les potentialités métaboliques des bactéries lactiques
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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la
Recherche Scientifique
UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA Faculté des Sciences
Département de Biologie Laboratoire de Microbiologie Appliquée
Thèse de Doctorat d’Etat Option : Microbiologie Alimentaire
Titre
Les potentialités métaboliques des bactéries lactiques isolées du lait cru de
chèvre dans le bio-contrôle de Staphylococcus aureus
Présentée par : GUESSAS Bettache
Président : Pr. EL-ABOUDI A. K. Université d’Oran
Examinateur : Pr. HENNI J. E. Université d’Oran
Examinateur : Pr. AOUES A. Université d’Oran
Examinateur : Dr. MOUSSA BOUDJEMA B. Université d’Oran
Rapporteur : Pr. KIHAL M. Université d’Oran
Année Universitaire 2006-2007
I
Sommaire
Résumé ....................................................................................................................................... IIISummary....................................................................................................................................VIIntroduction ................................................................................................................................11. Revue bibliographique ........................................................................................................31. 1. Problématique. .................................................................................................................31.2 Les bactéries lactiques .....................................................................................................41.3. Définition des bactériocines ..........................................................................................51.4. Ecologie des Bactériocines.............................................................................................81.5. Détermination de l’activité de la bacteriocine .........................................................91.6. Classification des Bactériocines ................................................................................121.7. Génétique, Biosynthèse et Mode d'Action ..............................................................15
1.7.1. Organisation des gènes: génétique et biosynthèse ......................................151.7.2. Les voies de biosynthèse ......................................................................................161.7.3. Modification post-translationnelle, activation et transport ......................201.7.4. Régulation de la biosynthèse ..............................................................................221.7.5. L’immunité chez la souche productrice...........................................................231.7.6. Mode d'action ...........................................................................................................24
1.8. Production et Modélisation du processus ..............................................................301.9. Purification des bactériocines ....................................................................................311.10. Résistance.......................................................................................................................321.11. Caractérisation des bactériocines...........................................................................33
1.11.1. La nisine ..................................................................................................................341.12. Spectres d'activité des bactériocines .....................................................................401.13. Propriétés ........................................................................................................................431.14. Applications dans les aliments ................................................................................44
1.14.1. Biopreservation des produits à base de viande..........................................451.14.2. Biopreservation des produits laitiers .............................................................491.14.3. Biopreservation des produits de la mer ........................................................52
1.15. Obstacles technologiques et sécurité alimentaire .............................................531.16. Bactériocines et emballage........................................................................................551.17. Observations finales ....................................................................................................582. Matériel et méthodes......................................................................................................... 582.1. Provenances des échantillons du lait ..................................................................... 582.2. Isolement et identification de la flore lactique ...................................................... 58
2. 2.1. Préparation de l’échantillon ............................................................................... 582.2.2. Identification des isolats. ..................................................................................... 59
2.2.2.1. Caractérisation morphologiques macroscopique et microscopique592.2.2.2. Identification des souches bactériennes ................................................. 59
2.3. Conservation des souches bactériennes................................................................. 642.3.1. Conservation courte durée .................................................................................. 642.3.2. Conservation longue durée.................................................................................. 64
2.4. Caractérisation technologiques ................................................................................. 652.4.1. Production de l’acidité titrable ........................................................................... 652.4.2. Utilisation du citrate en présence de sucre fermentescible (glucose) ... 662.4.3. Production des composés aromatiques........................................................... 662.4.4. Production des enzymes protéolytiques .......................................................... 662.4.5. Production de dextran. ......................................................................................... 67
II
2.5. Etude des interactions bactériennes........................................................................682.5.1. Recherche des substances antimicrobiennes................................................682.5.2. Détermination de la nature de l’agent inhibiteur. .......................................692.5.3. Etude des interactions Staphylococcus-bactéries lactiques ....................70
2.6. Etude de la cinétique de croissance en culture mixte........................................713. Résultats ...............................................................................................................................754. Discussion générale.........................................................................................................1185. Conclusion générale ........................................................................................................1246. Références bibliographiques .........................................................................................127الملخص ..........................................................................................................................................144Annexe ......................................................................................................................................145
III
A mes parentsA ma femme et mes enfants
IV
Remerciements
V
Résumé
Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des
agents protecteurs dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes
dans une grande variété d'aliments, tel que les laits fermentés, les yaourts, les
fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi, différentes souches d'intérêt
commerciale ou scientifique y sont couramment isolées. La contamination des
aliments est un problème majeur pour le consommateur surtout dans la
période estivale. Dans ce travail, 206 souches de bactéries lactiques ont été
isolées et identifie à partir du lait cru de chèvre des régions ouest du pays. Les
lactocoques est le groupe représentatif de cette flore avec 76,16%, les
streptocoques thermophiles ne sont représentés que par 14,78%, En revanche,
les leuconostoques ne représente que 8,6% de cette flore lactique. L’espèce
dominante est Lactococcus lactis subsp. lactis. Chez les lactobacilles,
Lactobacillus curvatus est l’espèce dominante. Lactobacillus acidophilus est la
mois représentée avec seulement 2,19%. L’étude des interactions a révélé la
capacité de deux souche Lc7 et Lc8 à inhiber Staphylococcus aureus. En
culture mixte, la souche lactique Lc8 diminue considérablement la croissance
de Staphylococcus aureus après quelques heures et elle est de 6 log cfu. Les
différents tests révèlent la nature proteique de cette substance impliquée dans
l’inhibition de Staphylococcus aureus. L’optimisation de la méthode de
recherche de souches lactiques protéolytiques a été investie et la concentration
de 2% était celle qui permet de déceler les souches faiblement protéolytiques
comme celle de forte activité prteolytique.
Mots clés : lait cru, chèvre, bactéries lactiques, Staphylococcus, culture mixte,bactériocine-like, protéolyse
VI
Summary
The lactic acid bacteria have been used for several centuries like
protective agents in fermented food. These bacteria are present in a large
variety of food, such as fermented milks, the fermented yoghourts, cheeses,
and meat products. Thus, various strains of commercial interest or scientist
are usually isolated there. The contamination of food is a major problem for the
consumer especially during the estival time. In this work, 206 strains of lactic
acid bacteria were insolated and identifies from raw goat’s milk in western
areas of the country. The lactocoques is the representative group of this flora
with 76,16%, thermophilous streptocoques are represented only by 14,78%, On
the other hand, the leuconostoques accounts are only 8,6% of this lactic flora.
The dominant species is Lactococcus lactis subsp. lactis. At the lactobacilles,
Lactobacillus curvatus is the dominant species. Lactobacillus acidophilus is the
month represented with only 2,19%. The study of the interactions revealed the
capacity of two strains Lc7 and Lc8 to inhibit Staphylococcus aureus. In mixed
culture, the lactic strain Lc8 decreases considerably the growth of
Staphylococcus aureus after a few hours and it is 6 log cfu. The various tests
reveal the proteic nature of this substance implied in the inhibition of
Staphylococcus aureus. The optimization of the method of search for proteolytic
lactic stocks was invested and the concentration of 2% was that which makes
it possible to detect the strains slightly proteolytic like that of strong prteolytic
activity
Key words: raw milk, goat, lactic acid bacteria, Staphylococcus, mixed culture,
bactériocine-like, proteolysis
1
Introduction
Depuis toujours, les bactéries sont présentes dans notre alimentation.
Certaines d'entre elles dont les bactéries lactiques, sont utiles, d'autres, comme
les bactéries pathogènes ne le sont pas. Depuis l'époque de Louis Pasteur et
Robert Koch, il y a eu un besoin essentiel d'identification scientifique pour
contrôler les micro-organismes de l’environnement. En plus, la découverte de
la pénicilline par Alexander Flemming en 1929 a ouvert la porte pour l’usage
thérapeutique des antibiotiques dans le domaine médical et vétérinaire afin de
lutter contre les microorganismes pathogènes. Bien que l'utilisation des
antibiotiques soient interdite dans les aliments, il y a d'autres agents
chimiques de conservation et additifs alimentaires, qui ont des propriétés
antimicrobiennes, sont devenus une conduite de la marque dans la sécurité et
la conservation des aliments. Actuellement, les scientifiques exploitent les
interactions microbiennes pour assurer la salubrité des aliments et pour
réduire d’une façon considérable la présence des microorganismes indésirables
et nuisibles. En plus de l’effet protecteur de l’acide lactique, l’acide acétique, le
diacetyle et le peroxyde d’oxygène, la découverte des bactériocines a donné un
élan pour le développement d’aliments de qualité sanitaire meilleure.
Le but de cette étude a donc été l'isolement des souches de bactéries lactiques
productrices de substances antimicrobiennes type bactériocine. De pouvoir
identifier correctement l'agent et la substance active. De plus. il a fallut
identifier les souches productrices et les souches sensibles et de déterminer
ainsi le spectre d'activité vis avis des microorganismes impliqués dans les
intoxications alimentaires en Algérie. Finalement, l'étude d'interaction et la
confrontation en milieu lait entre la souche de bactérie lactique productrice et
une souche de Staphylococcus aureus a été réalisée. Les objectifs de recherche
de la thèse ont donc été les suivantes :-
-.Isolement des souches de bactéries lactiques productrices de
bactériocines
- Caractérisation des substances antimicrobiennes
- Effet antagoniste vis-à-vis de Staphylococcus aureus en milieu lait.
2
Revue bibliographique sur les
bactériocines des bactéries
lactiques et leurs applications
dans la conservation des aliments
Revue bibliographique
3
1. Revue bibliographique
1. 1. Problématique.
Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des
agents protecteurs dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes
dans une grande variété d'aliments, tel que les laits fermentés, les yaourts, les
fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi, différentes souches d'intérêt
commerciale ou scientifique y sont couramment isolées. Les bactéries
lactiques, comme les lactocoques et les lactobaciIles, sont utilisées pour leurs
différentes propriétés, surtout celle de pouvoir fermenter le lactose. Cette
propriété permet d'améliorer les qualités organoleptiques d'un aliment grâce
aux différents composés de la fermentation (diacétyl, divers acides organiques,
etc.). La fermentation permet également d'augmenter la durée de vie des
aliments. En effet. I'acidification des aliments par la production d'acide lactique
permet d'inhiber la croissance de la plupart des bactéries indésirables.
Ces deux dernières décennies, une variété de bactériocines, produites par des
bactéries et inhibant la croissance d'autres bactéries, ont été identifiées et
caractérisées biochimiquement et génétiquement. Cette revue bibliographique
est consacrée à l'étude de l'écologie des bactériocines, détermination de leurs
activités, leur biosynthèse et leur mode d'action. La modélisation de la
production de bactériocines est aussi discutée. La nisine est la seule
bactériocine actuellement purifiée et approuvé pour son usage dans la
biopréservation des aliments. La nisine est utilisée avec succès comme un
agent de conservation des aliments dans plus de 50 pays. Ce travail est axé sur
l'étude des bactériocines du produites par les bactéries lactiques. Le
développement des études sur les bactériocines permet de révéler d'autres
molécules qui ont un large spectre d'activité et qui seront utilisées comme
agents de conservation des aliments. Bien que utilisation de la nisine soit
autorisée dans plus de 50 pays (Sahl et Bierbaum, 1998), l'émergence de
souches résistantes à la nisine accroît l'intérêt porté sur les autres
bactériocines. En effet, des souches résistantes à certaines bactériocines ont
déjà été isolées; c'est notamment le cas pour la nisine et la pediocine (Goulhen
et al., 1998; Ennahar et al., 2000a). Ceci dit, l'émergence de souches
résistantes à la nisine sur le marché alimentaire, doit être considérée et les
Revue bibliographique
4
précautions appropriées doivent être prises. Ainsi, la recherche de nouvelles
bactériocines et la caractérisation de leurs propriétés physiologique,
biochimique et génétique dans différents domaines de recherche mis de l'avant
pour offrir aux industriels des alternatives à la nisine.
1.2 Les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont des micro-organismes utiles à l'homme lui
permettant de fabriquer et de conserver un grand nombre de ses aliments. Les
bactéries lactiques ont été isolées pour la première fois à partir du lait
(Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972; et Carr et al., 2002). Les bactéries
lactiques sont Gram positive, immobiles, asporulées, de formes coccoide ou
bâtonnet, fermentant toutes les carbohydrates en acide lactique
principalement.
Figure 1. Schéma montrant l’arbre phylogénique basée sur la comparaison dugène de l’ARN 16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentageCG et la relation lointaine avec les germes à gram positif de haut pourcentageCG du genre Bifidobacterium et propionibacterium (Holzapfel et al., 2001)
Revue bibliographique
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Les bactéries lactiques appartiennent aux genres suivants: Carnobacterium,
Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc,
Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus et Weissella (Vandamme et al., 1996; Stiles et Holzapfel, 1997,
Axelson, 2004)(Figure 1). D’autres bactéries gram positive non sporulées et
productrices d’acide lactique appartenant à la famille des actinobacteriacée et
au genre, Aerococcus, Microbacterium, et Propionibacterium (Sneath et Holt,
2001) ainsi que le genre Bifidobacterium (Gibson et Fuller, 2000; Holzapfel et
al., 2001) sont aussi impliquées dans l’industrie agro-alimentaire.
Les travaux récents sur la taxonomie effectué sur la caractérisation des
bactéries lactiques basée l’étude de la comparaison de l’ARN ribosomal 16S ont
révélé une différence dans les relation entre les la caractérisation phénotypique
et la caractérisation phylogénique. Les techniques de biologie moléculaire
spécialement la PCR (réaction de la chaine polymerase) , RFLP (Restriction
Fragment Long Polymorphisme), DGGE (Electrophorèse en Gradient Gel
Dénaturé) et TGGE (Gèl Eléctrophorèse en Gradient de Température) sont
utilisées pour confirmer l’identification précise des espèces bactériennes.
1.3. Définition des bactériocines
La découverte de la première bactériocine remonte à 1925. Cette
dernière, isolée d'Escherichia coli, possédait une activité bactéricide envers une
autre souche de E. coli. Elle fut nommée colicine V (Gratia 1925). À cette
époque, le concept de compétition entre diverses bactéries était instauré et bien
accepté. Par contre, celui où des bactéries inhibent la croissance de souches de
la même famille diffère des conceptions établies. La découverte d'une
bactériocine chez les lactocoques remonte à 1933. À cette époque, Whitehead
(1933) avait observé dans un lot de lait spécifique que la présence de deux
souches de lactocoques inhibait la croissance d'un ferment de culture
fromagère. L'étude démontra que les deux lactocoques produisaient une
substance de nature protéique résistante au traitement thermique. Ce n'est
qu'en 1944 que la première bactériocine d'origine lactique, la diplococcine, fut
identifiée. C'est en 1951 que l'utilisation de bactériocine pour protéger les
aliments fut proposée. En effet, Hirsch et al. (1951) démontrèrent que la nisine
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6
inhibait la croissance de Clostridium lors de la maturation d'un fromage de type
suisse.
Les bactériocines diffèrent de la plupart des antibiotiques thérapeutiques par
leur composition protéique et possèdent généralement une spécificité d'action
étroite contre les mêmes espèces (Tagg et al., 1976). Les bactériocines sont des
polypeptides synthétisés par les ribosomes et possédant une activité
bactéricide. Elles sont produites par les bactéries et possédant des propriétés
antibactériennes, mais ne portant pas le nom d'antibiotiques afin d'éviter la
confusion; car les antibiotiques thérapeutiques conservent des réactions
potentiellement allergiques chez les êtres humains (Cleveland et al., 2001).
Vue leur composition protéique, les bactériocines sont dégradées rapidement
par les protéases dans le tube digestif (Joerger et al., 2000). Les bactériocines
sont un groupe très hétérogène, elles sont caractérisées et sélectionnées pour
être utilisées en tant qu’antagoniste vis-à-vis des bactéries de contaminations
et pathogènes; cependant, leur efficacité dans les aliments est limitée pour
plusieurs raisons. Il reste que leur coût de production entrave leur usage
comme additifs alimentaires. Les recherches récentes sur les bactériocines
continuent non seulement pour révéler d'autres bactériocines plus efficaces,
mais aussi pour le développement progressif pour l'optimisation de l’utilisation
des bactériocines existantes pour répondre aux inquiétudes biologiques et
économiques.
Depuis 1950, de nombreux pays utilisent la nisine comme agent bio-
préservateur dans les aliments. Seulement, dès 1988 l'organisation mondiale
de l'agriculture FDA a autorisée et élargie l’addition de la nisine dans les
produits laitiers fabriquées à partir de laits pasteurisés, comme additifs
alimentaires (FDA, 1988). La nisine est la principale bactériocine
commercialisée, bien que d'autres bactériocines ont été caractérisées et
développées pour un possible approbation et utilisation (Chi-Zhang et al.,
2004 ; Chikindas et Montville 2002).
Les bactéries lactiques et leurs métabolites ont été consommés en grande
quantité depuis plusieurs générations sans aucun effet indésirable, de ce fait
les bactéries lactiques continuent à être la source préférée de bactériocines
utilisées dans les aliments. L'obtention de bactériocines brutes se réalise en
cultivant les bactéries lactiques productrices de bactériocines sur substrat
Revue bibliographique
7
naturel brut, en particulier le lait. La fermentation par les bactéries lactiques
produit d'autres substances impliquées dans l'activité antimicrobienne. Le
terme de purification de bactériocines implique que la substance
antibactérienne active est la seule substance antimicrobienne contenue dans la
préparation purifiée. L'usage intensif des bactéries lactiques dans l'industrie
alimentaire a poussé les scientifiques à créer des souches modifiées
génétiquement pour répondre aux exigences technologiques telle que la
production de bactériocines pour lutter contre la prolifération des germes
indésirables. Etant donné l'utilisation des bactéries lactiques comme levain
pour la fabrication des aliments fermentées, elles sont ainsi des candidates
évidentes pour une éventuelle modifications génétiques, afin d’améliorer
génétiquement la régulation de la production de bactériocines.
En plus de la sécurité alimentaire confirmée par les travaux scientifiques, une
perception des consommateurs d’un rôle probiotique a été sentit. Actuellement,
les scientifiques révèlent progressivement le rôle thérapeutique des bactéries
lactiques. Le terme GRAS (Generally Recognized As Safe), désigne le rôle
nutritionnel et sanitaire attribuer aux bactéries lactiques.
L'utilisation des bactériocines dans les aliments fut introduite par Hirsh et al.,
en 1951, lorsqu'il démontra que la nisine était en mesure d'inhiber la
croissance de Clostridium dans un fromage fait de lait pasteurisé. Cette
découverte eut comme effet de propulser les études sur les bactériocines. En
effet, grâce à l'activité anti-microbienne de leurs bactériocines, les bactéries
productrices ont la capacité de diminuer la charge microbienne d'un aliment et
donc de contribuer à leur innocuité. Malgré tout, seule la nisine est autorisée à
ce jour comme additif alimentaire (Delves-Broughton, 1996). En effet, la nisine
est la seule bactériocine à posséder le statut GRAS (Generally Recognized As
Safe), décerné en 1988 par la FDA des Etats-Unis (FDA, 1988).
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont efficaces contre les
bactéries pathogènes gram-positif et ont un impact direct sur les maladies
transmises par les aliments. Les bactériocines inhibent les germes pathogènes
tels que Listeria monocytogenes, une bactérie pathogène répandue dans
l'environnement et difficile à contrôler dans les aliments. Ammor et al., (2006a
et 2006b) ont pu appliqué les bactériocines des bactéries lactiques dans des
films alimentaires afin d’inhiber la croissance des bactéries de contaminations.
Revue bibliographique
8
Arqués et al., (2006) ont montré l’efficacité des bactériocines des bactéries
lactiques à inhiber la croissance de plusieurs bactéries pathogènes telle que
Staphylococcus aureus dans des fromages. C’est le cas de d’autres études
(Millette et al., 2007). Pour ces raisons, l'intérêt de rechercher des bactériocines
a continué inchangé depuis les 25 derniers années et ne semble pas s'affaiblir
de manière significative.
1.4. Ecologie des Bactériocines
Il paraît que la capacité d'en synthétiser une ou plusieurs bactériocines a
été une caractéristique très avantageuse. Une opportunité claire pour la survie
et la prolifération d'un organisme peut être envisagée s'il peut éliminer un
micro-organisme en compétition là où la compétition peut être tout à fait
intense créant ainsi une diversité des espèces et la croissance rapide des
bactéries (Dykes 1995). Les antibiotiques de faible poids moléculaire (par
exemple, la tétracycline), agents lytiques, toxines, enzymes lytiques, les
bactériophages, et les métabolites secondaires, tel que les acides organiques,
l'eau oxygénée, et le diacétyle, agissent également d’une manière similaire.
Mais néanmoins la capacité de produire des bactériocines et la protéine
d’immunité par la cellule productrice se produit abondamment chez les
procaryotes, eubactéries et les archaebactérie. Les bactériocines jouent un rôle
fondamental dans la dynamique de la population bactérienne bien que le degré
d'interactions de la bactériocine soit si complexe au niveau écologique et
évolutif dans les cultures mixtes.
Comme noté par Riley (1998), le suivit des bactériocines dans les milieux
naturels, chez Lactobacillus plantarum dans la fermentation des olives vert,
chez Escherichia coli dans la conjonctive du cobaye, et Streptococcus mutans
dans la cavité orale humaine, a indiqué que l'avantage de la compétition est
augmenté substantiellement pour les bactéries productrices de bactériocines
envers les bactéries sensibles dans le même environnement.
Dans l’exemple du L. plantarum, une souche productrice de bactériocine a été
utilisée pour fermenter les olives vertes d’Espagne (Leal-Sánchez et al., 2003 ;
Ruiz-Barba et al., 1994). La souche productrice de bactériocines se maintient à
un niveau très élevé dépassant 12 semaines de fermentation. En revanche,
Revue bibliographique
9
quand une souche, non productrice, de la même espèce est utilisée en
fermentation, celle-ci n’est pas détectée après 7 semaines.
Sur ceci, les modèles mathématiques ont été conçus pour évaluer les
interactions entre souches productrices de bactériocine et variantes sensibles.
La plupart des modèles écologiques de bactériocines ont été fait avec la colicine
(bactériocine produite par Escherichia coli et montrant habituellement une
activité envers d’autres souches d'E. coli et des membres apparentés des
Enterobacteriaceae).
L’induction s’opère habituellement sous conditions stressantes telles
qu'épuisement nutritionnelle ou un surplus (Riley et Wertz 2002; Riley et
Gordon 1999). La colicine diffèrent des bactériocines des bactéries gram-positif
dans le sens qu'ils ont trois mécanismes d'action généraux: formation de canal
dans la membrane cytoplasmique, (le mécanisme commun est rencontré avec
les bactériocines des bactéries à gram-positif ), dégradation de l'ADN cellulaire,
et inhibition de la synthèse protéique. Il est estimé qu'approximativement 30%
des populations naturelles d'E. coli produisent des bactériocines (Riley 1998).
Plus de 25 types de colicine ont été identifiés (Pugsley 1984). Il est aussi
estimé qu’approximativement 70% de la population d'E. coli sont résistantes à
un sel type de colicine, et 30% sont résistantes à tout types de colicine produite
dans une population avec le du colicine-sensitive des cellules restantes
(Smarda 1992). Le nombre relatif aux souches productrices de colicine
dépendait de l'énergie associée avec la synthèse de la colicine (Riley et Gordon
1999).
1.5. Détermination de l’activité de la bactériocine
L’étude des interactions bactériennes est très commune. Les
bactériocines représentent une catégorie de substances produites par les
bactéries qui inhibent d’autres. Dès 1676, Antonie van Leeuwenhoek a défini
l’antibiose comme étant le produit excrété par un micro-organisme capable
d’inhiber un autre (Joerger et al., 2000). En 1877, Louis Pasteur et Joubert ont
rapporté l'effet inhibiteur de bactéries de l'urine sur Bacillus anthracis. Comme
mentionné plutôt, en plus des bactériocines, les substances inhibitrices
produites par les bactéries incluent les antibiotiques cliniques ou
thérapeutiques de faible poids moléculaire, les agents lytiques, toxines,
Revue bibliographique
10
enzymes bactériolytiques, bactériophages, et autres métaboliques secondaires,
tel que l’eau oxygénée et le diacétyle. Ainsi, dans une niche écologique, un seul
type de bactérie peut être plus compétitif qu'un autre vis-à-vis de la source
nutritionnelle ou la sensibilité à un facteur environnemental, tel que la
disponibilité de l’oxygène. Avec une telle variabilité de produits inhibiteurs ou
conditions environnementales, l’antagonisme n’est pas dû dans sa totalité par
les bactériocines. L’étude des bactériocines des bactéries lactiques doit prendre
en compte la grande quantité d’acides organiques produite au cours du
métabolisme bactérien et devrait écarter l’inhibition due à ces acides.
Un moyen commun pour rechercher l'activité des bactériocines est l'utilisation
des milieu gélosé en boite de Petri. Mayr-Harting et al. (1972), Piddock (1990),
Parente et Riccardi (1999) et Akçelik (2006) ont passés en revue les méthodes
de détection et d’évaluation de l’activité des bactériocines. Il y a beaucoup de
variations dans ces méthodes, la plupart d'elles dérivent de la méthode dite de
la double couche, un test direct, dont la souche productrice et sensible sont
co-cultivées et incubées puis des zones d’inhibition autour de la colonie de la
souche productrice sont recherchées. L’exemple conçu est la culture de la
souche productrice par touche ou strie, sur milieu gélosé sur laquelle une
surcouche de gélose moelle contenant la souche indicatrice ou sensible
(Sabine, 1963). Les différentes méthodes permettent de respecter le temps et
les conditions de culture relatives à la souche productrice et sensible, ces
dernières sont plus sensibles que les méthodes directes (Tagg et al., 1976).
Kekessy et Piguet (1970) décrivaient une procédure ou la souche productrice et
indicatrice étaient cultivées chacune sur leur milieu optimal respectif. La
souche productrice était cultivée sur milieu gélosé et après incubation le milieu
est complètement délogé à l’aide d’une spatule et déposé dans une autre boite
en sens inverse (culture au dessous). Une surcouche de gélose moelle
ensemencée par la souche indicatrice est coulée sur le premier milieu. Après
incubation, la production de bactériocine se traduit par l’apparition d’un halo
claire sur la surcouche contenant la souche indicatrice. Cet essai minimise les
effets d'acides et l’action des bactériophages, du fait que les deux souches sont
séparées physiquement par une couche d’agar. La composition du milieu de
culture est un facteur important dans les essais en boite de pétri, mais la
question va au-delà des exigences nutritionnelles de la souche productrice et la
Revue bibliographique
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souche cible. L’utilisation de l’agar dans les milieux solides peut perturber la
diffusion de la bactériocine, donc limiter l’efficacité de la méthode utilisée
(Lindgren et Clevstrom 1978). Les autres composés peuvent entraver les
résultats. Par exemple, Hoover et al., (1989) ont trouvés que β-glycérol
phosphate (utilisé comme tampon) dans le milieu M17 avec la méthode
Kekessy-Piguet interfère avec les zones d'inhibition causées par Pediococcus
acidilactici (PO2) comparé à d’autre milieu de culture et substance tampon.
Cependant, Spelhaug et Harlander (1989), n’ont rencontré aucune difficulté à
faire exprimer l'antagonisme de la bactériocine produite par Pediococcus
pentosaceus FBB61 et FBB63-DG2 sur milieu solide M17-glucose. Peut-être,
ceci est dû à une bactériocine différente produite par ces souches ou la
méthodologie utilisée était légèrement différente.
Rose et al., (1999) ont adapté la spectrométrie de masse pour une détection
rapide de la pediocin, la nisine, la brochocins A et B, et l’enterocins A et B à
partir de surnageants de culture. La méthode est dite matrix-assisted laser
desorption/ionization time-of-flight mass spectroscopy (MALDI-TOF MS) qui a
été conçue originairement pour l'examen de grandes molécules, tel que les
biopolymers. Dans ce protocole, un lavage du surnageant pendant 30 seconde
est opéré afin d’éliminer les impuretés puis la procédure est suivit jusqu’à
purification complète de la bactériocine.
