allostérie moléculaire et dynamique des protéines

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Régulation de l’activité enzymatique

1bis. Allostérie et dynamique des protéines

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Structure-fonction de phosphofructokinases

La phosphorylation du fructose 6-phosphate (F6P) en fructose 1,6-bisphosphate

est une étape clé de contrôle de la glycolyse dans la plupart des organismes.

Cette étape est catalysée par l'ATP-dépendant 6-phosphofructokinase (PFK-

1), une enzyme qui est soumise à une régulation allostérique extensive.

PFK-1 appartient à la famille des phosphotransférases qui catalysent le

transfert du γ-phosphate de l'ATP en fructose-6-phosphate.

Le site actif de PFK-1 comprend à la fois un site de liaison pour l'ATP-Mg 2+

et pour le F6P.

Réaction catalysée par Phosphofructokinase

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PFK-1 est une enzyme allostérique dont l'activité est décrite en utilisant le

modèle symétrique (concerté) de l'allostérie.

Une transition concertée ici se produit à partir d'un état T, enzymatiquement

inactif, vers l’état R actif lors de la liaison des substrats.

F6P se lie avec une haute affinité à l'état R, mais pas à l'état T. Pour chaque

molécule de F6P qui se lie à PFK, la population de l’enzyme se déplace

progressivement de l'état T vers l'état R.

L’activité PFK en fonction de la concentration F6P qui augmente adopte une

forme sigmoïde, caractéristique des enzymes allostériques qui démontrent de

la coopérativité entre les sous-unités.

La PFK bactérienne est modulée par seulement 2 molécules effectrices:

Mg2 + ADP agit comme activateur,

le phosphoénolpyruvate (PEP) ou l’ATP est inhibiteur.

L'analyse structurale des étapes catalytiques est basée sur les structures

cristallographiques de la PFK d’Escherichia coli (EcPfk) et de la PFK de Bacillus

stearothermophilus (BsPfk).

Les PFKs bactériennes sont homotétraméres possédant la symétrie D2.

Chaque sous-unité de 320 aa contient 1 site actif liant ATP et F6P et un site

effecteur liant le PEP / ATP ou l'ADP.

Figure 1

Lors de la liaison par ATP, il y a de

l’inhibition significative

ATP au site

régulatrice

Fru6-P au

site actif ATP au

site actif

BCM 2505 Allostérie et dynamique de protéine Page 4 of 17

Les PFKs eucaryotes présentent un mécanisme de régulation beaucoup plus

complexe et sophistiqué ; différant considérablement dans leur régulation

allostérique par rapport à la PFK bactérienne, elles sont influencées par une

vingtaine d’effecteurs.

Physiologiquement, le plus important est l'activation par l'AMP et le fructose

2,6-bisphosphate (Fru-2,6-P2), alors que l'ATP et le citrate exercent un effet

inhibiteur.

Transition conformationelle de PFK

La structure quaternaire de BsPfk (entrée PDB 4pfk) est représentée dans la

figure 2.

La liaison de F6P dans le site actif est représentée en orange, et le produit de la

réaction avec l’ATP, l’ADP est représenté en rouge liant avec un ion Mg indiqués

en vert.

Le site de liaison pour le F6P est composé de deux sous-unités différentes,

fermantes autour de chaque côté de la molécule. Il y a quatre sites de liaison,

deux qui sont présentés alors que les deux autres sont situés sur la face

arrière de la figure 2

L'enzyme a également quatre sites de liaison régulateurs ; deux à peine

visibles en haut et en bas - les molécules liées à deux autres sites ne sont pas

visibles et sont représentées par

des astérisques.

Une comparaison, montrée à

la figure 3, entre la structure de la

BsPFK liant le substrat (4pfk)

avec celle de BsPFK liant un

analogue de l'inhibiteur de la

PEP, phosphoglycolate, au site

allostérique (entrée PDB 6pfk)

révèle une conformation

différente pour ces deux formes.

La perspective de cette image

présente l’enzyme de côté par

rapport à la figure 2 (flèche

orange).

Figure 2

BCM 2505 Allostérie et dynamique de protéine Page 5 of 17

La structure de l’état R (active) est représentée à gauche sur la figure 3, et celle

de l’état T (inactive) stabilisé par PEP/ATP est représentée sur le côté droit de la

figure 3.

