domaine : science et technique filière génie des … · iii-4- la classification des bactéries...
Post on 02-Sep-2018
217 Views
Preview:
TRANSCRIPT
UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA
Faculté des Sciences et Technologie
et Sciences de la Matière
Département de Génie des Procédés
Mémoire
MASTER ACADEMIQUE
Domaine : Science et Technique
Filière Génie des Procédés
Spécialité : Génie chimique
Presenté par : ABBASSI KARIMA
Thème
Soutenu le 25/06/2012
Devant le jury composé de :
Mr. TABCHOUCHE Ahmed MA (A). Président Mr. KAHOUL Fares MA (B). Examinateur
Mr. GUERRI Messaoud MA (A). Rapporteur
2011-2012
Synthèse de l’acide acétylsalicylique et l’étude de
son effet synergique avec le noyau de l’acide 6-
aminopénicillanique 6-APA
N° d’ordre :
N° de série :
SOMMAIRE
Introduction générale 1
Chapitre I : Généralités sur les composes aromatiques
I-1-Introduction 2
I-2- Nomenclature des composés aromatiques 2
I-3-Les propriétés chimiques des composés aromatiques 4
I- I-3-1- La réaction de substitution électrophile 4
I-4-Les déferlants types de composées aromatiques
I -4-1-Les ester aromatique
I-4-1-Les amides aromatiques
5
5
6
Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques
II-1- Historique 7
II-2-Définition
II-3-Classification
7
7
II.4. Les pénicillines
II.4.1.Définition
II.4.2.Structure générale
II.4.3.Classification II.4.4.Activité antibactérienne
8
8
8
8
10
Chapitre III : Généralités sur la microbiologie
III-1-Introduction 11
III-2- Les bactéries 11
III-3- La structure bactérienne 11
III-4- La classification des bactéries 12
III.4.1.Classification selon le Caractères phénotypiques 12
III.4.2.Classification selon le Caractères génotypiques 13
III.5.Les différents modes d’action des antibiotiques sur les
bactéries
13
III.5.1.Inhibition de la synthèse de la paroi 13
III.5.2.Action sur la membrane 14
III.5.3.Réplication de l’ADN 14
III.5.4.Transcription de l’ADN 14
III.5.5.Traduction de l’ADN 14
Chapitre IV- Matériels et Méthodes
IV.1.Synthèse de l’aspirine
IV.1.1.La réaction
IV.1.2.Conditions expérimentales
IV.1.3.Mode opératoire
15
15
15
16
IV.2.L’acide 6-aminopénicillanique 17
IV.3.Test de l'activité biologique par la méthode des disques de
papier
18
IV.3.1. Les bactéries utilisées 18
IV.3.2. Le matériels et les réactifs utilisés 18
IV. 3.3.Préparation des solutions 18
IV.3.4.Préparation des mélanges de test 20
IV.3.5. Préparation des solutions de teste 20
IV.3.6. Préparation des disques de papier 20
IV.3.7. Préparation du milieu de culture 20
IV.3.8. Préparation de la suspension microbienne 20
IV .3.9. Préparation des inoculums 20
IV.3 .10.Test préliminaire 21
Chapitre V- Résultats et discussion
V.1.Introduction 22
V .2.Synthèse des composés 22
V.2.1.préparation de l’aspirine 22
V.2.2.préparation de l’acide 6-aminopénicillanique 24
V.3. La chromatographie 24
V.3.1. La chromatographie sur couche mince (CCM) 24
V.4. Résultats des tests bactériologiques 25
V.4.1. Test préliminaire 26
Conclusion générale 27
Bibliographique
Annexes
Abréviations utilisées
6-APA : L’acide 6-aminopénicilanique
ADN : Acide Di-ribonucléique
CCM : Chromatographie sur couche mince
µm : Micromètre
FITR Infrarouge à Transformé de Fourier
g : Gram
GC : Caractère génotypique
mL : millilitre
NaOH Hydroxyde de sodium
RMN Résonance magnétique nucléaire
IR : Infra rouge
UV : Ultra violet
Teb : Température d’ébullition
Tf : Température de fusion
Rdt : Rendement
Rf Facteur de rétention
ppm : Partie par million
List des figures et schémas
I -List des figures
Figure I-1: Quelques réactions de substitution électrophile sur le cycle aromatique 5
Figure I-2 : Quelques exemples des esters aromatiques 5
Figure I-3 : Exemple des amides aromatiques 6
Figure II-1 : structure générale de la Pénicilline 8
Figure II-2 : structure de base des pénicillines 9
Figure III.1 : La structure bactérienne 11
Figure III.2 : Mode d’action des antibiotiques sur les bactéries 13
Figure V.1: la plaque CCM de l’aspirine 24
II -List des schémas
Schéma II.1 : L'obtention des pénicillines semi synthétique par acylation de 6-APA. 9
Schéma IV-1 : Synthèse de l’aspirine 15
Schéma V.1 : Mécanisme de la synthèse de l’aspirine 23
List des tableaux
Tableau I-1 : Noms triviaux de certains composés aromatiques 3
Tableau IV.1: Préparation des solutions test de l’aspirine 19
Tableau IV.2: Préparation des solutions test de l’acide 6-aminopénicillanique 19
Tableau V.1 : Bandes IR de l’aspirine 24
Tableau V.2 : Bandes IR de L’acide 6-aminopénicillanique 25
Tableau V.3: Test préliminaire avec une solution de NaOH 25
Tableau V.4: L’effet des antibiotiques sur l’Escherichia coli 25
Tableau V.5: L’effet des antibiotiques sur la Staphylocoques 25
Tableau V.6: L’effet des antibiotiques sur la Psudomonase 26
Introduction générale
1
Introduction générale :
La synthèse de molécules organiques à partir de précurseurs simples, est importante
dans l'industrie pharmaceutique. De nouvelles molécules sont souvent conçues et synthétisées
afin de pouvoir évaluer leur activité thérapeutique [1], tel que la synthèse de l'aspirine qui est
un médicament analgésique, antipyrétique, anti-inflammatoire et antiagrégant plaquettaire en
fonction de la dose utilisé. Mais certaines bactéries sont résistantes à l'aspirine, c’est pourquoi
il faut utiliser de nombreux type d'antibiotique comme la pénicilline qui détruise les bactéries
en phase de croissance. Pour étudier les antibiotiques, il faut expliquer quelques définitions
sur les micro-organismes.
