méthodes d’évaluation de la · la toxicologie in vivo la toxicologie in vitro: les 3r et le...

Méthodes d’évaluation de la

toxicité

Toxicologie expérimentale in vitro

et in vivo

Laboratoire des Réponses Moléculaires et Cellulaires aux Xénobiotiques

Unité BFA – UMR CNRS 8251Université Paris Diderot

Pr Armelle BAEZA-SQUIBAN

DIU Toxicologie médicale

baeza@univ-paris-diderot.fr

Plan du cours

Introduction

La toxicologie in vivo

La toxicologie in vitro: Les 3R et le contexte réglementaire

o Quelques exemples de tests réglementaires

Les différents types de culture

Les évolutions technologiques en appui à l’évaluation des effets

La toxicologie prédictive

Ex de cultures cellulaires (épithélium respiratoire)

Evaluation de la toxicité: contribution à l’évaluation

des risques des substances

Ex d’applications concrètes

Étiquetage relatif au danger des

substancesMesures de gestion en milieu professionnel

Établissement de Valeurs Toxicologiques de Référence

Objectif: Protection du consommateur, des travailleurs,

de la population, de l’environnement

Exposition Dangereffet sanitaire indésirable

Quels sont le(s)organe(s) cible(s)?

Quel type de réponse toxique?

Etablir la relation dose-réponse

EXPOSITION: quantité de substance disponible pour l’absorption

DOSE: quantité de substance

réellement absorbée

- Epidémiologie

- Etudes expérimentales in

vivo et in vitro

Probabilité de la survenue d’un effet néfaste lors de l’exposition à une substance

Evaluation du risque

Risque = X

Xénobiotiques

Toxique direct

Interactions avec les macromolécules

cellulaires(protéines, lipides, acides nucléiques)

Toxique

indirect:

protoxique

Métabolisation

Réponse du

système

immunitaire

Effets spécifiques sur

les tissus(foie, reins, poumons, …)

Toxicité

génétique

Effets immunotoxiques(allergie, immunodépression)

Organotoxicité(hépatite, néphrite…)

Cancer(sarcomes,

lymphomes)

Effets

tératogènes(malformations)

Vieillissement

cellulaire

mutationsinflammation

toxiqueInteractions

macromoléculairesRéponses cellulaires

Réponses des organes

Réponses de l’organisme

Propriétés chimiques

Interaction récepteur/ligand

Liaison à l’ADN

Oxydation des protéines

Activation de gènes

Production de protéines

Signalisation perturbée

Physiologiealtérée

Homéostasie

Développement et fonctions

tissulaires altérées

mortalité

Développement réduit

Reproduction anormale

55

décrit le lien causal entre

• un évènement moléculaire initiateur provoqué par le toxique,

• des évènements clés intermédiaires (réponses cellulaires et moléculaires,

atteintes physiologiques)

• et l’effet indésirable pour un individu ou une population

AOP: adverse outcome pathways

Approches expérimentales

In vivo

1 2 3 4

A

B

C

In vitro

Modélisation

In silico

QSAR f=

PBPK

toxique Interactions

macromoléculaires

Réponses

cellulaires

Réponses des

organes

Réponses de

l’organisme

Dans « Toxicologie » ed Dunod

Evaluation de la toxicité

Expositions humaines contrôlées

Extrêmement rare

Approches expérimentales

In vivo

1 2 3 4

A

B

C

In vitro

Modélisation

In silico

QSAR f=

PBPK

toxique Interactions

macromoléculaires

Réponses

cellulaires

Réponses des

organes

Réponses de

l’organisme

Dans « Toxicologie » ed Dunod

Evaluation de la toxicité

Principe de la toxicologie expérimentale chez l’animal

Mortalité, autres effets toxiques

témoin Doses croissantes

Animaux sains (/ malade: pathologie pré-existante

spontanée ou provoquée)

