initiation aux bonnes pratiques de laboratoire

Initiation aux Bonnes Pratiques de Laboratoire

Pr C. PASQUIER - 2008UFR Pharmacie - Microbiologie

CHU Toulouse - VirologieINSERM U563

UE Stage M1 Janvier 2008

Objectifs pédagogiques

• Connaître les principales règles d’hygiène et de sécurité

• Prendre en compte les risques dans l’établissement des protocoles techniques (prévention)

• Réagir correctement en cas d’exposition à un risque

Objectifs pratiques

• Se protéger• Protéger les autres• Protéger l’environnement• Protéger la qualité des manipulations

• Respecter les réglementations

Les risques ?

• Liés à l’environnement de travail– Température, bruit, lumière, incendie,…

• Liés aux manipulations et produits manipulés– Risque biologique, toxique, radioactivité, animaux,

…• Liés aux comportements humains

– absence de communication, non respect des règles, ….

Les différents risques

• Biologiques• Chimiques• Radioactivité• Froid• Divers: gaz, électricité, incendie, accident,

• Identification / prévention / CAT si exposition

Evaluation des risques

• Présent ou absent• Quantifier et localiser• Proposer des réponses adaptées

– Supprimer– Réduire l’exposition (durée, intensité)– CAT en cas d’exposition– Contrôler les conséquences éventuelles

Principes de prévention

Quatre grands principes de prévention : évaluation du risque, élimination du risque, protection collective et protection individuelle (Source www.inrs.fr)

Votre arrivée au laboratoire• Votre encadrant (interlocuteur N°1)• Le responsable hygiène et sécurité

(informations et conseils)• Le Directeur du laboratoire (responsabilité)

Visite du laboratoire• Accès - Sorties de secours • Extincteurs - plan d’évacuation - douches

sécurité - rince yeux - salle premier soins• Espaces tertiaires - vestiaires - techniques• Localisation des risques (signalétique)

Signalétique

• Sas zone BM3

• Risques Toxique et infectieux

Signalétique des sas

Vos facteurs de risquesSignaler tout facteur de risque !

• Immunodépression• Allergie• Asthme• Risque de perte de conscience (épilepsie,

diabète, …)• Grossesse• Blessure ou plaie (à couvrir)

Risque Biologique

QuickTime™ et undécompresseur

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Définition

Les risques biologiques résultent de la manipulation de: - Microorganisme pathogène (bactérie, virus, champignon, parasite)- ATNC- Lignée cellulaire immortalisée- Organisme génétiquement modifié (OGM)

qui sont susceptibles de provoquer une infection / infestation, une allergie, une toxi-infection, l’implantation d’une tumeur

Manuel de sécurité biologique en laboratoire, OMS 2005

Facteurs de risqueQuickTime™ et undécompresseur

- Portes d’entrée- Hôte / Prédisposition

= chaîne de transmission

- Porte de sortie- Réservoir d’agent biologique

- Transmission

TransmissionsQuickTime™ et undécompresseur

Inhalation (toux, poussières, aérosols)

Contact avec la peau ou les muqueuses (projection, manipulation)

Inoculation (piqûre, coupure, morsure)

Ingestion (main à la bouche, manger, fumer)

Groupes de risqueQuickTime™ et undécompresseur

Directive 93/88/CEE, arrêté du 18/7/94, arrêté du 17/4/97, directive 97/59/CE, arrêté du 30/6/98)

RisqueIndividuFaible/nul

Modéré

Important

CollectivitéFaible/nul

Faible

Important

Pas de maladie sf terrain

Traitement et prévention

Maladie grave,Traitement et/ou prévention

Maladie grave, transmissiblePas traitement/prévention

Bacillus subtilis, E.coli non patho, …

Staphylococcus aureus, Aspergillus fumigatus,CMV, …

Mycobacterium tuberculosis, HIV, ATNC, …

Variole, Ebola, Crimée-Congo, …

OGMQuickTime™ et undécompresseur

(Directive 90-219, Circulaire du 16/4/96, arrêté du 28/8/96, décret 30/5/97, décret du 8/1/98)

