ifremer b1bllotheque la trembladearchimer.ifremer.fr/doc/00411/52230/52957.pdf · l - introduction...
Post on 16-Sep-2018
217 Views
Preview:
TRANSCRIPT
•
UNIVERSITE D'AIX-ftARSEILLE II
Faculté des Sciences de Luminy
•••••••• IFREMER B1BLlOTHEQUE LA TREMBLADE
DIPLOftE D'ETUDES APPROFONDIES D'OCEANOLOGIE
ftISE AU POINT D'UN ftODELE EXPERIftENTAL
DE REPRODUCTION ET D'ETUDE DE LA BONAftIOSE,
ftALADIE HEftOCYTAIRE DE L'HUITRE PLATE OSTREA EDULIS
Mémoire présenté
par
Véronique BIGOT-VUILLEftIH
Septembre 1987
Laboratoire de Pathologie et de Génétique des Invertébrés Marins Station IFREMER, LA TREMBLADE (CHARENTES-MARITIMES) (
,
SOli Il AIR E
l - INTRODUCTION ....... .. . . . . .... . . . . . .... . ........ .
II - IIATER I ELS ET IIETHODES.... . .. . ...... ... ...... . .. . 5
1 - ORIGINE DES ANIIIAUX . ... .. . . .. .. .. . . ..... ... . 5
2 - TECHNIQUES D'ELEVAGE AU LABORATOIRE . . . .. .. . . 5
a . lla i ntien des animaux .. . . .. . .. .. . . ........ . 5
b.Paramètres physico-chimiques.. . . .. . . . . .. . . 6
c . Nourr i ture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3 - PURIFICATION DU PARASITE BONAIIIA OSTRE AE. .. . 7
a.Protocole... ..... .. ... . . .. . ... . . .. . ... . ... 7
b . Test de viabilité .. ... ... . . . .. . .. . . . ... . .. 8
c.T e st de contamination.. . ........ . . ..... .. . 8
d . Comptage des parasites . ... .. . . .. ... . . . .. . . 9
4 - PATHOLOGIE EXPERIIIENTALE.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
a . lnfection per os ... . . . . .. . . ..... ... . ..... . 10
b . Infection par inocula t ion ..... . . . .. . . .. . .. 10
5 - HISTOLOGIE. . . ...... . . .. . . . ... .. .... ..... . . . . 11
a.llicroscop i e photonique......... . ... . . . .... 11
b.llicroscopie électronique . .... .. .. ... . . . .. . 12
6 - IIIII UNODOSAGE . . . . • • • • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
III - RESULTATS. . ........ . .. . . ............ . . .. .... .. 14
1 - PURIFICATION DE BONAMIA OSTREAE... .. . . . . . . .. 14
a . Comparaison de méthodes de comptage.. . . . . . 14
b . Contamination bactérienne.... . ... . ... . . . . . 15
c . Intégrité ultrastructurale et viabilité . .. 16
d . Bilan des purifications.. ....... . ... . . .. .. 16
2 - INFECTION PER OS D'OSTREA EDULIS.. . . .. ..... . 17
3 - INFECTION EXPERIMENTALE PAR INOCULATION ... . . 17
a.Etude du développement de la maladie chez Ostrea edulis en fonction de la quantité inoculée de Bonamia ostreae . .. . . . 17
b.Cinétique de développement de la bonamiose . ............... .. .. . .. . . .. 20
4 - INFECTIONS EXPERIMENTALES DE DIFFERENTES ESPECES DE BIVALVES... . ...... . ... . . . . .. . .... 21
a.Crassostrea 9i9as... ......... . . . ... ... . . .. 21
b.Ruditapes Philippinarum.... . . . .. .. .... ... . 22
c.Pecten maximus. . ............... . .. . ... .... 22
IV - DISCUSSIONS - CONCLUSIONS..... . . .... .. . . .... .. . 23
V - BIBLIOGRAPHIE... ... . . . . ........ . .. . . ... ..... . . . 28
l - INTRODUCTION
L'ostréiculture est une a ctivit é traditionnelle dans plusieurs
régions du monde et son importance économique est primordiale en
aquacul ture. Cependa nt, des mortalités à caractère épizootique
affectent les élevages des principales espèces d'huîtres. Dans
à ces un grand nombre de cas , des agents pathogènes associés
mortalités ont été mis en évidence ( 4 ) ainsi, en Amérique du
Crassostrea virginica a subi plusieurs Nord , l'huître creuse ,
épizooties successives , dues d'abord au protozoaire Perkinsus
maximus (Apicomplexa) ( 1 2) , puis à deux haplosporidies Minchinia
costalis et M. nelsoni (Ascetospora) (21 , 11) en France, une
maladie virale a totalement décimé les populations d'huître
po r t u gai s eC ", ... r",a"-s"",s",o,-,s""",t""r",e",a"-__ ",a",n",g",u"""l .. a,,t,,,a ...
L'absence de
C.gigas a
ostréicole .
sens ibil i té
permis s on
à ce
él eva ge
entre 1 966 et
viru s de l'huître
et la relance de
1 9 71 ( 5) •
japonaise
l'économie
Ultérieurement , l'huître plate "O-"s,-,t~r,-"e .. a,---=e",d,-,u"-"-l-"i,",,,,s a s u b i à son t 0 u r
l'impact de maladies p a ra sitaires
protozoaire Marteilia refringens (3,10)
1970 des mortalités massives dans les
rendant pratiquement impossibles en
la première, due au
a provoqué à partir de
élevages d'huîtres,
zone intertidale.
les
Les
élevages en eaux profondes, non affectés par ce parasite ont été
à leur tour touchés par une autre maladie parasitaire, la
bonamiose .
L'agent responsable fut identifié en Bretagne en 1979, et décrit
sous le nom de Bonamia ostreae
d'un nouveau genre (17).
(Ascetospora), seul représentant
Ce protozoaire qui mesure en moyenne 3~m, se multiplie dans les
hémocytes de l'huître au sein d'une vacuole parasitophore. Les
effets cytopathiques sont importants et aboutissent à la mort de
la cellule hôte. Les parasites libérés dans l'hémolymphe vont
alors infecter d'autres hemocytes et contribuer ainsi au
développement de la maladie . Celle-ci se traduit d'un point de vue
anatomopathologique par des ulcérations branchiales et des
réactions inflammatoires dans les tissus conjonctifs. L'évolution
de la maladie est fatale, des mortalités importantes étant
observées dès le sixième mois. La transmission de la maladie
s'effectue tout au long de l'année probablement par contamination
directe avec des parasites provenant des cadavres d'huîtres
parasitées (4,9).
Cette maladie s'est depuis 1979 propagée rapidement à presque
toutes les zones d'élevage de Bretagne faisant chuter la production
de 80 à 90 % ( 9) • Actuellement et suite aux nombreux transferts
nationaux et internationa ux, la bonamiose affecte les principaux
centres ost r éicoles européens et a été récemment signalée chez la
même espèce sur la côte ouest des Etats-Unis (7). Enfin un parasite
similai re, associé à des mortalités massives d' Ostrea lutaria vient
d'être mis en évidence en Nouvelle-zélande (6).
Compte tenu de son extension à l'échelle mondiale et de son impact
sur les élevages d'huîtres, la bonamiose représente actuellement
2
l'aléa majeur allant à l'encontre des activités ostréicoles.
L'importance des enjeux économiques liés à cette maladie (13) a
conduit l'IFREMER à développer des recherches sur la bonamiose
afin d'élaborer des mesures
zootechniques indispensables pour
activité ostréicole.
prophylactiques
assurer la
zoosanitaires et
pérennité de cette
Un premier axe de travail entrepris par l'équipe de pathologie et
gé nétique des Invertébrés marins a consisté à la mise au point de
méthode d'immunodiagnostic permettant de développer une stratégie
de prophylaxie zoosanitaire efficace. Ainsi, des anticorps
monoc lonaux spécifiques ont été produits ( 1 5) et l'un d'eux,
couplé à une phosphatase alcaline a été utilisé pour mettre au
point un immunodiagnostic enzymatique (2).
Un deuxième axe de recherche concerne l'étude de la maladie et
des relations hôte-parasite.
Al' échelle de l'individu, il S'agit de préciser l'anatomo-
pathologie et la physiopathologie de la bonamiose, et d'analyser
les réactions immunitaires de l'hôte.
A l'échelle des populations d'huîtres O.edulis, il est important
d'estimer la sensibilité des animaux afin de pouvoir identifier,
éventu ellement, des races géographiques (1) ou des individus
présentant un caractère résistant à la maladie et susceptibles
de ce fait d'être utilisés dans un programme de sélection.