Les maladies infectieuses sont responsables de 45% des décès dans les pays à faibles
revenus et de presque une mortalité prématurée sur deux dans le monde entier. Les infections
bactériennes représentent 70% des cas de mortalité causées par les microorganismes [2].
Selon l’Institut Nationale de Santé, les maladies infectieuses représentent la seconde cause des
décès et la première cause de perte d’années de vie productives à travers le monde [3].
La recherche d’une synergie n’est habituellement justifiée que dans les situations où la
bactéricide est difficile à obtenir avec un seul antibiotique. Cependant, la synergie résulte
d’une interaction positive entre deux antibiotiques dont l’action antibactérienne conjointe est
supérieure à la somme des actions de chacun des deux antibiotiques pris isolément. Une
synergie ou un antagonisme observé in vitro ne sont pas toujours extrapolables en clinique.
En effet, les conditions d’action in vivo de deux antibiotiques peuvent être influencées par des
paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques mal pris en compte in vitro [4].
L’utilisation de l’aspirine comme un anti-inflammatoire a un rôle très important dans
le domaine de la chimiothérapie. Cependant, l’association de ce produit avec l’acide 6-
aminopinicillanique peut donner une suite synergique et apporter un degré élevé d’activité
antibactérienne. C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à étudier l’effet synergique de
ce composé avec l’acide 6-aminopinicillanique.
Ce travail est réparti en cinq chapitres ; le premier chapitre est consacré pour des
généralités sur les composés aromatiques, tandis que le deuxième chapitre représente des
généralités sur les antibiotiques, le troisième chapitre décrit des généralités sur la
microbiologie, le quatrième chapitre présente les méthodes et le matériels utilisés, et enfin,
résultats et discussions.
Chapitre I chimie de Composés aromatiques
2
I-1-Introduction :
Le terme aromatique a été utilisé à l’origine pour décrire des molécules odorantes comme
le benzaldéhyde (qu’on retrouve dans les cerises, les pêches et les amandes), le toluène
(provenant du baume de tolu) et le benzène (issu de la distillation du charbon). Il a été montré
par la suite que les composés aromatiques ont un comportement chimique différent de celui des
autres composés.
Le terme aromatique sert à présent à décrire la classe de composés qui comportent des
cycles de type benzénique (cycles à six atomes comportant trois doubles liaisons). Plusieurs
composés importants sont aromatiques en partie, comme l’hormone stéroïdique œstrone, ou
l’analgésique ibuprofène. Le benzène lui- même est responsable de la baisse du nombre de
globules blancs par exposition prolongée et n’est plus utilisé comme solvant au laboratoire [1].
I-2-Nomenclature des composés aromatiques
Les substances aromatiques, plus que toutes autres classes de composés organiques,
ont hérité de nombreux noms triviaux, même si l’emploi de tels noms est à éviter. L’IUPAC
permet l’utilisation de ceux présentés dans le tableau I.1. Ainsi, le méthyl-benzène est
habituellement connu comme étant le toluène, hydroxy-benzène comme le phénol et l’amino-
benzène comme l’aniline etc [1].
Chapitre I chimie de Composés aromatiques
3
Tableau I-1 : Noms triviaux de certains composés aromatiques [1].
Les benzènes monosubstitués sont nommés de la même façon que les autres
hydrocarbures en ajoutant le suffixe benzène. Ainsi, C6H5Br est le bromo-benzène et
C6CH5CH2CH3 l’éthyl-benzène. Le préfix phényl est employé lorsque le groupement C6H5
est considéré comme substituant et le nom benzyl est utilisé pour le groupement C6H5CH2.
Les composés benzéniques di-substitués sont nommés à l’aide des préfixes
ortho- (o), méta- (m), ou para-(p). Dans un composé ortho-di-substitué, les deux substituant se
trouvent en position 1,2 sur le cycle ; un méta-di-substitué a ses deux substituant en position
1,3, tandis qu'un para-di-substitué a ses deux substituant en position 1,4 :
Chapitre I chimie de Composés aromatiques
4
Les composés benzéniques ayant plus de deux substituant sont nommés en numérotant
les positions des différents substituant du cycle de telle façon que les nombres les plus faibles
soient utilisés. Les substituant sont nommés dans l’ordre alphabétique.
Dans le troisième exemple, on a utilisé le suffixe -toluène au lieu-de -benzène. On peut
prendre n’importe quel des composés aromatiques monosubstitués du tableau 1 comme
suffixe; dans ce cas, le substituant principal (par exemple le -CH3 dans le toluène) est porté
par définition par le carbone n° 1. Ceci est illustré par les deux exemples suivants :
I-3. Les propriétés chimiques des composés aromatiques :
I-3.1. La réaction de substitution électrophile :
La réaction la plus importante des composés aromatiques est la substitution électrophile. Il s’agit
de la réaction d’un réactif déficient en électrons (électrophile E+) avec un noyau aromatique, qui conduit
à la substitution d’un des atomes d’hydrogène du cycle.
Plusieurs substituant peuvent être introduits sur le cycle aromatique par des réactions de
substitution électrophile, comme il est illustré dans la figure suivante (figure1) [1]:
Chapitre I chimie de Composés aromatiques
5
Figure I-1: Quelques réactions de substitution électrophile sur le cycle aromatique.
