a ma famillethesesups.ups-tlse.fr/2558/1/2014tou30224.pdfa ma famille « il n’y a qu’une chose...

A ma famille

« Il n’y a qu’une chose qui puisse rendre un rêve impossible : c’est la peur d’échouer. »

(Paulo Coelho, L’alchimiste, 1995)

Je tiens tout d’abord à remercier les membres du jury : le Pr Stéphane Allouche, le Dr

Bernard Lagane d’avoir accepté d’évaluer mon travail de thèse en qualité de

rapporteurs, du soin qu’ils y ont apporté, mais aussi pour vos remarques m’ont

permis d’améliorer ma thèse. Je remercie de plus, le Dr Massimiliano Beltramo qui a

accepté d’examiner ce travail et participé au jury de soutenance.

Je tiens aussi à remercier le Pr Bernard Francès, non seulement pour avoir accepté

de présider mon jury de soutenance de thèse, mais aussi pour m’avoir soutenue et

participé à mon comité de thèse durant cette grande aventure. Merci Bernard d’avoir

cru en moi, et soutenu depuis le M1.

Je remercie aussi le Dr Jean-Sébastien Saulnier-Blache qui a fait partie de mon

comité de thèse et m’a soutenu durant ces trois années.

Je tiens aussi à remercier le Pr Philippe Valet qui a cru en moi et m’a soutenue

notamment pour l’enseignement durant tout le M2R et durant ma thèse.

Je remercie bien évidemment et très chaleureusement ma directrice de thèse

Catherine Mollereau-Manauté et mon co-directeur de thèse, Lionel Moulédous. Merci

Catherine pour ton aide, ton soutien, tes conseils, ta rigueur, ta disponibilité, ta

compréhension. Je te souhaite le meilleur pour la suite dans ce nouveau départ qui

parait passionnant. Merci Lionel, pour ton soutien, ta confiance, tes conseils, tes

explications, ta patience. Je suis ravie de vous avoir eu tous deux comme

encadrants, même si il était parfois difficile d’harmoniser deux sons de cloches, je

garderai en mémoire la richesse de cet encadrement, de la formation, de la

méthodologie scientifique que vous m’avez transmis. Je n’aurais pas pu espérer

mieux.

Je suis heureuse d’avoir réalisé ma thèse dans l’équipe Zajac, une équipe

chaleureuse et profondément humaine. Merci Franck pour ton soutien, tes conseils,

ton enthousiasme, je crois qu’en fin de compte la musique des billes dans le couloir

me manquera. Merci Jean-Marie pour ton soutien, tes conseils, ta façon de toujours

tout dédramatiser m’a beaucoup aidé. Je garderai une bonne place dans mes

souvenirs pour nos discussions scientifiques et notamment sur la compréhension du

principe des expériences, leur histoire, mais aussi nos discussions ornithologie,

mures, myrtilles ou botanique…, qui, il faut bien l’admettre, n’intéressaient que

nous .

Merci à tous de m’avoir épaulé, soutenu, réconforté, rassuré. Merci pour le temps

que vous avez tous passé à me préparer pour toutes les évaluations qui ont ponctué

mon cursus, depuis le début, pendant la préparation au concours des allocations,

aux congrès et bien évidemment la thèse et la soutenance de thèse.

Je souhaite aussi remercier toutes les personnes que j’ai pu rencontrer dans ce labo.

Merci à Karine pour les manips de spectro de masse. Merci aussi à tous ceux que j’ai

croisé dans ce bureau ou dans le couloir : Delphine, Pierre, Anne, Laura, Annaël,

Zhong. Mais aussi Stéphanie, Catherine et toute l’équipe Salomé. Un grand merci

aussi à Nico qui a toujours été d’un grand soutien depuis le début.

Un grand merci aussi et surtout à toute ma famille qui m’a épaulé, soutenu, supporté

(dans les deux sens du terme..). Dès la reprise de mes études jamais vous n’avez

douté. Si moi je stressais et doutais à chaque examen ou concours, craignais de

l’échéance et de la finalité de tout ce chamboulement, vous n’avez jamais douté,

vous avez toujours su. Pour tout ça et tout le reste, un grand merci. Sans vous jamais

je n’aurai pu accomplir tout ça.

Enfin, je souhaite remercier le moteur de tout ceci : Hayden. Avec ce travail, j’espère

t’avoir démontré que rien ne peux t’empêcher de devenir qui tu souhaites être.

Donne-toi les moyens de réaliser tes rêves, quels qu’ils soient.

Abstract: Identification of Phosphorylations Involved in the Regulation of

NPFF2 Receptor activity

GPCR activation induces the phosphorylation of Serine and Threonine residues in

their intracellular domains. These phosphorylations are involved in receptor

desensitization and internalization but can also determine the involved signaling

pathway.

Neuropeptide FF belongs to a neuropeptide family which modulates opioid

analgesia by interacting with a Gi protein coupled receptor: the NPFF2 Receptor. It

thus inhibits adenylyl cyclase, activates the MAP-Kinase pathway and regulates

intracellular calcium level. In order to investigate the role of phosphorylation in the

regulation of NPFF2R function, a mass spectrometry analysis was performed to

characterize the agonist-induced phosphorylation pattern of the human and rat

receptor expressed in a neuroblastoma cell model (SH-SY5Y). All phosphorylation

sites were found in the carboxyl-terminus tail on Thr372/Ser373, Ser382, Ser386,

Ser395, Thr412 and Ser414/Thr415. In vitro GRK2 phosphorylation of the C-

terminus fragment of the hNPFF2R allowed us to identify the cluster 414TTNSS418

as a possible substrate for the kinase. Conserved sites of the rNPFF2R (TS372AA,

S395A, TNST412ANAA and ST414AA) as well as rat-specific residues (S382/S386)

were mutated to Alanine. Mutant receptors were expressed in SH-SY5Y cells. Their

binding, signalization and internalization properties were then compared to those

of the wild type (WT) receptor.

None of the mutation affects the ability of mutant receptors to inhibit adenylyl

cyclase, except the mutation of the rat-specific residues, showing a role of these

residues in G-protein coupling efficacy. All mutant receptors are able to activate

MAPK pathway similarly to the WT receptor, suggesting that this signaling

pathways do not depend on the mutated phosphorylation sites.

In calcium imaging experiments TS372AA, ST414AA and TNST412ANAA receptors

show a reduced desensitization after stimulation with the NPFF analog 1DMe,

compared to the WT receptor. The other mutants fail to show any significant

difference with the WT receptor.

We further investigated the role of these phosphorylation sites in rNPFF2R

internalization after 1DMe stimulation. Immunofluorescence experiments show a

strong internalization of the WT receptor after ligand stimulation. Internalization of

the S395A, ST414AA and TNST412ANAA mutants is reduced, indicating that these

phosphorylation sites play a role in receptor trafficking. These mutants are still

able to recruit -arrestin-GFP but probably with a reduced efficacy.

Western blot analysis confirms the agonist induced phosphorylation of T372 ,

T414 and T415. WT receptor phosphorylation, revealed with an anti-phospho-

threonine antibody, is diminished after treatment with pertussis toxin (PTX) or

/and G protein receptor kinase 2 (GRK2) inhibitor. These results suggest a role of

GRK2 in receptor phosphorylation and the involvement of Gi in kinase activation.

In parallel, in order to produce new tools to study NPFF2R we have characterized a

new peptidic ligand: YE(Bpa)WSLAAPQRFNH2. This iodinable ligand exhibits a high

affinity for the receptor and irreversible binding after UV irradiation.

Our study has identified, by mass spectrometry and western blot analysis, the

sites phosphorylated upon NPFF2 receptor activation and one of the kinases

involved. Mutagenesis studies and functional characterization indicate that S395

and 412TNST415 phosphorylation sites are implicated in receptor internalization and

that the TS372 and 412TNST415 cluster are involved in the first steps of receptor

desensitization. None of the mutated phosphorylation sites showed any role in

signal transduction except the rat-specific residues that seemed to be involved in

G-protein coupling efficacy.

These results bring new evidences of the specific role of the phosphorylation of

particular residues in the regulation of GPCR activity. Furthermore, these results

will enable us to generate phosphospecific antibodies that could be used in in vivo

studies of NPFF2 receptor activation.

Table des matières

AVANT PROPOS ............................................................................................. 1

INTRODUCTION ............................................................................................. 1

I. LES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G ..................................... 1

I.1 Classification des RCPG ........................................................................... 1

I.1.1 Famille Rhodopsine-like (ou classe A) ....................................................... 1

I.1.2 Famille Secretin-like (ou classe B) ............................................................ 4

I.1.3 Famille des récepteurs d’adhésion ............................................................ 4

I.1.4 Famille des récepteurs métabotropiques au glutamate ............................. 4

I.1.5 Famille Frizzled/Taste2 ............................................................................ 4

I.2 Activation des RCPG ................................................................................ 6

I.3 Protéines G et signalisation ...................................................................... 9

I.3.1 Les proteines G hétérotrimériques ............................................................ 9

I.3.2 Structure des protéines G hétérotrimériques .......................................... 10

I.3.3 Cycle d’activation des protéines G hétérotrimériques .............................. 14

I.3.4 Spécificité du couplage récepteur-protéine G .......................................... 15

I.3.5 Les protéines RGS ................................................................................. 16

I.4 Effecteurs et signalisation intracellulaire ................................................ 17

I.4.1 Signalisation dépendante des protéines G .............................................. 17

I.4.1.1 Adénylyl Cyclase ......................................................................... 17

I.4.1.1.1 Structure générale des adénylyl cyclases 17

I.4.1.1.2 Régulation de l’activité cyclase 18

I.4.1.1.2.1 Par les protéines G ........................................................... 18

I.4.1.1.2.2 Par le Calcium et les Kinases............................................ 19

I.4.1.1.2.3 Régulation pharmacologique ............................................ 21

I.4.1.1.2.4 Voie de signalisation de l’AMPc ......................................... 21

I.4.1.2 Les canaux ioniques .................................................................... 23

I.4.1.2.1 Les canaux calciques 23

I.4.1.2.2 Les canaux potassiques : GIRK 24

I.4.1.3 La Phospholipase C (PLC) ............................................................. 24

I.4.1.4 Voie des MAPK ............................................................................. 26

I.4.2 Spécificité de signalisation ...................................................................... 27

I.4.3 Signalisation et arrestines ................................................................... 28

I.4.4 Agonisme biaisé/sélectivité fonctionnelle ................................................ 29

I.5 Dimérisation des RCPG .......................................................................... 30

I.5.1 Spécificité de signalisation des hétéromères RCPG .................................. 33

I.5.1.1 Propriétés pharmacologiques ....................................................... 33

I.5.1.2 Activation des protéines G............................................................ 33

I.5.1.3 Sélectivité fonctionnelle ................................................................ 35

Switch de couplage de protéine G 35 I.5.1.3.1

I.5.1.3.2 Changement de voie de signalisation 35

I.5.1.3.3 Modification du trafic intracellulaire 36

II. MODULATION DE L’ACTIVITE DES RCPG PAR LES MODIFICATIONS

POST-TRADUCTIONNELLES ........................................................................ 37

II.1 Phosphorylation ..................................................................................... 38

II.1.1 Kinases .................................................................................................. 39

II.1.1.1 Déterminants structuraux ........................................................... 40

II.1.2 Désensibilisation hétérologue des RCPG par les kinases AGC ................. 42

II.1.2.1 PKA ............................................................................................. 42

II.1.2.1.1 Structure et mécanisme d’activation 42

II.1.2.1.2 Rôle de la PKA dans la désensibilisation hétérologue 43

II.1.2.2 PKC ............................................................................................. 44

II.1.2.2.1 Structure générale et mécanisme d’activation 44

II.1.2.2.2 Régulation pharmacologique et rôle dans la

désensibilisation hétérologue 45

II.1.3 Autres Ser/Thr Kinases impliquées dans la désensibilisation

hétérologue ...................................................................................................... 46

II.1.3.1 CAM Kinases ............................................................................... 46

II.1.3.1.1 Structure générale et mécanisme d’activation 46

II.1.3.1.2 Rôle dans la désensibilisation des RCPG 46

II.1.3.2 Casein Kinases (CK) ..................................................................... 47

II.1.4 Tyrosine Kinases .................................................................................... 47

II.1.5 GRK et désensibilisation homologue ....................................................... 47

II.1.5.1 Structure générale et mécanisme d’activation .............................. 47

II.1.5.2 Rôle des GRK dans la désensibilisation homologue des RCPG. .... 48

II.1.5.3 Régulation hétérologue et pharmacologique des GRK ................... 50

II.1.6 Phosphorylation des RCPG, exemple du récepteur MOP ......................... 50

II.1.7 Rôle de la phosphorylation dans la sélectivité fonctionnelle .................... 54

II.2 Ubiquitination ....................................................................................... 57

III. INTERNALISATION DES RCPG ............................................................... 59

III.1 arrestines et internalisation dépendante du ligand ............................. 59

III.1.1 Lien entre internalisation et désensibilisation ........................................ 61

III.2 Internalisation constitutive/recyclage .................................................... 62

III.3 Internalisation indépendante des -arrestines ........................................ 63

III.4 Internalisation indépendante de la clathrine, les cavéoles ....................... 63

IV. LE RECEPTEUR NPFF2 .......................................................................... 65

IV.1 Le système NPFF, .................................................................................. 65

un système multi-ligands/multi-récepteurs ..................................................... 65

IV.1.1 Les peptides NPFF ................................................................................ 65

IV.1.2 Les récepteurs NPFF ............................................................................. 67

IV.2 Effets pharmacologiques du système NPFF ............................................ 70

IV.2.1 Nociception ....................................................................................... 70

IV.2.2 Tolérance aux effets analgésiques des opiacés et dépendance .............. 72

IV.2.3 Effets renforçants et addiction ............................................................ 73

IV.2.4 Activité locomotrice ............................................................................ 74

IV.2.5 Effets sur la prise alimentaire ............................................................. 74

IV.2.6 Effets sur le contrôle de la température corporelle .............................. 74

IV.2.7 Rôle dans l’immunité ............................................................................ 75

IV.2.8 Effets cardiovasculaires ........................................................................ 75

IV.2.9 Rôle dans l’hypertension ....................................................................... 76

IV.2.10 Rôle dans le contrôle neuroendocrinien ............................................. 76

IV.3 Le récepteur NPFF2 ................................................................................ 78

IV.3.1 Distribution anatomique du récepteur NPFF2 ...................................... 79

IV.3.2 Signalisation ......................................................................................... 82

IV.3.2.1 Effets cellulaires propres .............................................................. 82

IV.3.2.2 Effet anti-opioïde .......................................................................... 84

IV.3.2.3 Mécanismes moléculaires et modèle de l’interaction MOP-NPFF2 .. 84

Objectifs ..................................................................................................... 87

PROCEDURE EXPERIMENTALE ................................................................... 89

I. Matériel ................................................................................................ 89

II. Vecteur, mutagénèse dirigée ................................................................. 89

II.1 Mutants du récepteur NPFF2 de rat ........................................................ 89

II.2 Construction de l’extrémité C-terminale du récepteur NPFF2 humain en

fusion avec la GST ........................................................................................... 90

III. Lignée cellulaire et transfection ............................................................ 90

IV. Liaison de radioligands ......................................................................... 91

IV.1 Préparation des membranes ................................................................... 91

IV.1.1 SH T7-NPFF2 ................................................................................ 91

IV.1.2 Bulbe olfactif ................................................................................ 91

IV.2 Saturation (liaison à l’équilibre) .............................................................. 92

IV.3 Compétition ............................................................................................ 92

IV.4 Marquage irréversible ............................................................................. 92

V. Dosage d’AMPc intracellulaire ............................................................... 93

VI. Immuprécipitation ................................................................................ 94

VI.1 Immunoprécipitation T7-rNPFF2R ........................................................... 94

IV.1.1 Préparation de l’échantillon pour le Western-Blot ............................... 94

IV.1.2 Préparation de l’échantillon pour l’analyse protéomique ..................... 95

VI.2 Immunoprécipitation hNPFF2R-YFP ........................................................ 95

VII. Phosphorylation in vitro ....................................................................... 96

VIII. Digestion par la trypsine et analyse nano-LC-MS/MS ........................... 96

IX. Recherche dans les bases de données et détermination du ratio

d’abondance des peptides NPFF2 phosphorylés ............................................ 97

X. Western Blot .......................................................................................... 98

X.1 Phospho-thréonine et T7 ........................................................................ 98

X.2 pERK et ERK ......................................................................................... 99

XI. Mesure des taux de calcium intracellulaire ............................................ 99

XII. Immunocytochimie .......................................................................... 100

XIII. Recrutement de la-arrestine ............................................................ 101

RESULTATS ............................................................................................... 103

I. Identification des phosphorylations impliquées dans la régulation de

l’activité du récepteur NPFF2 ..................................................................... 103

I.1 Identification du profil de phosphorylation du récepteur NPFF2 par

spectrométrie de masse ..................................................................................103

I.2 Analyse des phosphorylations des thréonines du récepteur T7-rNPFF2

par Western Blot. ...........................................................................................110

I.3 Effet de la mutation des sites de phosphorylation sur la signalisation

du récepteur rNPFF2 ......................................................................................114

I.4 Rôle des sites de phosphorylation dans la désensibilisation du

récepteur NPFF2 .............................................................................................117

I.5 Rôle des sites de phosphorylation dans l’internalisation du récepteur

NPFF2 ............................................................................................................120

Discussion .....................................................................................................124

II. Caractérisation d’un ligand photoactivable de haute affinité pour le

marquage covalent des récepteurs NPFF2 .................................................. 133

Introduction ...................................................................................................133

Discussion, Conclusion ..................................................................................135

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ............................................ 137

REFERENCES ............................................................................................ 145

ANNEXE .................................................................................................... 173

Identification and functional characterization of the phosphorylation sites of

the neuropeptide FF NPFF2 receptor

AVANT PROPOS

Afin de pouvoir réagir à son environnement, la cellule doit « capter » les stimuli

extérieurs et transmettre l’information au milieu intracellulaire. Percevoir ces

informations, faire une discrimination des stimuli pour les interpréter et

répondre au plus juste, requiert des récepteurs spécifiques à l’interface milieu

extracellulaire / milieu intracellulaire. Les récepteurs membranaires

permettent la communication des informations extracellulaires à l’intérieur de

la cellule. Il existe trois grandes familles de récepteur membranaire : les

récepteurs à activité enzymatique, les récepteurs canaux et les récepteurs

couplés aux protéines G ou récepteurs à sept domaines transmembranaires.

Ces derniers ont reçu cette dénomination de « récepteurs couplés aux protéines

G » (RCPG), car ils sont couplés et transduisent leur signal via des protéines

hétérotrimériques à activité GTPasique appelées protéines G (figure 1).

Seulement depuis quelques années ces récepteurs ont été montrés comme

étant capables de signalisation autre que celle passant par ces protéines. On

peut donc se poser la question aujourd’hui de la dénomination la plus

indiquée.

Les RCPG sont capables de transmettre des messages aussi divers que les

odeurs, les photons, les nucléotides, les nucléosides, les peptides, les lipides,

protéines et neurotransmetteurs. Cette famille de récepteur comprend, chez

l’homme, plus de 800 membres parmi lesquels figurent les récepteurs olfactifs

(environ 400) et représente un peu plus d’1% du génome [1,2].

La signalisation des RCPG et l’arrêt de cette signalisation suit un schéma

général adopté par une grande partie des RCPG (figure 1). Après stimulation

par l’agoniste, le récepteur recrute une protéine G hétérotrimérique permettant

la transduction du signal intracellulaire à des effecteurs et la production de

molécules appelées messagers secondaires. Le signal est ensuite transmis de

messagers en protéines effectrices. Cette cascade de signalisation aboutie à

une amplification du signal et permet ainsi au récepteur et donc à la cellule

d’être particulièrement sensible aux stimuli, même les plus infimes. Une fois le

signal transmis, le récepteur est phosphorylé par des kinases afin de diminuer

ou stopper sa transduction. Ces phosphorylations permettent le recrutement

de la machinerie d’internalisation dont la protéine -arrestine joue un rôle

primordial. Son interaction avec les protéines adaptatrices, comme AP2

entraine l’internalisation via des puits de clathrine et permet de faire

disparaitre le récepteur de la surface cellulaire. Après cette endocytose le

récepteur peut être soit déphosphorylé puis recyclé à la membrane soit dégradé

par la voie lysosomiale.

Figure 1: Schéma général de régulation de l'activité d'un RCPG [3]. 1 : Après stimulation par l’agoniste, le récepteur activé recrute une protéine G hétérotrimérique permettant la transduction du signal intracellulaire. 2 : Le récepteur est ensuite phosphorylé par des kinases (ici de type GRK, des kinases des

récepteurs couplés aux protéines G) qui permettent le recrutement de la arrestine (en 3) puis de

protéines adaptatrices comme AP2. 4 : Le récepteur est ensuite internalisé via des puits des clathrine. Après cette endocytose le récepteur peut être soit recyclé à la membrane (en 7) soit dégradé par la voie lysosomiale(6).

Le système NPFF (neuropeptide FF) est un système de peptides proche des

RFamides, originellement décrit chez le mollusque comme peptides

cardioexcitateurs. Chez les mammifères, les peptides NPFF ont d’abord été

isolés du cerveau de bœuf [4]. Ils sont issus de deux précurseurs : le proNPFFA

et proNPFFB [5,6] et sont impliqués dans la modulation de l’activité des

opioïdes [7]. Il existe deux types de récepteur au NPFF, les récepteurs NPFF1 et

NPFF2. Chez le rongeur , l’injection intra-cérébro-ventriculaire d’agonistes

NPFF réverse l’effet analgésique de la morphine, c’est l’effet anti opioïde [8]. Cet

effet anti-opioïde a été démontré pour le récepteur NPFF2, sur neurones isolés

[9] comme sur modèle cellulaire [7]. Chez le rongeur, le récepteur NPFF2 est

impliqué dans le développement de la tolérance induite par la morphine [10].

Les récepteurs opioïdes comme les récepteurs NPFF font partie de la grande

famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). L’arrêt de l’activité de

ces récepteurs fait intervenir des modifications post traductionnelles telles que

des phosphorylations sur des sites spécifiques. Si les sites de phosphorylation

du récepteur µ-opioïde (MOP) ont largement été étudiés ces dernières années,

rien n’était connu sur les phosphorylations régulant l’activité du récepteur

NPFF2.

Lors de ce travail de thèse nous avons voulu identifier les différentes

phosphorylations impliquées dans la régulation de l’activité du récepteur

NPFF2 et connaitre leur rôle sur un plan fonctionnel.

Avant de décrire les résultats obtenus lors de cette étude et de les discuter, les

RCPG, leur signalisation, leur phosphorylation et leur rôle dans la

désensibilisation, l’internalisation et dans la sélectivité fonctionnelle ainsi que

le récepteur NPFF2 seront abordés.

INTRODUCTION

1

INTRODUCTION

I. LES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G

Tous les RCPG possèdent des similarités de structure. Ces similarités se

caractérisent par sept domaines hydrophobes, en hélice alpha, les segments

transmembranaires 1 à 7, les domaines extracellulaires, les boucles E1 à E3,

trois domaines intracellulaires, les boucles I1 à I3, une extrémité amino-

terminale extracellulaire et une extrémité carboxy-terminale intracellulaire.

Malgré ces similitudes, les comparaisons de séquences primaires ont permis de

révéler l’existence de familles ne partageant pas d’homologie. Les RCPG ont

donc été classés en familles [1,2,11,12,13]

I.1 Classification des RCPG

Les RCPG sont classés en fonction de leur homologie de séquence et de la

localisation du site de liaison des ligands.

Il existe cinq familles chez l’homme, dont la première compte trois sous-

groupes ou sous familles.

I.1.1 Famille Rhodopsine-like (ou classe A)

Cette famille de RCPG est la mieux décrite et la mieux caractérisée de toute.

Elle compte 90% des RCPG. C’est la famille du récepteur rhodopsine, présent

dans les cellules en bâtonnets de la rétine, dont la cristallisation en 2D a

initialement permis de comprendre la structure des RCPG et leurs similarités

(figure 2).

Plus récemment d’autre RCPG de classe A ont pu être cristallisés (

adrénergique, µ-opioïde…). [1]

2 Introduction: Les récepteurs couplés aux protéines G

Cette famille possède des acides aminés hautement conservés d’un récepteur à

l’autre [14]. Ces résidus sont numérotés selon la numérotation des RCPG

Ballesteros/Weinstein [15] : le premier numéro correspond au numéro d’hélice

transmembranaire, le second correspond à la position de l’acide aminé dans le

TM. Selon ce système de notation le résidu le mieux conservé possède le

numéro 50.

C’est le cas d’un résidu aspartate (D) dans le domaine transmembranaire

2, qui serait impliqué dans la reconnaissance du ligand et le couplage à

la protéine G [16]

Le motif E/DRY [17] à l’interface du segment transmembranaire 3 et de

la boucle intracellulaire 2 est impliqué dans l’activation du récepteur

[18,19], le couplage de la protéine G, son activation [16,20,21] et aussi

probablement dans la liaison à l’arrestine [22].

Deux cystéines situées dans les boucles extracellulaires E1 et E3 sont

aussi particulièrement bien conservées et forment un pont disulfure

permettant la stabilisation du récepteur [23].

Le motif NPxxY dans le domaine transmembranaire 7 est aussi très

conservé, et joue un rôle majeur dans le changement de conformation

induit par liaison du ligand et du passage à l’état activé [24].

Le cluster aromatique FxxCWxP (6.44-6.50) de l’hélice transmembranaire

6. Les résidus les plus conservés étant F (6.44) et W (6.48). Ces résidus

jouent un rôle majeur dans le réarrangement des hélices (« toggle

switch ») durant l’activation du récepteur [1,14,25].

Un résidu cystéine, dans la portion proximale de l’extrémité C-terminale

est fréquemment modifié par palmitoylation. Le récepteur à rhodopsine a

été le premier à avoir été démontré comme étant palmitoylé [26]. La

nature hydrophobe de ce groupement permet son insertion dans la

bicouche lipidique [27] créant ainsi une quatrième boucle intracellulaire.

L’existence de cette boucle a, par la suite été confirmée et semble, dans

la plupart des cas, constituer une hélice amphiphile appelée hélice 8

[14,26].

3

Figure 2: Résidus conservés et microdomaines fonctionnels des RCPG. Rhodopsine lié à un agoniste inverse, le 11-cis-retinal pris comme RCPG représentatif. La structure du RCPG consiste en 7TM, des boucles intracellulaires (1 à 3) et des boucles extracellulaires (1à 3 en bas). L’hélice 8 suit directement le TM7 et est fréquemment palmitoylée sur des résidus cystéines (Cys322 et Cys323 dans le récepteur rhodopsine). L’extrémité Nterminale extracellulaire peut être glycosylée (ici Asn2 et Asn15). Un pont disulfure contraint la

partie extracellulaire en fin de TM3 et le milieu de la boucle (Cys1103.25 et Cys187). Les résidus les mieux conservés sont en bleu (selon la numérotation Ballesteros, ils sont désignés x.50

[28].

En fonction du site de liaison des différents ligands, la famille rhodopsine

des RCPG peut être subdivisée en sous-groupes [1,2,13]:

a. Le groupe alpha représente les récepteurs aux petites molécules

telles que les amines, odeurs, nucléotides. Le ligand se lie au

récepteur dans une poche hydrophobe entre les sept domaines

transmembranaires.

b. Le groupe beta représente les récepteurs aux neuropeptides. Le site

de liaison est formé par une portion de l’extrémité N-terminale et des

boucles extracellulaires en plus de la poche transmembranaire. C’est

à ce groupe qu’appartient le récepteur NPFF2.

c. Le groupe gamma contient les récepteurs aux peptides et aux ligands

lipidiques. Chez l’homme 59 récepteurs appartiennent à cette

catégorie dont les récepteurs opioïdes et certains récepteurs aux RF-

amides.

d. Le groupe delta représente des récepteurs aux hormones

glycoprotéiques aussi appelés LGR (Leucine-rich repeat containing

GPCR), comme les récepteurs au LH et FSH. La liaison du ligand

4 Introduction: Les récepteurs couplés aux protéines G

s’effectue sur un domaine riche en leucine essentiellement

extracellulaire.

I.1.2 Famille Secretin-like (ou classe B)

Ces récepteurs sont beaucoup moins nombreux que les récepteurs

appartenant à la classe A. Cette classe comprend les récepteurs aux hormones

peptidiques, de type sécrétine comme le glucagon, le VIP. Le domaine de liaison

du ligand est formé par le domaine N-terminal et une partie des boucles

extracellulaires 1 et 3.

I.1.3 Famille des récepteurs d’adhésion

On trouve dans cette famille des récepteurs impliqués dans les fonctions

immunologiques et dans le système nerveux central. Leur domaine N-terminal

est particulièrement long et possède de nombreux sites de glycosylation, jouant

un rôle majeur dans l’adhésion, mais aussi dans la reconnaissance des

molécules de signalisation extracellulaires dans les leucocytes activés.

I.1.4 Famille des récepteurs métabotropiques au glutamate

Aussi appelée classe C, cette famille regroupe des récepteurs à l’extrémité N-

terminale particulièrement longue, jouant un rôle prédominant dans la liaison

aux ligands. Les repliements de l’extrémité N-terminale permettent la formation

du site de liaison des ligands constitué de deux lobes séparés d’une région

charnière ce qui permet un mécanisme de liaison du ligand du type « venus

flytrap », lorsque les lobes se referment pour lier le ligand. Cette famille

comprend les récepteurs métabotropiques glutamatergiques (mGluR), les

récepteurs au calcium (Calcium sensing) [29], au GABA B (acide amino

butyrique)[30] et certains récepteurs aux phéromones [31].

I.1.5 Famille Frizzled/Taste2

On trouve dans cette famille les récepteurs Frizzled et smoothened, impliqués

dans le développement embryonnaire, la polarité cellulaire mais aussi la

segmentation [32,33,34]. On trouve aussi dans cette famille les récepteurs

Tas2 exprimés dans la langue et l’épithélium du palais jouant probablement un

rôle dans la perception du gout amer.

5

Figure 3: Dendrogramme des familles de RCPG humains et quelques structures ayant été résolues [1]. La

famille rhodopsine est divisée en sous-groupes (). Sont aussi représentés sur ce dendrogramme, les

récepteur de type sécrétine, d’adhésion, les récepteurs au glutamate et les récepteurs de type Frizzled/Tas2. Les membres des différentes familles dont la structure a été résolue sont représentés sur l’arbre et sur les panneaux hauts et bas la structure de leur site de liaison avec leur ligand. Adapté de Stevens et al. 2013 et Katrich 2013 [1,2].

6 Introduction: Activation des RCPG

I.2 Activation des RCPG

La liaison du ligand sur son récepteur n’est que la première étape dans la

transduction d’un signal de l’extérieur vers l’interieur de la cellule. La liaison

de l’agoniste entraine des réarrengements conformationnels nécessaires à

l’activation de la protéine G. Ce changement de conformation du récepteur

défini son passage de l’état basal à l’état activé.

La notion d’état activé d’un récepteur est apparu dans les années 1970,

lorsque l’existence de deux états d’affinités différentes pour l’agoniste du

récepteur - adrenergique a été démontrée [35] et un seul état de haute affinité

pour les antagonistes [36].

La liaison de l’agoniste induit la formation d’un complexe ternaire

(agoniste/récepteur/protéine G) de haute affinité, modulé par la concentration

en GTP, en Mg2+, et corrélé à l’activation de l’effecteur du récepteur : l’adenylyl

cyclase [35,36,37]. Ces études ont aussi pu mettre en evidence le caractère

« interconvertible » de ces formes de haute affinité et de basse affinité.