Parallèlement cette
sympat riques afin
bonamiose .
étude doit prendre en compte les espèces
de mieux cerner l'épid émio logie de la
3
Il apparaît que l'ensemble de ces recherches repose en grande
partie sur la reproduction expérimentale et la modélisation de la
maladie au laboratoire. Des essais antérieurs d'infe ction par
proxim ité (20) ou par inoculation de broyat d'huîtres parasitées
(18) on t été réussis mais ils présentaient un caract ère très
aléato ire quant à leur reproductibilité et leur efficience.
La mise au point récente
purif ication de B . ostreae ( 14)
des essa i s de reproduction
d'une méthode d'isolement et de
permet maintenan t d'entreprendre
dans des c o nditi o ns définies
notamment sur le nombre et la viabilité des parasi tes inoculés.
Dans le c adr e de mon stag e de DEA d'océano logie, je me suis
attachée initialement à me t tre au p oint les modalités
expérimentales de repr oduc ti on de la bonamiose.
J'ai pu ensuite aborder l a cinétique et la variabilit é individuelle
de développement de la maladie chez l'huître.
Enfin, j'ai che rché
d'autres espèces
hôtes réserv oi r s .
de
quelle était la sens ibi lité à B.ostreae
bivalves susceptibles de constituer des
4
II - MATERIELS ET METHODES
1 - ORIGINE DES ANIMAUX
Des huîtres plates O.edulis parasitées sont pêchées par
dragage dans la baie de Quiberon. Ce site est atteint par la
bonamiose, les taux d'infection variant entre 0 % et 30 % en
f onction de l ' âge et de la période (9).
De s huît r es plates saines âgées de 2 à 3 ans proviennent d e
l ' étang de Thau
B .o s trea e comme
cette populatio n est indemne du parasit e
l'attestent les examens histologiq u e s
effectués dans le cadre du suivi épidémiologique depuis
p lusieurs années.
Des huîtres creuses C.gigas (2ans) ont été récoltées dans des
él evages surélevés situés dans le bassin de Marennes -O lér o n.
Des palourdes Ru ditape s philippinarum (18 mois) ont ét é
prélevées sur parcs dans le bassin de Marennes-Oléron.
Le lot de coquilles Saint - Jacques Pecten maximus, originaire
de la baie de Saint Brieuc,
différents .
est composé d'individus d'âges
2 - TECHNIQUES D'ELEVAGE AU LABORATOIRE
a. Maintien des animaux
Les coquillages ,
maintenus dans
à raison de 30 par lot expérimental, sont
des ba cs cubiques (0.2 m2 de surface)
co ntenant environ 30 l d'eau de mer filtrée . Ces bacs sont
lavés trois fois par semaine à l'eau de mer (fig.1).
5
FIG.1 ." SALLE DE PATijOLOGIE EXPERIMENTALE
FIG.2 INOCULATION D'UNE SUSPENSION DE BONAMIA OSTREAE
DANS LA GLANDE DIGESTIVE D'UNE HUITRE TRONCONNEE
b. Param è tre s physico-chimiques
L'eau de mer util i sée est f il t r ée sur cartouche de 1 ~m de
poros i té. Dans ces conditions , il n'y a pas d'introduction
possible de protozoaires , en pa r ticulier de B.ostreae. Par
ailleurs, il faut noter que l ' élevage d'O.edulis est absent du
bassin de Marennes - Oléron ce qui limite les risques de présence
du parasite dans l'eau de me r.
L'oxygénation de l'eau de chaque bac est assurée par un
diffuseur, greffé sur un circuit surpressurisé à 0.3 bar.
Les observations d'infections n aturelles semblant indiquer qu e
celles-ci sont plus rapides durant l'été, la température
ambiante des s&lles d'élevage a été maintenue aux environs de 16" C
Compte tenu du changement régulier de l'eau dans les bacs
expérimentaux, leur salinité
l'estuaire de
30 pour mille.
c. No urrit u re
Tetraselmis
la Seudre qui
suesica,
appartenant aux Chlorophycées
est comparable à celle de
a pour valeur moyenne hivernale
algue
et
unicellulaire
la Chromophycée
flagellée
Isochrysis
galbana sont
deux souches,
cultivées au laboratoire . Un litre de mélange des
volume à volume , est distribué une fois par jour
dans chaque bac .
La densité des cultures uti l isées varie selon l'espèce
est en moyenne de 13 millions de cellules par ml.
6
elle
3 - PURIFICATION DU PARASITE BONAHIA OSTREAE
a. Protocole
Des h uîtres fortement parasitées sont identifiées par examen
histologique d 'appositions de coeur. Le système circulatoire
des huîtres étant ouvert, les hémo cytes sont disséminés dans
les différents organes . De ce fait, une purification
quantitative des parasites (schéma fig . 3) nécessite d'utiliser
le corps entier des huîtres parasitées, excepté le muscle
addu cteur dont la nature fibreus e empêche un e homogénéisation
correcte des tissus .
Les huîtres sont broyées à l'aid e d'un homogénéiseur de type
ultra - turrax dans de l'eau de mer filtrée à 0 .45 ~m (EMF).
Ap rès tamisage sur toile nylon de maille décroissante (300, 60
et 25 ~m), les broyats sont clarifiés par centrifugation
(3000g, 30mn, SOC) . Les culots (C1) sont remis en suspension
dans de l'EMF et centrifugés comme précédemment pour éliminer
les matières résiduelles en solution.
L'étape suivante de la concentration des parasites consiste en
une centrifugation sur coussin de sucrose 20 % (3000g, 30mn,
SOC). Celle-ci élimine une grande partie des microorganismes,
les cellules parasites sont alors présentes dans le culot (C2 ) .
Par une centrifugation différentielle sur gradient discontinu
de sucrose 20 %, 40 % (p /p) (3000g , 30mn, SOC), les cellules
parasites sont regroupées à l'interface 20 % - 40 % ( l . 3 ) .
Cel le-ci est prélevée à la seri n gue, lavée dans de l'EMF, puis
centrifugée (3000g, 30mn, SOC) afin d'éliminer le sucrose.
7
EMF ~ ______ ,-_______ CORPS D'HUITRES PARASITEES (eau de f:le r filt r ée , 0 , 45 1") '" : . :. (s ans muscle nddu c teur)
1 - HOMOGENEISATION 1 , " '.' (ultra - turrax ) .' ......... , '1 Broyat d' huitr es
. . (parasi t es libér és des hémocyt es)
2 - TANISAGE (300 ,60 ,251')
3 - CENTRI FUGATION (3 000g , 30mn , S ' C)
4 - CENTRIFUGATI ON (3000g , 30m~ , S'C)
5 - CENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE (3000g, 30r:m , S·C)
6 - CENTRIFUGATION (3000g,30mn,S'C)
7 - CENTRI FUGATION ISOPYCNIQUE (3000g,30mn ; S'C)
• CJ:·· ... ., . ' ..
Sus pension de parasit es ( exenpte de ~;ros débr is) ..
~ SI = bact é r ie s,lipides , glycogène , ...
~ Cl = parasi t es , noyaux ,débris cellulaires r S1 é l iminé
O Cl remi s e n suspens i o~
Coussin de sucrose 20 ~ ( p/ p)
+ ~ ~: par asites , débris r S2 éliminé
8 C2 r emis e n suspensio:1
20
~o Gradie nt de de ns ité dis c ont i nu de suc!'one 20 ~ - 40 ~ (p/ p) ..
820 I 3 = par as i tes
40 C3 = débris cellula i res r C3 éliminé
lm Dilut ion de 13 avec de l 'EMF .. ~ ~~ = parasites r S4 éliminé
~)O C4 r e mis en suspensio:1 40 50 Gradi~nt di s con tinu de Per eoll 60 30-40-50- 60- 70 ~ (V/V ) 70
• ~~: so 60 70
SUSPENSION PURE DE PARASITES
FIG.3 PROTOCOLE DE PURIFICATION DE BONAMIA OSTREAE
Localisation des oarasites
(Si = surnageant; Ii = interface Ci culot)
Les culots ( C 4 ) de parasites concentrés sont remis en
suspension et déposés à la surface d'un gradient de densité
discontinu EHf-Percoll (0 . 7 H NaCl) 30 - 40 - 50 - 60 - 70 X
(vol/voll. La purification des parasites est achevée par
centrifugation isopycnique (3000g, 30mn,
Les fractions correspondant aux interfaces 50 X
8 0 C ) •
60 X et
60 % -70 X contenant les parasites purifiés sont alors
prélevées. Ces suspensions de parasites sont directement
utilisables pour des infections expérimentales ,le Percoll
étant dépourvu de toxicité.
b. Test de viabilité
La viabilité des cellules parasites est vérifiée en fin de
purification selon un test à l'acridine orange (O.lmg / 100 ml
EH stérile) et au bromure d'éthidium (O.lmg / 100 ml EH stérile).