L’équilibre conformationnel de l'enzyme, 4pfk ⇌ 6pfk, implique un

changement de la forme du site actif.

Il a été proposé que ce changement de conformation, entre R et T, est à la

base moléculaire de la capacité du phosphoglycolate, et par extension PEP, à

diminuer l'affinité de BsPFK pour Fru-6-P.

Le changement conformationnel implique un mouvement de résidus Glu-

161 et Arg-162, selon que le substrat ou l’inhibiteur est lié ou non, et est

montré par les figures 4a et 4b.

Lorsque Fru-6-P est lié au site actif de BsPFK, la chaîne latérale

positivement chargée d’Arg-162 fait saillie dans le site actif et interagit

favorablement avec le groupe phosphate chargé négativement de Fru-6-P,

une interaction qui stabilise l'état R par rapport à l'état T et est en partie

responsable de l'effet homotropique amené par la liaison du F6P. Glu-161

est bien ôté du site de liaison dans cette structure.

Lorsque le phosphoglycolate est lié au site allostérique de BsPFK quand le

site actif est vide, le résidu Arg-162 se positionne hors du site actif, et son

état T

6pfk

état R

4pfk

Figure 3

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ancien emplacement est occupé par la chaîne latérale chargée négativement

de Glu-161.

Cet échange de position entre ces deux résidus de charge opposée introduit

une charge négative dans le site de liaison au Fru-6-P et provoque une

répulsion électrostatique putative entre la chaîne latérale de Glu-161 et une

molécule de Fru-6-P entrant dans le site actif, résultant en une affinité

réduite pour le Fru-6-P.

Cette transition structurale a été proposée pour expliquer l'inhibition

allostérique dans BsPFK [1], et elle est figurée dans les livres de biochimie afin

d'illustrer comment un ligand allostérique peut influencer la liaison du substrat à

distance.

Cependant, ce mécanisme d'échange a été réévalué due à la question de la

réciprocité, qui doit exister entre la liaison d'un ligand au site allostérique et la

liaison d'un substrat dans le site actif [2].

a)

état T

Figure 4: Site actif des états R et T de BsPfk1 (mauve et verte respectivement). Fru6-P est

uniquement montré dans l'état T pour indiquer la position du site actif.

état R

b)

Interactions

répulsives

F6P F6P

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Parce que le PEP diminue l'affinité pour Fru-6-P environ 500 fois à 25°C

([MgATP] = 3 mM), le couplage thermodynamique exige que le Fru-6-P

inhibe la liaison du PEP dans la même mesure.

D’un point de vue structurel, il n'est pas clair comment le mouvement de

Glu-161 et Arg-162, tous deux situés dans le site de liaison de Fru-6-P,

pourraient influer sur la fixation du PEP sur le site allostérique à environ

20 Å de distance. Bien qu’un repositionnement relativement modeste de

résidus ait été constaté, il n’y a pas de conséquences structurales

évidentes dans les structures de BsPfk [1].

Afin de tester ce modèle, la mutagenèse dirigée a été utilisée pour générer trois

mutants de BsPFK qui remplacent Glu-161 et Arg-162 pour un résidu d'alanine.

La mutation E161A créerait une enzyme mutante qui ne devrait plus être

inhibée par le PEP tandis que R162A devrait réduire l’affinité de liaison de

Fru6-P et PEP. Les résultats montrent que :

a) La mutation E161A n'a pas d'incidence sur l'inhibition de la BsPFK

par le PEP à 25°C

b) La mutation R162A diminue l'affinité de BsPFK pour le Fru-6-P

d'environ 30 fois et ne diminue l'efficacité de l'inhibition de PEP que

d’un tiers.

c) La combinaison E161A et R162A produit un comportement

comparable à R162A seul.

La réduction de l'inhibition par le PEP de E161A ou de R162A ou des deux

mutations ensemble a été considérablement moins de 500 fois.

Ces données indiquent que le mouvement de Glu-161 et Arg-162 ne joue pas le

rôle central dans la production de l'inhibition allostérique par le PEP comme

prévu initialement.

PFK-1 eucaryote est encore plus grande et plus complexe que l'enzyme

bactérienne.

Chez les mammifères, PFK existe sous forme de dimères, tétramères, octamères

et des formes encore plutôt filamenteuses.