Evaluation Organisme donneurHôte receveurVecteurADN recombiné

Groupe I Classe 1 Pas de risque (Homme,animaux, plantes et environnement)

Groupe II Classes risque croissant2 à 4

= Agréments spécifiques

Maîtrise du risqueQuickTime™ et undécompresseur

• Bonnes pratiques de laboratoire

• Agir sur la source de l’infection (réservoir)• Agir sur le mode de transmission• Agir sur les expositions potentielles

(procédures d’hygiène et de travail)

Précautions universelles

ManipulateurQuickTime™ et undécompresseur

• Vaccinations

• Tenue et hygiène

• Lavage ou désinfection des mains

VaccinationsQuickTime™ et undécompresseur

• Première mesure préventive

• Vaccinations systématiques

• Vaccinations supplémentaires ou adaptées aux risques

• Médecine préventive / responsabilité

Calendrier vaccinal 2007, BEH 31-32, www.invs.sante.fr

(Code santé publique, art L10, arrêté du 153/91, arrêtés du 6/3/07)

VaccinsQuickTime™ et undécompresseur

VACCINATION(corps de sant�)

RAPPELS

Tuberculose Obligatoire (IDR)

Dipht�rie Obligatoire Tous les 10 ans

T�tanos Obligatoire Tous les 10 ans

Poliomy�lite Obligatoire Tous les 10 ans

H�patite B Obligatoire S�rologie

Fi�vres typho•des Pr�conis�e Tous les 3 ans

Rub�ole Pr�conis�e

Grippe Pr�conis�e

(Code santé publique, art L10, arrêté du 153/91, arrêtés du 6/3/07)

Tenue de travailQuickTime™ et undécompresseur

• Blouse personnelle – Ininflammable (coton) – Manches longues– Propre (blanchisserie du labo, pas à la maison)– Laissée dans les espaces techniques

• Vêtements de villes et effets personnels (sacs, portable, …) dans le vestiaire (ou bureau)

• En fonction du risque: tenue spécifique adaptée(ex pyjama + blouse)

Différentes tenues

BM3 BSL3BSL2

Hygiène individuelleQuickTime™ et undécompresseur

• Hygiène des mains– Ongles courts, sans vernis– Pas de bague, bijou, bracelet, montre au poignet– Lavage simple des mains

• Avant et après le port des gants• Après tout geste potentiellement contaminant• Aux entrées et sorties des espaces techniques• Avant de manger, boire, fumer• Avant et après être allé aux toilettes

• Cheveux courts ou attachés• Interdiction de boire, manger, fumer (ou de porter

quelque chose à la bouche ou au visage) dans les espaces techniques. Pas de nourriture ou boisson.

Lavage des mainsQuickTime™ et undécompresseur

• Lavage simple– Mouiller les mains et poignets– Appliquer une dose de savon– Savonner 30s– Rincer abondamment– Sécher avec du papier à usage unique– Fermer le robinet avec le papier (sf si

automatique)– Jeter le papier usagé

• Friction avec solution hydro-alcoolique

• Lavage chirurgical• Désinfection des mains

GantsQuickTime™ et undécompresseur

• Gants en latex (non poudrés)– Toute manipulation à risque biologique– Manipulation de biologie moléculaire (RNAse)– Gants poudrés en 2nde paire (BSL3)

• Gants en vinyles– Allergie au latex

• Gants en nitriles– Manipulation BET, SYBR green

• Gants pour congélateurs• Gants de ménage

Port des gantsQuickTime™ et undécompresseur

• Obligatoire pour toute manipulation de matériel biologique– À la fin de chaque manipulation les retirer

• Quand les changer ?– Dés qu’ils sont endommagés ou souillés– Après toute manipulation sous PSM

• Ils ne doivent pas servir de vecteur de contamination – Poignées de portes– Circulation dans les couloirs– Téléphone– Clavier d’ordinateur

Autres matériels de protection

• Lunettes de protection– En cas de risque de projection ou d’aérosols– Se porte par dessus les lunettes de vue

