définition de la biotechnologie lutilisation dorganismes, de cultures tissulaires, de cellules...
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Définition de la BiotechnologieDéfinition de la Biotechnologie
L’utilisation d’organismes, de cultures tissulaires, de cellules vivantes ou d’enzymes cellulaires pour fabriquer un produit défini.
Source: Evens, R. P., Witcher, M., Source: Evens, R. P., Witcher, M., Therapeutic Drug MonitoringTherapeutic Drug Monitoring 1993; 15:514-520 1993; 15:514-520
BiothérapieBiothérapie
• Définition : Utilisation des produits de biotechnologie pour le diagnostic ou le traitement des maladies
– Corriger les déficits de substances endogènes
– Stimuler les processus physiologiques naturels
– Bloquer les protéines ou les acides nucléiques non fonctionnels
1953
Découverte de la structure de l’ADN
’73 ’75
Productiond’anticorps
monoclonaux
’82
Approbation de l’insuline recombinante
’61–’65
Identification du code génétique
A T
C
T
A
T
C
T
G
G
A
G
T
G
T
G
A
A
C
C
’77
Introduction
de la PCR
’86
Produits biologiques approuvés
pour l’utilisation
clinique
Fin des années 80 et 90
Petitesmolécules
Chimie combinatoire
Génomique
Thérapiegénique
Clonage d’un gène humain
CT A G GC
G T A A T
T G C T A
Evolution de la BiotechnologieEvolution de la Biotechnologie
Clonage de l’ADN
MédicalMédical RechercheRecherche AgricultureAgriculture EnvironnementEnvironnement IndustrieIndustrie
Impact de la Biotechnologie sur la sociétéImpact de la Biotechnologie sur la société
11
Cellule Cellule humaine et humaine et noyaunoyau
ChromosomesChromosomes
–– 23 maternels, 23 maternels, 23 paternels23 paternels
–– Femmes : XXFemmes : XX
–– Hommes : XYHommes : XY
4646
3 MILLIARDS3 MILLIARDSde paires de de paires de nucléotidesnucléotides
30.00030.000à à
100.000100.000gènesgènes
Chromosomes, Gènes, ADNChromosomes, Gènes, ADN
Le principe fondamental :Le principe fondamental :L’ADN fabrique l’ARN qui synthétise la protéineL’ADN fabrique l’ARN qui synthétise la protéine
TraductionTraduction
TranscriptionTranscription
ProtéineProtéine
Protéine complèteProtéine complète
RibosomeRibosome
Acidesaminés
GlycosylationGlycosylationPliagePliageCross-linkingCross-linking
ADNADNcellulairecellulaire ARNmARNm
NoyauNoyau
ARNmARNt
SécrétionSécrétion
UUU Phe UCU SerUUC Phe UCC SerUUA Leu UCA SerUUG Leu UCG Ser
CUU Leu CCU ProCUC Leu CCC ProCUA Leu CCA ProCUG Leu CCG Pro
AUU Ile ACU ThrAUC Ile ACC ThrAUA Ile ACA ThrAUG Met ACG Thr
GUU Val GCU AlaGUC Val GCC AlaGUA Val GCA AlaGUG Val GCG Ala
UAU Tyr UGU CysUAC Tyr UGC CysUAA Stop UGA StopUAG Stop UGG Trp
CAU His CGU ArgCAC His CGC ArgCAA Gln CGA ArgCAG Gln CGG Arg
AAU Asn AGU SerAAC Asn AGC SerAAA Lys AGA ArgAAG Lys AGG Arg
GAU Asp GGU GlyGAC Asp GGC GlyGAA Glu GGA GlyGAG Glu GGG Gly
ARNmARNm TRADUCTIONTRADUCTION ProtéineProtéine
Le code génétiqueLe code génétique
A U C C G A A U AAGGG A U A A C G U A GC
IIe
Arg
IIe
Arg
Arg
Gly
Asn
Asp
““Gène” sur le Gène” sur le chromosome (ADN)chromosome (ADN)
ChromosomeChromosome
ARNmARNm
pré-ARNmpré-ARNm
ProtéineProtéine
TranscriptionTranscription
TraductionTraductionSéquence de têteSéquence de tête
Intron 1Intron 1 Exon 3Exon 3Exon 2Exon 2Exon 1Exon 1 Intron 2Intron 2
SplicéosomeSplicéosomeSéquence de terminaisonSéquence de terminaison
Introns et Exons dans la transcription Introns et Exons dans la transcription des gènesdes gènes
Principales techniques de la Principales techniques de la BiotechnologieBiotechnologie
• Technologie de l’ADN recombinant
• Anticorps monoclonaux
• Blocage des nucléotides (anti-sens)
• Thérapie génique
• Amplification en chaîne par polymérase PCR
• Chimie combinatoire