Le site actif dans chaque sous-unité est très semblable aux PFKs bactérienne, alors

que les sites de régulation de l'ATP, ADP, et Fru2,6-P2 sont différents.

En dépit de leur taille, les PFKs chez les eucaryotes ont un comportement

cinétique et des transitions conformationnelles semblables.

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Notez que dans la PFK de S. cerevisiae, Glu-161 de BsPfk est remplacé par

Ser-390, qui à cause de sa plus courte chaine latérale et sa polarité ne

pourrait pas provoquer la répulsion électrostatique avec le Fru6-P arrivant,

même s’il pointe vers le Fru6-P.

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La dynamique des protéines

Le concept moderne de la catalyse enzymatique est intimement lié à la

dynamique des protéines et implique une variabilité dans l’état conformationnel

d’une protéine.

Les échelles de temps attribué à ces redistributions de conformations de

protéines sont variables.

Milliseconde à la microseconde - réseaux composés d'acides aminés et

reliés dans la protéine

Transmission des

changements

conformationnels

Différences en conformation

Fluctuations conformationnelles

La dynamique des protéines entraîne des changements entre des populations de conformations de protéines, dont plusieurs ont plus d'affinité pour certains ligands et/ou ils possèdent de plus hautes compétences catalytiques par rapport d’autres.

Burra et al. Global distribution of conformational states derived from redundant models

in the PDB points to non-uniqueness of the protein structure. Proc Natl Acad Sci USA.

2009 Jun 30;106 (26):10505-10. doi: 10.1073/ pnas.0812152106.

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Microseconde à la nanoseconde - mouvement d’un domaine

Nanoseconde à la picoseconde - fluctuations positionnelles des atomes

Les expériences indiquent que les transitions conformationnelles

correspondantes à une échelle de temps en millisecondes présentent souvent un

goulot d'étranglement à la conversion du substrat en produit.

La modification des taux ou l'étendue de ces changements de conformation

peuvent ainsi influencer la liaison du ligand et/ou la catalyse.

L'idée émergente en régulation allostérique est :

1) la capacité d'un effecteur à provoquer une redistribution entre des

populations de conformations de protéines, et

2) le mécanisme par lequel cette redistribution entre les populations

provoquerait des changements en compétence de liaison ou de catalyse.

L’effet allostérique alors ne serait pas limité uniquement à l'évolution des taux

d'échange entre des différentes populations comme dans le modèle concerté.

Les approches informatiques récentes ont décelé en plus l’existence des réseaux

de résidus d'acides aminés qui sont responsables de la fonction et de la

communication au sein des protéines.

Des changements imposés sur ces réseaux de résidus par des effets

allostériques modifieraient la dynamique des protéines et des équilibres

conformationnels, et la fonction des protéines.

La constatation qu'il y a des protéines dans lesquelles les effets allostériques

sont transmis à travers la protéine à la suite de changements dans leur dynamique,

en l'absence de changements structurels détectables par des méthodes courantes,

implique que le couplage dynamique entre des sites doit être pris en considération.

Ceci est résumé à la figure 5. Le pendule de Newton est une représentation

simplifiée de ce couplage dynamique - voir aussi.

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Dynamique des protéines et la catalyse enzymatique

Dans de nombreux cycles catalytiques enzymatiques, les changements de

conformation sont limitants dans la vitesse de transformation des substrats en

produits.

À comprendre comment ces changements conformationnels limitent l'efficacité

de la catalyse est essentielle pour l’ingénierie d’enzymes et la conception de

nouvelles enzymes.

Bien qu’expérimentalement difficile, il existe, un certain nombre d'exemples où

un lien a été établi entre la dynamique dans une protéine et une étape réactionnelle

dans le cycle catalytique.

1) Transitions conformationnelles dans la RNase A :

La RMN a été utilisée dans l'étude des complexes enzymatiques de la RNase A

en présence de ligands au site actif qui étaient des analogues des différents

intermédiaires le long du chemin réactionnel de l’enzyme. [3]

Différents modes de comportement allostérique

Figure 5

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Des expériences de RMN dites de ‘relaxation dispersive’ utilisant l'enzyme

native sans ligand ont révélé un processus d'échange de conformation impliquant

des sites multiples qui ne sont pas directement liés dans l'enzyme, et dont la vitesse

d’échange correspondait à un taux coïncidant avec kcat et/ou koff, la vitesse de

dissociation du produit.