La PCR est utilisée pour détecter les gènes responsables de la production et la
régulation de la bactériocine dans les cultures bactériennes. Rodriguez et al,
(1995) ont pu amplifier le gène structural de la lactocine S chez 7 souches de
lactobacilles isolés du saucisson fermenté. Dans un autre travail, Garde et al.,
(2001) ont détecté le gène de production du lacticine 481 et la nisine en
utilisant la PCR avec une spécificité dans l’isolement de Lactococcus lactis
subsp. lactis à partir du fromage de lait cru. Rodriguez et al., (1998) ont détecté
l’enterocine AS-48 à partir des entérocoques isolés du lait et les produits
laitiers en utilisent la méthode d'hybridation des colonies. Martinez-Bueno et
al., (1994) ont réalisé le séquençage des gènes codant la synthèse de
l’enterocine AS-48. Une technique PCR a été développée pour détecter
rapidement ces gènes (Joosten et al., 1997).
Mugochi et al., (2001) ont développé une méthode rapide et sensible pour
détecter les bactériocines à partir du milieu de fermentation. Les faibles
Revue bibliographique
12
concentrations d'ions de potassium ont été mesurées, ainsi la quantité libérée
par la souche bactérienne sensible corrélée avec la quantité de bactériocine
présente dans la portion de bouillon nutritif entrant dans celle-ci. Cette
méthode se compare facilement à celle de la méthode de diffusion en milieu
solide.
1.6. Classification des Bactériocines
Découvert en premier par Gratia en 1925, “principe V” a été produit par
une souche d'E. coli envers une autre souche de la même espèce. Le terme
“colicine” a été utilisé par Gratia et Fredericq (1946); “bactériocine” a été utilisé
par Jacob et al. (1953) comme un terme général pour les protéines
antibactériennes très spécifiques. Maintenant le terme colicine désigne une
protéine à caractère bactéricide produite par une souche d'E. coli et d’autres
membres apparentés aux Enterobacteriaceae (Konisky 1982). Bactériocines
(comme les colicines) ont été défini originairement comme protéines
bactéricides caractérisées par leur action létale, un large spectre d'activité, et
une adsorption spécifique sur des récepteurs de la membrane cellulaire (Jacob
et al., 1953).
Plus tard, la biosynthèse des bactériocines par les plasmides a été ajoutée à
leur description. La définition a depuis été modifié pour incorporer les
propriétés des bactériocines produites par les bactéries à gram-positif (Tagg et
al., 1976).
Chez les bactériocines, différentes règles de nomenclature ont déjà été
proposées (Hamon et Peron, 1963). Par contre, aucune n'a réellement été
adoptée de façon unanime. Bien que l'addition du suffixe «ine» soit
généralement employée, il demeure qu'il y a beaucoup de variabilité dans la
nomenclature. En fait, la nomenclature d'une bactériocine est parfois basée
sur le genre bactérien (Takeya et Tokiwa, 1974) ou parfois sur l'espèce
(Hamada et Ooshima. 1975). Il est même arrivé que pour une même espèce, la
bactériocine soit nommée selon les deux méthodes désignées. C'est notamment
le cas de Corynebacterium diphtheriae où les bactériocines sont nommées
corycine ou diphthericine selon l'équipe qui a isolé la bactériocine (Krylova,
1969; Gibson et Colman, 1973). Malgré tout, et pour des raisons de
Revue bibliographique
13
simplification, il arrive fréquemment que la désignation donnée aux nouvelles
bactériocines inclut le nom de souche de la bactérie productrice (Ross et al.,
1999).
Les bactériocines des bactéries à gram-positif ne possèdent pas de récepteurs
spécifiques pour l'adsorption mais des exceptions existent (Gravesen et al.,
2002b), ces dernières sont pour la plupart de faible poids moléculaire que les
colicines, ont une large gamme de bactéries cibles, avec différents modes
d'excrétion dans le milieu externe et de transport membranaire (Jack et al.,
1995; James et al., 1991; Riley 1998). Aujourd'hui, les peptides ou les
protéines à caractère bactéricide, produites par les bactéries font typiquement
référence aux bactériocines. Habituellement, la nature protéinique d'une
bactériocine récemment caractérisé est démontrée par sa sensibilité aux
enzymes protéolytiques telles que la trypsine, l’α-chymotrypsine, et la pepsine.
Son évaluation pour être utilisé comme additif alimentaire exige l’estimation de
sa résistance à la température, un facteur très utilisé dans l’industrie
alimentaire. Durant des années, plusieurs publications ont passé en revue les
colicines, bactériocines des bactéries lactiques et l’application de bactériocines
spécifiques. Les exemples incluent Reeves (1972), Franklin et Snow (1975),
Hardy (1975), Tagg et al., (1976), Konisky (1982), Klaenhammer (1988, 1993),
Jack et al., (1995), de Vos et al., (1995), Sahl et al., (1995), Venema et al.,
(1995c), Abee et al., (1995), Nes et al., (1996), et Cleveland et al., (2001).
La plupart des bactériocines des bactéries lactiques sont cationiques,
hydrophobes, ou des molécules amphiphiliques composées de 20 à 60 résidus
d'acide aminé (Nes et Holo 2000).
Afin de faciliter leur identification, différentes méthodes de classification ont
été proposées. En 1976, une méthode de classification des bactériocines isolées
des bactéries à Gram positif fut proposée (Tagg et al., 1976). Compte tenu du
nombre important de bactériocines et de leurs multiples origines, une première
classification des bactériocines produites par les bactéries lactiques f'ut
proposée (Klaenhammer, 1988) et remise à jour par le même auteur
(Klaenhammer, 1993). Essentiellement, cette méthode classe les bactériocines
selon leur résistance à la chaleur, leur taille, certaines propriétés physico-
chimiques, leur spectre d'activité et la présence ou non d'acides aminés
Revue bibliographique
14
modifiés. Pour ce faire, elle sépare les bactériocines produites par les bactéries
lactiques en quatre classes distinctes.
La classe I est formée des lantibiotiques. Ces petits peptides, de poids
moléculaire inférieure à 5 kDa, agissent au niveau de la membrane
cytoplasmique. Elles ont toute la caractéristique commune de posséder des
acides aminés modifiés. Ces derniers résultent de modifications post-
traductionnelles de la sérine, la thréonine et la cystéine en lanthionines. P-
méthylelanthionines ainsi qu'en résidus déshydratés. La nisine, la subtiline, la
duramycine ainsi que la cytolysine L1 sont des exemples de lantibiotiques
(Delves-Broughton et al., 1996; Saris et al., 1996; Sahl et Bierbaum, 1998).
La classe II est caractérisée par des petits peptides dont la masse moléculaire
est généralement inférieure à 10 kDa. Ces bactériocines sont stables à la
chaleur et sont caractérisées par un site de maturation conservé Gly-Gly situé
sur le peptide signal. Ces dernières ne contiennent pas d'acide amine modifié.
Par ailleurs, les bactériocines matures sont prédisposées à former des hélices
amphiphiles avec des régions d'hydrophobicité variable et il est prédit que la
structure secondaire de forme native possède des feuillets p. Cette classe est
subdivisée en trois sous-classes:
- classe IIa Bactériocine active contre les espèces de Listeria ayant une
séquence constitué en N-terminale de Tyr-Gly-Ans-Gly-Val-X-CyLsa. La
pédiocine PA- 1, la sakacine P, la leucocine A-UAL187 et la curvacine A
n'en sont que quelques exemples (Hastings et al., 1991 ; Holck et al.,
1992; Tichaczek et al., 1992).
- classe IIb Complexe de poration qui nécessite deux peptides pour être
actif. La lactococcine G et la lactacine F en sont deux exemples (Mulet-
Powell et al., 1998).
- classe IIc Peptides thiol-actives requérant la réduction du résidu
cystéine pour être actif. La lactococcine B en est un exemple classique
(Venema et al., 1993).
La classe III comprend toutes les bactériocines de poids moléculaire élevé (>30
kDa). Les bactériocines de cette classe ont la caractéristique d'être
thermosensible, c'est-à-dire qu'elles ne résistent pas aux traitements
Revue bibliographique
15
thermiques sévères. L'helveticine I et les lacticines A et B en sont trois
exemples (Joerger et Klaenhammer, 1986; Toba et al., 1991).
La classe IV englobe les bactériocines qui nécessitent une partie non protéique
pour être active. Klaenhammer (1993) a suggéré cette quatrième classe,
comportant des bactériocines complexes qui exigent des carbohydrates ou des
fractions lipidiques pour leur activité. Cependant, les bactériocines de cette
classe n'ont pas été suffisamment caractérisées au niveau biochimique vu que
leur définition nécessite des informations supplémentaires (Jimenez-Diaz et al.,
1995; McAuliffe et al., 2001). C'est le cas notamment de la pédiocine SJ-1 et de
la lactocine 27 (Upreti et Hinsdill, 1975; Schlyter et al., 1993).
1.7. Génétique, Biosynthèse et Mode d'Action
1.7.1. Organisation des gènes: génétique et biosynthèse
La synthétise des bactériocines est ribosomiale. Les gènes qui codent la
production et l’immunité sont organisés habituellement en opéron (Nes et al.,
1996; Sahl et Bierbaum 1998; McAuliffe et al., 2001). La synthèse des
bactériocines linéaires non modifier inclue la plantaricine, la carnobacteriocine
et la sakacine, paraît induite par des peptides spécifiques. Cette synthèse est
localisée sur le même opéron (Quadri et al., 1997; Brurberg et al., 1997;
Anderssen et al., 1998). Les gènes de synthèse des bactériocines peuvent être
localisés sur le chromosome, comme dans le cas de la subtiline (Banerjee et
Hansen 1988) et la mersacidine (Altena et al., 2000) ou plasmidique, comme
dans le cas de la divergicine A (Worobo et al., 1995) et la sakacine A (Axelsson
et Holck 1995), ou sur un transposon comme dans le cas de la nisine (Rauch
et de Vos 1992) et la lacticine 481 (Dufour et al., 2000).
Les opérons de la biosynthèse des lantibiotiques contiennent généralement des
gènes qui codent pour le prépeptide LanA – lan. Cette l'abréviation faisant
référence aux gènes homologues du gène des différents groupes de
lantibiotiques. Des enzymes responsables des réactions de transformation de la
prébacteriocine (LanB,C/LanM), des protéases responsables du clivage du
peptide (LanP), le système de transport ABC (ATP-binding cassette), un système
de transport protéique responsable dans la translocation du peptide (LanT),
des protéines de régulation (LanR, K), qui sont des protéines impliqué dans
Revue bibliographique
16
autoprotection chez la souche productrice (immunité) (LanI, FEG). Ces
informations ont été récoltées à partir d’une multitude d’analyse génétiques sur
plusieurs lantibiotiques, l’epidermine (Schnell et al., 1992, Bierbaum et al.,
1996; Geissler et al., 1996), nisine (Buchmann et al., 1988; Mulders et al.,
1991; de Vos et al., 1995), subtiline (Banerjee et Hansen 1988; Klein et al.,
1992; Klein et al., 1993, Klein et Entian 1994), lacticine 481 (Piard et al., 1993;
Rince et al., 1997; Uguen et al., 2000), et mersacidine (Bierbaum et al., 1995;
Altena et al., 2000).
La régulation génétique des bactériocines de la classe II, les lactococcines A, B,
et M (Holo et al., 1991; Van Belkum et al., 1991; Stoddard et al., 1992; Van
Belkum et al., 1992; Venema et al., 1995b), pédiocine PA- 1/AcH (pédiocine
PA-1 et AcH représentent la même molécule; le nom de pédiocine le PA-1 est
plus couramment utilisé) (Marugg et al., 1992; Motlagh et al., 1992;
Bukhtiyarova et al., 1994; Venema et al., 1995a), et plantaricine A (Diep et al.,
1994; 1995; 1996) ont été étudiées. Les gènes responsables de la biosynthèse
des bactériocines de la classe II se partagent plusieurs similitudes dans
l’organisation génétique. Elle en consiste dans le gène structural codant pour le
peptide précurseur, par le gène codant pour la protéine d’immunisation et
celles du système de transport ABC ainsi que d’autres protéines essentielles
dans l'excrétion dans le milieu. Ces protéines ne sont pas présentes chez les
lantibiotiques (Nes et al., 1996; Sablon et al., 2000). Enfin, dans certains cas,
on rencontre le gène de régulation. La génétique des lantibiotique et non
lantibiotique a été largement débattue par Klaenhammer,(1993), Jack et al.,
(1995), Nes et al., (1996), Sahl et Bierbaum (1998), Van Kraaij et al., (1999),
Ennahar et al., (2000b), Sablon et al., (2000), et McAuliffe et al., (2001).
1.7.2. Les voies de biosynthèse
La biosynthèse d'une bact6riocine nécessite l'interaction de plusieurs
facteurs qui sont généralement contrôlés par des protéines. L'induction de la
synthèse d'ARN, la maturation, l'exportation et finalement l'immunité de la
souche productrice sont toutes contrôlées par des familles de protéines
distinctes. De façon générale, la biosynthèse d'une bactériocine débute par le
signal provoqué par un facteur d'induction. En générale, ces facteurs
d'induction provoquent un signal chez une histidine-kinase située à la surface
Revue bibliographique
17
de la membrane. Celle-ci provoque la phosphorylation d'un régulateur de
réponse qui interagit directement avec les différents promoteurs présents sur
l'opéron de la bactériocine. Quelques facteurs d'induction sont bien connus.
Par exemple, la biosynthèse de la nisine est induite par la nisine elle-même
alors que pour les bactériocines de classe II, c'est un peptide similaire à la
bactériocine qui induira la biosynthèse (Kuipers et al., 1995; Nes et al., 1996a).
Ces peptides sont généralement inactifs. Par contre, le facteur d'induction de la
plantaricine démontre une activité bactéricide (Anderssen et al., 1998).
Suite à l'induction, les bactériocines sont synthétistes par la voie ribosomique
sous forme de pré-peptides. Ces derniers possèdent un peptide signal en N-
terminal qui doit être clive pour que la bactériocine mature soit active. La
présence du peptide signal joue un double rôle. En premier lieu, tout indique
que la présence du peptide signal inactive la bactériocine (Ennahar et al.,
2000b). De plus, cette séquence en N-terminal garantit que le pré-peptide sera
exporté via le transporteur dédié ou sec-dépendant approprié (Nes et al., 1996).
Ainsi, le peptide signal pourra être clivé par une peptidase spécifique ou,
comme c'est le cas pour la plupart des bactériocines de classe II, il sera clivé
par le domaine protéolytique du transporteur lors de la sécrétion de la
bactériocine par ce même transporteur (Havantein et al., 1995). Cette
reconnaissance du peptide signal est due principalement à sa séquence. En
effet, chez les bactériocines de classe II, il est très fréquent d'observer un
doublet glycine à la position -1 et -2 du site de clivage. C'est ce doublet qui
garantit une reconnaissance du site de clivage par la peptidase dédiée.
La plupart des bactériocines sont synthétisées comme un prépeptide
biologiquement inactif qui porte une extrémité N-Terminale attachée à
l’extrémité C-Terminale du propeptide. Pour les lanthibiotiques, la sérine,
thréonine, et les résidus cystéiniques dans leurs parties du propeptide
subissent une post-translation extensive pour former Lan/MeLan. La voie de
biosynthèse des lanthibiotique suit un schéma global (Figure 1): formation du
prépeptide, réaction de modification, clivage protéolytique de l’amorce
peptidique, transport du prépeptide modifié ou du prépeptide mûr à travers la
membrane cytoplasmique.
Le clivage de l’amorce se déroule soit durant l’opération de synthèse ou après
l’excrétion de la cellule. Sur la base de cette voie de biosynthèse les
Revue bibliographique
18
lantibiotiques sont génétiquement divisées en deux groupe I et II (Sahl et
Bierbaum 1998; Guder et al., 2000; McAuliffe et al., 2001). Ce plan de
classification n'est pas lié à la classification précédente qui divise les
lantibiotiques en type A et B, ainsi le groupe I et II peuvent être de type A ou B.
Par exemple, la lacticine 481 qui appartient au grouper II d'après ce plan
d'organisation génétique est un lantibiotique de type A. Dans la production des
lantibiotiques du groupe I, comme dans le cas de la nisine, l’épidermine, la
subtiline, et le Pep5, la réaction de déshydratation est catalysée
vraisemblablement par l'enzyme LanB, pendant que LanC est impliqué dans la
formation du thioether. Le prépeptide modifié est traité par une sérine-protéase
LanP et transporté à travers le système de transport ABC LanT. Par contre, les
lantibiotiques du groupe II, comme dans le cas de la cytolysine, la lacticine
481, et la mersacidine, sont modifiées par un seul enzyme LanM (Van Kraaij et
al., 1999; McAuliffe et al., 2001), et la maturation prend place de façon
concomitante au cours du transport par LanT(P). La lactocine S est l'exception
de cette classification. Elle est modifiée par un seul enzyme LanM et sa
maturation se fait avant son transport, de ce fait elle peut représenter un
nouveau groupe (Skaugen et al., 1997).
Revue bibliographique
19
Figure 2 : Schémas représentant les modifications post-translationelle du Pep 5. En haut leprépeptide Pep5 non modifié. A l’éxtremité, le site d’action de la protéase. Au milieu,Dehydratation du groupement gydroxyl de l’acide aminé (R=H pour Serine ou R=CH3
pour la thréonine) et la formation du thioether (R=H pour le Lantibiotique ou
R=CH3 pour le methionine lantibiotique). En bas, cleavage du peptide amorce et la
désamination du groupement N-terminal donnant le Pep5 mature et actif.
La classe II des bactériocines (Table 1) sont synthétisées comme un prépeptide
qui contient une extrimité N-Terminale qui demeure inchangée et un site
protéolytique avec deux molécules de glycine très caractéristique pour sa
maturation, à l’exception avec la classe IIc des bactériocines, qui sont
synthétisées avec une séquence typique N-terminal dite du type sec et sont
par la suite traitées et sécrétées par la voie de sécrétion générale (Leer et al.,
1995; Worobo et al., 1995).
Revue bibliographique
20
Figure 3. représente le schéma de la biosynthèse des lantibiotiques: (1) Formation dela prébactériocine; (2) la prébactériocine est modifiée par LanB et LanC, transloquée àtravers le système Abc de transport LanT, résultant de la maturation de labactériocine; (3) l’histidine a protéine kinase (HPK) phosphorylant la bactériocine; (4)le groupement phosphorylé (P) est transféré par la suite au régulateur répondant RR;(5) le RR active transcrit des gènes régulés; et (6) production de la protéines de
l'immunité, LanI, et les protéines de Transport, LanFEG (Leer et al., 1995).
Contrairement au lantibiotiques, la classe II des bactériocines ne subissent pas
une modification post-translationnelle. Le suivi de la formation du prépeptide
montre que ce dernier subit un traitement pour éliminer l’amorce peptidique
pendant son transport à travers le système ABC et ses protéines auxiliaires
(Nes et al., 1996; Ennahar et al., 2000b). La voie de biosynthèse de cette classe
est représentée dans la figure 3.
Plusieurs fonctions de l’amorce peptidique ont été proposées. Il peut servir
comme un site de reconnaissance qui dirige le prépeptide vers sa maturation et
vers la protéine du transport, protège la souche productrice en gardant le
lantibiotique dans son état inactif pendant qu’il se trouve à l’intérieur de la
cellule productrice et réagit avec le propeptide pour assurer une conformation
convenable qui est essentiel pour l’interaction du complexe enzyme-substrat
(van Der Meer et al., 1994; van Belkum et al., 1997; Sablon et al., 2000;
McAuliffe et al., 2001).
1.7.3. Modification post-translationnelle, activation et transport
Ingram (1969; 1970), le premier à avoir proposé deux étapes de réaction
de modification post-translationnelle d'un pre-lantibiotique menant à la
formation du Lan/MeLan. Initialement, les acides aminés hydroxylés, la sérine
et la thréonine, sont déshydratés pour former respectivement le 2,3-
Revue bibliographique
21
didehydroalanine et le 2,3-didehydrobutyrine. Quelques acides aminés
dehydratés ne contiennent pas de résidus de cystéine et restent comme tel
dans le peptide mûr; D’autres subissent une réaction intramoléculaire
d’addition de Michael qui implique le groupement thiol des résidus cystéine
avoisinants et la double liaison de l’acide didehydroamino, donnant ainsi lieu à
la formation de ponts thioether.
Le suivit des réactions de modification, montrent que les prélantibiotiques
modifiés subissent une protéolyse pour libérer la séquence terminale menant
ainsi à l’activation du lantibiotique. Pour le groupe I des lantibiotiques, la
séquence terminale est enlevée par une protéase à sérine, LanP, et, selon
l'emplacement du LanP, cela peut avoir lieu avant ou après la sécrétion du
peptide de cellule productrice par le système de transport ABC, LanT.
Figure 4. schématise la voie de la biosynthèse de bactériocines de la classe II: (1)Formation de la prébactériocine et le facteur initial prépeptide IF; (2) Laprébactériocine et le pré IF sont traités et transportés par le système de transport Abc,produisant la bactériocine mature et l’IF; (3) l’histidine kinase (HPK) capte l’IF et lephosphorolyse par l’ATP; (4) Le groupe phosphate (P) est par la suite transféré aurégulateur RR; (5) le régulateur RR active transcrit les gènes de régulation; et (6)
production de la protéine d’immunité (Leer et al., 1995).
Par exemple, les protéases LanP de l'epicidin 280 et Pep5 (Sahl et Bierbaum
1998) sont intracellulaire afin que la protéolyse prend place dans la cellule. Par
contre, les protéases de la nisine (van der Meer et al., 1993) et l’epidermine
(Geissler et al. 1996), lesquels sont extracellulaire, activent le lantibiotique
seulement après exportation par le système de transport ABC. Ce system
contient entre 500 et 600 acides aminés et est caractérisé par deux domaine N
et C-terminal. Le domaine N-terminal consiste en 6 hélices couvrant la
membrane qui peuvent reconnaître le substrat et créer son chemin à travers la
Revue bibliographique
22
membrane, pendant que le domaine cytoplasmique C-Terminal contient deux
domaines porteur d’ATP en conservant la liaison avec l’ATP. L'hydrolyse de
l'ATP se produit vraisemblablement au niveau du domaines de rattachement de
l’ATP, fournissant ainsi de l'énergie d''exportation (Fath et Kolter 1993;
McAuliffe et al., 2001). Les enzymes LanB et LanC, avec le transporteur LanT,
forment probablement un complexe multi-métrique associé à la membrane
(Siegers et al., 1996; Kiesau et al.1997). Pour le groupe II des lantibiotiques,
possédant un site de clivage di-glycine, le processus protéolytique se déroule en
concomitante avec l’exportation à travers un système de transport ABC
hybride. Cet ABC-Transporteur unique possède une protéase du domaine N-
Terminal fait approximativement de 150 résidus d'acide aminé qui clive la
séquence de tête diglycine (Nes et al., 1996; Sablon et al., 2000) (Figure 4).
Les ressemblances substantielles existent entre la séquence de tête peptidique
de la classe IIa et b et celles du groupe II des lantibiotiques. Les deux
contiennent le site de clivage à double glycine (Nes et al., 1996; Ennahar et al.,
2000b).
La conservation du site de clivage recommande fortement que le mécanisme de
traitement et de translocation des bactériocines de la classe IIa et b soit très
semblable à celui du groupe II des lantibiotiques. Les bactériocines de la classe
IIc sont traitées par une peptidase signal pendant la translocation à travers la
membrane cytoplasmique.
Figure 5. Le système de transport ABC avec un domaine N-Terminal de la protéase
(Sablon et al., 2000).
1.7.4. Régulation de la biosynthèse
La biosynthèse des lantibiotiques et nonlantibiotiques est régulée
habituellement à travers 2 systèmes régulateurs. Ces systèmes régulateurs
consistent en 2 protéines productrices de signal, une protéine kinase
membranaire représentant le site histidine (HPK), et un régulateur de la
Revue bibliographique
23
réponse cytoplasmique (RR) (Stock et al., 1989; Parkinson 1993; Nes et al.,
1996). Dans la voie de transduction du signal, le HPK opère une auto
phosphorylation du résidu histidine dans son domaine intracellulaire quand il
excrète une certaine concentration de bactériocine dans le milieu externe. Le
groupe phosphorylé est transféré vers le résidu de l'acide aspartique sur le
domaine récepteur du RR et les changements intramoléculaires résultants
déclenchent une réponse de régulation pour activer la transcription du gène
régulé. Ces gènes régulés incluent le gène structurel, les gènes exportateurs,
les gènes de l'immunité, et dans quelques cas, les gènes régulateurs eux-
mêmes (Kuipers et al., 1998).
Pour la nisine et la subtiline, la molécule de bactériocine, apparemment elle-
même agit comme un signal externe pour autoréguler sa propre biosynthèse
via un signal de transduction (Kuipers et al., 1995; Guder et al., 2000). Par
contre, la plupart des bactériocines de la classe II produisent un peptide
similaire à la bactériocine sans activité antimicrobienne et utilisé comme un
facteur d’induction (IF), pour activer la transcription des gènes de régulation.
Le facteur d’induction (IF) est un petit peptide, thermostable, cationique et
hydrophobe qui est synthétisé en premier comme une prépeptide avec une
séquence de tête à double glycine. Le system de transport ABC relatif clive
spécifiquement la séquence de tête du facteur IF en concomitance avec
l'exportation du peptide mûr à partir de la cellule. Le facteur IF ainsi sécrété
agit comme un signal externe qui déclenche la transcription des gènes
impliqués dans la production de la bactériocine (Nes et al., 1996; Ennahar et
al., 2000b).
1.7.5. L’immunité chez la souche productrice
Suite à la sécrétion de bactériocines matures, l'immunité doit être
conférée à la souche productrice. Pour les bactériocines de classe I identifiées
chez les lactocoques, deux systèmes participent à l'immunité. La majorité de
l'immunité est attribuable à des protéines d'immunité dont le mode d'action
exact demeure inconnu. Il est cependant postulé que ces dernières sont
présentes sur la surface externe de la membrane bactérienne et que leur
structure est modifiée par des lipides (Kuipers et al., 1993). Deux systèmes
d'immunité des lantibiotiques de la cellule productrice ont été identifiés. La
protection peut être véhiculée par la protéine d’immunité LanI, et son système
Revue bibliographique
24
de transport ABC relatif, LanFEG (Reis et al., 1994; Siegers et Entian 1995;
Peschel et Gotz 1996; Saris et al.,1996; McAuliffe et al.,2001). Ces deux
systèmes d'immunité fonctionnent synergitiquement pour protéger la cellule
productrice de leur propre bactériocine (Klein et Entian 1994). LanI, lequel est
attaché très probablement à la face externe de la membrane cytoplasmique,
donne une immunité aux cellules productrices en empêchant la formation de
pores par la bactériocine. LanFEG agit apparemment en transportant la
bactériocine qui est insérée sur la membrane vers le milieu environnant et
garder ainsi la concentration de la bactériocine dans la membrane à des
niveaux critiques.
Pour les bactériocines de la classe II, le gène d'immunisation code
habituellement pour une protéine qui est généralement associée avec la
membrane cytoplasmique. Quadri et al., (1995) ont utilisé la technique de
Western blot (immunoblot) pour ces analyses et ont indiqué que la majeure
partie de la protéine de l'immunité (CbiB2) de la carnobacteriocine B2 est
trouvée dans le cytoplasme et qu'une plus petite proportion est associée à la
membrane. Abdel-Dayem et al., (1996) ont démontré que la majorité des
protéines de l'immunité (MesI) de la mésentericine Y105 se situe dans le
cytoplasme, avec seulement une petite proportion détectée dans la membrane.