Le modèle proposé à l’époque, était celui de la formation d’un complexe

agoniste-récepteur-protéine G (la proteine G n’ayant pas été identifiée était

appelée composé X) [35] (figure 4).

Figure 4: (A) Modèle ternaire d'activation proposé par De Lean 1980. (B) Modèle ternaire étendu de Samama et al 1993. H : hormone, R : récepteur, X : composé X (protéine G)

Plus tard, un mutant de la boucle intracellulaire 3 du récepteur -

adrénergique, constitutivement actif, permettait à Samama et al [38], de

proposer un modèle d’activation ternaire étendu, sur la base de celui proposé

A B

7

par De Lean [35]. Dans ce modèle le récepteur subissait après liaison de

l’agoniste une transition allostérique vers un état intermédiaire d’activation lui

permettant d’interagir avec les autres composants. Un modèle ternaire cubique

fut ensuite proposé (Figure 5) [39] mettant en exergue l’état d’équilibre des

différents complexes et permettant au récepteur d’être précouplé à la protéine

G, avant activation.

L’évolution du modèle d’activation des RCPG est présenté en figure 6.

Figure 5: Modèle d'activation cubique d'un RCPG [39].(A) Transformations et interactions possibles dans ce modèle. (B) Vue schématique du cube. Ri : récepteur inactif, Ra : récepteur activé, G : protéine G, A : ligand

Figure 6: Evolution de la complexité du modèle d’activation d'un RCPG[39]. (a) la protéine G peut interagir avec le récepteur,(b) le récepteur peut exister dans deux états, le ligand a des affinités différente pour chacun d'eux, (c) la protéine G peut interagir avec chacun des états avec des affinités différentes.

La construction de mutants du récepteur -adrénergique constitutivement

activés révelait l’importance de motifs stucturaux précis dans le passage de

l’état inactivé à l’état activé [18,19,40]. Le fait que des mutations sur des

résidus précis puissent générer des récepteurs constitutivement actifs suggère

que l’état inactivé du récepteur est maintenu par des contraintes exercées par

des interactions liant les TMs ou les TMs aux segments inter TMs. Les résidus

engagés dans les interactions maintenant l’état basal du récepteur ayant été

8 Introduction: Activation des RCPG

mutés, les contraintes ne s’exercent plus et des mouvements des domaines

transmembranaires (TM3 et TM6) sont donc rendu possibles. La laison de

l’agoniste, permettant la modification de la conformation du récepteur et

l’activant, entraine son efficacité [41,42].

La cristallisation de nombreux récepteurs couplés aux proteines G a,

dernièrement, beaucoup aidé à la compréhention des modifications de

conformation du récepteur. Si certaines de ces modifications d’interactions

moléculaires résultant de la liaison de l’agoniste sont spécifiques à chaque

récepteur, certaines sont communes aux récepteurs de la famille de la

rhodopsine (figure 7).

Rotamer toggle switch/microswitch

Des expériences de mutagénèse dirigée ont démontré l’importance d’un résidu

conservé du segment transmembranaire TM6 (Pro 6.50 du motif CWxP) du

recepteur -adrénergique [25]. La cristalisation du récepteur a ensuite révélé la

formation d’un angle au niveau de ce résidu. Cette courbure permet le

mouvement de l’extremité cytoplasmique du TM6 vers le TM3 à l’état inactif. Ce

mouvement est appelé rotamer toggle switch. La cristallisation de ce récepteur

a aussi pu montrer un mouvement du TM5 dependant de la liaison de

l’agoniste [43,44]. La tyrosine du motif NPxxY est aussi sujette à des

modifications d’interaction entrainant des mouvements des hélices appelées

microswitches, durant l’activation du recepteur [45,46] (figure 7).

Ionic lock/Pont hydrogène

L’« ionic lock » fait intervenir les résidus concervés du motif E/DRY et Glu 6.30

du TM6. Cette interaction ionique a été observée dans la cristallisation du

récepteur Rhodopsine inactif [26], elle est rompue lorsque le récepteur est

activé [18,19,40]. L’ionic lock est aussi présent dans les récepteurs A2A et D3.

Cette interaction n’est pas toujours présente, par exemple, elle est absente du

récepteur 2AR, à la place, l’interaction entre Arg3.50 et His6.31 met en jeu un

pont hydrogène [47].

L’ensemble des changements conformationnels du récepteur conduisent à la

formation d’un site de liaison à la proteine G [48].

9

Figure 7: Réarrangement des helices (toggle switch) et courbures (microswitches) durant l’activation d’un RCPG [49]. Réarrangement des hélices transmembranaires

(toggle switch) implicant le motif CWxP et les modifications d’interactions des résidus des TM3 (Arg du motif DRY), TM6 (Trp du motif CWxP), TM7 (Tyr du motif NPxxY) entainant des courbures des helices

(microswitch). Aussi représentés : le site de liason au ligand et à la proteine G.

I.3 Protéines G et signalisation

Les réarrangements structuraux des hélices, l’engagement de la proteine G et

son activation successive sont des facteurs déterminants dans l’initiation de la

signalisation intracellulaire.

I.3.1 Les proteines G hétérotrimériques

Les protéines G sont composées des sous-unités G (39-45 kDa), G (32 kDa)

et G (8 kDa) Il existe chez les mammifères 21 sous-unités codées par 16

gènes, 6 sous unités G et 12 sous-unités G [50]. Selon la nature de la sous-

unité présente dans l’hétérotrimère, les protéines G sont classées en quatre

groupes ou familles : Gi/o, Gs, Gq/11, G12/13 [51], et selon leurs

similarités, chacun des sous-groupes est subdivisé en sous-types (tableau 1).

10 Introduction: Protéines G et signalisation

Tableau 1 Les protéines G hétérotrimériques, leurs effecteurs principaux, leurs fonctions, expression et régulation pharmacologique. D'après Milligan 2006, Khan 2013, Cabrera-vera 2003, Pitcher 1998 [51,52,53,54]. AC: Adénylyl cyclase, ERK: Extracellular signal regulated kinase, MAPK: mitogen activated kinase, PDE: phosphodiestérase, PLC: phospholipase C, PLD: phospholipase D, NHE: echangeur Na+/H+, iNOS: NO synthase inductible, PP5: protéine phosphatase 5, GRK: G protein coupled receptor kinase (kinase des RCPG), (S, L, XL): variants d’épissage, Pi3K: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, JNK: c-jun kinase.

I.3.2 Structure des protéines G hétérotrimériques

La nature hétérotrimérique des protéines G a été révélée grâce à leur

purification [55,56,57]. Leur fonction dépend de la capacité de la sous-unité

à passer d’une conformation inactive, liée au GDP, à une conformation active,

liée au GTP, capable d’activer les voies de transduction intracellulaires et les

effecteurs du récepteur.

La sous-unité G est composée d’un domaine d’interaction avec le nucléotide

GTP ou poche nucléotidique, appellé domaine Ras (figures 8 et 9), car il est

semblable au domaine de la petite protéine G, Ras et conservé chez toutes les

Famille Sous famille Effecteurs Régulation pharmacologique Expression

G i/o

Gi1 ↘ AC, ↗ ERK/MAPK, ↗ Canaux K+, ↘ Canaux Ca2+

PTX

Neurones, pratiquement ubiquitaire

Gi2 ↗ ERK/MAPK, ↗ Canaux K+, ↘ Canaux

Ca2+

Gi3 ↗ ERK/MAPK, ↗ Canaux K+,

↘ Canaux Ca2+

Go1 ↘ AC, ↗ GTPase tubuline, ↗ Canaux K+,

↘ Canaux Ca2+ Neurones, cellules

neuroendocrines, cœur,

astrocytes Go2

↘ AC, ↗ Src tyrosine kinase, ↗ Canaux

K+, ↘ Canaux Ca2+

Gz ↘ AC, ↘ Canaux Ca2+, ↗ Canaux K+ ?

Plaquettes, neurones, cellules

chromaffines, cellules neurosécrétrices

Gt1/2 ↗ Canaux K+, ↗ cGMP-PDE CTX/PTX

Cones, batonnets, cellules du goût

Ggust ?

PTX Cellules du goût, voies

aériennes

Gs

Gs (S) ↗ AC

CTX

Ubiquitaires Gs (L) ↗ AC

Gs (XL) ↗ AC, ↗ src tyrosine kinase

Gs (olf) ↗ AC, ↗ GTPase tubuline

Neurones olfactifs, certains

gaglions du système nerveux central, Tractus urogénital et

digestif

Gq

Gq

↗ PLC ↗ Canaux K+

? Ubiquitaires

Gq/11 YM-254890

Gq/14

?

Gq/15 Cellules hématopoïetiques

Gq/16

G12/13 G12 ↗ PLD

? Ubiquitaires G13 ↗ PLCiNOS, PP5

G

G1-5 ↗ PLC

Neurones, système

neuroendocrinien, (L) rétine

G3 ↗ GRK3 La plupart des cellules

expriment plusieurs sous type

de G et G G ↘ AC I, ↗ AC II, IV, VII, ↗canaux K+

(GIRK), ↗PKD, ↗Pi3K, ↘ Canaux Ca2+,

Calmoduline (↘ Calmoduline K), ↗ GRK2

G ↗ GRK2, GRK3, ↗ ERK/MAPK (direct ou

indirect), JNK, p38 Galleine, M119

: cônes, : batonnets,

autres G : ubiquitaires

11

protéines G. Ce domaine Ras est capable de lier le nucléotide guanosine sur la

poche nucléotidique et possède l’activité GTPasique, qui permet de terminer le

cycle d’activation (figure 10). Ce domaine Ras contribue aussi à la formation

d’une interface pour l’interaction avec le complexe Gle récepteur et les

effecteurs. L’autre domaine de G formé de six hélices , recouvrant la poche

de liaison au GTP est appelé domaine hd (helical domain) ou AH (figures 8 et

9). Ce domaine hélicoïdal est uniquement présent dans les sous unités des

protéines G hétérotrimériques. Toutes les sous unités G sont modifiées post–

traductionnellement par addition d’un groupement lipidique sur la partie N-

terminale de la protéine. L’attachement d’un groupement myristoyl sur un

résidu glycine (probablement le résidu le plus proche de l’extrémité N-

terminale)[58] permet l’ancrage à la membrane de la protéine. Cet ancrage

peut, parfois, être renforcé par des palmitoylations supplémentaires sur

certains résidus cystéines (excepté t qui n’est pas palmitoylée) [59]. La

myristoylation de la sous-unité est aussi impliquée dans l’interaction avec

d’autres protéines et un défaut de modification lipidique entraine une

altération dans la transduction du signal, notamment via l’adénylyl cyclase

[59,60].

Chaque type de sous-unité diffère en fonctionnalité et effets sur la

transduction du signal.

Les protéines Gi, pour inhibitrices, sont impliquées dans l’inhibition de

l’adénylyl cyclase [60] et les protéines Gs ont un effet stimulateur. La protéine

Gq active la voie de la phospholipase C (PLC). Il existe cependant d’autres

effecteurs rassemblés dans le tableau 1 [53].


Figure 8: Structure d’une protéine G. Panneau du haut : En rouge, le domaine Nterminal de G interagit

avec G En bleu la région de contact avec le domaine Cterminal du récepteur. A l’état inactif la molécule

de GDP est enfouie entre le domaine GTPasique et le domaine en hélice de G [53]. Panneau du bas :

Structure du dimère G (A) formation en hélice de G (jaune) formé par les sept répétitions WD40. G en

rouge composée de deux hélices alpha s’enroulant autour de l’hélice alpha de G. (B) Structure de

l’hétérotrimère montrant (en bleu) les domaines où se produisent les modifications conformationnelles, à

l’interface G-G. [61]

La toxine pertussique ou PTX, produite par Bordetella pertussis, responsable

de la coqueluche, catalyse l’ADP-ribosylation d’un résidu cystéine de Gi (si la

cystéine est présente, quatre résidus avant le C-terminal). Cette modification

rend impossible l’interaction de Gi avec le récepteur, maintenant Gi dans

une conformation inactive, donc incapable d’inhiber la production d’AMPc par

l’adénylyl cyclase.

De façon similaire, certains résidus de Gs peuvent être modifiés de façon

covalente par des toxines bactériennes, telle que la toxine cholérique

responsable du Choléra ou CTX. Cette toxine, produite par Vibrio cholerae

catalyse le transfert d’un groupement ADP-ribose d’un nicotinamide adénine

dinucléotide (NAD) sur un résidu arginine (Arg201) [62] des sous-unités Gs.

Cette modification inhibe l’activité GTPasique de G, la rendant

13

constitutivement active et provoquant une stimulation prolongée de l’adénylyl

cyclase.

La sous-unité Gest composée presque exclusivement de feuilletssoitsept

feuillets formés d’une répétition d’environ 40 acides aminés se terminant par

Trp-Asp (motif WD40) arrangés en hélice autour d’un axe central (figure 8).

Cette structure est impliquée dans les interactions protéine-protéine.

L’extrémité N-terminale de G adopte une conformation en hélice qui

s’enroule autour de l’extrémité N-terminale de G, l’extrémité C-terminale de G

en hélice interagit avec les feuillets de Gsitués sur la face externe de

l'hétérotrimèreL'interaction de la structure en hélice de G avec G dépend de

l'état d'activation de G [63,64].

La sous-unité G est constituée d’hélices engagées dans de très fortes

interactions avec G. Son extrémité C-terminale subit des modifications

lipidiques (addition d’un groupement farnesyl ou plus fréquemment

géranylgéranyl) permettant son ancrage à la membrane et l’interaction avec G

[58].

Le complexe G est indissociable, excepté dans des conditions dénaturantes.

Il est impliqué dans la régulation d’effecteurs, tels que certains types d’adénylyl

cyclase, les canaux ioniques calciques, potassiques et les phospholipases A2 et

C.

Figure 9: Structure du récepteur 2AR et de la protéine G.(a) La protéine G inactive, liée au GDP. (b) Le récepteur activé recrute la protéine G active, liée au GTP [65]


I.3.3 Cycle d’activation des protéines G hétérotrimériques

Dans le modèle conventionnel de l’activation des protéines G (figure 10),

l’interaction avec un récepteur activé (figure 9) catalyse l’échange du GTP. Les

modifications de conformation du récepteur favorisent l’échange GDP/GTP au

niveau de G, lui permettant de fonctionner comme une GEF (guanine

exchange factor). Le relargage du GDP par G permet la formation d’un

complexe stable : récepteur activé-protéine G. Le complexe se déstabilise

ensuite lorsque G se lie au GTP. L’hétérotrimère se dissocie alors en G-GTP

et G[66,67] et chaque sous-unité régule à son tour des effecteurs, tels que

l’adénylyl cyclase, les canaux ioniques, les phospholipases…

L’activité GTPasique de la sous unité permet le retour dans le cycle à l’état

inactif. L’hydrolyse du GTP peut être modulée par des protéines régulatrices,

les protéines RGS (regulator of G protein signaling)[68]. La forme liée au GDP

ayant une faible affinité pour les effecteurs, mais forte pour le dimère G,

l’hétérotrimère se réassocie.

Figure 10: Cycle d'activation des protéines G [53]

15

Cependant un modèle, un peu différent, a été avancé. Selon des études de

FRET [69] et de BRET [70], après activation, l’hétérotrimère ne se dissocierait

pas [70,71]. Après liaison de l’agoniste sur le récepteur 2 adrénergique, le

complexe préassemblé récepteur/protéine G subirait des réarrangements

conformationnels amenant à l’ouverture de l’interface G-G, sans pour

autant être complètement dissocié. Ce mode d’activation « non conventionnel »

dépendrait toutefois des sous-unités G et serait donc spécifique du type de

sous-unité engagée [69].

I.3.4 Spécificité du couplage récepteur-protéine G

Au regard du vaste nombre de RCPG, relativement peu de protéines G

transduisent un signal. Certains RCPG peuvent de plus activer plusieurs voies

de transduction dépendantes des protéines G. Il est donc important de réguler

cette interaction afin d’activer la voie de transduction appropriée. L’interface

récepteur–protéine G doit donc coder les informations déterminant quelle

protéine G interagit avec un RCPG particulier.

Des mutations de l’extrémité C-terminale de G ont fréquemment été utilisées

pour permettre au récepteur de coupler une protéine G différente

[72,73,74,75]. D’autres déterminants spécifiques de la portion N-terminale ont

aussi été démontrés, de même que le rôle du fragment C-terminal de G [76],

supposant l’existence de plusieurs déterminants participant simultanément à

la spécificité de cette interaction. La nature de la modification lipidique de G

semble aussi jouer un rôle dans l’affinité de la protéine pour le récepteur [77].

Le site de liaison à la protéine G du récepteur semble aussi déterminant dans

la spécificité de cette interaction et de nombreuse études ont démontré le rôle

des boucles I2 et I3, bien que les boucles I1 et I4 puissent aussi moduler cette

interaction [78]. Cependant d’autres mutations éloignées de ce domaine

d’interaction peuvent affecter le couplage, suggérant que la conformation

globale, adoptée par le récepteur après activation est importante. L’interaction

protéine G-récepteur ne dépend donc pas seulement d’un déterminant

structural mais d’un réseau de contacts entre le récepteur et la protéine G. Ce

réseau est différent pour chaque protéine G et chaque récepteur. Il en résulte

donc de multiples combinaisons, et une grande spécificité. Le fait que différents


ligands du même récepteur peuvent influer sur ce couplage supporte ce modèle

[41,42,79]. Par exemple, trois sous-types de protéine G peuvent être recrutés

par le récepteur canabinoïde CB1. Un ligand recrutant Gi1 et Gi2 se comporte

comme agoniste et lorsqu’il recrute Gi3 se comporte comme agoniste inverse.

Un autre ligand se comporte comme agoniste inverse en recrutant Gi1 et Gi2 et

comme agoniste lorsqu’il recrute Gi3 [80]. Un agoniste pourrait donc

déterminer quelle protéine G le récepteur va activer, suggérant que la

conformation adoptée par le récepteur après stimulation par un agoniste

particulier peut être plus ou moins favorable au couplage d’une protéine G

spécifique. La spécificité du couplage récepteur-protéine G découle donc d’une

interaction complexe protéine G-récepteur, mais aussi de la conformation du

site de liaison à la protéine G induit par liaison de l’agoniste sur le récepteur.

I.3.5 Les protéines RGS

Les protéines RGS (regulator of G protein signaling) ont été identifiées dans les

années 1990, comme protéines régulant la fonction GTPasique des protéines G.

Plusieurs études ont ainsi pu démontrer que ces protéines RGS augmentaient

l’activité intrinsèque des sous unités G, agissant donc comme des GAP

(GTPase activating proteins) [67,68,81]. Il existe une vingtaine de membres

classés en cinq sous-familles. Le rôle majeur de ces protéines régulatrices

repose sur la durée d’activation de la protéine G. En effet, même si la sous

unité G possède une activité GTPasique permettant une hydrolyse du GTP

relativement rapide et efficace, elle reste insuffisante pour permettre

d’expliquer des réponses physiologiques particulièrement rapides. L’action

stimulatrice des protéines RGS permet d’accélérer le processus d’hydrolyse, de

permettre une réponse plus rapide, d’écourter la durée d’activation de G et

donc de mettre fin à l’activation des voies de signalisations des protéines G.

17

I.4 Effecteurs et signalisation intracellulaire

I.4.1 Signalisation dépendante des protéines G

I.4.1.1 Adénylyl Cyclase

L’adénylyl cyclase est l’effecteur canonique de la signalisation par les protéines

G. Il existe 10 isoformes d’adénylyl cyclases, 9 membranaires et une soluble.

Cette enzyme a été caractérisée par son activation par les RCPG couplés Gs et

son inhibition par les récepteurs couplés Gi.

I.4.1.1.1 Structure générale des adénylyl cyclases

La purification de l’AC1 puis son clonage ont permis de révéler une structure

complexe qui comprend 12 segments transmembranaires (deux domaines

répétés de 6 segments transmembranaires), une extrémité N-terminale

variable, un domaine C-terminal étendu composé de deux régions C2a et C2b

et un domaine cytosolique composé des régions C1a et C1b [82]. Les domaines

cytosoliques C1a et C2a, domaines de liaison à l’ATP peuvent dimériser afin de

constituer l’unité catalytique de l’enzyme (figure 11).

Figure 11: Structure schématique d’une adénylyl cyclase. [83]

L’adénylyl cyclase catalyse la conversion de l’ATP en AMP cyclique qui est un

messager secondaire d’importance majeure pour de nombreux aspects de la vie

cellulaire (voir voie de l’AMPc). L’ATP se lie à l’une des deux régions de liaison à

l’interface C1-C2 grâce à la présence d’un motif de liaison au phosphate

(Walker loop ou P-loop (phosphate-binding loop))[84] sur le domaine C1. Deux

18 Introduction: Effecteurs et signalisation intracellulaire

acides aminés fortement conservés participent à cette interaction avec deux

molécules de Mg2+. Une contribue à la catalyse, l’autre interagit avec les

phosphates et du nucléotide, probablement pour le stabiliser [85,86]. Les

régions C2a et C2b sont impliquées dans la régulation de l’activité cyclase par

les protéines G et la transduction du signal intracellulaire. Enfin le domaine

C1b possède des sites régulateurs, sa structure est variable selon les isoformes

considérées.

I.4.1.1.2 Régulation de l’activité cyclase

I.4.1.1.2.1 Par les protéines G

I.4.1.1.2.1.1 G

Une fois l’agoniste lié au récepteur, le RCPG activé active à son tour la protéine

G. L’échange du GDP pour un GTP induit des modifications conformationnelles

qui aboutissent à la dissociation des différentes sous-unités de la protéine G.

Lorsque la protéine G activée est une protéine G stimulatrice, le domaine de

liaison de l’adénylyl cyclase, situé sur l’extérieur du domaine C2 et le N-

terminal de C1, permet à l’enzyme de fonctionner, puisque le domaine de

liaison à l’ATP est exposé. Lorsque la sous-unité libérée est une Gi et se fixe à

son domaine de liaison situé sur le domaine C1, l’activité de l’adénylyl cyclase

est inhibée (figure 12) [85,87].

G

Les effets de Gsont spécifiques de certaines isoformes d’adénylyl cyclase.

AC1 et AC8 sont inhibées, alors que AC2, AC4, AC5, AC6, AC7 sont stimulées.

Les autres isoformes sont insensibles. La stimulation des adénylyl cyclases par

Gs’effectue par interaction directe sur des motifs précis du site catalytique

[52]. Ces motifs sont présents exclusivement sur les AC sensible à la

stimulation G(tableau 2)

L’inhibition par G est moins bien comprise. La première inhibition par G a

été identifiée sur l’AC1 et est connue depuis pour l’AC3 et AC8. Le site

d’interaction de G sur l’AC1 se situe sur les domaines C1 et C2, comprenant

une partie du domaine C1a. Il a de plus été montré que ce type d’inhibition est

19

médiée par une G originaire d’une protéine Gi [88] et pourrait dans certains

cas provenir de Gs [89].

Figure 12: Structure de l’adénylyl cyclase [90] a : Structure cristallographique des domaines

cytoplasmiques de l’AC en complexe avec Gs-GTP, Forskoline. b : Vue cytoplasmique représentant plus

clairement le site catalytique et la forskoline. C1 : jaune, C2 : orange, Gs : vert, Forskoline : bleu. Le

domaine de liaison de Gi est montré par une flèche.

I.4.1.1.2.2 Par le Calcium et les Kinases

L’activité des AC peut aussi être régulée par le calcium, les acteurs des voies de

signalisation dépendantes du calcium [83] et les kinases dépendantes du

calcium (CaMK) ainsi que d’autres kinases activées par les messagers

secondaires comme la PKA et la PKC (figure13). Cette régulation peut s’exercer

de façon directe ou bien de façon indirecte. Selon ces caractéristiques de

régulation les AC peuvent être classées en quatre groupes [85]. Les différents

groupes et sources de régulation sont compilés dans le tableau 2.


Tableau 2: Les différentes isoformes d’adénylyl cyclases et leur régulation.

Figure 13: Régulation des ACs. Le calcium peut réguler l’activité de certaines ACs soit directement grâce à l’entrée de calcium venant de l’extérieur (SOCC : store operated calcium channels) de la cellule ou par la mobilisation des stocks intracellulaires, soit par l’intermédiaire de la calmoduline (CaM), calmoduline kinase (CaMK) ou calcineurine. La régulation des ACs peut aussi être réalisée par les protéine-Kinases (ici

PKC). Les protéines G modulent aussi l’activité des ACs, soit via G, soit via G. PLC : phospholipase C, DAG : diacyl glycérol, PIP2 phospho-inositol 2-phosphate, InsP3 : inositol 3-phosphate, InsP3R : récepteur à l’inositol 3-phosphate [52].

AC (isoformes) PM (KDa) Gs Gi G Forskoline Calcium Protéine kinases

Groupe I Stimulation par le calcium

AC1 123,37 (+) (-) (-) (+) (+, CaM) ou (-, CaMK IV) (+, PKC)

AC3 129,08 (+) (-) (-) (+) (+, CaM) ou (-, CaMK II) (+, PKC)

AC8 140,1 (+) (-) (-) (+) (+, CaM) (=)

Groupe II Insensible au Calcium

AC2 123,27 (+) (=) (+) (+) (+, PKC)

AC4 120,38 (+) (=) (+) (+) (+, PKC) ou (-, PKC)

AC7 122,71 (+) (=) (+) (+) (+, PKC, -, PKC)

Groupe III Inhibition par le calcium

AC5 139,12 (+) (-) (+,12) (+) (-, < 1µM) (-, PKA, PKC

AC6 130,61 (+) (-) (+,12) (+) (-, < 1µM) (-, PK, PKC)

Groupe IV

AC9 150,95 (+) (-) (=) (=) ou

(+, faiblement) (+, CaMKII)(-, Calcineurine) (-, Nouvelle PKC)

AC10 186 (=) (=) (=) (=) Stimulation par le calcium (=)

21

I.4.1.1.2.3 Régulation pharmacologique

Le diterpène forskoline, extrait de la plante Coleus forskohlii, active toutes les

isoformes d’AC, mise à part l’isoforme soluble AC9. Elle se lie à l’interface des

domaines catalytiques afin de les complexer grâce à des interactions

hydrogènes et hydrophobes [91,92], se comportant comme activateur

allostérique [93] (figure 12). Cette propriété est fréquemment utilisée en

pharmacologie afin de mesurer l’inhibition de l’adénylyl cyclase par les

récepteurs couplés aux protéines Gi. Après stimulation de l’AC par la

forskoline, le taux d’AMPc intracellulaire est suffisamment élevé pour que la

détection d’une diminution après activation du récepteur soit possible.

I.4.1.1.2.4 Voie de signalisation de l’AMPc

L’adénosine 3’-5’ monophosphate (cAMP) a été le premier messager secondaire

à être découvert. Il joue un rôle fondamental dans la réponse aux hormones et

aux neurotransmetteurs. Les taux intracellulaires d’AMPc sont régulés par

deux enzymes (figure 14) : l’adénylyl cyclase (AC) et la phosphodiestérase

(PDE). Il existe pour PDE, comme pour l’AC, différentes isoformes codées par

un grand nombre de gènes qui diffèrent dans leur mécanisme de régulation et

la localisation de leur expression, ce qui leur confère des activités tissu

spécifiques, cellule spécifiques et stimulus spécifiques [94]. L’AC peut donc être

régulée positivement ou négativement par les RCPG et l’AMPc est dégradé par

PDE. Mais d’autres signaux intracellulaires peuvent influer sur l’activité de ces

enzymes, comme les voies de signalisation dépendantes du calcium (via la

calmoduline, la calmoduline kinase, la calcineurine), les sous-unités G et/ou

G de certains RCPG ou les récepteurs tyrosine kinase. L’interférence ou

cross-talk entre ces différentes voies de signalisation permet de moduler la

force du signal, son amplification et sa spécificité. Il existe plusieurs effecteurs

de l’AMPc dont trois effecteurs majeurs : la protéine kinase A (PKA), le facteur

d’échange du nucléotide guanine (GEF) EPAC et les canaux ioniques activés

par l’AMPc. La PKA est la cible la mieux comprise, elle est composée d’un

complexe de deux sous-unités régulatrices et deux sous-unités catalytiques

(voir chapitre modulation de l’activité des RCPG, AGC kinases et

désensibilisation hétérologue des RCPG). Des protéines d’ancrage de la PKA


(AKAP) permettent une grande spécificité du signal en localisant la PKA près de

ses effecteurs et ses substrats. Une localisation subcellulaire proche de l’AC lui

permet d’être activée directement et inversement une localisation proche de la

PDE crée un rétrocontrôle négatif. De nombreuses protéines peuvent être les

substrats de la PKA, dont les RCPG. La PKA peut aussi réguler d’autres voies

de signalisation. Elle phosphoryle et inactive par exemple la PLC2. Au

contraire elle active la voie des MAPK en permettant via la phosphorylation, la

dissociation d’une protéine tyrosine phosphatase (PTP). Elle régule l’expression

et l’activité de nombreux enzyme, dont l’AC et PDE effectuant un rétrocontrôle

sur la voie de signalisation à laquelle elle appartient. La voie de l’AMPc permet

via la PKA la régulation des facteurs de transcription dépendants de l’AMPc

comme CREB (c-AMP response element binding protein). Un autre effecteur de

l’AMPc est EPAC, une GEF permettant l’activation de petites protéines G

(GTPases monomériques comme Rap1). Enfin, l’AMPc peut activer des canaux

calciques dont l’influx peut activer les voies dépendantes du calcium et réguler

à son tour la voie de l’AMPc via les enzymes AC et PDE. Ces canaux calciques

ne sont pas sélectifs, sont perméables au potassium et au sodium et pouvent

ainsi modifier le potentiel électrique de la membrane cellulaire [95].

23

Figure 14: La voie de l'AMPc [95].

I.4.1.2 Les canaux ioniques

I.4.1.2.1 Les canaux calciques

Les canaux calciques voltage-dépendants jouent un rôle majeur dans les

neurones, car ils contribuent à la libération des neurotransmetteurs dans la

fente synaptique. Trois types de canaux peuvent être régulés par la

signalisation des protéines G : les canaux Cav1 (de type L), Cav2 et Cav3 (de

type T). La régulation de la classe Cav2 est beaucoup mieux comprise que celle

des autres classes de canaux. L’activité des canaux Cav2 de type N (Cav2.2),

P/Q (Cav2.1) et R (Cav2.3) est augmentée par la dépolarisation, déclenchant

l’entrée massive de calcium. Cet influx calcique est inhibé en réponse à

l’activation des récepteurs couplés Gi/o via la liaison des sous-unités


[52,96]. Les canaux Cav2 sont composés d’un complexe oligomérique formé de

sous-unités 1 formant un pore, d’une sous-unité Cav cytoplasmique et d’une

sous-unité associée à la membrane, 2. Plusieurs domaines de liaison

possibles pour G ont été reportés sur la sous-unité 1 [97], sur les domaines

N-terminal, C-terminal et une portion intracellulaire connectant deux sous-

unités membranaires [98], mais seul un site de liaison existerait par canal [99],

formé par association des différents fragments (figure 15).

I.4.1.2.2 Les canaux potassiques : GIRK

Les GIRK (G protein-gated inwardly rectifying potassium channel), canaux

potassiques à rectification entrante activés par les protéines G, sont impliqués

dans l’hyperpolarisation des cellules excitables en réponse à l’activation des

récepteurs couplés aux protéines Gi. Ces canaux sont formés de quatre sous-

unités appartenant à la famille Kir 3, famille comprenant les sous-types Kir 3.1

à Kir 3.4. Leur régulation s’effectue par liaison directe de G sur les extrémités

N- et C-terminales des sous-unités du canal [52,81].

Figure 15: Structure générale des canaux calciques (Cav2) et potassiques (Kir3.2) avec les sites de liaison

des protéines G [52].