Le fait remarquable était que la liaison du ligand a eu peu d'influence sur la

cinétique de ces mouvements.

Ces résultats ont démontré un lien direct entre la vitesse de changement de

conformation et l'étape de dissociation de produits koff dont la vitesse est

limitante dans la RNase A,

Les résultats montrent que le changement de conformation n'est pas

induit par un ligand.

Le rôle de la liaison du ligand dans cette optique est de stabiliser une

conformation pré-existante, la sélection de cette conformation provient de la

population des conformères protéiques.

Cette étude met en évidence l'utilisation de la spectroscopie RMN pour

étudier la dynamique des protéines : ces expériences de RMN de

‘relaxation dispersive’ peuvent à la fois déterminer les vitesses des

processus cinétiques et estimer les populations des conformères.

Clef a été la détermination en RMN de la différence en déplacement

chimique (Δω) entre les conformations différentes qui a permis l'étude

des espèces peu peuplées, mais fonctionnellement importantes.

2) Transitions dynamiques dans la dihydrofolate réductase d’E. coli (DHFR):

La dynamique des transitions entre les conformations différentes de l’enzyme

limite la vitesse catalytique de la DHFR d'E. coli. [4]

Des expériences de RMN ont révélé que cinq conformations de la DHFR qui

constituent les principales espèces du cycle catalytique de l'enzyme échangent à

des taux qui sont égaux à ceux précédemment déterminés par des expériences

cinétiques.

En outre, chaque intermédiaire enzymatique est composé d'un ensemble de

conformations, y compris des populations mineures de conformations qui

ressemblent à l'espèce prédominante dans l’étape cinétique précédente et

suivante. Ceci est illustré dans la figure 6.

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Au fur et de mesure que les substrats sont liés, libérés et transformés

chimiquement en d'autres composés, les populations de conformations

dans un ensemble de protéines s’ajustent afin d’avancer la catalyse le

long des coordonnées réactionnelles.

La corrélation dans ces études entre les vitesses des étapes cinétiques et les

vitesses de changement de conformation met l’emphase sur le rôle que ces

Figure 6: La voie cinétique de la catalyse DHFR illustrant les ensembles

conformationnels de DHFR identifiés par RMN de ‘relaxation dispersive’. Les

grandes structures représentent les conformations les plus stables à l'état

fondamental, et les petites structures représentent les structures de haute énergie

de chaque intermédiaire dans le cycle catalytique. Comme indiqué par le schéma

de couleur, pour chaque intermédiaire les conformations de haute énergie

ressemblent aux conformations de l'état fondamental des intermédiaires

adjacentes. Les flèches rouges montrent les constantes de vitesse déterminées

préalablement par des expériences de cinétique, et les flèches noires montrent les

taux d'interconversion conformationnelle obtenue à partir de mesures RMN.

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changements conformationnels jouent dans la voie réactionnelle pendant la

catalyse.

Changements dans la répartition des conformations de protéines

La notion clé est qu’il y a des régions plus ou moins stables dans une protéine

donnée, et la structure de ces régions est due à un dépliement local spontané. Ce

dépliement est dynamique et donne lieu à des conformations différentes.

Ces dépliements locaux génèrent un grand nombre de conformations qui ne

différèrent les uns des autres que légèrement, et cette collection de conformères

est considérée comme l'ensemble de l’état natif.

Dans un cycle catalytique, il y a donc de multiples espèces séquentielles qui

existeront le long des coordonnées de la

réaction, et chacun de ces intermédiaires

est associé à un ensemble de

conformations, créant ainsi des chemins

de réaction parallèles (figure 7a).

Figure 7a: Représentation schématique

du paysage d'énergie libre pour une

réaction enzymatique illustrant les

ensembles de conformation de protéine

dans la catalyse et l'allostérie. Les

transitions conformationnelles se

produisent le long de l’axe des

coordonnées réactionnelles et ils

correspondent à la réorganisation conformationnelle qui facilite la réaction

chimique. En revanche, les changements de conformation possible à un stade

donné de la catalyse se produisant le long de l'axe de l’ensemble de conformations.

