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1
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE
(CLHP – HPLC)
PREMIERE PARTIE
GENERALITES
APPAREILLAGE
NOTIONS FONDAMENTALES
TECHNIQUES CLHP LES PLUS UTILISEES
- Chromatographie d’adsorption
- Chromatographie de partage
- Chromatographie d’échange d’ions
- Chromatographie par appariement d’ions
NOUVEAUX DEVELOPPEMENTS
DEUXIEME PARTIE
ETUDE DES CAS
2
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
HAUTE PERFORMANCE
HPLC
TECHNIQUE DE SEPARATION DES COMPOSES
EN SOLUTION.
INTERET
- TECHNIQUE NON DESTRUCTIVE
/ PERMET D'ISOLER, DE PURIFIER
DES PRODUITS.
/ ANALYSE DE COMPOSES:
- FORTEMENT POLAIRES
- P.M. ELEVE
- SYSTEME SOUVENT FACILEMENT
AUTOMATISABLE
LIMITE
SENSIBILITE DES DETECTEURS
SAUF SI COUPLAGE AVEC LA
SPECTROMETRIE DE MASSE.
3
LES COMPOSES A SEPARER SONT REPARTIS
ENTRE 2 PHASES.
- UNE PHASE DITE STATIONNAIRE
CONSTITUEE PAR UN ‘’LIT’’ DE MATERIAUX.
- UNE PHASE DITE ’’MOBILE’’ QUI S’INFILTRE
AU TRAVERS DE LA PREMIERE.
LE PROCESSUS CHROMATOGRAPHIQUE
PHENOMENES D’ADSORPTIONS ET DE
DESORPTIONS REPETES.
GENERALITE
4
APPAREILLAGE
SYSTEME ISOCRATIQUE
PHASE MOBILE
POMPE
INJECTEUR
COLONNE
DETECTEUR
TRAITEMENT DES DONNEES
SYSTEME A GRADIENT D’ELUTION
PHASE MOBILE A PHASE MOBILE B
POMPE A POMPE B
PROGRAMMATION DU GRADIENT CHAMBRE DE MELANGE
INJECTEUR
5
PHASE MOBILE
RÔLE ACTIF DANS LE MECANISME DE
SEPARATION
SON CHOIX DEPEND :
- DU TYPE DE CHROMATOGRAPHIE
- DE LA POLARITE DES COMPOSES ETUDIES
- DU TYPE DE DETECTEUR UTILISE
- CONSTITUEE PAR UN OU PLUSIEURS ELEMENTS
- COMPOSITION :
/FIXE : SYSTEME ISOCRATIQUE
/MODIFIEE EN FONCTION DU TEMPS :
SYSTEME A GRADIENT D’ELUTION.
6
PHASE STATIONNAIRE
SON CHOIX DEPEND DE LA TECHNIQUE
CHROMATOGRAPHIQUE UTILISEE.
- LE PLUS SOUVENT PARTICULES
/ DE SILICE SEULES
/ DE SILICE ’’GREFFEES’’
- IMPORTANCE DE LA GRANULOMETRIE
(’’FINESSE’’) DES PARTICULES.
A DEBIT IDENTIQUE DES PARTICULES PLUS
’’FINES’’ LA RESOLUTION ET LE SEUIL
DE DETECTION.
7
NOTIONS FONDAMENTALES
A-) TEMPS DE RETENTION (T.R.)
- SEPARATION DES COMPOSES EN FONCTION
DU TEMPS
tR
t'R
tM
Inj.temps
Produitnon retenu
LE T.R. PEUT-ÊTRE DIVISE EN DEUX TERMES tM ET
t'R.
t'R = tR - tM
t'R = T.R. REDUIT = TEMPS DE SEJOUR D'UN
COMPOSE DANS LA PHASE STATIONNAIRE.
tM = TEMPS DE SEJOUR DANS LA PHASE MOBILE
8
B - FACTEUR DE CAPACITE
° PERMET D’EXPRIMER LE TEMPS DE
“FIXATION” “D’ADSORPTION”, SUR LA PHASE
STATIONNAIRE, DES DIFFERENTS COMPOSES
D’UN MELANGE.
kt
t
t t
t
R
M
R M
M
''
EN PRATIQUE :
1 < k’ <10
9
C - CARACTERISTIQUES D’UN PIC -NOTION
DE PLATEAUX THEORIQUES -
tR
: LARGEUR DU PIC A LA BASE
: LARGEUR DU PIC A MI-HAUTEUR
° NOMBRE DE PLATEAUX THEORIQUES :
ntR
16
2
OU
ntR
5 545
2
,
° UN PIC PEUT - ÊTRE CARACTERISE / PAR SON T.R.