I.4.1.3 La Phospholipase C (PLC)

La phospholipase C est aussi un effecteur des protéines G. Il existe, chez les

mammifères 13 isoformes classées en 6 sous-types: PLC(1-4), (1,2), (1,3,4),

,et (1,2). Le sous-type PLC est activé par les RCPG par plusieurs

mécanismes différents et le sous-type PLC est activé par les récepteurs à

25

activité tyrosine kinase (RTK). Les autres sous-types sont des PLC secondaires,

elles ne sont pas directement activées par les protéines G ou les RTK, mais par

des messagers secondaires tels que le calcium (figure 16). L’activité de la PLC

peut être régulée à la fois par Gq et G. Son activation aboutie au clivage du

phosphatidylinositol-diphosphate (PIP2) en deux messagers secondaires,

l’inositol-tri-phosphate (IP3) et le diacylglycérol (DAG) [100]. Le DAG active

directement la PKC et l’IP3 se fixe aux récepteurs canaux à l’IP3 du réticulum

endoplasmique (RE), provoquant le relargage des stocks de calcium [101]. Ce

relargage des stocks intracellulaires de calcium peut aussi être effectué

indépendamment de l’activation de la PLC, via une interaction directe de G

avec les récepteurs à l’IP3 du RE [102]. Les PLC1 et PLC1 sont activées par la

mobilisation de calcium induite par l’activation des RCPG. Elles sont

impliquées dans un rétrocontrôle positif permettant l’amplification du signal.

La PLC est activée plus en aval de la signalisation, par les petites protéines G

Rho, Ras, ou Rap [100].

Figure 16: Régulation des différentes isoformes de la PLC et voies de signalisation. Les PLC primaires sont

activées par les sous-unités de la protéine G ou directement par les récepteurs tyrosine kinase (RTK). Les PLC secondaires sont activées par le calcium et par des petite protéines G (Ras, Rap). Les PLC activées produisent les messagers secondaires diacyl-gycérol (DAG) et inositol-tri phosphate. Ces messagers pourront à leur tour activer la PKC et provoquer la libération de calcium des stocks intracellulaires [100,103].

PLC primaires

PLC secondaires


I.4.1.4 Voie des MAPK

La voie des MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) est impliquée dans des

réponses cellulaires diverses. Elle joue un rôle important dans la régulation de

la prolifération, de la survie, de l’apoptose, de la différenciation et de la

migration cellulaire. Elle met en jeu des activations séquentielles de kinases

par phosphorylation. Cette voie a beaucoup été décrite en réponse à des stimuli

tels que les facteurs de croissance, agissants essentiellement via les RTK

(récepteurs tyrosine kinase). On sait aujourd’hui que les RCPG peuvent activer

cette voie grâce à une signalisation G. L’activation de la voie ERK1/2

(Extracellular Regulated Kinase) a largement été étudiée pour les récepteurs

couplés Gi de même que la voie JNK et p38. Elles contrôlent notamment

l’expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire, comme c-Fos en

régulant l’activation de facteurs de transcription tel que CREB (cAMP response

element-binding protein). L’activation de ces différentes cascades de

signalisation peut mettre en jeu différents mécanismes (figure 17) [52,104].

Figure 17: Les multiples voies liant les RCPG à l'activation des MAPK [104]. La sous unité G peut

activer Ras par l’intermédiaire d’un récepteur ou enzyme (Src) à activité tyrosine kinase et abouti au

recrutement de Sos et Grb2 à la membrane et l’activation de la petite protéine G monomérique Ras. Gq peut aussi stimuler Raf via l’activation de la PKC ou par l’intermédiaire d’une stimulation dépendante du

calcium de Ras GRF ou de tyrosine kinases agissant sur Sos. De façon tissus spécifique, Gi/o et Gs

peuvent activer la voie Rap qui active à son tour B-Raf et active la voie des MAPK. GAP : GTPase-activating protein, GRF : guanine nucléotide releasing factor, EPAC : protéine d’échange activée par l’AMPc, PYK2 : protéine tyrosine kinase 2, PI3K: phophoinositide-3 kinase, PKC : protéine kinase C, PKA: protéine kinase A, PLC: phospholipase C.

Le premier implique l’activation de Ras via l’activation d’un RTK (Récepteur

Tyrosine Kinase) et/ou de la PI3K puis celle d’une kinase de type Src et/ou

27

l’activation de la PLCSrc peut aussi être activé par l'interaction avec Gi ou Gs

et d’autres tyrosines kinases telles que FAK (focal adhesion kinase) ou la

proline-rich tyrosine kinase 2 (PYK2). Les récepteurs couplés Gq peuvent

activer la voie des MAPK via des mécanismes dépendants de l’activation de la

PLC et/ou de la PKC. Un autre mécanisme implique l’activation de la petite

protéine G, Rap, via une protéine Gs passant par l’activation de EPAC/PKA et

par la production d’AMPc.

La voie des MAPK peut aussi être activée via la -arrestine (voir plus bas).

I.4.2 Spécificité de signalisation

L’activation des RCPG peut donc mener à l’activation d’une grande variété de

voies de signalisation, mettant en jeu de multiples effecteurs tels que des

enzymes, des canaux, aboutissant à la production de messagers secondaires et

l’activation de facteurs de transcription. L’efficacité de ces voies de signalisation

est augmentée lorsque tous les acteurs de ces évènements intracellulaires sont

maintenus à proximité les uns des autres. Cette proximité est réalisée par des

protéines d’ancrages qui permettent la formation de complexes de signalisation

rassemblant les molécules signalisantes comme les kinases et leurs cibles. La

formation de ces plateformes de signalisation permet une meilleure spécificité

du signal et une meilleure efficacité. Une famille de protéines d’ancrage

impliquée dans la compartimentalisation du signal est la famille AKAP (A-

Kinase Anchroring Proteins). Cette famille de protéines possède la capacité à

lier la PKA et d’autres partenaires simultanément. Elles localisent l’interaction

dans des domaines spécifiques de la cellule, comme par exemple la membrane

plasmique grâce à leur interaction avec les lipides membranaires ou des acides

aminés chargés. Ces complexes de signalisation, appelés signalosomes,

permettent, par exemple de moduler localement les taux d’AMPc, en

assemblant la PKA, la PDE et l’AC [105].

Un autre exemple de spécificité de la signalisation des RCPG est la localisation

de la signalisation par rapport aux micro-domaines membranaires. Plusieurs

études ont suggéré que les récepteurs MOP pouvaient être adressés ou confinés

à ces micro-domaines de par leur composition lipidique, les interactions

protéines/protéines ou bien des protéines d’ancrages [106,107] et que le


mouvement de ces récepteurs entre les différents domaines était agoniste-

dépendant [108]. La composition de la membrane plasmique semble donc

influer sur la signalisation de ces récepteurs. Les rafts lipidiques, régions de la

membrane plasmique enrichies en sphingolipides et cholestérol, influent sur la

signalisation des récepteurs MOP. Les récepteurs activés par la morphine sont

confinés dans les rafts alors qu’après activation par l’étorphine, ils en sortent,

leur permettant d’activer la voie des MAPK via la -arrestine [109]. Dans une

autre étude, ces récepteurs sont adressés aux rafts après stimulation par le

DAMGO. Cette diffusion du récepteur dépend non seulement du ligand mais

aussi de la protéine G car le traitement des cellules par un agent découplant de

la protéine G (GppNHp) inhibe la redistribution du récepteur MOP exprimé

dans les cellules CHO [110]. Après traitement prolongé à la morphine, le

récepteur MOP, sur cellules modèles EcR, est colocalisé avec l’adénylyl cyclase

et la cavéoline 1, marqueur des rafts lipidiques [109]. Sur cellules SH-SY5Y, le

récepteur MOP n’est pas localisé dans les rafts [108,111]. La conformation du

récepteur induite par liaison de son agoniste ainsi que le type cellulaire étudié

jouent donc un rôle primordial dans la spécificité du signal et son efficacité. La

localisation du récepteur, la diffusion et l’interaction avec les protéines

d’ancrages permettent la proximité des différents acteurs de la transduction du

signal.

I.4.3 Signalisation et arrestines

Un nombre grandissant d’études reportent, depuis une dizaine d’années, que

les récepteurs peuvent moduler les voies de signalisation intracellulaires via les

protéines adaptatrices, -arrestine 1 et -arrestine 2 [112,113].

Les -arrestines sont des protéines cytosoliques liant les récepteurs activés et

phosphorylés, qui découplent des voies de signalisations initiées par couplage

aux protéines G. Ce sont aussi des protéines d’échafaudage permettant le

recrutement de la machinerie d’internalisation (voir chapitre internalisation des

RCPG) notamment via les puits de clathrine. L’idée d’une transduction du

signal par les arrestines est venue de l’observation que certains RCPG

activaient la voie des MAPK après internalisation. Les -arrestines fonctionnent

donc aussi comme adaptateurs fonctionnels, menant à l’activation des voies de

transduction telles que les voies JNK3, p38 ou ERK après activation de

29

nombreux récepteurs dont les récepteurs à l’angiotensine (AT1),

adrénergique2 (AR) ou bien encore à la vasopressine (V2)

[114,115,116,117,118]. Les voies de signalisation protéine G et -arrestine

semblent fonctionner en parallèle l’une de l’autre, cependant les cibles sont

différentes. Par exemple l’activation de ERK en aval de l’activation de la

protéine G aboutie à sa translocation dans le noyau et à l’activation de facteurs

de transcription cibles. Par contre, l’activation de ERK médiée par la -

arrestine séquestre ERK dans le cytosol, puisque la -arrestine possède une

séquence d’exclusion du noyau. Les cibles de ERK sont donc différentes, de

même que les conséquences au niveau cellulaire [119]. De plus la cinétique

des deux voies n’est pas identique. La signalisation par les protéines G est

rapide et transitoire alors que la signalisation par les -arrestines est plus

tardive et persistante. Dans la plupart des cas, lorsque le récepteur est couplé

Gs ou Gq, cette signalisation par les -arrestines est indépendante des

protéines G. Par exemple, cette voie -arrestine peut être activée par le

récepteur AT1 muté sur le motif DRY, déficient dans sa capacité à coupler la

protéine G, mais aussi par les agonistes biaisés induisant la signalisation via la

-arrestine et l’internalisation du récepteur sans activation du de la protéine G

[120]. Dans le cas des récepteurs couplé Gi cette signalisation apparait

dépendante à la fois de Gi, car elle est bloqué par la PTX, mais aussi de la

arrestine, car bloquée par les si-RNA -arrestine [121].

I.4.4 Agonisme biaisé/sélectivité fonctionnelle

Les RCPG peuvent donc activer une grande variété de voies de signalisation

intracellulaires. Ces fonctionnalités peuvent être modulées de façon ligand-

dépendante, et découlent du fait que les RCPG sont des protéines

particulièrement dynamiques, capables d’adopter des conformations différentes

en réponse à la liaison des différents agonistes. La notion d’agonisme biaisé

décrit le fait que chaque ligand d’un même récepteur peut activer des voies de

transduction qui lui sont spécifiques [41,122]. Ce phénomène a initialement été

décrit lorsque certains RCPG ont été montrés comme étant capables de coupler

plusieurs types de protéines G et que les agonistes pouvaient avoir une

« préférence » pour un type de signalisation ou une autre. Depuis la découverte

d’une signalisation dépendante des arrestines, l’étude de ce phénomène a pris


de l’ampleur. Cette sélectivité fonctionnelle représente un enjeu important de la

pharmacologie car elle ouvre le champ de possibles découvertes de ligands

ayant l’effet physiologique désiré et des effets secondaires amoindris. La

signalisation via la -arrestine s’est, par exemple, révélée être particulièrement

intéressante dans l’étude d’un agoniste des récepteurs à la dopamine, D2R. La

signalisation sélective de l’UNC9994 via la-arrestine semble en effet jouer un

rôle majeur dans l’efficacité anti-psychotique de l’agoniste alors que les effets

secondaires sur la motricité sont diminué [123]. A l’inverse, chez les souris KO

pour la -arrestine 2, l’effet analgésique de la morphine est augmenté comparé

aux souris sauvages. Ces souris KO sont, de plus, moins sujettes à la tolérance

et la désensibilisation du récepteur MOP est diminuée, les effets indésirables

tels que la constipation, et la dépression respiratoire sont eux aussi, diminués

[124,125,126]. Ces effets de la déplétion de la -arrestine ont été reproduits sur

la substance grise périaqueducale de souris [127] et sur la moelle épinière de

rat [128]. Un ligand opioïde dépourvu de sa capacité à activer la voie de la -

arrestine pourrait offrir un meilleur potentiel analgésique et des effets

indésirables amoindris. De même, il a récemment été démontré que certains

effets secondaires des agonistes KOR (kappa-opioid receptor) potentiellement

utiles dans le traitement de la douleur, sont attribués au recrutement de la -

arrestine. Un analgésique sélectif des protéines G, ne recrutant pas la -

arrestine, représenterait un bon candidat dans l’amélioration du potentiel

thérapeutique des récepteurs KOR [129,130].

I.5 Dimérisation des RCPG

Si les RCPG peuvent fonctionner comme monomères, nombreuses sont les

études reportant la signalisation de ces derniers en tant que dimères,

hétérodimères ou bien même oligomères. Ces complexes ont pu être observés

dans de nombreux systèmes hétérologues et leur étude a débuté par

l’observation de la dimérisation des RCPG de classe C.

L’hétérodimérisation des récepteurs GABAB est indispensable au couplage de la

protéine G et à l’initiation d’une signalisation [131]. Cet hétérodimère est

composé de deux sous-unités homologues ; GABAB1, responsable de la liaison

31

au ligand, [132], et GABAB2 comprenant le site de couplage à la protéine G et

permettant l’expression de l’hétérodimère à la membrane [133]. Cet

hétérodimère se forme au niveau du réticulum endoplasmique et est ensuite

exporté via l’appareil de Golgi vers la membrane plasmique [134]. La même

observation a été faite pour les récepteurs gustatif au sucre et umami [135].

Les récepteurs métabotropiques au Glutamate (mGluR) sont aussi fonctionnels

sous forme de dimères stabilisés par un pont disulfure entre deux cystéines de

chaque monomère [136]. La structure des domaines extracellulaires de ces

récepteurs sous forme dimérique [137,138] a révélé deux formes

conformationelles du dimère. Une, stabilisée par l’occupation d’un site de

liaison du monomère par l’agoniste, une autre stabilisée par l’occupation des

deux sites. Des constructions de récepteurs mutants pour le domaine

extracellulaire de l’un des monomères ont pu, par la suite, démontrer que seule

la forme stabilisée par occupation des deux sites pouvait permettre la complète

activation de la voie de signalisation (production d’inositol phosphate) [139].

L’existence de RCPG de classe C sous forme de dimères a initié la recherche de

dimères de RCPG de classe différente et aujourd’hui cette hypothèse est validée

dans de nombreux systèmes hétérologues. En effet, grâce à l’utilisation de

méthode de transfert de fluorescence (FRET), de bioluminescence (BRET) et

d’immunoprécipitation, l’association physique de nombreux récepteurs de

classe A a pu être démontrée. L’expression de récepteurs couplés à des

protéines fluorescente ou taggés a facilité les études sur la formation de ces

dimères. On distingue les dimères formés uniquement d’un type de récepteur :

les homodimères, et les hétérodimères, formés de deux types de récepteurs

différents. Ainsi, plusieurs dimères impliquant les récepteurs opioïdes ont été

démontrés. Comme, par exemple : CXCR4-DOP [140], D1-MOP [141] et NK1-

MOP (neurokinine1-µ-opioïde) par la méthode du FRET et du BRET, dans des

cellules HEK 293 [142], et le dimère NPFF2-MOP démontré dans des cellules

SH-SY5Y par FRET et immunoprécipitation [143].

Cependant, les preuves de l’existence de dimères in vivo restent plus rares et

non sans équivoque [144,145,146,147]. Le manque d’outils rend difficile l’étude

de ces complexes, notamment en ce qui concerne les RCPG de classe A qui

possèdent des extrémités relativement courtes et ne permettent que très

rarement la génération d’anticorps sensibles et spécifiques dirigés contre les

32 Introduction: Dimérisation des RCPG

formes endogènes de ces récepteurs. Malgré ces difficultés des anticorps

spécifiques de l’hétérodimère MOPR-DOPR ont pu être produits [145] et ont

permis de montrer par technique ELISA, l’augmentation de ces formes, chez la

souris, après traitement chronique à la morphine. Une autre stratégie adoptée

pour étudier ces complexes est de produire des ligands bivalents comme le

MDAN (MOP DOP agonist antagonist) ou bien des agonistes sélectifs de ces

dimères comme le 6’-GNTI (6’-guanidinonaltrindole) [146,148,149].

Fréquemment, si l’interaction fonctionnelle est bien démontrée entre deux

récepteurs, leur interaction physique n’est pas réellement claire in vivo.

Quelques études ont pu néanmoins la démontrer par co-immunoprécipitation

pour, entre autre, les récepteurs 5-HT1-mGluR2 dans le cortex [150], les

récepteurs D1-D2 [151,152], CB1-A2A dans le striatum [153,154,155]. Bien

qu’elles soient difficiles à mettre en œuvre, la technique de FRET a permis la

mise en évidence de l’hétéromère D1-D2 dans le tissu cérébral [156] et la

technique de proximity ligation assay [157] celle des hétérodimères D2-

Adénosine A2A sur coupe de cerveaux [158] et A1R dans le cortex [159].

La résolution de la structure cristallographique de nombreux récepteurs a

dernièrement révélé l’existence de dimères ou tétramères pour les récepteurs

MOP, KOP et CXCR4 [160,161,162,163]. Ces récepteurs ont cristallisé en

parallèle sous forme d’homodimère. Les interfaces TM5 et TM6 constituent les

interfaces principales des dimères CXCR4 et MOPR avec des points de contacts

présents sur toute la longueur du TM pour le récepteur MOP [163] [161]. Une

seconde interface TM1-TM2-H8 a aussi été révélée dans la structure des

dimères de récepteurs MOP [161] et KOP [162] mais il peut exister d’autres

interfaces pour d’autres dimères de RCPG [164]. Il est cependant important de

noter que ces structures correspondent à un état statique des récepteurs,

débarrassés de leurs partenaires protéiques et dépourvus de leur

environnement lipidique. De plus ces structures sont majoritairement réalisées

sur un récepteur inactif (lié à un antagoniste) et les interfaces peuvent être

modifiées en fonction de la conformation adoptée par le récepteur après liaison

d’un agoniste.

La réponse à la question de l’existence de ces hétéro- ou homodimères in vivo

est essentielle car elle permettrait de considérer ces formes comme des cibles

33

pharmacologiques importantes pour le développement de nouveaux

traitements.

I.5.1 Spécificité de signalisation des hétéromères RCPG

L’étude in vitro des conséquences fonctionnelles de l’homo/hétéromérisation a

permis de déterminer les voies de signalisation engagées par ces complexes.

L’hétérodimérisation a pu de ce fait être considérée comme une stratégie de

modulation de l’activité des RCPG et comme une méthode de sélection

fonctionnelle de cette activité.

I.5.1.1 Propriétés pharmacologiques

L’une des premières conséquences rapportée dans de nombreuses études est la

modification des propriétés de liaison des ligands [165,166,167,168,169]. Cette

modification des propriétés de liaison suggère un changement de conformation

du site de liaison au ligand. L’hétéromère peut adopter une conformation

créant un nouveau site de liaison, absent des monomères. L’un des récepteurs

se comporte comme un régulateur allostérique par rapport à l’autre et modifie

ses propriétés biochimiques. Cette hypothèse est supportée par l’identification

de ligands spécifiques des hétéromères, comme le 6’-GNTI, agoniste sélectif des

dimères KOP-DOP [146]. Cette interaction allostérique a aussi été rapportée

pour les dimères MOPR-DOPR [144] où l’occupation du récepteur DOP par un

agoniste ou un antagoniste augmente l’affinité du récepteur MOP pour la

morphine ou le DAMGO lorsqu’ils sont exprimés dans des cellules CHO ou de

façon endogène dans les cellules SK-N-SH. Ce n’est par contre pas le cas dans

le dimère MOP-NPFF2 [143].

I.5.1.2 Activation des protéines G

Le couplage de la protéine G à son récepteur nécessite deux sites d’interaction :

l’un mettant en jeu la partie C-terminale de G et l’autre la partie C-terminale

de G. Ces régions sont distantes de 55 Ǻ, alors que la distance entre deux

monomères d’un dimère serait de 45 Ǻ. La protéine G pourrait donc interagir

de façon asymétrique avec les deux monomères [167,170]. Cette observation


pose la question du rôle respectif de chaque monomère dans l’activation de la

protéine G. Plusieurs possibilités peuvent être envisagées. Soit le monomère

occupé par l’agoniste interagit lui-même avec la protéine G et l’active via un

processus de cis-activation (figure 18). Soit il active la protéine G via trans-

activation. Le processus de cis-activation a été rapporté notamment pour le

dimère des récepteurs au leucotriene B4 (LTB4)[171] et la trans-activation pour

le dimère des récepteur à la mélatonine (MT1 et MT2) [172].

Figure 18: Asymétrie des hétéromères RCPG [167]. (a) Récepteur couplé à une protéine G avec une stœchiométrie 1 :1. (b) Processus de cis-activation. (c) Processus de trans-activation

Si l’hétéromérisation influe sur le couplage aux protéines G, elle module aussi

leur activité. Ainsi plusieurs exemples de modulation allostérique de l’efficacité

intrinsèque des hétéromères ont été démontrés. L’efficacité d’activation de la

protéine G du récepteur MOP est diminuée lorsqu’il est associé au récepteur

DOP [173]. Dans l’hétéromère MOPR-2AR, l’activation par chaque agoniste de

façon indépendante, augmente l’efficacité de signalisation de chaque

monomère, alors que la stimulation concomitante par les agonistes des deux

monomères inhibe leur signalisation via la protéine G [174]. La signalisation

n’est pas altérée lorsque le récepteur MOP est associé au récepteur CB1 [175].

La formation d’hétéromères joue donc un rôle important dans l’interaction

fonctionnelle des deux récepteurs et la fonctionnalité de la protéine G dépend

de la conformation active adoptée par l’hétéromère.

35

I.5.1.3 Sélectivité fonctionnelle

L’hétéromérisation peut donc être considérée comme une façon de moduler

l’activité des RCPG. En effet l’un des récepteurs agissant comme modulateur

allostérique peut forcer l’hétéromère à engager l’activation d’une voie de

signalisation qui lui est propre, différente des voies de signalisation des

monomères.

Switch de couplage de protéine G I.5.1.3.1

La sélectivité fonctionnelle des hétéromères peut directement affecter le

couplage à la protéine G. C’est le cas de l’hétérodimère MOPR-DOPR [176]. Si

ces récepteurs sont couplés Gi lorsqu’ils sont exprimés indépendamment dans

des cellules HEK-293, l’hétéromère peut être couplé à Gz [177]. Dans

l’hétéromère DOPR-SNSR4 (sensory neuron specific receptor) aucun des

couplages individuels ne semble affecté et chaque récepteur stimulé

indépendamment est couplé à Gi/o. Après stimulation simultanée, l’inhibition

de l’AC n’est plus observée mais la voie de la PLC, médiée par Gq est activée

[178]. Un autre exemple est celui de l’hétérodimère D1-H3 (histamine). Après

activation, le récepteur D1 active la production d’AMPc, via l’activation de Gs.

Lorsqu’il est hétérodimérisé avec le récepteur H3, la stimulation par l’agoniste

D1 aboutit à une inhibition de l’adénylyl cyclase, soit un couplage Gi [179].

I.5.1.3.2 Changement de voie de signalisation

Un exemple pour lequel la dimérisation influe sur le choix de la voie de

signalisation activée est celui du dimère MOPR-DOPR. Le récepteur MOP est

couplé Gi. Dans les conditions normales de stimulation, la morphine active une

voie ERK dépendante de Gi et inhibe l’adénylyl cyclase. Lors d’un traitement

chronique à la morphine, la proportion d’hétérodimères MOPR-DOPR

augmente dans plusieurs régions du cerveau des souris traitées [145] et la

stimulation de l’hétérodimère dans les cellules CHO aboutie au recrutement

constitutif de la-arrestine 2 et à l’activation de la voie ERK via la -arrestine2,

ce qui en conséquence, modifie la dynamique spatio-temporelle de cette voie de

signalisation [166,180]. La signalisation par les protéines G peut être restaurée

grâce au blocage des protomères DOP [180] ou par un ligand bivalent [148].

L’activation par le dimère de cette voie de signalisation indépendante des


protéines G, pourrait jouer un rôle dans le développement de la tolérance

[181,182].

I.5.1.3.3 Modification du trafic intracellulaire

Plusieurs études ont démontré que les hétéromères peuvent co-internaliser en

présence de ligands de l’un ou l’autre protomère. Sur cellules modèles HEK-

293, c’est le cas de l’hétéromère NK1-MOPR qui internalise après stimulation

par l’agoniste MOPR (DAMGO) ou NK1(Substance P)[142]. De même pour

l’hétéromère DOPR-2AR qui internalise en réponse aux stimulations des deux

ligands étorphine et isoprénaline [183,184]. Cependant même si le DAMGO est

capable d’internaliser l’hétéromère MOPR-NK1, il n’induit pas l’internalisation

de l’hétéromère MOPR-SST2 [185] et lorsque le récepteur 2AR forme un

hétérodimère avec le récepteur KOP, l’internalisation induite par l’isoprénaline

est fortement diminuée. Le trafic du récepteur MOP est aussi altéré lorsqu’il

forme l’hétérodimère MOPR-NPFF2 dans les cellules SH-SY5Y. Après

stimulation par le DAMGO, l’internalisation du récepteur MOP est fortement

diminuée par rapport au récepteur MOP stimulé par le DAMGO lorsqu’il est

exprimé seul [143]. Le récepteur partenaire peut donc influer sur le trafic

intracellulaire de l’hétéromère [186,187].

37

II. MODULATION DE L’ACTIVITE DES RCPG PAR LES

MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES

Afin de répondre le plus finement aux stimulations extérieures, la cellule doit

mettre en place des systèmes de régulation. Les voies de signalisation engagées

par activation des RCPG doivent être stoppées, désensibilisées, afin d’éviter la

multiplication des signaux de réponses devenus obsolètes. Plusieurs stratégies

peuvent être mises en place. La première met en jeu des protéines spécifiques

de la régulation de la signalisation par les protéines G, les protéines RGS, et

agit donc sur la voie de signalisation activée. D’autres stratégies agissent

directement sur le récepteur et font intervenir des modifications post-

traductionnelles qui lui sont spécifiques. Le point central de mon sujet de thèse

étant la phosphorylation du récepteur NPFF2, nous accorderons une attention

particulière à la description de cette modification post-traductionnelle, des

enzymes impliquées dans cette modification des RCPG et du rôle des

phosphorylations dans la régulation de leur activité.

Certains des changements dans les conditions intérieures et extérieures à la

cellule peuvent intervenir de façon particulièrement rapide. Ces changements

doivent donc être rapidement relayés des senseurs aux effecteurs et ce, via des

modifications réversibles. Les modifications post-traductionnelles permettent à

la cellule de réguler l’activité des protéines au sens large. Elles jouent un rôle

crucial dans la prise en charge des réponses aux changements de conditions

extérieures comme intracellulaires.

Les modifications post-traductionnelles des RCPG sont variées et mettent en

jeu des enzymes spécifiques pouvant ajouter, ou bien retirer, ces modifications.

Le rôle fonctionnel de ces modifications peut résider dans la reconnaissance

des séquences modifiées ou de la modification elle-même grâce à l’interaction

avec des protéines reconnaissant ces modifications de façon spécifique. Au

contraire, il peut passer par l’inhibition de l’interaction avec les partenaires

qui, le site de reconnaissance occupé par la modification, ne peuvent plus

interagir. Les conséquences fonctionnelles sont donc multiples et comprennent

38 Introduction: Modulation de l’activité des RCPG

entre autre la régulation de l’interaction avec les protéines partenaires et

l’activité, la localisation et l’expression des récepteurs. Les études de

mutagénèse et le développement des méthodes de spectrométrie de masse

notamment, ont permis de grandes avancées dans l’identification de ces

modifications post-traductionnelles. Ainsi, de nombreuses modifications des

RCPG, telles que la phosphorylation, l’ubiquitination, la glycosylation, la

palmitoylation ont pu être mises en évidence. La variété de ces modifications

ainsi que les séquences sur lesquelles elles interviennent doivent être décodées

afin de comprendre la complexité des fonctions cellulaires dans lesquelles elles

interviennent.

II.1 Phosphorylation

La phosphorylation est le transfert d’un groupement phosphate (PO32-) de l’ATP

sur un résidu accepteur d’une protéine substrat. Les acides aminés accepteurs

sont les résidus portant un hydroxyle (-OH) comme la sérine, la thréonine et la

tyrosine.

La phosphorylation est sans doute la modification post-traductionnelle des

RCPG la plus étudiée de nos jours. Elle influence la conformation et la charge

de la protéine cible et joue de ce fait un rôle important dans son activité. La

phosphorylation intervient dans de nombreuses fonctions cellulaires, dans la

signalisation intracellulaire, et dans la régulation de l’activité des RCPG. En

effet, la phosphorylation permet de contrôler la durée d’activation des RCPG,

en provoquant une perte d’efficacité de la stimulation des voies de

signalisation, ce processus est appelé désensibilisation. On distingue deux

types de désensibilisation des RCPG. Une désensibilisation initiée par

l’occupation du récepteur par son agoniste, la désensibilisation homologue, et

la désensibilisation hétérologue qui survient après activation d’un autre

récepteur présent dans la cellule.

Les kinases catalysant la réaction sont classées en différentes familles, selon

les acides aminés cibles de la phosphorylation.

39

II.1.1 Kinases

Les kinases sont généralement classées selon leur spécificité de substrat en

deux grandes familles, les Ser/Thr kinases et Tyr Kinases. Mais selon leurs

homologies de séquences et leur fonctionnalité biochimique, elles peuvent être

classées en groupes, familles et sous-familles. Jusqu’ici 518 kinases humaines

ont pu être identifiées et classées en 7 groupes majeurs représentés dans le

dendrogramme, figure 19 [188].

Figure 19: Dendrogramme des différentes familles de kinases (Human kinome, Cell Signaling Technologies). TK : tyrosine kinase, TKL : tyrosine kinase like, STE : sterile, CK1 : casein kinase 1, CAMK: calcium calmoduline kinase, AGC et CMGC: nommé à partir de certain des membres de ces familles.


II.1.1.1 Déterminants structuraux

Malgré leur spécificité de substrat les protéines kinases possèdent des

déterminants communs essentiels. D’un point de vue structural, le

déterminant le mieux conservé, que la kinase soit Ser/Thr ou Tyr kinase, est le

domaine catalytique. Elles possèdent un cœur d’environ 250 résidus

relativement bien conservés formant deux lobes (figure 20) [189]. Le plus petit,

le lobe N-terminal inclut les domaines I à IV, et est impliqué dans la

reconnaissance et la liaison du nucléotide. Ce lobe possède presque

exclusivement des feuillets . Le plus grand lobe, C-terminal, inclut les

domaines VI à XI. Responsable de l’interaction avec la protéine substrat, il

initie le transfert du phosphate. Il est essentiellement formé d’hélices . A

l’interface des deux lobes se trouve le site catalytique. La structure de

différentes protéines kinases a permis de démontrer que la conformation des

deux lobes était modifiée par un repliement, lors de l’activation de la kinase.

L’étude de structures [189] et l’alignement des séquences de 510 kinases

humaines [190] a permis d’identifier 12 sites conservés ou sous-domaines,

s’articulant autour du cœur catalytique. Les principaux sont :

Le sous-domaine I qui forme une boucle autour du triphosphate de l’ATP.