Lors de l'examen au microscope à épifluorescence, les cellules
vivantes émettent en vert (acridine) alors que les cellules
mortes apparaissent orange (bromure d'éthidium) (fig.5), (16).
c. Test de contamination
La contamination microbienne des suspensions de paras i tes
purifiés est estimée
(T.S.A., Difco) d'une
par dépôt
série de
sur milieu nutritif gélosé
dilution au dizième. Les
colonies bactériennes sont comptées après 24H de culture.
8
d . Comptage des parasites
- Cellule de Halassez
C'est u n e ce l l ule à nu mé r ot ati on g l obulaire de 0 . 2 mm de
profondeu r. Chaque quadri ll age de la grille correspond à un
vol u me de 0 . 01 ~ l d ans l equel o n dénombre X parasites. A
partir d'u n e v al eur moyenne X établie sur 20 comptages, il est
poss i ble de quantifie r l e n om b re de parasites présents dans un
volume donné.
La suspension purifiée est préle v ée dans du percoll de même
densité que les parasites . Il est donc nécessaire de diluer
(1/4) cette suspension avec de l'eau de mer pour que les
parasites sédimentent rapidement et puissent être comptés.
Au microscope optique (X 40) , le parasite est reconnaissable
à l'état frais par ses granules réfringents (fig. 4).
- Co mpteur de p arti cul es (C o ul t r onic)
Le principe de comptage repose sur l'accroissement de la
résistance entre deux électrodes lors du passage d 'une
particule en suspension. L'amplitude de l'impulsion de la
tension ainsi générée est d irectement proportionnelle au volume
de la particule .
La gamme de taille des cel l ules parasites étant comprise entre
2 et 5 ~m, le comptage est réalisé avec la sonde dont le micro-
orifice est de 50 ~m de diamèt r e
cette sonde ( 0 . 6 à 24 . 6 ~m),
parmi les 16 canaux de
seuls les nO 6 à 9
correspondent à l a taille du parasite (1 . 9 ~m à 6 ~m).
Une solution témoin d'ea u de mer filtrée à 0.45 ~m permet
d'estimer le bruit de fond.
9
•
FIG . 4 : COMPTAGE DE B.OSTREAE
A LA CELLULE DE MALASSEZ lx40o)
CLASSE D' INf ECTI ON 3
0
•
• ri • e • •
• • • • .. e". 0
• • • • • •
., ••• •
• • • • • 0
0 • • 0
e
• e .. • • • o· • FIG. 5 TEST DE VIABILITE
DE B. OSTREAE (%400)
CLASSE D' INFECTION 4
FIG . 6 et 7 : EXAMENS HISTOLOGI QUES D'APPOSITION
. DE COEUR CHEZ O. EDULIS (xlOoo)
• •
• •
• • • •
• , •
Les comptages des cellules parasites sont effectués sur un
éch an ti llon de 50 ~l.
4 - PATHOLOGIE EXPERIMENTALE
a. Infection per os
La valve supérieure de s hu ît r es O.edulis est tronçonnée sur sa
partie antérieure droi te e n p r éservant l'intégrité de la
cha r nière. Les palpes labiaux qui bordent la bouche sont alors
visibles . La suspension de parasites est introduite dans la
bouche de l'animal à l'aide d'une micropipette type micro
pet tor (SMI).
b. In fec tion par inoculation
- Hu îtres : O.edu lis et C.gigas
La va lve supérieure est tronçonnée sur la longueur en évitant
de léser le manteau et de le décoller de la partie restante de
la coquille . L'inoculum (50 ~l) est inje cté directement dans
les tissus d e la glande digestive (aiguille, seringue) (fig.2).
- Palourde: R. philippinarum
Les valves sont simplement entai ll ées dans la partie
post érieure au n iveau du pied. L'orifice ainsi formé permet
d'inoculer dans la glande digestive.
- Coqu i lle Saint-Jacques : P .maximus
Les valves peuvent étre aisément écartées , ce qui permet
d'accéder directement à l'ensemble des organes . L'injection est
effect uée à la base de la branchie à proximité du muscle
adducteur.
1 0
5 - HI STOLOGIE
a. Hicroscopie photonique
Les appositions de t issus cardiaques sont particulièrement bien
adaptées au diagnostic histologique de B.ostreae,
sont représentatives de l 'infect ion.
car elles
Ap r è s ouverture de la cavi t é p é ricardiqu e, le ventricule est
préle v é et essoré sur papier filtre. Une série d'appositions
est al ors effectuée sur la lame histologique. Après séchage à
l'air, fixation au méthanol et colorat i on par l'hémacolor
(Merck), les parasites libr es et intracellulaires
facilement identifiables au microscope photonique (xl000).
Selon la richesse en parasites, l'in fection sera répartie en
en classes 0, 1, 2 , 3 ou 4 :
sont
- La première (classe 0) concerne les cas pour lesquels aucun
parasite n'a été observé après 10 mn d'examen microscopique.
- Si pour un même laps de temps, moins d'une dizaine de
parasites ont été identifiés,
la classe 1 .
l'infection sera classée dans
- La classe 2 regroupe les cas d'infection permettant
d'observer, 10 à 100 parasites en moins de cinq minutes.
- La classe 3 concerne les infections évidentes, des parasites
étant pr ésents dans pratiquemment tous les champs
d'observation du microscope (Xl000) ( fig . 6).
- Enfin, les cas de bonamiose avancée chez lesquels presque
tous les hémocytes sont parasités,
classe 4 (fig . 7) .
1 1
ont été placés dans la
Il
Cette échelle qui présent e un caractère approximatif, a été
dans ce rt aines expériences comparée aux résultats de
quant if ication d es infect io n s par immunodosage enzymatique.
b. Microscopie électronique
Les parasites pur ifiés en suspension~ont fixés (vol/voll dans
un mélange contenant du glutaraldéhyde (1.75 XI et du
paraformaldéhyde (2 XI tamponné par du cacodylate (0.1 MI.
L'osmolarité est ajustée à 1000 mosmoles par du sucrose. Une
post-fixation est effectuée par du tétraoxyde d ' osmium à 1 X.
Apr è s fixation,
d'agarose, puis
les cellules sont incluses dans un culot
s uccessivement déshydratées et imprégnées
d'épon par passage dans un automate (ultroprocesseurl.
Des coupes d'épaisseur 700 à 900 A sont contrastées à l ' aide
d'un automate (ultrostainer par l'acétate uranyle
aqueux et le citrate de
LKBI
plomb. Les observations sont
effectuées au microscope électronique de type Jeol 1200 CX.
6 - IMMUNODOSAGE
La présence et la quantité de cellules parasites de
B . ostreae dans un échantillon sont estimées à l 'aide d'un
immunodosage enzymatique de t ype direct (schéma fig.81.
L'hémolymphe (100 est p onctionnée dans la cavité
péricardique à l' aide d'une micropipette à embout conique. Ce
prélèvement est r éparti en v ol um e égal dans deux puits de
plaque de microtitration type Milli pore GV contenant 200 ~l
d'eau distillée.
1 2
ABC
Ll1JLI
-
-
1. Dépôt de l ' é chantill on
2. Addition d ' an ticorps monocl onaux (MAB ) couplés à l ' enzyme
O {?O : ,p o 0 000 00°: 0 0 o r oO o ° 0 0 r o O 0 00 0 00000 0 0 0
A J\.A J\. AJ... J\.J...
3. Lavage pour é l iminer l es ~IAB non f ixés
Addit i on du subs tra t de l' en zyme
·c ·~c· · 00 0 0 ° 0 0 . 0 •• • o 00 0 •• 00 • • •• o 00 0 0 0 0 0 O . JI lI( Jt lM ;t( l XXXXXl J...:J.. XX
,..-
r--
4 . La quantjt ~ de S~!bst~Dt transfor mé e n produi t coloré est fH::,o;)ür'..:ion!le lle à la quanti té de pa~asites présents dans l 'Oc llantillon
FIG.8 PRINCIPE D' IMMUNODOSAGE ENZYMATIQUE
DE B.OSTREAE (TYPE DIRECT) .