• Modelage moléculaire
• Chimie des hydrates de carbone
• Génomique
• Chimie des petites molécules
1. Isolement 2. Clonage 3. Production du gène et expression de protéines
Plasmide Clones
Enzymes de restriction Milieux de culture
Ligase Fermenteur
Promoteur/amplificateur Flacons cylindriques
Lieur (DNA linker) Chromatographe
Cellule hôte
Outils de la technologieOutils de la technologiede l’ADN recombinantde l’ADN recombinant
Gène
Transcriptase inverse
Polymérase
Sonde d’ADN
Site de coupure par l’enzyme
Escherichia coli
Haemophilus aegyptius
Thermus aquaticus
Desulfovibrio desulfuricans
Providencia stuarti
Microcoleus stuarti
Origine de l’enzyme
EcoRI
Hae III
Tag I
Dde I
Pst I
Mst II
Nom de l’enzyme Ex. de digestion par EcoRI
GG
CC
AA
TT
AA
TT
TT
AA
TT
AA
CC
GG
GG
CC
GG
CC
CC CC
GG GG
TT
AA
CC
GG
GG AA
CC TT
CC
GG
TT
AA
NN AA
NN TT
GG
CC
CC
GG
CC
GG
TT NN
AA NN
AA
TT
GG
CC
GG
CC TT GG CC AA GG
GG AA CC GG TT CC
Endonucléases de restriction : Endonucléases de restriction : Des enzymes qui coupent l’ADN au niveau de sites spécifiquesDes enzymes qui coupent l’ADN au niveau de sites spécifiques
GG
CC TT TT AA AA
GGCC
TTTT
AAAA
Eco
RI
Eco
RI
Pst I
EcoRIHind II
Sma II
Polylieur
Site de clonage
Opérateur
Promoteur
Origine
Résistanceà l’ampicilline
Plasmides : Vecteurs pour le clonage Plasmides : Vecteurs pour le clonage et l’expression des gèneset l’expression des gènes
Bam HIRésistance
à latétracycline
Transcriptase inverse
Bibliothèquegénomique
Séquençage des acides
aminés
Gène souhaité
Protéine
ARNm
Sonde d’ADN
ADN
Option 1
Option 2
Option 3
Synthèsede l’ADN
Etape 1 : Isolement du gèneEtape 1 : Isolement du gène
Plasmides
Enzymes de restriction
Amplificateur/promoteur
Protéine souhaitée
ADN ligase
1. Gène souhaité incorporé dans le vecteur
2. Transfert du vecteur dans la cellule-hôte
Lien d’ADN
Gène
3. Clonage/expression de la protéine souhaitée
Etape 2 : Clonage et ExpressionEtape 2 : Clonage et Expression
Inoculat
Culture cellulaire
Purification
Formulation Galénique
Banque cellulaireFlacon en T
Flacon agitateur Fermenteur
Flacons cylindriques d’inoculat
Flacon cylindrique Phase de croissance
Changement de milieu
Cycle 1 de production
Changement de milieu Récolte 2
Cycle 2 de production
Récolte 1
Concentration/diafiltration Protéine bruteen vrac
Chromatographie sur colonneProtéine brute décongelée Filtration stérile
Protéine purifiéeen vrac
Ampoules prêtes à l’emploi
Protéine purifiéeen vrac
Tampon et stabilisateurs
Etape 3 : Production de protéine Etape 3 : Production de protéine Cellules de MammifèreCellules de Mammifère
Banque cellulaireFlacon en T
Flacon agitateurFermenteur
Inoculat
Changement de milieu
Cycle 1 de production
Cycle 2 de production
Changement de milieu
CentrifugationPâte cellulairebrute en vrac
Pâte cellulairebrute en vrac
Chromatographiesur colonne
Filtration stérile
Protéine purifiéeen vrac
Protéine purifiéeen vrac
Tampon et stabilisateurs Ampoules prêtes à l’emploi
Inoculat
Culture cellulaire
Purification
Formulation Galénique
Destruction des cellules
DestructionDes vacuoles
Etape 3 : Production de protéine Etape 3 : Production de protéine Souche microbienneSouche microbienne
Banque cellulaire
Flacon en TFlacon agitateur Fermenteur
Flaconscylindriques
d’inoculat
Etape 3a : InoculationEtape 3a : Inoculation
Flacon cylindriquePhase de croissance
Changement de milieu
Cycle 1de production
Changement de milieu Récolte 2
Cycle 2 de production
Récolte 1
Concentration/diafiltration Protéine bruteen vrac
Etape 3b : Culture cellulaireEtape 3b : Culture cellulaire
Chromatographie sur colonne
Protéine brutedécongelée
Filtration stérile
Protéine purifiéeen vrac
