanol, produjo una
concentración mayor en M1 (40 g/L aproximadamente) que en M2 (28 g/L aproximadamente)
El crecimiento en M1 de 3Y4 (Fig. 24 A y B) la fase estacionaria apareció a las 48 horas,
después de este periodo, aproximadamente a las 72 horas, se observo una nueva fase log de
crecimiento, esto se ve reflejado en el comportamiento del microorganismo (Figura 24 A y B) ya
que en la cinética de fermentación a las 48 horas consumió la mayor parte, de igual forma se
observa que después de las 72 horas se presenta una nueva fase de producción de etanol. En M2
se observa marcadamente una etapa diauxica en el crecimiento del microorganismo hacia las 48
horas, la cual coincide con las últimas etapas de fermentación del sustrato predominante del
sustrato (Figura 24 C) y el cambio a la fermentación del sustrato presente en menor cantidad; en
cuanto a la producción de etanol se observa una producción exponencial de este hasta las 36
horas, observándose que se reactiva la producción después de las 60 horas,
79
Figura 23. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y3. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B)
Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
0
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Eta
no
l, G
lice
rol,
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eco
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)
Glu
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(g/L
)
Tiempo (h)
A
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0 24 48 72 96 120
Eta
nol,
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cero
l ,
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)
Glu
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, F
ruct
osa
(g/L
)
Tiempo (h)
B
GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO
80
Figura 24. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y4. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B)
Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
0
10
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, F
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(g/L
)
Tiempo (h)
A
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eco (g
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, F
ruct
osa
(g/L
)
Tiempo (h)
B
GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL PESO SECO
81
En M1 la cepa 3Y5 presentó crecimiento (Figura 25 A) y consumo de azúcar exponencial,
hasta las 36 horas (Figura 25 B) este microorganismo tuvo un paro en la fermentación a las 72
horas y dejo una alta residualidad del azúcar en el medio, la máxima producción de etanol se dio
hacia las 96 horas. En M2 (Figura 25 D) a las 24 horas se observo un punto diauxico, aquí se
observo el máximo crecimiento del microorganismos y un paro en la fermentación del azúcar; en
cuanto a la producción de etanol a las 72 horas se observo una nueva etapa de producción.
Para el aislamiento 3Y8 (Fig. 26A) tanto en M1 como en M2 el microorganismo presentó un
crecimiento exponencial hasta las 12 horas, manteniéndose en fase estacionaria hasta el final de
la fermentación; a las 72 horas el microorganismo termino la fermentación de glucosa y fructosa
dejando una residualidad menor de 5 g/L de ambos (Figura 26 A y B). En ambos medios la
producción de etanol fue exponencial hasta las 60 horas. Este microorganismo tuvo
comportamiento similar en ambos medios.
En la cepa control Fermichamp (Fig. 27 A) presento crecimiento exponencial en ambos
medios; el consumo de glucosa (Figura 27 B) se dio de forma exponencial, a las 72 horas
consumió el 78 % de la glucosa y al final de la fermentación el 99%; en M1 (Figura 27 C) el
consumo de la fructosa se dio de forma exponencial con dos cambios diauxicos, uno a las 4 horas
y otro a las 24 horas aproximadamente, al final de la fermentación se consumió el 83% de esta
azúcar. El etanol se produjo de forma exponencial aproximadamente hasta las 72 horas en ambos
medios encontrándose mayor producción en glucosa (41.4 g/L) que en fructosa (22.01 g/L)
82
Figura 25. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y5. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B)
Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
0
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L)
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l, P
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(g//
L)
Glu
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, F
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(g/L
)
Tiempo (h)
B
GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO
83
Figura 26. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y8. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B)
Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
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B
GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL PESO SECO
84
\
Figura 27. Cinética de fermentación a 30°C de Fermichamp® (FECHA). A) Medio M1
(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
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A
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L)
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)
Tiempo (h)
B
GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO
85
7.4. Caracterización de aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructofílica en medio
M3
Los aislados de S. cerevisiae con una alta actividad fructofílica fueron evaluadas en M3 (Tabla
VIII). Las levaduras 3Y3, 3Y5 y 3Y8 consumieron la glucosa al final de la fermentación y no
presentaron diferencia significativa entre ellas. La cepa control Fermichamp consumió la
totalidad de la fructosa presente en el medio, mientras que los aislamientos 3Y8 y 3Y5 tuvieron
un consumo mayor al 86.5% sin diferencia significativa. En cuanto a la producción de etanol no
se presento diferencia significativa entre las mejores 3Y5 y 3Y8.
En el medio M3 (Fig. 28) en general más del 50% de la glucosa es consumido a las 72 h por
las cepas 3Y5 (Figura 28 B) consume la mayoría de la glucosa a las 150 h, dejando en el medio
menos de 6 g/L; 3Y3, y 3Y8 a las 200 h; la cepa testigo deja alta concentración (30 g/L) al final
de la fermentación. En cuanto a fructosa las cepas a las 92 h consumen más del 50% de la
fructosa, 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejan una alta concentración de fructosa en el medio al final de la
fermentación, solo Fermichamp® termina la fermentación a las 150 h dejando menos de 1 g/L de
esta azúcar residual. El proceso inicia con la misma concentración de ambas azucares
observándose que las cuatro cepas en estudio consumen más rápido la glucosa que la fructosa,
dando lugar a una diferencia entre el consumo de estos azucares (Discrepancia GF) en el curso
completo de la fermentación. Al inicio de la fermentación se observa una mayor discrepancia,
cuando la glucosa empieza a ser limitante en el medio esta se reduce notablemente, observándose
que cuando la fermentación cesa las cepas aisladas del proceso de mezcal dejan una alta
concentración de fructosa en el medio, a excepción de la 3Y8 que hacia las 100 horas la relación
G/F tiene un valor de uno, ya que el microorganismo consume de igual forma la glucosa y la
fructosa. El etanol solo se midió al final de la fermentación, 3Y5 y 3Y8 fueron las cepas que
mayor concentración de este produjeron.
86
Tabla VIII.
Evaluación cinética al final (12 días) de la fermentación de los aislados de S. cerevisiae en medio M3 (glucosa:fructosa 1:1)
Cepa
Glucosa
residual
Fructosa
residual Azúcar residual Etanol YEtanol/azúcar
Velocidad de
consumo
g/L g/g Glucosa
g/L*h
Fructosa
g/L*h
3Y3 0.52+0.34A 15.41+2.10C 15.92+5.62B 68.63+1.05B 0.38+0.01 0.32+0.02 0.31+0.02
3Y5 0.22+0.13A 13.25+3.10B,C 13.47+4.13A,B 78.16+2.59A 0.43+0.01 0.29+0.00 0.32+0.02
3Y8 0.86+0.75A 9.29+4.38B 10.15+2.62A 76.25+4.60A,B 0.42+0.01 0.30+0.00 0.34+0.00
FECHA 31.88+3.73B 0.00+0.00A 31.65+7.67C 61.62+4.56C 0.35+0.00 0.21+0.01 0.36+0.00
FECHA: Cepa de referencia Fermichamp®. A, B, C agrupados por ANOVA con Prueba de Diferencia Mínima Significativa
87
Figura 28. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B)
3Y5 durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 100:100).