Le sous-domaine II qui fait contact avec le phosphate.

Le sous-domaine III représente l’hélice C du petit lobe. Il stabilise

l’interaction avec les phosphates de l’ATP.

Les sous-domaines VIb et VII sont directement impliqués dans l’activité

catalytique.

Le sous-domaine VIII est essentiel dans la stabilisation de la boucle

d’activation afin de former une plateforme pour lier la protéine substrat et

permettre l’interaction stabilisant le grand lobe.

Le sous-domaine IX stabilise la boucle catalytique du sous domaine VIb.

41

Figure 20: Structure du cœur catalytique des protéines Kinases [191]. Pour exemple est représentée la PKA. A:structure générale en deux lobes. Un petit lobe à l’extrémité Nterminale possédant le site de liaison à l’ATP et au magnésium et un large lobe à l’extrémité Cterminale impliqué dans la reconnaissance de la protéine substrat. A l’interface des deux lobes se situe le site catalytique. B : Segmentation du cœur

en sous-domaines I à XI. C : Représentation des motifs hydrophobes R-spine et C-spine [192].

Plus récemment l’étude du mécanisme d’activation des protéines kinases a

permis de définir, à l’intérieur du cœur catalytique, des ensembles régulateurs,

R-spine et catalytiques, C-spine [192,193]. Par exemple, dans la conformation

active de la PKA, le sous domaine VII interagit avec un résidu du lobe C-

terminal, une leucine de l’hélice C et un aspartate de l’hélice F du lobe C-

terminal. Ces résidus forment un ensemble hydrophobe appelé R-Spine créant

un pont entre les deux lobes. Les interactions s’effectuant dans cet ensemble,

régulent la conformation de la kinase et en définissent l’état actif ou inactif.

L’ensemble des acides aminés du site catalytique des deux lobes, en interaction

avec l’ATP est appelé C-spine. En présence d’ATP cet ensemble connecte les

deux lobes.

Chaque kinase possède un site de reconnaissance du substrat qui garantit sa

spécificité [194,195]. Certaines de ces séquences consensus sont compilées

dans le tableau 3. Il est ainsi possible de prédire les sites de phosphorylation

possibles et les éventuelles kinases impliquées. De nombreuses séquences

consensus ont déjà été identifiées pour de nombreuses kinases [196], mais en

ce qui concerne les séquences substrat des kinases de la famille GRK, les

choses sont moins claires. Mis à part les séquences substrats de la GRK2 qui

ont, très récemment, été étudiées et identifiées [197], les sites consensus de

cette famille ne sont pas bien définis.


Kinase Séquence consensus Références et revues

PKA R-R-X-(S/T)-Φ [198] [196,198]

PKC R-(R/F)-R-R-K/R-G-(S/T)-(F/L)-(K/R)-(K/R/Q) [196,198]

PKC (F/L)-(K/R)-R-(K/Q)-G-(S/T)-(F/M)-K-K-X-A [196,198]

PKC R-R-R-K-(K/G)-(S/T)-F-(K/R)-(K/R)-K-A [196,198]

CaMKII R-X-X-(S/T) [196,198]

GRK2 (D/E)X1–3(S/T), (D/E)X1–3(S/T)(D/E), ou (D/E)X0–2(D/E)(S/T) [197]

Tableau 3: Séquences consensus de certaines kinases, notamment impliquées dans la désensibilisation des RCPG (d'après [196,197,198]). Les sérines/thréonines phosphorylables sont en gras et entre parenthèses. Entre parenthèse, les acides aminés variables, X représente n’importe quel acide aminé et Φ un acide aminé aromatique.

Des programmes tels que GPS et KinasePhos permettent d’affecter à chaque

site possible de phosphorylation un score et de connaitre la ou les kinases

impliquées. GPS, par exemple possède une classification hiérarchisée de 408

protéine-kinases humaines. Ces programmes sont des outils utiles dans les

premières étapes de l’étude des sites de phosphorylation [199,200,201].

II.1.2 Désensibilisation hétérologue des RCPG par les

kinases AGC

Le groupe des kinases AGC a été nommé d’après les protéines kinases A, G et

C [189]. Il compte aujourd’hui 60 protéines kinases dont 42 possèdent en plus

du domaine kinase conservé, d’autres domaines fonctionnels d’interaction et de

localisation. On trouve dans ce groupe les familles des PKA, PKC et GRK.

II.1.2.1 PKA

II.1.2.1.1 Structure et mécanisme d’activation

La PKA est une holoenzyme [202,203] dépendante du messager secondaire

AMPc (figure 21). Elle fait donc partie intégrante des voies de signalisation

initiées par activation des RCPG. Elle fonctionne sous forme d’hétérotétramère

constitué de deux sous-unités catalytiques (coeur kinase dont la structure est

universelle chez les proteines kinases, décrit plus haut) et deux sous-unités

régulatrices. Ces deux sous-unités régulatrices controlent l’activité de la PKA

de facon dépendante de la concentration intracellulaire d’AMPc. Elles sont les

récepteurs pour le messager secondaire. Il existe quatre isoformes de sous-

unités régulatrices (RI, RI, RII, RII). Chaque isoforme possède un domaine

43

de liaison et de dimérisation (dimerization and docking domain / D/D

domaine) à l’extrémité N-terminale et deux domaines CNB (CNBA,CNBB) à

l’extrémité C-terminale [191]. En abscence d’AMPc, la sous-unité régulatrice se

lie à la sous-unité catalytique et inhibe son activité. Lorsque le messager

secondaire est produit, après activation de l’adénylyl cyclase, la liaison de

l’AMPc aux sous-unités régulatrices induit un changement de conformation

des sous-unité R libérant les sous-unités catalytiques et permettant la

phosphorylation de la protéine substrat (figure 22). L’activation de la PKA

nécessite aussi la phosphorylation de la Thr 197, présente sur sa boucle

d’activation (cœur kinase). Ce site pourrait être le substrat de la PDK1, mais

aussi de la PKA elle-même.

Figure 21: Structure de l'holoenzyme PKA [191,202,203]. A l’état inactif, la PKA est sous forme hétérotétramérique constituée de deux cœurs catalytiques et deux sous-unités régulatrices (CNBA et CNBB) liées par un N-linker. Lorsque la PKA interagit avec l’AMPc, les sous-unités régulatrices se dissocient du complexe permettant l’activation de la PKA.

La PKA peut etre régulée pharmacologiquement grace à des inhibiteurs comme,

par exemple, le H89 ou le peptide mimétique, PKI (5-24). Il existe aussi

quelques activateurs qui sont, pour la majorité, des dérivés de l’AMPc.

II.1.2.1.2 Rôle de la PKA dans la désensibilisation hétérologue

Les substrats de la PKA sont nombreux et variés. Il existe sur certains RCPG

des séquences consensus de reconnaissance, permettant l’interaction avec la

PKA. Les cibles de la PKA sont les résidus sérines et thréonines proches de

résidus basiques (tableau 3), préférentiellement positionnés comme dans la


séquence RRxS [204]. Cette séquence est, par exemple, présente à deux

reprises dans le récepteur 2AR en position 262 dans I3, et 346 en C-terminal.

Pourtant le résidu sérine 262 semble le plus impliqué dans la désensibilisation

par la PKA [205]. La PKA est aussi impliquée dans la désensibilisation

hétérologue du récepteur DOP. Après stimulation du récepteur dopaminergique

D1, la stimulation de la liaison du GTPS par le récepteur DOP est diminuée

montrant une désensibilisation de la réponse. Cette désensibilisation est

atténuée lorsque les cellules sont traitées avec un inhibiteur de la PKA [206].

Figure 22 Mécanisme d'activation de la PKA

II.1.2.2 PKC

II.1.2.2.1 Structure générale et mécanisme d’activation

Il existe 12 isoformes de la PKC, les isoformes conventionnelles, PKC, PKC,

PKC, les isoformes nouvelles ; PKC, PKC, PKCη, PKC et les atypiques PKCζ,

PKC et PKCfigure 23. La protéine kinase C est une kinase dépendante de la

signalisation Gq/PLC et de la production des messagers secondaires DAG et

calcium.

Figure 23: Représentation schématique

des isoformes de la PKC et de leurs domaines.

45

En plus de leur cœur kinase, les PKC conventionnelles possèdent une

séquence « pseudosubstrat » à leur extrémité N-terminale (C1 et C2), les

maintenant à l’état inactif. Lorsque C1 interagit avec le diacylglycérol (DAG) et

C2 avec le calcium, la PKC subit un changement de conformation libérant le

pseudosubstrat et permettant l’activation de l’enzyme (figure 24). Il existe des

différences dans la régulation des différentes PKC. En effet les nouvelles PKC

ne sont pas sensibles au calcium et les PKC atypiques ne possédent pas de

séquence pseudosubstrat et ne sont ni sensibles au calcium ni au DAG.

Figure 24: Mécanisme

d'activation de la PKC. La PKC phosphorylée est pleinement activée grâce à l’interaction avec le DAG et le calcium.

II.1.2.2.2 Régulation pharmacologique et rôle dans la désensibilisation

hétérologue

Les molécules activatrices telle que l’ester de phorbol, PMA, ou inhibitrices

(Chélérythrine, BIM2, RO32) sélectives de la PKC ont permis de mieux

comprendre le rôle de la phosphorylation dépendante de la PKC dans la

désensibilisation de plusieurs RCPG. Le PMA permet l’activation de plusieurs

isoformes de la PKC (les conventionnelles et les nouvelles) [207] et est

beaucoup utilisé dans l’étude du rôle de la PKC dans la désensibilisation

hétérologue. Ce rôle est particulièrement bien décrit pour les récepteurs MOP

[208,209]. En effet, l’activation de la PKC par l’ester de phorbol PMA induit la

phosphorylation du récepteur MOP exprimé dans les cellules HEK [210]. Dans

les neurones du locus coeruleus, l’activation de la PKC augmente la

désensibilisation induite par la morphine [211,212]. Au contraire, son

inhibition dans les cellules HEK, réduit la phosphorylation et la

désensibilisation induite par la morphine [213]. La PKC joue donc un rôle

crucial dans la régulation hétérologue de la phosphorylation et la

désensibilisation du récepteur MOP.


II.1.3 Autres Ser/Thr Kinases impliquées dans la

désensibilisation hétérologue

II.1.3.1 CAM Kinases

II.1.3.1.1 Structure générale et mécanisme d’activation

Les CAMK sont des kinases régulées par le calcium et la calmoduline. Il existe

deux types de CAMK : les CAMK spécialisées, impliquées dans la contraction

musculaire, comme les MLCK (kinase des chaînes légères de la myosine), et les

CAMK multifonctionnelles, appelées CAMKII. Ces kinases se présentent sous

forme d’holoenzyme de structure dodécaédrique. En plus de leur domaine

catalytique, elles possèdent un domaine régulateur et un domaine

d’association. En absence de calcium et de calmoduline, le domaine catalytique

est inhibé par le domaine régulateur, agissant comme pseudosubstrat. En

présence du complexe calcium/calmoduline il y a oligomérisation des CAMK

qui s’activent grâce à l’auto phosphorylation de résidus Thr.

II.1.3.1.2 Rôle dans la désensibilisation des RCPG

Les CAMKII, présentes dans le système nerveux central, jouent un rôle crucial

dans la sécrétion de neurotransmetteurs. En phosphorylant les récepteurs

métabotropiques au glutamate (mGluR1), la CAMKII désensibilise le récepteur

et diminue la production d’IP3 [214]. La CAMKII semble aussi être impliquée

dans la désensibilisation du récepteur MOP car la coexpression d’une forme

constitutivement active de la CAMKII et du récepteur MOP dans les cellules cos

ou HEK 293 augmente la désensibilisation induite par le DAMGO du récepteur

[215,216]. Cette désensibilisation n’est plus observée après mutation de deux

sérines : S261/S266, suggérant que ces deux sites sont des sites putatifs de

phosphorylation du récepteur MOP de rat par la CAMKII [216]. La mutation des

deux sites indépendamment a montré le rôle majoritaire de la S266 dans cette

désensibilisation par la CAMKII [217]. Chez l’homme, il existe un

polymorphisme S268P correspondant à la S266 du récepteur MOP de rat. Ce

récepteur, exprimé dans les cellules HEK 293, n’est plus sensible à la

désensibilisation médiée par la CAMKII et le couplage à la protéine G est

diminué [217]. Plus récemment, des études de phosphorylation in vitro ont

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Kinase_des_cha%C3%AEnes_l%C3%A9g%C3%A8res_de_la_myosine&action=edit&redlink=1

47

montré la phosphorylation de la T370 par la CAMKII [218], ce qui suppose que

ce site pourrait aussi être régulé par cette enzyme.

II.1.3.2 Casein Kinases (CK)

Le groupe des kinases CK1 (Cell Kinase ou Casein Kinase) est un petit groupe

de kinases qui diffère des autres groupes de kinases dans la séquence d’un

motif conservé (3 acides aminés) du sous-domaine VII. Elles jouent un rôle

dans la transduction du signal, et notamment dans la voie Wnt. CK1 et CK2

sont impliquées dans la phosphorylation du récepteur muscarinique M3. CK1

est impliquée dans la désensibilisation de la réponse calcique du récepteur,

CK2 oriente la signalisation du récepteur vers la voie JunK [219,220].

II.1.4 Tyrosine Kinases

Ce groupe de kinases phosphoryle exclusivement les Tyrosines. Il est subdivisé

en deux sous-groupes : les tyrosine kinases membranaires, ou récepteurs

tyrosines kinases, et les tyrosine kinases cytosoliques ou non récepteur. On

trouve dans ce groupe les récepteurs aux facteurs de croissances (EGFR,

Epidermal Growth Factor Receptors, FGFR, Fibroblast Growth Factor

Receptors, Eph, récepteur à l’éphrine). Src, une tyrosine kinase cytosolique est

impliquée dans la phosphorylation de la Y366 du motif NPxxY du récepteur

MOP et induit un switch de couplage Gi vers Gs [221]. Elle pourrait aussi être

impliquée dans la phosphorylation de son motif DRY et induirait une

diminution de l’efficacité de couplage du récepteur [222].

II.1.5 GRK et désensibilisation homologue

II.1.5.1 Structure générale et mécanisme d’activation

Les GRK (G protein Receptor Kinases) sont des sérine/thréonine kinases de la

famille AGC, elles aussi activées en aval de la signalisation RCPG. Elles sont

impliquées dans la modulation de leur activité, fréquemment en l’inhibant. Il

existe 7 GRK. GRK1 et GRK7 sont majoritairement visuelles alors que GRK2-

GRK6 sont plus largement exprimées.


Figure 25: Représentation schématique des GRK et de leurs domaines.

Leur activation résulte d’un réarrangement induit par leur interaction avec le

RCPG activé. Toutes les GRK possèdent, en N-terminal, un domaine homologue

aux protéines RGS. Quatre types de GRK, GRK1, GRK4, GRK6 et GRK7 sont

modifiées post-traductionnellement par ajout d’un motif lipidique qui leur

permet d’être constamment associées à la membrane plasmique donc proche

du récepteur à phosphoryler.

GRK5 s’associe à la membrane grâce à des interactions ioniques [223]. GRK2 et

GRK3 ont en plus des autres kinases de la famille GRK un domaine PH

(pleckstrin homology) permettant l’interaction avec la membrane plasmique et

un rapprochement du récepteur à phosphoryler (figure 26), mais nécessitent

l’interaction avec G pour être recrutées [223,224]. Une étude récente a aussi

montré que GRK6 pouvait interagir avec Gi après activation du récepteur

CXCR2 [225].

II.1.5.2 Rôle des GRK dans la désensibilisation homologue des

RCPG.

Les GRK sont impliquées dans la désensibilisation homologue de nombreux

RCPG. Chez des souris délétées du gène codant pour la GRK5, la réponse à

l’agoniste non sélectif des récepteurs muscariniques, oxotremorine, est

Figure 26 : Mécanisme d'activation de GRK2 GRK2 est recrutée à la membrane par son domaine PH et se

lie au PIP2 et à la sous unité G libérée après activation d’un RCPG.

49

exacerbée, et sur extraits de cerveau la désensibilisation de ces récepteurs

mesurée par liaison du GTPS, est diminuée [226]. De même, les souris KO

pour la GRK6 montrent une sensibilisation de la réponse dopaminergique [227]

et les souris GRK3-/- montrent une diminution de la tolérance à certains

analgésiques opioïdes [228,229]. La stimulation par le DAMGO du récepteur

MOP exprimé dans les cellules HEK induit la phosphorylation des résidus

T370, S375, T376, T379. Le knock-down de différentes isoformes des GRK a

permis de démontrer l’implication des GRK2/3 dans ces phosphorylations

[230,231] (la phosphorylation du récepteur MOP par les différentes kinases

sera discutée plus en détail un peu plus loin). Sur neurones isolés du locus

coeruleus de souris [232], et/ou de rat [211], l’inhibition de la GRK2 par

l’inhibiteur ARK1 [232], ou l’expression de dominants négatifs de la GRK2 et

de la GRK6 réduit la désensibilisation du récepteur MOP induite par le DAMGO

mesurée en Patch Clamp. De façon similaire, la désensibilisation par le

DAMGO du récepteur MOP, exprimé dans les HEK est aussi fortement

diminuée après expression d’un dominant négatif de la GRK2 dans les cellules

HEK [213]. Il en est de même pour d’autres RCPG, comme par exemple le

récepteur 1-adrénergique. L’expression d’un dominant négatif de la GRK2

dans les cellules HEK diminue la phosphorylation du récepteur mesurée par

incorporation de [32P] et la désensibilisation du récepteur après stimulation par

l’oxymétazoline [233].

La phosphorylation des domaines intracellulaires des RCPG par les GRK

intervient donc dans la désensibilisation homologue de ces récepteurs mais un

autre mécanisme dépendant des GRK a été proposé dans la désensibilisation

du récepteur MOP. Ce mécanisme est indépendant de la phosphorylation.

Après avoir évalué la désensibilisation du récepteur vis-à-vis des canaux GIRK,

Raveh et al ont proposé le mécanisme selon lequel la GRK séquestrerait la

protéine G, l’empêchant d’activer ses effecteurs [234]. Cette hypothèse est

supportée par la résolution de la structure de GRK2 en interaction avec Gq et

G [235] qui suggère aussi qu’indépendamment de la phosphorylation,

l’interaction de la GRK avec la protéine G participe à l’arrêt de l’interaction

RCPG/protéine G et donc à la terminaison du signal.


Bien que la phosphorylation par les GRK permette la désensibilisation du

récepteur, elle n’est pas toujours suffisante pour inhiber totalement la

signalisation. L’inhibition complète de la transduction du signal nécessite des

protéines adaptatrices capables de lier le récepteur et de le découpler des voies

de transduction. Dans le modèle classique de désensibilisation homologue, la

phosphorylation des RCPG par les GRK augmente leur affinité pour la

arrestine. La liaison de la arrestine au RCPG abouti à son découplage de la

protéine G et à son adressage à la machinerie d’internalisation [236,237].

II.1.5.3 Régulation hétérologue et pharmacologique des GRK

Les GRK peuvent être régulés par autophosphorylation ou bien par d’autres

kinases comme la CAMKII, la PKA ou la PKC. L’interaction GRK/protéine G

peut être modulée par la PKA qui, en phosphorylant GRK2, peut augmenter sa

capacité à lier G et le récepteur activé [238]. La PKC est elle aussi capable de

moduler l’activité de GRK2, probablement en augmentant son association avec

la membrane et/ou le récepteur [239]. Son activation par un ester de phorbol

(PMA) résulte donc dans l’activation de GRK2 et dans la désensibilisation

accrue du récepteur AR [240]. A l’inverse, GRK5 perd son activité enzymatique

lorsque qu’elle est phosphorylée par la PKC [223,241]. GRK2 peut aussi être

phosphorylée par ERK et cette phosphorylation induit non seulement son

inhibition [242,243] mais aussi sa dégradation [244].

Les GRK et notamment la GRK2 peuvent être inhibées par l’utilisation de

traitements pharmacologiques tels que l’inhibiteur ARK1i et la paroxétine

[245,246].

II.1.6 Phosphorylation des RCPG, exemple du récepteur

MOP

Il existe sur le récepteur MOP, responsable de l’analgésie opioïde, de nombreux

sites possibles de phosphorylation (figure 27). Les phosphorylations induites

après stimulation ont pu être détectées, soit par des anticorps

phosphospécifiques [247,248] soit par spectrométrie de masse

[218,249,250,251,252] et impliquent différentes kinases dont les GRK. Ces

51

phosphorylations interviennent rapidement après activation du récepteur (dès

20 secondes après stimulation par le DAMGO pour les T370 et S375)

[231,247], de façon séquentielle et hiérarchique [231]. Le site phosphorylé en

premier lieu, la S375, est requis pour la phosphorylation des résidus T370,

T379, T376. Les agonistes opioïdes les plus efficaces comme le DAMGO

permettent une phosphorylation de tous ces résidus de l’extrémité C-terminale

du récepteur MOP dans les cellules HEK [230,231,247,251]. La morphine, qui

est un agoniste partiel, moins efficace que le DAMGO, permet principalement la

phosphorylation de la Ser375 [247].

Figure 27: Représentation schématique du récepteur MOP de souris et des sites de phosphorylation putatifs du C-terminal. Jaune: S356/T357 aucun anticorps phosphospécifiques disponible; bleu: S363 phosphorylation constitutive; vert: T370 phosphorylation homologues et hétérologue; orange: S375, T376 et T379 phosphorylation homologue, avec une exception pour la S375 (voir texte), gris : pas de phosphorylation détectée [209].

La phosphorylation du résidu Ser375 initiant la cascade de phosphorylation

met en jeu GRK2/3 ou GRK5 selon les agonistes [230,253] et la

phosphorylation des autres résidus met en jeu GRK2 et GRK3 [230,231]. Dans

ces mêmes cellules, l’expression d’un dominant négatif GRK2 bloque la

désensibilisation du récepteur MOP induite par le DAMGO mais pas par la

morphine [213]. Les souris déficientes pour la GRK5 montrent une diminution

de la phosphorylation du résidu Ser375 induite par la morphine, suggérant

que GRK5 est, au moins en partie, impliquée dans la phosphorylation de ce

résidu pour cet agoniste [230]. Dans les cellules HEK la mutation de ce site de

phosphorylation (Ser375) bloque la désensibilisation du récepteur [253], et

chez les souris déficientes pour ce site de phosphorylation (KI MOP S375A), la

tolérance à l’analgésie opioïde induite par le DAMGO est diminuée [254], alors

que la délétion est sans effet dans le cas de la tolérance induite par la

morphine.


Les phosphorylations du récepteur MOP peuvent aussi être régulées de façon

hétérologue. En effet, nous avons vu (chapitre désensibilisation hétérologue par

la PKC) que la PKC est impliquée dans la désensibilisation du récepteur MOP.

Les récentes études ayant utilisé des anticorps phosphospécifiques ont

démontré que la phosphorylation sur le résidu T370 par la PKC est dépendante

de la concentration en PMA dans les cellules HEK-293 [247]. Le knockdown de

différentes isoformes de la PKC par des siRNA spécifiques a permis de préciser

que l’isoforme impliquée était la PKC [210]. La phosphorylation du résidu

T370 induite par le PMA est toutefois plus lente que la phosphorylation

homologue induite par le DAMGO. De plus, elle intervient de façon

indépendante de la phosphorylation homologue car l’inhibition de la PKC

n’influe pas sur cette phosphorylation après stimulation par le DAMGO. Il est

aussi intéressant de constater que la phosphorylation de la T370, induite par

la stimulation hétérologue du récepteur NK1 par la substance P, est aussi

médiée par la PKC [210] et entraine l’internalisation du récepteur. Les

mécanismes de régulation homologue et hétérologues des phosphorylations du

récepteur MOP sont donc bien distincts [209]. D’autres études ont aussi

rapporté la phosphorylation du récepteur MOP après stimulation d’un autre

RCPG. Par exemple, la stimulation du récepteur NPFF2 par le 1DMe, induit la

phosphorylation du résidu S375 du récepteur MOP, lorsqu’ils sont coexprimés

dans les cellules SH-SY5Y [249]. De façon surprenante, cette phosphorylation

apparait médiée par la GRK2, suggérant que cette kinase peut aussi être

impliquée dans la phosphorylation hétérologue.

Comme nous l’avons vu précédemment, d’autres kinases sont impliquées dans

la phosphorylation du récepteur MOP. La tyrosine kinase Src semble être

impliquée dans la phosphorylation de la Y366 [221] et probablement la Y166,

induisant un switch de couplage Gi/Gs. La CAMKII semble impliquée dans la

phosphorylation des résidus S261/S266 du récepteur de rat [216] ou S268 du

récepteur humain [217]. La T180 semble aussi être le substrat de la GRK3 car

sa mutation en alanine diminue la désensibilisation médiée cette kinase [255].

Deux autres résidus ont aussi été montrés comme jouant un rôle important

dans la désensibilisation du récepteur induite par le DAMGO, les S355 et S357

[256].

53

Site de

phosphorylation

Traitement/ type de

régulation Kinase Type cellulaire, tissu

Identification en spectrométrie de

masse/Stimulation

T180 DAMGO (homologue) GRK3 ovocytes de xenope [255] (-)

S261/S266 CAMKII (hétérologue) CAMKII HEK293 [216] (-)

Y166/Y366 Src (hétérologue) Src [221] (-)

S355 DAMGO

HEK293 [256] (-)

S356

Morphine, DAMGO [257]

S357 DAMGO

HEK293 [256] Morphine, DAMGO [257]

S363 Constitutive PKC

HEK293 [210,231]; tissu cérébral [210] Constitutive [257], Ser365(hMOP) [249],

[251]

PMA (hétérologue) PKC CHO [250]

T370

DAMGO (homologue) GRK2/3 HEK293 [230]

Morphine, DAMGO [257], [251], T378 (hMOP) DAMGO et 1DMe [249]

PMA (hétérologue) PKC HEK293 [210]

CAMKII (hétérologue) CAMKII In vitro [257]

S375 Morphine (homologue) GRK5

HEK293 [230], tissu cérébral

[230] Morphine, DAMGO [257], [251], S377 (hMOP) DAMGO et 1DMe [249]

DAMGO (homologue) GRK2/3 HEK293 [230]

T376 DAMGO (homologue) GRK2/3 HEK293 [231] DAMGO et 1DMe [249]

T379 DAMGO (homologue) GRK2/3 HEK293 [231] Ambiguïté

Tableau 4: Compilation des sites de phosphorylations identifiés du récepteur MOP, des kinases impliquées et les types cellulaires dans lesquels ces sites ont été identifiés. Adapté de Mann 2014 [209]

Cependant tous les résidus phosphorylables identifiés par mutagénèse, n’ont

pas été retrouvé phosphorylé après stimulation par les agonistes en

spectrométrie de masse ou détecté par les anticorps phosphospécifiques. C’est

le cas des tyrosines (Y166 et 366), de la S355 et la T180. Les données sur la

phosphorylation du récepteur MOP sont rassemblées dans le tableau 4.

Le récepteur MOP n’est pas un cas particulier. La phosphorylation et la

désensibilisation d’autres RCPG peuvent aussi impliquer de multiples kinases

et sont différentes selon les agonistes. Par exemple, la désensibilisation du

récepteur DOP peut être médiée par la GRK2, la PKC et une/des tyrosine

kinases après stimulation par l’agoniste alcaloïde étorphine. Par contre, la

désensibilisation du récepteur induite par les agonistes peptidiques,

deltorphine et DPDPE n’est pas affectée par l’inhibiteur PKC ou l’expression

d’un dominant négatif de la GRK2 [258].

La phosphorylation des RCPG est impliquée dans la désensibilisation et

implique des kinases différentes. Ces phosphorylations interviennent sur des


résidus spécifiques, dépendent du ligand et nous allons le voir, peuvent avoir

des fonctions diverses, notamment en terme de signalisation.

II.1.7 Rôle de la phosphorylation dans la sélectivité

fonctionnelle

La phosphorylation des RCPG par les protéines kinases induit principalement

une désensibilisation fonctionnelle de ces récepteurs. Cependant, la

phosphorylation peut aussi intervenir dans la sélectivité fonctionnelle,

notamment dans la spécificité du couplage. C’est le cas du récepteur 2AR

dont la phosphorylation du résidu serine 263, médiée par la PKA, induit un

switch de couplage Gs/Gi en système reconstitué [259] et dans les cellules

HEK 293 [260]. Cette spécificité de couplage aboutit à l’initiation d’une voie de

signalisation passant par l’activation de ERK. Un switch de couplage du même

type a été rapporté pour le récepteur murin aux prostacyclines [261]. Ce

récepteur exprimé dans des cellules HEK peut activer Gs, Gi, et Gq. Le

couplage aux protéines Gi et Gq est dépendant du couplage à Gs et de la

phosphorylation par la PKA. Après mutation de la sérine 357, le récepteur ne

pouvant plus être phosphorylé par la PKA, n’est plus capable d’activer Gi et Gq.

Le récepteur humain possède, en place du site de phosphorylation PKA, un site

PKC. Ce récepteur est capable d’activer Gi et Gq. Si le site PKC est remplacé

par un site PKA, alors le récepteur est capable d’activer Gs. Cette capacité est

perdue lorsque la sérine substrat est mutée [262]. C’est aussi le cas pour le

récepteur MOP qui, comme nous l’avons vu, est couplé Gs plutôt que Gi après

phosphorylation par Src [221]. La phosphorylation d’un résidu précis peut

donc amener à l’activation ou l’inactivation d’une voie de signalisation

spécifique. Cette modification est donc un évènement déterminant dans le

choix de la signalisation et la régulation des RCPG. Récemment, la génération

d’anticorps phosphospécifiques a permis d’étudier plus précisément le code des

phosphorylations des RCPG. Butcher et al [263] ont étudié le profil de

phosphorylation du récepteur M3 muscarinique et ont émis l’hypothèse que les

biais de signalisation et la spécificité de signalisation selon les tissus dépendait

du profil de phosphorylation du récepteur. Grâce à l’utilisation d’anticorps

phosphospécifiques, ils ont pu démontrer que le profil de phosphorylation du

récepteur dépendait du type cellulaire dans lequel il était exprimé, mais aussi

55

du stimulus. Les différents agonistes peuvent induire des phosphorylations de

façon préférentielle sur certains résidus spécifiques. La phosphorylation

préférentielle induite par ces ligands selon le type cellulaire pourrait donc

expliquer la sélectivité fonctionnelle des récepteurs et leurs fonctions tissu-

spécifiques. Le profil de phosphorylation des récepteurs serait donc une sorte

de code barre déterminant la voie de signalisation à activer. L’hypothèse du

code barre de phosphorylation est aussi supportée par l’étude de Nobles et al

sur le récepteur 2AR [264]. Lors de cette étude, les sites de phosphorylation

du récepteur exprimé dans les cellules HEK-293, ont été identifiés par

spectrométrie de masse, après stimulation par l’isoprotérénol. Ils ont ensuite

étudié les phosphorylations, individuellement, grâce à des anticorps

phosphospécifiques. Les sites de phosphorylation ont pu être comparés après

stimulation du récepteur par différents agonistes et les kinases impliquées

dans ces phosphorylations ont été déterminées. Le carvedilol, un agoniste

biaisé -arrestine induit un profil de phosphorylation différent de l’agoniste

plein (isoprotérénol). Alors que l’isoprotérénol induit le recrutement de la GRK2

et de la GRK6, le carvedilol permet, uniquement, la phosphorylation du

récepteur par la GRK6. Ce type de phosphorylation correspond pleinement à la

nature biaisé du ligand et au processus d’activation de la GRK2 : le carvédilol

n’active pas la protéine G, donc la GRK2 ne peut pas être recrutée à la

membrane via G. Le code barre de phosphorylation induit par les deux

kinases induit la désensibilisation du récepteur, mais seule la phosphorylation

par la GRK2 permet l’internalisation du récepteur. Le code barre de

phosphorylation induit par différentes kinases semble donc déterminant dans

l’interaction avec la -arrestine et donc dans la conformation qu’elle adopte.

