cellules souches pluripotentes induites (ips

Pr John DE VOS

Département d’Ingénerie Cellulaire et Tissulaire

INSERM 1183 - IRMB

Hôpital St Eloi - CHU de Montpellier

john.devos@inserm.fr

@_jdevos_ Montpellier ACLF 2016

CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES INDUITES (iPS) : APPLICATIONS AUX

PATHOLOGIES GÉNÉTIQUES ET LIMITES

CELLULES

SOUCHES

PLURIPOTENTES

Montpellier ACLF 2016

Induced pluripotent stem cells (iPS)

neurones

coeur

Sang

peau

OCT4

SOX2

cMYC

KLF4

2006 S Yamanaka – Nobel Price 2012

K. Takahashi and S. Yamanaka. Cell, 126:663, 2006.Montpellier ACLF 2016

1. Modélisation in vitro du développement normal et des maladies génétiques

2. Une source illimité de cellules pour la thérapie cellulaire potentiellement autologues

3. Un moyen de rajeunir des cellules âgées voire sénescentes

Applications

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MODELLISATION

DE PATHOLOGIES

GENETIQUES

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Montpellier ACLF 2016

iPS Progéniteurs neuronaux Neurones

BetaIII Tubulin

MAP2

11j 21j

Israel MA et al. Nature, 2012, 482: 216–220Montpellier ACLF 2016

Israel MA et al. Nature, 2012, 482: 216–220Montpellier ACLF 2016

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ESSAIS

CLINIQUES

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ESSAIS CLINIQUES

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Kimbrel EA et al. Nature Reviews Drug Discovery, 2015 14: 681–692.

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Menasche P et al. European Heart Journal, 2015 36: 2011–2017

LIMITES

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Q. Bai, R. Desprat, B. Klein, J.-M. Lemaitre, and J. De Vos, “Embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells? A DNA integrity perspective.,” Curr Gene Ther, vol. 13, pp. 93–98, Apr. 2013.

o Anomalies épigénétiques

o Anomalies génétiques secondaires à la reprogrammation

o N’est pas retrouvé par tous (sauf mutagénèse insertionnelle!): dépend du protocole de reprogrammation?

iPS = ES ?

[1] F. Rouhani,et al., “Genetic background drives transcriptional variation in human inducedpluripotent stem cells.,” PLoS Genet, vol. 10, no. 6, p. e1004432, Jun. 2014.

L’essentiel de la variabilité vient du fond génétique

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iPS = ES !

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ANOMALIES

GENETIQUES

INDUITES PAR LA

CULTURE

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1. Chronologie et déterminants de cette instabilité

1. A quelle vitesse les anomalies apparaissent-elles?

2. Impact des conditions de culture (passage)

3. Anomalies de caryotype vs infra-caryotypique?

2. Quelles anomalies génétiques?

3. Conséquences?

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CHRONOLOGIE

ET DETERMINANTS

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Impact de la dissociation cellulaire : “adaptation”

Passage mécanique

Dissociation cellulaire (trypsine)

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Passage mécanique

Dissociation cellulaire (trypsine)

+ inhibiteur ROCK (ou forte concentration cellulaire

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Impact de la dissociation cellulaire : “adaptation”

“Adaptation” à la dissociation cellulaire

+ inhibiteur ROCK (ou forte concentration cellulaire

Après 5 à 10 passages : adaptation

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Anomalies génétiques

o Comparaison d’un passage mécanique vs. enzymatique

o 3 lignées ES humaines à passage précoce:o HD129: p16 et HD291: p13; HS306: p25

o Trois techniques d’analyse génétique:o Caryotype

o Puces à AND SNP 6.0 (Affymetrix)

o NGS

ETUDE DES ANOMALIES GENETIQUES INDUITES PAR LE STRESS DE LA DISSOCIATION CELLULAIRE

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Anomalies caryotypiques

Montpellier ACLF 2016 Bai et al. Stem Cell Dev, 2015

Montpellier ACLF 2016

Anomalies caryotypiques

Bai et al. Stem Cell Dev, 2015

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Copy Number Variation (CNV)

Bai et al. Stem Cell Dev, 2015

NGS

o Analyse en cours

o Peu de mutations

o Hasard ou déterminisme de ces mutations de novo?

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Conclusion 1

o Instabilité génétique des CSP:

o Fortement dépendant du type de passage

o Peut-être très rapide (5 passages)

o Anomalies caryotypiques et CNV

o NB : anomalies de caryotype récurrent mais plutôt tardif, CNV non récurrent et précoce

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QUELLES

ANOMALIES

GENETIQUES?

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Nicolas Girault, Master 2

Said Assou, IR

Anthony Boureux, MCU

Thérèse Commes, PU

John De Vos, PUPH

Seadb.org (unpublished)

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Variants

Trisomy SNV CNV LOH Délétion Translocation Duplication

Inventaire de ces anomalies dans les CSP

Extraction

Etudes

Auteur PMID Année Journal Equipe

SEAdb

101

405735

Echantillons

Type d’échantillon

Paramètre de culture

Méthode de détection

905

SEAdb

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Zoom via a genome browser

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“HOTSPOT FINDER”

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“HOTSPOT FINDER”

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“HOTSPOT FINDER”

Translocations

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En

zym

ati

cM

ec

ha

nic

Impact de la méthode de passage sur la fréquence des variants

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Conclusion 2

o Les principales anomalies génétiques récurrentes:

o Aneuploïdies

o Et des gains > 1Mb

o Ce sont des anomalies « hyperrécurrentes »

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ALTERATION DU

TRANSCRIPTOME

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COPY NUMBER EFFECT

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COPY NUMBER EFFECT?

o 320 probesets avec au moins un FC > 4 dans une lignée (max : 119,04)

o 22 probesets localisées sur un CNV (max : 7,8)

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Signature transcriptionnelle caractéristique

EP15

MP15

P0

EP15

MP15

P0

mRNAseq

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Long non-coding RNA

EP15

MP15

P0

o Certains lncRNA induits massivement (> x50)

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si GFP

si 20-1

si 8-1

50K/cm²

25K/cm²

12,5K/cm²

- 91%

- 35%

o Knock-down par siRNA sur cellules adaptéesMontpellier ACLF 2016

Conclusion 3

o Modifications transcriptome plus importantes que ne le voudraient les anomalies génétiques

o Modifications du phénotype précèdent le changement génétique?

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Conclusion générale

o iPS : modèle prometteur d’étude des maladies génétiques

o Attention aux aneuploïdes induites par la culture

o surveillance régulière de la culture (caryotype, FISH?, puces? séquençage?)

o iPS « naïves »?

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CHU de

Montpellier

COLLABORATIONS

Franck PELLESTOR (CHROMOSTEM)Jean-Marc LEMAITREOuti HOVATTA

Present and past members :Engi AHMEDCaroline SANSACJulien BOUCKENHEIMERJean-Marie RAMIREZSaid ASSOUArnaud BOURDINJohn DE VOS

Mathilde PLINETNicolas AUSSELNicolas GIRAULTQiang BAIDoris CERECEDO

Montpellier ACLF 2016

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Montpellier ACLF 2016 Bai et al. Stem Cell Dev, 2015

SWAP

Montpellier ACLF 2016 Bai et al. Stem Cell Dev, 2015

SWAP

Montpellier ACLF 2016 Bai et al. Stem Cell Dev, 2015

Nombre de publications par année

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