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0 50 100 150 200 250
Porc
enta
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de
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Tiempo (horas)
A
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Porc
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de
azú
car
Tiempo (h)
B
FRUCTOSA GLUCOSA
88
Figura 29. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae C) 3Y8 y D)
Fermichamp® (FECHA) durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 1:1).
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0 50 100 150 200 250
Porc
enta
ge
(%)
de
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Tiempo (h)
C
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0 50 100 150 200 250
Porc
enta
je (
%)
de
azú
car
Tiempo (h)
D
FRUCTOSA GLUCOSA
89
Figura 30. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la fermentación
de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa
9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1).
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car
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Porc
enta
je (
%)
Azu
car
Tiempo (h)
B
M1 M2 M3
90
Figura 31. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la fermentación
de cepas S. cerevisiae A) 3Y8 y B) Fermichamp® (FECHA) en M1 (fructosa:glucosa 1:9),
M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1).
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0 50 100 150 200 250
Porc
enta
je (
%)
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car
Tiempo (h)
A
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250
Porc
enta
je (
%)
Azu
car
Tiempo (h)
B
M1 M2 M3
91
7.5. Caracterización de la tolerancia al etanol de los aislamientos Saccharomyces
cerevisiae fructofílicos
De acuerdo a este protocolo, la cepa con mayor resistencia al etanol a los tres minutos fue
3Y8 (5.4 x 105 cfu/ml), seguida por Fermichamp® (1.5 x105 cfu/ml) y 3Y5 (8.1 x 104 cfu/ml);
mientras que la 3Y3 (0% a 3 min) resultó ser el aislado más sensible (Figura 30). A los cinco
minutos la cepa con mayor resistencia al etanol fue la 3Y8 (2.1 x 105 cfu/ml).
Figura 32. Pérdida de viabilidad en células de levaduras Saccharomyces aisladas de mostos
de mezcal a 30°C en 25% v/v de etanol.
7.6. Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de
los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos
Las secuencias de los genes que codifican para la proteínas de los transportadores Hxt1p y
Hxt3p de los aislados identificados como S. cerevisiae fueron comparadas con secuencias de
la clona S228c (publicadas en el Saccharomyces Genome Database) y la cepa de referencia
Fermichamp® (obtenidas de Guillaume et al., 2007). Con la secuencia aminoacídica de S228c
se predijo el modelo conformacional de los 12 dominios de los segmentos transmembranales
(TM) para Hxt1p y hxt3p (Figura 33 A y B) además la posición de los polimorfismos
encontrados en las cepas aisladas de mostos de mezcal (AMM).
1.E+00
1.E+02
1.E+04
1.E+06
0 1 2 3 4 5
Via
bil
idad
(U
FC
/ml)
Tiempo (min)
3Y3 3Y5 3Y8 FECHA
92
El análisis de las secuencias (Tabla IX) de Hxt1p reveló que los segmentos
transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de mezcal y
Fermichamp®. En Hxt3 revelo que en TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en
S207L (cambio de un aminoácido no polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c. Para
TM7 de Hxt1p, los aminoácidos Q275, G279 y D280 están conservados en todas las cepas,
pero en Fermichamp®, 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el
polimorfismo K278T.
En Hxt1 se encontraron entre la región TM9, en el lazo externo y en la TM10 cambios de
aminoácidos en la posición 418-420 y 431, en Hxt3 se encontraron los polimorfismos en la
posición 418 y 419 solo para Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las
sustituciones Y402L y C401S; otro cambio notable que ocurrió solo en la cepa 3D3 que
presentó los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la región transmembranal 9. En
Hxt1 del segmento TM10 está presente el polimorfismo L377F, para 3Y8 cerca de la posición
F380. En la cepa 3D3 se encontraron los polimorfismos F406S; G408A; G411A en Hxt1. En
se encontró que en Hxt1 está presente el polimorfismo L439M en el TM12, en la cepa 3D3.
Probablemente los polimorfismos que se presenten en estos segmentos transmembranales
pueden modificar el tamaño del poro y la forma de señalización de la proteína con el azúcar,
evidenciando su importancia en la formación de la cadena, es probable que estas
modificaciones puedan distorsionar la conformación de la estructural exofacial ocasionando
alteraciones entre los sitios alostéricos de la proteína propiciando una diferente afinidad con
las moléculas de hexosas, alterando de manera importante la funcionalidad del transportador.
93
Figura 33. Predicción de la conformación de los segmentos transmembranales de las proteínas A) hxt1 y B) hxt3 basada en la
secuencia de la cepa Saccharomyces cerevisiae S288c y la posición de los polimorfismos de aislados de mostos de mezcal y la
Fermichamp®.
A)
B)
94
Tabla IX.
Predicción de de la posición de los polimorfismos en HXT1 y HXT3 para los aislados de mostos
de mezcal
Sustituciónes
aminoacídicas
Tansportador de hexosas
HXT1
Sustituciónes
aminoacídicas
Tansportador de hexosas
HXT3
S. cerevisiae aislados S. cerevisiae aislados V1A AMMb
L211S AMMb
T4M AMMb
I213V FECHAa
F19I 3Y5
G241C 3D2, 3D6
F19R 3Y8
M328I FECHAa
T34I 3Y4
L392M FECHAa
D34E FECHAa
Y393W FECHAa
F55N FECHAa
I396V FECHAa
P223S 3D6
C401S AMMb
S239G AMMb, FECHAa
Y402L AMMb
F255Y 3D2
Y405A 3D3 G258D 3Y4
A406F 3D3
R264T 3D2
S407L 3D3
T265G 3D2
G409R 3D5, 3Y2
M266K 3D2
V410A 3D2
T278K
FECHAa , 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5,
3Y8
V410L 3Y2
V294L 3Y5
E418Q FECHAa
F300L 3Y2
G419N FECHAa
G307S 3D3
V432C 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8 V308I 3D3
I266L AMMb, FECHAa
V308L 3D2
A555D 3D3 A334T 3D3
M567L AMMb
V349G 3Y8 D358N AMMb, FECHAa Q359N AMMb, FECHAa
P360G AMMb, FECHAa
V371C AMMb, FECHAa I372L 3Y8 E394Q 3Y8 F396G 3Y8 V400I 3Y8 S406F 3D3 A408G 3D3
A411G 3D3
I430F 3Y8 Y433F 3Y8 M439L 3D3 G471S 3D4, FECHAa L473P 3D3 G487S 3Y5, 3Y8 D489E 3D5 FECHA
a (Fermichamp®) = datos tomados de Guillaume et al. (2007).
AMMb =Aislados de mostos de mezcal (3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y2, 3Y4, 3Y5, 3Y8
95
8 DISCUSIÓN
En Tamaulipas, el proceso de elaboración del mezcal es realizado de forma artesanal bajo
condiciones no controladas, en la fermentación alcohólica generalmente se usan levaduras
nativas, originando largos tiempos y una gran variabilidad en la calidad en la fermentación.