De la même manière, le code barre de phosphorylation a été étudié par Doll et

al [247] sur le récepteur MOP afin de mieux comprendre les différences de

trafic intracellulaire du récepteur selon les agonistes. La génération d’anticorps

phosphospécifiques a, là aussi, permis de déterminer la différence de profil de

phosphorylation induit par les agonistes opioïdes. Le profil de phosphorylation

du récepteur MOP a aussi été étudié par spectrométrie de masse [251]. Ces

études démontrent la multi-phosphorylation du récepteur MOP après

stimulation par un agoniste plein, tel que le DAMGO, contrairement aux

agonistes partiels comme la morphine. Cette différence de profil de


phosphorylation est lié à la capacité des agonistes à induire l’internalisation du

récepteur. Par exemple, la morphine est un faible inducteur d’endocytose alors

que le DAMGO est un fort inducteur. Dans un système modèle surexprimant la

GRK2 [265] ou la -arrestine [266] l’internalisation du récepteur induite par la

morphine est facilitée. En substituant la partie C-terminale du récepteur MOP

par la partie C-terminale du récepteur DOP qui est un meilleur substrat à la

phosphorylation, Whistler et al ont démontré que l’augmentation de la

phosphorylation était corrélée avec le recrutement de la -arrestine [267]. En

combinant la pharmacologie du récepteur MOP et la capacité du récepteur DOP

à être phosphorylé, le récepteur chimérique devient un meilleur substrat pour

la phosphorylation et peut rapidement être internalisé. Plusieurs études ont

ensuite démontré que pour être internalisé, le récepteur MOP doit

nécessairement être multi-phosphorylé sur le cluster de résidus du C-ter

[230,231,247]. La morphine n’induisant pas la totalité des phosphorylations du

C-ter n’induit que peu d’endocytose, alors que le DAMGO qui phosphoryle la

totalité des sites du cluster est un fort inducteur d’endocytose [209,231]. La

corrélation entre la phosphorylation et l’interaction avec la -arrestine a aussi

été démontrée après phosphorylation in vitro de la partie C-terminale du

récepteur MOP par les kinases purifiées GRK2, PKC ou CAMKII avec une

augmentation de l’interaction avec la -arrestine plus forte après

phosphorylation par la GRK2, comparé au fragment non phosphorylé [257].

Chaque agoniste induit donc un profil de phosphorylation plus ou moins

favorable à l’interaction avec la -arrestine et donc à l’internalisation.

Le rôle de la phosphorylation dans la modulation de l’activité des RCPG est

donc crucial. Les processus mis en jeu sont particulièrement complexes et

spécifiques. Elle est impliquée dans la désensibilisation, l’interaction avec la -

arrestine, dans la sélectivité fonctionnelle et dans l’internalisation. L’étude de

ces sites de phosphorylation, du code barre de phosphorylation induit par les

différents agonistes et leurs rôles fonctionnels est donc d’un intérêt majeur

pour la compréhension des mécanismes de la régulation de l’activité RCPG.

57

II.2 Ubiquitination

Alors que la signalisation des RCPG est régulée par la phosphorylation,

amenant à la désensibilisation, au recrutement de la -arrestine et à

l’internalisation consécutive du récepteur, d’autres modifications post-

traductionnelles ont été révélées comme jouant un rôle important dans le trafic

mais aussi la signalisation de ces récepteurs. L’une de ces modifications est

l’ubiquitination. Cette modification est, contrairement à la glycosylation et la

palmitoylation, une modification réversible. Elle joue donc un rôle important

dans la régulation de l’activité des RCPG. Des études récentes ont démontré le

lien entre la phosphorylation, le recrutement de la -arrestine et

l’ubiquitination de certains RCPG [268].

L’ubiquitine est une chaine peptidique de 76 acides aminés. L’ubiquitination

est un processus ATP-dépendant, mettant en jeu, l’action séquentielle de

plusieurs enzymes : l’ubiquitine activating enzyme (E1), l’ubiquitin conjugating

enzyme (E2) et l’ubiquitine ligase (E3). Le transfert de l’ubiquitine s’effectue sur

un résidu lysine de la protéine cible. De même que la phosphorylation,

l’ubiquitination est une modification transitoire pouvant être retirée via des

déubiquitinases (DUBs). L’ubiquitination est un processus d’une grande

spécificité, notamment grâce à la grande variété d’E3 qui reconnaît

spécifiquement le substrat. Certaines de ces ubiquitine ligases (Nedd4-like)

reconnaissent par exemple les phospho-sérines et phospho-thréonines

adjacentes à un motif riche en proline [269]. L’ubiquitination régule de

nombreuses fonctions cellulaires et le type d’ubiquitination dirige les

conséquences fonctionnelles de la modification et le devenir de la protéine

modifiée. L’ubiquitine peut, elle-même, être ubiquitinée sur plusieurs résidus

lysine. La poly-ubiquitination qui en résulte a pour conséquence l’adressage au

protéasome de la protéine modifiée et donc sa dégradation. L’ajout d’une seule

ubiquitine sur un résidu (mono-ubiquitination) ou plusieurs résidus lysine

(multi-ubiquitination) ont des fonctions différentes, indépendante du

protéasome, incluant la régulation de l’endocytose. De nombreuses protéines

impliquées dans le trafic intracellulaire possèdent des domaines de liaison à

l’ubiquitine. Reconnaissant ainsi cette modification sur les RCPG, elles

régulent l’endocytose de certains, mais aussi leur adressage au lysosome [270].


Les récepteurs opioïdes sont régulés par l’ubiquitination de façon agoniste

dépendante. Contrairement à la morphine, le DAMGO induit l’ubiquitination

du récepteur MOP et sa dégradation par la voie lysosomiale. C’est ici un autre

exemple d’agonisme biaisé. L’ubiquitination induite par le DAMGO est un

mécanisme dépendant de la -arrestine 1, où elle semble jouer le rôle

d’adaptateur pour l’E3 [271]. La morphine qui ne recrute pas la -arrestine 1

n’entraine pas l’ubiquitination. Le trafic du récepteur PAR1 est lui aussi régulé

par l’ubiquitination. PAR1 internalise via des puits de clathrine par un

processus indépendant de la -arrestine. Pour être internalisé, PAR1 doit être

ubiquitinylé afin de permettre sa reconnaissance par l’epsine et phosphorylé

pour interagir avec AP-2 [272]. L’ubiquitination joue également un rôle dans la

régulation du récepteur CXCR4. Dans les cellules modèle HEK, une ubiquitine

ligase de la famille Nedd4-like (AIP4), semble interagir directement avec

certains résidus sérine et thréonine phosphorylés du récepteur CXCR4. Ces

résidus sont déterminants dans l’ubiquitination consécutive et la dégradation

du récepteur après activation [273]. Plus récemment, le rôle de l’ubiquitination

s’est révélé plus complexe. Une étude a montré son implication dans

l’adressage du récepteur aux micro-domaines membranaires, mais aussi dans

sa signalisation. En effet, CXCR4 active la voie des MAPK via la protéine Gi, et

requiert l’interaction avec AIP4 afin de l’adresser au raft, puisque cette

activation est inhibée après déplétion en cholestérol ou cavéoline-1 [274].

L’ubiquitination est donc une autre modification post-traductionnelle impliquée

dans la régulation de l’activité des RCPG, notamment en régulant leur traffic

intracellulaire, leur dégradation, mais aussi dans leur signalisation.

Les modifications post-traductionnelles, et en particulier la phosphorylation,

sont donc d’une importance majeure dans la régulation de l’activité des RCPG.

Elles déterminent la voie de transduction activée en sélectionnant le couplage

du récepteur avec ses effecteurs, l’efficacité de la réponse, mais aussi la

désensibilisation, le recrutement de protéines adaptatrices comme la -

arrestine, l’internalisation et le devenir du récepteur.

L’étude de ces modifications est d’un intérêt majeur dans la compréhension de

la pharmacologie des RCPG.

59

III. INTERNALISATION DES RCPG

Selon le modèle classique de régulation des RCPG, le récepteur, une fois activé

puis phosphorylé, est rapidement internalisé afin de terminer la signalisation.

Il existe différents mécanismes d’internalisation des RCPG et nous allons le

voir, l’implication de l’internalisation dans la désensibilisation et la terminaison

de la signalisation n’est pas aussi claire que le décrit le modèle classique.

III.1 arrestines et internalisation dépendante du

ligand

Nous l’avons vu (chapitre signalisation des RCPG), les -arrestines sont

impliquées dans la transduction du signal, notamment dans l’activation de la

voie ERK [275] et sont à l’origine de la notion d’agonisme biaisé. Les -

arrestines sont des protéines multifonctionnelles, jouant aussi un rôle majeur

dans le trafficking des RCPG.

La découverte des -arrestines découle d’études sur la désensibilisation du

récepteur 2AR. En systèmes purifiés (vésicules de phospholipides contenant la

protéine Gs, le récepteur et la GRK), alors que la GRK2 avait une activité

enzymatique importante et phosphorylait le récepteur avec une grande

efficacité, elle perdait sa capacité à inactiver le récepteur. Cette fonction était

restaurée après addition de -arrestine visuelle [276], montrant le rôle majeur

de cette protéine dans le découplage de la protéine G. Depuis, quatre membres

fonctionnels ont été clonés. Deux arrestines visuelles (arrestine 1 et 4) et deux

arrestines non visuelles (arrestine 2 ou -arrestine 1 et arrestine 3 ou -

arrestine 2). Les arrestines 1 et 2 sont ubiquitaires et exprimées à de hauts

niveaux dans le système nerveux central et le foie [237].

Les -arrestines ont, en plus de leur capacité à découpler le RCPG de sa voie de

transduction, la capacité d’interagir avec les composants de la machinerie

d’endocytose. Ainsi, elles se comportent comme des adaptateurs permettant

l’internalisation des récepteurs via les puits de clathrine. Cette fonction est

importante, non seulement dans la régulation de l’activité des RCPG, mais

60 Introduction: Internalisation des RCPG

aussi pour moduler l’expression des récepteurs à la membrane

(downrégulation) et leur resensibilisation.

Après phosphorylation par une GRK, la -arrestine se lie au récepteur

phosphorylé. Très récemment, la structure du récepteur 2AR en interaction

avec la-arrestine 1 a été résolue [277] et montre l’importance de l’interaction

de cette dernière avec la partie C-terminale phosphorylée du récepteur (figure

28). Mais la -arrestine reconnait, en plus des phosphorylations, la

conformation du cœur du récepteur [277].

Une fois recrutée par le récepteur, la -arrestine permet le recrutement de la

protéine adaptatrice AP2 permettant à son tour le recrutement des triskèles de

clathrine (figure 29). La complexation des triskèles permet l’invagination de la

membrane plasmique contenant le récepteur. Une petite GTPase, la dynamine

pourra alors fusionner les deux extrémités de la membrane plasmique et

provoquer leur scission. La vésicule d’endocytose ainsi formée pourra, via le

cytosquelette de la cellule, être acheminée vers l’intérieur pour être destinée au

recyclage ou à la voie de dégradation lysosomiale [278].

b

a Figure 28: Structure du domaine

d'interaction de la -arrestine 1

avec le récepteur 2AR. (a) vue de

l’interface -arrestine 1/2AR, et

des différents acides aminés impliqués dans l’interaction. (b)

modélisation de l’interaction. La -

arrestine interagit avec la partie C-terminale phosphorylée du récepteur puis avec le cœur formé par les segments transmembranaires du récepteur. En jaune, le C-ter phosphorylé, en

bleu: la-arrestine 1, en orange le

récepteur 2AR

61

Figure 29: Schéma général des étapes de l’internalisation des RCPG [237]. Après stimulation du récepteur par son agoniste, la protéine G activée se dissocie afin d’aller réguler les effecteurs de la signalisation intracellulaire. Le récepteur est ensuite désensibilisé (en 1) grâce à la phosphorylation par les GRK. Une

fois phosphorylé, l’affinité du récepteur pour la -arrestine augmente et permet la formation d’un

complexe RCPG--arrestine. La-arrestine permet le recrutement de la protéine adaptatrice AP2 et le

recrutement des triskèles de clathrine. Le manteau de clathrine permet l’invagination de la membrane plasmique et la GTPase dynamine termine la formation de la vésicule en effectuant la scission de la

membrane plasmique. Une fois internalisé (en 2), la-arrestine se dissocie du récepteur qui est ensuite déphosphorylé par des phosphatases (ici PP2A). Le récepteur peut être ensuite soit recyclé à la

membrane, soit dégradé par la voie lysosomiale. Les récepteurs de classe B ne se dissocient pas de la -

arrestine et sont soit directement dégradés, soit recyclés.

III.1.1 Lien entre internalisation et désensibilisation

En comparant plusieurs agonistes opioïdes et leur capacité à désensibiliser le

récepteur MOP, Alvarez et al ont mis en évidence une corrélation entre

désensibilisation et internalisation [279], ce qui correspondait bien au modèle

classique de désensibilisation des RCPG. Pourtant, ce principe a été remis en

question car plus récemment des études ont montré la capacité de la morphine

à induire la désensibilisation malgré une faible internalisation [280].

L’utilisation d’un ligand fluorescent sur neurones du locus coeruleus a permis

de mesurer de façon concomitante l’internalisation et la désensibilisation du

récepteur MOP. Après blocage de l’internalisation avec la concanavaline A,

l’accumulation intracellulaire de fluorescence était inhibée, mais n’affectait en

rien la désensibilisation du récepteur mesurée en électrophysiologie. Ces


résultats suggèrent que la désensibilisation ne dépend pas strictement de

l’internalisation [281]. Désensibilisation n’est donc pas toujours synonyme

d’internalisation, mais inversement, internalisation n’est pas toujours

synonyme de désensibilisation. En effet, ce même ligand fluorescent, DERM-

A594, micro-injecté dans la substance grise périaqueducale (PAG), produit un

effet analgésique chez le rat en agissant sur les récepteurs MOP. En bloquant

l’internalisation grâce à la micro-injection de concanavaline A ou d’un

dominant négatif de la dynamine, Macey et al ont montré une diminution de

l’analgésie, suggérant qu’une partie importante de la signalisation du récepteur

MOP dépend de l’internalisation [282]. Une autre étude sur le récepteur PTH

(Parathyroïde Hormone) a participé à la remise en cause du modèle classique

de désensibilisation. La méthode du FRET a permis de comparer la production

d’AMPc induite par activation du récepteur PTH avec deux ligands différents.

Les résultats montrent que les ligands testés, PTH et PTHrP (Parathyroïd

hormone related peptides) induisent des réponses différentes, notamment dans

la durée de production d’AMPc. Alors que l’action de PTHrP est restreinte à la

membrane, PTH est capable d’induire la production d’AMPc alors même que le

récepteur est internalisé. PTHR après internalisation peut donc rester couplé à

Gs. D’autres études ont rapporté une signalisation des RCPG dans les

endosomes. C’est le cas par exemple du récepteur PAR2 [114] et du récepteur à

l’angiotensine II, AT1A [119] pour lesquels une signalisation indépendante des

protéines G a été observée dans les endosomes. L’activation de ERK apparait

dans ce cas médiée par la -arrestine et constitue une seconde vague de

signalisation distincte de la signalisation par les protéines G à la membrane

plasmique.

III.2 Internalisation constitutive/recyclage

L’internalisation constitutive s’oppose à l’internalisation dépendante du ligand

par le fait que les récepteurs internalisés n’ont pas, au préalable, été activés

par leur ligand et phosphorylés. L’internalisation indépendante du ligand a été

pour la première fois rapportée pour le récepteur DOP [283]. Dans le cas du

récepteur à la galanine (GalR2), l’inhibiteur du recyclage, monensin réduit

l’expression du récepteur à la membrane et augmente son accumulation dans

les vésicules cytoplasmiques [284] de plus, l’inhibition de l’internalisation par

63

le methyl-β-cyclodextrin (MβCD), l’abaissement de la température ou les fortes

concentrations en sucrose, augmente l’expression du récepteur à la membrane.

De plus le récepteur est colocalisé avec la transferrine suggérant que cette

internalisation constitutive s’effectue via les puits de clathrine. Cette réserve de

récepteurs naïfs intracellulaire, protégés de la stimulation, pourrait servir à

renouveler le pool de récepteurs à la membrane, désensibilisés, et ainsi

permettre une resensibilisation rapide sans nécessité de synthèse de novo

[285].

III.3 Internalisation indépendante des -arrestines

La majorité du trafic des RCPG s’effectue via une endocytose -

arrestine/clathrine dépendante [286]. Cependant, d’autres mécanismes

d’internalisation ont été décrits, comme l’internalisation indépendante des -

arrestines. Ce type de mécanisme a pu être observé notamment pour les

récepteurs muscariniques M1–M4 à l’acétylcholine (ACh) et 5HT2A [287,288].

Grace à l’utilisation de dominants négatifs de la -arrestine et de la dynamine

ces études ont montré pour ces récepteurs une internalisation dépendante de

la dynamine et indépendante de la -arrestine. La même observation a été faite

pour le récepteur PAR1 [289] et le récepteur LTB4-1 dont l’internalisation

nécessite la phosphorylation par la GRK2 mais pas la -arrestine [290]. Ces

études démontrent l’existence de protéines adaptatrices alternatives dans les

mécanismes d’internalisation des RCPG. L’un de ces adaptateurs est la

protéine AP2, qui peut se lier directement au récepteur en absence de -

arrestine [278]. C’est le cas pour le récepteur PAR1 qui interagit avec cette

protéine plutôt qu’avec la -arrestine pour internaliser [272,291].

III.4 Internalisation indépendante de la clathrine,

les cavéoles

Les cavéoles sont de petites structures membranaires circulaires invaginées de

50 à 100 nm de diamètre, présentes sur certains types cellulaires [292]. Elles

sont riches en cholestérol et glycosphingolipides, comme les rafts lipidiques,

mais possèdent en plus des protéines qui leur sont spécifiques, les cavéolines.

Pour former la vésicule, les cavéolines s’oligomérisent, s’associent avec des


protéines adaptatrices, les cavines. Cet ensemble forme un manteau

recouvrant la vésicule. La scission de la vésicule dépend, comme pour les puits

de clathrine, de la GTPase dynamine [293]. Les cavéoles sont des micro-

domaines spécifiques qui représentent pour certains RCPG des plateformes de

signalisation préférentielles [286,294]. La phosphorylation, au même titre que

d’autres modifications post-traductionnelles, peut adresser les récepteurs vers

ces micro-domaines. C’est le cas du 1AR qui pour être transloqué et

internalisé par le mécanisme des cavéoles doit être phosphorylé par la PKA

[295].

Il existe donc différents modes d’internalisation des RCPG. Chacun de ces

modes pourrait avoir des destinations intracellulaires différentes et des

fonctions différentes. Dans le schéma classique de régulation des RCPG,

l’internalisation joue un rôle déterminant dans l’arrêt de leur signalisation,

cependant ce n’est pas toujours le cas, ce processus peut aussi rendre compte

de différences subtiles dans la signalisation. L’internalisation des RCPG est

donc d’une importance majeure dans la modulation de leur activité.

65

IV. LE RECEPTEUR NPFF2

IV.1 Le système NPFF,

un système multi-ligands/multi-récepteurs

IV.1.1 Les peptides NPFF

Le neuropeptide FF (FLFQPQRFa) est un neuropeptide amidé (RFa en C-

terminal) présent chez les mammifères. Sa découverte a pour origine la

purification d’un peptide cardioexcitateur apparenté chez le mollusque, le

FMRFa. L’utilisation d’anticorps dirigés contre ce peptide a permis de détecter

par immunohistochimie la présence de peptides apparentés dans le cerveau de

mammifère [296]. Plus tard, ces anticorps utilisés cette fois en

radioimmunoassay ont aidé à isoler du cerveau de bœuf deux peptides

possédant en C-terminal le motif PQRFa : le NPFF et le NPAF [4]. Alors que

Yang et Boer découvraient ces ligands chez le Bœuf, Dockray et al.[297]

isolaient grâce à des anticorps dirigés contre le FMRFa, cette fois chez le

poulet, une autre famille de peptides de type RFa mais possédant une

extrémité C-terminale légèrement différente : LPxRFa (où x représente une L

ou Q). Le clonage des gènes codant pour ces peptides a ensuite permis de

découvrir qu’ils dérivaient de deux précurseurs [5,6,298,299]. Dans la

séquence prédite par ses précurseurs se trouvaient plusieurs peptides, dont

certains avaient déjà été identifiés : les peptides NPFF et les peptides RFRP

(figures 30 et 31). Ces deux précurseurs furent alors dénommés Pro-NPFFA et

Pro-NPFFB [300].

Figure 30: Séquence du précurseur Pro-NPFFA et des peptides de la famille RFamide chez l’homme, le rat et la souris. Les peptides prédits par les sites de maturation sont représentés en gras. En italique : les sites de clivage, après une glycine, permettent l’amidation des peptides [5].

On trouve dans le précurseur Pro-NPFFA des peptides à extrémité C-terminale

PQRFa (NPFF, NPAF/NPSF) et dans le précurseur Pro-NPFFB des peptides à

NPAF

Souris MDSK-WAALLLLLLLLLNWGHTEEAGSWGE-DQVFAGEDKGPHPPQYAHIPDRIQTPGSL 58 Rat MDSK-WAAVLLLLLLLRNWGHAEEAGSWGE-DQVFAEEDKGPNPSQYANTPDRIQTPGSL 58 Humain MDSRQAAALLVLLLLIDG-GCAEGPGGQQE-DQLSAEEDSEPLPPQDA------QTSGSL 52 Souris FRVLLQAMDTPRRSPAFLFQPQRFGRSAWGSWSKEQLNPQARQ-----FWSLAAPQRFGKK 114 Rat MRVLLQAMERPRRNPAFLFQPQRFGRNAWGPWSKEKLSPQARE-----FWSLAAPQRFGKK 114 Humain LHYLLQAMERPGRSQAFLFQPQRFGRNTQGSWRNEWLSPRAGEGLNSQFWSLAAPQRFGKK 113

NPSF

NPFF

66 Introduction : Le récepteur NPFF2

extrémité C-terminale PQRFa (RFRP3/NPVF) ou bien LPLRFa (RFRP1). L’étude

du rôle physiologique des peptides RFRP a permis de démontrer une inhibition

de la libération de GnRH chez la caille [301]. Ces peptides furent alors nommés

GnIH. Ils dérivent du précurseur pro-NPFFB qui contient deux GnIH

apparentés GnIH-RP1 et GnIH-RP2 [297,302]. Leurs orthologues chez l’homme

sont aussi appelés RFRP1 et RFRP3/NPVF.

La famille des neuropeptides RFamide contient aussi les PrRP (prolactin

releasing related peptides), le 26RFa et la Kisspeptine [303].

Rat MEIISSKRFILLTLATSSFLTSNTLCSDELMMPHFHSKEGYGKYYQLRGIPKGVKERSVT 60

Souris MEIISLKRFILLTVATSSFLTSNTFCTDEFMMPHFHSKEGDGKYSQLRGIPKGEKERSVS 60

Homme MEIISSKLFILLTLATSSLLTSNIFCADELVMSNLHSKENYDKYSEPRGYP--KGERSLN 58

Rat ----KD------IKMSPAPANKVPHSAANLPLRFGRNIEDRRSPRARA--------NMEA 102

Souris FQELKDWGAKNVIKMSPAPANKVPHSAANLPLRFGRTIDEKRSPAARV--------NMEA 112

Homme FEELKDWGPKNVIKMSTPAVNKMPHSFANLPLRFGRNVQEERSAGATANLPLRSGRNMEV 118

Rat GTMSHFPSLPQRFGRTTARR-ITKTLAGLPQKSLHSLASSELLYAMTRQHQEIQSPGQEQ 161

Souris GTRSHFPSLPQRFGRTTAR--SPKTPADLPQKPLHSLGSSELLYVMICQHQEIQSPGGKR 170

Homme SLVRRVPNLPQRFGRTTTAKSVCRMLSDLCQGSMHSPCANDLFYSMTCQHQEIQNPDQKQ 178

NPVF / RFRP3/GnIH

Rat PRKRVFTETDDAERKQEKIGNLQPVLQGAMKL 193

Souris TRRGAFVETDDAERKPEK-------------- 188

Homme SRRLLFKKIDDAELKQEK-------------- 196

Figure 31: Séquence du précurseur Pro-NPFFB, membre de la famille RFamides chez l’Homme, le rat et la souris. Le peptide prédit par le site de maturation est représenté en rouge et gras. En italique : le site de clivage, après une glycine, permettent l’amidation du peptide [6].

Selon le site de clivage du précurseur au niveau d’un résidu basique, il

semblerait que ce ne soit pas le NPFF qui soit libéré mais un peptide de onze

acides aminés. De plus, il existe des différences quant aux peptides

potentiellement générés selon les espèces. Le NPA-NPFF ou SPA-NPFF ont été

isolés chez le rat et la souris respectivement [5,304]. Il en serait de même pour

le NPSF (forme courte du NPAF) dont la forme allongée en N-terminal : EFW-

NPSF chez le rat, présente une meilleure affinité pour les sites NPFF que le

NPSF, sur coupe de moelle épinière de rat [305]. Chez l’homme et chez le bœuf,

le pro-NPFFB génèrerait 3 peptides (RFRP1, RFRP2, RFRP3) alors que chez le

rat ou la souris, seulement deux seraient générés (RFRP1 et RFRP3). De plus

la longueur de ces peptides est différente selon les espèces. Le RFRP3 ou NPVF

par exemple, est constitué, chez le bœuf [306], de 28 acides aminés alors que

GnIH/RFRP1 RFRP2

67

chez le rat [307] il est de 18 acides aminés et chez l’homme de 8 acides aminés

[308].

IV.1.2 Les récepteurs NPFF

Les peptides dérivés des deux précurseurs agissent via deux RCPG : les

récepteurs NPFF1 et NPFF2, identifiés par clonage dans les années 2000

[6,303,309,310]. Les peptides dérivés du pro-NPFFA ont une meilleure affinité

pour le récepteur NPFF2 ou GPR74 et ceux dérivant du pro-NPFFB agissent

préférentiellement via le récepteur NPFF1 ou GPR147 [299,311,312]. L’affinité

des ligands NPFF pour les récepteurs NPFF1 et NPFF2 est de l’ordre du

nanomolaire, et la sélectivité reste modérée (S1/2, tableau 5).

Afin de rechercher des ligands plus sélectifs, l’étude de la structure et de

l’activité des ligands NPFF s’oriente aujourd’hui majoritairement sur le rôle de

l’extension N-terminale des peptides NPFF. En effet, l’amide (-NH2) en C-

terminal obtenu après clivage d’un résidu basique (G/R) ou (G/K) du

précurseur apparait indispensable, de même que les amino-acides du segment

C-terminal (PQRFa) [313]. La contribution de la partie N-terminale a été

démontrée par étude de peptide tronqués et/ou allongés, mettant en évidence

le rôle possible de ce segment dans l’établissement de la conformation optimale

pour l’interaction avec le récepteur (FLFQPQRFa). De plus il a été observé que

les peptides à extension N-terminale (NPA-NPFF, EYW-NPVF) avaient une

meilleure affinité. Plus récemment l’extension N-terminale a plus amplement

été étudiée, notamment en modifiant l’extrémité du peptide NPA-NPFF. L’étude

démontre que la substitution en alanine de l’asparagine (N) et de la proline (P),

ajoutée à la N-méthylation du premier résidu, augmente l’affinité mais aussi la

sélectivité pour le récepteur 2, suggérant que la nature des acides aminés

composant cette extrémité n’est pas plus essentielle que la longueur de cette

partie N-terminale [314].

Dans le but d’étudier in vivo les effets de chaque récepteur, les peptides les

plus affins et sélectifs ont été modifiés afin de les protéger des

aminopeptidases présentes dans les cellules. Le taux de dégradation du 1DMe

(dYL(NMe)FQPQRFa), agoniste des récepteurs NPFF, a été fortement diminué

en remplaçant le premier acide aminé en N-terminal par un énantiomère D,


non naturel et en méthylant la seconde liaison peptidique [315]. De même

pour le dansyl-PQRFa qui en plus d’être moins dégradable possède des

propriétés plus lipophiles lui permettant de passer la barrière hémato-

encéphalique [316,317]. En effet, les peptides NPFF agissant essentiellement

sur le système nerveux central (voir plus bas) il était nécessaire de synthétiser

des peptides pouvant être injectés de façon systémique [316,317]. Dans la

même optique, la recherche de ligands sélectifs des récepteurs NPFF s’est

poursuivie avec la recherche d’antagonistes. L’homologie du récepteur NPFF

avec les récepteurs au neuropeptide Y (30 à 35%) a orienté la recherche vers

un antagoniste non peptique du NPYR. Le BIBP3226, antagoniste sélectif

NPY1, a donc été testé et validé en tant qu’antagoniste sur les récepteurs NPFF

car il possède une bonne affinité pour ces récepteur notamment pour le

récepteur NPFF1 (12nM) [312,318,319,320]. Cependant, le BIBP3226 possède

une activité agoniste à forte concentration [318]. Plus récemment, un

antagoniste des récepteurs NPFF a été mis en évidence, le RF9 [321]. In vivo, le

RF9 peut être administré de façon systémique et diminue le développement de

la tolérance à la morphine chez la souris [10]. Le tableau 5 rassemble les

données obtenues après déplacement de la liaison des ligands iodés [125I]YVP

(pour le NPFF1) [311,322], [125I]EYF (pour le NPFF2) [323] et tritiés [3H]VPNL et

[3H]EYF [323] par différents ligands NPFF sur cellules modèles (CHO). Les

affinités de ces ligands, mesurées par autoradiographie sur coupe de moelle

épinière de souris [324], sur membranes de bulbe olfactif [325] et de moelle

épinière [326] de rat sont en accord avec celles mesurées sur cellules modèles.

La faible sélectivité de ces ligands NPFF (S1/2, tableau 5) ne permet pas de

distinguer précisément les effets NPFF1 ou NPFF2.

La recherche de ligands sélectifs de chacun des récepteurs est donc essentielle

afin de connaitre précisément le rôle et les effets médiés par ces récepteurs

mais aussi leur localisation dans le système nerveux central (voir localisation

des récepteurs NPFF, plus bas).

69

Ki CHO-NPFF1 Ki CHO-NPFF2 S1/2

Pro-NPFFA

NPFF (FLFQPQRFa) 2.82 ± 0.06 0.21 ± 0.03 13

1DMe (dYL(NMe)FQPQRFa) # 1.1 ± 0.4 0.18 ± 0.08 6.1

SQA-NPFF (h) 4.16 ± 0.31 0.16 ± 0.02 26

NPA-NPFF (b, s)

0.047 ± 0.003

dNPA, dNP(NMe)AFLFQPQRF-NH2 # 9.5 ± 1.6 0.17 ± 0.01 55.8

dA(NMe)AAFLFQPQRF-NH2 # 12.1 ± 3.1 0.16 ± 0.01 75.6

NPAF (h) 13 ± 2 0.14 ± 0.01 93

NPSF 32 ± 6 20 ± 2 1.6

EFW-NPSF (r) 20.8 ± 0.8 0.21 ± 0.01 94

EYW-NPSF 18 ± 3 0.24 ± 0.03 75

Pro-NPFFB

hRFRP1 1.27 ± 0.08 3.9 ± 0.6 0.3

NPVF 0.6 ± 0.1 17.4 ± 1.7 0.03

dVP(NMe)NLPQRF-NH2 # 3.6 ± 0.6 142.0 ± 1.20 0.025

YVPNLPQRFa 0.69 ± 0.09 8.9 ± 1.5 0.08

FMRFa 1.8 ± 0.2 6.6 ± 1.1 0.3

Peptide dérivé du NPY

FrogPP >1000 7 ± 2 >150

Antagonistes

RF9 58 ± 5 75 ± 9 1.3

BIBP3226 12 ± 1 84 ± 12 0.14

Tableau 5: Affinités (en nM) des principaux ligands NPFF et FMRFa d'après [312,314]. Ki: affinité déterminée par déplacement du ligand de référence [3H]EYF, [125I]EYF pour le récepteur NPFF2 et [125I]YVP, [3H]VPNL pour le récepteur NPFF1. S1/2: index de sélectivité (Ki NPFF1/Ki NPFF2). Les Ki ayant été déterminé par déplacement du ligand de référence tritié sont spécifiés par un #.