La protéine de l'immunité qui est cationique et constituée de 51 à 254 acides
aminés, fournit une immunité totale contre la bactériocine. L’interaction de la
protéine de l'immunité avec la membrane paraît protéger la souche productrice
contre sa propre bactériocine (Nissen-Meyer et al., 1993a, b; Venema et al.,
1994; Nes et Holo 2000). L'immunité serait en fait attribuée à une seule
protéine de surface. Ces protéines sont généralement de petite taille et
montrent un faible degré d'homologie entre elles. Par contre, Eijsink et al.,
(1998) stipulent que ces dernières pourraient avoir une conformation
structurelle similaire.
1.7.6. Mode d'action
La plupart des bactériocines produites par les lactocoques qui ont été
caractérisées démontrent un mode d'action semblable. En effet, à part la
lactococcine 972 qui sera décrite par la suite, les bactériocines semblent former
des pores dans la membrane des cellules sensibles. Certaines bactériocines,
Revue bibliographique
25
comme la nisine, n'ont pas de récepteur spécifique (Abee et al., 1995). En effet,
la nisine semble se lier aux lipides et phospholipides cationiques présents à la
surface de la cellule (Rink et al., 2005; Moll et al. 1999). Par contre, il
semblerait que pour les lactococcines A, B et M. l'initiation de la formation de
pores nécessite la présence d'un récepteur spécifique qui permet la fixation de
la bactériocine à la membrane cellulaire (van Belkum et al., 1991). De plus,
certaines bactériocines, telles que, la bactériocine J46 dont l’activité dépendent
de la présence d'une force proton motrice sur la membrane pour pouvoir s'y
lier (Huot et al., 1996). Le modèle actuel propose que les bactériocines se
concentrent à la surface de la membrane avant de s'y insérer en adoptant une
structure en forme de tonneau. Il résulte généralement de la formation des
pores une perte du potentiel de membrane ainsi qu'une perte du gradient de
pH, les deux facteurs responsables de la force proton motrice. En plus, les
lipides anioniques de la membrane cytoplasmique sont les récepteurs
primaires de la bactériocine des bactéries lactiques pour initier la formation
des pores (Abee 1995; Moll et al., 1999). La conductivité et la stabilité des
pores induits par les lantibiotiques, peuvent être surélevés en fixant des
molécules membranaires (lipide II, le précurseur du peptidoglycan). Dans le cas
des bactériocines de la classe II, apparemment, les récepteurs dans la
membrane cible agissent pour déterminer la spécificité (Venema et al., 1995b;
1995c). Les bactériocine de la classe I, peuvent induire la formation de pore par
un mouvement transmembranaire selon le modèle de Wedge (Figure 6-A), et
celles de la classe II, peuvent fonctionner en créant des pores sous forme de
pores en barils (Figure 6-B, Figure 7) ou par un mécanisme de moquette par
lequel les peptides s’orientent en parallèle à la surface de la membrane et
interagit avec la structure de la membrane (Moll et al., 1999).
Pour la nisine par exemple, les pores peuvent atteindre une dimension de 1,2
nm. La présence de ces pores induit la perte de plusieurs composés de faible
poids moléculaire (ions, acides aminés et ATP) qui vont quitter l'intérieur de la
cellule. La perte d'ions est ainsi responsable de la déstabilisation du potentiel
de membrane, de la perte d'ATP et du gradient de pH. La disparition de la force
proton motrice et l'inhibition de la synthèse de macromolécules provoquent la
mort de la cellule sensible après 20-30 minutes de contacte (DeVuyst et
Vandamme, 1994).
Revue bibliographique
26
Figure 6. Montre l’action des bactériocine de la classe I qui peuvent induire laformation de pore par un mouvement transmembranaire selon le modèle de Wedge (A)et celles de la classe II, qui peuvent fonctionner en créant des pores sous forme depores en barils (B) ou par un mécanisme de moquette par lequel les peptidess’orientent en parallèle à la surface de la membrane et interagit avec la structure de lamembrane (Moll et al., 1999).
Revue bibliographique
27
Figure 7. Schéma représentant la structure et le mécanisme d’action desbactériocines de la classe-IIa à travers la perforation de la membrane cellulaire: (a)structure de la bactériocine; (b) possibilité d’interactions avec la surface de lamembrane; (c) insertion de la molécule de bactériocine et la formation des poreshydrophiliques.
Gravesen et al., (2002b) ont examiné la résistance de Listeria
monocytogenes à la classe II des bactériocines et ont trouvés un rapport avec
le site spécifique de reconnaissance. Huit mutants de L. monocytogenes
Revue bibliographique
28
résistants aux bactériocines de la classe IIa, tel que la pediocine PA-1 et la
leucocine A, ont été isolés et étudiés. La mutation trouvée dans toutes les
souches mutantes résistantes était dûe à une sous unité d'une enzyme dans
un système d’enzyme appartenant à la phospho-transférase
phosphoenolpyruvate-dépendant mannose-spécifique régulée par le facteur de
transcription spécifique nommé σ54. Il a été interprété que la résistance à ces
bactériocines dans L. monocytogenes et autres bactéries gram-positives est
fondamentalement en rapport avec ce site commun sans aucun rapport avec la
souche, ni le type de bactériocine de la classe IIa, ou les conditions de cette
expérience. Il a été suggéré que la mutation à cette sous unité spécifique
localisée dans la membrane a changé le site de reconnaissance de la cible des
bactériocines de la classe IIa.
La lacticine 3147 est un lantibiotique constitué de 2 composants, 2 peptides
appelés lac 1 et lac 2 (McAuliffe et al., 1998); les deux composants sont
nécessaire pour exercer une activité antagoniste complète résultant de la
formation de pores ioniques spécifiques dans la membrane de la cellules gram
positive cible. McAuliffe et al., (2000) ont démontrés que la lacticine 3147 exige
une enzyme de modification séparée pour chacun des prepeptides lac1 et lac2.
Deux autres bactériocines à deux composants connues sont la lacticine F (Abee
et al., 1994), la lactococcine G (Nissen-Meyer et al., 1992), et la thermophiline
13 (Marciset et al., 1997).
La première étape d’action dans son adsorption à la membrane cellulaire
bactérienne nécessaire dans la rupture de la membrane par la nisine est
souvent comparée à un détergent cationique actif en surface. Cela est suivi par
une inactivation du groupe sulfhydryl. Bruno et al., (1992) ont démontré que
la nisine dissipe complètement la force protonique motrice chez L.
monocytogenes Scott A. D’autres souches de L. monocytogenes ont été trouvées
également sensibles à la nisine, en exprimant une réponse similaire à la
détérioration du gradient pH et le potentiel membranaire. D’autre bactériocines
de la classe I des bactéries lactiques se comportent d’une manière similaire. La
carnocine UI49 agit sur la membrane cytoplasmique dans un modèle
semblable à la nisine (Stoffels et al., 1994). La perméabilité aux ions ou la
formation de canaux dans les membranes cytoplasmiques provoqués par les
bactériocines de Lactobacillus acidophilus, a été démontrée en utilisant des
Revue bibliographique
29
membranes lipidiques artificielles (Palmeri et al., 1999). L’augmentation de la
conductance de la membrane a été détectée et des canaux avec une
conductance élémentaire de 68 à 70 mV a été mesurée en appliquant un
voltage externe de polarité différente.
La lactocine 27, produite par Lactobacillus helveticus LP27, a été décrite dans
les travaux de Upreti et Hinsdill (1975) comme une bactériocine dont l'effet
était bactériostatique. Elle a été adsorbée aussi bien par des souches sensibles
que par des souches résistantes en inhibant la synthèse des protéines.
Cependant, il y avait un effet remarquable sur l’ADN, la synthèse de l’ARN et
l'ATP. Zajdel et al., (1985) trouvez que la lactostrepcine, Las 5, bloque
immédiatement la synthèse d'ADN, de l’ARN, et les protéines, mais ces
conséquences étaient probablement une réaction secondaire à de multitude
ruptures sévère membranaire et perte de composants intracellulaires. Les
souches bactériennes sensibles et résistantes adsorbent de la même manière la
bactériocine Las 5. Les protoplastes des souches bactériennes sensibles n'ont
pas été affectés par Las 5, indiquant ainsi la nécessité les récepteurs
membranaires cellulaires pour l'action de la bactériocine.
Andersson (1986) a démontré que les souches gram-négatif résistantes telle
que Escherichia coli, Erwinia carotovora, Pseudomonas aeruginosa, et Serratia.
marcescens pourraient être rendus sensible à la bactériocine de Lactobacillus
plantarum en transformant les cellules gram-négatif en sphéroplastes. Des
travaux subséquents ont montré l’inactivation de bactéries pathogènes à gram-
négatif avec les bactériocines de bactéries gram-positives avec l'usage d'agents
chélateurs (EDTA), qui diminue les propriétés des barrières fourni par les LPS
membranaires externes de ces bactéries gram-négatives (Stevens et al., 1991;
Shefet et al.,1995; Scannell et al., 1997; Helander et al., 1997). Des stress
supplémentaires aux bactéries gram-négatives comme une approche à savoir
l’application simultanée de plusieurs processus peut rehausser l'efficacité
d'une bactériocine. Cutter et Siragusa (1995) ont montré que la nisine (à 2000
IU/ml) était efficace contre les bactéries gram-négatives (E. coli O157:H7 et
Salmonella enterolytica serovar typhimurium) quand elle est utilisée avec
l’EDTA, le citrate, ou le lactate. Ganzle et al., (1999) ont démontré que la
curvacine A et la nisine en combinaison avec un pH bas, une concentration de
NaCl supérieure à 5%, ou le propylparabene provoque une augmentation de la
Revue bibliographique
30
sensibilité de Salmonella et E. coli envers ces bactériocines. Tel effet est
suggérer par de nombreux travaux, la combinaisons de l’action de la
bactériocine avec des agents additionnels et d’une manière appropriée qui peut
élargir considérablement le spectre d’action de quelques bactériocines des
bactéries lactiques contre les bactéries gram négative.
1.8. Production et Modélisation du processus
Dans le but de rendre l’usage commercial des bactériocines économiquement
faisable, il est nécessaire d’optimiser le rendement pendant la production.
Dans une étude de production de la nisine, la pediocine PA-1 de Pediococcus
acidilactici, la leuconocine Lcm1 par Leuconostoc carnosum, et la sakacine A
par Lactobacillus sake Lb 706, Yang et Ray (1994) ont trouvé que dans le
milieu de culture, le facteur clé est le maintien d’un pH optimal et l’addition
dans le milieu, d’éléments nutritifs spécifiques pour chaque souche ou espèce.
Les conditions favorisant l’obtention d’une concentration élevée de cellules
résulte en une augmentation comparable dans la bactériocine libérée
représentant ainsi un indice de métabolite primaire. Pour augmenter le
rendement et la pureté des bactériocines des bactéries lactiques à partir des
fermentations industrielles et avec des frais de production inférieurs, Coventry
et al., (1996) ont démontré que la nisine, la pediocin PO2, la brevicine 286, et
la piscicoline 126 pourrait être synthétisé en excès dépourvu de protéines de
contamination (92 à 99%) en utilisant la diatomite au silicate de calcium et
plusieurs agents de désorption comparé aux surnageant de la culture d’origine
et aux extraits par le sulfate d'ammonium. Pour réduire les frais de production,
On continu à améliorer la vitesse et la production par la méthode de
purification de la bactériocine à partir du bouillon de culture (Guyonnet et al.,
2000). Carolissen-Mac Kay et al., (1997) ont examiné des protocoles pour
purifier des bactériocines des bactéries lactiques. Dans le but d'obtenir des
modèles de production qui ont été divisé pour prévoir l’efficacité commerciale
de la bactériocine basée sur les informations rassemblées dans les systèmes
tests afin d'optimiser les applications des bactériocines.
Blom et al., (1997) ont conçu une méthode pour l’examen simultané de l'effet
de facteurs intrinsèques (pH, concentration de la souche indicatrice, agar,
huile de soja, et la concentration du NaCl) sur la diffusion et l’efficacité de la
Revue bibliographique
31
bactériocine sur milieu gélosé en boite. En effet, la Sakacine A et P, piscicoline
61, pediocine PA-1, et la nisine chacune d'elle étaient dépendante d’un facteur
intrinsèque unique, bien que le pH et la concentration de la souche indicatrice
affecte toutes les bactériocines d’une manière similaire. A l'exception de la
préparation commerciale de nisine, les autres bactériocines ont été
synthétisées en utilisant des souches génétiquement modifiées de Lactobacille
Lb790.
Parente et al., (1998) ont analysé la régression de donnée catégoriques pour
générer des modèles prédictives pour la probabilité de survie pour Listeria
monocytogenes, comparé avec la leucocine F10 et la nisine dans un bouillon de
soja trypsique avec 0.6% d’extrait de levure. La nisine avait un effet
considérable sur la probabilité de survie, mais l’addition de la leucocine F10
était nécessaire pour éliminer Listeria monocytogenes. Une baisse dans le pH
du milieu de culture diminué la survie pendant que le NaCl et l’EDTA ont
exercé un effet limité. Pleasants et al., (2001) ont étudié comme modèle la
croissance de Listeria monocytogenes L70 en réponse à l’égard de la
bactériocine sakacin A de Lactobacillus sake 706. Dans le bouillon MRS, il a
été trouvé que Lactobacillus sake croit plus rapidement que Listeria
monocytogenes L70 à pH réduit. L’éxcrétion de la sakacine A par la souche
productrice réduit rapidement la présence de Listeria monocytogenes dans la
culture mixte. Il a été montré aussi que le modèle pourrait prévoir
correctement la croissance et l’interaction entre les deux bactéries dans le
milieu de culture utilisé.
1.9. Purification des bactériocines
Grâce a leurs caractéristiques intrinsèques, plusieurs bactériocines sont
purifiées selon un profil classique. A savoir, la purification de plusieurs
bactériocines de classe I et II s'accomplit à l'aide de trois étapes distinctes. La
première et la deuxième résident en une concentration, accompagnée d'une
pré-purification sur une colonne de chromatographie à basse pression. L'étape
finale consiste en une purification sur HPLC (chromatographie en phase
liquide). Ainsi, la plupart des protocoles de purification à l'échelle analytique
regroupent une étape de précipitation au sulfate d'ammonium (NH4)2SO4 suivie
d'une série de colonnes ionique ou hydrophobe et finalement d'une étape de
Revue bibliographique
32
chromatographie à phase inverse (Parente et Ricciardi, 1999). En revanche, il
arrive que la chromatographie puisse être remplacée par une étape
préparatoire selon le point isoélectrique (Venema et al., 1995b). De même,
lorsque les anticorps sont disponibles, I'immunoaffinité permet la purification
de bactériocine, telle que la nisine Z, en une seule étape (Bouksaim et al.,
2000). La concentration par précipitation au sulfate d'ammonium consiste en
l'ajout graduel du sel à une solution afin de précipiter les protéines. Compte
tenu que la précipitation des protéines dépend de leur charge nette, l'ajout
progressif de sel conduit à une première étape de purification avec l'obtention
d'un facteur purification de 2 à 3. Bien que mineure, le premier rôle de la
précipitation consiste à concentrer les protéines à un volume adéquat destiné à
la chromatographie sur colonne. La chromatographie à basse pression permet
de purifier partiellement les fractions avant I'HPLC. La chromatographie à
haute pression permet une séparation rapide, accompagnée d'une résolution et
d'une sensibilité accrue par rapport à la chromatographie à basse pression.
Compte tenu de la nature hydrophobe des bactériocines, la chromatographie à
phase inverse où la phase mobile est hydrophile et la phase non mobile est
hydrophobe, est fréquemment employée à cette étape.
1.10. Résistance
La présence d'une substance antibactérienne dans un environnement
donné, sélectionnera éventuellement une variété de bactéries résistantes aux
composants antagonistes. Comme, dans le cas de la résistance bactérienne aux
antibiotiques thérapeutiques dans l'environnement, on constate aussi,
l’émergence de mutants bactériocine-résistants.
Gravesen et al., (2002a) ont examiné les réponses de plusieurs souches de L.
monocytogenes à la pediocine le PA-1 et à la nisine, et ont trouvé une grande
gamme de résistances aux deux bactériocines qui se produisent naturellement.
L'influence du stress du milieu (abaissement du pH, basse température, et la
présence du NaCl) paru spécifique aux bactériocines; ceci dit, ces stress n'ont
pas influencé la fréquence de résistance à la pediocine PA-1, mais la fréquence
de résistance à la nisine a été considérablement réduite. La stabilité du
phénotype de résistance à la nisine a varié considérablement, cependant la
résistance à la pediocine était stable avec une croissance continue de L.
Revue bibliographique
33
monocytogenes. La diminution du taux de croissance chez les mutants
pediocine-résistants de L. monocytogenes a été démontrée, mais les mutants
nisine-résistants ont montré une réduction limitée du taux de croissance. Les
mutants de L. monocytogenes résistants aux bactériocines ne sont pas plus
sensibles aux stress environnementaux comparé à la souche sauvage; dans un
model de croissance sur saucisse les différences étaient faibles.
Horn et al., (1999) ont transférés les gènes de la biosynthèse de la pediocine
PA-1 dans une souche de L. lactis FI5876 productrice de nisine. En
conséquence, toutes les deux bactériocines, la pediocine PA-1 et la nisine A
sont synthétisées simultanément par cette souche de Lactococcus. Le niveau de
production de la pediocine PA-1 a été similaire à celui trouvé dans la souche
productrice d’origine de la pediocine, Pediococcus acidilactici 347. Vu que la
pediocine PA-1 et la nisine A sont des bactériocines sans aucun rapport,
l’utilisation de L. lactis FI5876 comme une culture starter dans les produits
laitiers fermentés devrait empêcher l’émergence d’isolats de L. monocytogenes
résistants aux bactériocines parce que la fréquence d’apparition d'une souche
résistante aux deux peptides devrait être très bas.
Modi et al., (2000) ont évalué la résistance de L. monocytogenes à la nisine afin
de répondre à la question, est-ce la résistance spontanée à la nisine conduit à
l’augmentation de la résistance à la chaleur relative aux souches de type
sauvage. En l'absence de nisine, il n'y avait aucune différence significative dans
la résistance à la chaleur. Quand la souche de L. monocytogenes résistante à la
nisine est cultivée en présence de nisine à 55°C, ses cellules deviennent plus
sensibles à la chaleur. Quand les cellules résistantes à la nisine ont été
soumises à un traitement combiné de la chaleur et la nisine, il y avait un effet
synergétique d'inactivation. Après exposition à la chaleur, les cellules
résistantes à la nisine, une fois encore, sont devenues sensibles aux effets de la
nisine. Dans le cas de L. moncytogenes, la résistance à la nisine ne paraît pas
être particulièrement stable, Aucune donnée sur l’effet indésirable de la
résistance à la chaleur surélevée n'a été enregistrée.
1.11. Caractérisation des bactériocines
L'analyse approfondie des différentes bactériocines produites par les
lactocoques sera abordée dans cette partie avec quelques caractéristiques
générales qui sont résumées au tableau 1.
Revue bibliographique
34
1.11.1. La nisine
A un moment donné, il était exacte de dire que les colicines étaient les
plus étudiés et la plupart très connues; cependant, c'est maintenant sûr de
dire que les bactériocines produites par les bactéries gram positives, est le
groupe le plus étudié des peptides antibactériens, permettant une possibilité
pour leur applications commerciales dans les produits alimentaire. La nisine
est devenue populaire à cause de sa longue histoire de son utilisation et son
efficacité ainsi que sa documentation sur son action contre les bactéries
pathogènes à gram positif et les microorganismes de contamination. Ce n'était
pas exceptionnel pour les fabricants de fromage d’observer des fermentations
manquées ou lentes. Pendant que l'infection avec les bactériophages était un
contributeur majeur à ce problème, il a été reconnu que quelques
streptocoques lactiques pourraient inhiber d’autres, responsables des
problèmes dans la fabrication fromagère. En 1928, Rogers et Whittier en
premier, ont publié sur l'effet inhibiteur implicite de la nisine dans laquelle
Streptococcus lactis (maintenant Lactococcus lactis subsp. lactis) a inhibé
Lactobacillus bulgaricus (Rogers 1928; Rogers et Whittier 1928). Whitehead et
Riddet (1933) ont décrit “streptocoques inhibiteurs” dans le lait. Le nom nisine
a été inventé par Mattick et Hirsch (1947) de “N inhibitory substance” depuis L.
lactis a été classé originairement comme appartenant au groupes sérologique
de Lancefield N. Des efforts récents, afin de mettre au point une application
pratique pour la nisine à savoir son efficacité pour le traitement des mammites
des troupeaux laitiers (Taylor et al., 1949). Hirsch et al., (1951), en premier,
ont examiné la possibilité de l’utilisation de la nisine comme conservateur
alimentaire
Revue bibliographique
35
Tableau 1 : représente différents types de bactériocines produites par lesbactéries lactiques (Chen et Hoover, 2003).
Bactériocines Souches productrices
Classe I-type A lantibiotique
Nisine Lactococcus lactis
lactocine S Lactobacillus sake
Epidermine Staphylococcus epidermidis
Gallidermine Staphylococcus gallinarum
Lacticine 481 L. lactis
Classe I-type B lantibiotique
Mersacidine Bacillus subtilis
Cinnamycine Streptomyces cinnamoneus
Ancovenine Streptomyces spp.
Duramycine S. cinnamemoneus
Class IIa
pediocine PA-1/AcH Pediococcus acidilactici
sakacine A L. sake
sakacine P L. sake
leucocine A-UAL 187 Leuconostoc gelidum
mesentericine Y105 Leuconostoc mesenteroides
enterocine A Enterococcus faecium
lactococcine MMFII L. lactis
Class IIb
lactococcine G L. lactis
lactococcine M L. lactis
lactacine F Lactobacillus johnsonii
plantaricine A Lactobacillus plantarum
plantaricine S L.plantarum
plantaracine EF L.plantarum
plantaracine JK L.plantarum
Class IIc
acidocine B Lactobacillus acidophilus
Camobacteriocine A Carnobacterium piscicola
divergicine A C. divergens
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36
enterocine P E. faecium
enterocine B E. faecium
Class III
helveticine J Lactobacillus helveticus
Helveticine V-1829 Lactobacillus helveticus
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Tableau 2: Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produitentpar les bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover, 2003).
Bacteriocines Souches productrice Spectre d’activité (fréquence de sensibilité)
Classe I
Acidocine
J1132
Lactobacillus
acidophilus JCM1132
Active contre différentes espèces de Lactobacillus (9/32)*. nonactive contre Lactococcus (0/6), Pediococcus (0/5), Streptococcus(0/7), Listeria monocytogenes (0/4), Bacillus spp. (0/7), etStaphylococcus spp. (0/2).
Lacticine
3147
Lactococcus lactis
DPC3147
Active contre différentes espèces de Enterococcus (4/4),Lactobacillus (14/14), Lactococcus (17/18), Leuconostoc (1/1),Pediococcus (3/3), Streptococcus (2/2), L. monocytogenes (1/1),Listeria innocua (1/1),Staphylococcus aureus (1/1), Bacillus spp. (2/2) et Clostridiumspp. (2/2).
Lactocine S Lactobacillus sake L45
Active contre différentes espèces de Enterococcus (1/1),Lactobacillus (8/8), Lactococcus (1/3), Leuconostoc (1/1),Pediococcus (3/3), L. monocytogenes (5/5), L. innocua (1/1),Staphylococcus (6/6), Bacillus cereus (1/1), et Clostridium spp.(5/5).
Nisine Lactococcus lactis subsp. lactis
Active contre différentes espèces de Enterococcus (2/2),Lactobacillus (9/9), Lactococcus (5/5), Leuconostoc (1/1), Pediococcus(4/4), L. monocytogenes (14/14), L. innocua (2/2), Listeria grayi(1/1), Listeria ivanovii (1/1), Listeria murrayi (1/1), Listeria seeligeri(1/1), Listeria welchimeri (1/1), et Staphylococcus spp. (7/7).Empèche la germination des spores de Bacillus spp. et Clostridiumspp. et un effet bactericide sur les formes végétatives.
Plantaricine C Lactobacillus plantarum LL441
Active contre différentes espèces de Enterococcus (1/1),Lactobacillus (8/11), Lactococcus (1/1), Leuconostoc (2/2),Pediococcus (2/2), Streptococcus (2/2), Staphylococcus carnosus(1/1), Bacillus spp. (2/3), et Clostridium spp. (2/2). Aucune activitécontre L. innocua (0/1).
Thermophiline 13 Streptococcus thermophilus SFi13
Active contre differentes éspèces de Enterococcus (1/1),Lactobacillus (3/3), Lactococcus (1/1), Leuconostoc (2/2),Streptococcus (1/1), L. monocytogenes (1/1), L. innocua (1/1), S.carnosus (1/1), Bacillus spp. (2/2), et Clostridium spp. (2/2).Empèchela germination des spores de B. cereus et Clostridiumbotulinum
Classe IIa
Acidocine ALactobacillus acidophilusTK9201
Active contre différentes espèces de Enterococcus (1/5),Lactobacillus (13/32), Pediococcus (2/7), Streptococcus (8/13), andL. monocytogenes (5/5). Aucune activité contre Bacillus subtilis(0/6) et S. aureus (0/2).
Bavaricine ALactobacillus sake
MI401
Active contre différentes espèces de Enterococcus (2/2),Lactobacillus (11/25), Lactococcus (5/15), Leuconostoc (4/7),Pediococcus (2/5), et L. monocytogenes (9/10). Aucune activitécontre Carnobacterium (0/1), Streptococcus (0/2), Brochothrixthermosphacta (0/1), Bacillus spp. (0/7), et Staphylococcus spp.(0/5).
Curvacine ALactobacillus curvatus
LTH1174
Active contre differentes éspèces de Carnobacterium (3/3),Enterococcus (1/2), Lactobacillus (10/23), Lactococcus (1/12),Pediococcus (5/8), L. monocytogenes (7/7), L. innocua (1/1), et L.ivanovii (1/1). Sans aucune activité contre Leuconostoc (0/3) etClostridium spp. (0/12).
Divercine V41 Carnobacterium divergens V41
Active contre différentes espèces de Enterococcus (4/4),Lactobacillus (2/5), Pediococcus (2/2), L. monocytogenes (1/1), L.innocua (1/1), et L. ivanovi (1/1). Sans aucune activité contreLactococcus (0/1) et Leuconostoc (0/3).
Enterocine AEnterococcus faecium
CTC492
Active contre différentes espèces de Enterococcus (4/4),Lactobacillus (2/2), Pediococcus (2/2), L. monocytogenes (4/4), et L.innocua (2/2).
Lactococcine Lactococcus lactis Active contre différentes espèces de Enterococcus (3/3),
Mesentericine
Y105
Leuconostoc mesenteroidesY105
Active contre différentes espèces de Carnobacterium (1/1)Enterococcus (2/2), Lactobacillus (2/2), Leuconostoc (2/2),Pediococcus (2/2), L. monocytogenes (1/1), et L. innocua (1/1).Empèche la germination des spores et la croissance des formesvégétatives de Clostridium botulinum
Mundticine Enterococcus mundtii ATO6
Active contre différentes espèces de Carnobacterium (3/3)Enterococcus (2/3), Lactobacillus (23/31), Lactococcus(1/14),Leuconostoc (3/4), Pediococcus (8/11), L. monocytogenes (12/12), L.innocua (2/2), L. ivanovii (1/1) Staphylococcus spp. (2/6), B. cereus(1/1), et Clostridium spp.
Pediocine PA-1Pediococcus acidilactici PAC1.0
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En 1957, la nisine a été rapporté pour être généralement un produit utilisé
dans le fromage de ferme (Chevalier et al., 1957). Dans cette même année,
Aplin et Barrett ont développé des préparations commerciales à utiliser dans
les aliments (Delves-Broughton et al., 1996). Les substances de nisine sont
habituellement trouvées parmi la flore fromagère (Hurst 1967). Actuellement, il
est connu que les lactocoques peuvent produire d'autres bactériocines et des
substances inhibitrices en plus de la nisine. Gross et Morrell en 1971, sont les
premier à élucider la structure de la nisine qui est faite de 34 acides aminés.