8.1 Identificación molecular de las levaduras
La fermentación de los mostos de mezcal es realizada por un complejo grupo de
microorganismos nativos que interaccionan entre sí (Cáceres et al., 2008), pero la levadura
que finalmente predomina en el proceso y produce la mayor concentración de etanol es la
Saccharomyces cerevisiae. En el proceso de fermentación espontanea de los mostos de
mezcal tamaulipeco a los dos y seis días se encontraron 9 cepas de S. cerevisiae, 3 de T.
delbrueckii, 1 de Z. bailii, 2 de K. marxianus y 1 de P. mexicana. El análisis de las secuencias
de los segmentos ribosomales 28S e ITS revelaron la diversidad entre estas, la posición
filogenética con el análisis de la secuencia 28S mostro un alto nivel de relación entre
organismos de la misma especie (99%); a diferencia de el análisis con ITS que las asoció con
un bajo nivel de relación a S. cerevisiae (81%), T. delbrueckii, Z. bailii y K. marxianus (64%)
y separó a P. mexicana (97%), a demás no asoció a 1Y9 con K. marxianus, esto es debido a
que la región ribosomal 5.8S-ITS exhibe una mayor diferencia interespecífica que los
segmentos 26S ribosomales (Kurtzman et al., 1998, 1992) no obstante 26S permite la
diferenciación de especies relativamente cercanas esto es resuelve diversidad interespecífica e
intraespecífica.
8.2 Caracterización de la productividad de las levaduras
El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de diferenciar grupos y
especies que taxonómicamente están muy cerca, pero que tienen propiedades muy diferentes
en lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y organolépticas dado el complejo grupo de
96
microorganismos que participan en una fermentación alcohólica es necesario el uso un
método de aislamiento rápido y confiable como rutina de laboratorio como lo es el ARDRA
(Baere et al., 2002; Escalante et al., 2006; Pérez et al., 2007). En esta investigación el
ARDRA evidenció un alta similitud en la huella genética de organismos del mismo género y
especie, especialmente en lo que se refiere a S. cerevisiae, con excepción de los identificados
como K. marxianus esto concuerda con el análisis de la secuencia 26S e ITS1-5.8S-ITS2.
En cuanto a la evaluación de crecimiento por DO(600nm) y consumo de azúcar residual las
cepas S. cerevisiae 3Y2, 3Y4 y 3Y8 (DO600=4.5 en promedio) fueron los que mejor se
adaptaron al ambos medios (M1 y M2) y consumieron casi en la totalidad tanto la glucosa
como la fructosa a demás presentaron mayor crecimiento que las levaduras analizadas por
Arroyo y colaboradores 2009, en donde evaluaron la inhibición por efecto del sustrato, ellos
encontraron que en 69.57% de fructosa (v/v) había una D.O600>1.
En la industria es importante encontrar levaduras con una alta preferencia a la fructosa o
tolerancia, ya que las altas concentraciones de esta azúcar incrementan el riesgo de la
contaminación al final de la fermentación causando detrimento en la calidad, al evaluar los
parámetros cinéticos de las levaduras aisladas de mostos de mezcal identificadas como S.
cerevisiae estas tuvieron comportamientos diferentes.
Las cepas destacadas en M1 fueron 3Y4, 3Y8 y Fermichamp® ya que al final de la
fermentación la concentración en el medio fue menos de 2 g/L de azúcar residual; en M2 los
mejores fueron 3D3, 3Y4, 3Y8 y al final de la fermentación la concentración fue menos de
g/L de azúcar residual; en M3 las tres cepas en evaluación 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejaron menos de
1 gr/L de glucosa residual; en cuanto a fructosa 3Y8 dejó una concentración menor a 10 g/L y
sólo FCHA consumió en su totalidad esta azúcar. Estos resultados son comparables con los
reportados por Díaz et al (2008) ellos analizaron S. cerevisiae aisladas de mostos para
producción de tequila, encontraron de 8-11 g/L de azúcar residual en el medio al final de la
fermentación en mostos de A. tequilana (a las 72 h y 95±5 g/L azúcares reductores), Cortes et
al (2009) realizaron fermentaciones en mostos de agave (100g/L de azucares reductores) con
S. cerevisiae y encontraron una residualidad de 6+1 g/L, Pinal et al (2009) analizaron
levaduras S. cerevisiae aisladas de mostos de agave encontraron una concentración menor a
los 5 g/L de azucares a las 72h de fermentación en mostos con 10° Brix; en otros estudios
encontraron que una levadura aislada de mostos de vino en fermentaciones de mostos de
97
agave para producción de tequila (108 g/L de azúcares reductores inicial) dejó alrededor de
15 g/L (Pinal et al., 1997). Berovic et al (2007), en mostos de uva (109g/L de glucosa y 103
g/L de fructosa) encontraron al final de la fermentación 6.5 ± 0.23 de azúcar residual. Dumont
et al (2009), analizaron cepas que dejaron menos de 5 g/L de ambos azucares reductores.
Los aislamientos que mayor biomasa produjeron en M1 fueron 3D3, 3D6 y 3D5 (Tabla
VI); en M2 los mejores fueron 3D3, 3D5, 3Y4 (Tabla VII). Las cepas evaluadas en el presente
estudio produjeron una menor cantidad de biomasa que la reportada en estudios realizados por
Díaz et al (2008), en donde encontraron de 4-5 g/L aproximadamente a las 12h.
Para la producción de etanol los aislamientos más destacados en M1 fueron 3Y3, 3Y4 y
Fermichamp® (Tabla VI); para M2 fueron 3Y3, 3Y5 y Fermichamp® (Tabla VII); en M3 fue
3Y5 y 3Y8 (Tabla VIII). Estos resultados concuerdan con los publicados por Díaz et al.,
2008, ellos encontraron en mostos de agave con 12° Brix 39.9-43.5 g/L de etanol, en otros
estudios realizados en fermentaciones de mostos de agave (10° Brix) encontraron 37 g/L al
final de la fermentación (Pinal et al., 2009), en mostos de agave una concentración de etanol
de 45+2 (Cortes et al., 2009), una S. cerevisiae aislada de mostos de vino en fermentaciones
de mostos de agave para producción de tequila (108 g/L de azúcares reductores inicial) tuvo
una producción de de 50 g/L de etanol (Pinal et al., 1997), en fermentaciones en mostos de A.
tequilana Weber variedad azul (100g de azucares reductores) evaluaron 8 aislamientos de S.
cerevisiae encontrando una producción de 35.85 a 46.16 g/L de etanol (Gutiérrez et al.,
2009); en mostos de uva encontraron 84.7+2.18 de etanol (Berovic et al., 2007). Polsinell et
al (1996), encontraron cepas que produjeron 97 g/L de etanol en mostos de uva; Dumont et al
(2009), analizaron cepas que produjeron 120g/L etanol.