/ PAR SA SURFACE
/ PAR SA HAUTEUR
10
D -SEPARATION
° LA SEPARATION DE DEUX PICS ADJACENTS
PEUT-ÊTRE CARACTERISEE PAR DEUX
PARAMETRES :
- FACTEUR DE SELECTIVITE ()
- RESOLUTION (R)
1)- FACTEUR DE SELECTIVITE
t'R(B)
t'R(A)
t M
A B
t
tempsInj.
produitnon retenu
t
t
k
k
R B
R A
B
A
'
'
'
'
( )
( )
12
2-) RESOLUTION
- SEPARATION REELLE DES PICS.
- NOTION DE “FINESSE” DES PICS ET
D’EFFICACITE DE LA COLONNE.
POUR UN FACTEUR DE SELECTIVITE IDENTIQUE
LA RESOLUTION PEUT - ÊTRE DIFFERENTE :
produitnon retenu
produitnon retenu
produitnon retenu
Inj.
Inj.
Inj.
t
1 2
2
21
1
temps
2121
2
2)(
ttR
Faible efficacité
Grande efficacité
13
TECHNIQUES CLHP
LES PLUS UTILISEES
- CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION.
- CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE.
- CHROMATOGRAPHIE D'ECHANGE D'IONS.
- CHROMATOGRAPHIE PAR APPARIEMENT
D'IONS.
14
CHROMATOGRAPHIE
D'ADSORPTION
PHASES STATIONNAIRES AYANT DES
PROPRIETES ADSORBANTES :
- GELS DE SILICE
- " D'ALUMINE
SEPARATION DE COMPOSES DE
POLARITE FAIBLE OU MOYENNE.
AVEC LES COMPOSES POLAIRES OU
TRES POLAIRES L'ADSORPTION EST
SOUVENT IRREVERSIBLE.
15
STRUCTURE DES GELS DE SILICE
SILICE = DIOXYDE DE SILICIUM QUI SE
PRESENTE SOUS DIFFERENTES FORMES :
Si
OH
O Si
OH
Si
O
O Si
O
H H
Si O Si
O
Si
O
O Si
O
HH
O
H
H
Si
O
O Si
O
HH
H
OH
O
H
H
OH
H
SILANOLS LIBRES SILANOLS LIES
SILANOLS LIBRES HYDRATES
PONT SILOXANE
SILANOLS FORTEMENT HYDRATES
16
MECANISME
° SUITE DE PROCESSUS D’ADSORPTION-DESORPTION.
S(P.M.) + M(a) S(a) + M(P.M.)
S = SOLUTE , M = PHASE MOBILE
EXEMPLE :
O
Si
OH
O
H
H2N R
O C
CH3
CH3
(P.M.)
Si
(S)
- L’ECHANTILLON (S) ADSORBE SUR UN Si-OH EST
HEURTE EN CONTINU PAR LES MOLECULES DE
PHASE MOBILE (P.M.) .
L’ENERGIE A FOURNIR DOIT-ÊTRE SUFFISANTE
POUR DELOGER L’ECHANTILLON ADSORBE ET
L’ENTRAINER JUSQU’A UN GROUPEMENT Si-OH
VOISIN.............
- (S) DOIT AVOIR UNE POLARITE VOISINE DE CELLE
DE (P.M.) .
17
PHASE MOBILE
SOLVANTS APOLAIRES
/ HEXANE
/ ISO-OCTANE
/ CYCLOHEXANE........EN MELANGE
AVEC DES SOLVANTS:
- ACCEPTEURS DE PROTONS
/ ETHER n-BUTYLIQUE
/ " ISOPROPYLIQUE
- DONNEURS DE PROTONS
/ CHLOROFORME
/ FLUOROALCOOLS
- DONNANT DES INTERACTIONS DIPOLAIRES
/ DICHLOROMETHANE
/ DICHLORO-1,2 ETHANE
SOLVANTS UTILISES EN MELANGES BINAIRES OU
TERNAIRES AVEC UNE FAIBLE PROPORTION
DE SOLVANTS POLAIRES : METHANOL ,
ACETONITRILE
18
SOLVANT
NON POLAIRE
-HEXANE
CHOIX D'UNE PHASE MOBILE
SOLVANT DE
POLARITE MOYENNE
-ACETATE D'ETHYLE
SOLVANT
POLAIRE
-METHANOL
MELANGE PRIMAIRE
SOLVANT A
HEXANE
+
ACETATE D'ETHYLE
MELANGE PRIMAIRE
SOLVANT B
ACETATE D'ETHYLE
+
METHANOL
MELANGE TERNAIRE
(FORCE ELUANTE VARIABLE)
HEXANE / ACETATE D’ETHYLE / METANOL
50% 50% 50% 50%
EXEMPLE :
19
EXEMPLE :
° SEPARATION DE 7 DERIVES DE LA
PHENOTHIAZINE.