I.4.Les différentes familles des composes aromatiques :
I .4.1.Les ester aromatique :
Les esters sont des composés qui répondent à la formule générale R-COO-R '. Tandis
que, les esters aromatiques sont probablement les dérivés les plus importants des acides
aromatiques, parce qu’ils sont très répandus dans la nature et servent à des usages très divers.
La figure I.2, représente quelques exemples des esters aromatiques.
Figure I-2 : quelques exemples des esters aromatiques.
Chapitre I chimie de Composés aromatiques
6
I.4.2.Les amides aromatiques :
Parmi les dérivés des acides carboxyliques aromatiques, on peut citer, les amides
aromatiques, qui répondent à la formule générale R-CON-R2, et qui sont les moins sensibles
à l’attaque nucléophile. Un exemple des amides aromatique est représenté dans la figure
suivante [5]:
Figure I-3 : Exemple des amides aromatiques.
Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques
7
II.1.Historique :
En 1928, Alexander Fleming constate que les staphylocoques dorés qu’il avait
ensemencés sur une gélose nutritive ne sont pas développés à proximité d’une moisissure de
type pénicillium qui avait souillé une culture, il émet l’hypothèse que le pénicillium sécrète
une substance qui tue ou inhibe le développement des staphylocoques, c’est par hasard qu’il a
ainsi découvert la pénicilline, ce premier antibiotique ne sera utilisé qu’à partir de 1942 [6].
II.2.Définition :
Les antibiotiques sont des substances chimiques produites par différent espèces de micro-
organismes, et dont le rôle est de supprimer la croissance d’autres micro-organismes
pathogènes, et éventuellement la destruction de ces derniers [7].
II.3.Classification :
Les antibiotiques sont regroupés en familles dans lesquelles les différents produits ont
une communauté de structure chimique et un mécanisme d’action identiques (ces deux
propriétés étant souvent liées). Les antibiotiques actuellement utilisés en médecine sont
regroupés en 10 familles : les B-lactamines, les aminosides, les phénicolés, les cyclines, les
macrolides, les lincosamines, les synergistines, les polypeptides, les glycopeptides, et les
quinolanes. Un certain nombre de produits orphelins comme les rifamycines, la fosfomycine
doivent être ajoutés à cette liste.
Les sulfamides, inhibiteurs compétitifs de l’acide para-amino-benzoïque dans la synthèse
de l’acide folique ne sont pas à proprement parler des antibiotiques.
A l’intérieur d’une famille, les produits peuvent être regroupés selon leur spectre
d’activité (ensemble des groupes bactériens sensibles à l’antibiotique considéré). Ils peuvent
aussi être regroupés en fonction des modifications successives qui ont été apportées à leur
structure chimique, pour améliorer leur spectre d’activité ou leur pharmacologie ; On parle
alors de (générations d’antibiotiques) [8].
Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques
8
II.4. Les pénicillines :
II.4.1.Définition :
Les pénicillines sont des bactéricides apparents à la famille des bâtalactamines [9]. La
pénicilline peut être extraite à partir de nombreuses espèces de Pénicillium et
d’Aspergillus. Historiquement, c'est la souche de Penicillium notatum qui était utilisée
[10].
Les Pénicillines sont indiquées dans le traitement des infections à germes sensibles
telles que l’angine streptocoque, l’érysipèle, l’endocardite bactérienne (infection d’une des
tuniques du cœur, l’endocarde), la syphilis et l’angine de Vincent, et en prévention des
crises de rhumatisme articulaire aigu.
Le spectre des Pénicilline est en médicaments sont peu nombreuses : bacille de la
diphtérie, gonocoque, méningocoque, etc. par ailleurs, les bactéries deviennent de plus en
plus résistantes aux pénicillines, certaines sécrètent une enzyme, la pénicillines, capable
de détruire plusieurs variétés de pénicillines [9].
II.4.2.Structure générale :
Elles sont constituées d’un noyon théazolidine (A) attaché à un noyon béta-lactam(B),
portant un groupement amine secondaire (R-NH-R’). Le radical acide R peut être attaché
ou bien séparé du groupement amine par les bactéries et autres amidases (Figure 2) [7].
Figure II.1 : Structure générale de la Pénicilline.
L’acide 6-aminopénicillanique (cycle thiazolidine lié au cycle beta-lactame) est le
noyau de base des pénicillines.
Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques
9
Figure II.2 : Structure de base des pénicillines (6-APA).
Il peut être substitué par l’acylation de la fonction amine, à l'aide de chlorures d'acyles
dans l'acétone et en présence de la triéthylamine pour neutraliser HCl formé et donner des
dérivés qui se caractérisent par leur stabilité.
Schéma II.1 : L'obtention des pénicillines semi synthétique par acylation de 6-APA.
Par ailleurs, la fonction carboxylique peut être transformée en carboxylate (plus
soluble) où permettre l’obtention d’esters (prodrogues). Cette fonction acide est toutefois
essentielle à l’activité antibactérienne (elle fait partie du pharmacophorie)[11].
II.4.3.Classification :
Les diverses Pénicillines peuvent être classées de la façon suivante en fonction de
certaines de leurs propriétés :
II.4.3.1.Groupe G :
Les pénicillines G sont d’origines naturelles, elles sont très soluble dans l’eau, mais
instable en solution, inactivée par l’acidité gastrique, elles doivent être administrées par vois
parentérale. On l’utilise aussi bien sous forme de sel de sodium ou de potassium.
Chapitre II : Généralités sur les antibiotiques
10
II.4.3.2.Groupe M :
Les pénicillines du groupe M sont particulièrement indiquées pour le traitement des
infections à staphylocoques producteurs de cet enzyme. Elles sont sensiblement moins actives
que les précédentes, mais résistantes à la pénicillinase.
II.4.3.3.Groupe A (ampicilline) :
Ces pénicillines semi-synthétiques ont le spectre d’activité de la pénicilline G avec une
action élargie sur les entérocoques et les bacilles Gram négatifs [6]. Elles sont encore très
largement utilisées notamment à cause de leur excellente diffusion [8].
