cytogénétique - 10/02/2000 nora chelloug -...
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Hémochromatose - 10/02/2000
INTRODUCTIONINTRODUCTION
� Hémochromatose génétique ouhéréditaire
� Maladie autosomique récessive� Surcharge progressive en fer
� Accumulation dans parenchyme decertains organes (foie, surrénales,cœur…)
� Apparition d ’insuffisancesfonctionnelles
Hémochromatose - 10/02/2000
INTRODUCTIONINTRODUCTION
� Mécanisme physiopathologique ? =augmentation de l ’absorptionintestinale du fer
� Maladie rare = la plus commune dansles populations d ’Europe du Nord
� Prévalence = 1/300 (1/200) :homozygotes atteints
10 % d ’hétérozygotes (1/8 : populationscaucasiennes)
Hémochromatose - 10/02/2000
INTRODUCTIONINTRODUCTION
� Identification récente du gène HFEet de la mutation C282Y
� Confirmer la prévalence, l’ethnie, lemode de transmission
� Diagnostic simple, spécifique
� Stratégie par un dépistage
systématique de masse
Hémochromatose - 10/02/2000
CLASSIFICATIONSurcharge ferrique primitiveCLASSIFICATIONSurcharge ferrique primitive
� Hémochromatose héréditaire - HFE lié
= C282Y, HLA, H63D ?
� Hémochromatose héréditaire - HFE non
lié = ∅ C282Y, HFE2 ?
� Hémochromatose juvénile (nouveau-né,
enfant) = ∅ C282Y, ∅ HLA
Hémochromatose - 10/02/2000
CLASSIFICATIONSurcharge ferrique primitiveCLASSIFICATIONSurcharge ferrique primitive
� Surcharge ferrique de l’Africain etde l ’Américain noir = ∅ C282Y
� Hyperferritinémie - Saturationnormale = C282Y, H63D (2/3)
� Hyperferritinémie - Cataracte
Hémochromatose - 10/02/2000
CLASSIFICATIONSurcharge ferrique secondaireCLASSIFICATIONSurcharge ferrique secondaire
� Thalassémie majeure
Sphérocytose héréditaire
=
érythropoïèse inefficace
� Alcool
� Porphyrie cutanée tardive = C282Y(homozygote, hétérozygote)
Hémochromatose - 10/02/2000
CLINIQUECLINIQUE
� Précoce� Diabète, hypogonadisme
� Sécheresse ichtyosiforme, déformationdes ongles, cheveux fins
� Myocardite, arthralgie (2ème, 3èmeMCP)
� Asthénie, hépatomégalie,
� Transaminases ➚ , hypersidérinémie
Hémochromatose - 10/02/2000
CLINIQUECLINIQUE
� Tardif� Mélanodermie� Insuffisance cardiaque, rhumatisme
chronique� Cirrhose, hépatocarcinome� ➚ Fer périportal → ➚ Fer
intrahépatocytaire
→ Fibrose = constante (réserve en fer = 10 x VN
Fer serrique > 1000 µg/l)
Hémochromatose - 10/02/2000
CLINIQUECLINIQUE
Intérêt du diagnostic précoce
Prévention = Saignée-------------------------
Rq : 90 % H : homozygotes C282Y
70 % F : homozygotes C282Y
développent la maladie en absencede traitement
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUEDIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
� Indications� Hépatomégalie, pigmentation cutanée,
asthénie� Cardiomyopathie
� Diagnostic d ’orientation� Bilan martial :
� Fer serrique : > 35 µmol/l� Coefficient de saturation de latransferrine (CST) >0,60 H, >0,50 F� Ferritinémie : > 300 µg/l H, > 400µg/l F
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUEDIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
� Transaminases : SGOT ➚ , SGPT ➚� Groupage HLA =
� HLA A3� 25% population générale� 75% hémochromatose
� HLA B14
Rq = CST normal - Ferritine ➚� Traitement = oestroprogestatif� Hyperthyroïdie� Syndrome inflammatoire� Alcool
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUEDIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
� Diagnostic de certitude
� Ponction biopsie hépatique
� Concentration hépatique en fer (=CHF) :
> 100 µmol/g de tissu sec
� Ratio : CHF / AGE (> 2)
Hémochromatose - 10/02/2000
GENETIQUE MOLECULAIRELE GENEGENETIQUE MOLECULAIRELE GENE
Historique� 1975
� Localisation chromosomique = 6p21� Liaison avec gènes du complexe
majeur d ’histocompatibilité : HLA - A
� 1996� Découverte du gène� Hypothèse
� Effet fondateur d ’une mutation� Déséquilibre de liaison
Hémochromatose - 10/02/2000
GENETIQUE MOLECULAIRELE GENEGENETIQUE MOLECULAIRELE GENE
� Gène / marqueurs polymorphes (45)
� Région de 6 mégabases
� Haplotype ancestral (sujets malades)
� Haplotype Commun = région restreinte = 250 Kb
� Séquençage
� 15 gènes inconnus
� 1 mutation préférentielle (malades / témoin)
Hémochromatose - 10/02/2000
GENETIQUE MOLECULAIRELE GENEGENETIQUE MOLECULAIRELE GENE
Gène candidat� HLA - H = HFE (nomenclature
internationale)� Séquence d ’ADN = 12 Kb� CDNA (partie codante) = 2,4 Kb� 7 exons� Expression ubiquitaire (sauf cerveau)
Hémochromatose - 10/02/2000
GENETIQUE MOLECULAIRELES MUTATIONSGENETIQUE MOLECULAIRELES MUTATIONS
� C282Y� 282 (cystéine / tyrosine)� Absente : Asie, Afrique, Finlande� USA (juifs séfarades)� Europe