Au moins 6 formes différentes ont été caractérisées (désigné par A jusqu’à E et
Z), avec la nisine A représentant le type le plus actif. La Nisine Z est un variant
naturel de la nisine qui différe de la nisine A par la substitution d'un résidu
histidine par l’acide aspartique. La forme commercialement disponible la plus
établie de la nisine utilusée comme conservateur alimentaire est a la
NisaplinTM, avec comme composant actif 2,5% de nisine A et le composant
prédominant est représenté par du NaCl (77.5%) et du lait sec sans matière
grasse (12% protéine et 6% carbohydrates). Plusieurs marques de produits
antimicrobiens vendues contiennent de la nisine.
La nisine est un lantibiotique. Le terme lantibiotique vient de l’antibiotique
contenant la lanthionine. Cette agent antimicrobien contient des acides aminés
inhabituels postranslationnellement modifiés, reliés par un pont thioether
lanthionine et 3-methyllanthionine, et le 2,3-didehydroalanine insaturé et le
2,3-didehydrobutyrine (van Kraaij et al., 1999). Ces résidus insaturés ou
déshydratés caractérisés par des centres électrophiliques qui peuvent réagir
avec les groupes nucléophiles proches (McAuliffe et al., 2001). Par conséquent,
les lantibiotiques caractérisés par des structures polycycliques qui sont très
important pour la propriété de l’insertion membranaire de la bactériocine. Ces
structures en bague maintiennent la rigidité du peptide (Kuipers et al., 1996)
aussi bien ils protègent la bactériocine des enzymes protéolytiques et la
dénaturation thermique (Hurst 1981). La nisine appartient à la classe I des
bactériocines et du type A des lantibiotiques (c'est un peptide étiré avec une
charge positive nette). Les lantibiotiques apparentés à la nisine qui ne sont pas
produites par les bactéries lactiques incluant la subtilins de Bacillus subtilis et
l'epidermins à partir de Staphylococcus epidermidis. Comme la Nisine, ces
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peptides fonctionnent en désorganisant par rupture de l'intégrité de la
membrane.
La nisine n'a habituellement aucun effet sur les bactéries gram négatif, les
levures, et les moisissures, bien que les bactéries gram négatif puissent être
sensibilisées à la nisine par la permeabilization de couche membranaire
externe similaire à celle causé par chauffage létale, la congélation, et les agents
chélateurs (Delves-Broughton et al., 1996).
Normalement seule les bactéries gram positif sont affectés, et ces types
incluent les bactéries lactiques, cellules végétative des bactéries pathogènes
tels que Listeria, Staphylococcus, et Mycobacterium, et les bactéries sporulales,
Bacillus et Clostridium. Les spores des bacilles et les clostridium sont
réellement plus sensibles à la nisine que leurs cellules végétatives, bien que
l'effet antagoniste soit sporostatique et pas sporicidale, ceci, exige la présence
continue de la nisine pour empécher la germination des spores. Les dégât
provoqués par la chaleur sur les spores substantiellement augmente leur
sensibilité à la nisine, afin que la nisine soit efficace contre les spores dans les
aliments à faible acidité et traités par un processus thermique, résultat de son
usage comme un complément de traitement dans les légumes en conserve. Le
mécanisme par lequel la nisine inhibe la germination des spores n’est pas clair,
bien qu'il ait été déterminé que l'action sporostatique de la nisine est causée
par son attachement aux groupes sulfhydrate des résidus de proteines (Morris
et al., 1984). Le mécanisme de son action sporostatique est distinct de son effet
bactéricide sur la membrane cytoplasmique de cellules végétatives.
La nisine purifié a été évalué pour l’effet toxicologique et a été trouvé
inoffensive ou au moins avec une toxicité très basse en utilisant des rats
comme cobaye (Frazer et al., 1962; Shtenberg et Ignatev, 1970). Son usage est
approuvé comme un additif alimentaire dans plus de 50 pays. C'est
probablement sûr de dire que dans la plupart de ces pays, la nisine est la seule
bactériocine autorisée comme un conservateur alimentaire. L'acceptation
Internationale de la Nisine a été donnée en 1969 par les experts des additifs
alimentaires de la FAO/WHO (WHO, 1969). Le seul autre composé utilisé
comme anti-microbiens avec une approbation similaire en tant qu'agent de
conservation sont les composés antimycotiques de surface, pimaricine
(Henning et al., 1986). Le Comité FAO/WHO a recommandé une prise
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journalière maximale de nisine de 60 mg de nisine pure ou 33000 Unités pour
une personne de 70kg (Hurst et Hoover, 1993). Cependant, la nisine est
autorisé dans la fabriquation fromagère en Australie, en France, et en Grande-
Bretagne sans limite maximale de doses. Aux Etats-Unis, la limite maximale
est de 10000 UI/g; en Russie, la limite maximale est de 8000 UI/g, pendant
qu'en Argentine, Italie, et Mexique, la limite est de 500 UI/g pour les fromages
et dans d’autres produits (Chi-kindas et Montville, 2002). Les exemples de
produits alimentaire internationaux qui peuvent être améliorer légalement par
la nisine sont, des conserves de soupes (Australie), de la glace pour conserver
du poisson frais (Bulgarie), aliments pour bébés, aliments subissant une
cuisson et la mayonnaise (République tchèque) (Hurst et Hoover 1993).
Cependant, la majorité des types de produit approuvés sont les produits
laitiers (surtout dans les fromages) et les conserves en boites. Aux Etats-Unis,
l'usage de levains produisant la nisine n’a jamais été régularisé, comme les
lactocoques considérés comme GRAS. Comme déduis du code FDA (1988)
concernant l’usage de bactériocines comme additifs alimentaires, quand la
substance antimicrobienne naturelle (c'est, les bactériocines tel que Nisine) est
utilisée comme agents de conservation des aliments, la culture qui la produise
doit être considérée comme un micro-organisme GRAS (d'où la recherche
d’agents de conservation des aliments à partir des bactéries lactiques).
Le service de sécurité et d’inspection des aliments (FSIS) de l'USDA, évalue la
sécurité et l’efficacité des bactériocine dans les denrées alimentaires tel que la
viande et les produits de volaille. Donc selon le type de produit, le FDA ou FSIS
approuvent l’usage de nouvelles bactériocines avant toutes autorisations
d’applications (Chikindas et Montville, 2002).
1.12. Spectres d'activité des bactériocines
La plupart des bactériocines de la classe I, ont un spectre inhibiteur assez
large. Ils n’inhibent pas seulement les bactéries apparentées, tel que des
espèces du genre Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc,
Pediococcus, et Streptococcus, mais inhibent aussi beaucoup de bactéries gram
positif, tel que L. monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et
Clostridium botulinum. Plusieurs bactériocines dans cette classe, tel que la
nisine et la thermophiline 13, empêchent la germination des spores de B.
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cereus et C. botulinum. De façon intéressante, l’acidocine J1132 a un spectre
d'action très étroit et les souches sensibles sont limitées aux membres du
genre Lactobacillus (Table 2), pendant qu'à l'autre extrême, la plantaricine LP84
(produite par Lactobacillus plantarum NCIM 2084) a montré un antagonisme
contre E. coli (Suma et al., 1998).
Comparé à la classe I des bactériocines. La plupart des bactériocines de la
clase IIa, ont des spectres d'activité comparativement étroits et inhibent
seulement des bactéries gram positif apparentées. En général, les membres du
genre Enterococcus, Lactobacillus, Pediococcus sont sensibles à cette classe IIa,
et les membres du genre Lactococcus sont résistants. Eijsink et al., (1998)
trouvent que la pediocine PA-1 était active contre des espèces différentes des
Enterococcus, Lactobacillus, et Pediococcus; cependant, seulement 1 parmis 11
souches de Lactococcus testées (Lactococcus lactis LMG 2070) était sensible à la
bactériocine. Quelques unes des bactériocines IIa, tel que la pediocine PA-1,
ayant des spectres inhibiteurs assez large et pouvant inhiber des bactéries, tel
que S. aureus et des cellules végétatives de Clostridium sp. et de Bacillus sp.
Quelques bactériocines de la classe IIa, tel que la mundticine produite par
Enterococcus mundtii, empêche la germination des spores de C. botulinum.
Les bactériocines de la classe IIa, sont généralement actives contre Listeria.
Eijsink et al., (1998) ont trouvé que 9 souches de Listeria testées, y compris L.
monocytogenes, Listeria innocua, et Listeria ivanovii, étaient très sensibles à 4
bactériocines de la classe IIa (la pediocine PA-1, l’enterocine A, la sakacine P, et
la curvacine A). D'ailleurs, l'étendue de la sensibilité varié de souche en
souche. Les concentrations minimales inhibitrices contre L. monocytogenes
pour les 4 bactériocines précités variés de 0.1 à 8 ng/ml; cependant, quelque
Listeria, tel que L. monocytogenes V7 et L. innocua LB1, résistent aux
bactériocines de la classe IIa (enterocine A, mesentericine Y105, divercine V41,
et la pediocine AcH) (Ennahar et al., 2000a).
Dans une comparaison directe, Il a été montré que la nisine a un spectre
d’inhibition plus large contre L. monocytogenes que la pediocin PA-1 (Ennahar
et al., 2000a). Rasch et Knochel (1998) trouvent seulement 2 sur 381 souches
de L. monocytogenes testées étaient capables de croître faiblement quand elles
sont exposées à 500 UI de nisine/ml.
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La majorité des souches ont été capable de pousser à 100 UI/ml mais pas à
500 UI/ml. Bien qu'une grande portion des 381 souches testées (67.5%)
étaient incapables de croître a des concentrations faibles de pediocine (100
AU/ml) et seulement 20 souches ont poussé normalement à 1600 AU /ml. Les
études supplémentaires ont indiqué qu'une grande partie de ces 20 souches
pediocine-résistantes étaient capables de croître normalement à de
concentration élevées de pediocine (12800 AU/ml).
Il peut paraître que les bactériocines avec des spectres d'activité plus large
seraient toujours préférables pour la conservation des aliments, mais dans
certains circonstances, des bactériocines a spectre d'inhibition plus étroits sont
plus désirable. Par exemple, la sakacine P qui a une activité limité contre les
bactéries lactiques mais elle est presque aussi efficace que la pediocine PA-1
contre Listeria, elle peut être appliquer dans les produits de fermentation par
les bactéries lactiques qui sont exposés aux contamination par L.
monocytogenes (Eijsink et al., 1998).
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Tableau 3. Caractéristiques générales des bactériocines produites par
différentes espèces des bactéries lactiques (Lactococcus lactis, Lactobacillus et
Pediococcus).
1.13. Propriétés
La classe I et classe IIa des bactériocines, sont habituellement très stables à pH
acide (Table 3). Rodriguez et al., (2002) ont observé que la pediocine PA-1 était
parfaitement stable après 21jours de stockage à 15 °C et à un pH 4 à 6;
cependant, la moitie de l'activité a été perdue à pH 7. Larsen et al., (1993) ont
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remarqué que la bavaricine A était très stable à pH 2.0 à 9.7, mais l'activité de
la bavaricine est complètement perdue à pH 12.5. De plus, les bactériocines de
ces 2 classess sont thermostables à pH acide. Plus l’acidité augmente, plus
leurs thermopstabilité baisses. Jack et al., (1996) ont noté que le chauffage de
la piscicoline 126 pendant 2 h à pH 2 et 3 n'ont pas affecté son activité
bactéricide, en la chauffant pendant 15 min à pH 4 ou 5, son activité est
réduite de 50%. En général, les bactériocines sont habituellement sensibles
aux enzymes protéolytiques gastriques, tel que la trypsine, dû à leur nature
protéolytique.
1.14. Applications dans les aliments
Les consommateurs sont directement concernés par la présence d'additifs
chimiques dans leurs aliments. En conséquence, ils sont attirés par des
produits alimentaires frais et sans ajout d’agents de conservation chimiques.
Cette perception, associée avec la demande croissante pour les aliments issus
de traitement de transformation minimale avec une longue durée de
conservation, a stimulé les recherches à trouver des agents de conservation
naturels mais efficaces.
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques, peuvent être considéré
comme des conservateurs naturels ou biopreservateurs qui accomplissent ces
exigences. La conservation Bio fait référence à l'usage de microorganismes
antagonistes ou leurs produits métaboliques inhibent ou détruisent des
microorganismes indésirables dans les aliments, afin de augmenter la sécurité
alimentaire et prolonger leur durée de vie de conservation (Schillinger et al.,
1996).
Trois approches sont utilisées couramment dans l'application de bactériocines
comme biopreservateurs dans les aliments (Schillinger et al., 1996):
(1) inoculation des aliments avec les bactéries lactiques produisant
des bactériocines dans le produit alimentaire. La capacité des
bactéries lactiques à croître et produire des bactériocine dans les
produits est cruciale pour son usage prospère.
(2) addition de la bactériocine purifiée ou partiellement purifiée
comme agents de conservation dans les aliments.
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(3) l'usage d'un produit fermenté précédemment avec une souche
productrice de bactériocine comme un ingrédient dans la
transformation d’un aliment.
1.14.1. Biopreservation des produits à base de viande
Listeria monocytogenes est une bactéries gram positif, asporulale,
bâtonnet anaérobie facultative largement distribuée dans la nature. Elle peut
pousser dans un pH allant de 4.1 à 9.6 et à une température variant de 0 à
45°C. De plus, elle est résistante à la dessiccation et peut croître à des valeurs
de l'Aw (activité de l’eau) aussi bas comme 0.90. La nature ubiquiste de L.
monocytogenes, sa structure robuste et sa capacité de pousser à des
températures de réfrigération et les conditions anaérobies la rendent une
menace à la sécurité des aliments. Il est considéré comme un problème majeur
de sécurité alimentaire pouvant causer des maladies sérieuses et voir même
des décès. Certains pays comme les USA possèdent la politique la plus sévère
concernant L. monocytogenes et ne tolérance pas la présence de L.
monocytogenes dans les aliments prêt manger (Jay, 1996; Ryser et Marth,
1999). Elle a été détectée dans une grande variété d’aliments et impliquée dans
plusieurs maladies transmises par des aliments (Jay, 1996). Beaucoup
d'études ont été menées pour contrôler L. monocytogenes dans les la viande et
ses dérivés depuis l’abattoir jusqu’à emballage (Ryser et Marth 1999).
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Tableau 4. Propriétés et caractéristiques de quelques bactériocines de la classeI et IIa produites par les bactéries lactiques (Chen et Hover, 2003)
PropriétésBacteriocines MW* (Da)
Classe IStable à 100 °C pendant 10 min à pH 5 ou 90 °Cpendant 10 min à pH 7.
Lacticine 3147A2847
Sensible à la trypsine l’α-chymotrypsine, laprotéinase K, et la pronase E, résistant à la pepsine.
Lacticine 3147B3322
Stable à 121 °C à pH 2. Devient moins Stable à pH5-7. Sensible à l’α-chymotrypsine, résistante à latrypsine, elastase, carboxypeptidase A, la pepsine, etla erepsine.
Nisine 3488
Stable à la température basse, à 100 °C pendant 60min ou 121 °C pendant 10 min. Moins stable à pHacide et neutres. Sensible à pronase, la trypsine, etl’α-chymotrypsine, résistante à la pepsine, laprotéinase K, l’ α-amylase, et à la lipase.
Plantaricin C 3500
Classez IIaStable à 100 °C pendant 60 min à pH 2.0 à 9.7.Sensible à la pepsine, la trypsine, la pronase E, laprotéinase K et l’α-chymotrypsine A4, résistante àcatalase.
Bavaricin UN 3500-4000
Stable à 70 °C pendant 30 min à pH 5 à 8. Sensible àla protéinase K, la trypsine et à la papaïne, résistanteà la glucoamylase, la lipase, l’ α-amylase et lelysozyme.
Lactococcin MMFII4143
Stable à pH 4 à 6, devient moins stable quand le pHaugmente. Stable à 80 °C pendant 60 min ou 100 °Cpendant 10 min. Sensible à la trypsine, la papaïne, laficine, l’α-chymotrypsine, la protéase IV, XIV, et XXIV,et à la protéinase K, résistante à la phospholipase C,la catalase, le lysozyme, la DNAses, la RNAses, et lalipase.
Pediocin PAPA 14624
Stable à pH 2 après 2 mois de stockage à 4 °C. stableà 100 °C pendant 120 min à pH 2 à 3. Devient moinsstable quand le pH augmente. Sensible à l’α-chymotrypsine, les différents types de protéase IV,XIV, XXIII, et la trypsine, résistante à la catalase, lalipase, et le lysozyme.
Piscicolin 126 4416
Seule l'activité de la nisine à des concentrations de 400 et 800 UI/g et en
combinaison avec 2% d’NaCl contre L. monocytogenes dans la viande de boeuf
crue hachée a été examiné par Pawar et al., (2000). Les échantillons de viande
crue hachée était inoculée avec 103 ufc/g de L. monocytogenes et a entreposée
à 4°C. Le dénombrement de L. monocytogenes dans l’échantillon témoin a
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47
augmenté de 3.0 Log à 6.4 Log ufc/g après 16 jours de stockage; cependant, la
nisine à réduit considérablement L. monocytogenes. L’addition de la nisine à
400 UI/g augmente la durée de la phase de latence de L. monocytogenes, et à
un niveau de 800 UI/g, résulte en un nombre de L. monocytogenes de 2.4 Log
cycles inférieur à celui trouvé dans l’échantillon témoin après 16 jours de
stockage. Quand la température de stockage est augmentée jusqu’à 37°C,
l’effet inhibiteur de la nisine a été moins prononcé. L’addition de 2% d’NaCl en
combinaison avec la nisine, augmente l'efficacité de la nisine aux deux
températures de stockage.
Les sections de carcasse de bœuf ont été inoculées avec approximativement 4
Log ufc/cm2 de Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium divergens, ou L.
innocua par Cutter et Siragusa (1994) pour évaluer l'efficacité de la nisine pour
aseptiser la surface des carcasses de viande rouge. Le traitements par
vaporisation d'eau n'ayant aucun changement sur les populations
bactériennes; cependant, le traitement par vaporisation de la nisine (5000
AU/ml) a réduit les populations bactériennes de 1.8 à 3.5 Log ufc/cm2 au
premier jour et de 2.0 à 3.6 Log ufc/cm2 après stockage à 4°C pour une
journée.
Fang et Lin (1994) ont remarqué que l’addition de 10000 UI/ml de nisine au
filet de porc cuit inhibe la croissance de L. monocytogenes, mais pas
Pseudomonas fragi. La nisine a été trouvé pour être plus efficace quand elle est
utilisée en combinaison avec un emballage sous atmosphère modifiée (MAP,
100% CO2, 80% CO2 + 20% air). MAP et la nisine (1000 ou 10000 IU/ml)
inhibent la croissance de deux microorganismes, et cet effet inhibiteur
MAP/nisine en combinaison est plus prononcé à 4 °C qu'à 20 °C.
Murray et Richard (1997) ont évalué l'activité des substances antilisteriales la
nisine A et pediocine AcH dans la décontamination artificiellement de
morceaux de porc cru. La nisine A était considérablement plus efficace que la
pediocine AcH, mais après 2 jours de stockage, la survie des bactéries dans la
viande traitée avec chacune des bactériocines reprend un taux semblable à
celui du témoin. De plus, la nisine était plus stable que la pediocine AcH. La
perte d'efficacité, surtout de la pediocine AcH, a été attribuée à une
dégradation rapide par les protéases de la viande.
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48
En plus de la nisine et la pediocine, les autres bactériocines des bactéries
lactiques ont été examinées pour contrôler la croissance de Listeria. Les
exemples incluent Laukova et al., (1999), qui ont examiné l'efficacité de
l'enterocine CCM 4231 dans la lutte contre L. monocytogenes dans le saucisson
fermenté et séché de salami. L’ajout de l'enterocin reduit le nombre de L.
monocytogenes de 1.7 Log cycle immédiatement après l’addition de la
bactériocine (nombre initial: 108 ufc/ml). Après une semaine de maturation du
salami, le nombre de L. monocytogenes dans le témoin (sans ajout enterocine) a
atteint 107 ufc/g, pendant que dans l'échantillon traité (avec ajout enterocine),
le nombre était 104 ufc/g, une différence qui a été maintenue après 2 et 3
semaines de maturation. Aussi, Hugas et al., (1998) ont trouvé que la sakacine
K, une bactériocines produite par Lactobacillus sake CTC494, inhibe la
croissance de L. innocua dans des échantillons de poitrines de volaille emballés
sous vide et de porc cuit, et dans des échantillons de porc haché cru emballés
dans une atmosphère modifié.
Schöbitz et al., (1999) déterminaient la capacité inhibitrice d'une substance
semblable aux bactériocines produite par Carnobacterium piscicola L103 contre
L. monocytogenes, et ont trouvé que la bactériocine a complètement inhibé L.
monocytogenes dans la viande emballée sous vide après 14 jours de stockage à
4°C. Vignolo et al., (1996) ont montré que la lactocine 705 produite par
Lactobacille casei CRL 705 a inhibé la croissance de L. monocytogenes dans du
bifteck haché; cependant, quand la souche productrice a été ajoutée à la
melange liquide, aucune inhibition considérable n'a été détectée. Degnan et al.,
(1992) ont démontré la possibilité d'utiliser des cultures bactériocinogènes de
Pediococcus acidilactici (souche productrice de pediocine AcH) pour inhiber la
croissance de L. monocytogenes dans les aliments emballées sous vide comme
la saucisse de bœuf (Table 4). Quand les saussices étaient inoculés en surface
avec L. monocytogenes et P. acidilactici et emballés sous vide, L.
monocytogenes et le pediocoque ont survécu dans les paquets tenus à 4 °C,
mais le pediocoque n'a pas produit d’acide ou la pediocine pendant le stockage
réfrigéré. Quand les paquets étaient gardés à une températures ambiante de 25
°C pour 8 jours, le nombre total de L, monocytogenes dans le test témoin (sans
ajout du pediocoque) a augmenté de 3.2 Log ufc/g. En revanche, L.
monocytogenes a été inhibée (moyenne de réduction de 2.7 Log ufc/g) dans les
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49
paquets inoculés avec Pediococcus acidilactici. La production de la bactériocine
a commencé tôt et coïncide avec la phase logarithmique de croissance du
pediocoque et continue tardivement avec cette phase.
La raisonne primaire de l’utilisation des nitrites pour la fumigation des viandes
est de stabiliser la couleur de la viande rouge et inhiber la flore de
contamination et les microorganismes d’intoxication alimentaire, tel que le C.
botulinum; cependant, la nitrite peut réagir avec les amines secondaires dans
les viandes pour former les nitrosamines cancérigènes. Cet effet nocif possible
a incité des chercheurs à explorer la possibilité d'utiliser les bactériocines
comme une alternative aux nitrites. Rayman et al., (1981) ont rapporté qu'une
combinaison de 3000 UI/g de nisine et de 40 ppm de nitrite presque inhibe
complètement la germination des spores de Clostridium sporogenes dans les
viandes en preparation liquide à 37 °C pendant 56 jours. Cependant, dans une
étude plus tardive (Rayman et al., 1983), ils ont trouvé que jusqu'à 22000 UI/g
de nisine en combinaison avec 60 ppm de nitrite ne peuvent inhiber la
germination des spores de C. botulinum dans ces préparations liquide de viande
à pH 5.8. La diminution du pH augmente l'activité de la nisine. Par exemple,
8000 UI/g de nisine en combinaison avec 60 ppm de nitrite ont inhibé la
germination des spores dans les préparations liquide de porc à pH 5.5. Taylor
et al., (1985) ont montré que la combinaisons de la nisine et les nitrites étaient
capables de différer la formation de la toxine botulinique dans les émulsions de
saucisse de poulet (pH 5.9 à 6.2). Des échantillons témoins (aucuns agents de
conservation n'ont été ajoutés) sont devenus toxiques après une semaines,
pendant que l’ajonction de 4000 UI/g de nisine et 120 ppm de nitrite ont
retardé la formation de la toxine à 5 semaines.
1.14.2. Biopreservation des produits laitiers
Les espèces de Listeria monocytogenes sont responsables de plusieurs
intoxications associées avec les produits laitiers, tel que le lait pasteurisé
(Fleming et al., 1985) et fromage (James et al., 1985). La nisine a montré son
efficacité contre L. monocytogenes dans les produits laitiers. Ferreira et Lund
(1996) ont trouvé qu’après inoculation d’une souche résistante à la nisine dans
du fromage blanc de longue durée de conservation à pH 4.6 à 4.7, le nombre de
L. monocytogenes décroit approximativement 1-Log ufc/ml pendant le stockage
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50
à 20°C pour 7 jours. L’addition de nisine (2000 IU/g) au fromage blanc
augmenterait le taux d'inactivation d’approximativement 3-Log ufc/ml dans 3
jours. Davies et al., (1997) ont déterminé l'efficacité de la nisine pour contrôler
L. monocytogenes dans les fromages du type ricotta de plus de 70 jours à 6-
8°C. L’addition de la nisine (100 UI/ml) inhibe efficacement la croissance de L.
monocytogenes pour une période de 8 semaines ou plus (dépendant sur type de
fromage). Le fromage témoin contient des niveaux dangereux du
microorganisme après 1 à 2 semaines de stockage. Zottola et al., (1994)
utilisent le fromage du cheddar contenant la nisine produite par un lactocoque
comme composant du fromage au lait pasteurisé. La durée de vie du fromage
au lait pasteurisé (301 et 387 UI/g de nisine) était considérablement plus
grande que celle de l’échantillon témoin de fromage. Dans le fromage en paquet
réfrigéré, la nisine (100 et 300 IU/g) a réduit largement le nombre de L.
monocytogenes, S. aureus, et des spores de C. sporogenes ayant subi un
choque thermique. Un autre problème dans la production fromagère est la
fermentation butyrique des Clostridium. La nisine est ajouté fréquemment aux
fromages au lait pasteurisé pour prévenir la germination des spores de
Clostridium, tel que Clostridium tyrobutyricum (Schillinger et al.,1996).
Une application de la lacticine 3147, une bactériocine à large spectre et à deux
2 composants produite par L. lactis. subsp. lactis DPC 3147, est le maintien de
la qualité du cheddar en réduisant le nombre de bactéries lactiques de la
population exogènes aux ferments pendant la maturation (Ross et al., 1999). Le
fromage produit avec L. lactis 3147 DPC4275 transconjuguée productrice de
lacticine 3147, contient 2 Log ufc/ml de bactéries lactiques exogènes aux
ferments que dans l’échantillon témoin après 6 mois de maturation.
De plus, le fromage fabriqué avec 3 souches productrices de lacticine 3147
n'avait aucune bactérie lactique exogène à la culture initiale détectable sur la
même période. Dans le fromage blanc la population de L. monocytogenes a été
réduite de 3-Log ufc/ml sur une période d’une semaine de maturation que
lorsqu’il a été fabriqué avec L. lactis DPC4275; cependant, le nombre de Listeria
dans l’échantillon témoin fabriqué par culture non productrice de lacticine
3147 reste inchanger (104 ufc/g). La culture transconjugante produisant la
lacticine 3147 a aussi été utilisée comme une culture protectrice pour inhiber
Listeria sur la surface d'un fromage à maturation par les moisissures. La
Revue bibliographique
51
présence de la souche productrice de la lacticine 3147 sur la surface du
fromage a réduit le nombre de L. monocytogenes de 3-Log ufc/ml (Ross et al.,
1999).
Tableau 5 : Obstacles technologiques pour rehausser la sécurité alimentaireeffets d’inactivationBacteriocines
En combinaison avec la températurela nisine (1000 IU/g) rehausse l’inactivation de Listeriamonocytogenes dans le homard par la température douce (60 ou 65°C).