Etape 3c : PurificationEtape 3c : Purification
Ampoules prêtes à l’emploi
Protéine purifiée en vrac
Tampon et stabilisateurs
Etape 3d : FormulationEtape 3d : Formulation
8+ tests8+ tests
Par exemple : Par exemple : Caryotype, Caryotype,
criblage criblage d’infectiosité/ d’infectiosité/ oncogénicité, oncogénicité,
stabilité stabilité du gènedu gène
20+ tests20+ tests
Par exemple : Par exemple : Séquence Séquence
Amino-acide, Amino-acide, cartes de cartes de
peptide, CLHP, peptide, CLHP, SDS-PAGE, SDS-PAGE,
dosage dosage radio-radio-
immunologique, immunologique, dosagesdosages
biologiquesbiologiques
10+ tests10+ tests
Par exemple : Par exemple : RechercheRecherche
d’endotoxine, d’endotoxine, provocationprovocationpar protéine,par protéine,rendement rendement en protéineen protéine
30+ tests30+ tests
Par exemple : Par exemple : Analyse réitéréeAnalyse réitéréede la protéine,de la protéine,
pureté,pureté,contamination de contamination de
l’ADN, tests del’ADN, tests destabilité :stabilité :
Plasmides et Plasmides et cellules-hôtescellules-hôtes
ProduitProduiten vracen vrac
Validation Validation du processusdu processus
Lots de produitLots de produitfinalfinal
Etape 4: Contrôle qualitéEtape 4: Contrôle qualité
– – congélationcongélation– – chauffagechauffage– – dénaturationdénaturation– – pHpH
1. Souris immuniséecontre l’antigène d’intérêt
2. Cellules B productrices d’anticorps extraites de
la rate
3. Cellules B fusionnées avec les cellules
myélomateuses(hybridome)
4. Sélection des hybridomes capablesde produire des anticorps monoclonaux
5. Culture du meilleurhybridome
6. Récolte et purification des anticorps monoclonaux Cellulesmyléomateuses
Technologie des anticorps Technologie des anticorps monoclonauxmonoclonaux
• Corriger un déficit héréditaire
• Corriger un déficit génique acquis
• Programmer une cellule
pour exprimer de nouvelles propriétés
Objectifs
• Lymphocytes
• Fibroblastes
• Cellules endothéliales
• Kératinocytes
• Hépatocytes
• Myocytes
• Epithélium bronchique
• Cellules-souches médullaires
Cellules cibles
ThérapieThérapieGéniqueGénique
Maladie de Gaucher, obésité, neuropathie de Charcot-Marie-Tooth
Cancer familial du côlon, stérilité
Rétinite pigmentaire, syndrome de von Hippel-Lindau
Maladie de Huntington
Polypose colique familiale
Hémochromatose, ataxie spino-cérébelleuse,bec de lièvre et fente palatine
Exostoses multiples, syndrome de Werner, Syndrome de Langer-Gideon
Mucoviscidose, syndrome de Williams
Mélanome malin, ataxie de Friedriech
Néoplasie endocrinienne multiple de type 2
Anémie falciforme, syndrome du QT long
Phénylcétonurie, diabète de type 2, syndrome de Stickler
Rétinoblastome, BRCA2, syndrome de Wilson
Dystrophie musculaire, adrénoleucodystrophie, hémophilie, syndrome de Barth
Neurofibromatose de type 2
Syndrome de Down, sclérose latéraleamyotrophique, maladie d’Alzheimer
Déficit en ADA, syndrome d’Alagille
Hypercholestérolémie familiale, dystrophie myotonique, BCL3
Amyloïdose, groupe sanguin kidd
Polykystose rénale, BRCA1
Polykystose rénale, fièvre méditerranéenne familiale
Maladie de Tay-Sachs, xeroderma pigmentosum
Maladie d’Alzheimer, porphyria variegata
X
Y
8
7
6
12
3
4
5
9
10111213
14
22
15
21
19
20
18
17
16
Cibles de la thérapie géniqueCibles de la thérapie génique
Objectifs Objectifs
Créer une carte Créer une carte physique physique
Séquencer toutes les Séquencer toutes les paires de base paires de base
Créer des informations, Créer des informations, des outils, des forums et des formationsdes outils, des forums et des formations
1
2
3
4
MarqueursMarqueurs
ClonesClones
...ACGTAATTCATGCCCCGG......ACGTAATTCATGCCCCGG...