En cuanto al acido acético en M1 la menor producción la tuvo FCHA, 3Y5, 3D5 y 3D3 con
concentraciones inferiores a 0.5 g/L. M2 la menor producción la tuvo FCHA, 3Y3, 3Y2, 3Y4
y 3Y8 en concentraciones inferiores a 0.7 g/L. En fermentaciones de mostos de agave para
producción de mezcal al final de la fermentación se han encontrado de .2 a .4 g/L de ácido
acético (Vera et al., 2009). Es importante determinar la concentración final de ácido acético
presente en una fermentación ya que en concentraciones de 1.2 a 4.8 g (20-80 mM) causa
muerte en las células de S. cerevisiae en la etapa exponencial induciendo condensación de la
cromatina a lo largo de la envoltura nuclear, exponiendo la fosfatidilserina sobre la superficie
98
citoplasmática de la membrana con posterior fragmentación de ADN (Loudovico et al.,
2001), a demás de que tiene un severo impacto negativo en el sabor de los vinos.
En la producción de acido láctico de menor producción en M1 fuero 3D6 (0.47+0.06 g/L)
y 3Y4 (0.00+0.00 g/L) (Tabla VI); para M2 los aislamientos 3Y2 (0.00+0.00 g/L), 3Y3
(0.00+0.00 g/L), 3Y4 (0.38+0.01 g/L) (Tabla VII). Díaz et al (2008) encontraron en
fermentaciones de mostos de Agave tequilana Weber una concentración de acido láctico de
0.0752 a 0.110 mg/L; la concentración usual producida por S. cerevisiae en fermentaciones de
vinos es de 0.1 a 0.5 g/L (Vasserot et., al 2010), es importante conocerlo ya que altas
concentraciones de acido láctico (más de 1 g/L) pueden modificar el metabolismo de la
levadura, inhibir el crecimiento, el efecto más obvio es el alargamiento de la fase lag,
(Vasserot et., al 2010); además de que puede provocar paro en la fermentación (Pampulha et
al., 2000).
La mayor concentración de glicerol en M1 la produjeron los aislamientos 3D4 (7.61+2.08
g/L) y 3D6 (5.82+0.40 g/L) (Tabla VI); en M2 fueron los aislamientos 3Y5 (4.37+0.03 g/L) y
3Y8 (4.21+0.12 g/L) (Tabla VII). Nuestros resultados son comparables a los obtenidos en
fermentaciones de mostos de agave en los que se encontró una concentración de 4.3 a 4.7 g/L
(Díaz et al., 2008), Cortes et al (2009) en mostos de agave encontraron 2.8 a 3.9; en mostos
de uva se encontró una concentración de 6.8 (Berovic et al., 2007). Es importante conocer la
concentración de glicerol en una fermentación ya que este compuesto le confiere calidad, en
vinos no es deseable que exceda 6 g/L.
Dado el carácter glucofílico de la levadura Saccharomyces cerevisiae y la importancia que
este microorganismo tiene en la industria vinícola, es necesario contar con levaduras que
fermenten en igual o similar proporción tanto la glucosa como la fructosa ya que
generalmente dejan una alta concentración de fructosa en el medio, causando una
discrepancia entre la cantidad de glucosa y fructosa consumidas durante la fermentación (GF)
(Berthels et al., 2004; Guillaume et al., 2007). Investigaciones realizadas por Berthels et al.
(2004) en mostos de la variedad de uva Colombard mostraron que las levaduras utilizadas
fermentaron más rápido la glucosa, no obstante que al inicio del proceso estaban presentes
cantidades similares de los dos azucares (110 g/L de cada una) la lenta utilización de la
fructosa dejó una diferencia (GF) y que cuando la glucosa es limitante en el medio la relación
GF decrece también, a los doce días estaba presente aproximadamente 5 g/L de glucosa, 30
99
g/L de fructosa y 85 g/L de etanol. En la evaluación de las levaduras en medio sintético tipo
mostos de uva (M3) se observó que solo la cepa control Fermichamp® consumió totalmente a
la fructosa aproximadamente en 180 horas, seguido por el aislamiento 3Y8; en cuanto a la
glucosa los aislamientos 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejaron menos de 1 g/L de azúcar residual. En este
estudio se observó que las cepas consumen más rápido la glucosa que la fructosa, coincidente
con el carácter glucofílico de las cepas S. cerevisiae empleadas en procesos fermentativos
vinícolas.
Al caracterizar una levadura fermentativa, es importante analizar la resistencia al estrés por
etanol ya que este perturba la homeostasis de las células impactando negativamente a diversas
actividades celulares, por ejemplo el metabolismo de los trasportadores de hexosas puede ser
bloqueado, causando desnutrición en las células y ocasionando por consecuencia un paro en la
fermentación; o bien la reproducción celular puede verse afectada factor importante en las
fermentaciones ya que se necesita que las cepas sean capaces de generar la biomasa requerida
para completar eficientemente la fermentación (Nagodawithana et al., 1975; Thomas et al.,
1978). En esta investigación se usaron niveles de etanol de 25% v/v debido a que causan
estrés en la célula, generando inactivación cinética tan rápida que no puede interferir los
factores debidos al régimen de cultivo, además de que es medible a través de un periodo corto
de tiempo (Pina et al., 2004). Se encontró que la cepa con que presento mayor porcentaje de
viabilidad fue la cepa control Fermichamp®, seguida por 3Y5 y 3Y8. Thomas et al (1978),
analizaron organismos S cerevisiae encontrando cepas que toleraban concentraciones de
etanol arriba del 20% a 30°C. Estrada et al (2001) reportaron cepas de S cerevisiae aisladas de
mostos de agave con una resistencia a más del 10% v/v de etanol considerando un crecimiento
positivo cuando se presentaba una DO (650nm) arriba del 0.020 unidades.
8.3 Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de
los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos
Los genes que codifican para los transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 están
presentes en mamíferos bacterias, plantas y levaduras, estos genes exhiben una estructura
conservada en los Segmentos Transmembranales (TM) 1, 3, 5, 7, 8, regiones que se
caracterizan por formar α-héliceses anfipáticas las cuales hipotéticamente interactúan,
formando un poro acuosos a través del cual pasa la hexosa, se sugiere que el hidroxil y la
amina del aminoácido forman cadenas de estas hélices uniéndose con la hexosa a través de
100
puentes de hidrógeno con los grupos hidroxilos del azúcar (Mueckler et al, 1999; Kasahara et
al., 2007), estudios sugieren que la hexosa es transportada de acuerdo a su polaridad, debido a
la unión estructural entre las fuerzas internas y externas entre el azúcar y el transportador,
iniciando desde el exterior por el C-1 (Carbono 1) siguiendo con C-4 y el C-6 (Hashiramoto et
al, 1992), probablemente los polimorfismos que se presenten en estos segmentos
transmembranales pueden modificar el tamaño del poro y la forma de señalización de la
proteína con el azúcar.