Da n s c es condi ti o n s , le s h émocy t e s subi s sent u n choc osmotique
q ui p r ovo q ue des a l térations i r réver~ibles des membranes.
Ai n si l es a nt ico r ps po urr ont accéder aux parasites
intrace l lulaires.
Les hémocytes
concentrés par
et les parasites sont ensuite rapidement
aspir a tion et adsorbés sur la membrane
Durapore (0 . 22 ~m) qui constitue le fond des puits.
Après séchage à l ' étuve et afi n d'éviter les
adsorptions ultérieures non spécifiques des anticorps, la
plaque est saturée pendant 2 heures, à température ambiante
(Tris 10mM, NaCl 90mM , Tween 20 à 1 X, BGG 1 X, BSA 1 X). Pour
chaque hémolymphe, un puit est conse r vé comme témoin et sera
incubé avec la solution de saturation (1 heure , température
ambiante) alors que l'autre puit sera incubé avec une solution
de l'anticorps
membranaire de
monoclonal
B . ostreae.
20
Cet
B2 spécifique d'un épi tope
anticorps , couplé à la
phosphatase alcaline est u tilisé après di lu tion au 1/1000ème
dans un tampon (Tris 10mM, NaCl 90mM, Tween 0.5 X, BGG 1 X).
Plusieurs lavages sont ensuite effectués (NaCl 90mM) pour
éliminer l'anticorps non fixé.
Enfin, chaque puit e st incubé a v ec une solution de substrat
soluble le NPP
diéthanol amine
( nit r ophenyl phosphate) dilué dans le tampon
( 5% , pH= 9. 8 ) . La présence d'anticorps
spéci f iques de B . ost r eae c oup l és à l 'en zyme e t fixés sur les
parasites, est r évélée p ar la coloration du produit de
t r ansformation du NPP . La densi t é optique (DO) mesurée au
lecteur de microplaques T ite r tek
à la quantité de parasites.
(405 nm) est proportionnelle
1 3
"
Les études cliniques, réalisées lors de la mise au point de
l'immunodosage (2) ont conduit à considérer comme infec tées les
hémolymphes corresp ondant à d es val eu rs de densité optique
supérieure s à 0.140 uni té DO. Seuls les r ésultats , dont les
témoi n s ont des valeu rs proches de 0 . 000 unité DO sont
considérés. En effet, dan s les cas d'huîtres e n phase pré-mortem,
des infections microbiennes sont susceptibles d'induire des
rés ul tats faussement positifs.
III - RESULTATS
- PUR IFI CATION DE BONAHIA OSTR EAE
Préa lablement aux purifications de parasites utilisées pour d es
infect ions expérimentales, deux purifications ont eu pour but de
tester la fiabilité de la méthode de comptage , la contamination
bactérienne , la viabili té ainsi que l'intégrité des parasites en
fin de purification.
a. Comparaison de méthodes de comptage
Les parasites prélevés dans les interfaces 50-60 X et 60-70 X du
gradient de Percoll sont comptés d'une part à la cellule de
Halassez et d'autre part à l'aide d'un compteur de particules .
Les résultats obtenus selon ces deux méthodes sont présentés
dans la figure 9 (A,B).
L'examen des profils de comptage par le compteur de particules
montre un pic centré sur 2 . 7 ~m (canal n07 ) . Les dimensions de
1 4
2.0
10
lrIo llhl" e de pr' l"l l cules
40 ' Nombre de particules
JC , 000 le 1 000
JO
2 D
0
,-
-- ,-
iÎ-f l---r-c N du 1
,-
l-
Expérlence
1
2
1
--
-, ~~,1-.1-.1-,~.-L_, L-. L-,l-"~"~U~,-) -,-.--,,--,,· cono l l , l ' ~ , 1 • , 10 Il Il Il l' I ~ l'
Taille du paras! te
Taille du parasite
E.tpèrienec 2
A) COMPTAGE DES PARASITES AU COMPTEUR COULTER
N ombre de particules
(canrlllx ('.7. 8 , 91
N' du canal
J' 000
97 000
78
83
Purification Cellule de ~laIQ(; se 'Z (1) Comp teur coulleur (2 ) Comparaison des 2 mtthoucs
2
Solution mère diluée au 1/ 3 :
dans 0 ,01 f l ---+ 'X ... 12 parosites
dans 1 ml ~ 1 200 000 porositcs
Solution mè re (x3)
dans 1 ml ---Ji- 3 ' 600 000 paras i tes
Solution lIu~rc dilu(:c ou 1/'1
dons 0,01 f'Ù -J> J. " 2,125
dons 1 ml -+ 2 125000 porasites
Salu t ion mè l'e (x'I)
don:; 1 nl 1 --+ 8 ')00 (X)O pat'nr.1tcu
Solut ion mère diluée au 1/6 : (2) - ( 1 ) , 080 000 - 3 600 000
dons 0 , 05 ml -Jil- 3'1 000 particules 480 000
dons 1 ml --.. 680 000 pnrticulcs cc qui correspond à une variation
Solution mère ( x6): de 12 ,;
dons 1 ml ~ 4 080 000 particules
Solutton mère diluée ou 1/5 (2) - ( 1) : 9 700 000 - 8 500 ()()()
don:; 0,05 ml -Jo97 000 particu les
dans 1 ml -Jo 1 9/10 000 pnrticules
So luti on ml' I'C ( liS) :
011111:. 1 !n I -Ji" IJ '(DO ClOO l'nl ' 1. h:1l1c ll
1 200 000
ce qui correspond à une variati on
dc 13 ,;
FIG 9 (A,Bl COMPTAGE DES PARASITES B_ OSTREAE
APRES PURIFICATI ON
B . ostreae étant comp ri ses e ntre 2 e t 5 ~m , seuls les canaux 6,7,
8 et 9 do i vent être co n si d é r és .
Pour la purif i ca t ion n 01 , 78 % des p ar t icules comptées peuvent
être assimi l ées à du parasite et 83 % po u r la purification nO 2.
Sur la base des observations en microscopie photonique, les
particules plus petites peuvent être assimilées à des
microorganismes et des débris cellulai r es alors que les plus
grosses sont
Malassez qui
(variation de
parasites. Il
en majorité des noyaux. Le comptage à la cellule de
est comparable
12 %) r epose
s'avère ainsi
à celui du compteur de particules
sur une identification directe des
particulièrement intéressant d'une
part pour sa représen t ativité et d'autre part pour sa plus
g rande simplicité de mise en oeuvre .
b. Contamina t i o n bactérienne
Les organes des huîtres étant en contact direct avec le milieu,
la contamination
particulier dans
moribondes.
bactérienne
le cas
est à priori importante, en
d'huîtres fortement parasitées
Les caractéristiques de taille et de densité de B.ostreae et des
microorganismes étant très voisines, la purification du parasite
ne permet pas d'éliminer la totalité des contaminants microbiens.
Ces derniers sont estimés à 10 % environ lors du comptage des
particules totales (fig.9,A canaux 2,3,4,5) .
Ces résultats
milieu gélosé.
de bactéries
sont confirmés par dénombrements bactériens sur
Le rapport du nombre de parasites sur le nombre
établi pour plusieurs purifications est compris
entre 70 et 120.
1 5
c. Intégrité ultrastructurale et viabilit é
Les s u spensions de par as it e s ob te n ue s l o r s des purifications 1
et 2 ont été t r ait é e s p a r de s examens en microscopie
élect r o n ique (f i g . l 0).
Ceux-ci ont mont r é qu e la morpho l ogie des cellules parasites
(fig . l l ) est simi l ai r e à ce l le décrite pour des formes
int r acellulai r es obser v ées su r
organites caractéris t iques tels
granules denses(~) sont présents.
membrane, corresp on da n t à la
des coupes de tissus. Les
q ue les haplosporosomes(qet les
Des fragments résiduels de
vacuole parasitophore, sont
identifiables à ' la surface des pa r asites purifi és . Ces derniers
présentent, dans certains cas , un espace périnucléaire dépourvu
de ribosomes . Cet artéfact de coupe probablement lié aux
modalités de purificatio n ,rend indispensable la réalisation du
test de viabilité.
Selon la technique à l'acridine orange et au bromure d'éthydium,
les tests de viabilité ont toujours indiqué des viabilités
comprises entre 95 et 1 00 % (fig.5).
d . Bilan d es puri f i cation s
Chaque infection expérimentale a été réalisée à partir d'une
p uri fication dont les caractéristiques sont reportées dans le
tableau 1 .