II.4.3.4.Pénicillines anti-pyocyaniques :
Membres plus récents du groupe des pénicillines.
On distingue actuellement deux principaux groupes :
Les carboxypénicillines ;
Les uréidopénicillines.
II.4.4.Activité antibactérienne :
Les étapes du mécanisme antibactérien sont :
a. Liaison de la molécule de pénicilline aux protéines spécifiques dites
PBPC(PénicillinBindingProtéins) qui jouent le rôle de récepteur bactériende la
pénicilline,
b. Inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne par blocage de la transpeptidation des
peptidoglycans,
c. Activation des enzymes autolytiques de la paroi bactérienne conduisant à la lyse
bactérienne [6].
Chapitre III généralités sur la microbiologie
11
III.1.Introduction :
La microbiologie a souvent été définie comme l’étude d’organismes trop petits pour
être vus à l’œil nu, on peut même dire c’est l’étude des micro-organismes. Elle est
principalement concernée par les organismes d’un diamètre inferieur à un millimètre, qui sont
invisibles et doivent être examinés au microscope, tels que les virus, les bactéries [11].
III.2.Les bactéries :
Les bactéries sont les plus petits organismes connus, doués de métabolisme et capables
de croitre et de se diviser aux dépens de substances nutritives. Leur diamètre est
habituellement d’environ 1µm [10].
III.3.La structure bactérienne :
C’est la microscopie électronique avec ses différents modes d’exploitation qui a mis
en lumière l’architecture de la bactérie telle quelle est représentée dans la (figure III.1).
Figure III.1 : La structure bactérienne.
Les coupes ultrafines ont permis en particulier de découvrir la ((structure fine)) des
bactéries. La cellule apparait entourée d’une enveloppe rigide, la paroi qui lui donne sa forme,
Chapitre III généralités sur la microbiologie
12
sa résistance et qui entoure une seconde enveloppe beaucoup plus mince et plus délicate, la
membrane cytoplasmique. Le cytoplasme sous-jacent, en général très homogène, contient
essentiellement des granulations d’acide ribonucléique, les ribosomes, parfois aussi des
substances de réserve qui rendement sa structure plus grossière. Il ne referme aucun des
organismes décrit dans la cellule eucaryote (réticulum endoplasmique, mitochondries…).
Dans le cytoplasme, l’appareil nucléaire se distingue par son aspect fibrillaire,
finement réticulé. Il n’est pas entouré d’une membrane. La paroi, la membrane, le cytoplasme
et l’appareil nucléaire représente les structures essentielles de la cellule. Elles sont toujours
présentes. D’autres peuvent éventuellement s’y adjoindre : la capsule, enveloppe externe qui
pet prendre un développement considérable lorsqu’on favorise la synthèse de ses
constituants ; les flagelles de nature protéique, qui confèrent à la bactérie sa mobilité ; enfin
les pili au fimbriae plus fins que les flagelles rigides et cassants ; certains, appelés pili sexuels
joueraient un rôle au cours de la conjugaison bactérienne [10].
III.4.La classification des bactéries :
Une classification des bactéries est nécessaire à la communication scientifique. Les
bactéries sont classées selon une nomenclature internationale, elles sont désignées par deux
mots latins écrits en italique : le premier, commençant par une majuscule, désigne le genre, et
le second en commençant par une minuscule, caractérise l'espèce (par exemple
Staphylocoques aureus). En pratique, on utilise aussi des termes communs tels que
staphylocoque, colibacille, etc.
La classification des bactéries (taxonomie) a d'abord été fondée sur l'étude de leurs
caractères phénotypiques, puis de leurs caractères génotypiques.
III.4.1.Classification selon le Caractères phénotypiques :
• La morphologie : forme de la bactérie, mobilité éventuelle traduisant la présence de
flagelles, présence éventuelle de spores : coloration de Gram, aspect des colonies, etc. [12].
• Les propriétés biochimiques : relation avec l'oxygène, utilisation de différentes sources
de carbone, besoin en facteurs de croissance.
• La nature des antigènes de surface.
• La sensibilité aux antibiotiques.
• La sensibilité à des bactériophages.
Chapitre III généralités sur la microbiologie
13
• L'analyse des constituants de la paroi.
III.4.2.Classification selon le Caractères génotypiques :
Ils reposent sur l'étude du génome.
• La composition en base de l'ADN (GC%) peut varier selon les espèces.
• La mesure du pourcentage d'homologie de l'ADN avec une souche de référence (déterminé
par hybridation) est une méthode qui a été très utilisée en taxonomie. On considère que des
souches ayant plus de 70% d'homologie appartiennent à la même espèce. Ce critère a conduit
à modifier des classifications qui avaient été établies en fonction de caractères phénotypiques.
Le séquençage du gène de l'ADN ribosomal 16S, gène qui comporte des régions
conservées et des régions variables, est également très employé pour la classification des
bactéries [13].
III.5.Les différents modes d’action des antibiotiques sur les bactéries :
Ils agissent au niveau du métabolisme cellulaire sur des cibles très variées que tente de
schématiser la figure III.2 [10].
Figure III.2 : Mode d’action des antibiotiques sur les bactéries.
III.5.1.Inhibition de la synthèse de la paroi :
Les antibiotiques inhibant la synthèse de paroi sont bactéricides est agissent seulement
sur les germes en phase active de multiplication. Ainsi, lorsque des bactéries Gram positives
Chapitre III généralités sur la microbiologie
14
comme staphylococcus aureus, en voie de croissance, sont traitées par la pénicilline, la
synthèse de leur paroi est arrêtée.
III.5.2.Action sur la membrane :
Les antibiotiques de nature polypeptidique comme la thyrothricine, la polymyxine et les
antibiotiques voisins agissent sur la membrane cytoplasmique à la manière des agents tensio-
actifs. L’intégrité de la structure de la membrane n’est plus maintenue. Les cellules, dont la
plupart des constituants s’échappent, dégénèrent puis meurent, atteintes dans leurs fonctions
vitales essentielles.
