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BIOTECHNOLOGIEPHARMACEUTIQUE

De l’éprouvette au produit final

La totalité du matériel présenté est disponible à l’adresse web:http://www.gch.ulaval.ca/agarnier/

PHA 2501: Sciences Pharmaceutiques II

Alain Garnier, Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB), génie chimique, PROTEO, Hiver 2010

Définition et contexte

Biotechnologie: l’application de la science et de la technologie aux organismes vivants, à d’autres matériaux vivants ou non vivants, pour la production de savoir, biens et services. (source: OCDE)

Traditionnelle: Utilisation de micro-organismes et d’enzymes sélectionnés pour produire des agents d’intérêt; Isolation d'agents à partir de sources biologiques.

Contemporaine: Utilisation de micro-organismes et d’enzymes modifiés, directement ou non, pour produire des agents d’intérêt.

Les médicaments d'origine biologique

Traditionnels: D'origine animale: produits sanguins,

hormones, stéroïdes, catécholamines, prostaglandines, anticorps, insuline, vaccins…

D'origine végétale: alcaloïdes, flavonoïdes, méthylxanthines, terpénoïdes, glycosides cardiotoniques et coumarines, ac salicylique…

D'origine microbienne: antibiotiques,

enzymes, protéases, vaccins, … D'origine virale: vaccins

Les médicaments d'origine biologique (suite)

Biopharmaceutique: substance utilisée à des fins thérapeutiques ou diagnostiques, à base d'acides nucléiques ou de protéines, produites par des moyens autre que l'extraction directe d'une source biologique non-modifiée.

Exemples: Facteurs sanguins (facteurs VIII et Factor IX) Agents trombolytiques (activateur tissulaire du plasminogène) Hormones (insuline, hormone de croissance, gonadotrophine, etc) Facteurs de croissance (cytokines, interférons (IFN), interleukines (IL),

érythropoïétine (EPO), facteur de croissance des colonies, …) Vaccins (méningocoque, influenza, antigène de surface de l'hépatite

B, …) Anticorps monoclonaux Autres (facteur de nécrose tumorale, plasmides, vecteurs viraux,

microARN, ARNi, …)

Seulement 12% des nouveaux médicaments sont produits par synthèse/extraction

34%

21% 22%

12% 12%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

%

Cell. Mam. Microbe Vaccins Extr/Synthèse Thérapiegénique

% de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)

Plan

Cibles Sources Produits/caractérisques Méthodes analytiques Développement de systèmes de production

Construction/sélection Procédés de production Procédés de séparation

Cibles des biopharmaceutiques

Francis Crick, 1958 (source: NCBI)

traduction

PROTÉINE

ARN

ADN Dépistage/thérapie génique

Transcriptome/ARNi

Protéome/Anticorps, hormones…

DIAGNOSTIC/THÉRAPIE

Syst immunitaire/vaccinMétabolisme/ Thérapie cellulaire

Sources de biopharmaceutiques

Virus Bactéries Levures Moisissures Cellules animales

Invertébrés Mammifères Primates non-humains Humaines Lignées établies Cultures primaires Cellules souches

Les virus

Influenza

Herpes Adenovirus

Vaccins ou vecteurs de thérapie génique

Vaccins - exemples: •Influenza (GSK)•Adénovirus 4 & 7 (Wyeth Pharma pour DoD, 105-106 doses•Aussi: variole, rubéole, rougeole, oreillons, varicelle, hépatite, polio, rage, fièvre jaune, encéphalite japonaise, cancer, etc

Maladies traitées par thérapie génique

Vecteurs utilisés

Type de gènes employés

Phases cliniques

La thérapie génique

AdénovirusRétrovirus

La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche.

Adénovirus: cycle d’infection

Adénovirus: les gènes

B Massie, IRB

Adénovirus: évolution des vecteurs

B Massie, IRB

Adénovirus: construction

R. Gilbert, IRB

Adénovirus: production et utilisation

B Massie, IRB

Rétrovirus

- Rétrovirus s’insère dans le génome de la cellule hôte- 3 familles de gènes: gag = capside, pol = polymérase, env = enveloppe- On manipule la protéine d’enveloppe pour altérer le tropisme du virus

Rétrovirus: cycle de réplication

Rétrovirus: construction de lignée de production

Les autres outils génétiques

Diagnostic Patron de digestion par enzymes de restriction Séquençage Hybridation FISH Gene chip qRT-PCR