Animaux jeunes, âgés

Génétiquement modifiés

humanisés

Voies d’expositionVoie oraleVoie respiratoire Voie cutanée

Modèles animaux

Durée d’exposition

aiguë

Quelques jours

< 1 mois

90 jours

Plus de 3 mois

subaiguë

subchronique

chronique

Courbe dose-réponse

dose

réponse

50

100

Dose létale/efficace 50

organes cibles

réponse toxique

relation dose-réponse

Objectifs de la toxicologie expérimentale chez l’animal

dose

réponse

50

100

Dose sans effet nocif observé

(DSENO = NOAEL)

Dose minima avec effet nocif observé

(LOAEL)

Pour dériver VTR: valeurs toxicologiques de

référence

organes cibles

réponse toxique

relation dose-réponse

Objectifs de la toxicologie expérimentale chez l’animal

Courbe dose-réponse

Voies d’expositionVoie oraleVoie respiratoire Voie cutanée

Modèles animaux

Durée d’exposition Paramètres de toxicité

Toxicité aiguë:systémique (détermination DL50)locale: - irritation, corrosion

- sensibilisation cutanée

Toxicité subaiguë/subchronique/chroniqueidentification organe(s) cible(s), de l’effet critique, détermination de NOAEL

Toxicité pour la reproduction et le développement prénatal

Mutagénicité

Cancérogénicité

aiguë

Quelques jours

< 1 mois

90 jours

Plus de 3 mois

subaiguë

subchronique

chronique

Toxicité Aiguë

1 administration par voie orale

(animaux mis à jeun 16h auparavant)

1 exposition continue pendant 4h par inhalation

1 application de 24 h par voie dermique

(flanc et dos rasés 24h auparavant, bandage semi-

occlusif)

Détermination de la DL50

pour comparaison des molécules entre elles

aiguë

Quelques jours

Paramètres enregistrés pendant 14 jours:Mortalité, signes cliniques, poids corporel,

Observations macroscopiques à l’autopsie

catégorie

DL50 orale

Rat

mg/kg

DL50

cutanée

Rat ou lapin

mg/kg

CL50

inhalatoire

Rat

mg/L/4hrs

très toxique 25 50 0.5

toxique 25-200 50-400 0.5-2

nocive 200-2000 400-2000 2-20

Toxicité Aiguë aiguë

Quelques jours

Etudes par administrations répétées

Buts:

•Mettre en évidence des altérations fonctionnelles et/ou

anatomo-pathologiques

Effets toxiques systémiques/locaux,

Effets toxiques généraux ou spécifiques, organes cibles

•Déterminer la limite d’innocuité expérimentale

NOAEL: No observed adverse effect level (VTR)

< 1 mois

90 jours

Plus de 3 mois

subaiguë

subchronique

chronique

Problèmes éthiques

Réduction ou interdiction de l’expérimentation animale

Reach Directive cosmétiques

Cout, durée

Extrapolation à l’homme:

Problèmes de la toxicologie expérimentale chez l’animal

Pas suffisant de substances évaluées

prédictivité?

Approches expérimentales

In vivo

1 2 3 4

A

B

C

In vitro

Modélisation

In silico

QSAR f=

PBPK

toxique Interactions

macromoléculaires

Réponses

cellulaires

Réponses des

organes

Réponses de

l’organisme

Evaluation de la toxicité

Refine: raffiner

Espèces moins sensibles

Réduire douleur et détresse

techniques exploratoires non invasives

Reduce: réduire

Réduire le nombre d’animaux

Partage banque de données

-omics

Replace: remplacement

Études in vitro (tissus, cellules, molécules)

Études in silico (modélisation)

Etudes de chimie analytique

Les 3 R (Russel and Burch, 1959)

viabilité, autres atteintes cellulaires

témoin Doses croissantes

In vitro sur cultures cellulaires

cardiomyocytesfibroblastes

hépatocytesCellules rénales

kératinocytesCellules

endothéliales

neurones

chondrocytes

Cellules humaines

Types cellulaires

représentatifs des

différents organes

Principe de la toxicologie expérimentale in vitro

REMPLACER

Facilité de mise en œuvre (études à haut débit)

Moindre coût (animaux)