Créer une carte Créer une carte génétique génétique
Projet du génome humainProjet du génome humain
Cibles potentielles :VirusCancersMaladies auto-immunes
Mécanisme en présence devirus ou d’oncogènes : Anti-sens
biologique(anti-ARNm)
ARNm cible(filament sens)
La liaison complémentaire
bloque la traductionde l’ARNm protéines
responsables de pathologies non
synthétisées
Vecteur(virus ou lipide)
Blocage des nucléotides : Blocage des nucléotides : Thérapie anti-sensThérapie anti-sens
1. Récolte d’ovocytes fertilisés de souris
2. Gènes du cancer du sein isolés, copiés, injectés dans les ovocytes
3. Ovocytes contenant les gènes du cancer
transplantés chez la mère
4. Environ un tiers de la portée est transgénique, avec présence des gènes du cancer dans toutes les cellules
Source: Biotechnology for the 21st Century, 1995.
Souris transgénique
Créer des animaux transgéniquesCréer des animaux transgéniquescomme modèles de maladiescomme modèles de maladies
Développement HoméostaseActivation
inappropriéeInhibition
inappropriée
Rôles physiologiquesRôles physiologiques Rôles pathologiquesRôles pathologiques
dans le membre foetal dans la division rapide des leucocytes
dans la maladied’Alzheimer
dans l’infection virale
expression des gènesanti-apoptose
mutationßêta-amyloïdesensibilité aux toxines
bone marrow
ApoptoseApoptose
* Bone marrow : Moelle osseuse
Moelleosseuse
SenescenceSenescence
Adapted from Science, 1994.
Sénescence cellulaire, télomères et Sénescence cellulaire, télomères et vieillissementvieillissement
Sénescence
Télomères
Cellules cancéreuses Télomérase
Maladie du viellissement
Immortalité cellulaire
Ajoute des télomères
Cellules somatiquesnormales
Facteurs de croissancehématopoïétiques
Cellule soucheCellule souchepluripotentepluripotente
Blaste CFUBlaste CFU
Ligand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3 SCFSCF
Ligand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3 SCFSCF
Ligand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3 SCFSCF
Ligand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3 SCFSCF
CFU-GEMMCFU-GEMM Cellule souche lymphoïdeCellule souche lymphoïde Précurseur NKPrécurseur NK
SCFSCFIL-3IL-3
Ligand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3
MGDF/TPOMGDF/TPOSCFSCFIL-3IL-3
SCFSCFIL-3IL-3
SCFSCFIL-3IL-3
SCFSCFIL-3IL-3
SCFSCFIL-3IL-3
SCFSCF Ligand flk-2/flt-3Ligand flk-2/flt-3
IL-7IL-7
SCFSCFLigand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3
IL-7IL-7
IL-3IL-3GM-CSFGM-CSF
G-CSFG-CSF
SCFSCFIL-3IL-3
GM-CSFGM-CSFIL-11IL-11IL-6IL-6
MGDF/TPOMGDF/TPO
SCFSCFIL-3IL-3
GM-CSFGM-CSFEPOEPO
IL-3IL-3GM-CSFGM-CSF
BFU-EBFU-E CFU-MegCFU-Meg CFU-GMCFU-GM CFU-EoCFU-Eo CFU-BaCFU-Ba CFU-MastocyteCFU-Mastocyte Cellule pré-BCellule pré-B Cellule pré-TCellule pré-T
CFU-ECFU-E
MégacaryocyteMégacaryocyte
CFU-GCFU-G CFU-MCFU-M
ProplaquettesProplaquettes
PlaquettesPlaquettes
RéticulocyteRéticulocyte
HématieHématie
IL-3IL-3GM-CSFGM-CSF
EPOEPO
BasophileBasophileMacrophageMacrophage Cellule NKCellule NKPlasmocytePlasmocyte
IL-3IL-3GM-CSFGM-CSF
G-CSFG-CSF
IL-3IL-3GM-CSFGM-CSF
M-CSFM-CSF
IL-7IL-7
IL-3IL-3GM-CSFGM-CSF
IL-3IL-3 IL-3IL-3SCFSCF
IL-6IL-6 IL-2IL-2IL-7IL-7
SCFSCFIL-2IL-2
Lymphocyte BLymphocyte B
Lymphocyte TLymphocyte TNeutrophileNeutrophile EosinophileEosinophile Mastocyte tissulaireMastocyte tissulaire
GM-CSFGM-CSFM-CSFM-CSF
MonocyteMonocyte