III.5.3.Réplication de l’ADN :
La mitomycine C et les porfiromycines en formant des ponts entre les deux chaines de
l’hélice d’ADN empêchent leur migration au moment de la division cellulaire. La réplication
de l’ADN par l’ADN polymérase qui nécessite une séparation totale des deux chaines devient
impossible. Ces substances inhibent donc la synthèse de l’ADN, bloquent la division et
provoquent l’accumulation dans la bactérie d’une grande quantité de désoxy-ribonuclésides
libres et de thymine.
III.5.4.Transcription de l’ADN :
L’actionomycine représente le chef de file de ce type d’agents. Elle ne bloque pas l’activité
de l’ADN polymérase qui réplique l’ADN, mais celle de l’ARN polymérase qui copie lune
des chaines de l’ADN en l’utilisant comme matrice pour la synthèse de l’ARN messager. La
présence d’actionomycine empêche la progression de l’ARN polymérase le long de cette
matrice.
III.5.5.Traduction de l’ADN :
Un certain nombre d’antibiotiques agissent directement sur la synthèse des protéines
au niveau des ribosomes en empêchent la lecture du code ou en la faussant [10].
Chapitre IV : Matériels et Méthodes
15
IV.1.Synthèse de l’aspirine :
Dans notre travail, nous avons choisi un protocole de synthèse pour préparer l’aspirine
qui a été décrit par Nicolas CHEYMOL et all [14]. Ce produit a été testé avec l’acide 6-
aminopénicillianique sur quelques bactéries pour déterminer l’effet synergique.
IV.1.1.La réaction :
Schéma IV-1 : Synthèse de l’aspirine.
Il s’agit d’une réaction d’estérification de l’acide salicylique par l’anhydride acétique en
présence d’acide sulfurique, qui joue le rôle de catalyseur [14].
IV.1.2.Conditions expérimentales :
IV.1.2.1.Réactifs utilisés :
Les réactifs utilisés dans ce travail sont de la marque (Merck).
L’acide salicylique.
L’anhydride acétique.
L’acide sulfurique.
L’éthanol.
IV.1.2.2. Matériels :
L’erlenmeyer de 100 ml.
Bain marie.
Thermomètre.
Pipette pasteur.
cristallisoir de 250 ml.
Agitateur magnétique.
Chapitre IV : Matériels et Méthodes
16
Entonnoir de Buchner.
Fiole à vide.
Evaporateur rotatif.
IV.1.2.3.Le point de fusion :
Le point de fusion a été mesuré sur un tube capillaire par un appareil électro- thermal de
type GALLENKAMP.
IV.1.2.4.La chromatographie :
La chromatographie sur couche mince (CCM) a été réalisée sur les plaques d’alumine, et
les spots ont été révélés par la lampe UV.
IV.1.2.5.Spectre Infrarouge :
Les spectres infrarouges ont été enregistrés sur un appareil FITR, marque SHIMADZU.
IV.1.2.6.Spectres RMN :
Les spectres RMN 1H,
13C ont été enregistrés sur un appareil spectrophotomètre de type
Brucker AC 300 WBP.
IV.1.3.Mode opératoire :
Dans un erlenmeyer de 100 mL dont on a éliminé les traces d’eau par un lavage à
l’acétone et un séchage sous l’air comprimé, (3.0 g, 21.73 mmol, 1 eq) d’acide salicylique sont
introduite suivi par l’addition de 7.0 mL d’anhydride acétique et de 30 à 40 gouttes d’acide
sulfurique à l’aide d’une pipette pasteur. Le mélange est placé dans un bain d’eau à 80 °C et
agité pendant 10 minutes, afin de dissoudre le solide et obtenir une solution limpide. Ensuite,
l’erlenmeyer est retiré du bain d’eau et 100 gouttes d’eau sont ajoutées. Le mélange est chauffé à
nouveau sur un bain d’eau pendant 5 minutes et 30 mL d’eau sont ajouté et laissé refroidir à
température ambiante. Un précipité blanc d’acide acétylsalicylique est apparaît et la précipitation
est complétée en plongeant l’erlenmeyer dans un bain d’eau glacée. Le solide est filtré sur un
entonnoir de Buchner, lavé avec 10 mL d’eau glacée, puis recristallisé avec l’éthanol.
Chapitre IV : Matériels et Méthodes
17
IV.1.3.1.Résultats:
Recristallisation(EtOH). Solide blanc, Rdt= 51%.
IR [νmax (KBr, Disc) = 2800– 3300 cm-1
(O-H), 1683.7 cm-1
(C=O) et 1305.7 cm-1
(C-
O)].
Le point de fusion : 135°C (littérature 137°C).
RMN1H (300 MHz, DMSO-d6) : δ=2.24(s, 3H), 7.18 (d,
3J=7.9Hz, 1H), 7.37(t,
3J=7.5 Hz,
1H), 7.62(t, 3J=7.1 Hz, 1H), 7.93 (d,
3J=7.7Hz, 1H) ppm.
RMN 13
C (75MHz, DMS-d6) : δ=21.1, 123.9, 124.6, 126.2, 131.6, 133.8, 150.4, 166.0,
169.4 ppm
C9H8O4 (180 g/mol). Rf (cyclohexane/Acétate d’éthyl ; 20 / 80) = 0.54.
Le point de fusion : 135°C, Lit [14] = 137°C.
IV.2.L’acide 6-aminopénicillanique:
L’acide 6-aminopénicillanique a été préparé dans un laboratoire a SAIDAL et sa structure
a été confirmé par les analyses IR et RMN 1H.
IR [νmax (KBr, Disc) = 3500 cm-1
(N-H), 1772.5 cm-1
(C=O) et 1338.5 cm-1
(C-O)].