Etude des mécanismes d’action

Utilisation de cellules humaines: plus de barrières inter-espèces

Les cultures cellulaires en alternative à

l’expérimentation animale

REMPLACER

Les cultures cellulaires en alternatives à

l’expérimentation animale

fonctionnalité des modèles cellulaires

Culture non homéostasique

Non adapté à certains produits à tester

MAIS

Joint Research Center

ISPRA (Italy)

Directive 86/609/EEC** on the protection of animals used for

experimental and other scientific purposes,

the Commission and the Member States should actively support the

development, validation and acceptance of methods which could

reduce, refine or replace the use of laboratory animals

Création de l’ECVAM en 1991:

European Center For Validation of

Alternative Methods

Le rôle de l’Union Européenne

Une méthode recevable par les autorités réglementaires doit être validée afin

d’apporter la preuve

de sa pertinence,

de sa capacité à détecter les effets observés chez l’animal ou chez

l’homme

de sa reproductibilité

Validation des méthodes in vitro au niveau réglementaire

Processus très long

Etapes pour le remplacement d'un test

réglementaire existant par une nouvelle méthode:

•l'élaboration de la méthode pour le test

•la prévalidation;

•la validation;

•la révision par les pairs ou l'évaluation indépendante

•l'acceptation au niveau réglementaire

Réglementation Expérimentation animale encore dominante

Besoin de méthodes alternatives validées et acceptées

REACHCosmétiques:Depuis 2009 :

interdiction de commercialiser en

Europe des ingrédients et produits qui

ont été testés chez l’animal pour

évaluer les effets aigus et locaux

En 2013:

interdiction de commercialiser en

Europe des ingrédients et produits qui

auront été testés chez l’animal pour

évaluer les effets systémiques et/ou à

long terme

Enregistrement

Evaluation

Autorisation

des substances chimiques

Méthodes in vitro et réglementation

En complément des études in

vivo pour fournir des explications

mécanistiques

Situation actuelle•corrosion

•irritation de la peau

•Phototoxicité

•absorption dermique

•mutagénicité/génotoxicité

•toxicité par doses répétées

•Carcinogénicité

• toxicité pour la reproduction

•toxicocinétique

Mais……

Méthodes in vitro validées

sensibilisation cutanée

OCDE: Essai n° 431: Corrosion cutanée in vitro :

Essai sur modèle de peau humaine

Produit à tester

ou contrôle positif (KOH 8N)

Peau humaine reconstruite

3 min

1h

Test MTT

Substance corrosive pour la peau si:

Viabilité après 3min < 50%

Viabilité après 3min ≥ 50% et viabilité après 1h <15%

Substance non corrosive pour la peau si:

Viabilité après 3min ≥ 50% et viabilité après 1h ≥ 15%

viabilité cellulaire

Test WST-1

WST-1 Formasan

Soluble

l d’absorption 450 nm

EpiDerm SIT / SkinEthic RHE assay

Application d’une

substance liquide

Application d’une

substance solide

Application

42 min

rinçage

42 heuresMTT

SDS 5%

contrôle +

Substance irritante pour la peau si:

Viabilité < 50%

Substance non irritante pour la peau si:

Viabilité ≥ 50%

+ IL-1a

Irritation cutanée in vitro :

Essai sur modèle de peau humaine

OCDE: Essai n° 432: Essai de phototoxicité in vitro

3T3 NRU

NRU: neutral red uptake

Évaluation de la viabilité cellulaire

1 h incubation

avec le toxique

50 min

5J/cm²

Poursuivre l’incubation 22h

viabilité cellulaire

Test Rouge Neutre

l d’absorption 540 nm

S’accumule dans les lysosomes des cellules normales

Essai de phototoxicité in vitro

3T3 NRU

La sensibilisation cutanée

Nécessité d’associer plusieurs tests illustrant les différentes étapes de l’AOP

Les différents types de cultures

cellulaires

• cultures organotypiques

• cultures primaires

• lignées cellulaires :

- d’origine cancéreuse

- immortalisées / transforméesAmerican tissue culture collection (ATCC)

• cultures organotypiques:

• cultures primaires:

La culture est réalisée à partir d'un tissu ou fragment d’organe

cellules non immortelles,

sujettes au phénomène de sénescence

dédifférenciation

Confluent culture of fœtal kidney cells

• lignées cellulaires :