O
N
H
- PHASE MOBILE:
/ SOLVANT A = 65% [ISO-OCTANE (50%) +
ETHER ISOPROPYLIQUE (50%) +
TRIETHYLAMINE 0,2 %]
/ SOLVANT B = 35% [ETHER ISOPROPYLIQUE
(50%) + METHANOL (50%) +
TRIETHYLAMINE 0,2%]
- COLONNE : SILICE TYPE SPHEROSIL 6-7 um
(L:15 cm x DI:0,6 cm), DEBIT: 1 ml/min.
20
° DOSAGE DU 5-FU.
N
N
O
O
H F
H
- PHASE MOBILE:
/ SOLVANT A = 75% [HEXANE] + AMMONIAQUE: 1%
/ SOLVANT B = 25% [ETHANOL] + AMMONIAQUE:1%
-COLONNE : SILICE TYPE PORASIL 10 m
(L:30 cm x DI:0,39 cm), DEBIT: 1 ml/min.
INJECTION : 1 g
5-FU5-BrU
5-FU5-BrU
6.44 7.48A B
21
DOSAGE DU 5-FU.
N
N
O
O
H F
H - PHASE MOBILE:
/ SOLVANT A = 21% [HEXANE
(50%) + ETHER ISOPROPYLIQUE (50%)
+ TRIETHYLAMINE 0,05 %]
/ SOLVANT B = 79% [ETHER
ISOPROPYLIQUE (50%) + METHANOL
(50%) + TRIETHYLAMINE 0,05%]
- COLONNE : SILICE TYPE
LICHROSPHER Si 60 5m (L:25 cm x DI:0,4
cm), DEBIT: 1 ml/min.
INJECTION : 50 ng
8.79
22
CHROMATOGRAPHIE
DE PARTAGE
LA SEPARATION DEPEND DES DIFFERENCES DE
SOLUBILITE DES SOLUTES DANS LA PHASE MOBILE
ET DES DIFFERENTES INTERACTIONS DES SOLUTES
AVEC LES GROUPEMENTS ORGANIQUES GREFFES SUR
LA PHASE STATIONNAIRE.
ON DISTINGUE :
- LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE "NORMALE "
AVEC PHASE STATIONNAIRE POLAIRE ET PHASE
MOBILE APOLAIRE OU PEU POLAIRE.
- LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE A POLARITE DE
PHASE STATIONNAIRE INVERSEE (APOLAIRE) ET PHASE
MOBILE POLAIRE.
23
PHASE STATIONNAIRE
- PHASES NORMALES
O
Si
O
NH2
O
Si
O
(CH2)3 NH2
O
Si
O
O
Si
O
C N C N
O
Si
O
(CH2)3
O
Si
O
(CH2)3 O CH2 CH CH2
OH
OH
; ;
; ;
- PHASES INVERSEES
O
Si
O
C8H17
O
Si
O
C18H37
OCTADECYLEOCTYLE
;
24
PHASE STATIONNAIRE “NORMALE”
O
Si
O
NH2
O
Si
O ...............
- PHASE MOBILE
/ SOLVANTS APOLAIRES :
- HEXANE, ISO-OCTANE.......
+
/ SOLVANTS PEU POLAIRES OU POLAIRES: - CHCl3, CH2Cl2, THF, ETHANOL, METHANOL
ACETONITRILE......
SOLVANTS POLAIRES = MODIFICATEURS POLAIRES
° LE T.R. LORSQUE LE % EN SOLVANT POLAIRE .
° L’ORDRE D’ELUTION DEPEND DE LA POLARITE DES
SOLUTES:
LE T.R. AVEC UNE DE LA POLARITE
DU PRODUIT ETUDIE.
25
PHASE STATIONNAIRE INVERSEE
O
Si
O
C8H17
O
Si
O
C18H37;
- PHASE STATIONNAIRE APOLAIRE
- PHASE MOBILE POLAIRE
° ‘’SOLVATATION’’ DES CHAINES ALKYLE DE LA
PHASE STATIONNAIRE PAR LE SOLVANT
ORGANIQUE DE LA PHASE MOBILE :
UN LIQUIDE VISQUEUX DANS LEQUEL
LES SOLUTES PEUVENT DIFFUSER.