RMN 1H(300 MHz, DMSO-d6) : δ=1.47(s, 3H), 1.56(s, 3H), 4.14(s, 1H),
4.55(d, 3J=4.2 Hz, 1H), 5.39(d,
3J=4.2 Hz, 1H) ppm.
Chapitre IV : Matériels et Méthodes
18
IV.3.Test de l'activité biologique par la méthode des disques de papier:
Après la préparation des composés aromatiques, on a testé leur efficacité biologique sur
quelques types de bactérie par la méthode de diffusion dans laboratoire de l’établissement
publique de sante de proximité Ouargla (SEMEP/O).
IV.3.1. Les bactéries utilisées :
Escherichia Coli : Gram Négatif.
Staphylocoques : Gram positif.
Pseudomonase.
IV.3.2. Le matériels et les réactifs utilisés :
Des boite de pétri.
Pipette pasteur.
Disques papier filtre.
Des tubes à essai.
L’eau distillée.
L’eau physiologique.
Autoclave.
IV. 3.3.Préparation des solutions :
IV. 3.3.1.Préparation de la solution mère de l’aspirine :
Dans un bécher de 250 mL (0.5 g) de l’aspirine est introduit, suivit par l’addition de 160
mL de l’eau distillée. Une solution de l’aspirine de concentration 3.125 g/l est obtenue. Ensuite, 1
mL de la solution préparée est transféré dans un erlenmeyer et 30.25 mL de l’eau distillée sont
ajoutés, pour obtenir une solution mère de concentration 100 µg/mL.
IV. 3.3.2.Préparation des solutions test de l’aspirine :
Après avoir préparé la solution mère, des solutions test sont préparés, comme il est
indiqué dans le tableau IV.1.
Chapitre IV : Matériels et Méthodes
19
Tableau IV.1: Préparation des solutions te stde l’aspirine :
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentration
μg/mL
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Volume de
l’eau mL
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Volume de
l’aspirine mL
5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5
IV. 3.3.3.Préparation de la solution mère de l’acide 6-aminopénicillanique:
Dans un bécher de 250 mL (1 g) de 6-APA est introduit, suivit par l’addition de (0.18 g)
de NaOH et 20 mL de l’eau distillée. Le mélange est agité à température ambiante et une solution
de 6-APA de concentration 55.05 g/l est obtenue. Ensuite, 0.1 mL de la solution préparée est
transféré dans un erlenmeyer et 54.95 mL de l’eau distillée sont ajoutés, pour obtenir une solution
mère de concentration 100 µg/mL.
IV. 3.3.4.Préparation des solutions test de l’acide 6-aminopénicillanique:
Après avoir préparé la solution mère, des solutions test sont préparés, comme il est
indiqué dans le tableau IV.2.
Tableau IV.2: Préparation des solutions test de l’acide 6-aminopénicillanique:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentration
μg/ml
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Volume de
l’eau ml
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Volume de la
pénicilline ml
5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5
Chapitre IV : Matériels et Méthodes
20
IV.3.4.Préparation des mélanges de test : Pour préparer les mélanges de test ; on prélève 50 %
de chaque solution qui ont la même concentration.
IV.3.5. Préparation des solutions de teste : On prend 10 ml de solution d’hydroxyde de sodium
à des concentrations différentes.
IV.3.6. Préparation des disques de papier :
On coupe le papier en petits disques de 5 mm de diamètre, on les met dans l’étuve et les
laisser stérilisés à 130 °C pendant 45 minutes.
IV.3.7. Préparation du milieu de culture :
Après la dissolution du milieu de Muller Hinton, on le verse dans les boite de pétri, on
laisse le milieu jusqu’à la solidification et on le sèche dans un étuve pendant 15 minutes pour le
déshumidifier.
IV.3.8. Préparation de la suspension microbienne :
On dépose à chaque fois une goutte du milieu de culture délivrée à la pipette pasteur pour
les trois espèces de bactéries dans des tubes à essai contenant un Bouillon nutritif (10 ml), en
agitant bien, et on prend une suspension de densité 0.5 McFarland pour chaque bactérie. On
disperse la suspension sur le milieu de Muller Hinton contenu dans la boite de pétri, et on passe 3
fois sur la même zone afin de s’assurer qu’il est entièrement couvert, puis on l’incubait pendant
18-24h à 37 0C.
IV .3.9. Préparation des inoculums :
La méthode utilisé pour la préparation des inoculum, est la méthode de VINCENT
(JACOBETAL, 1979) [13]. On prépare deux tube à essai qui contiennent respectivement :
l’aspirine dans l’eau distillée et l’acide 6-aminopénicillanique dans hydroxyde de Sodium, des
disques de papier filtre de 3 mm de diamètre sont immergé dans les tube et sont imprégnés d’une
faible quantité de nos produits, puis à l’aide de distributeur, on les dépose à la surface de boite
pétri préalablement ensemencée à la surface par les bactéries à étudiés. Après l’incubation ; on
fait la lecture des résultats par la mesure de diamètre d’inhibition en mm.
Chapitre IV : Matériels et Méthodes
21
IV.3 .10.Test préliminaire :
Dans le but de tester la toxicité du solvant vis-à-vis les souches bactériennes, on ajoute 2
ml de NaOH à une boite de pétri contenant le milieu de culture, puis on mélange pour
homogénéiser le milieu, et ensemencer les bactéries à étudiés, puis on laisse le milieu jusqu’à la
solidification. Après l’incubation ; on fait la lecture des résultats.
Chapitre V : Résultats et discussion
22
V.1.Introduction :
De nombreux travaux de recherches en synthèse organique montrent l’importance et la
synthèse de l’aspirine. Cependant, après la Première Guerre mondiale, le Traité de Versailles
stipule que la marque et le procédé de fabrication tombent dans le domaine public dans un
certain nombre de pays (France, États-Unis… mais ils perdurent dans d'autres pays comme le
Canada). Tandis que l'acide 6-aminopénicillanique est le noyau de base des pénicillines. Il est
obtenu de la fermentation de la moisissure Penicillium et est utilisé comme composé de départ
dans la préparation de nombreuses pénicillines d'hémisynthèse.