1 6
L l
FIG.10 EXAMEN DES PARASITES B.OSTREAE APRES PURIFICATION (X17 . 000)
~":-:. .; ; "\..>.:
.. .'~ .. . . , ., ... .. .
FIG. 11 ULTRASTRUCTURE DU PARASITE B.OSTREAE APRES PURIFICATION (X 48 000)
Purification
1
2
3
4
5
6
7
6
9
10
Il
12
Nbre hultres Nbre total Nbre total Nbre parasites Utilisation parasitées de parasites , de parasites Rdmt .
(en millions) /m1 Hu1trcs (en millions) (en millions)
Test 15 54 3.6 3.6
Test 20 270 6 . 5 13 .5
Ingestion / / 4 /
Effet 10 64 2.6 6.4
11 75 2.6 6.6
Dose.
5 170 6.6 34 Inoculation
4 42 1.5 10.5 d.
GD 6 93 J.2 15.5
Cinétique (inoc.ds GD) / / 4.4 /
Sensibilité 9 90 3.5 10
d'espêce
C. ghas 5 25 3 5
Sens!. [!!.:..Eh. / / 6 / d ' esp. P.rn.
TABL.l BI LAN DES PURIFICATIONS
Numéro Diagnostic de l' animal Date du sac r ifice(ti) Histologi e ELISA (DO)
1 0 0 . 053 2 0 0 . 054 3 0 0 . 082 4 0 0 . 084 5 0 0 . 096 6 0 0 . 098 7 0 0 .11 5 8 0 0 .12 3 9 t4 4 mois 0 0.125
10 0 0 . 126 Il 0 0 . 127 12 0 0 . 134(T·O .I05) 13 0 0 . 217 14 0 0·366 15 0 0 . 447(T·0.1271 16 0 0.598(T.0.803) 17 0 0 .599 (T.0 . 645) 18 0 ) 2(T>2 )
TABL . 2 : EXP. D' INFECTION PER OS
DIAGNOSTIC ET ESTIMATI ON DU DEGRE D' INFECTI ON
PAR HISTOLOGIE ET IMMU~ODOSAGE (T=puits t émoin)
2 - INFECTION PER OS D'OSTREA ED ULIS
Un lo t d e 3 0 huître s O . edul i s prove n ant de l'étang de Thau a été
infecté expé ri me nt a l e ment par ingestion forcée de 50 ~l d'une
suspension de pa ra si t es purifiés (4 000 000 parasites Iml) soit
200 000 B.ostreae pa r huître .
La d urée de l' e xp é ri ence étant de quatre mois , B animaux sont
mo r ts penda n t ce t t e période,
terme .
les 22 autres ont été sacrifiés à
L'examen histo l ogique des appositions de tissu cardiaque a
conduit à mettre en évidence un seul cas d'infection, très
faible , chez une huître morte au 45ème jour .
Les résultats d'ana l yse par immunodosage enzymatique des huîtres
sacrifiées en fin d'expé r ience sont p r ésentés dans le tableau 2.
Les valeurs, signif i catives par rapport aux témoins (T) sont
comp rises entre 0 . 053 DO et 0 . 366 DO . Ainsi, les deux
hémolymphes (13,14) chez lesquelles aucun parasite n'a été
identifié en histologie optique, ont une absorbance supérieure à
0.140 DO, valeur suggérant la présence de parasites .
3 - I NFE CT I ON EX PERIMENTALE PAR I NOCULATI ON
a - E t ud e du développem en t d e l a ma l a d ie ch e z Os t rea edulis
en fonct i on d e la qu a n ti t é inoculée d e Bo n amia ostreae
Cinq expé r iences d'infections expéri mentales ont été réalisées
pa r inoculation dans l a glande digestive. Le nombre de
parasites inoculés p ar huître est variable: 0 , 1, 100, 10000,
100 000, 000 000 . Pour chaque quantité de parasites, 30
huîtres sont inoculées .
1 7
Les résultats de ces expériences sont illustrés par les figures
12 (a,b,c,d,el.
Des mortalités précoces, moins de deux mois après l'infection,
sont notées sans mise en évidence de B.ostreae et ce, quelles
que soient les quantités de parasites inoculés. Le tableau 3
récapitule les pourcentages respectifs.
Leur analyse statistique est effectuée sur des pourcentages car
les lots d'huîtres sont de même taille en début d'expérience.
Par une analyse de variance, on remarque que pour un seuil de
5 '-
- les pourcentages ne sont pas significativement
différents d'une dose à l'autre (1, 100, 10 000)
- il existe un effet "purification" si gn if i c a t if
(expériences, lots d'huîtres différents)
L'effet "purification" est testé par la méthode de la PPDS
(plus petite différence significative). Les effectifs
correspondants aux différentes doses ( 1 , 100, 10 000) son t
alors regroupés (réplica) . Le classement des moyennes
(tableau '1) pour un seuil de 5 révèle que
les expériences 4,6 t 7 puis 6,7,8 ne sont pas
significativement différentes , .
.. • " .... ft
l'expérience 5 est différente des expériences 4,6,7.
Il faut noter, en particulier, que les mortalités précoces sont
similaires dans les lots témoins qui ont reçu 50 ~l d'eau de . , .. mer filtrée (0.45 ~m) par inoculation dans la glande digestive .
Pa r ailleurs, des animaux de même provenance, non inoculés, ont
'" .." .. ~ é té maintenus en élevage sans mortalité. •
1 8
"
)
2
)
2
o
Cl. d ' i n rection
o
o
o
o~o
o
•• 00
o
o
o
o 00 0 o o
..., SACRIFICES
i .. •
•
• •
........ 00
......... ~ .... ol.::...lo-..,,64
L-____________ ~--__________ ~------------~--------------~- -- - ---- - -~ 1 ,
FIG. a l
Cl. d ' iI,r, ·,; I ' "'' -
• ••
••
o
••
. ..
.. "ni!,"
I .... i ll l
•
... .
_ .-. . ~-
L-----~--~---:-------_;_-----....._lr- ---- ----""* z 3 fi Temp8
(IllOis)
FIG. bl
Cl. d'in f ection
o •
00 • 000 00 0
L-------,-------,,-------;-------. t-------- -- --, i 1·.· .....
( ... 01 ,, 1
FIG. 12 (a.b , c , d , cl
f 0 : MORTALITE
lb. : SACRIFICE
FIG. cl
EXP . DE CINërIQUE DE DEVELOPPEMENT DE L'INFECTION
REPARTITION ET QUANTIFICATION DES INFECTIONS
EN FONCTION DU TEMPS ( ECHELLE HISTOLOGIQUE
NOMBRE DE PARASITES INOCULES / IillITRE
= 0 NATIIRELLE = 1 - 100 - 10 000
CJ 100 000 - 1 000 000
CI. d'infectIon
•••
•
• 0 0
•
o 000
.. ...... !1t .. .. .. 6.>4 ......... ............ . .
L ____ ___ , ________ -;, _________ ,:;-_______ ----:.+ ------- -1~~
Cl. d'Inhction
c 088
FIG. d)
8 8
FIG. el
o 0 00 0
( .. ,, 1
SACRI I CF.S
•••
••• 00
o 0
3
4
5
6
7
8
% moyen
a 1 100 la 000 100 000
/ 43 56 56 65
/ 16 3 ,5 20 /
50 40 36 70 /
24 33 26 53 /
30 40 33 20 /
34 34 31 44
3. TAUX D'INFECTION ( en %) DES HUITRES MORTES DE FACON PRECOCE
(\~'= dose non effectuée)
p4 = 51.7 J 4. TEST DE LA PPDS ENTRE p6 =
P7
1 000 000
/
17
1
/
/
48 .7 ]
(Pi) 37 .5 :J
LES EXPERIENCES p8 = 31 ] (0( =0. 05) P5 13
TABL. 3 et 4 MORTALITES PRECOCES D'HUITRES 0 .EDULIS ,
OBSERVEES PENDANT LES DEUX PREMIERS MOIS
APRES INOCULATION lE B .OSTREAE
A partir du 3ème mois après l'infection, des mortalités sont
associées à la présence de parasites. Cependant, l'intensité
des infections observées, variable entre et 4 selon l'échelle
histologique précédemment établie, indique que ces mortalités
ne peuvent être imputées directement au parasite.