Nisine
la nisine (500 à 2500 IU/ml) rehausse l’inactivation de Salmonellaenteritidis par La température douce (55 °C).
Nisine
les deux bacteriocines ont réduit la viabilité des bactéries à gram-négatif et à gram-positif qui survivent aux stresses subléthales.
Nisine,Pediocine AcH
En combinaison avec les agents chélateursquand elle est utilisée avec l’EDTA, du citrate, ou du lactate, laNisine (2000 IU/ml) est efficace contre les bactéries gram-négatif(Salmonella typhimurium et E. coli O157:H7). En combinaison avecl’emballage sous atmosphère modifiée.Quand elle est utilisée en combinaison avec l’emballage sousatmosphère modifiée et la température basse, la Nisine à un niveaude 400 IU/ml augmenterait la phase de latence de L.monocytogenes, et à 1250 IU/ml empèche sa croissanceLa combinaison emballage sous atmosphère modifiée (100% CO2,80% CO2 + 20% air) et la Nisine (1000 ou 10000 IU/ml) inhibe lacroissance de L. monocytogenes et Pseudomonas fragi
Nisine
En conbinaison avec les substances antimicrobiennes
l'utilusation combinée de sorbate de potassium (0.3%) et la Nisine(400 IU/ml) inhibe la croissance de L. monocytogenes.
Nisine
Un effet synergistique avec le diacétate de sodium (0.3 et 0.5%) et lapediocine (5000 AU/ml) contre L. monocytogenes.
Pediocin AcH
effet synergétique les esters d'acide gras, du saccharose et la nisinesur inhibition bactéries gram-positif.le dioxyde de carbone et la nisine jouent un rôle synergétiquecontre L. monocytogenes.
Nisine
quand elle est combinée avec le carvacrol (0.3 mmol / l), la nisine (6IU/ml) est plus efficace.Pour réduire le nombre de Bacillus cereus que lorsqu’elle estappliquée seule.
Nisine
la nisine (100 IU/ml) et le monolaurin (0.25 mg/l) agissentsynergétiquement contre les cellules végétatives de Bacillus sp.dans le lait.
Nisine
En combinaison avec les lactoperoxidaseseffet synergétique et bactéricide sur L. monocytogenes entre lanisine (100 ou 200 IU/ml) et le système des lactoperoxidases.Nisine
Effet synergétique de la nisine (10 ou 100 IU/ml) et le système deslactoperoxidases sur l’inactivation de L. monocytogenes dans laitécrémé.
Nisine
En combinaison avec d’autre bacteriocines
quand elle est utilisée avec la nisine, la lacticine 481, ou lalactacine F, la pediocine AcH donne un effet synergétique.
Pediocine AcH
En combinaison avec la nisine, la leucocine F10 fournit la plusgrande activité contre L. monocytogenes.
Leucocine F10
L’addition simultanée ou séquentielle de la nisine (50 IU/ml) et lacurvaticin 13 (160 AU/ml) induit un plus grand effet inhibiteurcontre L. monocytogenes que lors qu‘elle est utilisée seule.
Curvaticine
Revue bibliographique
52
1.14.3. Biopreservation des produits de la mer
L'efficacité des bactériocines et les cultures protectrices pour contrôler la
croissance de L. monocytogenes dans le saumon fumé emballé sous vide a été
démontrée par plusieurs chercheurs. Katla et al., (2001) qui ont évalué l'effet
inhibiteur de sakacin P et/ou la culture de L. sake (productrice de sakacin P)
contre L. monocytogenes dans le saumon fumé. Les échantillons de saumons
emballés sous vide ont été incubés à 10°C pour 4 semaines. La sakacin P avait
un effet inhibiteur initial sur la croissance de L. monocytogenes pendant que la
culture de L. sake avait un effet bactériostatique. Quand L. sake a été ajoutée
au saumon avec la sakacin P, un effet bactéricide contre L. monocytogenes a
été observé. Nilsson et al., (1999) ont montré qu'une souche non productrice de
bactériocine de C. piscicola était aussi efficace qu'une souche productrice de
bactériocine de Carnobacterium piscicola pour l'inhibition de L. monocytogenes
dans le saumon fumé emballé sous vide. Ils ont suggéré que l'inhibition de la
croissance de L. monocytogenes était probablement due à une compétition
nutritionnelle de C. piscicola qui en résulte en un épuisement d'éléments
nutritifs essentiels.
L'effet inhibiteur de la Nisine en combinaison avec le CO2 et la basse
température sur la survie de L. monocytogenes dans le saumon fumé a aussi
été étudié (Nilsson et al., 2000 ; Nilsson et al., 1997). L’ajout de la Nisine (500
ou 1000 UI/g) au saumon inoculé avec L. monocytogenes et entreposé à 5°C a
retardé, mais n'a pas empêchée la croissance de L. monocytogenes dans des
emballages sous vide. Le nombre de L. monocytogenes a augmenté jusqu’à 108
ufc/g dans du saumon emballé sous vide en 8 jours, alors que l’emballage du
saumon fumé par le CO2 résulté en une phase de latence de 8 jours pour L.
monocytogenes avec un nombre qui atteignent finalement 106 ufc/g dans 27
jours. L’addition de la Nisine au saumon fumé emballé au CO2 résulte en une
réduction de 1 à 2log10 de L. monocytogenes suivi par une phase de latence de
8 et 20 jours dans le saumon en utilisant la Nisine à 500 et 1000 UI/g,
respectivement. Le niveau de L. monocytogenes reste au-dessous de 103 ufc/g
pendant 27 jours de stockage pour les deux concentrations de Nisine.
Pour améliorer la durée de vie, les saumures de crevette sont préparées par
l'addition d'acides sorbique et benzoïques. Les inquiétudes au sujet de l'usage
de ces acides organiques ont mené des chercheurs à explorer la possibilité
Revue bibliographique
53
d'utiliser des bactériocines pour leur conservation. L'efficacité de la Nisine Z, la
carnocine UI49, et une préparation brute de bavaricine A sur l’augmentation
de la durée de vie de saumure de crevette a été évalué par Einarsson et Lauzon
(1995). La carnocine UI49 n'a pas affecté la durée de vie comparée au témoin
(10 jours de vie), pendant qu’avec la bavaricine A, la durée de vie a été de 16
jours. La nisine Z donne une durée de vie de 31 jours. La solution du benzoate-
sorbate était supérieure en préservant les saumures de crevette pour une
période de conservation de 59 jours.
Dans une étude utilisant la truite fumée emballée sous vide et réfrigerée,
Nykänen et al. (2000) ont examiné l'inhibition de L. monocytogenes et les
bactéries aérobie mesophile par la Nisine, le lactate de sodium, ou leur
combinaison. Les échantillons de la truite ont été entreposés à 8 °C pendant 17
jours ou à 3°C pendant 29 jours. La nisine et le lactate, tout deux, ont inhibé
la croissance de L. monocytogenes dans du poisson fumé, mais la combinaison
des 2 composés était plus efficace. La combinaison de la nisine et le lactate du
sodium injecté dans le poisson fumé ont diminué le nombre de L.
monocytogenes de 3.3 à 1.8 log pour plus de 16 jours de stockage à 8°C. Le
niveau de L. monocytogenes est resté presque constants (4.7 à 4.9 log) pendant
29 jours à 3°C dans les échantillons qui ont subi l’injection avant de les fumer
et lesquel ont contenu la nisine et le lactate de sodium.
1.15. Obstacles technologiques et sécurité alimentaire
Les limitations majeures pour l'application des bactériocines dans les aliments,
sont leurs spectres d'activité relativement étroits et leurs effets antibactériens
modérés. De plus, elles ne sont pas généralement actives contre les bactéries
gram négatif. Pour surmonter ces limitations, de plus en plus les chercheurs
utilisent le concept d’obstacles technologiques d’améliorer la durée de vie et
rehausser la sécurité alimentaire (Tableau 5 et 6). De multiples documents
scientifiques, montrent que les bactéries gram négatif deviennent sensibles aux
bactériocines si les propriétés de la barrière de la perméabilité de leur
membrane externe sont affaiblies. Par exemple, les agents chélateurs, tel que
l’EDTA, peuvent lier magnésium de fer des couches de lipopolysaccharides et
par conséquent rompre la membrane externe des bactéries gram négatif, donc
permettre à la Nisine de gagner l'accès à la membrane cytoplasmique (Abee et
Revue bibliographique
54
al., 1995). La nisine rehausse l’inactivation thermique des bactéries, donc
réduire le temps du traitement et donner ainsi un plus à la qualité de l’aliment
(Tableau 5). Par exemple, Boziaris et al., (1998) trouvent que l’addition de
Nisine (500 à 2500 UI/ml) dans le milieu, ou une solution d’oeuf entier, ou le
blanc d'oeuf, réduit le temps de pasteurisation exigé jusqu'à 35%. Budu-
Amoako et al., (1999) ont trouvé que la Nisine réduit la résistance à la chaleur
de L. monocytogenes dans la viande du homard et réduit considérablement le
temps du traitement comparé avec le traitement thermique seul. La réduction
du processus de traitement à la chaleur réduit, en conséquence, la perte du
poids de l’aliment qui pèsera sur le coût de fabrication.
L’effet synergétique entre bactériocines et d’autres processus technologiques
sur l'inactivation des micro-organismes a aussi été rapporté fréquemment dans
la littérature (Tableau 5). Schlyter et al., (1993) ont rapporté l’effet synergétique
entre le diacetate de sodium et la pediocine contre L. monocytogenes dans la
préparation liquide de viande. Dans les échantillons témoin, le nombre de L.
monocytogenes a augmenté de 4.5 log à approximativement 8 log dans 1 jour à
25 °C et dans 14 jour à 4 °C. Un effet listericidal (approximativement 7 log de
différence comparé aux échantillons témoin) était observé dans des traitements
qui contiennent la pediocine (5000 UA/ml) avec 0.5% de diacétate à 25 °C et la
pediocine avec 0.3% de diacétate à 4°C. Zapico et al. (1998) ont montré un effet
synergique de la nisine (10 ou 100 UI/ml) et le système lactoperoxidase sur
l’inactivation de L. monocytogenes dans le lait écrémé. L'addition de la nisine et
le système lactoperoxidase affecte le nombre de L. monocytogenes jusqu'à 5.6
log inférieur que dans l’échantillon témoin de lait après 24 h à 30°C, pendant
que la nisine seule n'avait aucun effet sur le nombre. Cette synergie
d’inactivation a aussi été observé dans les bactéries gram négatives qui sont
normallement insensibles à ces bactériocines (Boziaris et al., 1998). L'usage
d’une combinaison de plusieurs bactériocines a aussi été révélé pour
augmenter l'activité antibactérienne (Hanlin et al., 1993; Mulet-Powell et al.,
1998). Quand elle est utilisée en combinaison avec la nisine, la leucocin F10
fournit la plus grande activité contre L. monocytogènes (Parente et al., 1998).
L'intérêt dans l'industrie alimentaire à utiliser des traitements non thermique,
tel que la haute pression hydrostatique (HP) et par champs électriques pulsés
(PEF) dans la conservation des aliments est très recherché. Il est fréquemment
Revue bibliographique
55
observé que les bactériocines, en combinaison avec ses techniques de
traitement, rehaussent l’inactivation bactérienne (Tableau 6). De plus, les
bactéries gram négatif qui sont habituellement insensibles aux bactériocines
des bactéries lactiques, tel qu'E. coli O157:H7 et S. typhimurium, deviennent
sensibles en suivant les traitements HP/PEF qui induisent des dégâts létales
aux cellules bactériennes (Kalchayanand et al., 1994). Il a été démontré que la
Nisine augmente l'inactivation par pression des spores de Bacillus coagulans,
Bacillus subtilis, et Clostridium sporogenes (Roberts et Hoover 1996; Stewart et
al., 2000).
1.16. Bactériocines et emballage
L’incorporation des bactériocines dans l’emballage en plastique pour contrôler
la détérioration des aliments et les micro-organismes pathogènes ont été une
aire de recherche très active pour la dernière décennie. L’emballage en
plastique antimicrobien empêche la prolifération microbienne sur surface de
l’aliment par contact direct de l’emballage avec la surface de l’aliment, tel que
les viandes et fromage. Pour cette raison, et pour qu’il soit correcte, l’emballage
en plastique antimicrobien qui doit entrer en contacte avec la surface de
l’aliment, pour que les bactériocines puissent diffusent à la surface. La
libération graduelle de la bactériocine du film d'emballage vers la surface de
l’aliment peut avoir un avantage dans le trempage et la vaporisation des
aliments avec la bactériocine. Dans le dernier processus, de l’activité
antimicrobienne peut être perdue ou réduite dû à l’inactivation de la
bactériocine par les composants de l’aliment ou diluée au-dessous de
concentration active dû à sa migration dans l’aliment (Appendini et Hotchkiss
2002).
Deux méthodes ont été utilisées communément pour préparer un emballage en
film de plastique avec bactériocines (Appendini et Hotchkiss 2002, Durango et
al., 2006). Le premier est l’incorporation directement de la bactériocine dans le
polymère. L’exemple de l’incorporation de la Nisine dans des films en protéines
biodégradables (Padgett et al., 1998). Le deuxième, est la méthode de film
d'emballage par presse thermique et celle du moulage, ont été utilisées pour
incorporer la Nisine dans des films fait de protéines du soja et les protéines de
maïs dans cette étude. Les films de presse thermique et le moulage ont formé
des films excellents et ont inhibé la croissance de Lactobacillus plantarum.
Revue bibliographique
56
Comparé aux films par presse thermique, le moulage a montré de plus grandes
zones d’inhibition quand les mêmes niveaux de Nisine ont été incorporés.
L’incorporation de l'EDTA dans les films a augmenté l'effet inhibiteur de la
Nisine contre E. coli. Siragusa et al., (1999), ont incorporé la Nisine dans un
film en plastique de polyéthylène qui a été utilisé dans l’emballage sous vide de
carcasse de bœuf. La Nisine est resté active contre Lactobacillus helveticus et B.
thermosphacta inoculés en surface dans des sections de tissu de carcasse. Une
réduction initiale de 2 log de B. thermosphacta a été observé avec un emballage
de boeuf imprégné de Nisine dans les premiers 2 jours de stockage à 4°C.
Après 20 jours de stockage à 4 ou 12°C (pour simuler le mauvais usage de la
température), la population de B. thermosphacta à partir d'échantillons
enveloppés en plastique et imprégné de Nisine, était considérablement moins
que celle dans l’échantillon témoin (sans Nisine). Coma et al., (2001) ont
incorporé la nisine dans des films cellulosiques comestibles faits avec
l’hydroxypropylmethylcellulose en ajoutant la nisine à la solution de fabrication
du film. L'effet inhibiteur pourrait être démontré contre L. innocua et S. aureus,
mais l’addition de l'acide stéarique utilisé pour améliorer les propriétés
d’évaporation d’eau du film, réduit significativement l’activité inhibitrice. Il a
été noté que la désorption du film et la diffusion dans l’aliment exige
d’avantage d'optimisation de l’activité de la nisine pour une efficacité en tant
qu’agent préservatif dans les aliments emballés.
Une autre méthode pour incorporer les bactériocines dans les films d’emballage
est d’enrober ou d’adsorber les bactériocines aux surfaces du polymère. Les
exemples incluent l’enrobage des films de polyéthylène par des couches de
nisine, methylcellulose. La nisine est enrobée par les produits adsorbant telles
que le polyéthylène, l’acétate du vinyle de l'éthylène, le polypropylène, le
polyamide, le polyester, le fibre acrylique, et le chlorure de polyvinylique
(Appendini et Hotchkiss 2002). Dawson et al., (2005) ont démontré que
l’adsorption de la nisine sur des surfaces de silice inhibe la croissance de L.
monocytogenes. Les films à nisine ont été exposés à un milieu contenant L.
monocytogenes et les surfaces en contact ont été évaluées à 4 h d’intervalle
pendant 12 h. Les cellules sur la surface qui avaient été en contact avec une
haute concentration de nisine (40000 UI/ml) n’ont montré aucune croissance
et beaucoup d’entre elles sont complètement détruites. Les surfaces ont
Revue bibliographique
57
contacte avec une concentration faibe de nisine (4000 UI/ml) montrent un
degré d'inhibition faible. En revanche, les surfaces des films à nisine ou cette
dernière est dénaturée par traitement thermique, ont permis la croissance L.
monocytogenes.
Listeria innocua et S. aureus (en plus de L. lactis sp. lactis) ont été aussi étudié
par Scannell et al., (2000) dans des isolants bioactives à base de cellulose et
des pochettes antimicrobiennes en polyéthylène/polyamide. La lacticin 3147 et
la nisine étaient les bactériocines testées. Bien que, la lacticin 3147 adhére
faiblement au film en plastique, la nisine se fixe mieux et les films bioactives
font avec la nisine un produit stable pour 3 mois avec ou sans réfrigération. La
réduction bactérienne jusqu'à 2 log dans le fromage emballé sous vide a été
constatée conjointement avec une atmosphère modifiée lors de l’emballage
(MAP) avec stockage à température réfrigérante. Les isolants bioactives à base
de cellulose sont placés entre les tranches de fromage et jambon sous MAP. Les
isolants avec de la nisine immobilisée, ont réduit la croissance de L. innocua
(inoculum initial etait de 2 à 4x105 ufc/g) de plus de 3 log dans le fromage
après 5 jours à 4°C, et par approximativement 1.5 log dans le jambon en
tranches après 12 jours, pendant que S. aureus (inoculum initial était de 2 à
4x105 ufc/g) a été réduite de 1.5 et 2.8 log dans le fromage et le jambon
respectivement. L'efficacité de l’enrobage par la bactériocine sur l'inhibition des
bactéries pathogènes a aussi été démontrée dans d’autres études. Par exemple,
l’enrobage avec la pediocine sur boîtes en cellulose et les sacs en plastique ont
été efficace pour inhiber complètement la croissance de L. monocytogenes
inoculée dans les viandes et volaille durant 12 semaines de stockage à 4°C
(Ming et al., 1997). Enrober une solution contenant la nisine, l’acide citrique,
l’EDTA, et le Tween 80 sur chlorure de polyvinyle, polyéthylène linéaire à basse
densité, et les film en nylon réduisent le nombre de Salmonella typhimurium
dans la peau de volaille de 0.4- à 2.1-log après incubation à 4°C pour 24 h
(Natrajan et Sheldon 2000).
Bien que la durée de vie ait été étendue dans les denrées alimentaires par
réduction de la population des micro-organismes de contamination dans les
aliments, les essais fondamentaux étaient de prévenir les microorganismes
pathogènes anticipant le produit. Dans cette considération, l’entreprise Rhodia,
a développé des boîtes utilisées dans la fabrication de sandwich et d’autres
Revue bibliographique
58
viandes cuites. Le film consiste en une combinaison de propriétés de
bactériocines, des enzymes, et substances végétales, la cible visée est L.
monocytogenes et les résultats sont décrits comme très prometteuses. Le coût
ajouté est considéré économiquement sans effet sur le consommateur.
1.17. Observations finales
Bien que les études intensives sur la dernière décennie ont énormément
progressés sur les connaissances de bactériocines, un travail supplémentaire
est exigé avant que nous soyons capables de comprendre complètement les
mécanismes moléculaires, rapports de la structure-fonction, et mécanismes
d'action de bactériocines. Dans la biosynthèse de lantibiotics, le mode d’action
des enzymes responsables pour les réactions de la modification n'est pas
encore clairement demontré. Les principaux mécanismes de l'immunité des
souches productrices reste à déterminer. Entreprendre des recherches dans ce
domaine aiderait pour les applications efficaces de bacteriocines et
développerait les méthodes de production et de regulation génétique de
bacteriocines avec une meilleure activité, solubilité, et stabilité.
La génie génétique ou la modification chimique des bactériocines sont réalisées
afin d’améliorer et de développer efficacement l’activité, la propriété et la
stabilité de la structure active. Rollema et al., (1995) ont démontré la solubilité
et la stabilité de la nisine Z en remplaçant l’asparagine (acide aminé n° 27 ) ou
la serine (acide aminé n° 31) par la lysine; Johnsen et al., (2000) ont amélioré
la stabilité de la pediocine PA/1 à 4°C et à la température ambiante en
remplaçant la méthionine (acide aminé n° 31) par l’alanine, l'isoleucine ou la
leucine. Miller et al., (1998) trouvent que la pediocine PA/1 modifiée est de 2,8
fois plus efficace sur la souche test de Lb. plantarum. Ces exemples
représentent des solutions aux problèmes rencontrés lors des applications des
bactériocines. Cependant, la réglementation de l'approbation pour l'usage de la
bactériocine serait très difficile actuellement car considérées comme nouvelles
protéines, nécessitant ainsi une recherche plus approfondie afin d’écarter les
effets secondaires indésirables possible (Montville et al., 1995).
Néanmoins, l’étude des bactériocines est en plein essor, l’optimisation de leur
activité vis-à-vis des germes indésirables nécessite la recherche des conditions
d’association avec d’autres facteurs physico-chimiques complémentaires tel
Revue bibliographique
59
que la température basse, conditionnement sous-vide, réduction de l’activité de
l’eau et la haute pression qui agissent en synergie et en complémentarité. Cette
stratégie vise à élargir le spectre d’action des bactériocines.
La recherche de nouvelles bactériocines permettra de combattre plus
efficacement les diverses bactéries d’altération ou pathogènes. La résistance
des bactéries indésirables aux composés antibiotiques est un phénomène
préoccupant, et c'est pour cette raison que de nouvelles molécules
d’antibiotiques sont constamment recherchées. Cela s'applique aussi aux
bactériocines puisque la sélection de bactéries devenues résistantes à ces
peptides est possible. La recherche de nouvelles bactériocines trouve aussi
raison dans l'acquisition de connaissances fondamentales sur la structure, la
biosynthèse, le mécanisme et le spectre d'action ainsi que l'organisation
génétique des ces molécules antimicrobiennes.
58
Matériel et méthodes
Matériel et méthodes
58
2. Matériel et méthodes
2.1. Provenances des échantillons du lait
Les échantillons de laits crus de chèvres proviennent de différentes
régions dans l’ouest algérien (Saida, Oran, Tiaret, Bechar, Tindouf,
Messerghine, Boutelelisse et Arzew). Les échantillons du lait sont prélevés dans
des conditions d’hygiène parfaites dans des flacons de 250 ml stériles. Ces
derniers sont transportés immédiatement au laboratoire pour analyse. Dans
les cas des zones lointaines, les échantillons sont conservés à 4 °C lors de leur
transport au laboratoire, le temps de transport ne doit pas dépasser 24 h
après le prélèvement. Certains isolats, proviennent directement de la collection
du Laboratoire de Microbiologie Appliquées L.M.A.
Les souches de bactéries tests sont à gram positif Staphylococcus aureus, et à
gram négatif Escherichia coli proviennent aussi du laboratoire LMA
2.2. Isolement et identification de la flore lactique
2. 2.1. Préparation de l’échantillon
1 ml de l'échantillon est pippeté aseptiquement dans 10 ml d'eau peptonée et
des dilutions décimales sont réalisées (10-1 à 10-8). Les dilutions ainsi
préparées, un ml de la dilution appropriée est ensemencé en profondeur dans
l'un des milieux suivant :
- Le milieu MRS solide (De Man et al., 1960) incubé en anaérobiose à 30 et
à 45°C pendant 48h pour l'isolement des lactobacilles et les
streptocoques thermophiles. Le MRS est aussi incubé à 30°C pour
l'isolement des lactobacilles et Leuconostoc mésophiles (composition des
milieux dans l’annexe milieu)
- Le milieu MRS acidifié, pH 5,4 (MRSA) utilisé pour l'isolement des
lactobacilles.
- Le milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) est incubé à 30 °C pour
l'isolement des lactocoques
- Le milieu MRS + Lait écrémé à 10% (MRSL) incubé à 28 °C pendant 24
à 48h pour l'isolement de la flore protéolytique. Les colonies présentant
des halos transparents tout autour représente un résultat positif.
Matériel et méthodes
59
- Le milieu Kempler et Mac Kay (1980) KMK est utilisé pour l'isolement
des microorganismes fermentant le citrate.
2.2.2. Identification des isolats.
2.2.2.1. Caractérisation morphologiques macroscopique et microscopique
Dix colonies typique de bactéries lactiques à savoir leur apparence
macroscopique (aspect de la colonie: forme, taille, pigmentation, contour,
viscosité) sont prises au hasard, à partir de boites contenant entre 25 et 250
colonies des différents milieux de cultures utilisés (MRS, M17, MRSA, MRSL et
KMK) et sont ensuite repiquées dans le bouillon MRS et incubées à 28 °C.
Après incubation, les colonies sont réensemencées dans du MRS solide. Les
souches seront examinées pour leur coloration de Gram et le test de la
catalase. Les bactéries Gram positives et catalase négatives sont présumées
des bactéries lactiques et seront conservées dans le milieu lait écrémé à
l’extrait de levure (LEY) supplémenté de 20% de glycérol et conservé à -20°C.
Les souches conservées seront davantage examinées pour les identifier.
2.2.2.2. Identification des souches bactériennes
Afin de pouvoir identifier correctement les bactéries lactiques, deux type
d’identification sont à suivre, une identification selon le genre et une autres
selon selon l’espèces.
Determination du genre selon Carr et al., (2002). :
Les tests a, b, c, d, e sont à considérer comme identification du genre. Cette
derniere suit un schéma montrer sur la figure 9.
a- température
La croissance bactérienne est évaluée par un trouble en milieu MRS après
72 h d'incubation à 10, 15, 45°C.
b- Type fermentaire
Le bouillon MRSG (Bouillon MRS + glucose au lieu du lactose) + cloche de
Durham est utilisé pour mettre en évidence la production du CO2 et de
savoir ainsi le type fermentaire de nos souches (hétéro ou homolactiques).
c- Tolérance à la salinité
La détermination des isolats appartenant au genre Streptococcus et
Lactococcus est effectuée selon les tests physiologiques utilisés par Samelis
et al. (1994), Garvie (1983), Schleifer et al., (1985) et Carr et al., (2002).
Matériel et méthodes
60
Afin de différencier les lactocoques des streptocoques fécaux, plusieurs test
confirmatifs sont utilisés.
Etant donnée que les lactocoques et le Streptococcus thermophilus ne
poussent pas à 6,5% d’NaCl, les souches de formes cocci, sont testées pour
leur capacité à croître dans le bouillon hypersalé contenant 4,5% et 6,5%
d'NaCl. L’incubation se fait à 28°C pendant 4 jours.
d- Tolérance au pH alcalin
Le bouillon MRS alcalininé à pH 9,6 est aussi utilisé pour différencier les
lactocoques des streptocoques fécaux. Ainsi seuls les enterocoques fécaux
poussent dans ce type de milieu (Carr et al., (2002)).
e- Hydrolyse de l’arginine
La recherche de l’arginine déhydrolase (ADH) est étudiée sur le milieu M16
BCP (Thomas, 1973).
Ce milieu contient du lactose (2 mg / ml) et de l’arginine (4 mg / ml) et un
indicateur de pH le pourpre de bromocrésol (0,05 mg / ml). Les bactéries
lactiques utilisent le lactose en acidifiant le milieu, les colonies donnant
ainsi une coloration jaunatre. D’autres bactéries lactiques sont capables
d’utiliser l’arginine et réalcalinisent le milieu, leurs colonies apparaissent
blanchatres. La couleur de l’indicateur de pH demeure inchangée.
Determination de l’espèce
f- Profile fermentaire
La fermentation des carbohydrates a été mené sur milieu MRS sans extrait
de viande et additionné au pourpre de bromocrysol (BCP) comme indicateur
de pH (MRSBCP-EV). La source de carbone est représentée par l'un des
sucres suivant : arabinose, glucose, fructose, galactose, lactose, maltose,
mannitol, raffinose, rhamnose, saccharose, et xylose. Les solutions sucres
sont préparée à 3% et stérilisées par autoclavage. Un millilitre de la
solution sucrée est additionné à 10 ml de MRSBCP-EV. Vu le nombre
important de souches étudiées ainsi que le nombre de tubes à essai à
utiliser avec chaque souche, un mini préparation est réalisé au laboratoire.
