identification des champignons
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Identification des champignons
Identification champignons
Isolement des moisissures
•La plupart des milieux naturels air, sol, eau et matières premières
alimentaires peuvent servir de matériel de départ pour l’isolement des
moisissures.
• Ces échantillons naturels contiennent aussi plusieurs espèces bactériennes
et des levures.
• L’élimination des ces microorganismes pour l’isolement sélectif des
champignons filamenteux est réalisé en combinant le traitement des milieux
de cultures par un antibiotique avec le choix et le contrôle des conditions de
culture.
Identification champignons
Isolement des moisissures
1. Milieux de culture
• De très nombreux milieux sont utilisables pour la culture des champignons,
certains sont très spécifiques d’un groupe d’espèces, d’autres permettent la
culture de très nombreuses espèces.
• L’aspect cultural des moisissures peut considérablement changer d’un milieu
à l’autre.
• Quelques exemples de milieux de culture: PDA, Sabouraud, Malt agar …..
Identification champignons
Isolement des moisissures
1. Milieux de culture
Composition milieu PDA (Potato Dextrose Agar)
200g de pomme de terre ; 15g de Dextrose; 20g d’agar; 1L d’eau
distillée
Composition milieu Malt agar
10g Malt; 15g agar ; 1L d’eau distillée
Composition milieu Sabouraud
10g peptone; 20g de glucose; 15g d’agar; 1L d’eau distillée et quelques
vitamines et facteurs de croissance.
Composition milieu Czapek
3g NaNO3; 5g MgSO4,7H2O; 0.5g KCL; 0.01g FeSO4, 7H2O; 1g
K2HPO4; 30g saccharose; 15g agar ; 1L d’eau distillée
Identification champignons
Isolement des moisissures
2. Addition des antibiotiques
• L’isolement des moisissures est réalisé le plus souvent à partir de
produits contenant, également des bactéries et des levures, donc il est
nécessaire d’employer des inhibiteurs spécifiques pour les détruire.
• L’addition d’antibiotiques aux milieux de cultures est utilisée pour
empêcher le développement des bactéries.
• Les antibiotiques utilisés sont : le chloramphénicol, la gentamycine,
l’oxytétracycline, streptomycine, colistine, novobiocine ou des
colorants (rose Bengale, cristal violet).
• En raison de leur stabilité, la gentamycine et la chloramphénicol
peuvent etres stérilisés avec le milieu et leurs larges spectres d’action
en font des antibiotiques très utilisés.
Identification champignons
Isolement des moisissures
3. Choix des milieux de cultures sélectifs
• Ces milieux sont utilisés pour la détermination de champignons
appartenant le plus souvent à des genres difficiles à mettre en évidence en
favorisant la croissance de certains genres ou espèces facilitant ainsi leur
caractérisation.
• A titre d’exemple: Aspergillus flavus et Aspergillus Parasiticus isolés sur
milieu Aspergillus flavus et Parasiticus agar (AFPA) qui permet une
caractérisation simple par la couleur jaune orangé de l’envers des colonies.
• Milieu gélose à la créatine (CREA) permet d’identifier par leur apparence
diverses espèces d’Aspergillus, Penicillium.
Identification champignons
• L’identification des champignons présente est une étape
primordiale.
• Pendant longtemps, cette identification a été uniquement
basée sur l’observation des caractères culturaux et
morphologiques de l’espèce.
• Les progrès de la biologie moléculaire ont permis de
proposer des outils aidant à faire l’identification en prenant
aussi en compte la séquence de certains gènes d’interèts.
• L’analyse du potentiel métabolique d’une souche fongique
peut aussi apporter des éléments importants permettant
d’orienter l’identification mais aussi de mieux évaluer le risque
lié à son développement (comme la production de
mycotoxines).
Identification morphologiques
• Pour identifier une espèce fongique, l’analyse morphologique est
indispensable.
• Elle repose sur des critères macroscopiques (aspect des colonies, de
leurs revers, exsudats, production de sclérotes …) et microscopiques
(aspect du mycélium, des spores, des phialides, des conidiophores,
des conidies…).
• Des paramètres culturaux comme la température et la vitesse de
croissance peuvent aussi être pris en compte.
• Plusieurs critères sont à prendre en considération lors de
l’identification morphologiques (macroscopiques et microscopiques).
Identification champignons
Critères d’identification macroscopique
Sur milieu de culture, les champignons filamenteux forment
des colonies dont l’aspect peut être variable.
• Structure du thalle: les colonies peuvent apparaitre duveteuse,
laineuse, cotonneuse, veloutés, poudreuse ou granuleuse.
• Relief des colonies: les colonies peuvent être plates ou
plissées et leur consistance peut être variable (molle, friable,
élastique ou dure).
• Taille des colonies: après une période d’incubation donnée, on
peut observer de petites colonies (Cladosporium) ou au contraire
des colonies étendues, envahissantes (mucor, rhizopus).