Lors du sacrifice des animaux à la fin du 4ème mois
d'expérience, les ta u x d'infection observés dans chaque lot
(cla s ses 1,2 , 3 , 4) varient de % à 88 % en fonction de la
quantité de parasites inoculés (tableau 5).
L ' anal y se statistique de la réponse à l'infection est étudiée
sur des effectifs ~Ar les lot s d'huitres sacrifiées n ' ont plus
une taille comparable .
L'analyse de variance étudie l'évolution du pourcentag e de
la classe d'infection a sur les doses 1,
(a = 0 . 05)
100 et 10 000
- les effectifs sacrifiés ne révèlent pas une différence
significative en foncti o n d e s expériences
- les effectifs de la classe d'infection 0 montrent une
différence significative d'une dose à l'autre
L'effet T'dose" observé (1 , 100, la 000) est alors testé sur
la classe d'infection 0 par la méthode de la PPDS en
r e groupant les effectifs des différentes expériences
(réplica). Le classement des moyennes (respectivement 57 , 72,
99) montre pour un seuil de 5 %, une différence
significative entre les trois doses . Il existe donc un effet
dose important sur l'initiation des infections (passage de
la classe 0 aux suivantes) .
1 9
Nombre de pa rasi te 8 inoculés 0
Echelle de
~ 0 1 2
'E:xpér1en~e
4 / / /
5 / / /
6 8 0 0
1 9 0 0
8 12 0 0
L 21 0 0
[en ~ 100
.. .-
1 100 10 000 100 000
J , 0 1 2 J , 0 1 2 J , 0 1 2 J , 0 1 2 J
/ / 10 0 0 0 0 5 1 1 0 0 4 2 0 1 2 2 J 1 0
/ / 21 0 0 0 0 21 J 0 2 0 10 , J 0 0 / / / /
0 0 11 1 0 0 0 8 2 0 2 0 2 0 0 1 0 / / / /
0 0 12 0 0 0 0 1 J 1 0 , , 1 0 2 0 / / / /
0 0 11 0 0 0 0 10 0 J 0 0 1 2 2 1 0 / / / /
0 0 65 1 0 0 0 5 1 9 5 , 0 27 9 5 , 2 2 J 1 0
0 99 1 l' 26 51 'J 28 12
5. TAUX D' IN~ECTION DES HUITRES SACRI~IEES (en effectif)
("1" = dose non effectuée)
Class e
~ 0 l Do::;e
65
6. TEST DU KHI - 2 (~ =0 .05) 100 51 18
10 000 27
[ 143
Classe d ' infection 0 2
Dose
7. TEST DU KHI-2 (0. =0 . 05) 100 5 1 9 5
10 000 27 9 5
r 78 18 10
TABL . 5,6,7 :SACRI~ICES DES HUITRES O.EDULIS EF~ECTUES
QUATRE MOIS APRES INOCULATION DE B.OSTREAE
20
39
3 • 4
4
6
10
- ,
1 000 000
4 0 1 2 J 4
1 / / / / /
/ 1 , 1 1 1
/ / / / / /
/ / / / / /
/ / / / / /
1 1 , 1 1 1
12 88
~
66
69
47
182
49
47
116
L'ana l ys e de l a r é partition des cla s s e s d'i nfec t io n pe u t
s 'effectuer pa r de s te s t s d u Khi 2 p o ur l e s d oses 1 , 100 et
l a 0 0 0 (a = 0 . 05)
- les classes a et l (1 = classes 1+2+3+4) sont
s ignific a tivement di f f é rent es ap r ès correction par le
f a cteur d e Yate s (tabl .6 ) .
- la ré pa rtiti o n e n c la sses 0 , 1, 2 , 3 + 4 ne r évèle par
co n t r e a u c u ne dif fé r e n ce significative après
co rre c ti o n p a r l e fac t e ur de Ya tes (tabl . 7)
b. Ci n é t ique de développeme n t de la b o n a mio s e
Un l ot de 1 26 hu î tre s a é t é infecté expérimentalement par
inoculat i on d ans l a g lande d igestive de 220 000 B.ostreae
par huître . Cette d o s e a été retenue suite aux premières
observations conce r na nt les expériences 4,5,6,7 , 8. Celles - ci
montraie n t q u'e n tre 100 000 et 1 000 000 de B . ostreae injectés,
des infections étaie n t i dentifiées dès le 2ème mois.
Les première s détec t ions de l a bonamiose par examen
histologique, s e font p eu av a nt le ?ème mois d'infection pour
des mo r tali t és spontanées (fig . 13 ) .
Le 1 er sacrifice me n suel (t l ) , condu i t à i dentifi e r le parasite
chez 5% des a ni maux , l e 2 è me (t2) chez 5 0 %, le 3ème (t3) et l e
dernie r (t4) ch ez 100 % des c as ( t abl . 8 , f i g.14) .
L'analyse stati s t i que de l a r épa r t i t i on de l'infection en
c l asse a et l ( 1 = cl asses 1+2+3+4) s ' effect u e par un test du
Khi 2 ( ta bleau 9) : a près correction par le facteur de Yates,
20
"
3
2
o
Cl . d'infec tion
Mortalité naturelle
Sacrifice
o
o 00
o ~~ 0 a
ooo~~ 00 00
a 00: %> 00
2
ooog 00 a
o
o
o
Tempo e n Illois 3 •
nc. 1}: REPfl.IlT I TlOH l':-r QUfl.NTTFTCfl.1TOH OF.S T N FF.c:T 'ON ~ EN FOHCT JOI ou Tf':MIOS
\00
50
:::::ect if en ~
h o 123 4
tl
r
I-
l-
h o 1 2 3 4
t2 :: 2
ECHELLE Ill STOLOGIQUE
-
r-
I-
o 1 234
t3 • 3
~
l-
l-
o 1 234
tl; :: 4
CI .d'inrect ion
Socrifices en moi~
FIG . 14 HISTOGRAMME DE REPARTITION DES INFECTIONS D'O.EOULIS
A CHAQUE SACRIFICE MENSUEL (ti)
FIG . 13 et 14 EXP . DE CINETIQUE DE DEVELOPPEMENT DE L'INFECTION
CHEZ O.EDULIS
Clas~e
t 1 r.loi~
, 2 2 mois
'3 3 mois
, 4 4 mois
0 2 3
'.!ffe c tif • cffp.~tir ~ effec tif ~ effectif r .. 22 95 5 0 0 0 0
11 50 6 27 4 18 • 0 0 7 70 10 2 20
0 0 3 50 2 33 17
TABL. 8 REPARTITION DES INFECTIONS A CHAQUE SACRIFICE MENSUEL
~e 0 l ~ ét: ... $
22 23
TABL. 9 TEST DU KHI-2 ( .0.05) 2 11 11 22
TABL. 8 et 9
3 0 10 10
4 0 6 6
1: 33 28 61
EXP. DE CINETIQUE DE DEVELOPPEMENT DE L'INFECTION
CHEZ O.EDULIS
• e r f"ect j f < .'
0 0
0 0
0 0
0 0
e l le mont r e u ne différence significative entre les temps ti de
l ' infection .
Il faut remarquer que le diagnostic histologique a été effectué
en deux temps
suggéraient la
en effet les résultats des immunodosages
présence de parasites chez des animaux
initialement considérés comme négatifs (tabl.l0 : *)
L'hémolymphedes animaux morts de façon précoce avant la fin du
1er mois de l'expérience, et celle des animaux morts entre les
temps tl et t2 n'ont pas été analys ées en ELISA.
Les résultats
(qOlbl.l0) sont
établis
corrélés
par chacune de ces deux méthodes
dans 77 des diagnostics.
L'immunodosage est dans 7 X des cas supérieur à l'histologie
(A) , et inversement . ). Cette situation correspond aux
limites de sensibilité pour de très faibles infections. Enfin,
dans 9 X des analyses (.), l'état moribond des animaux rend
les diagnostics incertains en particulier en immunodosage.
4 - INFE CTIONS EXPERIMENTALES DE DIFFERENTES ESPECES DE BIVALVES
a - Crassostrea gigas
Des essais d'infection expérimentale de C.gigas ont été
réalisés par inoculation dans la glande digestive. 30 huîtres
réparties en quatre lots ont r eçu respectivement 175, 1750,
17 500 et 175 000 B.ostreae par huître (fig.15) .
Les mortalités précoces se sont avérées très importantes dans
les deux expériences , quelles que soient les quantités de
parasites inoculés .