Une plaque d'Elisa est utilisée pour ses puits. Les puits de chaque ligne
contiendront une source de carbone qui sera utilisée par différentes
souches (figure 8).
Matériel et méthodes
61
Une solution bactérienne servant à ensemencer les puits contenant les
différentes source de carbonne à été préparée. Une culture de 18 heures de
la souche appropriée est centrifugée à 8000 tr/mn pandant 15 min. Le culot
ainsi récupéré est additionné de 2 ml de tampon phosphate puis
recentrifugé aux mêmes conditions pour le débarrasser des restes du milieu
de culture et obtenir un cullot cellulaire pur. A ce culot, 5 ml de milieu
MRSBCP-EV est additionné pour former la solution cellulaire servant à
ensemencer les puit contenant différentes source de carbone ; 100 µl de
cette solution bactérienne est déposée dans chaque puit. La lecture des
résultats sa fait après 24 et 48 heures d’incubation.
Sucres utilisés
Souches
Figure 8: schéma représentant la mini préparation pour le test de la fermentation
des sucres
L’identification complète de nos souches bactériennes a été achevée selon les
schémas de systématique illustré dans le schéma ulustré dans les figure
9,10,11,12,13,14.
Figure 9. Schéma de différentiation des genres appartenant aux bactéries lactiques
Matériel et méthodes
62
Figure 10. Schéma d’identification rapide des streptobacterie
Figure 11. Schéma d’identification rapide pour lactobacilles heterofermentatifs
Matériel et méthodes
63
Figure 12. Schéma pour différentier le Group D des streptococci de celui desstreptocoques lactiques (Deibel et Seeley, 1978).
Figure 13. Schéma pour l’identification présomptive des Leuconostoc spp (Mathohet al., 1994 ; Kihal et al.,, 1996)
Matériel et méthodes
64
Figure 14. Schéma général servant pour l’identification des aerocci et des pediococci
(Carr et al., (2002)).
2.3. Conservation des souches bactériennes
Deux types de conservation de nos souches sont à noter. Une de courte durée
et l’autre à longue durée.
2.3.1. Conservation courte durée
Les souches sont ensemencées sur gélose MRS (ou M17) incliné en tube.
Ces cultures sont gardées à 4 °C. Les repiquages se font toutes les deux
semaines (Saidi et al., 2002).
2.3.2. Conservation longue durée
A partir de jeunes cultures (18-48 h) sur milieu liquide, les cellules sont
récupérées par centrifugation à 4000 t / min pendant 10 min. Une fois le
surnageant éliminé, on ajoute le milieu de culture de conservation sur le culot.
Le milieu de conservation contient du lait écrémé, 0,2% d’extrait de levure et
30% de glycérol. Les cultures sont conservées en suspension dense et en tubes
eppendorfs à –20 °C. Accolas et al. (1972) indiquent que des suspensions très
concentrées résistent mieux à la congélation. En cas de besoin, les cultures
sont repiquées dans du lait écrémé à 0,5 % d’extrait de levure, avant utilisation
(Figure 15).
Matériel et méthodes
65
Culture de 18 h sur bouillon MRS
Centrifugation à 4000 tr/mn pendant 10 min
Conservation du culot
Culot est additionné de 2ml de lait écrémé stérile
à l’extrait de levure plus 30 % de glycérol.
Répartition dans des tubes Eppendorfs
Conservation à – 20 °C.
Figure 15. Schéma de conservation longue durée des bactéries lactiques purifiées
(Saidi et al., 2002)
2.4. Caractérisation technologiques
2.4.1. Production de l’acidité titrable
Cette manipulation a pour but de déterminer par titrage la concentration
molaire en ions H3O+ dans un échantillon de lait. Cette concentration est
exprimée en "degrés Dornic". Le matériel nécessaire est le suivant: un statif
avec noix et pince, une fiole conique de 100 mL, une solution de NaOH N/9,
une burette de 25 mL, une pipette jaugée de 10 mL et une solution de
phénolphtaléine à 1% dans l'éthanol. Remplir la burette de la solution de
NaOH N/9 et la fixer au statif. Régler le niveau du liquide à zéro. À l'aide de la
pipette de 10 mL, prélever 10 mL de lait et transférer dans la fiole conique de
100 mL. Ajouter 5 gouttes de solution de phénophtaléine et titrer jusqu'à
apparition d'une couleur rose persistante. Noter le volume de solution titrante
utilisé en dixièmes de millilitres. Nombre de dixièmes de millilitre de NaOH =
1°D
Matériel et méthodes
66
Figure 16. Instruments pour la mesure de l’acidité titrable.
2.4.2. Utilisation du citrate en présence de sucre fermentescible
(glucose):
L’utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980)
(Annexe). Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et une
solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la
réaction entre l’ion ferrique et le potassium ferricyanide. Les colonies qui
fermentent le citrate lancent la réaction entre ces ions il en résulte la formation
de colonies bleues ou ayant un centre bleu (après 18 h-72 h d’incubation). Les
colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches.
2.4.3. Production des composés aromatiques.
La production d’acetoîne est testée sur milieu Clark et Lubs (FIL, 1996). Les
souches sont cultivées sur ce milieu ; Après 24h d’incubation, on test par la
réaction de Voges-Proskaeur dite réaction de V.P.
Dans un tube à hémolyse, 2ml de cette culture sont transvasés, 0,5 ml de
réactif α-naphtol à 6% dans l’alcool absolu (VP1) et 0,5 ml d’une solution de
soude (NaOH) à 16% dans l’eau distillée (VP2). On agite soigneusement les
tubes et on laisse au repos 5 à 10 min à température ambiante. La production
d’acétoîne se traduit par l’apparition d’un anneau rose à la surface du milieu.
2.4.4. Production des enzymes protéolytiques
La recherche de l'activité protéolytique au sein de nos souches lactiques
à été conduite par une recherche qualitative et quantitative.
Les souches présumées des bactéries lactiques isolées des différents
échantillons de lait ont été cultivées sur milieu MRSL. Les bactéries possédant
une activité protéolytique donne des zones clair autour de la colonie. Les
Matériel et méthodes
67
mêmes souches sont cultivées dans du bouillon MRS additionné de caséine.
L'appréciation de l'activité protéolytique se fait par l'apparition d'un coagulum
dû à l'hydrolyse de la caséine. On remarque que plus la souche est
protéolytique plus le coagulum s'hydrolyse à son tour.
La quantification de l'activité protéolytique à été réalisée par la recherche de la
vitesse d'hydrolyse de la caséine en utilisant la méthode de la ninhydrin. Cette
méthode se base sur la quantification des groupements -NH2 libérés à partir
de la caseine.
Le culot cellulaire est obtenu par centrifugation des cultures jeune en milieu
MRS des souches retenus (après 18 h d'incubation). Le culot est lavé dans du
tampon phosphate (TP) par centrifugation 4000 tr pendant 5 min. Le culot
ainsi obtenu est dilué dans 2 ml du TP, cette solution est désignée par CTP.
Une série de tube (6 tubes) pour chaque souche, contenant 5ml de TP à 1% de
caséine (le milieu est stérilisé par autoclavage à 120°C pendant 20 min) est
ensemencé par 0,2 ml du CTP de la souche à tester. L'incubation se fait à la
température de croissance optimale de chaque souche. Une lecture de la
densité optique est faite à intervalle de temps.
Après incubation et à intervalle de temps, un tube est retiré de l'incubateur, la
culture est centrifugée et le surnagent est récupéré. 0,5 ml du surnageant est
prise puis traitée par la solution de la ninhydrin puis chauffée à 85 °C pendant
5 min puis aussitôt refroidie dans de l'eau glacée. La densité optique est lue à
une longueur d'onde de 507 nm. La quantité de -NH2 libéré est exprimée en
meq de leucine libéré dans le milieu (Chekroun et al., 1998).
2.4.5. Production de dextran.
La production du dextrane à partir du saccharose est mise en évidence
sur milieu solide MSE (Mayeux et al., 1962). Les souches productrices de
dextrane sont caractérisées par la formation de colonies larges, visqueuses et
gluantes. Ce test est aussi considéré comme clé d’indentification permetant
aussi de différencier entre les leuconostoques productrices et non productrice
de dextran.
Matériel et méthodes
68
2.5. Etude des interactions bactériennes
2.5.1. Recherche des substances antimicrobiennes
Les bactéries lactiques isolées sont testées pour leur activité antagoniste selon
deux méthodes.
a- méthode directe
L’activité antimicrobienne de nos souches a été évaluée sur milieu solide selon
la méthode de Barefoot et Klaenhammer (1983). Le milieu MRS est ensemencé
en touche par nos souches. Après 24 heures d’incubation une couche de gélosé
moelle (0,7%) ensemencée par la souche de Lactobacillus curvatus (souche de
bactéries lactique sensible aux substances antimicrobiennes et ne produisant
pas ces dernières, offerte par le Dr Hammes, laboratoire de hohenhain,
Allemagne) est coulée à la surface puis réincubée pour 24 à 48 heures
supplémentaire. Les souches présentant une zone claire tout au tour sont
considérées comme productrices de substances antimicrobiennes.
b- méthode indirecte
Cette méthode permet de mettre en contacte le surnageant de la souches
lactiques productrice de substance antimicrobienne avec la souche test. Les
souches précédemment sélectionnées pour leur production de substances
antimicrobienne sont concernées par ce test.
Les souches sont cultivées dans du milieu MRS liquide et incubées pendant 18
heures. Après incubation, le milieu est centrifugé (8000 tr/mn 10 min) et le
surnagent est conservé. Dans une boite de Pétri contenant du MRS solide et
ensemencé par la souche test, des puits sont réalisés avec un emporte pièce et
celée par 10 µl de gélose MRS (figure 17). Les puits recevront 100 µl du
surnageant de la souche à testée et les boites sont incubée pendant 24 à 48
heures. Les colonies entourées d'une zone claire dans la nappe de culture de la
souche test et ayant un diamètre supérieur à 2 mm sont considérées comme
positive.
Matériel et méthodes
69
Figure 17. Les différentes méthodes utilisée pour la recherche de substances
antimicrobienne. (a) méthode de la double couche, (b) méthode de diffusion en puits
2.5.2. Détermination de la nature de l’agent inhibiteur.
Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite par nos
bactéries lactiques, il est impératif de réaliser une série de test.
a- inhibition due au peroxyde d’hydrogène
Pour écarter l’effet du peroxyde d’hydrogène dans l’inhibition de Staphylococcus
aureus, les surnagents des cultures des bactéries lactiques sont traités par 1
mg/ml de catalase puis incubée à 37°C pendant 1 heure. Le surnageant est
stérilisé par filtration et testé par la méthode des puits sur Staphylococcus
aureus.
b- inhibition due à l’acide lactique
L’acide lactique est un facteur majeur dans les inhibitions par les bactéries
lactiques. Afin d’éliminer son effet, les bactéries lactiques sont cultuvées dans
du MRS liquide tamponé; ainsi l’acide lactique produit par la souche lactique
sera neutralisé et seule la substance antimicrobienne si elle est produite
exprime son action sur Staphylococcus aureus.
c- inhibition due aux bactériophages
Avec une pipette Pasteur, on découpe un fragment de gélose dans la zone
d’inhibition. Ce fragment est mis en suspension dans 1 ml de milieu contenant
50 µl de chloroforme. Après agitation, on laisse décanter 5 min, puis on prélève
300µl de milieu que l’on ajoute à 7 ml de gélose molle contenant la souche
Matériel et méthodes
70
indicatrice. Le mélange est coulé stérilement dans une boite de Pétri et incubé
48 h à 28°C. La présence de plage de lyse indique la présence de phages.
d- recherche de la nature proteique de la substance antimicrobiene
La recherche de substances antimicrobiennes comme les bactériocines,
nécessitent la recherche de la nature de cette substance qui si elle appartenait
aux bactériocines devrait avoir une nature protéique. Pour ce faire le filtrat de
culture de la bactérie lactique productrice est traité par différents types
d’enzymes protéolytiques. Ainsi, 1 ml du filtrat de culture est traité par 1
mg/ml de trypsine ou chymotrypsine et incubé à 37°C pendant 1 heure. Le
filtrat ainsi traité est stérilisé par filtration sur filtre millipore de 45 µm de
diamètre. L’action de ce filtrat est testé par la méthode des puits sur milieu
Chapman et incubé à 37°C pour 24 à 48 heure.
e-Effet de la température
Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur résistance à la
température et la conservation de leur activité vis-à-vis de Staphylococcus
aureus. Le filtrat de culture de la souche lactique productrice est traité par
différentes températures (75, 80 et 100°C) puis testé sur Staphylococcus
aureus sur milieu gélosé Chapman par la méthode des puits.
2.5.3. Etude des interactions Staphylococcus-bactéries lactiques
L’étude des interaction de Staphylococcus aureus et nos souches de
bactéries lactiques productrices de substances antimicrobienne à été conduite
selon les deux méthodes déjà décrites en haut. Les bactéries lactiques
donnant un résultat positif avec la méthode directe sont retenues et tester de
nouveau par la méthode indirecte en puits sur gélose Chapman; L’incubation
se fait à 37°C pour 24 à 48 heures. L’inhibition de la croissance de
Staphylococcus aureus par nos bactéries lactiques peut être due à la
production de peroxyde, à l’acide lactique, aux bactériophage ou à des
substances antimicrobiennes produites dans le milieu externe (extracellulaire).
Afin de confirmer la nature antimicrobienne des substances produites, il est
impératif d’éliminer l’action des autres facteurs inhibiteurs. Il faut noter que
seules les souches inhibant Staphylococcus aureus par la méthode des puits
est retenue.
Matériel et méthodes
71
2.6. Etude de la cinétique de croissance en culture mixte
L’étude de la cinétique de croissance de Staphylococcus aureus en
présence et en absence de bactéries lactiques productrices de substance
antimicrobienne a été faite sur milieu lait (figure 18).
La souche LC8 et Staphylococcus aureus sont d’abord ensemencés sur milieu
lait pendant 18 heures. Trois fioles contenant chacune 100 ml de lait écrémé
stérilisé sont préparées puis ensemencer par 3 % de culture bactérienne. La
première série reçoit la bactéries lactique seule, la deuxième Staphylococcus
aureus et la troisième représentera la culture mixte et contenant la bactérie
lactique et Staphylococcus aureus. Chaque fiole ainsi préparée est répartie en
10 tubes à raison de 10 ml chacun. Les tubes sont incubés et à chaque heure
d’incubation des comptages sur milieu solide sont effectués selon la méthode
officielle (IDF). Pour la culture mixte seule le staphylocoque est compté. Le
comptage se fera sur les milieux appropriés à savoir sur gélose MRS pour la
bactérie lactique et sur gélose de Chapman pour Staphylococcus aureus.
Matériel et méthodes
72
Pour chaque culture et à intervalle de temps égale on réalise :1- des cultures pures : un dénombrement de Staphylococcus aureus sur milieuChapman.et celui de la bactérie lactique sur milieu MRS.2- de la culture mixte : un dénombrement de Staphylococcus aureus sur milieu
Chapman, on mesure le pH du milieu. Et on calcule l'acidité produite
Figure 18. Schéma résumant la méthodologie utilisée pour l'étude des culturesmixtes
Répartition 10 ml dans des tubes
St. aureus La souchelactique
St. aureus+
la souche lactique
1ml1ml
0.1ml0.1ml
Culture de 18h deLa souche lactique
Sur MRS
10ml delait écrémé
18hCulture de 18h de
St. aureus surBouillon nutritif
100ml de laitécrémé stérile
0h 4h 8h 24h 48h
58
Résultats et discussion
Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats
75
3. Résultats
Caractérisation des Bactéries Lactiques Isolées du LaitCru de Chèvre des Régions Arides d’Algérie.
N. SAIDI (*), B. GUESSAS (*), F. BENSALAH (*), A. BADIS , M. HADADJI(*), D.EHENNI, H. PREVOST (**) et M. KIHAL (*)
(*)Laboratoire de Microbiologie Appliquée, Département de Biologie, Faculté des Sciences,Université d'Oran. BP 16 Es-Sénia, 31100, Oran, Algérie,
(*) Chercheurs associés au CRSTRA,(**)Département Sciences des Aliments, Laboratoire Microbiologie Alimentaire et Industrielle,
ENITIAA, BP 82225, 44322 Nantes Cedex 3 France.
SUMMARYDiversity and density of lactic acid bacteria isolated from Algerian raw goats'
milk in arid zones were studied. Microbiological, phenotypical, physiological andbiochemical analysis were realised.The study of 206 isolates revealed the presence of 115 cocci and 91 lactobacilli.The representative species of the total cocci were Lactococcus species (76,16%),Streptococcus thermophilus (14,78%) and Leuconostoc species. (8,6%). Thedominating species is Lactococcus lactis subsp. lactis.Lactobacilli species found in local raw goats' milk and their proportion were: Lb.curvatus (25,25 %), Lb. helviticus (10,98%), Lb. plantarum (9,89%), Lb. reuteri(9,89%), Lb. casei (7.69%), Lb. brevis (5,49%), Lb. bulgaricus (5,49%) Lb. paracasei(4,39 %) and Lb. acidophilus (2,19%). Only two isolates of Lactococcus lactissubsp. lactis shown high proteolytic activity.The amount of lactic acid production by several strain was between 42,2 mM and110,6 mM in pure culture in milk. Whereas, in the mixed culture the resultrevealed positive and negative interactions.This investigation of goats' raw milk microflora should have many industrial andbiotechnological applications
KEY-WORDS: Goats' raw milk - Lactic acid bacteria - Characterization -Identification - Acidification - Proteolytic activity.
Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats
76
KIHAL Mebrouk E-mail : kihal-mebrouk@caramail.com
RESUME
La diversité et la densité des bactéries lactiques du lait cru de chèvre des
zones arides de l’ouest d’Algérie ont fait l'objet d’analyses bactériologiques,
phénotypiques, physiologiques et biochimiques.
L'étude de 206 souches de bactéries lactiques a révélé la présence de 115 de
formes cocci et 91 bâtonnets. Les cocci sont représentés par les genres
Lactococcus (76,16%), Streptococcus thermophilus (14,78%) et Leuconostoc (8,6%).
Lactococcus lactis subsp lactis est l’espèce dominante. Les espèces de lactobacilles
détectées sont curvatus (25,25%), helviticus (10,98%), plantarum (9,89%), reuteri
(9,89%), casei (7.69%), brevis (5,49%), bulgaricus (5,49%), paracasei (4,39%) et
acidophilus (2,19%).
Deux souches de Lactococcus lactis subsp lactis possèdent une activité
protéolytique considérable. Le pouvoir acidifiant obtenu par les différentes
souches testées en milieu lait se situe entre 42,2 mM et 110,6 mM en culture
pure. En revanche, l’évaluation de la cinétique d’acidification en culture mixte fait
apparaître différentes interactions positives et négatives.
Mots clefs: Lait de chèvre, bactéries lactiques, identification, pouvoir acidifiant,
protéolyse.
INTRODUCTION
Le lait de chèvre joue un rôle alimentaire important dans régions arides [38,
39, 43]. La production de lait de chèvre dans le monde est évaluée à 7.2 millions
de tonnes par an [38]. Elle ne cesse d’augmenter vu sa valeur nutritionnelle [1,
16, 48]. La sélection de souches de bactéries lactiques pour leurs aptitudes
industrielles ou leur probables potentialités thérapeutiques a pris tout son essor
dans de nombreux pays [1, 19]. Ainsi des bactéries lactiques sont recherchées
Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats
77
dans leurs divers écosystèmes naturels telle que les plantes [4, 27, 35], les
fromages [36, 40] et les produits carnés et marins [35].
La nécessité d'obtention de nouvelles souches lactiques performantes et
stables a reçu un intérêt particulier. La sélection de ces souches utilisées comme
starter est basée sur la production d'acide lactique, de composés aromatiques, de
bactériocines et de leur résistance aux bactériophages [5, 7, 9, 13, 14, 17, 18, 20,
24].
L'objectif de cette étude est d'une part l'isolement, la caractérisation et
l'identification de bactéries lactiques du lait cru de chèvre des zones arides
algériennes, et d'autre part l'évaluation de leurs aptitudes technologiques.
MATERIEL ET METHODES
Isolement des souches
Les échantillons de lait cru de chèvre proviennent des villes suivantes:
Béchar, Saïda, Ghardaïa, Béni-Abbès, Tamanrasset et Tiaret. Dans des conditions
d’asepsie, les échantillons du lait cru sont recueillis par la traite dans des flacons
stériles conservés à 4°C et sont transportés le même jour au laboratoire pour
analyse. Chaque échantillon du lait cru est réparti en tube à raison de 10 ml.
Deux des tubes sont maintenus à température ambiante, deux incubés à 30°C, et
deux autres à 45°C jusqu'à coagulation par les bactéries endogènes. L’isolement
des souches bactériennes mésophiles et thermophiles est réalisée selon les
méthodes décrites par FIL (Fédération Internationale du Lait) [11]. Les souches
retenues sont conservées à – 20°C dans une solution contenant 70% de lait
écrémé (enrichie par 0.5 g/l d'extrait de levure et 0.5 g/l de glucose) et 30% de
glycérol à 40% [42].
Caractérisation physiologique et biochimique
Tous les isolats sont préalablement testés pour la coloration de Gram, la
catalase et la sporulation. Les caractéristiques des colonies sont aussi
déterminées sur milieux solides M17 [45] et MRS [6]. Seules les bactéries à Gram
positif et à catalase négative sont par la suite identifiées par le test de Sherman
[22].
Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats
78
L’effet de la température sur la croissance est testé pendant 5 jours à 15°C,
37°C et 45°C. En outre la résistance à une température élevée (60°C , 30 mn) est
réalisée selon la méthode de Joffin et Leyral [22]. La production de gaz à partir de
glucose a été déterminée sur milieu liquide contenant des tubes de Durham [15].
L'hydrolyse de l'arginine et l'utilisation du citrate ont été testées sur milieu
M16BPC de Thomas [46, 47] et milieu Kempler et Mc Kay [23]. L'aptitude à croître
en présence de 4% et 6,5% de NaCl et à pH 9.6 a été observée en milieu liquide
M17 à 30°C pendant 2 jours. La production de dextranes à partir de saccharose a
été déterminée sur milieu solide MRS [33]. La production d'acétoïne à partir de
glucose est réalisée selon le test de Voges-Proskauer [42].
Fermentation des carbohydrates
Elle est déterminée sur milieu liquide MRS additionné de 0.04 g/l de
pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH, et supplémenté avec 1% des
carbohydrates suivants: L-Arabinose, Ribose, D-Xylose, Galactose, D-Fructose,
Mannitol, Sorbitol, Cellobiose, Maltose, Lactose, Mélibiose, Saccharose, Tréhalose,
et D-Raffinose. Après inoculation, les conditions d'anaérobiose sont assurées par
l'addition d'huile de paraffine stérile à la surface [42]. Ces tests sont complétés
par celui de l'hydrolyse de l'esculine [34]. Enfin, le système d’identification API
50CH (Biomerieux Marcy l'Etoile France) a servi pour l’établissement du profil
fermentaire des souches.
Activité protéolytique
L'aptitude à la protéolyse des différentes espèces de Lactococcus est
recherchée sur milieu à base de lait écrémé Y.M.A [37]. L’intensité de la réponse
est notée à chaque fois (-, +, ++).
Croissance et production d'acide sur milieu lait
L'évaluation de l'acidité produite par les souches en cultures pures ou en
cultures mixtes (mélange de deux souches) est réalisée par titrimétrie ( titrage de
10 ml d'échantillon de culture avec NaOH N/9 en présence de 5 gouttes de
phénolphthaléine) et par pH-métrie. Ce test est réalisé dans le lait écrémé qui est
reconstitué à 10%, enrichi par 0.5 g/l d'extrait de levure et stérilisé à 110°C
pendant 10 mn. La pré-culture est obtenue par l'inoculation du lait écrémé (6 ml)
Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats
79
par une seule colonie de bactéries lactiques. Après incubation à la température
convenable et après coagulation, le tout est transvasé stérilement dans 200 ml de
lait écrémé. La cinétique de croissance et d'acidification sont réalisées
simultanément à des intervalles de temps régulier [20, 24]. La production d'acide
lactique est exprimée en mM selon la méthode de Kumar et al., [26].
RESULTATS.
Caractérisation des souches bactériennes
Les isolats à Gram positif, catalases négatifs et non sporulés sont
étudiées. La croissance des souches en présence de 6.5% de NaCl, à 45°C et à pH
9.6 permet de séparer les entérocoques. Par contre les formes cocci qui ne
poussent pas dans de telles conditions sont classées parmi les bactéries lactiques
(115 souches) (Tableau1).
Les tests physiologiques et biochimiques ont facilité la répartition des
isolats en 6 groupes : coques homofermentaires mésophiles (groupe 1: 88
souches), coques hétérofermentaires mésophiles (groupe 2: 10 souches), coques
homofermentaires thermophiles (groupe 3: 17 souches).
Dans le groupe 1, (88 souches) la recherche de l'ADH et de l'acétoïne ont
permet l’identification de l’espèce et la sous-espèce : c'est le cas de Lactococcus
lactis subsp. lactis ADH+ (74 souches) et Lactococcus lactis subsp. cremoris ADH-
(14 souches) et même la sous-espèce, c'est le cas de la production d'acétoïne et
l'utilisation du citrate caractéristique de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar
diacetylactis (39 souches).
Pour les autres groupes, contrairement aux lactocoques, ces deux tests
s'avèrent insuffisants quant à leur identification; car elle repose essentiellement
sur la fermentation des carbohydrates. Les 10 souches du groupe 2 appartiennent
au genre Leuconostoc (Tableau 1). Parmi ces dernières, deux sont caractérisées
par un profil fermentaire réduit, ne dégradent pas l'arginine et ne produisent pas
de dextranes. Ces caractères nous permettent de les classer dans l'espèce
Leuconostoc mesenteroïdes subsp. cremoris. L'espèce dominante de ce genre
appartient à Leuconostoc mesenteroïdes subsp. mesenteroïdes qui dégrade
l’arabinose et produise du dextrane.
Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats
80
Le troisième groupe (17 souches) possèdent les caractéristiques de
Streptococcus thermophilus qui sont un profil fermentaire réduit, ne poussent pas
en milieu Sherman. Cette souche ne supporte pas le pH 9.6 et 6.5 % de NaCl.
Les lactobacilles sont représentés par 91 souches, les bâtonnets
homofermentaires mésophiles (groupe 4: 53 souches), bâtonnets
homofermentaires thermophiles (groupe 5: 20 souches) et bâtonnets
hétérofermentaires mésophiles (groupe 6: 18 souches). Les résultats obtenus lors
de la fermentation des carbohydrates (Tableau 1) permet de les répartir selon
différentes espèces. Le groupe 4 est constitué de Lb. plantarum 9 (9.89 %), Lb.
casei 7 (7.69 %), Lb. curvatus 23 (25.27 %), Lb. rhamnosus 10 (10.98 %) et Lb.
paracasei 4 (4.39 %); le groupe 5 renferme Lb. acidophilus 2 (2.19 %); Lb.
helviticus 10 (10.98 %), Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus 5 (5.49 %) et Lb.
delbrueckii ssp. lactis 3 (3.29 %); quant à Lb. brevis 5 (5.49 %), Lb. reuteri 9 (9.89
%) et Lb. fermentum 4 (4.39 %), elles font partie du groupe 6.
Activité protéolytique et pouvoir acidifiant
Un pourcentage de 39.47 des lactocoques ne présentent aucune activité
protéolytique; 53.9% un halo d'hydrolyse inférieur à 10 mm; 5.26% un halo
compris entre 10mm et 20 mm. Seule une espèce de Lactococcus lactis subsp.
lactis possède une activité protéolytique importante (halo égale à 26 mm).