Cet axe représente les ensembles de configurations existantes à tous les stades le

long des coordonnées de réaction, conduisant à un grand nombre de voies

parallèles catalytiques. Cette figure alors illustre les multiples populations de

La vision classique que les protéines existent dans leur état natif en équilibre

entre des conformations stables et que les changements conformationnels

représentent des interconversions entre deux conformations distinctes doit

être remplacée par une vision plus globale.

Dans cette vision les protéines figurent comme des ensembles statistiques,

composés de conformères, et dans lesquelles les protéines se déplient et se

replient en permanence dans des régions localisées.

BCM 2505 Allostérie et dynamique de protéine Page 15 of 17

conformations, des intermédiaires et des états de transition. Pour les enzymes

réelles, le nombre de maxima et minima le long des coordonnées devrait être

supérieur à celui indiqué. Les voies catalytiques peuvent être modifiées par les

conditions extérieures et les effecteurs allostériques.

Ce point de vue de la liaison du ligand est appelé le paradigme du « paysage

relaxé » (détendu).

Des protéines individuelles dans un ensemble subissent des changements

conformationnels petits et grands en nature.

Les échanges conformationnels correspondent à des états possédant des

énergies similaires, et l'ensemble lui-même peut être décrit comme « l'état

natif`».

Figure 7b. Trois possibilités (i, ii et iii) décrivant l'impact d'un effecteur

allostérique sur le paysage énergétique des protéines. Les lignes noires

représentent le paysage en l'absence d'un effecteur allostérique, et les lignes

rouges représentent l'état en présence d‘un effecteur lié. (i) L'état non lié

possède plusieurs états énergétiquement comparables. La liaison de

l’effecteur stabilise un état au détriment des autres, conduisant à une

conformation avec une majorité de la population. (ii) la liaison de l'effecteur

entraîne à un changement discret de conformation. (iii) l'état non lié possède

une seule conformation de basse énergie. La liaison de l’effecteur donne lieu

à un ensemble plus hétérogène de conformations possibles.

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La liaison d'un effecteur allostérique conduit à un changement dans la

répartition des protéines parmi les états de conformation (figure 7b).

Ce changement peut ou ne peut pas être observable par des méthodes de rayons-

X ou RMN car il peut être subtil en termes d'impact sur la structure moyenne.

Toutefois, il faut souligner dans le cas d'un effet allostérique, la nouvelle

répartition des états conformationnels de la protéine est, par définition,

fonctionnellement différente.

Si chacun de ces états conformationels est peu peuplé à l'état natif, même un

petit changement dans leur distribution (dû à un changement de longue portée, par

exemple, qui n’est pas nécessairement observable par la technique de rayons-X ou

RMN) pourrait avoir des conséquences importantes sur la fonction (illustré par fig

7b – cas iii).

Figure 8: Le modèle d'allostérie révèle la base énergétique de la liaison.

L'ensemble pour une protéine avec une sous-unité effectrice (I) et fonctionnelle

(II) est représenté (A) avant et (B) après l'activation par un ligand effecteur

(cercle bleu). Avant l'activation, l'état le plus probable est une sous-unité

fonctionnelle inactive (II avec cercle noir). La stabilisation de la conformation

active de la sous-unité effectrice (flèches bleues) a peuplé la conformation active

de la sous-unité fonctionnelle (II avec étoile rouge).

Récapitulation

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Références

1. Schirmer T, Evans PR. Structural basis of the allosteric behaviour of

phosphofructokinase. Nature. 1990 Jan 11;343(6254):140-5.

2. Kimmel JL, Reinhart GD. Reevaluation of the accepted allosteric mechanism of

phosphofructokinase from Bacillus stearothermophilus. Proc Natl Acad Sci U S

A. 2000 Apr 11;97(8):3844-9. PubMed PMID: 10759544;

3. Cole R, Loria JP. Evidence for flexibility in the function of ribonuclease A.

Biochemistry. 2002 May 14;41(19):6072-81

4. Boehr DD, McElheny D, Dyson HJ, Wright PE. The dynamic energy landscape

of dihydrofolate reductase catalysis. Science. 2006 Sep 15;313(5793):1638-42.

5. Goodey NM, Benkovic SJ. Allosteric regulation and catalysis emerge via a

common route. Nat Chem Biol. 2008 Aug;4(8):474-82. Review.

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