Autres phénomènes Épigénétique ARNi

Techniques analytiques:L’identification de séquences d'ADN

La digestion de l'ADN avec des enzymes de restriction, suivi d'une électrophorèse permet une identification par la différence de taille des fragmentsTiré de Microbiology 101, WSU

L’identification de séquences (suite)

En réalisant des PCR sur des fragments d'ADN en présence de désoxynucléotides et une alternance de didésoxynucléotides, on parvient à complètement séquencer l'ADN

Hybridation fluorescente in situ (FISH)

LE FISH est une technique de biologie moléculaire d'hybridation in situ utilisant des sondes marquées à l'aide d'un marqueur fluorescent et utilisées sur des coupes en microscopie.

Ces sondes peuvent être utilisées sur de l'ADN ou de l'ARN (sonde ADN), ou sur des protéines (sonde anticorps). Le FISH est une technique de cytogénétique permettant de voir des éléments à l'intérieur de la cellule.

L'expression des gènes: les biopuces

1- Comparaison de l’expression génétique de 2 échantillons cellulaires

2- Extraction de l ’ARN3- Réverse transcription avec des

nucléotides marqués par des fluorochromes différents

4- Hybridation compétitive sur des lamelles contenant des milliers d’oligonucléotides différents connus

5- Lecture des lamelles6- Analyse des résultats

Les biopuces (suite)

Joe DeRisi et al., Stanford U., 6116 gènes (cliquez sur les images pour une explication détaillée).

quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)

Cliquez sur l'image pour un lien vers une simulation de la PCR

quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)

Épigénétique

• Le terme épigénétique définit les modifications transmissibles et réversibles de l'expression des gènes ne s'accompagnant pas de changements des séquences nucléotidiques. Les changements peuvent se produire spontanément, en réponse à l'environnement, à la présence d'un allèle particulier, même si celui-ci n'est plus présent dans les descendants

• Certains caractères épigénétiques hérités pouvaient être transmis lors de la réplication cellulaire (méiose), voire subsister d'une génération à l'autre pour des organismes multicellulaires.

• Les phénomènes épigénétiques constituent un programme qui déciderait quels gènes activer ou inhiber. L’environnement influence ces signaux épigénétiques qui peuvent ainsi subir de petits changements. Ces épimutations sont plus fréquentes que les mutations classiques de l’ADN.

Phénomènes épigénétiques

•Paramutations•Bookmarking•Imprinting•Gene silencing•X chromosome inactivation•Position effect•Reprogramming•Transvection•Effet maternel

L’ARN anti-sens, interférent, micro-ARN

(Pour plus de détails, cliquez ici)

Exemple 1: Infectio Diagnostic

Originalement Infectio Diagnostic, puis GeneOhm Sciences et maintenant Becton Dickinson (BD) Diagnostics à Québec: Identification génétique de bactéries

pathogènes, de gènes de toxines et de gènes de résistance (Strep B, SARM, …)

Basé sur la sensibilité, la spécificité et l'ubiquité de l'amorce PCR

Temps du test ≈1 hr

Exemple 2: Diagnocure

La plate-forme technologique PCA3, un gène dont l'ARN messager est détecté dans la majorité des cancers de la prostate chez l'humain. Le même ARN messager n'est exprimé qu'à un très faible niveau dans la prostate normale et est absent des autres tissus normaux. PCA3 peut donc servir de marqueur tumoral et les molécules dérivées de sa séquence, ARN messager ou peptide, peuvent servir à la mise au point de divers produits de diagnostic ou de thérapie. La découverte du gène PCA3 est le fruit d'une collaboration entre DiagnoCure et l'Université de Nijmegen et DiagnoCure détient des droits mondiaux sur cette plate-forme technologique.

La technologie DiagnoGeneMC est l'association de technologies pour la détection d'acides nucléiques et de séquences de gènes spécifiques au cancer. Les produits dérivés de cette plate-forme technologique contiennent trois trousses utilisées selon un protocole en trois phases. Une trousse contient des billes de silice pour la purification des acides nucléiques de la préparation cellulaire analysée. Une autre trousse contient des amorces, des séquences d'acides nucléiques spécifiques au cancer investigué, et les réactifs nécessaires à l'amplification isothermique des ARNs messagers isolés avec la première trousse et complémentaires aux amorces fournies. La troisième trousse sert à la détection immunoenzymatique du produit amplifié. Cette plate-forme technologique peut donc servir à la mise au point de trousses de détection de tout cancer pour lequel on connaît une séquence spécifique. Dans le cadre de l'accord de licence avec Organon Teknika, DiagnoCure détient des droits mondiaux sur les technologies Boom et NASBA, pour tous les cancers.