° LES SOLUTES PEUVENT INTERAGIR:
-AVEC LE SOLVANT ORGANIQUE DE LA
PHASE MOBILE,
-AVEC LES CHAINES ALKYLE DE LA
PHASE STATIONNAIRE.
/ SOLUTES APOLAIRES, SURTOUT, EN INTERACTION
AVEC LES CHAINES ALKYLE.
/ SOLUTES POLAIRES, PLUTÔT, EN INTERACTION
AVEC LE SOLVANT ORGANIQUE DE LA PHASE
MOBILE.
26
MECANISME
EXEMPLE:
- PHASE STATIONNAIRE: C18
- PHASE MOBILE: H2O/MeOH
- SOLUTE:
/ SOLUTE PLUTÔT APOLAIRE SURTOUT EN
INTERACTION AVEC LES CHAINES C18.
- DU % EN MeOH DONNE DE LA
SOLUBILITE DANS LA PHASE MOBILE,
DONC DES INTERACTIONS AVEC LE
SOLVANT ORGANIQUE CE QUI CONDUIT A
UNE DU T.R.
- INVERSEMENT UNE DU % EN H2O
CONDUIT A UNE DU T.R.
D’OU :
COMPOSES POLAIRES ELUES AVANT
COMPOSES APOLAIRES.
27
- RÔLE DE LA PHASE STATIONNAIRE
° LE T.R. ET LE k’ AVEC LE NOMBRE DE
CHAÎNES ALKYLE GREFFEES.
° VARIATION LINEAIRE DU T.R. ET DE k’ AVEC
LA LONGUEUR DE LA CHAÎNE.
- RÔLE DE LA PHASE MOBILE
° GENERALEMENT : MELANGES H2O OU
TAMPON / MeOH, CH3CN, ETHANOL.....
° PARFOIS : AJOUT, EN FAIBLE PROPORTION,
D’UN 3ème SOLVANT, LE PLUS SOUVENT, DU
T.H.F. :
FORTE INTERACTION AVEC LES CHAÎNES
ALKYLE - MODIFICATION DE LA FORCE
D’ELUTION -.
28
RÔLE DU THF
EXEMPLE: SEPARATION DU PHENOL ET DE L’ALCOOL
BENZYLIQUE.
- COLONNE : C18
(30 cm x DI 0,4 cm), 10 m
- PHASE MOBILE : H2O/MeOH (60%/40%) + THF
EN PROPORTION VARIABLE
29
° PLUS LE SOLUTE EST IONISE PLUS LE T.R.
EST FAIBLE (FORTE SOLUBILITE DANS H2O).
° NECESSITE DE CONTROLER LE pH DE LA
PHASE MOBILE SI LES COMPOSES ETUDIES
POSSEDENT DES GROUPEMENTS ACIDES OU
BASIQUES .
/ UN COMPOSE ACIDE SERA ANALYSE A
UN pH = pKa - 2
/ UN COMPOSE BASIQUE SERA ANALYSE A
UN pH = pKa + 2
30
°CHROMATOGRAPHIE DE COMPOSES BASIQUES
‘’TRAINEES’’ EN SORTIE DE PICS, LE PLUS SOUVENT, A CAUSE
D’INTERACTIONS AVEC LES SILANOLS RESIDUELS DES
PHASES STATIONNAIRES.
POUR REDUIRE LE PHENOMENE :
- AGIR SUR LE pH DE LA PHASE MOBILE
(3,5 < pH <5,5) – (SELS DE POTASSIUM 0,01- 0,1 m).
- UTILISER UN MODIFICATEUR TEL QUE
LA DIETHYL OU LA TRIETHYLAMINE (0,05-0,1 M).
31
° EXEMPLE :
MELANGE : o-TOLUIDINE (1)
m-TOLUIDINE (2)
p- TOLUIDINE (3)
a-PHASE MOBILE: H2O/MeOH (40v/60v)
b-PHASE MOBILE : “ “ “ +
TRIETHYLAMINE 1%
32
APPLICATIONS
TRES NOMBREUSES.
LA SIMPLICITE DES PHASES MOBILE
(POLAIRES) UTILISEES ET LA QUALITE DES
SEPARATIONS EXPLIQUENT LE SUCCES DE LA
CLHP AVEC PHASE STATIONNAIRES INVERSEES
C8, C18.
EXEMPLE :
DOSAGE DU DIPYRIDAMOLE
(TRAITEMENT DE CERTAINES AFFECTIONS
CARDIAQUES).
N
N
N
N
N
N
N
N
CH2
CH2H2C
H2
CH2C
CH2
CH2
OH
HO
HO
H2COH
- DETERMINATION DIRECTE A PARTIR DU
PLASMA.