21
NUIllt!ro Dale de DK)rtalilé Diagnos ti c Numé ro Date de .ortal!té (ti il t n (tiA. tJ)
e l'onimol ou de u crUJce ( l J ) de l 'animal
ou de sacrir i ce ( li) llisto ELISA
1 a 0 .000 ' 6 2 a 0.021 '7
3 a 0 . 028 48
" a 0 .029 '9
5 a 0.036 50
6 a 0.0)7 51
7 a 0 .038 52
8 a 0 .043 53
9 a 0 .052 5' t 2 è t 3 la a 0.053 55
tl • 1 .,ia 0.056 56 11 a
12 a 0·057 57
13 a 0.061 58
l' a 0.067 59
15 a 0.068 60
16 a 0 .076 61
17 a 0.081 62
18 a 0.125 63
19 a 0. 129 6' 20 .0 0.~14(T.O.q56)+ 65 21 a 0 .49 1(T _0.444 )+ 66 22 a )2 (T > 21+ 67 23 0-4 1 0.103 0
68
2" a 0.025 69 t3 • )lIIOis
25 a 0 .027 70 26 a 0.040 71
27 a 0.040 72 28 a 0.054 73
29 a 0.054 7' 30 a 0 .068
75 31 a 0.082 76 32 a 0.155 ..
77 J3 a 0 . 162 .. 78 t 3 il t " 3" t2 • 2 DOis a 0. 163 ..
79 15 1 0.076 •
80 36 1 0.086 • 81 37 0-4 1 0.109 •
j8 1 0.20 0; 82
)9 1 0.472( T-0 . 514 >+ 83
"0 1 O. 601( T-0 . 455 )+ 8' t4 • 1; fIIOis
' 1 2 0 . 111 . 85
'2 2 0.150 86
"3 2 0. 159 87
44 2 0.705(T.0.3981 +
'5 3 0.247
TABL. 10 EXP . DE CINETI QUE DE DEVELOPPEMENT DE L'INFECTION
DIAGNOSTIC ET ESTIMATION DU DEGRE D'INFECTI ON
PAR HISTOLOGIE ET IMMUNODOSAGE (T=puit t emoin)
Diagnost i c
H1sto ELISA ( DO)
O~ 1 0.11 ) •
0-1 1 0.125 •
a 0 . 1)6
a 0.159(To O.!!'I + a o. 259(T.o . 476 1.
. '1 0. 173
1 0. 192
1 0.236
1 0.252
2 0 .291
2 0.539
3 0.563
3 0 .998
3 1 .002 , 1.156
• 1.855 , 1 . 882
• >2 , >2
0--7 1 0.117 0
0--7 1 0 . 145 . ...
0-4 1 0. 238 ....
0--7 1 0.246 . ...
1 0·321
1 0.)21
1 0 · 321
2 0.370
3 0.715
3 0.908
1 0 . 190
1 0 .292
2 0 . 429
3 0.765 , 1.079
4 1.769
• 2
1 0 .086 •
0-11 '0. 10) •
1 0 . 1)0 •
2 0. 134 •
2 0.)47
3 0 . 974
A C:l. l ' , .. rec t , ....
J
2
&9.:,0 00 888 08 8 0"0'0 &, JI. • UU'::UI. ••
• ... A._ • .s '1 e\.. : .':. • • •
o o
• • • 0: ••
2 )
EXPERIENCE A)
.. CI. cl ' , ,, 1" '0" i""
2
• • •
00000000 0000 8800 0 000000 g 00 0 00 o 0
•• n" .. .. :: . ••• • •• • • " • 0 •• •• • :u O ••• "Z".,"!":I." .. " " " 0 "". C) ..... ... : ....... •• .: .. • • . ' • • • •••• • •
2 J
EXPERI ENCE B)
FIG. 15 (A,B) RESULTATS D'ESSAIS D'INFECTION PAR B. OSTREAE,CHEZ C.GlGAS .., .,c_ t'1 ,., Il . . ~ . ..
l'CID,,:. (rnois)
o
0
l'clllpll (illois)
Au tr o isi è me mois, l e s ta ux de survi e ne dépassent pas 15 %.
Ch e z qua tre huître s d e la d e u x i ème expérience, des parasites,
en no mbr e tr ès limité , on t été mis en év i dence (fig 15 Bl.
b - Rudi ta pe s philipp i n ar um
Un lot de 40 p alou r des R.philippinarum agées de 18 mois a été
infecté par i n oculation de 300 000 B.ostreae par huître dans
la g l ande digestive. Les animaux ont particulièrement bien
tolé r és l'inject i on p u isque se u lement 8 sont morts pendant les
quatre mois de l ' expérience. Aucun parasite n'a été identifié
chez ces palourdes , ni dans celles sacrifiées en fin
d'expérie n ce .
c - Pecten maximu s
L'essai d ' infection a porté sur 41 individus d'âges différents.
Deux mois après i noculation de 300 000 B . ostreae par huître,
aucune cellule parasite n'a été identifiée dans les cas de
mortalité spontanée , il en est de même chez les animaux
sacrifiés au bout de 4 mois . La présence de rickettsies a par
contre été constante.
22
IV - DISCUS SIONS - CONCLUSIO NS
L'étude des relat i o n s d'un pa r asite avec son hôte repose sur
une maîtrise opt i ma l e des modalités de reproduction
expérimentale de la maladie.
Dans la pratique, l'élaboration d'un tel modèle nécessite
initialement de pouvoir isoler et purifier l'agent, bien que
la maladie puisse être souvent reproduite de façon empirique.
Ainsi, la bonamiose a pu être initiée au laboratoire chez des
huîtres saines par " proximité" avec des huîtres infectées (9,
19) et par "feeding" (18) ou par inoculation (9,18) avec de s
broyats d'huîtres parasitées . L'extrême variabilité des
résultats alors obtenus est évidemment liée à l'hétérogénéité
des inoculum .
La disponibilité d'un protocole de purification de B.ostrea e
représente une amélioration notable de préparation de tels
inoculum. Dans mes exp é riences, les parasites régulièrement
isolés et purifiés ont pu être quantifiés précisément et leur
viabilité vérifiée.
Cependant, la contamination bactérienne et éventuellement
fongique (levures), estimée en moyenne à %, constitue encore
un aléa difficile à solutionner par une amélioration du
protocole de purification. L'addition d'antibiotiques pourrait
être essayée en vérifiant leur inocuité pour B.ostreae.
Par ailleurs, l' i mpact de cette contamination sur les
mortalités précoces ,
certain. En effet,
observées dans nos expériences, n'est pas
les résultats similaires observés chez le s
animaux témoins suggèrent que l'inoculation elle-m ê me dans la
23
gl ande digestive puisse être directem ent impliquée dans les
mo r ta lit és. Ce lle s - ci résulteraient de lésions tissulaires et
de se pti cémies secondaires .
*****
Dans le cadre de l 'essai d'infection per os, cette faible
contami nat ion bactérienne n'intervient évidemment pas, mais
l'ingestion forcée de 200 000 parasites chez 30 huîtres, s'est
traduite par l'identification histologique d 'un seul cas de
bonamiose.
Ces résultats sont à comparer à ceux obte nus par immunodosage
enzymatique des hémolymphes
à
( 2 ) .
des
En effet,
résultats d'infections associées
supérieurs à 0 .1 40 DO, le s animaux 1 3 , 1 4,
sur la base
d'immunodosage
peuvent être
considérés comme
supposer que la
positif .
durée de
Dans ces conditions, on peut
l'expérience (4 mois) a été trop
courte pour diagnostiquer les débuts d'infection. A l'encontre
de cette hypothèse, il faut ra ppeler que des infections sont
identifiées dès le troisième mois lors d'introduction
d'huîtres saines dans une zone in fectée .
Cette expérience est actue ll ement r épé tée s ur une centaine
d ' huîtres , une première série de sacrifice devant être
effectuée au six i ème mois .
*****
24
Les résultats obtenus pour les infections expérimentales par
inoculation de différentes quantités de parasites sont
particul ièr emen t intéressants à analyser.
Compte tenu des mortalités précoces observées chez tous les
animaux et estimées à 30 % environ ,
d'améliorer les modalités d'infection.
il s'avère nécessaire
Des essais d'injection, dans des organes moins susceptibles de
s'infecter, suite à une inoculation, doivent être maintenant
développés il s'agit en particulier du muscle et du
péricarde. Parallèlement ,
pénicillines, agissant
des antibiotiques,
spécifiquement sur
tels que des
les parois
bactériennes , pourront être utilisés, la posologie devant être
définie.