Les protéines recombinantes (PR)

1ère: insuline dans E. coli (1982, Ely Lilly)

73 sur le marché en 2004, >80 en essais cliniques

Croissance de 65% entre 2004 et 2010 (52G$/2010)

Insuline+EPO+IFN = 57% du marché Protéines glycosylées = 60% du marché

des PR, principalement mAb

Les anticorps

Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa (chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de l’anticorps pour son antigène

Anticorps monoclonaux - applications

37% des nouvelles molécules thérapeutiques biologiques

Identification/diagnostic Thérapeutique:

Contre cancer, Crohn, Asthme, Psoriasis, SIDA,... Dirigés contre une protéine spécifique, ils

peuvent bloquer une interaction récepteur-ligand ou déclencher une réponse immunitaire.

Ils peuvent aussi être liés à un agent chemothérapeutique, radioactif ou autre pour augmenter leur effet.

Exemple: Agent anti-angiogénétique (Laboratoires Aeterna)

Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des micro-organismes.

Les cellules thérapeutiques

Cellules du sang: cellules souches hématopoïétiques, Lymphocytes, Mégakaryocytes, plaquettes (Hema-Québec)

Cellules musculaires (myoblastes, Jacques Tremblay, CHUL) Cellules épithéliales (peau, vaisseaux sanguins, Hopital du

Saint-Sacrement, LOEX) Cellules souches d'adulte et embryonnaire (Réseau

canadien sur les cellules souches, http://www.stemcellnet.ca): travaux sur le traitement du diabète, la maladie de Parkinson, l'insuffisance cardiaque, la dystrophie musculaire, la cécité, etc

Les cellules souches hématopoïétiques

Les cellules souches embryonnaires

Les cellules souches adultes

Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD)

• Prévalence: 1 garçon/3500• Espérance de vie ≈ 20 ans

Thérapie cellulaire de la DMD

Essais cliniques phase 1

3x1010 cellules/kg à traiter

Équivalent: 100g muscle donneur /kg à traiter

Multiplication in vitro incontournable

Volumes de culture: 30L/kg à traiter

Prérequis: Milieu de culture efficace et

sécuritaire

Bioprocédé à grande échelle (en développement)

Caractéristiques des protéines: épissage

Source: U Miami, cours BIL150

chip.html

Exemple: Nyman et al (1998), "Identification of nine interferon-a subtypes produced by Sendai virus induced human peripheral blood leucocytes". Biochem J, 329:295-302.

Caractéristiques des protéines: structure

Thèse PhD, François GUILLONNEAU, 2002

Caractéristiques des protéines: les modifications post-traductionnelles

•Clivage•Pont S•méthylation, phosphorylation, glycosilation•conformation•ajout de ligands spécifiques (lipid anchor)

Tiré de PHK

Analyses protéique et cellulaire Analyse de protéines

activité ELISA Électrophorèse 1D, 2D, capillaire Chromatographie liquide (HPLC) Spectrométrie de masse

Analyse cellulaire: Immuno-histo-chimie Cytométrie en flux Imagerie cellulaire en temps réel Systèmes robotisés

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Électrophorèse sur gel

SDS-PAGE

Transfert sur membrane de nitrocellulose et révélation avec marqueur spécifique:

Western: EP + anticorps spécifiques à protéines

Southern: EP + ADN marqué

Northern: EP + ARN marqué

Tiré de Segura, Garnier et al (2007). Figure 2. Fractionation of purified retroviral vector preparations by 1D Gel ElectrophoresisPurified virus preparations with (a) and without (b) subtilisin treatment were fractionated on a 4-12% Tris-Glycine polyacrylamide gel (Invitrogen) run under reducing conditions and visualized by silver staining. Protein bands from gel b were excised and subjected to in-gel tryptic digestion prior to MS/MS analysis. Bands containing statistically significant peptide identifications (A-L) are indicated on gel b. Figure 2c shows the protein profiles of samples a (green) and b (blue) superimposed. The theoretical migration positions of all MoMLV viral-encoded proteins are indicated in figure c.