Augmentent Augmentent la masse la masse et la force et la force musculairesmusculaires
Comment les neurotrophines pourraientComment les neurotrophines pourraient
agir dans les maladies agir dans les maladies
du neurone moteurdu neurone moteur
Neuropathie périphériqueNeuropathie périphérique
Neurones sensorielsNeurones sensoriels
Neurones sympathiquesNeurones sympathiques
Neurones parasympathiquesNeurones parasympathiques
Sclérose latérale amyotrophique (SLA)Sclérose latérale amyotrophique (SLA)Neurones moteursNeurones moteurs
Maladie d'AlzheimerMaladie d'Alzheimer
Neurones cholinergiques du Neurones cholinergiques du
cerveau antérieurcerveau antérieur
Neurones néocorticauxNeurones néocorticaux
Maladie de ParkinsonMaladie de Parkinson
Neurones dopaminergiquesNeurones dopaminergiques
NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5NGF, FGF-2NGF, FGF-2CNTFCNTF
CNTF, BDNF, NT-4/5, IGF-1,CNTF, BDNF, NT-4/5, IGF-1,GDNFGDNF
Relations avec les troubles neurologiques
Favorisent la Favorisent la survie des survie des neurones neurones moteursmoteurs
Favorisent la Favorisent la régénération régénération axonaleaxonale
2
1
4
Induisent le Induisent le bourgeonnement des bourgeonnement des plaques terminales plaques terminales motricesmotrices
3
Barrière Barrière hémato-méningéehémato-méningée
Récepteursspécifiques
Actionsspécifiques
NGFNGFBDNF, NT-3, NT-4/5BDNF, NT-3, NT-4/5
GDNF, BDNF, NT-4/5, GDNF, BDNF, NT-4/5, FGF-1, FGF-2, IGF-1FGF-1, FGF-2, IGF-1
Facteurs NeurotrophiquesFacteurs Neurotrophiques
BDNF NT-3
TrkB TrkC
Membrane cellulaire
Développementd’un vaccin classique
Développementd’un vaccin recombinant
Clonage du gène de l’antigène viral dans une cellule de levure
Antigène viral non-infectieux
Pool de plasma humain
Purification
Inactivation Purification
Vecteurs viraux
Maladies infectieusesMaladies infectieuses
VIH, HSV, CMV, hépatite B, VIH, HSV, CMV, hépatite B, grippe, rotavirus, grippe, rotavirus, coqueluche, maladie de coqueluche, maladie de Lyme, Lyme, Campylobacter Campylobacter jejuni, Chlamydia jejuni, Chlamydia trachomatistrachomatis
CancerCancer
Mélanome, sein, côlon, Mélanome, sein, côlon, ovaire, col utérin, prostateovaire, col utérin, prostate
Sclérose en plaquesSclérose en plaques
Polyarthrite rhumatoïdePolyarthrite rhumatoïde
PsoriasisPsoriasis
ContraceptionContraception
VaccinsVaccinsà base d’ADN recombinantà base d’ADN recombinant
En cours de En cours de développementdéveloppement
Vaccin recombinantsVaccin recombinantsComment sont-ils fabriqués ?Comment sont-ils fabriqués ?
Problèmes pratiques concernant la Problèmes pratiques concernant la manipulation des matériaux biologiquesmanipulation des matériaux biologiques
• Conservation– réfrigération habituellement nécessaire– la congélation/décongélation et la chaleur peuvent dénaturer la protéine
• Stérilité– absence habituelle d’agent de conservation
• Préparation– une agitation excessive pendant la reconstitution peut dénaturer la protéine– l’utilisation d’un diluant approprié est essentielle– peuvent adhérer au plastique ou au verre– calculs des doses basés sur les unités d’activité vs les unités pondérales (micro
grammes)– administration habituellement parentérale (SC ou IV)
• Problèmes concernant l’administration à domicile– Transport– Conservation– Auto-administration– Formation du patient
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