Identification champignons
Critères d’identification macroscopique
• Couleur des colonies : elle peut aider à identifier le genre
fongique voire même parfois à différencier les différentes
espèces au sein d’un genre. Les couleurs sont variées: blanche,
crème, jaune, orange, noire, violet, vert, bleu…les pigments
peuvent être localisés au niveau du thalle (mycélium,
conidiophores, spores …) ou diffuser dans le milieu de culture.
La couleur du revers de la colonie peut être informative.
• Structure des fructification: la présence ou l’absence au centre
de la colonie, des structures de fructification
sexuée(cléistothèces ….) ou asexué (pycnides ou acervules) est
aussi un élément important de diagnostic.
Identification champignons
Couleur colonies
Critères d’identification microscopique
l’identification microscopique est réalisé grâce à un étalement
entre lame et lamelle, ou bien en réalisant un scotch test. On utilise
le plus souvent comme liquide de montage du bleu de coton dilué
dans du lactophénol d’Amann.
Un examen généralement réalisé à l’objectif 40, est suffisant pour
mettre en évidence la plupart des élements importants de diagnose.
Identification champignons
Critères d’identification microscopique
• Thalle: tous les champignons possèdent un appareil
végétatif constitué de filaments (hyphes) qui ensemble
forment le thalle filamenteux ou mycélium ; le thalle peut
étre siphonné ou septé.
Thalle siphonné: constitué d’éléments tubulaires peu
ou pas ramifiés, de diamètre large et irrégulier non
cloisonné (5 à 15µm), non cloisonné est caractéristique
des zygomycètes.
Thalle cloisonné: constitué de filaments de
diamètre étroits ( 2 à 5µm) et régulier, divisé par des
cloisons en articles uni ou pluricellulaire est caractéristique
des ascomycétes, basidiomycètes et deutéromycètes.
Identification champignons
• Les spores issues de la reproduction asexuée:
l’examen des spores et de leur organisation est
une étape importante de l’identification
fongique. Elles peuvent étre endogènes ou
exogènes :
Les spores endogènes (endospores) sont
produites à l’interieur d’un sac fermé (sporange),
porté par un filament spécialisé
(sporangiophore). Ces spores que l’on observe
par exemple chez les Mucorales, sont libérées
suite à la déchirure de la paroi de sporange à
maturité.
Les spores exogènes (conidies), retrouvées
chez les ascomycètes, basidiomycètes et
deutéromycètes, sont formées à partir d’une
cellule spécialisée (cellule conidiogène).
Critères d’identification microscopique
Identification champignons
d’après la forme et les modalités de septation, on
distinguer 5 groupes de spores :
1. Les amérospores : spores unicellulaires de petite
taille (Penicillium et Aspergillus)
2.Les didymospores: spores bicellulaires
(Trichothecium)
3. Les phragmospores: spores pluricellulaires à cloison
transversales (Curvularia)
4. Les dictyospores: spores pluricellulaires à cloison
transversales et longtidinales (Alternaria)
5. Les scolécospores: spores étroites, effilées, souvent
incurvées et cloisonnées transversalement
(Fusarium)
Critères d’identification microscopique
Identification champignons
Critères d’identification microscopique
Les conidies sont en général regroupés à l’extrémité
de la cellule conidiogène. L’organisation de ce
regroupement est aussi un facteur d’identification.
Les principaux types sont :
1. Grappes : Beauveria, Trichothecium
2. Masse: Botrytis
3. Tètes ou glomérules: Acremonium, Trichoderma
4. Chaines basipètes : Scopulariopsis, Aspergillus,
Penicillium
5. Chaines acropètes: Cladosporium, Alternaria
Identification champignons
Critères d’identification microscopique
a. Regroupées à l’extrémité dilatée du
conidiophore, formant une tète (ex:
Aspergillus).
b. Regroupées en verticille au sommet
du conidiophores, formant un pinceau
(ex: Penicillium).
a. Disposées en verticille le long du
conidiophore (ex: Verticillium).
Identification champignons
Critères d’identification microscopique
Remarque:
La présence des chlamydospores peut aider à l’identification notamment des
espèces du genre Fusarium.
Ce sont des éléments de résistance, formés à partir du filament mycélien ou à
son extrémité, ayant une paroi épaisse. Contrairement aux autres spores, les
chlamydospores ne possèdent pas de mécanismes de libération permettant
leur dissémination à maturité. Bien qu’elles puissent étre présentes chez
presque toutes les espèces lorsque les conditions défavorables.
Chlamydospores
Identification champignons
Identification physiologique
• L’étude de l’impact des paramètres environnementaux sur la croissance
d’une espèce fongique peut aussi apporter des éléments intéressants
d’aide à la diagnose.