La production maximale d'acide (Figure 1) des cultures pures se situe entre
42.2 mM et 110.6 mM. Les vitesses maximales moyennes obtenues entre deux
heures et dix heures d'incubation sont respectivement de 1.9 mM h-1 et 9 mM h-1.
Les figures 2a et 2b présentent la production d'acide lactique en cultures mixtes
de deux couples de lactocoques. La production d’acide lactique est stimulée entre
la souche LL.9LMA (31.1 mM) et la souche LL.30LMA (50 mM) celle-ci atteint
127.6 mM après 16 h d'incubation (Fig 2a). L’augmentation de la production
d'acide est significative (+ de 57.3 %). La deuxième montre l'effet antagoniste entre
la souche LL.9LMA (31.1 mM) et la souche LL.11LMA (55.5 mM) se manifeste par
une réduction de 33.3 mM en co-culture après 10h d'incubation (Fig 2b).
DISCUSSION
Notre présente étude a permis d’isoler, de caractériser, et d’identifier 206
souches de bactéries lactiques réparties essentiellement entre de lactocoques (Lc.
Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats
81
lactis subsp. lactis (35 souches), Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, (39
souches), Lc. lactis subsp. cremoris (14 souches), de streptocoques (Sc.
Thermophilus 17 souches), de leuconostocs (Ln. mesenteroides subsp.
mesenteroides 8 souches, Ln. mesenteroides subsp. cremoris 2 souches), et de
lactobacilles (Lb. plantarum 9 souches, Lb. casei 7 souches, Lb. curvatus 23
souches, Lb. rhamnosus 10 souches, Lb. paracasei 4 souches, Lb. acidophilus 2
souches, Lb. helviticus 10 souches, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, 5 souches, Lb.
delbrueckii ssp. lactis 3 souches, Lb. brevis 5 souches, Lb. reuteri 9 souches et Lb.
fermentum 4 souches).
Les espèces de bactéries lactiques détectées dépendent essentiellement de la
nature du lait cru et des conditions d’analyse. Ainsi, à partir du cheddar, la
caractérisation phénotypique et génotypique de la microflore lactique a permis de
recenser les espèces dominantes de Lb. paracasei, de Lb. plantarum, de Lb.
curvatus, et de Lb. brevis [12]; alors que pour Bissonnette et al., [2], l'espèce
dominante du même fromage était Lc. lactis subsp. cremoris. Les espèces de
bactéries lactiques dominantes des levains artisanaux appartiennent à Lb.
plantarum, Lb. curvatus, et Lb. brevis [32]. Pour le poisson, ce sont Lc. lactis
subsp. lactis et Ln. citreum. et pour le riz bouilli Lb. paracasei [3, 35]. Dans les
produits carnés, Hugas et al., [21] ont trouvé que Lactobacillus plantarum
représente 8 % des lactobacilles isolées et l'espèce dominante était Lactobacillus
sake avec 55 %; en revanche, Rovira et al., [41] trouvèrent Lactobacillus plantarum
l'espèce dominante de la flore lactique isolée. Dans les produits végétaux tels que
le sorgho, les espèces de bactéries lactiques dominantes appartiennent aux
lactobacilles (Lactobacillus plantarum 34.7 %, Lactobacillus sake-Lactobacillus
curvatus 15 %), aux leuconostocs (Leuconostoc mesenteroides 28.2 %) et aux
pédiocoques (Pediococcus pentosaceus 10.2 % et Pediococcus acidilactici 7.8 %);
par contre les lactocoques ne représentent que 4 % [27].
La deuxième étape a permis de recenser des souches possédant des
propriétés technologiques intéressantes telles que le pouvoir acidifiant et l’activité
protéolytique. Dans notre cas, les souches les plus acidifiantes appartiennent aux
deux sous espèces Lc. lactis subsp. lactis et Lc. lactis subsp. lactis biovar
diacetylactis.
Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats
82
Une stimulation de la production d’acide entre LL.9LMA et LL.30LMA. est
obtenue. Cette protocoopération a été observé entre les souches de bactéries
lactiques [10]. Elle peut aboutir à une augmentation de la croissance de ces
souches et à une acidification du lait plus importante que la somme de ces
activités propres à chacune des deux espèces [10].
Les méthodes utilisées pour la mise en évidence de l’activité protéolytique
sont cependant assez dissemblables et les résultats obtenus sont difficilement
comparables. Elles diffèrent notamment par la nature des substrats protéiques et
la spécificité des activités enzymatiques. Pour notre cas nous avons utilisé le
milieu Y.M.A. pour détecter l’activité protéolytique. En plus de son action sur la
coagulation du lait lors de la croissance des bactéries lactiques, la protéolyse
d’origine bactérienne est essentielle à l’affinage des fromages par le développement
de flaveurs [29] et de la texture [31]. La composition du milieu de croissance et les
conditions de culture peuvent modifier l’activité protéolytique totale ou
activer/inhiber une activité protéasique ou peptidasique donnée [25, 28]. Les
souches les plus protéolytiques que nous avons isolées appartiennent à l’espèce
Lc. lactis subsp. lactis. Desmazeaud et Vassal [8, 30] ont montré que les souches
les plus protéolytiques sont Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis. Les
bactéries lactiques testées sont peu protéolytiques et rejoignent les résultats
obtenus par Reinheimer et al. [40].
Les souches présentant un halo de lyse entre 5 et 10 mm de diamètre, ont
une acidité de 65.5 mM. La valeur maximale de production d’acide lactique
obtenue est de 99,9 mM. Alors que pour 3 sous-espèces protéolytiques de Lc.
lactis subsp. lactis, le pouvoir acidifiant varie entre 74.4 mM. et 99.9 mM. De
telles constatations ont été enregistrées par Sodini et al., [44].
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85
Tableau 1: Propriétés physiologiques et biochimiques des différentes souches debactéries lactiques isolées à partir du lait cru de chèvre.
Cocci BâtonnetGroupe 1 2 3 4 5 6
Type Fermentaire Homo hétéro homohomohomo hétérNombre desouches
35 39 14 8 2 17 53 20 18
ADH + + - - - 6 10Croissance à 15°C
37°C
45°C
++-
++-
++-
++-
++-
-++
-+-
-++
-+-
Croissance à 4%NaCl
6.5%NaCl
+-
+-
--
--
--
--
--
--
--
Production deDextrane
Acétoïne
--
-+
--
+-
-+
--
--
--
--
Fermentation deArabinoseRiboseXyloseGalactoseFructoseMannitolSorbitolCellobioseMaltoseLactoseMelibioseSaccharoseTrehaloseRaffinose
1133234+31633+332523321
13+3373029112131+3522+1
4+-++13-
12111326+-
++-6+--+++5++-
-+-1----1++-+-
55-57--32++16+-
15473050514435+
49522133278
2+3141846411181217-
1013-
12+167+13127167-
+: réaction positive; -: réaction négative; les chiffres indiquent le nombre de souches positives.
Tableau 2: Activité protéolytique des différentes espèces de Lactococcus sur milieuYMA.
Degré de protéolyseEspèces Nombre 0 + ++ +++
Lactococcus lactis subsp lactisLactococcus lactis subsp lactisbiovar diacetylactisLactococcus lactis subsp cremoris
3539
14
1618
8
1421
6
40
0
10
00: absence d'un halo d'hydrolyse; +: halo 10mm; ++; halo de 10mm à 20 mm; +++: halo 20mm.
Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats
86
Figure1: Cinétique d'acidification en mM d’acide lactique produit enculturespures.LL.111LMA º, LL.150 LMA et LL.8 LMA ).
Figure 2: Cinétique d'acidification en mM d'acide lactique produit en culturespures et mixtes.(A) LL.9 LMA , LL.30 LMA o, LL.9 LMA +, LL.30 LMA observées et LL.9 LMA + , LL.30 LMA calculées ▲. (B) ) LL.9 LMA , LL.11 LMA o, LL.9 LMA + LL.11 LMA observées et LL.9 LMA + LL.11 LMA calculées ▲
0
20
40
60
80
100
120
140
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Temps(h)
Acid
ité
pro
du
ite
(mM
)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Temps(h)
Aci
dit
ép
rod
uit
e(m
M)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Temps (h)
Aci
dit
épro
duit
e(m
M)
A B
Dirasat, Agricultural Sciences, Volume 32, No.3 2005 Résultats
91
Inhibition of Staphylococcus aureus growth by lactic acid
bacteria in milk
bettache GUESSAS*, Miloud HADADJI, Noureddine SAIDI and Mebrouk. KIHAL
Laboratoire de Microbiologie appliqué, Département de biologie, Faculté des Sciences,
Université d’Oran, BP 1524 El mnaouer, Oran 31000 Algeria.
Abstract
Lactic acid bacteria (LAB) from raw goat and ewes' milk, from arid and semi-
arid zones in west Algeria were tested for the production of antimicrobial
substances against Staphylococcus aureus in milk. Twenty samples of raw milk
were collected from which 96 LAB strains were isolated and exhibited
antagonistic effects on solid agar medium. Two strains exhibited inhibition
towards S. aureus from their supernatant culture medium. A Lactococcus lactis
subsp lactis biovar diacelylactis (Lc8) strain proved by far the most efficient,
produced a heat stable bactericid substance with a proteinaceous nature,
suggesting a bacteriocin. Lc8 inhibited S. aureus. in milk, so that no cell was
counted after 48h of incubation. This strain acts either by decreasing the pH
or by bacteriocin production which makes it a good candidate strain in cheese
making and useful in preventing growth of S. aureus.
Key words: Lactic acid bacteria, bacteriocin, Staphylococcus aureus, milk,
bactericidal, Lactococcus lactis .
*Corresponding author
e-mail : guessas.bettache@univ-oran.dz or guessas_b@yahoo.com
Dirasat, Agricultural Sciences, Volume 32, No.3 2005 Résultats
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Gram-negative species (Blackburn et al., 1989; Lewus et al., 1991; Stevens et
al., 1991; Kalchayanand et al., 1992; Arihara et al., 1996). The mode of action
of some bacteriocins has been identified, but for many others only a general
description of the bacteriostatic (Lewus et al., 1992; Thompson et al., 1996) or
bactericidal effects (van Belkum et al., 1991; Venema et al., 1993; Schved et al.,
1993; Samelis et al., 1994; Enan et al., 1996) has been reported.
In the arid zones of Algeria, the mil preservation factories are unavailable,
hence most raw goat’s or ewes’ milk is made into cheese, using goat’s rennet
for coagulation. This type of cheese is subject to spoilage especially by
pathogenic bacteria like Staphylococcus aureus. If milking goat and ewes have
mastitis, then large numbers of infectious micro-organisms may be shed in
their milk (De Vries, 1975) and consequently form a significant part of the flora
of raw milk products such as farmhouse cheeses.
The aim of this work was to isolate bacteriocin-producing LAB capable of
inhibiting Staphylococcus aureus in order to use them as starter for traditional
production of cheese in arid and semi-arid zones.
Materials and methods
Bacterials strains and cultures
Staphylococcus aureus and Lactobacillus curvatus LTH1432 (WP Hammes) was
chosen as indicator strains to demonstrate and measure bacteriocin activity.
All cultures were maintained as frozen stocks held at -20°C MRS broth with
25% (v/v) glycerol (Difco Laboratories, Detroit, M1, USA). Before experimental
use, cultures were propagated twice in broth for 18 to 24 h. The following
strains were grown in the indicated media: lactobacilli, pediocococci, and
enterococci, in MRS (de Man, Rogosa, and Sharp) broth (Difco); and lactococci,
in M17 (Difco); and Staphylococcus aureus in Tryptic Soy Broth (TSB, Difco).
Isolation and identification of antistaphylococcal LAB and activity assays
The search for anti-S. aureus LAB was carried out by using raw milk as source
of this bacteria. A total of 12 samples of raw goats and ewes’ milk were
aseptically collected from different farms in west Algerian arid zones (Table 1)
and stored frozen at -20°C with glycerol (10%) until use. Samples were thawed
and kept at 25 °C for 4h. Ten fold dilutions of milk samples were spread out on
the surface of four MRS agar (0,1 ml of appropriate dilution is used ). Plates
were incubated anaerobically at 30 °C for 2 days and then overlaid with 5 ml of
Dirasat, Agricultural Sciences, Volume 32, No.3 2005 Résultats
94
Tryptic Soy Broth with 0.75% agar which was previously inoculated with 0.1
ml of 18 h culture of Staphylococcus aureus in TSB. After overnight incubation,
bacterial colonies found positive for anti–staphylococcal activity were identified
by their inhibition zones, streaked for single colony isolation, and tested
further (from each sample, ten colonies were kept from higher dilution).
Isolates were inoculated in MRS broth to yield an initial concentration of ca.
103 cfu/ml and incubated for 18 h at 37 °C. After centrifugation (2700Xg for 10
min), the pH of the supernatant was adjusted to 6 with 0.1 M NaOH and filter
sterilized ( 0.45-μm pore size). Antistaphylococcal activity of the obtained cell-
free filtrate (culture extract) was tested by the well diffusion assay (deferred
method) described by Tagg and McGiven (1971), with double layer consisting of
MRS agar and Chapman agar seed with Staphylococcus aureus as for the direct
method. To quantitate inhibitory activity, the diameter of the inhibition zone (in
millimetres) was measured.
All isolates were tested for their Gram reaction, catalase activity using H2O2,
shape by observation of overnight cultures using a phase contrast microscope
standard and presumptively classified as lactic acid bacteria. Full identification
was carried as described in Guessas and Kihal (2004).
Determination of bacteriocin activity
Bacteriocin activity was determined by an agar well diffusion assay, as
described by Ryan et al. (1996). Molten agar at 48°C was seeded with the
indicator strain Lactobacillus curvatus (50 μl of an overnight culture per 20 ml
agar), dispensed into sterile Petri dishes, and allowed to solidify. Wells of
approximatively 4-6 mm in diameter were made and bottom selled by one drop
sterile agar. Fifty μl aliquots of two fold serial dilution of bacteriocin
preparation were dispensed into the wells. After incubation overnight at 30 °C,
bacteriocin activity was calculated as the inverse of the latest dilution that gave
a definite zone of clearance. Activity units were expressed per millilitre
(1/dilution x 20).
Sensibility to heat and proteolytic enzymes
The culture extract of the selected strain was treated with several enzymes:
trypsin; α-amylase and catalase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). All
samples were adjusted to pH 7 with 1.0 M NaOH, filter sterilized (0.45 millipore
size), and held for 1 h at 25 °C. The residual activity of the treated and control
Dirasat, Agricultural Sciences, Volume 32, No.3 2005 Résultats
95
samples was determined by measuring the diameters of the inhibition zones in
the well diffusion assay. To determine the heat sensitivity, cell-free
supernatants were heated at 80, 100, 110, and 120 °C each for 10, 15 and 30
min; they were then cooled and tested for residual activity by the agar well
diffusion assay.
Growth of S. aureus strain in the presence of a bacteriocin producer
To demonstrate the effect of bacteriocin-producing strain on a growing culture
of Staphylococcus aureus strain. This bacterium was grown together with the
strain Lc8 in reconstituted milk. Selected LAB strains Lc8, and S. aureus were
grown in skimmed milk (100g/l) for 24 h. Reconstituted milk was divided into
10 ml portions, placed into 45 flasks and heat treated at 80°C for 10 min. Each
15 flasks were inoculated with a 3% of a 24-h culture consisting of Lc8 strain,
Staphylococcus aureus, the mixed culture of Staph. and Lc8 respectively. The
flasks were finally incubated at 30 °C. In order to estimate growth in single and
mixed cultures, variation in cell density of Staphylococcus aureus and Lc8 was
determined by plating the samples onto specified agar plates medium
(Chapman and MRS respectively); in mixed cultures, however only
Staphylococcus aureus count was made in single cultures.
Lactic acid production
The lactic acid production by the screened strains of LAB was determined by
measuring the pH expressed as Dornic degree (°D) in heat treated (5 min at
121°C) reconstituted skimmed milk (100 g/L). Three percent of 24-h pre-
cultured milk was added, and the pH was measured after incubation at 30 °C.
Results and discussion
The inactivation of pathogenic and food spoilage micro-organisms is a major
concern with respect to food processing. The food-borne pathogens which are
of particular importance in dairy foods include Staphylococcus aureus and
Listeria monocytogenes. S. aureus is one of the most problematic
microorganisms present in raw milk. If milking goat and cows have mastitis,
then large numbers of infectious microorganisms may be shed in milk (De
Vries, 1975) and consequently form a significant part of the flora of raw milk
products such as farmhouse cheeses.
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96
A total of 96 bacterial isolates with antagonistic effects on S. aureus were
isolated from 12 raw goat and ewes milk samples. In most cases the
antagonistic effect was due to a decrease in the pH resulting from the
production of organic acids. The culture extracts from two strains were shown
to be active against Staphylococcus aureus by the action of antibacterial
substances other than organic acids. These bacterial isolates were Lactococcus
lactis subsp lactis (Lc7) and Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacelylactis
(Lc8) (Figure 1,2). The latter one proved to be by far the most efficient, with a
culture extract activity of 14,025 AU/ml (arbitrary units).
Similar results were obtained by Geis et al., (1983), who tested 93 strains
Lactococcus lactis subsp. Cremoris and found that 36 strains exhibited
antagonistic effects on agar, but only one of them produced an antibacterial
substance in the liquid medium. Also Schillinger and Lucke (1989) found only
one strain exhibiting antibacterial action in liquid medium from 221 isolates.
Noonpakdee et al., (2003), isolated 14020 lactic acid bacteria isolates in which
only one strain exhibited inhibition toward Staphylococcus aureus. The Lc8
strain showed a high capability to inhibit S. aureus growth. Vaughan et al.,
(1994), demonstrate the ability of LAB isolated from raw milk to inhibit S.
aureus.
The antibacterial substances contained in the culture extract of Lc8 strain were
inactivated in the presence of catalase, which exclude an inhibition by
hydrogen peroxide. They were however inactivated by the proteolytic enzyme
trypsin, and no change in their activity was observed when they were treated
with α-amylase. In fact although the initial culture extract produced an
inhibition zone with a diameter of 10 mm in Staphylococcus aureus culture.
Later, no inhibition zone was detected after treatment with these enzymes
(Figure 3). The antibacterial substance is, therefore, a substance of a
proteinaceous nature. Since no change was observed upon treatement with α-
amylase, it can be inferred that no carbohydrate moiety is essential for the
bacteriocin activity (Jack and Jung, 2000). To evaluate the heat stability of
these antistaphylococcus substances, cell-free supernatants were incubated at
80, 100, 110, and 120 °C for various periods of time. There was no remarkable
reduction in the antibacterial activity after heating at 80°C for 30 min.
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97
The addition of the concentrated neutralized culture supernatant of Lc8 to a
culture of S. aureus in TSB broth resulted in a rapid inactivation of the
sensitive cells. The number of viable cells per millilitre declined from 1.5x106 to
1.2x104 after 8 hours of incubation (Figure 4) and below 500 cells per ml after
24 hours, and cells did not regrow within 48 h. In contrast, the culture of S.
aureus was unaffected by the addition of a concentrated supernatant of the
bacteriocin-negative strain. These results indicate a bactericidal mode of action
of the antibacterial compound. The bactericidal mode of action and the
proteinaceous nature of this substance are typical characteristics of bacteriocin
(Tagg et al., 1976). Similar results were reported by Galvin et al., (1999) who
found that Lactococcus lactis subsp. lactis DPC3147 is active against S. aureus
and reduced considerably cell numbers after 2 h in time-kill curve conducted
in broth medium.
The acidity produced by Lc8 strain in skimmed milk evaluated by the amount
of lactic acid released and expressed as Dornic degree show a production of 17
°D lactic acid after 6 h and 35 °D after 8 h of culture. The production increased
to reach 40 °D after 24 h of culture. The final pH is about 4.64 at 8 h and
about 4.36 after 24 h of incubation.
The inhibition of a growing culture of S. aureus by adding a bacteriocin-
producing strain Lc8 in milk was examined and compared with the growth of
Staphylococcus aureus in milk (figure 5). A decrease in S. aureus count after 8h
was noted; on the other hand, in single culture, the growth of S. aureus
increased after the same period of time. After 24 h the decrease in S. aureus
growth was considerable and continued until only two bacteria were counted
after 48 h.
We note the double action of Lc8 either by acidifying action and/or a
bacteriocin production. The acidity is the first step in cheese making to reach
suitable pH to form a curd. Acidity and bacteriocin production together play an
important role in cheese making as described by Ryan et al., (1996). The
inhibition of S. aureus by Lc8 strain is due to bacteriocin production however
the acidity plays a combined role in this inhibition. Similar results were
reported by Noonpakdee et al., (2003) who isolated about 14020 strains from
fermented sausage and found that only one strain was capable of reducing pH
in a manner similar to our finding.
Dirasat, Agricultural Sciences, Volume 32, No.3 2005 Résultats
98
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100
thiolo-activated bacteriocin from Lactococcus lactis. Applied EnvironmentMicrobiology, 59,1041-1048.
Table 1: Type and source of raw milk sample used in this study
Region Tiaret Saida Bechar El bayed
Type Goat Ewe Goat Goat Goat
Number 3 2 3 2 2
Fig 1: Inhibition of Staphylococcus aureus by lactic acid bacteria by agar well
diffusion assay. Symbols: (a) Lc8; (b) Lc7
Fig 2 : Inhibition of Staphylococcus aureus by lactic acid bacteria by an agar
spot test. Symbols (a), Lc7; (b), Lc8.
a
b
a
a
b
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Fig 3: Inhibition of Staphylococcus aureus by Lc8 culture supernatant by the
agar well diffusion assay. Wells contained cell-free supernatant which were
treated by adding lipase (well 1); adding catalase (5 mg/ml)(well 2), or trypsin
(0,5 mg/ml)(well 3).
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3
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5
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0 4 8 24 30 48 52
hours
Lo
gu
fc/m
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Fig. 4: Bactericidal effect of the bacteriocin produced by Lactococcus lactissubsp lactis biovar diacelylactis Lc8 on Staphylococcus aureus. Symbols : ,without adition of the cell-free concentrated supernatant; ■, cell-freeconcentrated supernatant from Lc8 added.
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fc/m
l
Fig 5: Growth of Staphylococcus aureus in presence of Lactococcus lactis subsplactis biovar diacelylactis in Milk at 37 °C. Symbols:, Lc8; ■, Staphylococcusaureus; ●, Staphylococcus aureus in a mixed culture with Lc8.
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103
Proteolytic activity detection in cultivable lacticacid bacteria isolated from Algerian raw goat’s
milk
M. Moulay.1, H. Aggad1, Z. Benmechernene2, B. Guessas 2, D.E. Henni2 andM. Kihal2*
1Faculty of Sciences Agro-Vétérinairy, Tiaret University , BP 78 , Tiaret. Algeria2Laboratory of Applied Microbiology, University of Oran. Department of Biologie, Faculté of
Sciences, Oran University BP 16. Es-senia, 31100, Oran, Algeria.
Summary
The proteolytic systems play an essential role in nitrogen metabolism of lacticacid bacteria in milk. The extracellular cell wall-bound proteinase is a keyenzyme in this system, in which its activity is necessary for the growth of lacticacid bacteria in milk by initiating the breakdown of casein to smaller peptides.The screening of the proteolytic strains has been achieved on three solid mediaYMA, PCA and FSDA. The strain of Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcuslactis subsp. lactis, biovar. diacetylactis and the Enterococcus were tested.Lactococcus lactis produced a large hydrolysis zone more than 10 mm ofdiameter. The concentration of 3 and 5% of inoculum produced the highestacidity which was superior to 60°D. The proteolytic strains of Lactococcus lactissubsp. lactis biovar. diacetylactis at 3% of inoculum showed a maximalacidification rate 5°D/h and 0.3 unit pH/h. The strongest proteolytic strainLactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis produced an acidificationrate of 8 °D/h and a pH rate which decreases to 0.28 unit of pH/h with a finalpH value of 4.29. The rate of casein hydrolysis by the original Lactococcus lactissubsp. lactis biovar. diacetylactis (90 mg/h) was three times higher. Theproteolytic activity of this strain can be exploited for the selection ofperformante lactic acid bacteria for the Algerian dairy industry.
Keys words : lactic acid bacteria, proteolysis, caseins, goat's milk.
Corresponding author. : KIHAL Mebrouk, (KihalM@hotmail.com)
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
104
INTRODUCTION
The primary role of lactic acid bacteria is the production of lactic acid from
carbohydrates, resulting in a pH decrease and proteolysis as to liberate short
peptides and free amino acids. These compounds affect flavour and texture of
products (Meijer and Hugenholtz 1997). The proteolytic system of lactic acid
bacteria consists of a cell envelope associated proteinase, specific peptide and
amino acid transport systems, and several cytoplasmic peptidases. An
important metabolic function that influence the fast growth of lactococci in
milk is their proteolytic system, which is required to obtain the amino acids
needed for growth to high cell density (Palaez and Requena 2005). Mills and
Thomas (1981) reported that the concentration of amino acids especially
isoleucine and leucine is very low in milk. However, the lactococcal proteinase
remains the only proteolytic enzyme whose extracellular localization is
ascertain. The type of proteinase was shown to play a crucial role in the
interaction between proteolytic and nonproteolytic lactococci associatively
cultured in milk (Juillard et al. 1995; Flambard et al. 1998; and Garault et al.
2001). A proteinase, located at the outer surface of the cell catalyses partial
hydrolysis of one or more of the casein components of bovine milk to a number
of oligopeptide products (El Soda 1993).
The selection of new strains of lactic acid bacteria for technological interest and
the exploitation of their potentialities is a subject to their growth capacity in
milk. The objective of this study is to select some strains of Lactococcus sp
which have a high proteolytic activity and susceptible to be integrated as a
starter in fermented milk. The microbiological methods used here permitted to
classify the Lactococcus sp strains by their proteolytic activity levels.
MATERIAL AND METHODS
Bacterial strains and growth conditions.
Lactic acid bacteria strains were isolated from Algerian raw goat's milk and
they belong to the culture collection of Applied Microbiology Laboratory,
Department of Biology, Sciences Faculty, Oran University Algeria, were used in
this study. 32 strains of lactic acid bacteria isolates are listed in table I. All
strains were stored at -80°C in a reconstituted skimmed milk containing 30%
(wt/vol) glycerol. For cultivation, aliquots were reactivated in M17 broth at
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
105
30°C for 24h (Mathot et al. 1994). Cultures were stored at 4°C and maintained
in M17 medium every month.
Strains selection:
After activation of the cultures in M17 broth, the purification was achieved in
M17 agar medium and incubated at 30°C for 24 h. For the tests of proteolytic
activity, strains were grown on three types of media containing 1% of sterile
skimmed milk: The solid media plates count agar (PCA), yeast milk agar (YMA)
and FSDA agar were used (Huggins and Sandine 1984; Badis et al. 2004). The
plates were evaluated by measuring the diameter of the hydrolysis and clear
zones formed around the colonies which served into classifying the strains
according to their proteolytic activity. In all cases, the average value from three
replicates and standard deviation were calculated.
Proteolytic strains identification :
Strains were identified as to possess the proteolytic activity and they were
subsequently characterized according to the criteria described by Badis et al.
(2004). Strains were subcultured in M17 broth, incubated at 30°C until visible
growth occurred. Strains were checked for their purity by streaking colonies on
M17 agar. Plates with pure culture were used to rapidly test for cell
morphology by microscopy, Gram and catalase reaction. Gram-positive and
catalase negative strains were further identified by a limited number of
biochemical and physiological tests : gaz production, arginine hydrolysis on
M16 BCP agar (Thomas 1973), which differentiates between the strains of the
Leuconostoc genus and the heterofermented Lactobacillus genus. Citric acid
degradation on solid medium of Kempler and Mac Kay (1980) separated the
subspecies of Lactococcus. The MSE agar medium (Mayeux et al. 1962)
differentiates the subspecies of Leuconostoc and the Sherman test used in
order to differentiate the Streptococcus and the Lactococcus species. Other tests
were applied such as, the growth in salt, pH 9.6 broth and thermoresistance as
to separate the Enterococcus sp. (Mathara et al. 2004; Badis et al. 2004).