- d’origine cancéreuses- immortalisées / transfectées

HeLa

Le challenge :

maintenir la différenciation cellulaire

Rôle du microenvironnement

• cultures primaires

Rôle de la matrice extracellulaire (collagène, Matrigel)

Rôle de la polarité cellulaire

Les "solutions" :

- cultures sur filtres (Transwell®)

- cultures tridimensionnelles ("beads")

- co-cultures

• lignées bien différenciées (ex : CaCo2)

Les évolutions technologiques en appui à l’utilisation des

approches in vitro

Toxicology

Testing in the

21st Century

Analyse cellulaire multiparamétrique La cellomique

Combinaison de sondes indicatrices de

différents mécanismes d’action

-Hoescht : comptage cellulaire, changements nucléaires

-Iodure de propidium: viabilité cellulaire

-Methyl rodhamine: potentiel membranaire mitochondrial

-BODIPY 665: peroxydation lipidique

- Fluo-4AM: concentration en Ca2+ intracellulaire

Caractérisation phénotypique à

l’échelle de la cellule

High Content screening

Claude et al, Med Sci

La toxicologie et les -omiques

Culture cellulaire et microfluidique: vers la toxicocinétique in vitro

HμRELflow™

25% 9%66%

QSAR

PBPK

bioinformatique,

biostatistiques

La toxicologie prédictive

• les méthodes in vitro : • les méthodes in silico

Cultures cellulaires: 2D - 3D

méthodes haut débit:

High-throughput screening: HTS

• Toxicologie systémique:

-omics

Modélisation des

interactions

Physiology Based PharmacoKinetics (PBPK)

calculer les doses internes à partird’une dose administrée.

extrapolation des résultats• de l’animal à l’humain, • des fortes doses vers les faibles

doses (et inversement) • d’une voie d’exposition à une

autre. • entre scénarios d’exposition

(exposition continue ou aiguë) • entre individus (variabilité

interindividuelle). • vitro – vivo (et inversement)

Un exemple de culture

cellulaire :

L’épithélium respiratoire

humain

Appareil respiratoire

Voies aériennes: zone de conduction

Alvéoles: zone respiratoire

•Supérieures

•inférieures

Surface alvéolaire: 100m²

Surface capillaire: 120m²15 m3 d’air /jour

Epithélium bronchique / alvéolaire

Les différents modèles de culture

d’épithélium respiratoire

Culture organotypique

Cultures primaires

À partir d’explants de trachée ou de

polypes/cornets nasaux

À partir de cellules dissociées

Obtention de lignées permanentes ou de

lignées transfectées

Lignées provenant de carcinomes

respiratoires (A549, NCIH-292, Calu-3)

Lignées transformées (16HBE, BEAS-2B, ATI)

Culture organotypique

Les différents modèles de culture

d’épithélium respiratoire

Culture organotypique

Cultures primaires

À partir d’explants de trachée ou de

polypes/cornets nasaux

À partir de cellules dissociées

Obtention de lignées permanentes ou de

lignées transfectées

Lignées provenant de carcinomes

respiratoires (A549, NCIH-292, Calu-3)

Lignées transformées (16HBE, BEAS-2B, ATI)

Explants

de 2mm2

Prélèvement

de la trachéeOuverture

de la trachéeDissection sous

loupe binoculaire

1,2 ml de gel de collagène

( type 1)•Collagène

•SVF

•MEM

•NaOH2 h d’attachement

200 µl de milieu de culture:•MEM

•10 % SVF

•Fungizone 2.5 µg/ml

•Insuline 5 µg/ml

•EGF 25 ng/ml

•Transferine 5µg/ml

•Hydrocortisone 92 ng/ml

BP: Ø 35 mm

Culture par la méthode des explants

MEB

Explant et tapis cellulaire

adjacentle tapis cellulaire

10µm 10µm

Les différents modèles de culture

d’épithélium respiratoire

Culture organotypique

Cultures primaires

À partir d’explants de trachée ou de

polypes/cornets nasaux

À partir de cellules dissociées

Obtention de lignées permanentes ou de

lignées transfectées

Lignées provenant de carcinomes

respiratoires (A549, NCIH-292, Calu-3)