Dans nos essais ,
directement liée
respectivement de
10 000 , 100 000 et
la quantité de parasites inocul és est
aux taux d'infections initiés, qui sont
'Y. , 28 %, 43 %, 71 % et 88 % pour 1, 100,
000 000 de parasites. Ces dernier s taux sont
nettement plus importants que ceux obtenus précédemment par
d'autres méthodes (1,9,18,20).
Cependant, au sein de chaque lot, les degrés d'infections sont
différents. Ces
individuelle de
résultats suggèrent
la sensibilité à
une variabilité
B.ostreae qu'il sera
nécessaire d'étudier ultérieurement sur des effectifs plus
élevés, afin d'obtenir des résultats exploitables d'un point
de vue statistique.
25
Par contre , et c'est probablement le point primordial de ce
travail , il apparaît que des huîtres pourraient présenter
entre elles une sensibilité différente au parasite. D'un point
de vue immunopathologie des mollusques, il devient ainsi
possible d'appréhender expérimentalement les mécanismes
immunitaires, cellulaires et humoraux, en réponse à une
infection parasitaire.
l'analyse individuelle
De telles investigations reposent sur
de l'hémolymphe d'huîtres pendant
plusieurs semaines. Les techniques de base, telles que prise
d e sang, détermination des populations de cellules sanguines,
analyse biochimique de facteurs seriques, immunodosage du
parasite sont maîtrisées au laboratoire.
Un début d'interprétation des phénomènes que nous avons mis en
é vidence est donc envisageable. Parallèlement, des analyses à
l'échelle cellulaire des relations hôte-parasite sont
développées suite à la mise au point de modèle d'étude in
vitro. (Mourton, CH., comm. pers.)
*****
Cette variabilité individuelle se retrouve dans notre
expérience qui avait pour but de préciser la cinétique de
développement de l'infection. En effet, dans le même lot
expérimental, l'infection s'avère fatale pour certaines
huîtres alors que d'autres semblent exemptes de parasites.
26
Comme précédemment , l'analyse individuelle du développement de
l'infection est nécessaire à la compr éhension des processus
infectieux .
*****
D' u n point d e vu e épidémiologique et de l'éventuelle
sensibilité d'autres espèces de b ivalves vis à vis de
B.ostreae, seu l e l'huître creuse C.gigas semble mériter d ' être
prise en compte. Des infections expérimentales seront donc
renouve l ées.
*****
En conclusion , ce travail expérimental est or i ginal en
pathologie des mollusques de par sa méthodologie expérimentale
(parasites purifiés
(immunodosage) . Il
et
présente
quan tif i és)
de ce
et analytique
fait de nombreuses
imperfections qui indiquent plusieurs voies d'améliorations
pour acquérir le statut de modèle d'étude. Cependant, il rend
possible , prochainement, des r echerches en immunopathologie
infectieuse . En fin , sur ces premières bases méthodologiques,
un travail en collaboration avec une équipe américaine est en
cours pour vérifier la résistance à B. ost r eae d'une souche
d'huître plate lo cale (8).
*-* - *-* -*-*-*-*-*-*
27
v - BIBLIOGRAPHIE
1 - BACHERE, E., GRIZEL, H., 1983 . Réceptivité de trois populations naturelles d'huîtres plates Ostrea edulis Linné au protozoaire Bonamia ostreae (Pichot et al., 1980). Rev. Trav. Inst. Pêches marit . , 47 (3 et 4) : 237-240
2 - COC HENNEC, N., BOULa, V., MIALHE, E., GRIZEL, H., ROGIER, H. , CLAVIES, C., HERVAUD, E., PAU, B., PUYGRENIER, M. and PAOLUCCI, F . . Use of a monoclonal antibody in an enzyme immunoassay for the detection of Bonamia ostreae in the hemolymph of fIat oysters Ostrea edulis in European Association of fish pathologists conference, Bergen, Norway, August 31 - September 3, 1987
3 - COMPS, M. , 1970. Observations sur les causes d'une mortalité anormale des huîtres plates dans le bassin de Marennes. Rev . Trav. Inst. Pêches marit., 34 (3) 317-326
4 - COMPS, M., 1 983. Recherches histologiques et cytologiques sur les infections intracellulaires des mollusques bivalves marins. Thèse, Doct. Etat Sci. Nat. Montpellier 128 pp.
5 - COMPS , M. , DUTHOIT, J.L., 1976. Infection virale associée à la "ma ladie. des branchies'T de Crassostrea angulata LMK , 283 : 1595-1596
l'huître portugaise C.R. Acad. Sci., Paris, D,
6 - DINAMANI, P ., HINE, P.M., JONES, J.B . . The occurence and characteristics of the hemocyte parasite, Bonamia ostreae, in New Zealand dredge oyster, Tio st rea lutaria. In press.
7 - ELSTON, R.A., FARLEY, C.A., KENT, M.L., 1986. Occurence and significance of bonamiasis in European fIat oysters Ostrea edulis in North America. Diseases of aquatic organisms, 2 : 49-54
8 - ELSTON , R.A., KENT, M.L., Ostrea edulis to Aquaculture 64
WILKINSON, M.T., 1987. Resistance of Bonamia ostreae infection. 237-242
9 - GRIZEL , H . , 1985. Etude des récentes ép izooties de l'huître plate Ostrea edulis Linné et de leur impact sur l'ostréiculture bretonne. Thèse, Doct. Etat Sci. Nat . , Montpellier 145 pp.
10 - GRIZEL, H., COMPS, M., COUSSERANS, F., BONAMI , J.H ., VAGO , C., 1974. Etude d'un parasite de la glande digestive observé au cours de l'épizootie actuelle de l'huîtr e plate. C.R. Acad. Scien., Papis, D, 279 : 783 -7 84
28
11 - HASKIN, H.M., STAUBER, A., MACKIN, J.G., 1966. Minchinia nelscni n.sp. (Haplosporida, Haplosporidiidae) causative agent of the Delaware Bay oyster epizootie.
Science 153 : 1414-1416
12 - MACKIN , J . G., OWEN, H.M., COLLIER, A., 1950. Preliminary rate on the occurence of a new protistan parasite, Dermocystidium marinum n.sp. in Crassotrea virqinica (Gmelin) Science 111 : 328-329
13 - MEURIOT, E., GRIZEL, H., 1984. Note sur l'impact économique des maladies de l'huître plate en Bretagne. Rapport IFREMER .
14 - MIALHE, E . , BACHERE, E., CHAGOT, D., GRIZEL, H .. Isolation and purification of the protozoan Bonamia ostreae (pichot and coll, 1979), a parasite affecting the fIat oyster Ostrea edul is L. (sous presse).
15 - MIALHE E . , BOULO, V., COCHENNEC, N., GRIZEL, H., ROGIER, H., CLAVIES, C., HERVAUD, E., PAU, B., PUYGRENIER, M. and P~6LUCCl, ~ . . Monoclonal antibodies against Bonamia ostreae, protozoan parasite of the fIat oyster Ostre a edulis in European Association of fish pathologist conference, Bergen, Norway August 31 - September 3, 1 987.
16 -PARKS , D.R., BRYAN, V.M., al, V.T. and HERZENBERG, L.A., 1979. Antigen specific identification and cloning of hybridomas with a fluorescence-activated cell sorter (FACSl Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76 : 1962.
17 - PICHOT, Y., 1984. Contribution à l'étude des protozooses de l'huître plate Ostrea edulis Linné, 1758. Thèse Doctorat Université,Univ. Sei. Techn. Languedoc, Montpellier, 90 p.
18 - PODER , M. , CAHOUR, A., BALOUET, G .. Hemocytic parasitosis in European oyster Ostrea edulis L. : Pathology and contamination in"rlIrd Int. Coll. on Invertebr. Pathol. proc!, Brighton, U.K., 6-10 Sept, 1982.
19 - TIG E, G. , GRIZEL, H .. Evolution of the haemocytic disease caused by Bonamia ostreae in"IIIrd Int. Coll. Invertebr . Pathol. Proc.", Brighton, U.K., 6-10 Sept. 1982
20 - VA N BANNING, P., 1982. So rne aspects of the occurence, importance and control of the oyster pathogen Bonamia ostreae in Dutch oyster culture, in"IIIrd Int. Co ll. Invertebr. Pathol. Proc .", Brightlln, U. K., 6- 1 0 Sept. 19 8 2 .
21 - WOOD, J.L . , ANDR EWS, J.D., 1962. Haplosporidium costa le (sporozoa) associated with a disease of Virginia oyste r s , Science, 136 : 710- 71 1.
29
top related