Las investigaciones han revelado en los FMS (súper familia de los principales
facilitadores, por sus siglas en inglés) el TM5 de levaduras es importante para el
reconocimiento y paso del substrato, específicamente en el transportador HXT2 se encontró
que en esta región el aminoácido Leucina (L201) es esencial para una alta afinidad de
transporte bajo condiciones limitadas de glucosa (Kasahar et al, 2003); igualmente se
encontró que la Glutamina (Q) esta altamente conservada en otros transportadores para
glucosa, fructosa, galactosa, xilosa y arabinosa (Glut1 Q161, en HXT1 Q149 y HXT3 Q206 )
evidenciando su importancia, estudios previos sugieren la participación de este aminoácido
en la formación exofacial de la cadena, básicamente en el sitio de unión con el sustrato
(Mueckler et al, 1994). En nuestro caso el análisis de las secuencias de Hxt1 reveló que los
segmentos transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de
mezcal y Fermichamp® con la secuencia de la clona S228c. El análisis de Hxt3 reveló que en
TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en S207L (cambio de un aminoácido no
polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c; Fermichamp® presenta el polimorfismo
V209I; considerando su cercanía al aminoácido conservado Q206 y a las características del
cambio de Leucina por Serina del transportador en las cepas aisladas de mezcal, como en
Fermichamp®, es probable que estas modificaciones puedan distorsionar la conformación
estructural exofacial ocasionando alteraciones entre los sitios alostéricos de la proteína
propiciando una diferente afinidad con las moléculas de hexosas.
El segmento TM7 tiene un alta homología en otros SMF y está situado en la parte superior
de la membrana, probablemente este cumple el papel de reconocimiento del sustrato por parte
de la célula, esto es en la interacción exofacial de la proteína con el azúcar, además de que
participa en el doblamiento de la hélice; Hashiramoto (1992) mostró que en GUT1 el
aminoácido Q282 (HXT1 Q275; HXT3 Q332) se encuentra en una región conservada, es posible
que una modificación en esta zona, altere de manera importante la funcionalidad del
101
transportador; hipotéticamente este aminoácido forma puentes de hidrógeno con el C-1 de la
glucosa (Liang et al., 1977; Mueckler et al., 2009), además de que puede participar en la
unión de la estructura conformacional externa entre TM7 y TM12 propiciando el movimiento
helicoidal ascendente cuando un sustrato es incorporado del exerior hacia el interior; en otros
estudios se encontró que el aminoácido glicina (HXT1 G279 y HXT3 G336) esta altamente
conservado en transportadores de mamíferos y hongos, y es crítico para el transporte de
glucosa (Liang et al., 1997, 1998); Kasahara (2010) encontró que el segmento Hxt7 tiene una
región hidrofílica y que posee el aminoácido D340 (HXT2 D331; HXT1 D280; HXT3 D337) en la
parte central de la cadena, posoción que hipotéticamente afecta la estructura de unión al
sustrato o el papel que tiene de unirse a otros residuos, estos ensayos sugieren que Asp340
interacciona con el C-1 de la D-glucosa (Mueckler et al, 1994; 2004). En este estudio el
análisis, el segmento TM7 de Hxt1, los aminoácidos Q275 (GUT1 Q282; Hxt3 Q332), G279 y
D280 (D340) están conservados para todas las cepas, pero en Fermichamp®, 3D6, 3Y2, 2Y3,
2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el polimorfismo K278T, considerando que la Lisina
(K) es un aminoácido positivo mas grande y puede estar sujeto a ubiquitinación/acetilación, se
sugiere que hipotéticamente esta modificación cambia el plegamiento de la región TM7
pudiendo afectar el tamaño del poro y la forma de señalización de la proteína con el azúcar
afectando en forma importante la funcionalidad del transportador.
Guillaume et al (2007) encontraron 6 mutaciones situadas entre la región TM9, en el lazo
externo y en la TM10 de Hxt3, esta región no ha sido identificada como crítica en el
transporte del azúcar, no obstante las mutaciones presentes pueden tener un efecto en la
proteína, ya que es se encuentran situadas exofacialmente; en Hxt1 se encontraron en la
misma región cambios de aminoácidos en la posición 418-420 y 431, el análisis de cepas
nativas y comerciales con caracteristicas vinícolas reportaron los mismos polimorfismos en la
misma región, sugiriendo que estos cambios pueden afectar positivamente el desarrollo de la
fermentación (Guillaume et al., 2007; Karpel et al; 2008). Para este trabajo, se encontró en el
transportador Hxt1 de la cepa testigo y en los aislados de mezcal, los polimorfismos
reportados por Karpel (2007) en la misma región (418-420 y 431) (TM9, el rizo medio y la
TM10). En Hxt3 se encontraron los polimorfismos en la posición 418 y 419 reportados por
Karpel (2007) pero solo para Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las
sustituciones Y402L y C401S; otro cambio notable que ocurrió solo en la cepa 3D3 que
presentó los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la región transmembranal 9. Todos
los cambios mencionados anteriormente pueden afectar considerablemente la conformación
102
estructural de ambas proteínas favoreciendo o disminuyendo el transporte de la hexosa en la
fermentación.
En ensayos realizados con levaduras mutantes (Kasahara et al, 1997; 1998; 2006; Dietvorst
2009), se encontró que en el gen Snf3 el aminoácido conservado Phe462 (Glut1 F379, Hxt1 F380,
Hxt2 F431,Hxt3 F437) situado en la TM10, este aminoácido está relacionado como sitio de
reconocimiento (o punto de unión) en la parte interna de la hélice para los azúcares fructosa,
glucosa y manosa. En las cepas analizadas se encontró que en Hxt1 del segmento TM10 esta
presente el polimorfismo L377F, para 3Y8 cerca de la posición F380, probablemente esto y
otras características (no evaluadas), favorezca el transporte tanto de la glucosa como la
fructosa a través de la membrana ya que es de las cepas que más consume estos azúcares.
Existen reportes de que en la TM11 el Triptófano se encuentra conservado en Glu1 (W412)
Hxt1 (W413), Hxt3 (W470), Muecler et al (2009) sugieren que este aminoácido aromático se
une al sustrato interaccionando con el C-6 de la piranosa. En la cepa 3D3 los polimorfismos
presentes en Hxt1 (F406S; G408A; G411A) encontrados en la TM11 se localizan cercanos al
aminácido Triptófano (W413). Kasahara (2000), reportó que la posición 504 (Phe) en Gal2 en
TM12 es crítica para el transporte de galactosa, y que este aminoácido aromático está
conservado en un gran número de transportadores de azúcar o proteínas relacionadas, se
reportó que este aminoácido fue remplazado en Hxt3 por (Phe945) y se obsevó una
disminución en el transporte de glucosa, observándose por el crecimiento de la célula sobre la
placa en medio YNB, sugiriendo que este sitio contribuye fuertemente a la discriminación del
reconocimiento en el sustrato, aun que Liang (1997) realizó ensayos con inserción y deleción
en TM12 del transportador Hxt3 encontrando que esta región no es crítica para el transporte
de glucosa. En nuestro estudio se encontró que en Hxt1 esta presente el polimorfismo L439M
en el segmento transmembranal 12, adyacente a la posición F438 (Gal2 F504) en la cepa 3D3,
posiblemente estos cambios interfieren con el sitio de reconocimiento de la glucosa ya que
3D3 es de los aislados que dejó mas de 5 g/L de glucosa residual al final de la fermentación
(dejando menos de 2 g/L de fructosa). Los polimorfismos encontrados en los genes de los
transportadores Hxt1 Y Hxt3 de las cepas aisladas de mostos de mezcal podrían ser cambios
naturales debido al proceso evolutivo incrementado por las condiciones específicas de estos
mostos, con la posibilidad acumulativa de mutaciones neutrales o tal vez negativas y/o
positivas pero es necesario realizar más investigación al respecto.
