contrôle de la mort cellulaire par la voie des mapk1/3

Contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3

Sébastien Cagnol

Equipe du Dr Ellen Van Obberghen-Schilling

Institut de Signalisation, Biologie du Développement et CancerCNRS UMR6543

Sous la direction du Dr Jean-Claude Chambard

La mort cellulaire programmée ou Apoptose

Conservée au cours de l’évolution

Mécanisme présent au sein de chaque cellule

Permet l’auto-élimination physiologique des cellules

La mort cellulaire programmée ou Apoptose

Au cours du développement embryonnaire

Dans l’organisme adulte

Maintien de l’homéostasie cellulaire et tissulaire

Remodelage des tissus

Renouvellement de certains tissus

Excès de mort cellulaire

Destruction tissulaire brutale (ischémie, hépatite)

Défauts de mort cellulaire

Maladies Autoimmunes

Maladies neurodégénératives

L’apoptose pathologique

Cancer

Les caspases

clivage auto-protéolytique

procaspases

caspases initiatrices

dimérisation

caspases effectrices

Les caspases

caspases effectrices

Modificationsdu cytosquelette

Fragmentation de l ’ADN et du noyau

Inhibition du potentiel mitochondrial

Réorganisation de la membrane plasmique

condensation cellulaire

corpsapoptotiques

caspase 8

caspases effectrices3,6,7

Apaf1

caspase 9Apoptosome

récepteursde mort

procaspase 9

cytochrome c

mitochondrie

FADD

L’activation des caspases

Stress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques

procaspase 8

Bid

Apaf1

cytochrome c

mitochondrie

La voie mitochondriale

Stress cellulaire Agents antimitotiquesAgents génotoxiques

Apoptosome procaspase 9

Apaf1

cytochrome c

mitochondrie

Stress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques

La voie mitochondriale

Apoptosome procaspase 9

caspases effectrices3,6,7

Apaf1

caspase 9

cytochrome c

mitochondrie

Stress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques

La voie mitochondriale

Apoptosome procaspase 9

caspases effectrices3,6,7

Apaf1

caspase 9

récepteursde mort

cytochrome c

mitochondrie

FADDStress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques

procaspase 8DISC

Les récepteurs de mort

Apoptosome procaspase 9

caspases effectrices3,6,7

Apaf1

caspase 9

cytochrome c

mitochondrie

FADDStress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques

procaspase 8

Les récepteurs de mort récepteursde mort

Apoptosome procaspase 9

caspase 8

caspases effectrices3,6,7

Apaf1

caspase 9

récepteursde mort

cytochrome c

mitochondrie

FADDStress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques

procaspase 8

Bid

Les récepteurs de mort

Apoptosome procaspase 9

survieapoptose Facteurs de survie

matrice extracellulairesérum

cellules en prolifération

Survie cellulaire

PI3K

PKC MAPK

MEK

Raf

PKAJaksAKT

AMPc

Facteurs de survie

Les voies de survie

Croissance cellulaire

Prolifération cellulaire

Différenciation cellulaire

NFB

GTP

La voie des MAPK1/3

Prolifération

Différenciation

Survie cellulaire

Migration cellulaire

Ras

MEK1/2P P

Raf-1

MAPK1/3P

MAPK1/3P

P

KSR

GTP

Substrats cytosoliques

Substrats nucléaires

P

Récepteurs tyrosine kinase

Ras

Récepteurs couplés aux protéines G

Intégrines

B-Raf

MEK1/2

Raf1

MAPK1/3 MAPK1/3P P

P P

Le contrôle de l’activité des MAPK

Forme active phosphorylée Forme inactive

déphosphorylée

MAPK Phosphatases(MKP 1,2,3)

MEK1/2

Raf1

MAPK1/3 MAPK1/3P P

L’enlèvement du sérum inhibe les MAPK

Forme active phosphorylée

MAPK Phosphatases(MKP 1,2,3)

Forme inactivedéphosphorylée

pMAPK1/3

MAPK1

sérum : + -tamoxifène :