Électrophorèse SDS-PAGE

Gel d’électrophorèse 2-D

(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)

High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Réservoir dePhase mobile

Pompe

Échantillon

Colonne

Échantilloneur

Détecteur

Collecteur de fraction

•Échange d’ions•Tamis moléculaire•Interaction hydrophobe•Phase inverse•Électrophorèse

•En fonctionde la colonne•Gradient

•UV/visible•Fluorescence•Infra-rouge•Indice de réfraction•Conductivité•Spectrométrie de masse

•Automatique•Réfrigéré

Hydrolysat trypsique de la BSA

Spectrométrie de masse (MS) - interface

L'électro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI)

"Make elephants fly", Prix Nobel de Chimie 2002: John B Fenn

MS – domaines d'application

L'électro-atomisation à pression atmosphérique (API-electrospray) permet l'analyse de protéines

MS - analyseurs

Constitué de:1) une source

d'ionisation2) un ou plusieurs

analyseurs qui séparent les ions produits selon leur rapport m/z

3) un détecteur qui compte les ions et amplifie le signal

4) un système informatique pour traiter le signal

Secteur magnétique

MS - Quadrupole

m/z 10-4000 Précision :~m/z 0.1-0.2 Vitesse de balayage: 5000

m/z par sec Le temps de vie d’un ion

de sa formation à sa détection ~40-100 μs.

www.bris.ac.uk

MS - Temps d’envol (TOF)

L’incorporation d’un réflectron dans le tube du TOF ou une extraction ionique délayée (Cornish et

Cotter, 1994; Cotter et al., 2004) TOF est communément

employé avec MALDI, il peut aussi être utilisé avec un ESI (Boyle et

Whitehouse, 1992)

www.chemistry.adelaide.edu.au

LCMS – exemple d'appareil

Agilent 1100 MSD: API-ES, quadrupole

MS – exemple de résultat

•Myoglobine, MM= 16951 Da•Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant les rapports m/z des ions détectés sur l'abscisse et l'abondance relative de ces ions sur l'ordonnée•Le spectre est le résultat de la distribution de charges sur la population moléculaire•Permet d'analyser qualitativement et quantitativement la protéine d'intérêt

Analyse de protéines par MSMS

(Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002)

MS spectrum

MS/MS ion spectrum

m/z

m/z

Nomenclature de la dissociation en fragments proposée par Roepstorff, 1984

Exemple d'analyse MSMS

Albumine

Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L), souvent utilisée en milieu de culture de cellules de mammifères

Exemple d'analyse MSMS

Albumine

Informations obtenues sur Expasy (www.expasy.org)

>P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA

Number of amino acids: 594 Molecular weight: 68026.9 Theoretical pI: 5.77

position mass peptide sequence position mass peptide sequence

25-28 500,2463 DTHK 300-309 1177,5591 ECCDKPLLEK

29-34 712,3736 SEIAHR 310-318 1015,4877 SHCIAEVEK

37-44 974,4577 DLGEEHFK 319-336 1955,9596 DAIPENLPPLTADFAEDK

45-65 2435,2427 GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK 341-346 752,3573 NYQEAK