103
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
El contar con un método rápido de detección y aislamiento para levaduras Saccharomyces
cerevisiae, además que sean candidatas a consumir eficientemente la fructosa es una
herramienta predictiva muy útil en microbiología con fines de uso industrial. Debido a la
fuente fructofílica de los mostos de agave el aislamiento de levaduras con características
fructofílicas y de producción de etanol además de tolerancia a altas concentraciones de etanol,
son susceptibles de ser usadas en otros modelos fermentativos, como lo son los mostos de uva
ya que la composición de estos es aproximadamente 100 g/L de glucosa y 100g/L de fructosa,
siendo esta ultima una azúcar residual de alta concentración al final de la fermentación.
Por lo que es de gran relevancia la evaluación de la cepa 3Y3, 3Y5 3Y8 en mostos de
agave, así como en mostos de uva con un fin productivo para mezcal y vinos de mesa ya que
es necesario encontrar cepas de S. cerevisiae productivas y adaptadas a las diversas
condiciones de fermentación por que la calidad de estas bebidas alcohólicas depende entre
otras cosas al rápido establecimiento y la eficiencia de la levadura durante la fermentación.
Los resultados obtenidos del análisis de las secuencias de los transportadores mostraron
que las cepas con mayor consumo de azúcares reductores presentaron un mayor despliegue de
polimorfismos relacionados con cambios en la región interna del poro y/o en las regiones
regulatorias de acuerdo a la literatura. La cepa 3Y8 presentó el mayor número de cambios
importantes en Hxt1, Para el HXT3 los polimorfismos analizados mostraron en todas las
cepas menores cambios en relación a la Fermichamp y en lo particular para las cepas
analizadas con más detalle (3Y3, 3Y5, 3Y8) se presentó el polimorfismo Val432Cys. Los
resultados obtenidos en el análisis de los HXT1 y HXT3, sugieren la necesidad de realizar
estudios de expresión y mutagénesis en sitio dirigida para determinar las capacidades
fructofílicas de cepas de S. cerevisiae aisladas de mostos de mezcal.
104
10 APÉNDICES
Apéndice 1. Microfotografías de las levaduras Saccharomyces cerevisiae aisladas de mosto
de mezcal.
Figura 34. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX-
51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular
del microscopio. A) 3D2; B) 3D3; C) 3D4; D) 3D5; E) 3D6.
A B
C D
E
105
Figura 35. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX-
51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular
del microscopio. F) 3Y2; G) 3Y3; H) 3Y4; I) 3Y5; J) 3Y6; K) 3Y8.
F G
H I
J K
106
Apéndice 2. Secuencias 26S de las levaduras aislados de mostos de mezcal.
>3D2 Saccharomyces cerevisiae
CCGGGGTTGCCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG
GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT
GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT
CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG
TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC
TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG
TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG
GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACC
>3D3 Saccharomyces cerevisiae
GGGGCATGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG
GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT
GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT
CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG
TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC
TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG
TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG
GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACCC
>3D4 Saccharomyces cerevisiae
AGGGAATCCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG
GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT
GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT
107
CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG
TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC
TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG
TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG
GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACCGCGAACCA
>3D5 Saccharomyces cerevisiae
CGGGGAATGCCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG
GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT
GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT
CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG
TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC
TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG
TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG
GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG
>3D6 Saccharomyces cerevisiae
GGGGAAAAGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG
TACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGT
CTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA
GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC
TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG
TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC
TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG
TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG
GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACACACGGGACCA
108
>3Y2 Saccharomyces cerevisiae
CGGTATgCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCTAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACC
TTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTcTAT
GTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGC
GGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAG
TGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACA
AGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGT
GAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGC
TCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGC
AGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAA
TACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATG
GTTATATGCCGCCCGTCTTGAAAAACCCGGAACCAAA
>3Y3 Saccharomyces cerevisiae
CAAAGGGAATGCTTATACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTG
GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT
GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT
CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG
TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC
TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG
TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG
GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACCACGGACCAAAA
>3Y4 Saccharomyces cerevisiae
CGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGT
ACCTTCGGTGCCCSAgTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGtCT
aTGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTG
CGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAA
GTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAAC
AAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTAC
GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCT
109
GCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTG
GCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGG
AATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAA
TGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAA
>3Y5 Saccharomyces cerevisiae
ACAGGGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG
TACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGT
CTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA
GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC
TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG
TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC
TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG
TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG
GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG
>3Y8 Saccharomyces cerevisiae
CgGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG
TACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGT
CTATgTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAG
TGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCT
AAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGA
ACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGT
ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCT
CTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGT
GGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGG
GAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATA
ATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACAAACGGACCAA
110
Apéndice 3. Secuencias ITS’s de las levaduras aisladas de mostos de mezcal
>3D2 Saccharomyces cerevisiae
ATATTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGCAA
GAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGGGGTCTTGC
TAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTT
GTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTT
TGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAA
AGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAA
ATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAA
GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCG
AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAG
CGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAA
CTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTG
CGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTA
ATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGG
CGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAA
>3D3 Saccharomyces cerevisiae
CAAATTTGATAATTTTGAAATGGATTTTTTTATTTTTGGGAATGGAGAGCGAGCTT
TTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTG
CGCGGCCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTGGGCATACAAAACGGGGAGAGTT
TTCGGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAGCACTAGGGGGT
ATTTTCCTATCTTTTCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCAAGAGG
TAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTT
TCGTAACAGGAATTTTGAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC
TCGCATCGATGAAAAACACATCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTC
CKGGAATCATCGAATCTTTGAACGCTAATTGTTCCCTTTGGTATTCCTGGGGGCTT
GGGTGTTGGAGCGAAATTACCTACCCAAAGATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACT
CTTTGTAATAAATTTTAACTAAACGGCCTTTTCATTGAAATTTTTTTTTCTAAAAAT
TGGTTCCACGGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCTTTTTGGGTTTAACCA
CCTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAATAAGAA
AGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAAACGGGKAGGAAGAC
CCCCCTGAACTTAAGCTTCACTAAGAGCGGGGGAAGATAAA
111
>3D4 Saccharomyces cerevisiae
CAAAGATTATATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAACAAGAGAGCTTTT
ACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCG
CGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTC
TGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTT
TCAAATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAA
CAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG
TAACKGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCG
CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTCCG
GGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCAKG
CCTGTTTAAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCT
TTGGAGTTAACTTGAAATKGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGA
GGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAA
CTGCGGCTAATCTTTTTTTATACCGGAGCGTTTTGGAACGTTTTCGAAAAAAAAA
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ACCCCGCTGAACTAGCCTAAAAAGAGGGCGGGGGGAGAGAGTACAAAATTTTTA
TATTTTTGTAAAATGGAATTTTTTTTTTTTTTTTGG
>3D5 Saccharomyces cerevisiae
CAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGCTAAGAACTGAAGACCTT
TCTCTGGGTAAGAAGACAAAAAAGGGAGAGCCCAGCTGGGCCTGCGCTTAAGGG
CGCGGCTTTGCTAGGTTTGCAAGTTTCTTGCTCGCTCTTCCAAACGGTGAAATATT
TCTGAGCTTTTGTTATAGGACACTTAAAGCCGTTTCATTACATCACGCTGTGGAGT
TTTCACAGCTTAGCAACTTTTTCTTGGGGCTTTCAAGCAAGCGGGGCCCAGAGGT
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TCGTAACTGGAAATTTTAAAACATTAAAACCTTACAACAACGGATCACTTGTTTC
TCGCATCGATTAACACCCCACCGAAATGCTAATCGTACTGTGAATTGCAAAATTC
CGTGAATCATCGATTCTTTGAACACACATTGCGCCCCTKGGTATTCCGGGGGGCA
GGCCGGTTTTAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATCCT
CTTAGTAGTTAACTTGAAATTGCCGGCCTTTACCTTGGAGGTTTTTTTTCCAAAAA
TAGTTTCCTCTGCTTGCTTGAGGCATAATGCAAGTACGGTCTTTTTAGGTTTAACC
ACCAGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCCAAAAAAAAA
112
AAGCTTCTAGGCCAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAACCAGGGAGGAGTCC
CCGCTGAACTTAACCATTCAAAAAAGCGGAGGAAAAAAAG
>3Y2 Saccharomyces cerevisiae
CAGTAATAGTTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTAC
TGGGCAAGAAAACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAKTGCGCG
GTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTG
TGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTC
ATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACA
AACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTA
ACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT
CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGA
ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTKGGTATTCCAGGGGGCATGCCT
GTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTG
GAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGT
TTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTG
CGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTA
>3Y3 Saccharomyces cerevisiae
ATGATGATTCTTTTCGTTGGGCAAGAGCTGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGAAG
GCGATGGAGAGTCGGCCGGGCCTGCGCTTAAGGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAA
GTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACA
ATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTT
CTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATT
TATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATA
TTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCG
AAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAAC
GCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTT
CTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCT
GGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGT
ATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATAC
TGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTC
TTAAAAGTTTGACCT
113
>3Y4 Saccharomyces cerevisiae
CAAAGAAAATTAATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAAGCATGAG
AGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTT
AAGTGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAG
AGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGT
GGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAG
AGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGA
ATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG
TTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGA
ATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGG
GGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGA
TACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAA
AGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTT
ACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACCGAGCGTATTGGAACGTTATCGAAAAAA
AAAGAGCGTCTAGGCGAACAAGGTTTTAAAAGTTTGCCTC
>3Y5 Saccharomyces cerevisiae
TATGATGATTTTTTTCGTTGGGCAAGAGCGGAGGTTACGGAAAAAAAAGAAGGG
AGAGCAGCGGGCTGCGTTAAGTGGGGGCTGGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTG
CTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGAAAATTAAAACCGTT
TCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTC
GAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAAT
TTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTC
AACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACG
TAATGTGAATTGCAGAATTCCKTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC
CCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCT
GTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATT
GGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTA
CGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGG
AACGTTATCGATAAGAAAAAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTT
>3Y8 Saccharomyces cerevisiae
TAAATTTATAATTTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTT
TTACTGGGCAAGAAGAAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGC
114
GCGGTTTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTT
CTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTT
TTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAA
CAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG
TAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC
ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGT
GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGC
CTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTT
GGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGG
TTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACT
GCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGC
GTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGC
TGAACTTAAGCATATCAATAAACGGGGGAAAAGATCATTAAAGAAATTTAATAA
TTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCMARGGCATGGAGAGCTTTT
115
Apéndice 4. Comparación de las secuencia de los genes HXT1 de las levaduras seleccionadas
por su fructofilia.
Figura 36. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen HXT1 de aislados de
mostos de mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminoácido
idéntico; color rojo indica cambio en el aminoácido.
116
Apéndice 5. Comparación de las secuencia de los genes HXT3 de las levaduras seleccionadas
por su fructofilia.
Figura 37. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen hxt3 de Aislados de
Mostos de Mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminoácido
idéntico; color rojo indica cambio en el aminoácido
117
11 LITERATURA CITADA
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Crop Evolution 55(4): 493-510.
Zuzuarregui A, Del Olmo M. 2004. Analyses of stress resistance under laboratory conditions
constitute a suitable criterion for wine yeast selection. Antonie van Leeuwenhoek 85,
271–280.
135
12 RESUMEN BIOGRÁFICO
Amanda Alejandra Oliva Hernández Candidata para el Grado de Doctor en Ciencias
Tesis: EVALUACIÓN CINÉTICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS
FRUCTOFÍLICAS AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO
Campo de Estudio: Biotecnología con acentuación en Microbiología Datos Personales: Nacida en Reynosa, Tamaulipas el 3 de Mayo de 1968, hija de Amanda
Leticia Hernández Monreal y Gerardo Enrique Oliva Guzmán Educación: Egresada del Tecnológico de Estudios Superiores de Monterrey, grado
obtenido Ingeniera Agrónoma en Producción en 1993.
Egresada de la Universidad Autónoma de Tamaulipas, grado obtenido Maestra en Ciencia y Tecnología de Alimentos en 2007.
Experiencia Profesional: Puesto de Profesor Asociado “C” de Tiempo Completo en el
Instituto Politécnico Nacional, desde el 2003, asociada de investigación en el Laboratorio de Biotecnología Industrial (CBG-IPN).
PRODUCTIVIDAD
Presentaciones orales en congresos nacionales e internacionales
De la Torre F. J., Guido N., Oliva-Hernández A., Narváez-Zapata José A. y Larralde-Corona P. (2010) Monitoreo por técnicas moleculares (FISH y ARISA) de un cultivo mixto de levaduras durante la fermentación del mosto de agave. 7 Encuentro Nacional de Biotecnología del IPN. 11 al 13 de Octubre 2010. Mazatlán, Sinaloa.
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De la Torre- González F, Tarqui-Callejas N., Oliva-Hernández A., Narváez-Zapata J., Larralde-Corona P. 2012. Determinación de la Tolerancia de Tres Especies de Levaduras Aisladas del Mezcal Tamaulipeco. VII Congreso Nacional y XXVIII Internacional de Ingeniería Bioquímica.. 28, 29 y 30 de Marzo. Ixtapa Zihuatanejo, Guerrero, México.
Artículos científicos indexados Amanda A. Oliva Hernández, Patricia Taillandier, Diana Reséndez Pérez, José A.
Narváez Zapata, Claudia Patricia Larralde Corona. The effect of hexose ratios on metabolite production of Saccharomyces cerevisiae strains obtained from the spontaneous fermentation of mezcal. En prensa: Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology, DOI 10.1007/s10482-012-9865-1
Flores-Magallón R., Oliva-Hernández A.A., Narváez-Zapata J.A. (2011).
Characterization of microbial traits involved with the elaboration of the Cotija cheese. Food Science and Biotechnology 20(4): 997-1003.
Larralde-Corona C.P., Ramírez-Gonzalez S., Oliva-Hernández A., Pérez-Sánchez G.