The fermentative profil of several carbohydrates (glucose, lactose, xylose,
fructose and sucrose) was carried out (Durlu-Ozkaya et al. 2001; Mannu et al.
2002; Guessas and Kihal 2004).
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
106
Optimization of proteolysis detection on solid media:
Lactic acid bacteria which were cultured by multipoint system on the surface of
three different media PCA, YMA and FSDA containing various concentrations of
skimmed milk (1%, 2% and 4% w/v) which serve in evaluating the proteolytic
activities of the strains. Hydrolysis proteolytic zones of the strain were
compared and statistical analysis was carried out. The calculation of the
difference between two observed average measurement were compared to the
standard variance, using the T Student test (Huggins and Sandine 1984).
Strains which showed positive proteinase phenotypes on assays were grown on
11% sterilized skimmed milk medium which was sterilized by autoclaving at
110°C for 10 min. Acidifying activity of strains was measured according to
the International Dairy Federation (IDF) standard 306 (1997), Kihal et al.
(1996) and Alonso-Calleja et al. (2002). The dornic acidity as well as the pH
were measured every two hours.
Sterilized milk was inoculated at 0.2% with each pre-cultured strain in
MRS broth at 30°C for 24 h, in order to obtain approximately 106 cfu ml-1,
and then were incubated at 30°C for 24 h. The proteolytic activity of the
strains was determinate by the tyrosine method, according to the
International Dairy Federation (IDF) standard 149A (1997).
After incubation until coagulation of milk at 30°C, the culture was inoculated
in 200 ml of sterilized skimmed milk and homogenized. The mixture was
distributed in tubes and the kinetics of growth and acidification were measured
every 2 hours. Determination of the specific growth rate µ and the calculation
of some arithmetic parameters permitted to get values of the differences
existing in the results (Kihal et al. 1996).
Determination of caseolytic activity
Kinetic of growth in presence of casein : The proteolysis of casein was
determinate in M17 broth medium containing 1 g l-1 of casein as a substrate :
10 ml of 18 h freshed culture M17 broth was centrifugation (4000 rpm during
10 min at 4 °C). The Cell pellets were collected and washed twice in tryptone
salt. They served to inoculate 100 ml of M17 casein broth. The growth of all
strains was measured every hour by optical density at 600 nm by
spectrophotometer. Casein residue was measured according to Bradford
method (Meijer and Hugenholtz 1997).
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107
RESULTS AND DISCUSSION
Strains characterization.
All strains were gram positive and had a cocci form in pair or chains. A 28 of
32 purified strains are proteolytic giving clear visible zone on PCA and YMA
+2% skimmed milk medium respectively. Morphological, physiological and
biochemical characteristics (Kempler and Mc Kay 1980; Stiles and Holzapfel
1997; Badis et al. 2004) allowed the identification of: 17 strains which belongs
to Lactococcus lactis species, 11 strains belonging to the genus Enterococcus
and 4 species belonging to Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis
(table 1).
Table 1 : Identification of lactic acid bacteria strains.
Strain code Identification
La12, La15, La16, La32, La34, La36,
La38, Ma4, Ma6, Ma18, Ma19, Ma21,
Ma26, Ma37, Max, SLO3+, LcX1
Lactococcus lactis subsp. lactis
La4, La20, La21, La23, La24, La30,
La35, Ma20, Ma24, Ma25, SD17
Enterococcus sp.
La11, Ma1, Ma2, Ma27 Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.
diacetylactis
Proteolytic activity:
Four strains La11, Ma1, Ma2, and Ma27 have presented a proteolytic activity
which raised on the three tested concentrations of milk and also on the two
solid media culture PCA (Fig. 1) and YMA. On PCA medium, milk
concentrations resulted in the appearance of a hydrolysis zone whilst a
significant difference was observed between the presence of the concentrations
(1% and 4%) of skimmed milk however, it was highly significant in the presence
of 1% and 2% of skimmed milk. On YMA medium, the difference was highly
significant between 1% and the other two concentrations of skimmed milk
therefore 1% of skimmed milk is a suitable concentration for detecting
proteolytic activity in lactic bacteria strains. On FSDA medium, in addition to
the proteolytic activity, the use of lactose and the production of acid lactic were
also ascertained by the turn of bromocresol purple colour indicator to Yellow as
shown in (Fig. 1).
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
108
Most of these strains yielded most visible zones with diameters varying between
0.15mm to 11.5mm which were established in the presence of 1% of skimmed
milk. All strains have presented a hydrolysis zone of 11mm diameter and which
was identical to La11, Ma1 and Ma2 Ma27 strains (11 mm).
Fig. 1 Optimization of the detection of proteolysis on PCA medium (1%, 2 %
and 4 % of skimmed milk) (A, B and C) on FSDA medium (D) and YMA medium
(E)
Statistical evaluation of strains activity:
Screening for hydrolysis zones produced by several proteolytic strains were
achieved on three different media and as a result a hydrolysis zones of 5mm to
10mm of diameter were produced by 73% of strains on FSDA medium, 70% on
PCA medium and 59% on YMA medium. However, strains producing hydrolysis
zones which their diameters higher than 10mm was represented by 15.38% on
FSDA, only 3.7% on PCA medium and 7.4% on YMA medium. Therefore, from
these observations we can postulate that FSDA is the most favourable medium
for detecting proteolytic lactic acid bacteria.
Moreover, proteolysis zone of diameter higher than 1cm was represented in
7.5% of the strains on YMA medium and it reached 15.38% on FSDA medium
A
D
CB
E
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
109
and this led to differentiate between the strongly and slightly proteolytic strains
(Huggins and Sandine 1984, Wehrle et al. 1999).
pH Kinetic on skimmed milk :
The inoculum concentration of 3% to 5% of strain (Ma2) which was incubated
for 24hours in skimmed milk produced the highest acidity which was superior
to 60°D however, the latter decreased to 35°D with an inoculum
concentrations that varied between 0.1% and 0.5%. Moreover, the same
phenomenon was observed with concentrations of 3% and 5% of inoculum
incubated in skimmed milk for only 6 hours whilst the pH decreased rapidly
(inferior than 5). Therefore, the production of lactic acid is related to the
concentration of the initial inoculum.
A maximal speed of 5°D per hour is obtained while using a concentration of 2%
of inoculum, this speed rate is steady even if the concentration of the inoculum
gets higher however the former gets lower than 5°D/h if the concentration
deceases to less than 2%. The fall of velocity of the pH was about 0.35Unit per
hour for Ma2 strain.
In order to follow the kinetics of growth on milk medium and M17 synthetic
medium Dudley and Steele (2001) used an inoculum of 1% and in order to
study the kinetic of caseins degradation (Herreros et al. 2003), which is going
to be in relation with the strain used. Demarigny et al. (1994) obtained a
maximum pH rate which varied between 0.34 and 0.51Unit of pH/h using the
same concentration of inoculum 1%. Kinetic of acidity for 12 strains varied
between 0.75 and 3.5°D per hour, and pH decreases from 0.03 to 0.14Unit of
pH per hour, final dornic acidity and pH were of 35°D and 4.63 in strains LcX1
respectively.
Strain Ma2 produced a velocity of acidity of 8°D/h and a varied velocity of pH
of 0.28 Unit of pH/h, the maximum rate of the produced acidity is 51°D with a
final pH of 4.29. Juillard et al. (1995) obtained a final pH of 4.5 after 9 hours of
growth for Lactococcus lactis which is identical to Ma2 (diacetylactis). strain
used in this work. Lactococcus lactis subsp. cremoris studied by Ruas-Madiedo
et al. (2005) achieved a final pH of 4.4 on milk medium. Ma2 strain had
showed both good kinetic acidity and growth on milk medium.
La38 is a weak proteolytic strain which is characterised by a weak pH variation
in relation with a weak dornic acidity evolution. Maximal velocities for pH and
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
110
acidity are of 0.0475Unit of pH per hour and 3.75°D/h, and a final value of pH
24°D was achieved after 24hours of incubation.
Growth Kinetic in mixed culture
Lactococcus lactis (Ma2) and Leuconostoc mesenteroides (19D) strains have
produced on a pure culture (5% of inoculum) a final acidity of 56 and 46°D
respectively. On the mixed culture, the dornic acidity remained stable and
identical to the one produced by Lactococcus lactis (56°D) (Fig. 2). pH variations
followed the same speed of dornic acidity in pure and mixed culture on milk
medium. Ma2 and 19D strains produced maximum velocity of 0.32, 0.33 and
0.32 in pure and mixed cultures respectively. Moreover, maximum velocities
obtained for the variation of dornic acidity is of 7°D/h for Ma2 strain and 5°D
for 19D strains in mixed culture.
Curve obtained for the weak proteolytic strains were characterized by a weak
velocity of milk acidity; however, the inverse was obtained with the proteolytic
strains. In the mixed culture, samples that have been studied did not show any
relation neither with synergy or antagonism.
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
111
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
0 4 8 12 16 20 24
Time (h)
pH
19D Ma2 19D+Ma2
0
10
20
30
40
50
60
0 4 8 12 16 20 24
Time (h)
°D
19D Ma2 19D+Ma2
Fig. 2 Kinetics of pH and dornic acidity evolution in pure and mixed culture on
skimmed milk
In milk medium, the kinetics showed that the pure cultures of Leuconostoc
mesenteroides (19D) and Lactococcus lactis (Ma2) have a growth rate of 0.49 h-1
and 0.12 h-1 respectively; however, it is slightly higher (0.53h-1) in the mixed
culture (Fig 3). In MRS or M17 medium, this rate is practically identical in
Leuconostoc mesenteroides species due to the richness of the medium with
nutritive elements (Courtin et al. 2002).
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
112
6
7
8
9
10
11
0 4 8 12 16 20 24
Time (h)
Gro
wth
Lo
gcfu
/ml
Ma2 19D 19D+Ma2
Fig. 3: Kinetics of growth of the 19D and Ma2 strains in pure culture and
mixed culture
The same rate (0.24 h-1 to 0.4 h-1) was obtained with Bifidobacterium species
which are originally from human, cultivated in skimmed milk medium (Hadadji
et al. 2005), and also with Lacctococcus sp. (0,32 h-1to 0,48 h-1) (Chambellon
and Yvon 2003).
We have noted a different behaviour within the chosen species, while
exponential phase for both, pure culture of Leuconostoc mesenteroides and the
mixed culture (19D and Ma2), is accelerated between 2 and 6 hours of
incubation and this is due to the effect of citrate on the stimulation of
Leuconostoc mesenteroides species (Kihal et al. 1996). Lactococcus lactis
subsp. lactis biovar. diacetylactis culture had presented a regular growth whilst
the exponential phase is not accelerated.
Kinetic growth on M17 casein medium
Hence La38 strain hardly bear casein (rate of 0.564 h-1 ) the Ma2 strain had
developed rapidly (rate of 1.162 h-1). Lactococcus strain’s behaviour towards
casein (Juillard et al. 1998; Parra et al. 1999) can be referred to the cell wall
bound protease which is responsible for casein degradation into amino acids
and peptides (Flambard et al. 1998). In addition, the rapid development for
Ma2 strain in the presence of caseins is due to its enzymatic equipment.
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
113
Dosage of residual casein
The Velocity average of the consumption of casein (90mg/h) by Lactococcus
lactis subsp. lactis biovar diacetylactis (Ma2) is three times higher than the one
consumed by Lactococcus lactis subsp. lactis (La38) (23.3 mg/h). Final
concentrations of casein residues are 0.1g/l and 0.54g/l in Ma2 and La38
strains respectively, which is identical to other studies (Huggins et Sandine
1984).
0
0.5
1
1.5
2
0 1 2 3 4
Time (h)
Do
60
0n
m
La38 Ma2
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 1 2 3 4
Time (h)
Casein
g/l
La38 Ma2
Fig. 4: Growth of La38 and Ma2 strains on M17 casein broth medium
incubated at 30°C
CONCLUSION
The effect of culture media on hydrolysis zones of casein by Lactococcus chosen
species is weak; however skimmed milk concentrations had a remarkable
influence.
Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats
114
The majority of strains (more than 60%) produced hydrolysis zones of 5mm to
10mm of diameter. The proportion of Lactococcus lactis species which posses
hydrolysis zones superior than 10mm was inferior than 10%. Among strongly
proteolytic strain, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis strain
gave a velocity of acidity of 8°D/h and a varied pH velocity of 0.28Unit of pH/h
and the final pH was 4.29.
Leuconostoc mesenteroides and Lactococcus lactis had growth rate of 0.49 h-1
and 0.12 h-1 in pure culture of milk media, however, their growth was a bit
higher (0.53 h-1) in mixed culture.
The growth of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis and the
slightly proteolytic strain Lactococcus lactis subsp. lactis on M17 casein
medium, have showed that the first strain developed rapidly with a rate of
1.162 h-1; however, it was weak in the case of the second strain (0.564 h-1)
(Demarigny et al., 1994).
The results obtained suggest that lactic acid bacteria found in goat’s raw milk
can be used in dairy industry by their proteolytic and acidifying activities. Our
results have also shown that a rich source of strain variability exists in the
proteoltytic activities. Goats’ milk may, therefore, constitute a source of strains
with physiological properties of biotechnological interest.
Further studies should be directed on the identification and characterization of
the peptides that are accumulated in the milk after the various strains
application which play an important role in the proteolytic enzymes activities.
The choose of used strain could be an instrumental knowledge in the
improvement of the organoleptic quality of fermented dairy products.
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Discussion générale
118
4. Discussion générale
Notre présente étude sur la microflore lactique du lait cru de chèvre a
permis d’isoler, de caractériser, et d’identifier 206 souches de bactéries
lactiques réparties essentiellement entre de lactocoques (Lc. lactis subsp.
lactis (35 souches), Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, (39 souches),
Lc. lactis subsp. cremoris (14 souches), de streptocoques (Sc. Thermophilus 17
souches), de leuconostocs (Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides 8 souches,
Ln. mesenteroides subsp. cremoris 2 souches), et de lactobacilles (Lb. plantarum
9 souches, Lb. casei 7 souches, Lb. curvatus 23 souches, Lb. rhamnosus 10
souches, Lb. paracasei 4 souches, Lb. acidophilus 2 souches, Lb. helviticus 10
souches, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, 5 souches, Lb. delbrueckii ssp. lactis 3
souches, Lb. brevis 5 souches, Lb. reuteri 9 souches et Lb. fermentum 4
souches).
Les espèces de bactéries lactiques détectées dépendent essentiellement de la
nature du produit et des conditions de culture. L’analyse de 35 produits laitiers
traditionnels dont des fromages est effectuée et 4379 isolats ont été
caractérisés. La flore dominante est représentée par les lactocoques à 38%. Les
lactobacilles thermophiles ne représente que 9% (Cogan et al., 1997). Une
étude récente sur la flore lactique du fromage artisanal en Egypte menée par
Ayad et al., (2006), montre une flore equilibrée représenté par les lactocoques
(Lactococcus lactis subsp. lactis et cremoris) et les lactobacilles. A partir du
cheddar, la caractérisation phénotypique et génotypique de la microflore
lactique a permis de recenser les espèces dominantes de Lb. paracasei, de Lb.
plantarum, de Lb. curvatus, et de Lb. brevis (Fitzsimmons et al., 1999); alors
que pour Bissonnette et al., (Bissonnette et al., 2000), l'espèce dominante du
même fromage était Lc. lactis subsp. cremoris. Les espèces de bactéries
Discussion générale
119
lactiques dominantes des levains artisanaux appartiennent à Lb. plantarum,
Lb. curvatus, et Lb. brevis (Lopez et Mayo, 1997). Dans l’étude de Medina et al.,
(2001), les enterocoques était la flore dominante avec 48 % et les lactobacilles
avec 30%. En revanche les lactocoque représentent que 14% et moindre les
leuconostocs avec 9%. La caractérisation des bactéries lactiques d’un fromage
mexicain révèle que les lactocoques étaient la flore dominante avec
Enterococcus faecium et Lactobacillus casei (Torres-Llanes et al., 2006).
Dans les produits carnés, Hugas et al., (1993) ont trouvé que
Lactobacillus plantarum représente 8 % des lactobacilles isolées et l'espèce
dominante était Lactobacillus sake avec 55 %; en revanche, Rovira et al., [1997]
trouvèrent Lactobacillus plantarum l'espèce dominante de la flore lactique
isolée. Samelis et al., (1994) ont montré une grande diversité de cette flore
lactique lors de l’analyse de 348 souches isolées à partir des produits de
charcuterie en particulier du salami fermenté, qui sera réparti en deux grands
groupes, des lactobacilles et des leuconostoques ( ou Weissella). Les espèces
de bactéries lactiques présentes dans le poisson, ce sont Lc. lactis subsp. lactis
et Ln. citreum, pour le riz bouilli c’est l’espèces de Lb. paracasei qui domine
[Bouton et al.,1998 ; Paludan-Muller et al., 1999].
Dans les produits végétaux tels que le sorgho, les espèces de bactéries
lactiques dominantes appartiennent aux lactobacilles (Lactobacillus plantarum
34.7 %, Lactobacillus sake-Lactobacillus curvatus 15 %), aux leuconostocs
(Leuconostoc mesenteroides 28.2 %) et aux pédiocoques (Pediococcus
pentosaceus 10.2 % et Pediococcus acidilactici 7.8 %); par contre les
lactocoques ne représentent que 4 % [Kunene et al., 2000]. Les bactéries
lactiques isolées des pousses de luzerne ont été aussi investies dans le but de
limiter les dégâts produits par des bactéries pathogènes. Les bactéries
Discussion générale
120
représentatives sont Lactococcus lactis subsp. lactis et Pediococcus acidilactici
(Wilderdyke et al., 2004).
Quatre souches La11, Ma1, Ma2, et Ma27 ont présenté une activité
protéolytique qui a augmenté sur les trois concentrations en lait écrémé
examinées et également sur le milieu PCA et YMA. Les concentrations de lait
écrémé utilisées en milieu PCA donne des zones d’hydrolyse tandis qu'on
observait une différence significative entre la présence des concentrations 1%
et 4% en lait écrémé. Cependant, la protéolyse était fortement significative en
présence de 1% et de 2% de lait écrémé. Sur le milieu YMA, la différence était
fortement significative entre 1% et les deux autres concentrations de lait
écrémé, ceci qui montre que la concentration de 1% de lait écrémé est une
concentration optimale pour la détection de l'activité protéolytique des souches
de bactéries lactiques. En plus, le milieu FSDA, permet de détecter à la fois
l’activité protéolytique et l'utilisation du lactose par la production de l’acide
lactique. La plupart des souches testées ont montré des zones d’hydrolyse
visible avec des diamètres variant entre 1,5 mm et 11.5 mm en présence de
1% de lait écrémé. Cependant, les souches produisant des zones d'hydrolyse
supérieures ou égale à 10 mm sont réparties comme suit : 15.38% sur FSDA,
3.7% sur milieu PCA et 7.4% sur milieu YMA. Par conséquent, de ces
observations nous pouvons postuler que le milieu FSDA est le plus favorable
pour détecter les bactéries protéolytiques. D'ailleurs, le diamètre de la zone de
protéolyse supérieure à 10 mm a été observé dans 7.5% des souches sur le
milieu YMA et elle a atteint 15.38% sur le milieu FSDA et ceci a mené à
différencier entre des souches lactiques fortement et légèrement protéolytiques
(Huggins et Sandine 1984, Wehrle et al., 1999).
L'acidité produite par la souche Lc8 en milieu lait est évaluée par la
quantité d'acide lactique libérée et exprimée en degré Dornic. Une production
d'acide lactique de 17 °D après 6 h et 35 °D après 8 h de culture. La
production a augmenté pour atteindre le 40 °D après 24 h de culture. Le pH
final est environ 4.64 à 8 h et d’environ 4.36 après 24 h d'incubation.
L'inhibition des micro-organismes pathogènes et la flore de
contamination des aliments sont un souci important en ce qui concerne la
transformation des produits alimentaires. Les micro-organismes pathogènes
d'importance particulière en produits laitiers, incluent Listeria monocytogenes,
Discussion générale
121
Staphylococcus aureus. Cette dernière est l'un des micro-organismes les plus
problématiques présents dans le lait cru. Si l’animal présente une mammite,
un grand nombre de micro-organismes indésirables contamine le lait (De Vries,
1975) et par conséquent constituent une partie importante de la flore du lait
cru et de ses produits tels que des fromages de ferme. Un total de 96 isolats
bactériens avec des effets antagoniques sur Staphylococcus aureus a été
detecté. Dans la plupart des cas l'effet antagonique était dû à une diminution
du pH, résultante de la production d’acides organiques. Les extraits de culture
de deux souches se sont avérés actifs contre Staphylococcus aureus par l'action
de substances antibactériennes autres que les acides organiques. Ces souches
bactériennes appartenaient à Lactococcus lactis subsp. lactis (Lc7) et
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis (Lc8). La souche Lc8 s'est
avéré de loin la plus efficace, avec une activité d'extrait de culture de 14.025
AU/ml (unités arbitraires). Des résultats semblables ont été obtenus par Geis
et al., (1983), qui ont examiné 93 souches de Lactococcus lactis subsp. cremoris
et ont constaté que 36 souches ont montré des effets antagoniques sur milieu
solide, mais seulement une seule espèce produit une substance
antibactérienne dans le milieu liquide. En outre Schillinger et Lucke (1989) ont
trouvé seulement une souche exprimant une action antibactérienne dans le
milieu liquide sur 221 isolats étudiés. Noonpakdee et al., (2003), ont isolés
14020 isolats de bactéries lactiques dans lesquels seulement une souche était
capable d'inhiber Staphylococcus aureus. La souche Lc8 a montré des
possibilités élevées, empêchant ainsi la croissance de Staphylococcus aureus.
Vaughan et al., (1994), démontrent les capacités des bactéries lactiques isolées
du lait cru à inhiber la croissance de Staphylococcus aureus. La substance
anti-staphylococcus contenue dans l'extrait de culture de la souche Lc8 n’a pas
été inactivée en présence de la catalase, qui exclue une inhibition par le
peroxyde d'hydrogène. En revanche, elle a été inactivée par la trypsine. En fait
bien que l'extrait initial de culture ait produit une zone d'inhibition de 10 mm
de diamètre dans la culture de Staphylococcus aureus. Après traitement,
aucune zone d'inhibition n'a été détectée. Par contre aucun changement de
l’activité antimicrobienne n'a été observé quand il a été traité avec de l'α-
amylase. La substance antibactérienne est, donc, une substance de nature
protéique. Du fait, qu’aucun changement n’a été décelé après traitement avec
Discussion générale
122
de l'α-amylase, il peut impliquer qu'aucune partie d'hydrate de carbone n'est
essentielle pour l'activité de cette substance (Jack et Jung, 2000). Pour évaluer
la stabilité à la chaleur de cette substance anti-staphylococcus, Le surnageant
de la culture a été traité par différentes température 80°C, 100°C, 110°C, et
120°C. Il n'y avait aucune réduction remarquable de l'activité antibactérienne
après chauffage à 80°C pendant 30 minutes.
La croissance de Staphylococcus aureus en culture mixte avec la souche
a été évaluée sur milieu lait. Après 4 h d’incubation la croissance de
Staphylococcus aureus commence à diminuer est était de 0,2 Log cfu. Cette
décroissance continue est atteinte 0,8 Log cfu après 24 h d’incubation. A 48 h
de temps d’incubation le nombre de cfu de Staphylococcus aureus était
inférieur à 10 cellules.
L'addition du surnageant de culture concentré de la souche Lc8 et traiter
avec 1mg/ml d’α-chymotrypsin pendant 1h à 37 °C à une culture de
Staphylococcus aureus en milieu TSB a eu comme conséquence une
inactivation rapide des cellule de Staphylococcus aureus; Le nombre de cellules
viables par millilitre diminuées de 6,7 Log cfu après 8 heures d'incubation et
en-dessous de 500 cellules par ml après 24 heures. En revanche, aucune
croissance n’a été décelée après 48 h d’incubation. Par contre, la culture de
Staphylococcus aureus en culture pure est restée inchanger. Ces résultats
indiquent un mode bactéricide de l'action du composé antibactérien. Le mode
bactéricide de l'action et la nature protéique de cette substance sont des
caractéristiques typiques de bactériocine (Tagg et al., 1976). Des résultats
semblables ont été rapportés par Galvin et al., (1999) qui ont constaté que
Lactococcus lactis subsp. lactis DPC3147 était active contre Staphylococcus
aureus., le nombre de cellule est considérablement réduit après 2 h
d’incubation. Otero et Nader-Macías (2006) ont constaté l’inhibition de
Staphylococcus aureus par l’H202 produit par Lactobacillus gasseri ; ceci mis en
évidence l’effet combiné dû H202 et de la bactériocine produite par cete souche.
Nous notons la double action de Lc8 par la production d’acide et/ou une
production de substance antimicrobienne (bacteriocin-like). L'acidité est la
première étape dans la production de fromage pour atteindre le pH approprié
pour former un lait caillé. L'acidité et la production de bactériocine jouent
Discussion générale
123
ensemble un rôle important en production fromagère comme décrit par Ryan et
al., (1996). L'inhibition de Staphylococcus aureus par la souche Lc8 est dû à la
production de substances antibactérienne cependant l’acidité produite joue un
rôle combiné dans cette inhibition. Des résultats semblables ont été rapportés
par Noonpakdee et al., (2003) qui ont isolé un nombre considérable de
bactéries lactiques à partir des produits de charcuterie et ont constaté que
seulement une souche était capable de ramener le pH en quelque sorte
semblable à notre conclusion.
Conclusion générale
124
5. Conclusion générale
Les bactéries lactiques isolées du lait cru de chèvre possèdent des
potentialités très intéressantes et très variées, non seulement par leur capacité
à se développer dans le lait avec une croissance lente et d’autre avec une
croissance rapide qui est due surtout à la présence des enzymes protéolytiques
capables de fournir les acides aminés essentiels à leur croissance. Les souches
aromatiques sont bien représentées. La détection de l’activité protéolytique sur
milieu solide, a été optimisée par l’usage de 2 % de lait écrémé. La technique
permet de déceler non seulement les souches fortement protéolytiques mais
aussi les souches faiblement protéolytiques ainsi que les activités
intermédiaires.
La confrontation de 256 souches de bactéries lactiques sur milieu solide
révèle la présence de souches productrices de substances antimicrobiennes (%
des souches). La nature et la composition de l’agent inhibiteur a été
déterminée, ce qui nous a encouragé à déterminer le spectre d’activité sur les
germes impliquées dans les intoxications alimentaires. La cinétique de
croissance de Staphylococcus aureus a été évaluée en culture pure et en
culture mixte dans le milieu naturel le lait en présence des souches
productrices de substances antimicrobiennes (bacteriocin-like).
Ce travail nous a permet de détecter plusieurs souches de bactéries
lactiques capable d’inhiber Staphylococcus aureus en milieu lait. L’un des
intérêts de recherche actuelle sur les bactéries lactiques est de développer une
stratégie permettant de contrôler et de limiter la croissance des germes
indésirables par les potentialités des bactéries lactiques qui sont capable
d’assurer une qualité hygiénique désirable des produits alimentaires. Le
Conclusion générale
125
développement d’un levain spécifique doter d’un pouvoir bio-conservateur
permet d’augmenter la durée de conservation des produits alimentaires et
d’assurer une qualité hygiénique suffisante par l’élimination des germes
indésirable. L’exemple dans cette étude, des interactions entre les souches de
bactéries lactiques locales et Staphylococcus aureus nous amène à une
possibilité de développer un levain possédant ces caractéristiques préventives.
126
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