-TEMPS D’ANALYSE COURT: COLONNE C8
-ETALON INTERNE : NAPHTOL
-DETECTION : FLUORIMETRIE
33
-PHASE MOBILE:
H2O [TAMPON pH 7,4 (0,01M)]/CH
3CN
(60v/40v)
-COLONNE : C8 TYPE LICHROSORB RP8 10m
(L: 15 cm x ID : 0,48 cm)
34
CHROMATOGRAPHIE
D'ECHANGE D'IONS
PRINCIPE
- LA PHASE STATIONNAIRE EST UN ECHANGEUR
D'IONS CONSTITUE PAR DES ELEMENTS
PORTANT DES CHARGES EXCEDENTAIRES
POSITIVES OU NEGATIVES.
° CES CHARGES SONT COMPENSEES PAR DES
IONS DE POLARITE OPPOSEE:
IONS - COMPENSATEURS (APPORTES PAR LA PHASE MOBILE).
° CES IONS PEUVENT ÊTRE REMPLACES PAR
DES MOLECULES DE SOLUTE DE MÊME CHARGE.
35
- PHASE STATIONNAIRE :
POLYMERES DE HAUTE MASSE MOLAIRE OU
GEL DE SILICE SUR LESQUELS SONT GREFFES
DES GROUPEMENTS IONIQUES.
° ECHANGEURS DE CATIONS
/ GROUPEMENTS ACIDE SULFONIQUE
(ECHANGEUR FORT)
/ GROUPEMENTS ACIDE CARBOXYLIQUE
( ECHANGEUR FAIBLE)
° ECHANGEURS D’ANIONS
/ GROUPEMENTS AMMONIUM QUATERNAIRE
36
MECANISME
ECHANGEUR DE CATIONS
Si CH2 CH2 SO3
Na+ -
OOCH
H3C CH COOH+NH3
SOLUTE
ION COMPENSATEUR
TAMPON ACIDE pH4
37
ECHANGEUR D’ANIONS
Si CH2
-OH
SOLUTE
ION COMPENSATEUR
TAMPON BASIQUE
pH
CH2 CH2 N
CH2
H3C CH3
+
CH3COO- +
NH4
38
EXEMPLE :
EXTRATION DE GLUCURONOCONJUGUES
(FONCTION COOH)
URINE (O,1-1 ml)
LAVAGE ETHER
ETHYLIQUE
PHASE AQUEUSE
RESINE ANIONIQUECOLONNE (5 x 20 mm)
FIXATIONACIDE FORMIQUE (0,01N)
LAVAGES : CHCl3, H2O, ETHER ETHYLIQUE
ELUTIONCH3COOH (0,3M) DANS METHANOL
EVAPORATION
RESIDU
CLHP
39
CHROMATOGRAPHIE DE
PAIRES IONS
(OU D'INTERACTIONS D'IONS)
ASSOCIATION DE DEUX IONS DE CHARGE OPPOSEE DUE
:
- A DES INTERACTIONS ELECTROSTATIQUES .
- A DES EFFETS HYDROPHOBES
DES IONS ORGANIQUES DE GRANDE TAILLE
COMPORTANT UNE PARTIE APOLAIRE ET UN
GROUPEMENT IONIQUE S'ASSOCIENT EN
''PAIRES D'IONS'' EN SOLUTION AQUEUSE
° UTILISEE POUR CHROMATOGRAPHIER DES
SUBSTANCES IONISEES OU IONISABLES.
40
PRINCIPE
-PHASE STATIONNAIRE :
O
Si
O
C8H17
O
Si
O
C18H37
OCTADECYLEOCTYLE
;
- PHASE MOBILE :
MELANGE :
/ TAMPON (pH APPROPRIE) / MeOH,
ACETONITRILE.......
+ CONTRE - IONS = ION ORGANIQUE
COMPORTANT UNE OU PLUSIEURS
CHAÎNES HYDROPHOBES.
41
EXEMPLE :
A pH 6 - 7 L’ANION D’UN ACIDE CARBOXYLIQUE
RCOO- EN PRESENCE D’UN CATION AMMONIUM
QUATERNAIRE, TETRABUTYL AMMONIUM PAR
EXEMPLE
CH2 CH2 CH2 4 N
+H3C
CONDUIT A LA FORMATION DE “PAIRES D’IONS”
EN PHASE AQUEUSE EN RAISON DU CARACTERE
HYDROPHOBE DU CATION AMMONIUM.