66-75 1163,6306 LVNELTEFAK 347-359 1567,7427 DAFLGSFLYEYSR

76-88 1349,546 TCVADESHAGCEK 361-371 1283,7106 HPEYAVSVLLR

89-100 1362,6722 SLHTLFGDELCK 375-386 1388,5708 EYEATLEECCAK

101-105 545,3405 VASLR 387-399 1497,6314 DDPHACYSTVFDK

106-117 1364,4803 ETYGDMADCCEK 402-412 1305,7161 HLVDEPQNLIK

118-122 658,3155 QEPER 413-420 1011,42 QNCDQFEK

123-130 977,4509 NECFLSHK 421-433 1479,7954 LGEYGFQNALIVR

131-138 886,4152 DDSPDLPK 438-451 1511,8427 VPQVSTPTLVEVSR

139-151 1519,7461 LKPDPNTLCDEFK 460-468 1052,4499 CCTKPESER

157-160 537,282 FWGK 469-482 1667,8131 MPCTEDYLSLILNR

161-167 927,4934 YLYEIAR 483-489 841,46 LCVLHEK

169-183 1888,9268 HPYFYAPELLYYANK 490-495 660,3563 TPVSEK

184-197 1633,6621 YNGVFQECCQAEDK 499-507 1024,455 CCTESLVNR

198-204 701,4014 GACLLPK 508-523 1823,8996 RPCFSALTPDETYVPK

205-209 649,3338 IETMR 524-528 609,2878 AFDEK

212-218 703,4097 VLASSAR 529-544 1850,8993 LFTFHADICTLPDTEK

223-228 649,3338 CASIQK 549-557 1014,6193 QTALVELLK

229-232 508,2514 FGER 558-561 509,3194 HKPK

236-241 689,3729 AWSVAR 562-568 818,4254 ATEEQLK

249-256 922,488 AEFVEVTK 569-580 1399,6926 TVMENFVAFVDK

257-263 789,4716 LVTDLTK 581-587 725,2593 CCAADDK

267-280 1578,5981 ECCHGDLLECADDR 588-597 1050,4924 EACFAVEGPK

281-285 517,298 ADLAK 598-607 1002,583 LVVSTQTALA

286-297 1386,6206 YICDNQDTISSK      

Albumine: fragments trypsiques

Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsiqueANALYSE MS2, cliquez ici

Identification de protéine, cliquez ici(Logiciel Mascot, Matrix Science)

Protéomique du sérum sanguin

Tirumalai et al., 2003

•60 à 80 g/L de protéine (Tirumalai et al., 2003)

•10 000 protéines différentes

•22 protéines = 99% de la quantité protéinique du sérum (Zhang et al., 2005)

•12 log de variation de concentration (Anderson et Anderson, 2002; Zhang et al., 2005)

•325 protéines identifiées en 2003 (Pieper et al., Proteomics, 3: 1345-1364)

•3020 protéines identifiées en 2005 (Omenn et al., Proteomics, 5:…)

Protéomique du sérum sanguin

Anderson et Anderson, 2002

Analyse cellulaire

Le compteur de Coulter enregistre un signal provoqué par une modification du champ électrique établi au travers d’un orifice au travers duquel un fluide contenant les particules est aspiré. Ce signal est proportionnel au volume des particules.

Exemple: distribution de tailles de particules pour deux échantillons différents

Immuno-histo-chimie

Technique utilisant des anticorps spécifiques liés à des fluorochromes pour mettre en évidence une protéine présente sur une cellule ou un tissu. L'échantillon est par la suite observé en microscopie à fluorescence

Distribution d'histones, de peroxisomes, et d'actine dans une culture de cellules Vero, Olympus

Cytométrie en flux

Technique permettant d'analyser des cellules à grande vitesse en les faisant passer une à une dans le faisceau d'un laser. La lumière ré-émise (par diffusion ou fluorescence) permet de classer la population suivant plusieurs critères et de les trier.

En anglais: Flow cytometry ou Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)

Exemple de cytométrie en flux

Imagerie cellulaire en temps réel

Chambre thermostatée, humidifiée et à concentration en CO2 controlée, montée sur la platine du microscope

Exemple: suivi de la division et de la polyploïdisation de cellules mégakaryocytaires sur 12 hrs (cliquez ici)

Sytèmes robotisés

Composés: D'unités de gestion des liquides

(Liquid handling stations) De bras robotisés D'incubateurs automatisés De lecteurs

(Système Xiril, cliquez ici)

Développement de systèmes de production

Établissement de lignées cellulaires Construction/sélection Procédés de production Procédés de séparation

Types de cellules animales

Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC).

Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée de vie limitée (30-50 divisions).

Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.

Différentes lignées

MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes, vaccins

HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche

CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile

Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile

Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression baculovirus

HEK-293: embryon de rein humain, transformée par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension (293S)

Exemple: historique du développement de la lignée HEK-293

Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977

La construction d'un système d'expression – transformation/transfection/transduction

• Introduction d'ADN exogène sous la forme d'un plasmide dans des cellules procaryotes (transformation) ou eucaryotes (transfection)

•Les cellules manipulées pour accepter un ADN étranger sont dites compétentes

• Différentes méthodes:• Phosphate de Calcium• Liposomes• Polycations (ex: polyéthylène

imine, PEI; DEAE-Dextran)• Électroporation• Gene gun

• Transduction: introduction d'ADN exogène par le biais d'un virus (procaryote)

• STABLE OU TRANSITOIREAccess Excellence

La cassette d'expression

• Composé de un ou plusieurs gènes et des séquences contrôlant leur expression

• Promoteur (constitutif; inductible: lac, cumate, T, etc; tissu spécifique)

• Phase ouverte de lecture (Open reading frame)