MEK1/2

Raf1

MAPK1/3 MAPK1/3

tam

tamoxifène

P P

P P

L’activation de Raf-1:ER maintient les MAPK actives

pMAPK1/3

MAPK1

sérum : + - -

+tamoxifène :

Raf-1:ER

Raf1

tam

ER

MAPK Phosphatases(MKP 1,2,3)

contraste de phase iodure de propidium

+ sérum

Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER

surviesérum

apoptose

apoptosesurvie

sérum

contraste de phase iodure de propidium

apoptose

contraste de phase iodure de propidium

MAPK

Raf1

tam

ER

Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER

L’activation de Raf:ER protège les cellules CCL39 contre la mort induite par enlèvement de sérum et d’ancrage (Le Gall. MBC 00 11,1103)

La voie des MAPK inhibe l’apoptose mitochondriale

mitochondrie

caspase 9

PAR

PARP

P

BclxL

tamoxifen (1M) : - - +

-sérum 24h

PARP

CCL39 Raf-1:ER

caspase 3

0 3 6 9 12 24

CCL 39

CCL 39BclxL

enlèvement de sérum ( h )

PARP

PARPp-MAPK

MAPK1

tamoxifène :

0 6 9 14 24

caspase 9

p-MAPK

MAPK1

procaspase 9p37p35

- - + - + - + - +

enlèvement de sérum (h) :

La voie des MAPK inhibe l’activité et l’activation de caspase 9

contrôle - sérum (14h) - sérum + tam

050

100150200250300

activ

ité c

aspa

se 9

caspases effectrices3,6,7

Apaf1

caspase 9

cytochrome c

mitochondrie

L’apoptose mitochondriale

MAPK1/3

MEK1/2

Raf1

tam

ER

Apoptosome procaspase 9

contrôle - sérum (14h) - sérum + tam

dapi

caspase-3activée

cytochrome c

La voie des MAPK ne bloque pas la sortie du cytochrome c

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Apaf1

Apoptosome

fractionsprotéiques

lysatcellulaire

12000

0

20

40

60

80

669

443

200150

100

mAU

2.000 kDa

155 101Fractions :

Etude de la multimérisation d ’Apaf-1 par chromatographie d ’exclusion

colonne

cytochrome c

Apaf-1

cytochrome c

Apaf-1

Mr (kDa)

Fractions : 1 5 10 15

669 443 200

cytochrome c

Apaf-1

contrôle

- sérum+ tamoxifène

- sérum

La voie MAPK ne bloque pas l ’oligomérisation d ’Apaf1

Fractions : 1 10 20 30

669 443 200 150 66

contrôle

- sérum

Mr (kDA)

La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l ’apotosome

caspase 9

caspase 9

caspase 9- sérum+ tamoxifène

contrôle

Fractions : 1 10 20 30

669 443 200 150 66Mr (kDA)

Fractions de hautpoids moléculaire

concentrées

1 10 1 10 1 10

- sérum

La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l ’apotosome

caspase 9

caspase 9

caspase 9

caspase 9

- sérum+ tamoxifène

contrôle

- sérum

- sérum+ tamoxifène

caspases effectrices3,6,7

Apaf1

caspase 9

cytochrome c

mitochondrie

L’apoptose mitochondriale

MAPK1/3

MEK1/2

Raf1

tam

ER

Apoptosome procaspase 9

MEK1/2

MAPK1/3

Raf1

tam

P P

P P

ER

?

La protection par Raf1:ER est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ?

caspase 9

U0126 MEK1/2

MAPK1/3

Raf1

tam

P P

P P

caspase 9

ER

?

La protection est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ?

MAPK1/3

MEK1/2U0126

L’inhibition du clivage de caspase 9 dépend de l’activité MEK

0 0.3 1 3 10

-sérum (24h) + tam -S+S

p-MAPK

MAPK1

U0126 (µM) :

caspase 9

Raf1

tam

ER

apoptose

sérum

MAPK

sérum :

U0126 : 0 010 103

5% 1%

caspase 9

p-MAPK

0 4 6 8 10 12 14h

+ S - S - sérum + tamoxifène (24hr)

addition retardée de U0126 :

L’activité MEK est nécessaire de façon continue

caspase 9

MAPK1/3

MEK1/2U0126

Raf1

tam

ER

MEK1/2

MAPK1/3

Raf1

tam

P P

P P

protéineantiapoptotique

ER

?