RCOOe-+ Bu4Ne
+RCOO
- +NBu4 RCOO
- +NBu4e a
e = PHASE AQUEUSE
a = PHASE ORGANIQUE
44
RÔLE :
DE LA PHASE MOBILE, DU CONTRE-IONS,
DE LA PHASE STATIONNAIRE
° LE T.R. DONC LE FACTEUR DE CAPACITE (k’) :
- AUGMENTE ,
/ AVEC LA CONCENTRATION DU CONTRE -IONS .
/ AVEC LA LONGUEUR DE LA CHAÎNE ALKYLE
DU CONTRE - IONS.
/ AVEC LA LONGUEUR DE LA CHAÎNE ALKYLE
DE LA PHASE STATIONNAIRE.
- EST D’AUTANT PLUS ELEVE QUE LE SOLUTE EST
PLUS HYDROPHOBE.
- DIMINUE AVEC UNE AUGMENTATION DU % EN
SOLVANT ORGANIQUE.
45
RÔLE DU pH
° POUR UN COMPOSE ACIDE ON OBTIENDRA LE T.R.
MAXIMUM EN TRAVAILLANT A UN :
pH pKa + 2
° POUR UN COMPOSE BASIQUE ON OBTIENDRA LE T.R.
MAXIMUM EN TRAVAILLANT A UN :
pH pKa - 2
46
IONS COMPENSATEURS LES PLUS UTILISES
- COMPOSES BASIQUES ANALYSES A L’AIDE DE
SELS SODIQUES D’ALCOYLSULFONATE.
EXEMPLE :
° HEPTANE SULFONATE DE SODIUM
C7H15SO3
- Na
+
- COMPOSES ACIDES ETUDIES AVEC DES
PHOSPHATES OU DES NITRATES D’AMMONIUM
TETRABUTYLE.
EXEMPLE :
° TETRABUTYLAMMONIUM NITRATE
CH2 CH2 CH2 4 N
+ NO3
-H3C
° CONCENTRATION EN IONS COMPENSATEURS DE
0,003 M A 0,05 M.
47
EXEMPLE :
DOSAGE DE GLUCURONOCONJUGUES DE
BENZODIAZEPINES (METABOLITES DE PHASE II).
STRUCTURES :
N
NO
Cl
CH3
O
O
HO
OH
OH
COOH
N
NO
Cl
O
HO
OH
OH
COOH
H2C
H2C O
F
A
B
48
° CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
- PHASE MOBILE:
H2O (TAMPON pH 4,6 [NaH
2PO
4 (0,025 M)]/MeOH
(60v/40v).
-COLONNE : C18
TYPE BONDAPAK 10 m
(L:25 cm x DI:0,46 cm), DEBIT: 1 ml/min.
EXTRACTION A PARTIR DE 2 ml D’URINE
A + B + impuretés
49
° CHROMATOGRAPHIE D’APPARIEMENT D’IONS
- PHASE MOBILE:
H2O (TAMPON pH 4,6 [NaH
2PO
4 (0,025 M) + CONTRE
IONS : TBAN (0,0025M)]/MeOH
(60v/40v).
-COLONNE : C18
TYPE BONDAPAK 10 m
(L:25 cm x DI:0,46 cm), DEBIT: 1 ml/min.
EXTRACTION A PARTIR DE 2 ml D’URINE
A
B
50
ANALYSE QUANTITATIVE
EN CLHP
°ESSENTIELLEMENT PAR ETALONNAGE INTERNE
° PRECAUTIONS:
- LE SOLVANT D’INJECTION DOIT ASSURER UNE
SOLUBILISATION TOTALE DE L’ECHANTILLON.
- LA SOLUTION INJECTEE
/ DOIT ÊTRE LIMPIDE
/ DOIT ÊTRE COMPATIBLE AVEC LA
PHASE STATIONNAIRE ET LA PHASE
MOBILE.
- IL EST PREFERABLE DE SOLUBILISER
L’ECHANTILLON DANS LA PHASE MOBILE
AVANT INJECTION.
51
° RESULTATS PLUS REPRODUCTIBLES :
- SI ELUTION EN REGIME ISOCRATIQUE.
- ELUTION PAR GRADIENT PRESENTE SOUVENT
LES INCONVENIENTS SUIVANTS :
/ DERIVE DE LA LIGNE DE BASE.
/ APPARITION DE PICS PARASITES DUS AUX
SOLVANTS ET/OU A L’EXTRACTIF.
/ NECESSITE UN REEQUILIBRAGE DE LA
COLONNE AVANT CHAQU’ANALYSE.
- IL EST IMPORTANT DE SELECTIONNER DES
COLONNES MECANIQUEMENT TRES
RESISTANTES ET STABLES DANS LE TEMPS.
STABILITE ET RESISTANCE PAR AJOUT D’UNE
PRECOLONNE.