• Masques de protection– Normes FFP1 à 3 (différent des masques antiprojections)– En cas de risque d’aérosols ou transmission aérienne

• Pyjama, surblouse, surchaussure, calot, sabot, visière, …

Postes de Sécurité Microbiologique - PSM

PSM : Hotte à flux laminaire, safety cabinet

• Protection du manipulateur

• Protection de l’environnement

• Protection du matériel manipulé

Nécessite :- matériel propre, entretenu et contrôlé- conditions d’utilisation correctes- manipulations correctes

Protection dumanipulateur

Pas de protectiondu produit

Protection del’atmosphère

PSM type IQuickTime™ et undécompresseur

Protectiondu produit

PSM type IIQuickTime™ et undécompresseur

Protectiondu produit

PSM type IIIQuickTime™ et undécompresseur

Manipulation Sous PSM-II

Maintien du caractère laminaire du flux

• Flux en fonction depuis > 15 min• Débuté les manipulations 1 min après entrée des bras

Plan de travail dégagé et préparé (pipettes, embouts, poubelle, vortex, pipetaid, …) - pas de source de chaleur

• Mouvements de bras anticipés pour être minimaux et précis

• Mouvements lents, pas au dessus du matériel• Décontamination du plan de travail et matériels sortis• Enlever les gants après manipulation

MatérielQuickTime™ et undécompresseur

• Matériel à usage unique– Tubes, pipettes, bouchons, …– Jeter dans poubelle à risque biologique (Déchets d’Activité de

Soins à Risques Infectieux - DASRI)

• Matériel réutilisable– Nettoyage, décontamination, stérilisation

Filières différentes

SurfacesQuickTime™ et undécompresseur

• Rangement – Le moins de matériels possible sur paillasse– Facilite le nettoyage et désinfection– Limite l’empoussièrement

• Nettoyage – Fréquent

• Désinfection– Régulière

• Lisses, non poreuses, sans joint, résistantes aux désinfectants

Niveaux de confinementQuickTime™ et undécompresseur

• Réglementation– Enceinte du laboratoire– Équipements obligatoires– Organisation précise

• Contrôles – AFSSAPS (Agence Française de Sécurité Sanitaire des produits de

Santé)

• Imposés par le groupe à risque des agents / OGM– NSBL 1 à 4 (L1 à L4)– NSBA 1 à 4 (animalerie A1 à A4)

Confinement L1QuickTime™ et undécompresseur

Locaux Isolé par une porte et des fenêtres ferméesPaillasses, murs et sols lisses et facilement lavables

Matériel Autoclave dans le bâtiment (optionnel)

Pratiques Vêtements de protectionPaillasses propres et rangées

Manipulation d’agent du groupe 1

Locaux Accès réglementé pour les personnes autoriséesLavabos à commandes non manuellesStockage des agents biologiques en lieu sûr

(arrêté du 16/7/07)

(la majorité des labos)

Matériel Autoclave dans le bâtimentPostes de Sécurité Microbiologique IICentrifugeuses sécuriséesPratiques Vêtements de protection (rangement)Décontamination matériel/déchets,Containers spécifiquesMinimisation formation aérosols

Laboratoire L2

Locaux L2 + 2 sas, oculus. Fermeture hermétiqueFiltration de l’air (entrant) et sortant, P° négative (alarme).(Douche pour décontamination)

(3 à TOULOUSE)

Matériel Autoclave dans le laboratoire à double entréePostes de Sécurité Microbiologique type IICentrifugeuses sécuriséesPratiques L2 + surbottes et surblouses. Gants x 2Inactivation des effluents des éviers et des douches

Autoclave double entrée

Laboratoire L3

Locaux L3 + double sas. Douche obligatoire.Double filtre HEPA (air sortant).Ventilation-électricité secourue. Interphone obligatoire

Matériel L3 +Postes de Sécurité Microbiologique type III

PratiquesL3 + scaphandre

(Mérieux - LYON)