La protection est-elle dépendante de l’induction d’une protéine antiapoptotique ?

caspase 9

MEK1/2

MAPK1/3

Raf1

tam

P P

P P

protéineantiapoptotique

ER

?

La protection est-elle dépendante de l’induction d’une protéine antiapoptotique ?

caspase 9

émétine

+ S - S - sérum + tamoxifène (24hr)

MAPK1

0 2 4 6 8 haddition retardée d’émétine :

p-MAPK

L’effet protecteur de la voie MAPK dépend de la synthèse protéique

caspase 9

L’inhibition de caspase 9 dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels

tamoxifène : - - -+ +

caspase 9 T125A

p-MAPK

Le mécanisme de protection ne dépend pas de la phosphorylation de caspase 9

sur son résidu T125

PETPCN

P

125

Allan et al, Nat Cell Biol 2003 5,647

caspase 9

- sérumNT

MAPK1/3P P

Conclusions

L’activation de la voie des MAPK inhibe le clivage de caspase 9

L’effet protecteur dépend de mécanismes traductionnelset post-traductionnels

L’activation de la voie des MAPK n’empêche pasla formation de l’apoptosome

caspases effectrices3,6,7

caspase 9

mitochondrie

MEK1/2

MAPK1/3 P P

P P

IAPs

Quel est le mécanisme d’inhibition ?

Raf1

tam

ER

caspase 9

XIAP

tamoxifen : - - +

-sérum 24h

Apoptosome procaspase 9

Rôle antiapoptotique de la voie MAPK dans les tumeurs

Développement tumoral

Inactivation de l’apoptosome

Mutation de B-Raf

MAPK1/3?

Le MAPK paradoxe

L’activation des MAPK induit la mort cellulaire

0 5 10 30 600 5 10 30 60

stimulationau sérum tamoxifèneexpo

stimulation (min) :

p-MAPK

MAPK1

Stimulation de la voie des MAPK dans les cellules HEK293 Raf1-ER

iodure de

propidium

L’activation prolongée des MAPK induit la mort des cellules HEK293

tamoxifène 24hcontrôle tamoxifène 48h

L’activation prolongée des MAPK induit l’ apoptose des cellules HEK293

0 13 18 24 30 40 48 72tamoxifène ( h ) :

MAPK1

p-MAPK

PARP

- + - +

ZVAD

tam (48h) :

PARP

AD

N s

ub-G

1 (%

)

0 24 48 720

10

20

40

30

50

tamoxifène ( h ) :

tamoxifène 48h (1M) : - + - + - +

CHX 1 g/mL

U0126 10 M

PARP

p-MAPK

MAPK1

L’apoptose dépend de l’activité MEK et de la synthèse protéique

Cycloheximide (CHX) = inhibiteur de la synthèse protéique

tamoxifène (48h):

10

30

35

40

25

20

15

5

14 24h 10

cliv

age

de P

AR

P (

%)

0

Une protéine apoptotique est accumulée durant les premières heures

addition retardée de cycloheximide

0 - + + + + +

tamoxifène (48h):

10

30

35

40

25

20

15

5

14 24h 10

0

0 - + + + + +

addition retardée de U0126 après

L’apoptose dépend d’une activation continue de la voie MAPK

cliv

age

de P

AR

P (

%)

caspase 8

caspases effectrices3,6,7

Apaf1

caspase 9

récepteursde mort

cytochrome c

mitochondrie

BclxL

Crm A

Apoptosome procaspase 9

CD8 Crm A BclxL

10

20

30

40

50

cliv

age

de P

AR

P (

%)

- + +tamoxifène (48h) :0

+

CD8

La mort induite par la voie MAPK dépend de la voie caspase 8

Cliv

age

de P

AR

P (

%)