Il a récemment été montré que les autres neuropeptides RFamide, PrRP, le

26RFa et la Kisspeptine [327], bien qu’ils agissent principalement via leurs

récepteurs respectifs (GPR10, GRP54, GRP103), sont aussi reconnus par les

récepteurs NPFF avec une forte affinité sur cellules CHO, et certains de leurs

effets, mesurés in vitro et in vivo, pourraient être médiés par l’activation de ces

récepteurs [320,328,329] (figure 32).


Figure 32: Membres de la famille RFamide de mammifère. La famille prolactin releasing peptide (PrRP), la

famille NPFF et peptides apparentés (NPAF, NPSF, and NPVF), la famille humaine des RFamide related peptides (hRFRPs), les familles metastin/kisspeptins, et QRFP. Les récepteurs spécifiques de chaque famille de peptides ont été identifiés mais il existe pour certaines familles un cross talk entre les peptides et les récepteurs,

indiqués par des flèches [330].

Comprendre les caractéristiques de liaison des ligands et les mécanismes de la

sélectivité permettrait de développer de nouveau ligands sélectifs

indispensables pour l’étude des rôles respectifs des récepteurs NPFF1 et

NPFF2.

IV.2 Effets pharmacologiques du système NPFF

IV.2.1 Nociception

Les effets du NPFF sur la nociception dépendent du site d’injection du peptide.

En effet, en supra-spinal (injection intracérébroventriculaire, icv) chez le

rongeur, le NPFF ou des analogues atténuent les effets analgésiques des

agonistes opioïdes, dans des tests de douleur tel que le test de retrait de la

queue [315,331,332]. Chez la souris, l’administration centrale de SQA-NPFF

(icv), inhibe l’analgésie induite par la morphine administrée icv, dans ce même

test de retrait de la queue [333].

Le NPFF attenue aussi l’analgésie induite par les opioïdes endogènes libérés

par le stress dans des modèles de douleur thermique chez la souris [334], mais

71

aussi après une injection locale (dans l’aire tegmentale ventrale (VTA)) dans un

modèle de douleur inflammatoire chez la rat [335]. Après une injection

localisée, dans le noyau dorsal du raphé, la VTA ou le noyau parafasciculaire,

le seuil de douleur n’est pas modifié lors d’une douleur thermique ou chimique

mais l’analgésie induite par l’injection de morphine dans ces aires est abolie

[335,336]. L’effet du NPFF dans la substance grise périaqueducale dépend du

type de douleur appliquée. Chez le rat neuropathique, le NPFF reverse les effets

analgésiques de la morphine co-administrée dans un test douleur thermique,

mais reste sans effet sur la douleur mécanique [337].

L’effet anti-opioïde du NPFF sur l’analgésie morphinique, mesuré dans le test

de retrait de la queue, est inhibé lorsque le RF9, antagoniste des récepteurs

NPFF est co-injecté [338]. Les effets des ligands NPFF sur l’analgésie opioïde

sont donc bien dépendants de la stimulation des récepteurs NPFF.

Après injection intra-thécale (it), les agonistes NPFF (NPFF, 1DMe) produisent

des effets anti-nociceptifs ou bien potentialisent les effets analgésiques de la

morphine. Cet effet pro-opioïde est observé chez la souris [339] mais aussi chez

le rat dans des modèles de douleur aigue (thermique ou mécanique) [340,341]

ou chronique (inflammatoire ou neuropathique) [342,343]. L’anti-nociception,

comme la potentialisation des effets opioïdes sont reversés par des

antagonistes des récepteurs MOP et DOP, ce qui suggère un rôle de ces

récepteurs dans la médiation des effets NPFF [340,344]. L’injection de 1DMe au

niveau spinal augmente la libération de met-enképhaline [345]. Le mécanisme

proposé pour expliquer ces effets analgésiques et pro-opioïdes du NPFF est un

blocage fonctionnel des récepteurs DOP présynaptiques, impliqués dans le

rétrocontrôle négatif de la libération de met-enképhaline. En levant l’inhibition

exercée par les récepteurs DOP sur cette libération d’opioïde endogène, le NPFF

permet l’activation des récepteurs MOP post-synaptiques par la met-

enképhaline et une diminution de la libération de dynorphine, un peptide

opioïde ayant un effet pro-nociceptif au niveau spinal [346,347].

Etant donné la faible densité de récepteur NPFF1 dans la moelle épinière, on

peut supposer que la majorité des effets observés à ce niveau sont médiés par

l’activation du récepteur NPFF2. L’expression des deux récepteurs au niveau

central et la faible sélectivité des agonistes NPFF nous oblige à rester prudents


quant à l’action individuelle des deux récepteurs. L’injection centrale d’un

peptide dérivé du NPVF, agoniste NPFF1, produit les mêmes effets anti-opioïdes

que le NPFF dans le test de la plaque chauffante chez le rat [299] et chez la

souris, l’administration centrale de NPVF ou de EYF (EFWSLAAPQRF-NH2,

agoniste NPFF2) augmente de façon dose dépendante l’analgésie induite par la

morphine dans le test de retrait de la queue [348]. Pourtant, dans ce même test

et à la même dose testée, le 1DMe produit un effet anti-opioïde [333], suggérant

que la modulation des effets pro et anti-opioïdes ne dépend pas strictement de

la sélectivité de l’agoniste. Une étude similaire, comparant l’effet du dNPA-NPFF

sur l’analgésie induite par différentes doses de morphine lors du test de retrait

de la queue, a permis de démontrer l’effet anti-opioïde du dNPA-NPFF injecté

icv, de plus cet effet dépendait de la dose de morphine [349].

IV.2.2 Tolérance aux effets analgésiques des opiacés et

dépendance

La tolérance est un état d’adaptation dans lequel l’exposition à une drogue

produit des changements entraînant l’atténuation progressive d’un ou

plusieurs effets de la drogue. Il existe, selon Rothman [350], un équilibre

homéostasique entre les systèmes peptidergiques. Ainsi lors d’une prise répétée

d’opioïdes, l’organisme tendrait à rétablir cet équilibre en provoquant la

libération de certains peptides s’opposant à leurs effets. Le blocage des

récepteurs de ces peptides dits « anti-opioïdes » ou l’inhibition de la libération

de ces peptides pourrait donc atténuer l’incidence des adaptations mises en

jeu. Cette hypothèse se vérifie dans le cas des peptides NPFF. Chez le rat, après

traitement chronique à la morphine l’immunoréactivité des peptides NPFF

augmente dans le cerveau mais aussi dans la moelle épinière [351,352,353].

De plus l’expression des récepteurs NPFF2 augmente dans le cerveau de rat

après un traitement aigu à la morphine [354]. Après traitement chronique au

NPFF, le taux d’expression des récepteurs MOP diminue chez le rat [355].

Le rôle du système NPFF dans la tolérance à l’analgésie morphinique a été

démontré grâce à l’administration icv d’anticorps anti-NPFF chez le rat [356] et,

chez la souris, d’oligonucléotides anti-sens du SQA-NPFF [357]. Un retard dans

le développement de la tolérance induite par injections systémiques répétées de

morphine est aussi observée lorsque l’antagoniste des récepteurs NPFF, RF9,

73

est injecté de façon chronique [10]. Inversement, l’administration chronique de

1DMe augmente la tolérance à la morphine chez le rat [358]. L’hyperalgésie

induite par les opioïdes peut, elle aussi, aussi être bloquée par le RF9 [321]

La dépendance physique est quant à elle un état d’adaptation qui se manifeste

par un syndrome de sevrage propre à une classe de drogues, lors de la

cessation brutale, la réduction rapide de la dose, la réduction du taux de

drogue dans le sang et/ou l’administration d’un antagoniste. Chez le rat,

l’administration centrale d’anticorps anti-NPFF diminue le syndrome de

sevrage induit par l’antagoniste opioïde, naloxone [359], de même que

l’injection chez la souris, d’oligonucléotides anti-sens du SQA-NPFF [357]. De

plus, l’injection i.c.v de NPFF [353] ou sous-cutanée d’un analogue NPFF, le

dansyl-NPFF [316] précipite le syndrome de sevrage chez les rats traités

chroniquement à la morphine [353].

IV.2.3 Effets renforçants et addiction

Les propriétés motivationnelles d’une drogue contribuent au développement

d’une addiction. Les effets renforçants des opioïdes impliquent le circuit de la

récompense. Ce circuit dopaminergique comprend entre autre la VTA, le noyau

accumbens et le cortex préfrontal. On peut mesurer les effets renforçant des

opioïdes grâce au paradigme de préférence de place, qui consiste à associer un

environnement à la prise de drogue. Le dispositif est constitué de deux

compartiments. Durant le conditionnement, l’animal est injecté avec la drogue

à tester et placé dans l’un des compartiments. Après plusieurs jours de

conditionnement, l’animal est placé dans le dispositif, libre de se déplacer dans

le compartiment associé à la prise de drogue ou bien dans le compartiment

contrôle. On mesure alors le temps passé dans chacun des compartiments. Si

la drogue injectée possède des propriétés renforçantes, l’animal passe plus de

temps dans le compartiment précédemment associé à sa prise. Ce

comportement est appelé la préférence de place. L’injection icv de 1DMe

diminue le développement de la préférence de place induite par la morphine

chez la souris [360]. Injecté juste avant le test, le 1DMe inhibe l’expression de

ce comportement chez le rat [361]. Le NPFF injecté icv chez la souris diminue le

développement mais aussi l’expression de l’aversion induite par

l’endomorphine-2. Cet effet est réversé par l’injection de RF9 [362]. De plus, le


RF9 augmente la préférence de place induite par la morphine, sans pour

autant avoir d’effet par lui-même [10]. Le système NPFF joue aussi un role

dans la libération de neuromédiateur dans le circuit de la récompense.

L’injection intra-VTA de NPFF inhibe le turn-over dopaminergique dans le

noyau accumbens et le cortex préfrontal [363]. De même, le dNPA, plus sélectif

des récepteurs NPFF2, diminue la libération de dopamine et de sérotonine dans

le noyau accumbens après injection intra-péritonéale de morphine [364].

IV.2.4 Activité locomotrice

Les opioïdes stimulent l’activité locomotrice chez le rongeur, cette

hyperlocomotion implique le circuit dopaminergique de la récompense et

résulte de l’augmentation de la libération de dopamine induite par la

stimulation opioïde au niveau de la VTA. L’injection de NPFF, co-injecté avec la

morphine dans cette aire, inhibe l’hyperlocomotion chez le rat [365], cet effet

est relié avec la diminution de la libération de dopamine et sérotonine induite

par la morphine au niveau du noyau accumbens [364]. L’inhibition de

l’hyperlocomotion est aussi observée chez la souris, après une injection icv

[366].

IV.2.5 Effets sur la prise alimentaire

Le système NPFF joue aussi un rôle dans la prise alimentaire. En effet,

l’injection icv de NPFF, tout comme l’injection de naloxone, diminue la prise

alimentaire des rats à jeûn [367]. Ces effets n’étant pas additifs, le NPFF

pourrait jouer un rôle anti-opioïde sur les peptides opioïdes endogènes

orexigènes. Cependant, un autre mécanisme d’action a été proposé suite à

l’observation de l’augmentation de la prise de boisson après injection icv de

NPFF chez le rat [368]. Cette augmentation de prise de boisson pourrait être à

l’origine de la diminution de la prise alimentaire.

IV.2.6 Effets sur le contrôle de la température corporelle

L’effet du système NPFF sur le contrôle de la température corporelle a été

étudié chez la souris grâce à l’injection de ligands sélectifs de chacun des

récepteurs. Le NPVF et le dNPA produisent des effets opposés : injectés dans le

troisième ventricule, le dNPA produit une hyperthermie, alors que le NPVF

produit une hypothermie. Ces effets sur le contrôle de la température sont

75

antagonisés par l’injection de RF9 dans la même zone [369]. De plus, l’injection

de NPFF dans cette même zone produit une hypothermie réversée par

l’injection de RF9, chez la souris. L’injection cérébrale de RF9 réduit aussi

l’hypothermie induite par la morphine ou la nociceptin/orphanin FQ [370], et

dans un modèle de neuro inflammation aigu, le RF9 attenue la fièvre induite

par l’injection icv de lipopolysaccharide (LPS) [371]. Ces résultats suggèrent

que les effets des peptides NPFF sur le contrôle de la température sont médiés

par leurs propres récepteurs, mais aussi que l’hypothermie induite par la

morphine et la fièvre induite par le LPS nécessitent au moins en partie leur

activation [370].

IV.2.7 Rôle dans l’immunité

Le système NPFF est aussi impliqué dans l’immunité. Il module la prolifération

des lymphocytes [372], et diminue l’inflammation induite par injection de

carragénine dans la patte de souris [373].

IV.2.8 Effets cardiovasculaires

Les effets cardioexcitateurs du FMRFa étaient déjà connus chez le mollusque et

très rapidement après l’isolation des peptides NPFF, leurs effets sur la pression

artérielle ont été rapportés. Les premiers effets cardiovasculaires des peptides

NPFF ont été observés après injection systémique de deux analogues NPFF

chez le rat [374]. Ensuite, des injections locales ont été réalisées dans le noyau

du tractus solitaire, qui est un noyau central impliqué dans la régulation

cardiovasculaire, recevant les afférences terminales des influx

cardiovasculaires de la périphérie. L’injection de NPFF dans le noyau du

tractus solitaire produit une bradycardie et augmente la pression artérielle.

Cette augmentation peut être atténuée par les antagonistes adrénergiques

[375]. De plus, les neurones synthétisant du NPFF dans ce noyau sont activés

en réponse à une hémorragie et l’hypertension induite par le syndrome de

sevrage à la morphine [376]. L’injection icv de NPFF induit une augmentation

dose dépendante de la pression artérielle ainsi qu’une augmentation de

l’activation des neurones NPFF dans cette zone et une augmentation de la

transcription des gènes NPFF mesurée par hybridation in situ chez le rat [377].

Ces effets sont aussi observés après injection icv et sont inhibés par la co-


injection icv de RF9 [321]. Les effets cardiovasculaires du NPFF ne sont pas

réversés par la naloxone (antagoniste des récepteurs opioïdes). L’augmentation

de la pression artérielle est, par contre, inhibée par un prétraitement à

l’antagoniste 1-adrénergique, prazosin et la diminution du rythme cardiaque

par l’atropine, un antagoniste muscarinique [375]. Ces études démontrent le

rôle du système NPFF dans la régulation des fonctions cardiovasculaires. Cette

modulation du système nerveux autonome pourrait impliquer des circuits

neuronaux spécifiques liés aux noyaux paraventriculaires de l’hypothalamus

[378].

IV.2.9 Rôle dans l’hypertension

Le système NPFF est aussi potentiellement impliqué dans l’hypertension.

L’abondance des peptides NPFF et la localisation des récepteurs NPFF dans les

noyaux paraventriculaires (PVN) de l’hypothalamus en relation anatomique

avec des peptides impliqués dans la régulation cardiovasculaire comme la CRH

(corticotropin releasing hormone) suggère un rôle des peptides NPFF dans

l’hypertension. Récemment des études immunohistochimiques de patients

atteint ont permis de démontrer une diminution des neurones NPFF dans les

régions hypothalamiques et les noyaux impliqués dans la régulation

cardiovasculaire [379,380]. Dans ces études l’immunoréactivité NPFF diminue

fortement dans les régions proches des noyaux PVN et supra optique, un site

où le nombre de neurones GABAergiques est important. Ces neurones sont

impliqués dans le contrôle de la sécrétion de vasopressine par l’hypophyse. La

perte de projection NPFF vers les neurones GABAergiques pourrait altérer la

régulation des réflexes cardiovasculaires et le contrôle de la pression artérielle

[330].

IV.2.10 Rôle dans le contrôle neuroendocrinien

Après la découverte des peptides RFRP, leur rôle sur l’inhibition de la libération

hypophysaire de gonadotropine chez la caille a été démontré et ces peptides ont

alors été dénommés GnIH [301]. Ce rôle dans la régulation de l’axe

hypothalamo-hypophysaire est supporté par la distribution des récepteurs

NPFF, et plus particulièrement NPFF1 dans le noyau paraventriculaire (PVN) de

l’hypothalamus dont les axones se projettent dans l’éminence médiane et

77

régulent la libération d’hormones hypophysaires [311]. Chez les mammifères,

comme chez les oiseaux, les peptides RFRP suppriment l’activité reproductrice

[381,382,383]. L’injection icv de RFRP3 chez le rat, augmente la libération

d’hormone de croissance et diminue la libération de LH, sans altérer la puberté

[384]. A l’inverse, l’injection icv de RF9 chez le rat, augmente la sécrétion de LH

et de FSH [385]. De même chez la brebis, l’injection icv de RF9, augmente la

concentration plasmatique de LH [386]. Récemment un modèle de souris KO

NPFF1 a été généré. La délétion du gène codant pour le récepteur NPFF1 n’a pas

d’effet sur la fertilité ou bien la puberté des souris, cependant les auteurs ont

pu observer une modification de la sensibilité à l’obésité et à l’hypogonadisme

des jeunes souris en condition de stress ou de régime gras [387]. Le récepteur

NPFF1 et la signalisation induite par les peptides GnIH/RFRP/NPFF1 semblent

donc jouer un rôle dans la régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire mais

aussi dans le métabolisme, notamment dans l’obésité associée à

l’hypogonadisme.

Le NPFF est aussi impliqué dans l’activation des neurones GABAergiques et à

ocytocine du PVN il régule aussi la libération d’ocytocine et de prolactine

[378,388].

Le système NPFF, et notamment le récepteur NPFF1, est donc particulièrement

impliqué dans la régulation des secrétions hormonales de l’axe hypothalamo-

hypohysaire.

Le système NPFF est donc un système de neuropeptides multifonctionnels.

L’étude de ce système est d’un grand intérêt dans la compréhension de

plusieurs types de régulation centrale, notamment de la modulation de

l’activité opioïde et des conséquences des traitements aux analgésiques

opioïdes.


IV.3 Le récepteur NPFF2

Le récepteur NPFF2 est un récepteur de la famille de la rhodopsine, il

possède plusieurs motifs structuraux caractéristiques : deux résidus cystéine

sur les boucles E1 et E2 pouvant former un pont disulfure stabilisant la

structure, un motif DRF (analogue du motif DRY) sur l’I2 et une cystéine

pouvant être modifiée par ajout d’un motif lipidique pour une insertion à la

membrane en C-terminal (figure 33).

Figure 33: Alignement des séquences du récepteur NPFF2 de souris, humain et rat.

Il est constitué d’une séquence de 420 acides aminés chez l’homme et 417 chez

le rat et la souris (figure 33). Il possède 55% d’homologie avec le récepteur

NPFF1 et 30 à 35% avec le récepteur NPYR. Sa structure cristallographique n’a

pas encore été résolue mais une étude récente a permis, grâce à plusieurs

mutations de localiser le site de liaison dans la partie supérieure des TM5,

TM6, TM7, proche de la boucle E2 et d’identifier certains résidus essentiels

dans l’activation du récepteur en position 5.27 et 6.59 [389]. L’étude suggère

que ces sites (5.27, 6.59) participent à la formation d’un domaine acide, chargé

négativement, formant un site de liaison pour la partie C-terminale du ligand

(figure 34). L’étude des caractéristiques de liaison de différents ligands, dont le

II III

VI

IV V

VI

Souris MSEKWDSNSSESWNHIWSGNDTQHHWYSDINITYVNYYLHQPQVAAVFISSYLLIFVLCMVGNTVVCFIVIRNRHMHTVT 80

Humain MNEKWDTNSSENWHPIWNVNDTKHHLYSDINITYVNYYLHQPQVAAIFIISYFLIFFLCMMGNTVVCFIVMRNKHMHTVT 80

Rat MGKRWDSNSSGSWDHIWSGNDTQHPWYSDINITYMNYYLHQPHVTAVFISSYFLIFFLCMVGNTVVCFVVIRNRYMHTVT 80

81 NFFILNLAISDLLVGIFCMPITLLDNIIAGWPFGSSMCKISGLVQGISVAASVFTLVAIAVDRFRCVVYPFKPKLTVKTA 160

81 NLFILNLAISDLLVGIFCMPITLLDNIIAGWPFGNTMCKISGLVQGISVAASVFTLVAIAVDRFQCVVYPFKPKLTIKTA 160

81 NFFIFNLAISDLLVGIFCMPITLLDNIIAGWPFGSSMCKISGLVQGISVAASVFTLVAIAVDRFRCVVYPFKPKLTVKTA 160

161 FVTIVIIWGLAIAIMTPSAIMLHVQEEKYYRVRLSSHNKTSTVYWCREDWPRHEMRRIYTTVLFATIYLAPLSLIVIMYA 240

161 FVIIMIIWVLAITIMSPSAVMLHVQEEKYYRVRLNSQNKTSPVYWCREDWPNQEMRKIYTTVLFANIYLAPLSLIVIMYG 240

161 FVMIVIIWGLAITIMTPSAIMLHVQEEKYYRVRLSSHNKTSTVYWCREDWPNQEMRRIYTTVLFATIYLAPLSLIVIMYA 240

241 RIGASLFKTAAHCTGKQRPVQWH-VSKKKQKVIKMLLTVALLFILSWLPLWTLMMLSDYTDLSPNKLRIINIYIYPFAHW 319

241 RIGISLFRAAVPHTGRKNQEQWHVVSRKKQKIIKMLLIVALLFILSWLPLWTLMMLSDYADLSPNELQIINIYIYPFAHW 320

241 RIGASLFKTSAHSTGKQRLEQWH-VSKKKQKVIKMLLTVALLFILSWLPLWTLMMLSDYADLSPNKLRVINIYVYPFAHW 319

320 LAFCNSSVNPIIYGFFNENFRNGFQDAF--QICQKKAKPQEAYSLRAKRNIVINTSGLLVQEPVSQNPGGENLGCGKSAD 397

321 LAFGNSSVNPIIYGFFNENFRRGFQEAFQLQLCQKRAKPMEAYALKAK HVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYRKSAE 400

320 LAFCNSSVNPIIYGFFNENFRSGFQDAF--QFCQKKVKPQEAYGLRAKRNLDINTSGLLVHEPASQNPSGENLGCRKSAD 397

398 NPTQESLIEEMGEATNSTVA 417

401 KPQQELVMEELKETTNSSEI 420

398 NPTQESLMEETGEATNSTET 417

I

79

RF9 et BIBP3226, a de plus permis de mettre en évidence le rôle du résidu 7.35

dans la sélectivité [389].

Figure 34: Modélisation du site de liaison au ligand du récepteur NPFF2 [389]. En gris le squelette du récepteur vu de l’extérieur, en rouge et orange les amino-acides du site de liaison. Le ligand est représenté coloré en

fonction de son hydrophobicité : les parties hydrophobes sont colorées en vert, les parties hydrophiles en rouge.

IV.3.1 Distribution anatomique du récepteur NPFF2

Les premières études de la distribution des récepteurs ont été réalisées avant le

clonage des récepteurs NPFF [390,391]. Après le clonage des récepteurs et des

précurseurs et leur caractérisation pharmacologique, une cartographie plus

précise a été a pu être effectuée grâce à l’utilisation de ligands radiomarqués le

[125I]-YVP (dérivé du NPVF, agoniste sélectif du récepteur NPFF1) et le [125I]-EYF

(dérivé du EFW-NPSF, agoniste sélectif du récepteur NPFF2). Etant donné la

faible sélectivité des radioligands pour chacun des récepteurs, un peptide

dérivé du NPY, FrogPP, sélectif du récepteur NPFF2, non marqué a été utilisé

afin d’apprécier au mieux la distribution des récepteurs [311,390,391] (figure

35).


Figure 35: Distribution du récepteur NPFF2 chez le rat [311]. Le ligand [125I]EYF a été utilisé à une concentration de 0.05 nM.

CA3 : Corne d’Ammon 3, (hippocampe), MMn : noyau mamillaire médian.

Région [125I]EYF, Liaison

spécifique NPFF2 (pCi/mg)

Télencéphale

Acb: Noyau Accumbens 277

CPu: Caudé Putamen 970

VDB: Noyau du limbe vertical de la bande diagonale 748

LSD: Noyau septal latéral, partie dorsale 464

LSI: Noyau septal latéral, partie intermédiaire 1496

BST:Noyau du lit de la strie terminale 200

Pre: presubiculum 1639

MPA: Aire préoptique médiane 636

Diencéphale

hippocampe postérieur 1637

thalamus

AD: Noyau thalamique antérodorsal 713

PVA: Noyau Paraventriculaire, partie antérieure 662

CM: Noyau thalamique centromédian 796

VM: Noyau thalamique ventromédian 961

PF: Noyau thalamique Parafasciculaire 3808

LD: Noyau latérodorsal 2253

PT: Noyau thalamique Paratenial 862

ZI: Zona incerta 1322

hypothalamus

VMH:Noyau hypothalamique ventromédian 1027

LH: Hypothalamus lattéral 1518

M: Noyau mamillaire 1912

SCh: Noyau suprachiasmatique 1603

Mésencéphale

APTD: Partie dorsale du Noyau prétectal antérieur 2730

MG: Noyau géniculé médian 504

IP: Noyau interpédonculaire 1080

SuG: Couche grise superficielle du collicule supérieur 521

DR: Noyau Dorsal du Raphé 1432

CG: Matière grise centrale 970

VTg: Noyau tegmental ventral 1481

Rhombencéphale

LPB: Noyau parabrachial latéral 1617

PBG: Noyau Parabigéminal 1522

Sp5: Noyau trigéminal spinal 669

Sol: Noyau du tractus solitaire 1643

sp5: Tractus trigéminal spinal 2277

Moelle épinière

couches I–II 2411

81

La plus forte densité de récepteur NPFF2 a été détectée dans le système

nerveux central, notamment dans la moelle épinière, le récepteur NPFF1 serait

localisé uniquement dans le septum, le thalamus et l’hypothalamus (figure 35).

La distribution des récepteurs NPFF1 et NPFF2 a été comparée chez différentes

espèces [392] et chez toutes les espèces étudiées, le récepteur NPFF2 est le plus

représenté, excepté chez le dègue (octodon) qui ne possède pas de sites NPFF2.

Comparé à la souris, le rat, le marmouset et le lagomorphe, le cobaye présente

une plus forte densité de sites NPFF1, notamment dans les couches

supérieures de la moelle épinière. Il existe aussi des différences de distribution

chez les rongeurs, selon la lignée. Par exemple, contrairement au rat Wistar, le

rat Sprague-Dawley présente des sites NPFF1 dans les régions corticales,

spinales et dans le noyau accumbens. La distribution du récepteur NPFF2 est

aussi différente. De même, les souris C57BL/6-SV129 ont une densité de

récepteurs NPFF2 supérieure dans les régions corticales et du télencéphale, que

les souris Swiss. Ces différences de distribution selon les espèces et les lignées

pourraient, entre autre, mener à des différences de modulation de

l’antinociception opioïde [393]. La distribution des récepteurs NPFF a aussi été

étudiée par immunohistochimie chez l’homme et le rat, et confirment la

présence d’une grande densité de récepteurs NPFF dans le système nerveux

central, notamment dans l’hypothalamus et dans la zone périphérique du

noyau supra optique. Certaines différences ont aussi pu être mises en avant,

comme l’absence de neurones NPFF positif dans le noyau supra optique de

l’homme [394]. Quelques études ont pu détecter par hybridation in situ, la

présence de mRNA du peptide NPFF dans la rate, les testicules et l’épididyme

de rat [395], le plasma humain [396], du mRNA du récepteur NPFF2 dans le

tissus adipeux [310] et dans les macrophages de souris [373]. Chez l’oiseau, le

récepteur NPFF1 et les peptides NPFF1 ont été détectés en périphérie, par PCR,

hybridation in situ et immunonocytochimie dans les gonades [397].

Récemment, une étude a démontré l’existence de variants d’épissage du

récepteur NPFF2, trois chez l’homme, deux chez la souris. Cet épissage

alternatif pourrait jouer un rôle dans des différences de régulation tissus-

spécifique car la distribution de ces variants diffère chez la souris. De plus,


l’étude montre qu’il existe aussi des différences de distribution entre le rat et la

souris suggérant une possible régulation espèce spécifique [398].

La distribution des récepteurs NPFF est en accord avec les effets

pharmacologiques observés : le rôle du récepteur NPFF1 dans le contrôle de

l’axe hypotalamo-hypophysaire, et du récepteur NPFF2 dans la nociception, la

modulation de l’activité des opioïdes et de l’activité cardiaque. Cependant, ces

distributions sont soumises à controverse car la faible sélectivité des ligands ne

peut pas permettre de déterminer avec exactitude la distribution précise des

récepteurs. Le problème est d’autant plus complexe que sur un plan

fonctionnel certains effets sont partagés par les deux récepteurs.

IV.3.2 Signalisation

IV.3.2.1 Effets cellulaires propres

Le clonage du récepteur NPFF2, et sa caractérisation ont permis de démontrer

un couplage aux protéines Gi/o. Dans les cellules CHO, HEK et SH-SY5Y la

stimulation du récepteur induit une inhibition de l’AC sensible à la PTX

[299,303,310]. Dans les cellules SH-SY5Y la stimulation des récepteurs NPFF

diminue les taux intracellulaires d’AMPc [7] comme dans les cellules HEK-293

[310] avec une EC50 de l’ordre du nanomolaire à la dizaine de nanomolaire

pour les agonistes les plus sélectifs (tableau 6).

83

EC50 (nM) CHO-hNPFF2 EC50 (nM) CHO-mNPFF2

EC50 (nM) SH2D9-hNPFF2

Pro-NPFFA

NPFF (FLFQPQRFa) 2.3 ± 0.5

1DMe (dYL(NMe)FQPQRFa) 2.7 ± 0.5 0.72 ± 0.18 0.8 ± 0.1

SQA-NPFF (h) 0.56 ± 0.05 0.74 ± 0.13

NPA-NPFF (b, s) 0.84 ± 0.25

dNPA, dNP(NMe)AFLFQPQRF-NH2

dA(NMe)AAFLFQPQRF-NH2 0.53 ± 0.03

NPAF (h) 222 ± 26

NPSF 2.2 ± 0.3 70 ± 13

Pro-NPFFB 21 ± 4

hRFRP1 133 ± 11

NPVF 107 ± 8

dVP(NMe)NLPQRF-NH2 517 ± 91

Antagoniste

RF9 >5 μM 1679 ± 530

Tableau 6: Caractérisation fonctionnelles des récepteurs NPFF1 et NPFF2 (d'après [7,312,399]). Les EC50 ont été déterminées après dosage des taux intracellulaires d’AMPc après stimulation de l’AC par la forskoline. h : humain, m : mouse.