Laboratoires L 4

Limiter les aérosols• Circonstances de génération

– Centrifugation– Vortex– Va et vient à la pipette

Prévention• Matériels propres, entretenus et contrôlés • Vérifier cuve centrifugeuse (stylo), équilibrage• Fermer tubes, plots et couvercles• Utiliser tubes plastiques• Vortex et va et vient à la pipette sous PSM

En cas d’exposition

• Nettoyage et décontamination immédiate• Prévenir immédiatement un responsable

(encadrant, RHS, chef) pour mesures complémentaires

• Déclaration d’accident et mise en place d’un suivi médical

• Si Accident d’Exposition au Sang (AES)– Appel au SMIT (risque HIV)

Décontamination

• Autoclavage• Universel : Glutaraldéhyde, Hypochlorite

de sodium, formol• Détergent désinfectant

• Désinfectant :– Eau de javel 1,2°Cl– Alcool 70°C

Gestion des déchêtsTrier les déchets

OM DASRI Chimiques Radioactifs

sont requis pour visionner cette image.QuickTime™ et undécompresseur

Conditionnement spécifique Identification producteur et du risque

Elimination par filière spécifique (prestataire)Traçabilité obligatoire jusqu’à destruction

Déchêts biologiquesQuickTime™ et undécompresseur

Solide - LiquideNon coupant

Solide - Liquidecoupant

Matériel réutilisable

Nettoyageautoclavage

Déchêts à risque infectieux

Déchêts toxiques

Risque Chimique

DéfinitionQuickTime™ et undécompresseur

INDICATIONS de PRODUITS DANGEREUXÊ:

Identification

• Logo sur chaque emballage primaire– Le reprendre en cas d’emballage secondaire– Associé à des phrases R et S

• R explicite le risque (ex R25: toxique en cas d’ingestion)• S explicite les conseils de sécurité (ex S9: conserver le

récipient dans un endroit bien ventilé)– Obligation du fournisseur de donner une FDS

• Fiche de données de sécurité précisant composition, risque, précaution d’usage, d’élimination et CAT en cas d’exposition

Vous devez connaître le risque des produits que vous manipulez ou présents dans les pièces ou vous manipulez

Armoire à toxique et SPS

Stockage

• Armoire verrouillée et ventilée pour les solvants• Armoire verrouillée pour les toxiques • Armoire pour les chimiques

• Balisage du risque• Quantité minimale pour utilisation quotidienne

(hebdomadaire) dans les labos• Liste à jour des toxiques (quantité, localisation

par pièce)

Quelques précautions• Port de gants adéquats• Manipulation des acides et des bases: Lunettes + gants,

toujours verser l’acide dans l’eau• Renseignez vous toujours sur les interactions entre

produits en cas de mélange• Si nécessaire manipulation sous une sorbonne (aspiration

connectée sur l’extérieur) ou une hotte à filtre charbon (pas sous PSM!)

• Pas de solvant dans un congélateur ou réfrigérateur (ventilation nécessaire)

• Gants en nitrile (pas de latex pour BET), pas de NaOCl• INTEGRER les règles spécifiques dans les modes

opératoires

Adapter sa tenue

Tenue décontamination au HCl 0,1N

CAT• Dispersion de produits chimiques

– Baliser, évacuer, kit anti-dispersion, voir FDS, nettoyage et élimination

• Contact– Rincer immédiatement à l’eau (douche, rince-yeux), voir

FDS– Pas de javel sur BET– Contacter centre anti-poison ou SAMU (15)

Autres risques

Radioactivité• Risque d’irradiation et de contamination

– radioélément (ou de la source du rayonnement), – type de rayonnement – Dose manipulée et durée d’exposition

• Responsable radioprotection• Pièce spécifique pour la manipulation

• La manipulation nécessite une formation spécifique• Écran, masque et gants de protection• Condition de stockage avant et après élimination spécifique• Dosimètre

Froid• Azote liquide (-195°C) et carboglace (-57°C)

– Risque de brûlure (pas de contact ou gants spécifiques pour la carboglace - lunettes anti-projection)