� Gradient décroissant (Nord/Ouest,Sud/Est)� 20% hétérozygotes - Irlande� 3% hétérozygotes - Italie
� Mutation Nord-européenne� Fréquence dans population générale = 6%
Hémochromatose - 10/02/2000
GENETIQUE MOLECULAIRELES MUTATIONSGENETIQUE MOLECULAIRELES MUTATIONS
� H63D� 63 (histidine / acide aspartique)� Polymorphisme ? Mutation mineure ?� Fréquence élevée dans population
générale = 17%� Mais : > 50% sujets atteints
Rq = fréquence des hétérozygotes = 1/17
Hémochromatose - 10/02/2000
GENETIQUE MOLECULAIRELA PROTEINEGENETIQUE MOLECULAIRELA PROTEINE
� Protéine� 348 AA� Protéine transmembranaire� Structure primaire connue� Homologie avec HLA-A2
� Rôle ?� Récepteur d ’un ligand fixant le fer� Signal de transduction� Système immunitaire (expressionHLAI sur membranes)
Hémochromatose - 10/02/2000
GENETIQUE MOLECULAIRELA PROTEINEGENETIQUE MOLECULAIRELA PROTEINE
� Cystéine : rôle dans maintien destructure tertiaire du domaine α3
� Conformation essentielle à
l ’interaction de chaîne α avec B2
microglobuline
� Mutation C282Y = destruction du pontdisulfure indispensable à cette liaison
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC MOLECULAIREDIAGNOSTIC MOLECULAIRE
� Diagnostic simple = techniquesclassiques de biologie moléculaire
� Altération de sites de restrictionsenzymatique par les deux mutations =C282Y - H63D
� Méthode :� Sang total (EDTA : 5 ml)� Extraction d ’ADN
Rq : Consentement écrit indispensable (loi = article L145-
15 - loi du 29 juillet 1994)
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC MOLECULAIREDIAGNOSTIC MOLECULAIRE
� PCR = Amplification simultanée desdeux fragments d ’ADN
� Digestion enzymatique = 2 enzymes derestriction = RSAI, BCLI
� Migration : électrophorèse = Geld ’agarose
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC MOLECULAIREDIAGNOSTIC MOLECULAIRE
PCR = principe de base
5 ’
A T C G C T T
T A G C G A A
3 ’
3 ’ 5 ’
ADN = Double brin
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC MOLECULAIREDIAGNOSTIC MOLECULAIRE
PCR = principe de base5 ’ Dénaturation = 94°C
ADN : simple brinA T C G C T T
C G A A
3 ’
3 ’ 5 ’*5 ’
A T C
T A G C G A A
3 ’
3 ’ 5 ’
Séquence d ’acidenucléique = amorce(15 à 17 nucléotides)
* Fixation des amorces = 57°C (température d ’annealing)
* Elongation = 72°C
Ezyne TAQ polymerase
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC MOLECULAIREDIAGNOSTIC MOLECULAIRE
PCR = principe de base5 ’
A T C G C T T
T A G C G A A
3 ’
3 ’ 5 ’
5 ’
A T C G C T T
T A G C G A A
3 ’
3 ’ 5 ’
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC MOLECULAIREDIAGNOSTIC MOLECULAIRE
Digestion enzymatiqueRSA I
ADN normal5 ’
G T C C
C A G G
3 ’
3 ’ 5 ’
G T C C
C A G G→1 fragment
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC MOLECULAIREDIAGNOSTIC MOLECULAIRE
Digestion enzymatique
ADN mutéCréation d ’un sitede restriction
5 ’
G T A C
C A T G
3 ’
3 ’ 5 ’
G T A C
C A T G
*
2 fragments
*
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC : CONDUITE A TENIRDIAGNOSTIC : CONDUITE A TENIR
� Bilan biologique perturbé
� CST (++)� Ferritine� Tests hépatiques fonctionnels normaux� Eliminer une cause secondaire
surcharge fer
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC : CONDUITE A TENIRDIAGNOSTIC : CONDUITE A TENIR
Diagnostic génotypique
Homozygote hétérozygote composite hétérozygote → hyperferritinémieC282Y / C282Y C282Y /H63D C282Y/normal un peu élevé
homozygote hétérozygote → non en faveur duH63D / H63D H63D / normal diagnostic
Confirme le compatible avec une Enquête familialediagnostic hémochromatosed’hémochromatosehéréditaire( degré de ferritinémie) Examens complémentaires = IRM) Ponction biopsie hépatique
(CHF / AGE)IRM --> diagnostic de certitude
Hémochromatose - 10/02/2000
DIAGNOSTIC : CONDUITE A TENIRDIAGNOSTIC : CONDUITE A TENIR
Diagnostic génotypique
Enquête familiale
- 2 individus hétérozygotes → 1/4 enfant atteint
- 1 individu homozygote 1/20 enfant atteint + → - 1 individu hétérozygote
Hémochromatose - 10/02/2000
CONCLUSIONCONCLUSION
� Questions ?� Pénétrance
� Expressivité variable de la maladie� Sujets homozygotes C282Y = absencedu tableau classique� Fréquence élevée en Bretagne etIrlande des hétérozygotes = 17 à 20 %
→ Fréquence théorique de lamaladie =
1/100 à 1/150� Rôle de facteurs génétiques associés
Hémochromatose - 10/02/2000
CONCLUSIONCONCLUSION
� Dépistage de masse� Caractéristiques :
� Sévérité clinique� Caractère invalidant� Mortalité� Fréquence élevée� Méthode simple de diagnostic
� Etude de la protéine� Meilleure compréhension de laphysiopathologie
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