• La grande capacité d’adaptation des moisissures fait que ces
paramètres ne peuvent, à eux seuls, permettre l’identification au stade
d’espèce. Cependant, ils peuvent apporter des éléments
complémentaires à une analyse morphologique.
• Les principaux paramètres pouvant influencer la croissance fongique
sont les mêmes que ceux qui influencent la croissance de tout
microorganisme.
Activité de l’eau (Aw)
pH
Présence d’oxygène
Température
Identification champignons
Identification moléculaire
• Au cours des dernières années, les progrés de la biologie moléculaire ont
été progressivement mis à profit dans l’identification des espèces fongiques.
• Ces méthodes reposent sur l’étude des acides nucléiques (ADN et ARN).
Dans l’immense majorité des cas, l’identification moléculaire nécessite un
isolement préalable des souches (identification de souches pures et non
directement à partir d’un échantillon biologique ou alimentaire).
• Les méthodes les plus utilisées sont basées sur l’amplification par PCR
(Polymerase Chain Reaction) de certaines régions spécifiques et notamment
des Internal Transcribed Spacers (ITS) qui correspondent à des portions
d’ADN ribosomique non transcrite et fortement polymorphe en fonction des
espèces.
Identification champignons
• Pour l’étude des espèces proches phylogénétiquement, il peut
étre utile d’ajouter l’étude de la séquence d’autres gènes comme
par exemple: la béta tubuline, la calmoduline, ou le mating type
factor ..
• En fonction des genres fongiques, les gènes cibles pour
l’identification d’espèce peuvent varier.
• Ces outils moléculaires sont utiles pour confirmer ou préciser
l’identification des espèces morphologiquement très proches, voire
caractériser de nouvelles espèces.
Identification moléculaire
Identification champignons
Identification moléculaire
Identification champignons
Identification moléculaire
Identification champignons
Identification moléculaire
• Si les techniques classiques d’observations sont longues
imprécises et nécessitent l’expertise d’un mycologue, les
techniques de biologie moléculaire permettent d’obtenir une
identification fiable et représentent la référence en matière
d’identification.
• Cependant, de nouvelles méthodes d’identifications ont émergé
des dernières années, notamment les méthodes spectrales, qui
pourraient être appliquées à l’identification haut débit et peu
couteuse des champignons filamenteux. Ces méthodes
comprennent la spectrométrie de masse MALDI TOF et les
spectroscopies.
Identification champignons
Identification moléculaire
Spectrométrie de masse MALDI TOF
• La spectrométrie de masse est utilisée en chimie depuis de
nombreuses années mais sa première application à l’identification
bactérienne remonte à 1975.
• La spectrométrie de masse « Matrix Assisted Laser Desorption
Lonisation Time Of Flight = MALDI TOF » est une technique couplant
une source d’ionisation laser assistée par une matrice et un analyseur à
temps de vol.
• Le principe se base sur l’ionisation des protéines fongiques par un
rayon laser et la création des pics caractéristiques (spectre). À partir
d’une base de données de spectres, le logiciel associé recherche la
correspondance à l’espèce de champignon selon un indice de fiabilité
entre les deux spectres.
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Identification champignons
Identification moléculaire
Spectrométrie de masse MALDI TOF
• L’instrument est composé de trois éléments fonctionnels :
Une source d’ionisation pour transférer les ions moléculaires de
l’échantillon dans l’analyseur.
Un analyseur de masse pour séparer les ions en fonction de leur ratio
masse / charge.
Un détecteur.
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Identification champignons
Identification moléculaire
Identification moléculaire
Spectrométrie de masse MALDI TOF
• La plupart des microorganismes peuvent étre analysés sans lyse
cellulaire préalable car l’exposition à l’acidité de la matrice permet
de lyser les cellules.
• Cependant, certains organismes comme les champignons
filamenteux ayant une paroi épaisse et résistante, il est préférable
de passer par une étape d’extraction avant l’analyse par
spectrométrie de masse.
Identification champignons
Identification moléculaire
Spectrométrie de masse MALDI TOF
• La matrice va absorber l’énergie du laser conduisant à la désorption des
échantillons qui sont ainsi ionisés et propulsés dans l’analyseur TOF, un
tube de métal sous vide, dans lequel les ions vont être séparés en
fonction de leur ratio m/z, avant d’atteindre le détecteur..
• Chaque pic du spectre de masse correspondra ainsi à un rapport m/z et
la hauteur du pic sera proportionnelle au nombre d’ions de même m/z
ayant atteint le détecteur.
• La spectrométrie de masse MALDI TOF est une technique rapide,
répétable et peu couteuse en terme de cout d’analyse par échantillon, et
elle permet de générer es spectres de masse caractéristiques via la
détection des protéines ribosomales dont l’expression est abondante,
constante et bien conservée d’une espèce à l’autre, ce qui en fait une
candidate idéale pour l’identification microbienne.
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Identification moléculaire
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