• Séquence de polyadénylation (PolyA)

• Transactivateurs

• Gènes de résistance ou reporteur (LacZ, GFP, …)

Des Internal Ribosome Entry Sites (IRES) peuvent être intercalés entre plusieurs ORFs

Autre exemple: la co-transfection d’un plasmide et d’un adénovirus dans la lignée cellulaire 293 pour produire un adénovirus recombinant:

B. Massie, IRB

Sélection (Screening)

• Commencer par une expression transitoire

• Sélectionner en fonction:

• Résistance à l'agent de sélection

• Le niveau d'expression du gène reporteur ou de la protéine d'intérêt

• La stabilité de l'expression

• La qualité du produit (analyse crystalographique, RMN, MS, patrons de glycosylation, activité, stabilité, pharmacocinétique)

Les systèmes d’expression

Bactéries (1-3 um)

Levures Fungi Cellules animales (10-20

um)

• Modifications post-traductionnelles + poussées

• Produit plus stable• Milieu de culture +

complexe• + grande fragilité des

cellules• Coûts + élevés• Produits à + haute valeur

ajoutée

Critère de sélection: choisir le système le plus simple qui va faire le travail!

Exemple de milieu de culture de cellules de mammifères: Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM)

Sels (mg/L) CaCl2 200.00 Fe(NO3)3.9H2O 0.10 KCl 400.00 MgSO4 97.67 NaCl 6400.00 NaHCO3 3700.00 NaH2PO4.H2O 125.00

Acides aminés (mg/L) Arginine 84.00 Cystine.2HCl 63.00 Glutamine 584.00 Glycine 30.00 Histidine 42.00 Isoleucine 105.00 Leucine 105.00 Lysine.HCl 146.00 Méthionine 30.00 Phenylalanine 66.00 Sérine 42.00

Méthionine 30.00 Phenylalanine 66.00 Serine 42.00 Thréonine 95.00 Tryptophane 16.00 Tyrosine.2Na.2H2O 104.00 Valine 94.00

Vitamines (mg/L) Ca.pantothénate 4.00 Chlorure de choline 4.00 Acide folique 4.00 Inositol 7.20 Niacinamide 4.00 Riboflavine 0.40 Thiamine.HCl 4.00 Pyridoxine.HCl 4.00

Autres (mg/L) Glucose 4500.00 Rouge de phénol 15.00 Na.Pyruvate 110.00

+ composants non-définis: sérum sanguin (5-15%), cocktail de facteurs de croissance, etc.

Comparaison des différents systèmes d’expression

X (densité cellulaire)

Oxygen respiration rate (OUR, mM/L)

Vitesse d’agitation

Coût du milieu

Bactéries 5-50 gMS/L 50-500 500-700 rpm 1-5$/L

Cellules animales

1-50 x106 cells/mL

(≈0,2-10 gMS/L)

0.1-10 20-120 rpm 25-1500$/L

Difficulté supplémentaire

Temps de division augmente avec la taille: Les cellules animales nécessitent des conditions

d’asepsie très strictes Adhésion obligatoire:

Certaines lignées de cellules de mammifères nécessitent un support pour être viables. Cela:

pose un problème de mise à l ’échelle les rend particulièrement susceptibles au cisaillement

Ex: tapis cellulaire de myoblastes

Culture sur microporteurs

Exemple: Culture de myoblastes - test de différents microporteurs

Comparaison de différents types de microporteurs

0,00E+00

5,00E+05

1,00E+06

1,50E+06

2,00E+06

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Temps (jour)

# c

ellu

les/

ml Cytodex 1

Cytodex 3

Texcel

Autosuture

Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91 (1):63-74.

Culture de myoblastes - transfert de particule à particule

0 5 10

0.0

0.5

1.0

Time [d]

100-mL spinner flasks 500-mL spinner flasksM

yobl

ast

dens

ity [

x 10

6 cel

ls/m

L]

Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91 (1):63-74.