L’originalité de ce travail consiste dans l’étude de l’effet synergique de ces deux
composés.
V .2.Synthèse des composés :
V.2.1.préparation de l’aspirine:
L’acide acétylsalicylique (Aspirine) a été préparé en deux étapes. Dans un premier
temps, l’anhydride acétique réagit avec l’acide sulfurique pour former un intermédiaire
réactionnel. Ce dernier réagit ensuite avec l’acide salicylique pour former l’aspirine selon le
mécanisme indiqué dans le Schéma V.1 [14].
Chapitre V : Résultats et discussion
23
Schéma V.1 : Mécanisme de la synthèse de l’aspirine.
La structure de ce composé a été identifiée par les méthodes spectroscopiques telles
que RMN 1H, RMN
13C et IR.
Le spectre RMN 1H présente cinq signaux distincts, à 2.24 ppm (s, 3H, CH3), 7.18
ppm (d, 1H, CH aromatique), 7.37 ppm (t, 1H, CH aromatique), 7.62 ppm (t, 1H, CH
aromatique) et 7.93 ppm (d, 1H, CH aromatique).
Le spectre RMN 13
C montre neuf signaux à 21.1 ppm (s, CH3), 123.9 ppm (s, CH
aromatique), 124.6 ppm (s, C aromatique), 126.2 ppm (s, CH aromatique), 131.6 ppm (s, CH
aromatique), 133.8 ppm (s, CH aromatique), 150.4 ppm (s, C aromatique), 166.0 ppm (s, C du
groupement acide) et 169.4 ppm (s, C du groupement ester).
Le spectre IR montre deux bandes caractéristiques larges ; entre 2800 cm-1
et 3300
cm-1
attribuée à la vibration d’élongation de la liaison O-H de l’acide aromatique, et à 1683.7
cm-1
attribuée à la vibration de valence de la liaison C=O de l’ester aromatique. D’autres
bandes sont indiquées dans le tableau V.1:
Chapitre V : Résultats et discussion
24
Tableau V.1 : Bandes IR de l’aspirine.
Fréquence cm-1 observation
3050 cm-1
Correspond au C-H aromatique
1751.2 cm-1
Vibration d’élongation du C=O de l’acide
aromatique
1604 .7 cm-1
Vibration d’élongation de C=C aromatique
1305.7 cm-1
Vibration d’élongation de C-O de l’ester
V.2.1.1. La chromatographie sur couche mince (CCM) :
On observe l’apparition d’une seule tache, ce qui preuve qu’on a un seul produit,
comme il est représenté sur la figure suivante :
Figure V.1: la plaque CCM de l’aspirine.
V.2.2.préparation de l’acide 6-aminopénicillanique:
L’acide 6-aminopénicillanique a été préparé dans un laboratoire à SAIDAL, est sa
structure a été confirmé par les méthodes spectroscopiques telles que RMN 1H, IR.
Le spectre RMN 1H présente cinq signaux distincts, à 1.47 ppm (s, 3H, CH3), 1.56
ppm (s, 3H, CH3), 4.14 ppm (s, 1H, CH), 4.55 ppm (d, 1H, CH) et 5.39 ppm (d, 1H, CH).
Le spectre IR montre deux bandes caractéristiques ; à 3500 cm-1
attribuée à la
vibration d’élongation de la liaison N-H de l’amine primaire, et à 1772.5 cm-1
attribuée à la
vibration de valence de la liaison C=O de l’acide. D’autres bandes sont indiquées dans le
tableau V.2:
Chapitre V : Résultats et discussion
25
Tableau V.2 : Bandes IR de L’acide 6-aminopénicillanique.
Fréquence cm-1 observation
2983.7 cm-1
Vibration d’élongation du C-H de CH3
1624.0 cm-1
Vibration d’élongation du C=O de lactame
1338.5 cm-1
Vibration d’élongation de C-O de l’acide
V.4. Résultats des tests bactériologiques :
V.4.1. Test préliminaire :
Tableau V.3: Test préliminaire avec une solution de NaOH.
Souche de test Ensemencement sans
NaOH
Ensemencement avec
NaOH
Escherichia Coli Croissance Croissance
Staphylocoques Croissance Croissance
Psudomonase Croissance Croissance
D’après les résultats du tableau, on constate la croissance des bactéries, ce qui veut
dire que la solution de NaOH n’a aucune influence sur les bactéries.
1) Test sur l’Escherichia coli :
Tableau V.4: L’effet des antibiotiques sur l’Escherichia coli.
Composé Escherichia Coli Diamètre (mm) Catégorie de la
souche
6-APA - 0 R
Aspirine - 0 R
Mélange - 0 R
(+) : sensible au compose, (-) : résistante.
D’après les résultats du tableau, on constate que notre souche (Escherichia Coli) de
test est résistante à l’aspirine et à 6-APA, ainsi qu’au mélange. Donc, les composés
synthétisés n’ont pas une activité antibactérienne.
2) Test sur la Staphylocoques :
Tableau V.5: L’effet des antibiotiques sur la Staphylocoques.
Composé Staphylocoques Diamètre (mm) Catégorie de la
souche
6-APA - 0 R
Aspirine - 0 R
Mélange - 0 R
D’après les résultats du tableau, on constate que notre souche (Staphylocoques) de
test est résistante à l’aspirine et à 6-APA, ainsi qu’au mélange. Donc, les composés
synthétisés n’ont pas une activité antibactérienne.
Chapitre V : Résultats et discussion
26
3) Test sur la Psudomonase :
Tableau V.6: L’effet des antibiotiques sur la Psudomonase.