– Aération (dégagement d’azote ou C02 pouvant conduire à des hypoxies) - locaux spécifiques

– Risque infectieux souvent associé

• Congélateurs (-140°C, -80°C, -20°C)– Risque de brûlure (gants spécifiques)

• Réfrigérateur et chambre froide (+4°C)– Vérifier que personne n’est enfermé dans la chambre froide

(ouverture intérieure obligatoire)

Gaz• Gaz de ville (méthane + tétrahydrotiophène)

– Risque de brûlure, d’incendie et d’explosion (pas de bec buzen, éteindre le gaz, vérifier la vanne de fermeture générale)

– Risque d’asphyxie

• CO2, N2, …– Risque d’asphyxie

• O2– Risque d’incendie et d’explosion (comburant)

Electricité• 220 V alternatif (ou supérieur)

– Risque de brûlure, d’incendie et d’électrocution (pas de prise multiple, pas de mains mouillées)

– Contrôles de installation obligatoire– Attention aux cuves d’électrophorèse! (et aux UV pour

les photos de gels : écran / masque /gants)

• Laser (FACS, Séquenceur, …)

• Champ magnétique

Incendie• Plan d’évacuation

– Guide et serre-file, ne pas utiliser d'ascenseur, lieu de rassemblement, refuge pour les PMR

– Exercices réguliers• Matériel de secours et prévention

– Couverture ininflammables, alarme, détecteur de fumer, portes coupe-feu

– Extincteurs (eau + additifs agissant par refroidissement, plus rarement CO2 pour les feux électriques et poudres pour les feux gaz agissant par étouffement) ou lance à incendie

Biologie Moléculaire

• Risque pour les manipulations– Pièce propre (réactifs) (BM1)– Pièce Pré-PCR (extraction, ADN, ARN)(BM2)– Pièce post-PCR (manipulation d’amplicons, plasmides)

avec sas en surpression (BM3)

• Prévention– Organisation et circulation des matériels et personnes– Respect des protocoles– Tenue adaptée– Hotte PCR– Décontamination (NaOCl, HCl)– Blancs, témoins négatif, Wipe-test, aliquotage

Personnes isoléeset accidents

• Ne travaillez jamais seul – Nécessité de pouvoir vous secourir– Toujours prévenir une personne de confiance (travail le

soir et les WE) - autorisation de votre encadrant– Bip (homme mort), vidéo-surveillance

• Ne jamais courir• Les couloirs doivent être dégagés et propres

• Couloir propre et dégagé

Couloir

Contrôles des accès• Accès restreints

– Ne pas diffuser clés, cartes ou codes– Ne pas pas faire visiter les zones à accès

restreint aux personnes non autorisées– Vérifier les fermetures

• Fenêtres fermées– Courants d’air diffusant micro-organismes et

toxiques– Intrusion d’animaux (oiseaux, rats) - lutte contre

les insectes et rongeurs

• Accès par carte personnelle

Accès restreint

Accès labo BSL3

Synthèse

• Tous concernés par la sécurité– Consulter les procédures et les référents– Poser des questions !– Réfléchissez avant d’agir (visualiser vos manipulations)

• Signaler tout incident ou anomalie

• Obligation de respecter les réglementations• Mise en place de système qualité (dispositif

d’amélioration continu)

Conclusion

• La qualité– Contrôler l’ensemble des processus d’un

laboratoire grâce à une traçabilité (gestes, formation du personnel, matériels, environnement de travail et organisation)

– Analyse des dysfonctionnements et des indicateurs choisis

– Amélioration continue et reconnaissance extérieure

• Certification (ISO) et accréditation (COFRAC)

Votre rapport

• Présenter votre laboratoire d’accueil– Encadrant, Responsable H&S, directeur du

labo– Installations spécifiques (BSL2, BSL3,

radioactivité, animalerie, …)– Dans votre Matériels et méthodes préciser vos

conditions de manipulations• Sous PSM II• Pièce post-PCR, • Préciser les produits toxiques et groupes des agents

que vous manipulez, …

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