La production

Le bioréacteur Les paramètres Les cinétiques de croissance des

micro-organismes et de production

Les modes de production

Bioréacteurs

Gracieuseté B.BraunLaboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB, U. Laval)

Bioréaction: les paramètres

Température pH composition du milieu Agitation Aération Asepsie

Contrôle des paramètres

Contrôle

Lecture

RPMT

O

2

N

2

Air

CO2

TpHO

2

pH

F

Optimisation des paramètres

T=32°C T=35°C T=37°C T=39°C

Effet de la température sur la production d’adénovirus recombinant en 293S

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80

time (hpi)

R

ela

tiv

e ti

ter

Jardon et Garnier, 2000

Les cinétiques de croissance et de production

Xdt

dX

dt

dP

XYdt

dSSKs

S

Xdt

dX

sx

MAX

/

Le modèle le plus simple:

(bilan sur les cellules)

(bilan sur le substrat)

(cinétique de Monod)

(modèle de Luedeking-Piret pour le produit)

X: concentration cellulaire; S: concentration en substrat limitant; P: concentration en produit d’intérêt; : taux spécifique de croissance; max et Ks: paramètres de l ’expression de Monod; Yx/s: coefficient de rendement cellule/substrat; , : coefficient de la relation de Luedeking-Piret. S0 et X0, sont les concentrations en substrat et en cellules initialement. Xmax = Yx/s * S0+X0.

tXX

XX

X

YK

X

X

X

XYKMAX

MAX

MAX

MAX

SXS

MAX

MAXSXS

)(

)(lnln

0

/

0

/

00

/00 ln XXXX

XXYKXXPP

MAX

MAXsxS

MAX

La solution

Simulation à partir d’un modèle simple

X, S et P vs t

05

10152025

0 2 4 6 8

temps (h)

co

nc

en

tra

tio

n (

g/L

)

X

S

P

Cuvée, MAX = 1,16h-1, KS = 4 g/L, YX/S = 0,5 g/g, = 0,4 g/g, = g/(g.h)

Autres cinétiques

Inhibition par le substrat:

Inhibition par le produit:

...

iS

MAX

KSSK

S2

iS

MAX

KPSK

S

1

Les modes d’opération

filtrat

Perfusion

Chemostat

Cuvée-alimentée(fedbatch)

Cuvée (batch)

X, P

Culture en perfusion

0

200

400

600

800

1000

0 20 40 60 80

Time [ hpi ]

Rel

ativ

e F

luor

esce

nce

Uni

t

[ R

FU

]

Figure 4. Fluorescence of 293S cells during infection with adenovirus: , Control; , B1 Perfusion 35oC; , B2 Perfusion 35oC; , B3 Perfusion 37oC; X, T-flask.

Cortin et al., 2002

Le traitement en aval (downstream processing)

Les étapes séparation homogénéisation concentration purification

Séparation/Clarification

Objectif: séparer les cellules du surnageant et conserver la fraction d’intérêt selon que le produit est intracellulaire ou extracellulaireLes méthodes usuelles:

centrifugationmicro-filtration (0,1-0,45 um)

Filtres à fibres creuses (AG tech)

Principe de centrifugation en continu

Grande échelle = filtration tangentielle

Homogénéisation

Objectif: briser les cellules pour récupérer un produit intra-cellulaire

Moyen: Gel/dégel Ultrason contraintes (stress) hydrodynamiques

Concentration

Objectif: réduire le volume

Moyens:PrécipitationUltra-centrifugationUltra-filtration (5kDa - 500kDa)

AG technologies

Purification

Objectif: Isoler le produit d’intérêt

Moyen: chromatographie

Access Excellence

Purification (suite)

3 types de chromatographie:

Access Excellence

Le contrôle de qualité

Les molécules biopharmaceutiques sont soumises aux mêmes normes que la fabrication de molécules de synthèse: Bonnes pratiques de fabrication (GMP)

Protocoles d’opération normalisés (SOP) Validation des procédés Documentation

Ces normes sont appliquées de façon encore plus stricte pour les produits biologiques étant donné que les réactions menant à la formation du produit (le métabolisme cellulaire) ne sont pas bien définies.

Le contrôle de qualité (suite)

Toute une série de normes, lignes directrices et de «points à considérer » sont émis par le « Center for Biologics Evaluation and Research » (CBER) de la Food &Drug Administration » (FDA) http://www.fda.gov/cber/

Les sections 210, 211 et 600 du titre 21 du "Code of Federal Regulations" (CFR)

"Guidelines" et "point to consider » particulièrement pertinents: "Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy" "Point to consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventative Infectious

Disease Indications" A proposed Approach to the Regulation of Cellular and Tissue-based

Products

Le contrôle de qualité (suite)

Classent le processus de production GMP en 7 catégories:

Installation Équipement Personnel Matériels Protocoles Tests Documentation