52
° UNE BONNE STABILITE DE LA PHASE MOBILE EST
INDISPENSABLE .
- TOUTE VARIATION DU DEBIT OU DE LA
COMPOSITION DE LA PHASE MOBILE
ENTRAINE UNE MODIFICATION DU T.R. ET DE
LA FORME DES PICS.
/ VARIATION DANS LA COMPOSITION DE LA
PHASE MOBILE A CAUSE :
- DE LA VOLATILITE D’UN SOLVANT
- DE LA NON-REPRODUCTIBILITE D’UN
GRADIENT D’ELUTION.
53
ANALYSE DES TRACES
QUANTITES ALLANT DE 1 g/ml A QUELQUES pg/ml.
A CE NIVEAU PROBLEMES DUS :
- A LA DETECTION
- A L’ISOLEMENT DES COMPOSES (EXTRACTION)
- AUX INTERFERENCES ( PRODUITS ENDOGENES....)
LA QUANTITE MINIMALE DETECTABLE DEPEND :
- DE LA SENSIBILITE DU DETECTEUR
- DE LA DILUTION APPORTEE PAR LA COLONNE
CONDITIONS IDEALES :
- T.R. FAIBLE AVEC UNE COLONNE
/ COURTE
/ DE FAIBLE DI
/ UNE PHASE A GRANULOMETRIE FINE (3 m-1,8m)
- TRAVAILLER AVEC UNE COLONNE CAPILLAIRE.
54
- AMELIORATION DE LA SENSIBILITE
° ANALYSE AVEC DE GRANDS VOLUMES:
INJECTION DE GRANDS VOLUMES SI
SOLVANT DE FORCE ELUANTE > A
CELLE DE LA PHASE MOBILE
MINIMISE LA DILUTION APPORTEE
PAR LA COLONNE.
° PRECONCENTRATION DU SOLUTE
ECHANTILLON EN SOLUTION DANS UN
SOLVANT DE TRES FAIBLE FORCE
ELUANTE QUI DONNE DES T.R. ELEVES.
( H2O SI ON TRAVAILLE EN PARTAGE)
55
NOUVEAUX DEVELOPPEMENTS
-RAPIDE CLHP
-CLHP HAUTE RESOLUTION
COLONNES COURTES ET OU DE FAIBLE DIAMETRE
GRANULOMETRIE : 1,8 µm
PRESSION DE COLONNE : 600 A 1000 BARS
POMPES BINAIRES
SYSTEMES A FAIBLE VOLUME MORT
NOUVELLES APPROCHES
POUR AUGMENTER LA SENSIBILITE
58
N SO3
CH3
CH3
N SO3
CH3
CH3
N SO3
CH3
CH3
-(S
iO)-
COLONNE HILIC (HYDROPHILIC INTERACTION LIQUID
CHROMATOGRAPHY)
COMBINAISON DES CARACTERISTIQUES DES 3 TYPES DE
COLONNES LES PLUS UTILISEES EN CLHP :
- PHASE INVERSE
- PHASE NORMALE
- PHASE IONIQUE
PHASE MOBILE : EAU OU TAMPON LEGER/ACETONITRILE -
METHANOL (PROPORTION ELEVEE EN SOLVANT ORGANIQUE)
NOUVEAUX DEVELOPPEMENTS
59
EXEMPLE : MELANGE URACIL-NAPHTALENE
A
B
A : COLONNE 1254 mm, C18, 3 m
B : COLONNE 1254 mm, HILIC, 3 m
PHASE MOBILE : H2O/ CH3CN; 10v/90v
DEBIT : 1ml/min.
1 : URACIL
2 : NAPHTALENE
60
DETECTEUR DE LA CLHP
- DOIT FONCTIONNER SUR UNE PHASE MOBILE
ANIMEE D’UN MOUVEMENT CONTINU.
- CUVE DE FAIBLE VOLUME : 5 A 10l
- LA RESOLUTION ET LA SEPARATION DONNEES PAR
LA COLONNE DOIVENT ÊTRE CONSERVEES PAR LE
DETECTEUR.
61
° UN BON DETECTEUR DOIT SE CARACTERISER :
- PAR UNE LIGNE DE BASE PLANE, SANS DERIVE
- PAR UN BRUIT DE FOND AUSSI FAIBLE QUE
POSSIBLE.
- LE PLUS PETIT PIC DETECTABLE CORRESPOND
EN GENERAL A UN RAPPORT SIGNAL / BRUIT
DE FOND EGAL A 2d.
d
2d
62
PRINCIPAUX DETECTEURS
A - DETECTEUR UV-VISIBLE
- A LONGUEUR D’ONDE VARIABLE 190-600 nm.