Composé Psudomonase Diamètre (mm) Catégorie de la
souche
6-APA - 0 R
Aspirine - 0 R
Mélange - 0 R
D’après les résultats du tableau, on constate que notre souche (Psudomonase) de test
est résistante à l’aspirine et à 6-APA, ainsi qu’au mélange. Donc, les composés synthétisés
n’ont pas une activité antibactérienne.
Conclusion générale
27
Conclusion générale :
Ce travail nous a permis d’apprendre beaucoup de choses à savoir ; les différentes
méthodes de synthèses, les techniques de purifications, la maîtrise de différentes méthodes
d’analyses et les testes biologiques.
Nous avons dans un premier temps, synthétisé l’acide acétyl salicylique avec un
rendement acceptable. La purification de ce produit a été faite par la recristallisation dans
l’éthanol et sa structure a été confirmée par les méthodes spectroscopiques telles que ; IR, RMN
1H et RMN
13C. Dans un second temps, nous avons testé ce produit avec 6-APA sur trois types
de bactéries ; Escherichia Coli, Staphylocoques et Pseudomonase.
Et d’après les résultats obtenus, nous constatons que les produits testés n’ont aucune
activité antibactérienne. Cependant, la combinaison des deux produits avec différentes
concentrations n’a donné aucun effet synergique, où antagonisme.
Références
[1]- John. McMurry., Chimie organique, les grands principes, cours et exercices corrigés. .
Dunod, Paris, 2007, p- 171.
[2]-WALSH. C., Antibiotics: action, origins, resistance. Washington,D.C.,ASM.Press, 2003, p-.
[3]-FAUCI. A. S., Infectious diseases: considerations for the 21st century. Clin. Infect. Dis.32.,
2001, p-675-685.
[4]- http://www.sfar.org/cexpassomonoab.html, 5 Juilier 2007.
[5]-K . Peter; C. Vollhardt; Neil. E. Schore., Traité de chimie organique. De boeck, Paris, 2004,
p-832.
[6]-Jeam. Figarelle ; Guyleyral. Michéle. Terret., Microbiologie générale et appliquée, edition
Jacques Lanore, , p-102.
[7]-Helai. Abdelkader., Pharmacologie Fondamentale et clinique, ENAG Edition Alger, 1999, p-
135.
[8]-Jean. Louis. Fauchére ; Jean. Loup., Bactériologie général et médicale, Elipses Edition
Marketing S.A, 2002, p-
[ 9]-Frank. G. Staughter Petit Larousse de médecine, Paris, 2008, p-710.
[10]-H. Leclerc ; D. Izard ; M. O. Husson ; P. Wather ; E. Jakubzak., Microbiologie générale,
doin éditeurs, paris, 1983, p- 284, 286, 287.
[11]-Lansing. M. Prescott; Johm. P. Harhey; Donld. A. Klein., Microbiologie, 2eme
édition
française, , p-2.
[12]-Erimont. Pad, taxonomy and classification of bacteria, manual of clinical microbiology, 7th
edition, 1997, p-.
[13]-Murray. P; Barone. ASM Press, Wasington, ,p-249-261.
[14]-Nicolas. Cheymol ; Michael. Hoff., La microchimie, DeBoeack, Paris, 1999, p-194.
Annexes
L’effet de l’aspirine sur l’Escherichia coli
L’effet de l’aspirine sur la Pseudomonase
L’effet de l’aspirine sur la Staphylocoques
Annexes
L’effet de la 6-APA sur l’Escherichia Coli
L’effet de 6-APA sur la Staphylocoques
L’effet de 6-APA sur la pseudomonas
Annexes
Annexes
Annexes
Annexes
Annexes
Résumé :
L’acide acétylsalicylique a été synthétisé par la réaction de l’acide salicylique et
l’anhydride acétique en présence de l’acide sulfurique comme catalyseur avec rendement
acceptable. La structure de ce produit a été confirmée par L’infrarouge à transformer de
fourrier, RMN 1H et RMN
13C.
Le produit préparé a été testé avec l’acide 6-amino pénicillique sur les bactéries telles
que ; Escherichia Coli, Staphylocoques, Pseudomonase et l’effet synergique a été déterminé.
Mots clés : acide salicylique, anhydride acétique, acide acétylsalicylique, acide 6-amino
pénicillique, effet synergique, bactéries.
Abstract:
The acetyl salicylic acid has been synthesized by the reaction of salicylic acid and acetic
anhydride in presence of sulfuric acid as a catalyst, with an acceptable yield. The product has
been characterized by the FITR, RMN 1H and RMN
13C.
The product has been tested with 6-amino penicillic acid on bacteria Escherichia coli,
Staphylococcus and Pseudomonase, and then the synergic effect was determined.
Keywords: 6-amino penicillic acid, acetyl salicylic acid, salicylic acid, acetic anhydride,
Biological effect.
:ملخص
جم جحضٍس حمض االسحٍم سانٍسٍهٍك عن طسٌق جفاعم حمض انسانٍسٍهٍك مع انهدزٌد اسحٍك فً وجىد حمض
انكبسٌث كمحفز و ذنك بمسدود مقبىل و جم انحاكد من صٍغة هرا انمسكب بىاسطة انححانٍم انمطٍافٍة منها االشعة جحث
RMN انحمساء و انسنٍن اننىوي انمغناطٍسً 1Hو RMN
13C
انبكحٍسٌا انقىنىنٍة انمكىزات انعنقىدٌة و :امٍنى بٍنٍسٍالنٍك عهى انبكحٍسٌا انحانٍة-6هرا انمسكب ثم اخحبازه مع حمض
انبسىدومىناس و جم جحدٌد انحأثٍس انبٍىنىجً
:الكلمات الدالة
امٍنى بٍنٍسٍالنٍك حمض االسحٍم سانٍسٍهٍك حمض انسانٍسٍهٍك انهدزٌد اسحٍك جاثٍس بٍىنىجً-6حمض
top related