Lignées transformées (16HBE, BEAS-2B, ATI)

Pronase:

2mg/ml de milieu

20 h, 4°c

•Milieu + 10% de sérum

•Filtration (nylon: Ø 30µm)

•Préplating sur plastique (1h30)

Ensemencement

sur boite

revêtue de collagène

Culture de cellules dissociées

Culture submergée Culture IAL

Culture à l’interface air-liquide

IAL

+ rétinoïde

0,1µM

- rétinoïde

DIFFERENCIATION

EPIDERMOIDE

DIFFERENCIATION

MUCOCILIAIRE

Cellules dissociées 30 000 cellules/cm2

confluence

300 µl

700 µl

milieu DMEM/F12-BEGM (CloneticsTM):•Insuline 0.5 µg/ml

•EGF 0.5 ng/ml

•Transferrine 10 µg/ml

•Hydrocortisone 0.5 µg/ml

•Epinéphrine 0.5 µg/ml

•Triiodothyronine 6.5 ng/ml

•Gentamycine 50µg/ml

•Amphotéricine 50 ng/ml

•Extrait de glande pituitaire 0.13 mg/ml

•BSA 1.5 µg/ml

Insert (Transwell, Costar) coatés par 10µg/cm2 de collagène de placenta humain

Modèle de culture en Interface Air-Liquide

Epithelix

Unsupervised hierarchical clustering of airway epithelial cells.

Pezzulo A A et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2011;300:L25-L31

Laser scanning micrograph of the triple cell co-culture. The macrophages (red) and the epithelial cells

(blue) are located at the upper side of the transwell membrane (A, scale bar=5 μm), whereas the dendritic

cells (yellow) are located at the basal side (B, scale bar=10 μm).

Cellules

dendritiques

81±19

Macrophages

107±42

epithelial cells

4382±524

co-cultures

cellules épithéliales + macrophages + cellules dendritiques

Les différents modèles de culture

d’épithélium respiratoire

Culture organotypique

Cultures primaires

À partir d’explants de trachée ou de

polypes/cornets nasaux

À partir de cellules dissociées

Obtention de lignées permanentes ou de

lignées transfectées

Lignées provenant de carcinomes

respiratoires (A549, NCIH-292, Calu-3)

Lignées transformées (16HBE, BEAS-2B, ATI)

Quel mode d’exposition?

Méthodes d’exposition in vitro à des polluants atmosphériques

Exposition indirecte

Les cultures sont exposées au toxique solubilisé ou resuspendu dans le milieu de culture

Les cultures sont exposées à des échantillons d’air collectés par filtration ou par des méthodes de bullage

Exposition directe

particules

Méthodes d’exposition in vitro à des polluants atmosphériques

Exposition indirecte

Exposition directe

Exposition submergée

Le gaz est introduit dans la suspension cellulaire submergée à l’aide de tubes

Exposition intermittente

Exposition directe continue

Les cellules sont exposées alternativement au composé gazeux et au milieu de culture

Les cellules sont continuellement exposées au toxique placé du coté apical alors que les cellules sont nourries du côté basolatéral

Exposition statique Exposition dynamique

Système d’exposition

aux polluants gazeuxChambre d’exposition

Diluteur de gaz Dial 1000

Gaz

vecteur

SO2

Piège du flux

gazeux sortant

Hotte

extractive

Flux gazeux sortant

Flux gazeux entrantCirculation

d’eau chaude

Bain marie

Cultures primaires d’explants de trachée

Exposition directe intermittente

MEB

10µm

témoin

SO2 10 ppm,

1 h d’exposition

Exposition directe continue

Les cellules sont continuellement exposées au toxique placé du coté apical alors

que les cellules sont nourries du côté basolatéral

Exposition statique Exposition dynamique

Exposition dynamique

Vitrocell® system

Huh et al, Science 2010

« Organ-on-a-chip » Reconstitution in vitro de la barrière alvéolo-capillaire

soumise à des forces d’étirement

PDMS (poly(dimethylsiloxane)

Huh et al, Science 2010