Narváez-Zapata J.A. (2011). Identification of differentially expressed genes in the citrus epiphytic-yeast Pichia guilliermondii during interaction with Penicillium digitatum. Biological Control 57: 208-214.
Reyes-López, M. A., Salazar-Marroquín, E. L., Oliva-Hernández, A. A., Salinas-López,
N., Narváez-Zapata, J. A. (2009) White-spot syndrome virus diagnostic in frozen shrimp stocks imported to Mexico. CyTA Journal of Food 7: 89-94.
Capítulos en libros institucionales Arratia-Mireles J. M., Larralde-Corona C.P., Oliva-Hernández A. A., Narváez-Zapata
J.A. (2009) Estudio de la diversidad de levaduras asociadas a los mostos de mezcal. En: Avances en el Estudio de la Biotecnología. Narváez Zapata J. A., Villegas-Hernández M. C. & Mendoza Herrera A. Editorial Politécnico. 2009. ISBN: 978-607-414-060-6. pp: 42-45.
Oliva-Hernández A. A, Narváez-Zapata J.A., Resendez D., Taillander P., Larralde-
Corona C.P. (2009) Evaluación de levaduras fructofílicas aisladas del mezcal tamaulipeco. En: Avances en el Estudio de la Biotecnología. Narváez Zapata J. A., Villegas-Hernández M. C. & Mendoza Herrera A. Editorial Politécnico. 2009. ISBN: 978-607-414-060-6. pp: 191-194.
Posters en congresos nacionales e internacionales
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Larralde-Corona C.P., Oliva-Hernández A.A., Narváez-Zapata J.A., Resendez-Pérez D. y
Taillander P. 2009. Caracterización productiva de levaduras fructofílicas aisladas del mezcal Tamaulipeco. XIII Congreso nacional de Biotecnología y Bioingeniería y el VII Simposio Internacional de Producción de Alcoholes y Levaduras (SIPAL). Del 21 al 26 de Junio. Acapulco, Guerrero, México. Poster
Arratia-Mireles M., Oliva-Hernández A., De la Torre-González F., Trujillo-Negreros E.,
Narváez-Zapata J.A. y Larrralde-Corona C.P. (2009). Diversidad genética y capacidad fermentativa de levaduras involucradas en la producción del mezcal tamulipeco. XIII Congreso nacional de Biotecnología y Bioingeniería y el VII Simposio Internacional de Producción de Alcoholes y Levaduras (SIPAL). Del 21 al 26 de Junio. Acapulco, Guerrero, México.
Oliva Amanda, Narváez José, Resendez Diana, Strehaiano Pierre, Taillandier Patricia,
Larralde Patricia. 2009. Mezcal fermentation: yeast diversity and their productive characterization on high fructose synthetic medium and Agave must. 27th International Specialised Symposium on Yeasts. Institut Pasteur. Paris, France.
De la Torre-González F. J., Narváez-Zapata José A., Oliva-Hernández A. y Larralde-
Corona C.P. 2010 Caracterización de la cinética de cultivos mixtos de levaduras aisladas del mezcal Tamaulipeco. XXXVII Congreso Nacional de Microbiología. 29 de junio al 2 de Julio. Morelia, Michoacán. México
Oliva-Hernández A., Resendez D., Taillandier P., Narváez-Zapata J., Larralde-Corona
C.P. 2011. Fructose utilization by yeasts isolated from agave must. 29th International Specialised Symposium on Yeasts. Guadalajara, Jalisco. México
Narváez-Zapata J., Segura-Cabrera A., Oliva-Hernández A., Larralde-Corona C.P. 2011.
Predictive homoplasic sites in HXT1 and HXT3 transporters related to fructophilic profiles in yeasts isolated from agave must. 29th International Specialised Symposium on Yeasts. Guadalajara, Jalisco. México..
Estancias de investigación Estancia de Investigación de 3 meses en "Laboratoire de Génie Chimique UMR CNRS
5503" . INP-Toulouse, Francia. 2007. Estancia de Investigación de 3 meses en "Laboratoire de Génie Chimique UMR CNRS
5503". INP-Toulouse, Francia. 2009.
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Résumé Au Mexique l’état de Tamaulipas est susceptible de devenir l'un des plus grands producteurs de mezcal. Contrairement à d’autres boissons alcoolisées, la mycoflore responsable de la fermentation alcoolique du mezcal n'a pas été pleinement identifiée ou caractérisée métaboliquement. Il est d'un grand intérêt industriel de savoir si les levures indigènes impliquées dans la fermentation de moûts d’agave ont une forte nature fructophilique qui serait induite par la composition naturelle riche en fructose du moût. De plus, la caractérisation cinétique des levures et au niveau moléculaire des transporteurs impliqués dans la consommation de fructose par cette flore est pertinente étant donné que des études sur l'utilisation des hexoses par Saccharomyces cerevisiae n’ont pas montré que les transporteurs de glucose et de fructose étaient différents. Dans ce travail, la population levurienne étudiée était de 17 isolats, à partir de 103 initialement isolés de la mezcaleria "El Palmar" Emilio Lozoya, situé à San Carlos (Tamaulipas, Mexique) au niveau de différentes étapes. Seules les levures de l’espèce Saccharomyces cerevisiae ont été retenues et étudiées. En particulier de polymorphismes des 2 gènes des transporteurs principaux de sucres associes au fructose consume HXT1 et HXT3, a été évalué en comparaison à une souche de référence. Les résultats obtenus dans cette étude suggèrent la nécessité d'une analyse approfondie afin de préciser les liens entre la fructophilie et l'expression et / ou la structure des gènes des transporteurs de sucres lors de la fermentation alcoolique. Mots clés: Mezcal, Saccharomyces cerevisiae, transporteurs d’hexoses HXT, fructophile, fermentation alcoolique
Abstract The Mexican state of Tamaulipas has the potential to become one of the main producers of mezcal. But contrary to what is known about other alcoholic beverages, the mycoflora involved in this alcoholic fermentation has not been completely identified nor characterised from the metabolic point of view. There is an increasing industrial interest on knowing if the native yeasts associated to agave must fermentations possess a fructophilic behaviour, favoured by the natural high fructose composition of the agave musts. Moreover, the kinetic characterisation of these yeasts and the molecular analysis carried out on the hexose transporters genes reported to be involved in the glucose and fructose consumption is pertinent, and several studies on Saccharomyces cerevisiae have demonstrated a differential preference for each hexose. In this study, a set of 17 yeast isolates were chosen from an original collection of 103 yeast isolated at the mezcalería El Palmar Emilio Lozoya, which is located at San Carlos (Tamaulipas, Mexico) from different stages of the fermentation. Only those belonging to S. cerevisiae specie were studied, mainly concerning the polymorphisms found on their two main hexose transporter genes associated to a preferential consumption of fructose, HXT1 and HXT3, and results compared to a control strain. The results obtained showed that there is no a direct link between the fructophilic phenotype and/or the structure of these genes and that more studies are needed to establish such relationships. Keywords: Mezcal, Saccharomyces cerevisiae, hexose transporters HXT, fructophilic, alcoholic fermentation
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