Sur neurones isolés de ganglions de la racine dorsale de souris [400] et du

noyau dorsal du raphé [401] le 1DMe et ses analogues produisent un effet

direct sur les canaux calciques en inhibant les courants entrants induits par la

dépolarisation. De même, le NPVF inhibe les conductances calciques des

canaux de type N en agissant via le récepteur NPFF1 exprimé dans les cellules

SH-SY5Y [402] (figure 36).

Dans une lignée cellulaire dérivant des ganglions de la racine dorsale de rat (F-

11), le dNPA active les courants potassiques sensibles du voltage [403]. Sur

cellules SK-N-MC le NPFF active la voie des MAPK [404]. Dans les cellules SH-

SY5Y l’activation de ERK apparait PKA dépendante car elle est abolie après

traitement par un inhibiteur de la PKA, le H 89 [405]. De plus, dans ces mêmes

cellules, l’activation du récepteur NPFF2 endogène active la voie NF-B [405].

Ce mécanisme a été démontré sur culture primaire de macrophages dans

laquelle le NPFF bloque la production de NO lors du processus d’inflammation

induit par traitement au LPS. Cet effet est bloqué par le RF9, diminué par un

inhibiteur de la voie NF-kB [373] et par un inhibiteur de la NO-synthase

suggérant l’implication de l’oxyde nitrique (NO) dans les voies de signalisation

activées par le NPFF [373].


Figure 36: Schématisation de la signalisation du récepteur NPFF2 dans les cellules neuronales. La stimulation du récepteur NPFF2 par son agoniste induit l’activation d’une protéine de type Gi qui inhibe l’adénylyl cyclase,

les conductances calciques et augmente les courants potassique sortant. L’activation du récepteur entraine aussi l’activation de la voie des MAPK (ERK1/2).

IV.3.2.2 Effet anti-opioïde

Sur des neurones isolés à partir du noyau dorsal du raphé, du noyau

parafasciculaire de l’hypothalamus et des ganglions de la racine dorsale de la

moelle épinière de rat, le NPFF présente une activité anti-opioïde cellulaire.

Après traitement par l’agoniste opioïde, les conductances calciques induites

par la dépolarisation diminuent. Un prétraitement avec l’agoniste NPFF, 1DMe

et/ou NPA-NPFF diminue l’inhibition des canaux calciques voltage dépendant

de type N (Cav2.2) exercée par les opioïdes, nociceptine [401,406,407] et

DAMGO [9,407] sur neurones isolés des noyaux de rat ou de souris précités.

Cet effet anti-opioïde sur neurones isolés du noyau parafasciculaire et du

dorsal raphé a été étudié avec deux agonistes NPFF sélectifs de chacun des

récepteurs. Le NPVF (sélectif du NPFF1) et le NPA-NPFF (sélectif du NPFF2)

produisent tous les deux le même effet cellulaire [406].

IV.3.2.3 Mécanismes moléculaires et modèle de l’interaction MOP-

NPFF2

L’effet anti-opioïde a été reproduit sur cellules modèles SH-SY5Y exprimant les

récepteurs MOP et NPFF2 [7] (figure 37). Les propriétés de liaison des agonistes

de chacun des deux récepteurs ne sont pas modifiées. Les affinités du DAMGO

pour le récepteur MOP et du 1DMe pour le récepteur NPFF2 sont de l’ordre du

nanomolaire et l’inhibition de l’adénylyl cyclase s’effectue avec une puissance

similaire à celle des récepteurs exprimés indépendamment [143]. Des

expériences de stimulation de liaison du [35S]GTPγS sur cellules SH-SY5Y

85

indiquent qu’aux concentrations d’agoniste NPFF, montrées comme produisant

l’effet anti-opioïde, la capacité du récepteur MOP à lier la protéine G reste

inchangée [402]. Le mécanisme de l’activité anti-opioïde n’implique donc pas

seulement et/ou strictement une inhibition au niveau de la protéine G ou une

modification de la liaison des agonistes opioïdes

Figure 37: Représentation schématique de l'effet anti-opioïde. La stimulation opioïde inhibe les

courants calciques induits par la dépolarisation. Le traitement par l’agoniste NPFF réduit l’inhibition exercée par les opioïdes sur les conductances calciques.

Afin de comprendre plus avant les mécanismes moléculaires de cette

interaction fonctionnelle, Roumy et al ont exprimé les récepteurs MOP et NPFF2

fusionnés à deux protéines fluorescentes, YFP et CFP respectivement, et étudié

en FRET une possible association physique [143]. Après stimulation par le

1DMe, le signal de FRET augmente entre les deux récepteurs suggérant un

rapprochement physique confirmé par co-immunoprécipitation. De plus,

l’internalisation du récepteur MOP stimulé par le DAMGO après traitement au

1DMe est fortement diminuée comparé à une stimulation opioïde seule [143].

Cette dimérisation pourrait être impliquée dans la perte d’activité du récepteur

MOP.

Comme nous l’avons vu précédemment, (chapitre modulation de l’activité des

RCPG), la désensibilisation du récepteur MOP implique la phosphorylation de

résidus spécifiques, notamment la Ser375 [253]. La phosphorylation de ce

résidu suite à l’activation du récepteur NPFF2, a par la suite, été évaluée par

Western Blot grâce à l’utilisation d’un anticorps phosphospécifique anti-Ser377

(résidu conservé chez le récepteur humain correspondant à la sérine 375).

Après stimulation du récepteur NPFF2 exprimé dans les cellules SH-SY5Y, le

récepteur MOP est phosphorylé sur la Ser377 [249]. Le récepteur MOP pourrait

donc être désensibilisé après traitement à l’agoniste NPFF. Le même anticorps

utilisé en immunocytochimie a permis de localiser le récepteur phosphorylé.


Après stimulation par le 1DMe, le récepteur MOP est maintenu à la membrane

plasmique, ce qui indique que la phosphorylation n’est pas suffisante pour

induire l’internalisation. Le recrutement de la -arrestine a été évalué par

complémentation de fluorescence entre le récepteur MOP-Vc (couplé au

fragment C-terminal de la protéine fluorescente Venus) et la -arrestine Vn

(couplé à la partie N-terminale de la venus). La stimulation NPFF induit le

recrutement de la -arrestine mais ne permet pas l’internalisation. L’utilisation

de siRNA GRK2 a permis de monter que la kinase mise en jeu lors de cette

trans-phosphorylation est, de façon surprenante, une kinase habituellement

décrite comme impliquée dans la désensibilisation homologue, la GRK2.

Cette trans-phosphorylation pourrait être impliquée dans la désensibilisation

du récepteur MOP et participer à l’effet anti-opioïde du NPFF.

Le système NPFF est impliqué dans de nombreux aspects de la régulation

centrale des fonctions physiologiques. L’étude de ce système est donc

essentielle à la compréhension des mécanismes précis de son action,

notamment dans l’analgésie opioïde.

87

Objectifs

Les phosphorylations et le code barre de phosphorylation sont d’une

importance capitale dans la signalisation, la désensibilisation et le trafficking

des RCPG. Les anticorps phosphospécifiques utilisés dans les études des sites

de phosphorylation sont des outils particulièrement efficaces et essentiels pour

étudier précisément les sites de phosphorylation qui peuvent être utilisés

comme marqueurs d’activation des RCPG grâce à l’utilisation de ces anticorps

in vivo.

Le thème de recherche de l’équipe est l’étude des mécanismes d’action des

récepteurs NPFF et avant ma thèse, il n’y avait aucune indication sur les sites

de phosphorylation du récepteur NPFF2 et leur rôle. Nous avons donc voulu

identifier le profil de phosphorylation du récepteur NPFF2 exprimé dans un

modèle cellulaire se rapprochant au maximum de sa localisation

physiologique : les cellules SH-SY5Y, dérivées du neuroblastome humain (SK-

N-SH) et possédant les caractéristiques principales des neurones. Ces cellules

sont excitables, possèdent des enzymes spécifiques des neurones, comme la

Tyrosine Hydroxylase (TH), expriment de façon endogène les canaux calciques

voltage-dépendants et le récepteur MOP.

Nous avons choisi d’identifier les phosphorylations induites par l’agoniste par

spectrométrie de masse, qui est une méthode précise permettant de d’identifier

avec précision les résidus phosphorylés et la présence sur une même protéine

de plusieurs résidus phosphorylés (multi-phosphorylation). Cette technique

permet aussi une quantification relative des peptides phosphorylés en fonction

de différentes conditions de traitement [249,251].

Nous avons aussi voulu déterminer le rôle fonctionnel des phosphorylations

identifiées en réalisant des mutations de ces sites en alanine, et en observant le

comportement du récepteur déficient en phosphorylation vis-à-vis de sa

signalisation, sa désensibilisation et son internalisation.

Parallèlement à ce travail, nous avons synthétisé et caractérisé un nouveau

ligand de haute affinité pour le récepteur NPFF2 capable de se lier de façon

88 Objectifs

irréversible après photoactivation. En effet, de nouveaux ligands sont

nécessaires afin de décoder la complexité du système NPFF, départager la

localisation précise des récepteurs NPFF1 et NPFF2 mais aussi dans le but

d’identifier le mode de liaison des agonistes sur le récepteur NPFF2.

Après avoir détaillé les procédures expérimentales abordées lors de ces deux

études, les résultats obtenus lors de l’étude des sites de phosphorylation du

récepteur NPFF2 seront exposés et discutés. Ensuite la caractérisation du

nouveau ligand NPFF2 sera abordée.

PROCEDURE EXPERIMENTALE

89

PROCEDURE EXPERIMENTALE

I. Matériel

Les oligonucléotides ont été synthétisés par Sigma Genosys. Les enzymes de

restriction viennent de New England Biolabs (France). L’anticorps anti-T7 vient

de MERCK Millipore (Allemagne) 488 et de lapin anti-phospho-Thréonine

viennent de Invitrogen (France). Les anticorps secondaires de chèvre anti-

souris couplés au fluorophore Alexa Fluo, les anticorps secondaires de chèvre

anti-lapin et anti-souris couplés à la peroxydase HRP sont de Jackson

ImmunoResearch (Royaume Uni). L’agoniste NPFF2, 1DMe a été produit par

synthèse automatisée (model 433A, Applied Biosystems). La toxine pertussique

(PTX) et l’inhibiteur de la protéine kinase C (Chelerythrine) viennent de Sigma.

L’inhibiteur de la PLC (U73122), l’inhibiteur de la calmoduline (W7) et

l’inhibiteur beta-ARK1 sont de Calbiochem (Merck, Millipore, Allemagne). La

[3H]adénine (26 Ci/mmol) vient de GE Healthcare (France). Le radioligand

[3H]EYF (Glu-Tyr-Trp-Ser-Leu-Ala-Ala-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2) a été tritié par

Tritec (Suisse) [323]. Les autres produits viennent de Sigma (France).

II. Vecteur, mutagénèse dirigée

II.1 Mutants du récepteur NPFF2 de rat

Une PCR a été réalisée afin d’amplifier le cDNA codant pour le récepteur NPFF2

de rat inséré dans le vecteur pCDN (don du Dr S. Krief). Les amorces pour la

PCR ont été construites de façon à introduire un site de restriction AfeI à

l’extrémité 5’ (catataagcgctatgggcaagagatgggactcaaactct), un codon stop et un

site XbaI à l’extrémité 3’ (aatcctctagactaagtctcagtactgttggtagcttctccc) du

fragment. Les fragments ont ensuite été clonés dans le cadre de lecture du

vecteur pRc/CMV avec un tag T7. Les mutations ponctuelles ont été

introduites dans la séquence T7-rNPFF2 par PCR en utilisant le kit Quikchange

Lightning Site-Directed Mutagenesis (Stratagene, Agilent Technologies

90 Procédure expérimentale

Company, France) selon les instructions du fabricant. Les amorces utilisés

sont :

TS372AA (s: acgcaacctggacataaacgcagctggcctgttggtc,

as: gaccaacaggccagctgcgtttatgtccaggttgcgt),

S382/6A (s: gtccatgaacctgcagctcaaaacccagctggggaaaacttgg,

as: ccaagttttccccagctgggttttgagctgcaggttcatggac),

S395A (s: tggggaaaacttgggatgtagaaaagctgcagacaatccc,

as: gggattgtctgcagcttttctacatcccaagttttcccca),

ST414AA (s: aaacgggagaagctaccaacgctgctgagacttagtctagaggg,

as: ccctctagactaagtctcagcagcgttggtagcttctcccgttt),

TNST412ANAA (s: aaacgggagaagctgccaacgctgcagagacttagtctag,

as: ctagactaagtctctgcagcgttggcagcttctcccgttt).

II.2 Construction de l’extrémité C-terminale du récepteur

NPFF2 humain en fusion avec la GST

Une PCR a permis d’amplifier le cDNA codant pour les 85 derniers acides

aminés de l’extrémité C-terminale du récepteur NPFF2 humain. Les amorces

utilisées ont permis d’introduire un site de restriction BamHI à l’extrémité 5’

(cgcggatccttcaacgagaacttc), un codon stop et un site EcoRI à l’extrémité 3’

(ggaattcttaaatctcactgctgttag) du fragment. Le fragment a ensuite été cloné dans

le Vecteur pGEX2T (GE Healthcare) en fusion avec la GST (glutathion S-

transférase) suivie d’un site de clivage à la thrombine. Chaque construction a

été vérifiée par séquençage (Millegen, France).

III. Lignée cellulaire et transfection

Les cellules SH-SY5Y transfectées avec le récepteur NPFF2 humain (hNPFF2)

taggé en C-terminal avec la protéine fluorescente YFP (yellow fluorescent

protein) sont cultivées en milieu DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium,

4.5 g/L glucose, GlutaMAX-I, Fischer scientific), gentamicin 50µg/ml (Gibco,

life technologies) et 5µg/ml blasticidine (Cayla, Invitrogen, France) [111]. Les

cellules SH-SY5Y ont été transfectées avec le récepteur NPFF2 de rat (rNPFF2)

sauvage (WT) ou muté, taggé en N-terminal avec le tag T7. Les cellules SH-

91

SY5Y ont été maintenues en culture dans un milieu contenant du DMEM et

gentamicin 50µg/ml. Le jour précédent la transfection, les cellules SH-SY5Y

ont été ensemencées sur une plaque 6 puits (100 000 cellules par puits). La

transfection a été effectuée dans le milieu de culture ne contenant pas

d’antibiotique de sélection avec du FUGENE 6 (Roche Diagnostics) selon les

instructions du fabricant. 48h après transfection le milieu est remplacé par du

milieu contenant l’antibiotique de sélection soit : 500µg/ml de géniticine (G418,

Gibco, Life Technologies). Les clones sont ensuite sélectionnés après dilution

limite.

IV. Liaison de radioligands

IV.1 Préparation des membranes

IV.1.1 SH T7-NPFF2

Les cellules cultivées dans des boites de culture (140 mm) jusqu’à confluence

sont récupérées dans 10 ml de PBS (phosphate buffer saline) à 4°C. Après

centrifugation (1000 g, 15 min, 4 °C) le culot est congelé à -80 °C. Il est ensuite

re-suspendu dans un tampon Tris 50mM, pH 7.4 et homogénéisé au Potter,

puis centrifugé (1000 g, 15 min, 4 °C). Le surnageant est récupéré, le culot est

repris dans le tampon Tris, homogénéisé, puis de nouveau centrifugé. Enfin,

une étape d’ultracentrifugation des surnageants (40 000 g, 35 minutes à 4 °C)

nous permet de récupérer la fraction membranaire qui est reprise dans un

volume de tampon Tris 50mM défini selon la taille du culot.

Les membranes sont aliquotées puis conservées à -80 °C. La quantité de

protéines est dosée selon la technique colorimétrique de Bradford en utilisant

la BSA (bovine serum albumine) comme standard.

IV.1.2 Bulbe olfactif

Les souris (C57Bl6, male) de 20g, ont été décapitées et les bulbes olfactifs

disséqués, pesés et homogénéisés dans un potter dounce dans 12 volumes de

Tris 50mM, pH 7.4 et NaCl 60 mM. Après centrifugation 100 000g, 30min, le

culot membranaire est repris dans ce même tampon et de nouveau


homogénéisé et centrifugé. Le culot est enfin repris dans le tampon

d’homogénéisation dans un volume permettant d’obtenir une concentration

protéique finale de 3 à 4 mg/ml.

IV.2 Saturation (liaison à l’équilibre)

L’affinité du ligand tritié de référence (3[H]EYF) [323] ou du

[125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFa et le niveau d’expression (Bmax) des différents

récepteurs (WT ou Mutants), ont été déterminés par des expériences de

saturation.

Les membranes (entre 30 et 90 µg de protéines) sont incubées dans un volume

final de 500 µl de tampon Tris 50 mM, pH 7.4 NaCl 60 mM, BSA 0,1% (Bovine

Serum Albumine) en tubes de polypropylène

La liaison totale est effectuée en présence de radioligand en concentrations

croissantes. La liaison non spécifique est déterminée en présence de

concentration saturante de ligand froid (EYF, 1 µM). Après incubation une

heure à 25 °C les mélanges réactionnels sont filtrés sur filtres Whatmann

GF/B imbibés de PEI 0.3% (polyéthylèneimine) et lavés trois fois par 4 ml de

tampon de filtration (Tris 10 mM, BSA 0.1%) à 4 °C. Les filtres sont ensuite

transférés dans des fioles à scintillation auxquelles on ajoute 4 ml de

scintillant. La radioactivité est mesurée par un compteur à scintillation liquide

(Packard).

IV.3 Compétition

Les membranes (entre 1 et 10 µg de protéines) sont incubées dans un volume

final de 500 µl de tampon Tris 50 mM, NaCl 60 mM, BSA 0,1% (Bovine Serum

Albumine) en présence de 3[H]EYF 0.5 nM et de concentrations croissantes en

YE(Bpa)WSLAAPQRFa. La liaison non spécifique est déterminée en présence de

concentration saturante en dNPA (1µM). Après incubation une heure à 25 °C le

mélange réactionnel est traité de la même manière que dans les expériences de

saturation.

IV.4 Marquage irréversible

Après liaison du [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFa à 1 nM durant 1h à 25°C, les

membranes sont irradiées aux ultraviolets (365nm, 10mW/cm2) dans une

93

plaque 24 puits, 60 minutes à 4°C, grâce à une lampe noire (Black Ray Lamp,

B-100AP, Ultraviolet Products). Les membranes sont ensuite lavées deux fois

par centrifugations successives (120 000g, 30 min). Le culot final est repris

dans du tampon de Laemmli 2x (concentration finale : Tris 50 mM, pH 6,8, 2%

SDS, 10% glycérol, 0,02% Bleu de Bromophénol, 5% beta mercapto-éthanol),

incubé 30 min à 37°C et soumis à une électrophorèse (SDS PAGE). Après

dessiccation du gel, le marquage est détecté au PhosphorImager, et la densité

des bandes analysée grâce à ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda).

V. Dosage d’AMPc intracellulaire

Le récepteur NPFF2 étant un récepteur couplé aux protéines de type Gi, il est

possible de mesurer l’inhibition de l’adénylyl cyclase après accumulation

intracellulaire d’AMPc induite par stimulation de l’adénylyl cyclase par la

Forskoline selon la méthode de chromatographie d’affinité sur colonne

d’alumine (Sigma, France) décrite précédemment [7,312,408].

Le jour précédent l’expérience, 200 000 cellules sont ensemencées dans des

plaques 24 puits. Le jour de l’expérience, le milieu de culture est remplacé par

du milieu contenant 1µCi de [3H]Adénine durant 1 heure. Après rinçage par

500µl de KRH (Tampon Krebs Ringer HEPES : 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25

mM MgSO4, 1.5 mM CaCl2, 1.25 mM KH2PO4, 25 mM HEPES, 8 mM glucose,

0.5 mg/ml bovine serum albumin (BSA), pH 7.4), les cellules sont incubées en

présence de Forskoline 5 µM (Sigma, France), 0.1 mM 3-isobutyl-

1methylxantine (IBMX, Sigma, France), 0.1 mM Ro-20-1724 (Fisher, France) et

de 1DMe à concentrations croissantes durant 10 min. La réaction est arrêtée

par ajout d’HCl 2.2 M, puis le milieu est transféré sur colonne d’alumine. Les

colonnes sont ensuite rincées par ajout de 4ml d’HCl 5 mM, puis 500 µl

d’acétate d’ammonium 0.1 M. L’élution est ensuite réalisée grâce à l’ajout de 3

ml d’acétate d’ammonium. 7,5 ml de liquide à scintillation (Beckman Coulter)

sont ajoutés à l’éluât dans les fioles à scintillation. La radioactivité est ensuite

mesurée grâce à un compteur à scintillation liquide (Packard).


VI. Immuprécipitation

VI.1 Immunoprécipitation T7-rNPFF2R

Les cellules amenées à 80 % de confluence sont incubées dans un milieu de

culture déprivé en serum (0,5 % SVF) pendant 2h. Le milieu est ensuite

remplacé par du tampon KRH. Le cas échéant, les inhibiteurs sont appliqués

dans du tampon KRH (ARK1i 50µM, Chelerythrine 10µM, W7 20µM). La toxine

pertussique (PTX) est ajoutée la veille de l’expérience, pour un traitement de 18

heures à 100 ng/ml, dans le milieu de culture. Les cellules sont ensuite

incubées en présence du ligand (KRH contenant du 1DMe à 1µM) ou du KRH

seul (contrôle) pendant 30 min à température ambiante. Les cellules sont

ensuite récupérées sur glace puis soumises à centrifugation (1000 g, 10 min,

4°C). Le culot cellulaire est lysé dans du tampon de solubilisation contenant 50

mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, et

inhibiteurs de protéases et phosphatases (Complete EDTA-free et PhosphoStop

respectivement, Roche Diagnostics), 1 heure à 4°C sous agitation. L’homogénat

est ensuite centrifugé à 20 000 g pendant 2 min à 4 °C. Le surnageant est

récupéré puis soumis au dosage colorimétrique de Bradford en utilisant la BSA

comme standard. L’immunoprécipitation proprement dite est ensuite réalisée

sur des quantités de protéines équivalentes, en présence de billes d’agarose

couplées à un anticorps anti-tag T7 (mouse monoclonal T7 tag agarose beads,

EMD Millipore Merck, Allemagne) sur la nuit à 4 °C dans un rapport 12µg de

billes pour 1 mg de protéines. Les billes sont ensuite lavées successivement

dans des tampons Tris-HCl 50mM, NaCl 150 mM, NP40 0,5 %, EDTA 5 mM

puis Tris-HCl 50mM, NaCl 150 mM, NP40 0,5 %, et enfin Tris-HCl 50mM,

NP40 0,5 %.

IV.1.1 Préparation de l’échantillon pour le Western-Blot

Les billes sont ensuite resuspendues dans du tampon Laemmli 2x

(concentration finale : Tris pH 6,8 50 mM, 2% SDS, 10% glycérol, 0,02% Bleu

de Bromophénol, 5% beta mercapto-éthanol). Les échantillons sont ensuite

dénaturés 5 minutes à 95°C et déposés sur un gel SDS-PAGE.

95

IV.1.2 Préparation de l’échantillon pour l’analyse protéomique

Les billes sont resuspendues dans du tampon Laemmli 2x (soit en

concentration finales : Tris pH 6,8, 50 mM, 2% SDS, 10% glycérol, 0,02% Bleu

de Bromophénol, 30 mM DTT) puis dénaturé 5 min à 95°C. L’échantillon,

exempt de billes, est ensuite alkylé en présence de iodoacétamide 90 mM

pendant 30 minutes dans l’obscurité puis séparé par électrophorèse SDS-

PAGE. Le gel est ensuite incubé dans du bleu de Coomassie (17% ammonium

sulfate, 34% méthanol, 3% acide orthophosphorique and 0.1% Brilliant Blue

G-250) pendant 24 h. Le gel est ensuite incubé dans de l’acide acétique 1% afin

de le décolorer.

VI.2 Immunoprécipitation hNPFF2R-YFP

De la même manière que durant l’immunoprécipitation T7, les cellules à

confluence sont déprivées en sérum puis traitées (1DMe) ou non (contrôle)

dans du KRH. Après une courte centrifugation, le culot cellulaire est lysé dans

le tampon de solubilisation décrit plus haut durant une heure. Après une

nouvelle centrifugation (20 000 g, 2 min, 4°C) les échantillons sont soumis à

un preclearing de 3 heures, 4°C sous agitation en présence de 50µl/ml de billes

EZview red protein A affinity gel (Sigma). Les échantillons sont ensuite soumis

à une centrifugation 12 000 g, 30 sec, 4°C. Un dosage colorimétrique de

Bradford (Sigma) est ensuite réalisé en utilisant la BSA comme standard, afin

de réaliser l’immunoprécipitation sur les mêmes quantités de protéines. Les

surnageants sont ensuite incubés en présence de l’anticorps monoclonal de

souris-anti-GFP 4 µg/ml (mAb3E6, Life Technologies) pendant 1h, 4°C sous

agitation. Les échantillons sont ensuite soumis à l’immunoprécipitation

proprement dite durant la nuit, 4°C sous agitation avec les billes 50µL/ml. Les

billes sont ensuite lavées, comme dans l’immunoprécipitation anti-T7, dans les

trois tampons contenant Tris, NP40, NaCl, EDTA, puis Tris, NP40, NaCl et

enfin Tris, NP40. Après exclusion des billes par centrifugation, les échantillons

sont ensuite préparés pour l’analyse protéomique comme mentionné plus haut.


VII. Phosphorylation in vitro

L’extrémité C-terminale du récepteur NPFF2 humain, fusionnée au fragment

GST-Thrombine est purifiée sur colonne d’affinité, MicroSpin GST Purification

Module (GE Healthcare) selon les instructions du fabricant. Après induction

avec 0.2mM d’IPTG, les bactéries transformées (E coli, BL21), sont lysées par

sonication dans du tampon Tris 50mM, EDTA 2 mM, Triton X100 0.1%,

lysozyme 1 mg/ml contenant des inhibiteurs de protéases (Complete EDTA-free

cocktail, Roche Diagnostics). Après centrifugation le surnageant est déposé sur

colonne. Les lavages sont réalisé avec du PBS contenant 0.1 % de Triton X-100

puis avec du PBS contenant 400 mM de NaCl. L’élution est réalisée avec du

Glutathion 10mM, Tris 50mM pH=8. Le fragment ainsi purifié (4µg) est soumis

à la phosphorylation par la GRK2 (0.4µg, don du Pr J. Benovic, Thomas

Jefferson University, Philadelphia) dans un milieu contenant 20mM HEPES,

1mM DTT, 1mM EDTA, 5mM MgCl2 et 200µM ATP durant 2h à 30°C.

L’échantillon (volume final de 20 µl) est ensuite préparé pour l’électrophorèse

SDS PAGE et l’analyse protéomique comme mentionné plus haut.

VIII. Digestion par la trypsine et analyse nano-LC-MS/MS

Après séparation des protéines par SDS-PAGE, le gel est coloré au bleu de

Coomassie. La bande correspondant au récepteur T7-rNPFF2 à 95 KDa,

hNPFF2-YFP à 130 KDa ou GST-hNPFF2 (36 KDa) est découpée et soumise à la

digestion par la trypsine comme décrit précédemment dans l’étude des sites de

phosphorylation du récepteur MOP [249]. Les bandes de gel sont mises à

incuber dans une solution de trypsine à 20ng/µl (Proméga), bicarbonate

d’amonium 50mM, d’abord 15 minutes à 4°C puis à 37°C, 18h. Le surnageant

est ensuite prélevé et conservé. Les morceaux de gels sont incubés avec du

bicarbonate d’ammonium sous agitation durant 15 minutes à 37°C. Le

surnageant est prélevé et ajouté au premier. Une nouvelle incubation des

morceaux de gel est ensuite réalisée dans un mélange eau milli-Q-acétonitrile-

acide formique (50/50/5) durant 15 minutes à 37°C sous agitation. Cette étape

qui permet l’extraction des peptides les plus hydrophobes est répétée deux fois.

L’ensemble des surnageants prélevés sont réunis et déshydratés dans un

97

évaporateur rotatif. Les extraits de peptides séchés correspondant au récepteur

hNPFF2-YFP ou T7-rNPFF2 sont ensuite soumis à une chromatographie liquide

« nano » (nano-LC) dans un système Ultimate 3000 (Dionex, Pays-bas) couplé

au spectromètre de masse (LTQ Orbitrap Velos, Thermo Fisher Scientific,

Allemagne). Les peptides sont ensuite fragmentés selon une procédure

alternative, par ETD (electrotransfer dissociation) ou par CID (collision induced

dissociation). Pour le fragment C-terminal GST-thrombine-hNPFF2 le système

Ultimate 3000 est couplé au spectromètre LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher

Scientific, Bremen, Allemagne). Le spectromètre LTQ Orbitrap XL a été calibré

sur un mode d’acquisition dépendant des données grâce au logitiel XCalibur

(version 2.0 SR2, Thermo Fisher Scientific, Allemagne) permettant une fenêtre

d’exclusion de 60 secondes afin d’éviter des sélections répétées du même

peptide. Le scan MS a été réalisé dans l’Orbitrap sur des valeurs m/z de 300-

2000 avec une résolution de 60 000 pour une valeur m/z de 400. Les cinq ions

dont les pics MS étaient les plus intenses ont ensuite été sélectionnés pour une

analyse en tandem (MS/MS) et les fragments générés ont été analysés par

trappe linéaire. L’énergie de collision a été réglée à 35 %.

IX. Recherche dans les bases de données et

détermination du ratio d’abondance des peptides

NPFF2 phosphorylés

La liste des pics a automatiquement été extraite des fichiers bruts de XCalibur

en utilisant le logiciel Proteome Discoverer (version 1.4, Thermo Fisher

Scientific, France). Les paramètres ont été réglés comme précédemment [249].

L’intervalle de masse a été fixé à 300–5000 Da, sans groupement des scans

MS/MS. Afin de simplifier les spectres ETD, le module “non-fragmented filter” a

été utilisé avec des fenêtres d’exclusion des ions parents de 4 Da. Les

précurseurs réduits et chargés ainsi que les précurseurs neutres provenant des

peptides chargés réduits sont exclus avec une fenêtre de 2 Da, la masse

maximale de la perte étant fixée à 120 Da. Seules les modifications de type

oxydation et phosphorylation ont été considérées comme dynamiques. Les

autres modifications telles que la carbamidométhylation des cystéines ont été


considérées comme fixes. La liste des pics a été recherchée dans les bases de

données SwissProt, TrEMBL humaine ou de rat en ajoutant les séquences des

Tags de chaque récepteur ou fragment de récepteur, grace au logiciel Mascot

(version 2.3.01, Matrix Science, UK). Une tolérance de trois clivages manqués

par la trypsine a été choisie. Pour les récepteurs T7-rNPFF2 et hNPFF2-YFP les

tolérances de masse pour la MS étaient de ± 10 ppm et pour la MS/MS de 0.6

Da. Pour le fragment GST-Thrombine-hNPFF2 les tolérances étaient de ± 10

ppm pour la MS et de 0.8 Da pour la MS/MS. La localisation des sites de

phosphorylation identifiés a été réalisée grâce à l’algorithme phophoRS 3.1

[409] contenu dans le logiciel Proteome Discoverer. La probabilité de la

localisation d’un phospho-résidu était ensuite calculée et la valeur 0.75 a été

utilisée comme seuil. L’aire des pics a été mesurée automatiquement à partir

du chromatogramme des ions de chaque peptide extrait dans le fichier brut de

la nano-LC-MS grâce à l’utilisation du module Label-Free d’un logiciel

développé dans le laboratoire (MFPaQ version 4.0.0) [410]. Afin de calibrer les

quantités de récepteurs NPFF dans chaque échantillon, une normalisation a

été réalisée. Cette normalisation est basée sur la somme des aires des pics

obtenus après la chromatographie des peptides du récepteur NPFF identifiés

par rapport à des peptides de référence du récepteur NPFF, non modifiés et

toujours présents dans l’échantillon. Les peptides de références pour le

récepteur hNPPF2-YFP étaient: 200TSPVYWCR207 dans la séquence du récepteur

et 428GEELFTGVVPILVELDGDVNGHK450, 451FSVSGEGEGDATYGK465,

470FICTTGK476, 565LEYNYNSHNVYIMADK580,

593HNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSK630 dans la séquence

YFP.