- + - +- +tamoxifène (28h) : - +

5

10

15

0

CH11 TRAIL TNF

20

CH11TNFTRAIL

La voie MAPK favorise l’apoptose induite par les récepteurs de mort Fas et DR4/5

Fas DR4/5 TNFR

ligand (14h) :

La voie MAPK augmente l’expression de FADDpar un mécanisme post-transcriptionnel

tamoxifène ( h ) : 0 4 12 18 2414108

FADD

contrôletamoxifène ( 24h )

am

plifi

catio

n p

ar

RT

-PC

R

0 0.01 0.1 1 10quantité initiale d’ARN (ng)

0

10

20

30

40

50

FADD

36B4

MAPK1

CH11TRAIL

Fas DR4/5

caspase 8

FADD

La mort induite par la voie MAPK ne dépend pas des récepteurs de mort

FADD

MAPK1

- + + + +

siRNA GFP

siRNAFADD DN-FADD

PARP

DN-FADD

CH11TRAIL

FADD

Fas DR4/5

DN-FADD

siRNA FADD

caspase 8

tamoxifène (48h) :

- + ++IETD-fmk : - -

PARP

caspase 3active

caspase 8

- ++tamoxifène (48h) : +

Crm A:

+

-

La voie MAPK induit l’activation de caspase 8

procaspase 8

0 13 18 24 30 40 48 72tamoxifène ( h ) :

p42fragmentsclivés

p28

MAPK1

tamoxifène (48h) :

Conclusions partie 2

L’activation prolongée des MAPK1/3 induit l ’apoptose des cellules HEK293

La voie des MAPK active la caspase 8 indépendammentdes récepteurs de mort

La voie des MAPK augmente l’expression de FADD et favorise l ’apoptose induite par les récepteurs de mort

L’apoptotose dépend de mécanismes traductionnelset post-traductionnels

Perspectives partie 2

Activation de caspase 8 indépendante des récepteurs de mort

Augmentation d’expression de FADD est elle impliquée dansla régulation physiologique des récepteurs de mort ?

Ce mécanisme pourrait-il servir à réactiver l’apoptose dans les tumeur à forte activité MAPK ?

Implication dans les maladies neurodégénératives ?

Mécanismes d ’activation de caspase 8 ?

Mécanismes d’induction post-transcriptionnelle de FADD ?

Rôle dans des modèle physiologiques d ’apoptose induite par les récepteurs Fas et DR4/DR5 ?

Lien avec une activité nucléaire prolongée des MAPK ?

caspase 8

caspases effectrices

caspase 9

mitochondrie

MAPK1/3

Comment réconcilier les deux modèles ?

Bid

Apoptosome procaspase 9

Remerciements

Equipe Ellen Van Obberghen :Etienne Boulter Jean-Claude ChambardIvana Fantozzi Dominique GrallAnna MansourSylvie MaubantSamantha Sauze-Fernandez

INSERM U526 Dir P Auberger

INSERM U452 Dir P Boquet

Laboratoire d ’OncophamacologieDir: G Milano

Dr Urszula Hibner

Dr Alain Eychène

Equipe Anne-Odile HueberEquipe Gilles PagèsEquipe Jacques Pouysségur

UMR 6543

Association pour la Recherche sur le Cancer

La Ligue Régionale Contre le Cancer

Laboratoire du Dr Véronique Paquis

+S - sérum

ins Tam-Bim EL

Bim S

BIM

+S -S -S+Tam

LLNL :émetine :

++ +

Bim EL

P-MapK

BclXl

caspase 9

-

--

+

-

+

+

Tamoxifène :

U0126 :

p-MAPK

p-MEK

- sérum

-

Le mutant Raf T481A bloque le clivage de caspase 9

tamoxifène (48h) : - + - +

PARP

p-MAPK

MAPK3

cellules attachées

cellulesen suspension

tamoxifène (24h)

Cliv

age

de P

AR

P (

%)

0

10

20

30

40

50

tamoxifène: - + + + + +-CH11: - - - - + +-

DN-Fas : - - + - - +-

L’apoptose induite par la voie des MAPK ne dépend pas du récepteur Fas

* *

Morphologie des cellules HEK 293 mourantes