- A BARETTES DE DIODES (190-600 nm).
63
B - DETECTEUR DE FLUORESCENCE
FLUORESCENCE = RAYONNEMENT EMIS PAR
CERTAINS COMPOSES EXCITES PAR UNE
RADIATION LUMINEUSE.
ON ENVOIE UNE LONGUEUR D’ONDE
D’EXCITATION ET ON MESURE L’EMISSION.
(EXCITATION < EMISSION)
FLUORESCENCE NATURELLE SI :
- GROUPEMENTS AROMATIQUES
- DOUBLES LIAISONS FORTEMENT CONJUGUEES
SOUVENT SENSIBILITE 1000 FOIS > A L’UV.
64
° CERTAINS COMPOSES PEUVENT ÊTRE RENDUS
FLUORESCENTS PAR REACTION CHIMIQUE.
EXEMPLE :
COMPOSES POSSEDANT DES FONCTIONS AMINES
PRIMAIRES, SECONDAIRES.
SO2Cl
N
CH3H3C
+ CH
R
H2N
COOH
O2S
N
CH3H3C
CH
R
HN
COOH
O
O
O
O O
O
O
O
OH
N
O
O
CH
R
H2N
COOH
CH
RHN
COOH
HO
CHR
COOH
CHLORURE DE DANSYLE
FLUORESCAMINE
65
C - DETECTEUR ELECTROCHIMIQUE
- TRES SENSIBLE, TRES SELECTIF.
- PRINCIPE :
PHENOMENES D’OXYDATION ET DE
REDUCTION PAR ELECTROLYSE SOUS
L’INFLUENCE D’UN POTENTIEL APPLIQUE
ENTRE DEUX ELECTRODES.
- EXCELLENTS RESULTATS AVEC :
/ LES PHENOLS
/ LES CATECHOLAMINES
/ LES NITROSAMINES
/ LES ACIDES ORGANIQUES
- LIMITES :
- LA PHASE MOBILE :
/ DOIT-ÊTRE RENDUE CONDUCTRICE PAR
AJOUT D’UN SEL, CE QUI EXCLU LA
CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTION.
/ NE DOIT CONTENIR NI OXYGENE NI
CONTAMINANTS METALLIQUES, NI
HALOGENURES QUI LE BRUIT DE FOND.
- LE POTENTIEL DOIT-ÊTRE FAIBLE POUR
EVITER UNE ELECTROLYSE DE LA PHASE
MOBILE.
66
D - DETECTEUR DE RADIOACTIVITE (DETECTEUR DE SCINTILLATION)
-PRINCIPE :
TECHNIQUE DE SCINTILLATION = LUMIERE EMISE
PAR UN COMPOSE PHOSPHORESCENT SOUS
L’INFLUENCE D’UN PHENOMENE IONISANT.
PHOSPHORESCENCE = EMISSION DE LUMIERE PAR
L’EXCITATION DUE A DES RADIATIONS.
A LA DIFFERENCE DE LA FLUORESCENCE NE
PEUT SE FAIRE QUE PAR APPORT D’ENERGIE
EXTERIEURE.
67
UTILISATION DES RADIOELEMENTS
EN PHARMACOCINETIQUE
ETUDE DU METABOLISME
LE MARQUAGE DOIT ÊTRE :
ISOTOPES UTILISES : 3H, 14C, 35S, 32P, 125I
-SPECIFIQUE : SITES DE MARQUAGES PRECIS
ET EXCLUSIFS.
-QUANTITATIF : LE PLUS ELEVE POSSIBLE
ET CONNU AVEC PRECISION.
68
ETUDE DU METABOLISME
1ère ETAPE : INCUBATION DU MEDICAMENT
AVEC DES HEPATOCYTES, DES
MICROSOMES OU DES LIGNEES
CELLULAIRES BIEN DEFINIES.
SOIT UN MEDICAMENT RADIOMARQUE P :
2ème ETAPE : RECUEIL DU MILIEU INTRA ET/OU
EXTRACELLULAIRE.
3ème ETAPE : ANALYSE PAR CLHP.
69
P
M4
M3
M2
M1
INJ
P M1
M2 M3
M4
INJ
P
M1
M2
M3
M4
INJ
30 min
P
INJ
1H
2H
Produit marqué
CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
P
70
RECHERCHE DE METABOLITES DE
GLUCURONOCONJUGAISON
1- CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
2- CHROMATOGRAPHIE PAR APPARIEMENT D ’IONS
(AJOUT DE TBAN A LA PHASE MOBILE)
P
M4
M3
M2
M1
INJ
2H
INJ
M4
M2
M3 M1
P
2H
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