X. Western Blot

X.1 Phospho-thréonine et T7

Après avoir été bouillis 5 min à 95 °C les extraits sont déposés sur gel SDS-

PAGE 10 % acrylamide (37,5 :1). Après séparation, les protéines sont

transférées sur membrane PVDF (polyvinylidene difluoride). L’immunoblot est

ensuite réalisé selon les conditions standards. Un blocage est réalisé durant 1

99

heure dans du TBS (Tris-buffered saline : 20 mm Tris, pH 7.6, 137 mM NaCl)

Tween 0,2 %, 5 % lait ou 3 % BSA pour les immunoblots dirigés contre les

phospho-thréonines. La membrane est ensuite incubée en présence de

l’anticorps primaire sur la nuit à 4 °C (anti-phopho-thréonine 1µg/ml,

Invitrogen). Pour la normalisation, les membranes sont incubées avec un

anticorps anti-tag T7 (1/20 000 mouse monoclonal Merck Millipore). Après

trois lavages, la membrane est incubée une heure avec l’anticorps secondaire

couplé HRP (Horse radisch peroxidase) correspondant (anti-lapin et anti-souris,

Jackson scientific,1/10 000). Après trois nouveaux lavages l’immunoréactivité

est révélée à l’aide du kit de détection ECL 2 (Pierce Thermo Scientific). Les

films sont scannés sur un densitomètre GS 900 (Bio-Rad) et quantifiés à l’aide

du logiciel Quantity One (Bio-Rad) en utilisant la quantité totale de récepteur

comme standard interne.

X.2 pERK et ERK

Le jour précédent l’expérience les cellules sont ensemencées dans une plaque

24 puits. Après traitement ou non (condition contrôle) par le 1DMe dans du

tampon KRH, les cellules sont directement récupérées dans du tampon

Laemmli 1x. Les échantillons sont ensuite dénaturés 5 min à 95°C puis

déposés sur gel SDS-PAGE. Le transfert est ensuite réalisé dans les mêmes

conditions que pour les Western Blots anti-phosphothréonine et T7. Après

blocage dans du TBST, lait 5%, la membrane est incubée avec un anticorps de

lapin anti-phospho (Thr202/Tyr204)-p44-42 MAPK (Cell Signaling Technology,

France). Pour la normalisation les membranes sont incubées avec un anticorps

de lapin anti-p44/p42 MAPK (Cell Signaling Technology, France). Les

membranes sont ensuite traitées comme décrit plus haut. La quantification est

réalisée de la même manière que pour les Western Blots anti-phospho-

thréonines, en utilisant cette fois ERK total comme standard interne.

XI. Mesure des taux de calcium intracellulaire

L’imagerie calcique est réalisée comme décrit précédemment [7]. Le jour

précédant l’expérience, les cellules sont ensemencées dans des boites de 35

mm. Pour le traitement à la PTX les cellules sont incubées dans le milieu


contenant 100 ng/ml de PTX durant 18 heures. Le jour de l’expérience le

milieu de culture est remplacé par du tampon HEPES 10mM, NaCl 150 mM,

KCl 5mM, glucose 10 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1mM. Les cellules sont incubées

durant 10 min. Les cellules sont ensuite incubées 30 min dans le tampon

HEPES contenant 3.6 µM de Fluo-4-AM (Molecular probes, Pays-Bas) et 0.1 %

d’acide pluronique dans l’obscurité à 37°C. Le milieu est ensuite remplacé par

du tampon HEPES auquel est ajouté 0.1 % BSA et les cellules sont incubées à

température ambiante durant 15 minutes supplémentaires. Les cellules sont

ensuite perfusées tout le long de l’expérience avec du tampon HEPES

contenant de la BSA +/- 1DMe 1µM et, le cas échéant, l’inhibiteur de la PLC,

U73122, 10 µM. Les cellules sont observées à l’objectif 40/0.65. La

fluorescence émise est visualisée après excitation à 488 nm. L’objectif connecté

à une caméra CCD (charge coupled device) couplé au logiciel de traitement des

images Meta View (Universal Imaging Corporation) pour l’acquisition des

données en continu. L’intensité moyenne des pixels de chaque cellule est

mesurée sur la totalité du champ d’observation. L’intensité de fluorescence est

exprimée sous forme F/F0 où F est la fluorescence au temps t et F0 la

fluorescence moyenne des mesures effectuées lors des 20 premières secondes

de l’enregistrement avant perfusion par l’agoniste.

XII. Immunocytochimie

Le jour précédant l’expérience, 150 000 cellules sont ensemencées sur lamelles

de verre dans des plaques 24 puits. Dans le cas du prétraitement à la PTX, les

cellules sont incubées 18 heures dans le milieu de culture contenant la PTX à

100 ng/ml. Le jour de l’expérience, les cellules sont rincée dans du KRH puis

traitées ou non (contrôle) dans du KRH contenant le 1DMe à 1 µM pendant 30

min. A la fin de la stimulation, les cellules sont rincées dans du PBS froid puis

fixées et perméabilisées sur glace dans du PBS contenant du paraformaldehyde

(PFA) 3,7 % et du triton X-100, 0.2 %. Après rinçage, les cellules sont incubées

dans du PBS, SVF (sérum de veau fœtal) 10 %, BSA 2 % pendant 1 heure à

température ambiante. Trois rinçages dans du PBS SVF 2 % sont ensuite

réalisés. L’anticorps primaire (anti-tag T7, monoclonal de souris, Merck

millipore, 1/2000) est ensuite incubé sur la nuit à 4 °C. Trois rinçages sont

101

effectués afin d’éliminer l’anticorps primaire n’ayant pas réagi ou engagé dans

une liaison de faible affinité (non spécifique). Les cellules sont ensuite incubées

en présence de l’anticorps secondaire (anti-souris-AlexaFluor488, Invitrogen,

1/400) durant 1 heure à température ambiante. Après trois nouveaux rinçages

les lamelles sont montées sur lames de verre dans du milieu de montage

(Vectashield, Vector Laboratories, AbCys, France). La fluorescence émise après

excitation du fluorophore à 488 nm est observée au microscope confocal

Olympus (FV 1000) à l’objectif x60/NA1.4. Les images sont ensuite traitées

grâce au logiciel ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda). La

quantification est réalisée à l’aide du logiciel de traitement d’image, Metamorph

(Molecular Devices, USA). Pour chaque cellule, la mesure des intensités

moyennes de la membrane et de la totalité de la cellule sont mesurées.

L’internalisation est ensuite calculée selon l’équation suivante : 100 -

[(fluorescence à la membrane1DMe / fluorescence totale1DMe) x100) / (fluorescence

à la membranecontrole / fluorescence totalecontrole)].

XIII. Recrutement de la-arrestine

La transfection transitoire de la -arrestine 2 couplée à la GFP (don du Pr S.

Allouche) a été réalisée par électroporation grâce au kit Amaxa Cell Line

Nucleofection (Lonza, Allemagne) en suivant les instructions du fabricant.

Après électroporation les cellules sont ensemencées sur des lamelles en verre

dans des plaques 24 puits. 48 heures après transfection, les cellules sont

incubées dans le milieu déprivé en sérum (0.5% SVF) durant 2 heures. Les

cellules sont ensuite rincées dans du KRH puis incubées à température

ambiante dans du KRH (condition contrôle) ou KRH contenant du 1DMe à 1µM

durant 30 minutes. Les cellules sont ensuite fixées et montées comme pour

l’immunocytochimie. La fluorescence est ensuite visualisée au microscope

confocal Olympus à l’objectif 60x/NA1.4.

RESULTATS

103

RESULTATS

I. Identification des phosphorylations impliquées dans

la régulation de l’activité du récepteur NPFF2

I.1 Identification du profil de phosphorylation du récepteur

NPFF2 par spectrométrie de masse

Nous avons établi une lignée cellulaire SH-SY5Y exprimant le récepteur NPFF2

de rat taggé T7 en N-terminal. Ce tag nous permettra de purifier le récepteur

par immunoprécipitation afin d’effectuer les analyses en spectrométrie de

masse et de déterminer son profil de phosphorylation. Le récepteur a été

caractérisé par saturation à l’équilibre et par dosage des taux intracellulaires

d’AMPc après stimulation par la forskoline (tableau 7). L’affinité du récepteur

pour le ligand de référence ([3H]EYF, [323]) est de l’ordre du nonamolaire

(KD=4.1 nM) et est comparable aux affinités évaluées sur les récepteurs humain

et de souris [7,399]. Le récepteur est fonctionnel et inhibe l’adénylyl cyclase

avec une CE50 de 32 pM et apparait nettement inférieure à celles obtenues sur

les récepteurs humain et de souris [7,399] (voir plus loin pour une

comparaison détaillée avec le récepteur humain).

Pour les analyses en spectrométrie de masse, le récepteur a été purifié par

immunoprécipitation puis séparé sur un gel de polyacrylamide SDS. Après

coloration du gel, la bande correspondant au récepteur (à 95 KDa) a été

découpée puis soumise à une digestion par la trypsine afin d’être analysé.

Cependant, l’analyse par nano-LC MS/MS n’a donné que peu de résultats. La

somme des aires des pics correspondant aux peptides du récepteur ne

représentait que 8 ± 2% de la totalité des aires des pics des peptides présents

dans l’échantillon (n=8) indiquant un rapport signal/bruit de fond défavorable.

De plus la détection et la quantification des peptides étaient gênées par un fort

taux d’oxydation et un grand nombre de clivages manqués dans les

échantillons. Comme dans l’étude précédente sur la phosphorylation du

104 Résultats

récepteur MOP [249], l’efficacité de l’immunoprécipitation du récepteur taggé

YFP était élevée, et l’analyse MS/MS donnait des résultats clairs nous avons

utilisé une lignée cellulaire SH-SY5Y exprimant cette fois le récepteur NPFF2

humain taggé YFP en C-terminal [111], en supposant que les sites de

phosphorylation importants devraient être conservés entre le récepteur humain

et de rat (figure 39). En effet, la séquence du récepteur de rat montre 22 sites

de phosphorylation possibles alors que la séquence du récepteur humain en

possède 18 dont 12 sont conservés entre les deux espèces.

hNPFF2-YFP 366KAKSHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYRKSAEKPQQELVMEELKETTNSSEI420ESAMVSK

rNPFF2 363RAKRNLDINTSGLLVHEPASQNPSGENLGCRKSADNPTQESLMEETGEATNSTET417

CE50 (nM) Kd (nM) Bmax (pmole/mg)

SH-hNPFF2-YFP 1.4 ± 0.6 2.7 ± 0.3 1.5 ± 0.2

SH-T7-rNPFF2 0.032 ± 0.008 4.1 ± 0.4 7.4 ± 0.4

Tableau 7: Caractérisation pharmacologique des récepteurs hNPFF2-YFP et T7-rNPFF2 exprimés dans les cellules SH-SY5Y. Les paramètres de liaison ont été obtenus par liaison du ligand [3H]EYF. Les paramètres de signalisation (CE50) ont été obtenus par mesure des taux intracellulaire d’AMPc après stimulation par la forskoline. Les données représentent les moyennes ± SEM d’au moins trois expériences réalisées en double et indépendamment. * : p<0.05 mesuré dans un t-test non apparié. Au-dessus du tableau figurent les séquences C-terminales des récepteurs humain et de rat. Les résidus potentiellement phosphorylables et conservés entre les deux espèces sont colorés en rouge, les résidus phosphorylables spécifiques à chacune des espèces sont colorés en bleu.

Le récepteur hNPFF2-YFP a donc été caractérisé afin de confirmer les

paramètres pharmacologiques obtenus précédemment [111] et de les comparer

à ceux obtenus sur le récepteur de rat. L’affinité du récepteur pour le ligand de

référence déterminée par saturation à l’équilibre (KD=2.7nM) est comparable

aux affinités évaluées sur cellules modèles [7,323] et à celle obtenue pour le

récepteur de rat (KD=4.1nM). Les deux récepteurs sont fonctionnels. Le

récepteur humain inhibe la production d’AMPc après stimulation par la

forskoline avec une CE50 de 1.4 nM, similaire aux CE50 précédemment

évaluées sur ce modèle [7,111]. Le récepteur de rat semble, dans ce même test,

être particulièrement puissant puisque la CE50 mesurée est de 32 pM soit près

de 50 fois inférieure à celle obtenue pour le récepteur humain (p<0.05). Cette

différence dans la puissance du récepteur à inhiber l’adénylyl cyclase apparait

donc comme une caractéristique spécifique au rat et sera plus amplement

étudiée et détaillée par la suite.

Le récepteur humain a ensuite été purifié par immunoprécipitation puis séparé

sur un gel de polyacrylamide SDS, comme pour le récepteur T7-rNPFF2. Afin de

déterminer l’emplacement exact du récepteur, un gel suivi d’un Western Blot

105

avec un anticorps anti-GFP a été réalisé en parallèle (figure 39A panneau de

gauche). Le gel prévu pour l’analyse protéomique a été coloré au bleu de

coomassie puis la bande à 130 KDa, correspondant au récepteur (figure 39A

panneau de droite) a été découpée et soumise à une digestion par la trypsine

avant d’être analysée en nano-LC-MS/MS. Ainsi, nous avons obtenu des

spectres montrant les intensités des pics des peptides détectés en fonction de

leur masse (m/z) (figure 39 C et D).

Comparé au T7-rNPFF2, les résultats obtenus avec le hNPFF2-YFP étaient

meilleurs, avec un signal plus fort et un ratio signal/bruit de fond plus

important. Le somme des aires des peptides spécifiques au récepteur

représentait 25 ± 4% du signal MS total (n=10). Afin d’optimiser l’identification

des phosphorylations nous avons utilisé deux types de fragmentation couplés

aux logiciels Proteome Discoverer et Mascot. La dissociation par collision (CID :

collision induced dissociation) nous a permis d’avoir une couverture de la

séquence du récepteur de 38 à 51%, alors que la méthode par électrotransfert

(ETD : electro transfer dissociation) a permis une couverture de 19 à 43%.

Les phosphorylations induites par la liaison de l’agoniste ont été déterminées

après traitement des cellules 30 min avec le 1DMe (1µM) à température

ambiante avant de purifier le récepteur et de le soumettre à la nano-LC

MS/MS. La quantification des peptides phosphorylés a été effectuée grâce à la

méthode de quantification relative label-free, en utilisant comme référence des

peptides non modifiés présents soit dans la séquence du récepteur soit dans la

séquence de l’étiquette YFP car ces peptides sont toujours détectés et

permettent de normaliser la quantité de récepteur dans chaque échantillon.

Les spectres montrant les intensités des pics des peptides détectés en fonction

de leur masse (m/z) (figure 39 C et D) nous ont permis d’identifier les peptides

non phosphorylés, mono-phosphorylé et di-phosphorylés. La liste des peptides

phosphorylés identifiés et des peptides correspondants non phosphorylés est

présentée dans le tableau 8. Mise à part la T157 de la seconde boucle

intracellulaire, tous les sites possibles de phosphorylation ont été couverts par

l’analyse (figure 38). Tous les sites phosphorylés identifiés sont détectés dans la

partie C-terminale du récepteur.

106 Résultats

Tableau 8: Liste des peptides phosphorylés et non phosphorylés du récepteur hNPFF2 identifiés par nano-LC MS/MS dans les cellules SH-SY5Y et identifiés par phosphorylation in vitro par la GRK2 purifiée sur le fragment C-ter du récepteur couplé à la GST. Les résidus phosphorylés sont en rouge et entre parenthèse lorsqu’il y a eu ambiguïté sur la position de la phosphorylation. Les peptides ont été quantifiés grâce à la méthode « label-free » du logiciel MFPaQ v4.0. Leur quantité a été calibrée dans chaque échantillon par rapport aux peptides de référence du récepteur NPFF. Le ratio 1DMe/contrôle correspond au ratio des aires des pics de la condition traité par rapport à la condition contrôle, et sont exprimés en moyenne ±

SEM. (n) est le nombre de fois où le peptide a été identifié au cours des cinq expériences. Dans le cas où

un peptide était identifié dans une condition mais pas dans l’autre la valeur de l’aire du 5ème percentile de la totalité des peptides a été utilisée pour remplacer la valeur manquante. Les données de phosphorylation in vitro sont représentatives de deux expériences réalisées indépendamment. Théo. Mass. : Masse théorique, MC : clivage manqué.

Theo. Mass. MC Position Sequence Phospho-residue

3423.7535 1 367-396 AKSHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 1.28 (1)

3503.7198 1 367-396 AKSHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 1P pS369 0.47 ± 0.24 (3)

3583.6861 1 367-396 AKSHVLIN(T)(S)NQLVQESTFQNPHGETLLYR 2P pS369 + pT375 or pS376 65.44 (1)

3224.6214 0 369-396 SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 0.58 ± 0.23 (5)

3304.5877 0 369-396 SHVLIN(T)(S)NQLVQESTFQNPHGETLLYR 1P pT375 or pS376 6.23 ± 3.29 (3)

3304.5877 0 369-396 SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 1P pS376 13.49 ± 5.25 (2)

3384.5541 0 369-396 SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 2P pT375 + pS376 10.43 (1)

3384.5541 0 369-396 SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 2P pS369 + pS376 32.28 (1)

1757.8869 1 398-412 SAEKPQQELVMEELK 0.59 ± 0.12 (5)

1837.8533 1 398-412 SAEKPQQELVMEELK 1P pS398 0.52 ± 0.17 (5)

1885.9819 2 397-412 KSAEKPQQELVMEELK 0.38 ± 0.05 (5)

1965.9482 2 397-412 KSAEKPQQELVMEELK 1P pS398 0.29 ± 0.06 (2)

3479.7011 3 397-427 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEIESAMVSK 0.14 ± 0.07 (5)

3559.6773 3 397-427 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEIESAMVSK 1P pS398 0.04 (1)

3351.6061 2 398-427 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEIESAMVSK 0.22 ± 0.06 (5)

3431.5725 2 398-427 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEIESAMVSK 1P pS398 0.14 ± 0.07 (2)

1611.7298 0 413-427 ETTNSSEIESAMVSK 0.23 ± 0.04 (5)

1691.6961 0 413-427 ETTNSSEIESAMVSK 1P pS418 0.36 ± 0.14 (3)

2827.3198 3 288-311 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P pT415

2827.3198 3 288-311 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P pT414

2827.3198 3 288-311 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P pS417

2907.2861 3 289-311 KSAEKPQQELVMEELKETTN(S)(S)EI 2P pT415 + pS417 or pS418

2699.2248 2 289-311 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P pT415

2699.2248 2 289-311 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P pS417

2699.2248 2 289-311 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P pS418

2779.1911 2 289-311 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 2P pT415 + pS418

hNPFF2-YFP

Peptide ratio

(1DMe/Control)

hNPFF2 C-term / in vitro GRK2

107

Figure 38: Alignement des séquences des récepteurs NPFF2 humain (hNPFF2) et de rat (rNPFF2). Les acides aminés conservés entre les deux espèces sont surlignés en gris. Les sites possibles de

phosphorylation sont surlignés en noir. La position des segments transmembranaires est indiquée au-dessus des séquences.

Le premier peptide SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR, parfois allongé de

deux résidus (AK) en partie N-terminale à cause d’un clivage manqué, était

présent sous plusieurs formes, non phosphorylé, phosphorylé sur les résidus

S369, T375, S376, ou doublement phosphorylés avec des combinaisons

différentes sur les trois résidus. Après traitement par l’agoniste, l’abondance

des peptides phosphorylés sur les résidus T375 et/ou S376 était augmentée,

alors que les formes non phosphorylées ou phosphorylées sur la S369 étaient

diminuées. Ce qui indique une diminution des peptides non phosphorylés au

profit des peptides phosphorylés et suggère que la phosphorylation du résidu

S369 n’est pas régulé par l’agoniste. L’activation du récepteur par le 1DMe

induit donc la phosphorylation du doublet 375TS376.

Les données concernant le peptide final (fusionné à la YFP) ont été plus

difficiles à interpréter. La digestion par la trypsine n’ayant pas été très efficace,

les peptides obtenus étaient de tailles variables avec jusqu’à trois clivages

manqués (tableau 8). Parmi ces peptides, seulement deux phosphorylations ont

pu être identifiées de façon reproductible : S398 et S418. De façon étonnante,

le traitement par l’agoniste diminuait l’abondance de tous les peptides, qu’ils

soient phosphorylés ou non. La diminution des peptides non phosphorylés ne

se fait donc pas au profit des peptides phosphorylés. Par conséquent, d’autres

modifications dans cette région pourraient intervenir et être à l’origine de la

perte de détection du fragment par notre technique. Cependant la recherche de

résidus ubiquitinylés, grâce au logiciel Mascot, n’a pas révélé ce type de

modification sur la partie C-terminale du récepteur. Une autre explication

I II

hNPFF2R MNEKWDTNSSENWHPIWNVNDTKHHLYSDINITYVNYYLHQPQVAAIFIISYFLIFFLCMMGNTVVCFIVMRNKHMHTVTNLFILNLAISDLLVGIFCMP

rNPFF2R MGKRWDSNSSGSWDHIWSGNDTQHPWYSDINITYMNYYLHQPHVTAVFISSYFLIFFLCMVGNTVVCFVVIRNRYMHTVTNFFIFNLAISDLLVGIFCMP

1 50 100

III IV

hNPFF2R ITLLDNIIAGWPFGNTMCKISGLVQGISVAASVFTLVAIAVDRFQCVVYPFKPKLTIKTAFVIIMIIWVLAITIMSPSAVMLHVQEEKYYRVRLNSQNKT

rNPFF2R ITLLDNIIAGWPFGSSMCKISGLVQGISVAASVFTLVAIAVDRFRCVVYPFKPKLTVKTAFVMIVIIWGLAITIMTPSAIMLHVQEEKYYRVRLSSHNKT

150 200

V VI

hNPFF2R SPVYWCREDWPNQEMRKIYTTVLFANIYLAPLSLIVIMYGRIGISLFRAAVPHTG.RKNQEQWHVVSRKKQKIIKMLLIVALLFILSWLPLWTLMMLSDY

rNPFF2R STVYWCREDWPNQEMRRIYTTVLFATIYLAPLSLIVIMYARIGASLFKTSAHSTG.KQRLEQWHV.SKKKQKVIKMLLTVALLFILSWLPLWTLMMLSDY

250 300

VII

hNPFF2R ADLSPNELQIINIYIYPFAHWLAFGNSSVNPIIYGFFNENFRRGFQEAFQLQLCQKR.AKPMEAYALKAKSHVLINTSNQL.VQESTFQNPHGETLLYRK

rNPFF2R ADLSPNKLRVINIYVYPFAHWLAFCNSSVNPIIYGFFNENFRSGFQDAFQF..CQKK.VKPQEAYGLRAKRNLDINTSGLL.VHEPASQNPSGENLGCRK

350 400

hNPFF2R SAEKPQQELVMEELKETTNSSEI.......420

rNPFF2R SADNPTQESLMEETGEATNSTET.......417

108 Résultats

pourrait être qu’une phosphorylation hétérogène et/ou une multi-

phosphorylation soit responsable de la production d’un grand nombre de

peptides différemment modifiés ne pouvant pas être détectés par notre analyse

car présents individuellement en trop faible quantité.

Nous avons utilisé le logiciel de prédiction de phosphorylation GPS [199], qui

nous a permis d’identifier un site consensus pour la GRK2 dans l’extrême

partie C-terminale du récepteur ce qui laisse supposer qu’elle pourrait être

impliquée dans la phosphorylation du cluster 414TTNSS418. Nous avons donc

entrepris des expériences de phosphorylation in vitro avec la kinase purifiée. La

GRK2 et le fragment C-terminal (85 résidus) du récepteur NPFF2 fusionné à la

GST, incubé en présence d’ATP pendant deux heures. Le fragment a ensuite été

purifié et isolé par SDS-PAGE (figure 39B). Le fragment, digéré par la trypsine a

ensuite été soumis à une nano-LC MS/MS de façon similaire au récepteur

total. La liste des peptides phosphorylés est présenté dans le tableau 8 et,

comme prédit par le logiciel GPS, tous les peptides montrent des

phosphorylations dans le cluster 414TTNSS418. Ces peptides étaient

phosphorylés de façon hétérogène et/ou multi-phosphorylés. Ils portaient soit

une phosphorylation simple sur l’un des résidus T414, T415, S417, S418, soit

une double phosphorylation T415 + S417 ou S418.

L’analyse protéomique par MS/MS nous a donc permis d’identifier les sites de

phosphorylation du récepteur NPFF2 humain. Tous ont été identifiés dans la

partie C-terminale du récepteur. La S398, le doublet 375TS376 et le cluster final

414TTNSS418 sont apparus phosphorylés. Le doublet 375TS376 et le cluster

414TTNSS418 semblent régulés par l’agoniste. La S369 apparait comme

phosphorylée à l’état basal et ne semble pas régulée par la liaison de l’agoniste.

109

Figure 39: Identification des

sites de phosphorylation par spectrométrie de masse. (A) Isolation du récepteur hNPFF2 couplé à la YFP. Sur la gauche : Western Blot anti-GFP après immunoprécipitation du récepteur. Sur la droite : Gel coloré au bleu de Coomassie obtenu à partir de l’immunoprécipitat, pour l’analyse protéomique. Les pointillés montre l’emplacement du gel découpé qui est soumis à la digestion par la trypsine pour la nano-LC MS/MS. (B) Gel coloré au bleu de

coomassie après purification du fragment C-terminal du récepteur hNPFF2 couplé à la GST. (C et D) Spectres MS/MS obtenu après analyse protéomique. (C) Spectre MS/MS du peptide phosphorylé sur le doublet 375TS376 (369-

SHVLINpTpSNQLVQESTFQNPHGETLLYR -396), obtenu après fragmentation CID (le peptide précurseur porte 3 charges positives (MH3+) et une m/z de 1129.1885). Les séries d’ions b et y indiquent que les résidus T375 et S376 sont phosphorylés. (D) Spectre MS/MS obtenu après fragmentation ETD du peptide 397- pSAEKPQQELVMEELK -412 portant une phosphorylation (le peptide précurseur porte 3 charges positives à m/z = 613.6251). Les séries d’ion c et z montrent que la S398 est phosphorylée. Les phosphorylations sont indiquées sur la séquence des peptides au-dessus de chaque spectre.

Mise à part la S369, tous les résidus identifiés comme étant phosphorylés chez

l’homme sont retrouvés dans la séquence du récepteur de rat (figure 40). Ces

résidus ont donc ensuite été mutés en alanine (figure 40) afin d’évaluer le rôle

fonctionnel de ces phosphorylations dans la régulation de l’activité du

récepteur NPFF2 de rat, sa signalisation, et son trafic intracellulaire.

110 Résultats

hNPFF2-YFP 366KAKSHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYRKSAEKPQQELVMEELKETTNSSEI420ESAMVSK

GST-C-term/GRK2 286KAKSHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYRKSAEKPQQELVMEELKETTNSSEI311 rNPFF2 363RAKRNLDINTSGLLVHEPASQNPSGENLGCRKSADNPTQESLMEETGEATNSTET417

TS372A (372) .........AA............................................

S382A/S386A (382) ...................A...A...............................

S395A (395) ................................A......................

ST414AA (414) ...................................................AA..

TNST412ANAA (412) .................................................A.AA..

Figure 40: Alignement des séquences de l’extrémité C-terminale des récepteurs hNPFF2-YFP, GST-trombine-hNPFF2 et T7-rNPFF2 et résidus identifiés comme étant phosphorylés en nano-LC MS/MS. En gras et colorés en rouge : les résidus phosphorylés identifiés sans ambiguïté et en bleu, les résidus spécifiques du rat. Les résidus en gras et italique représentent les sites de clivage de la trypsine. En italique à l’extrémité C-ter du hNPFF2-YFP, le linker et la partie N-ter de la YFP. Sur le bas, la position des mutations en alanine des résidus phosphorylés. Le nom simplifié de chaque mutant est indiqué entre parenthèses.

Les résidus T372 et S373, correspondant au TS375/376 chez l’homme, ont été

mutés dans la construction TS372AA. La S395 a été muté en alanine dans le

récepteur mutant S395A (S398 chez l’homme), les résidus S414 et T415 (S417,

T418 chez l’homme) dans la construction ST414AA et le cluster total TNST

dans le mutant TNST412ANAA. Enfin, deux résidus spécifiques au rat, S382 et

S386, identifiés comme étant phosphorylés dans la première partie des

analyses MS/MS faites sur le récepteur de rat, ont aussi été mutés dans la

construction S382A/S386A. Afin de simplifier, pour la suite de l’étude nous

adopterons une appellation conservant uniquement le numéro de la position de

la première mutation, soit 372, 395, 414, 412 et 382 respectivement.

I.2 Analyse des phosphorylations des thréonines du récepteur

T7-rNPFF2 par Western Blot.

Avant d’étudier le rôle de chacun des sites de phosphorylation par mutagénèse

dirigée nous avons étudié la phosphorylation globale sur les résidus Ser et Thr

du récepteur de rat. Les cellules ont été traitées ou non avec le 1DMe 1µM. Le

récepteur a ensuite été immunoprécipité grâce à un anticorps anti-T7. Nous

avons ensuite testé plusieurs anticorps anti-phopho-sérine et anti-phospho-

thréonine afin d’évaluer la phosphorylation du récepteur immunoprécipité par

Western Blot. L’efficacité des anticorps anti-phospho-résidus dépend fortement

de la séquence d’acides aminés entourant la phosphorylation et,

malheureusement, aucun anticorps anti-phospho-sérine n’a été capable de

reconnaitre les phosphorylations basales ou induites par le 1DMe sur le

récepteur rNPFF2. Par contre, un anticorps anti-phospho-thréonine (Life

111

Technologies) nous a permis d’observer une forte augmentation de la

phosphorylation du récepteur après traitement au 1DMe (figure 41).

0 20 40 600

50

100

150

Time (min)

1D

Me

-in

du

ce

d T

hr

Ph

osp

ho

ryla

tio

n

(%

max)

Figure 41: Cinétique de phosphorylation des thréonines du récepteur rNPFF2 exprimé dans les cellules SH-SY5Y. A gauche : Western blot montrant la phosphorylation sur les thréonines du récepteur NPFF2 après différentes durées de stimulation par le 1DMe à 1 µM, ou non traité (0 min). Le récepteur est immunoprécipité grâce à un anticorps anti-T7 puis l’immunoblot est réalisé d’abord avec l’anticorps anti-phospho-thréonine puis avec l’anticorps anti-T7. A droite, Quantification de la phosphorylation sur les thréonines normalisée par rapport à l’intensité intégrée des bandes correspondant au récepteur total (Blot T7) et exprimée en pourcentage de la phosphorylation maximale (à 60min) induite par le 1DMe. Une régression non linéaire a ensuite été réalisée. Les données représentées ici sont issues d’une expérience unique n’ayant pas pu être répétée faute d’outil (anticorps) disponible.

La cinétique de phosphorylation des thréonines du récepteur NPFF2 de rat par

le 1DMe est rapide. Comme le montre la figure 41, la phosphorylation du

récepteur WT intervient rapidement (figure 41) après le début de la stimulation.

Après 2 minutes de stimulation par le 1DMe (1µM) le récepteur est phosphorylé

à 47% de la phosphorylation maximale qui est pratiquement atteinte dès 10

minutes de traitement. La phosphorylation du récepteur WT sur les thréonines

atteint ensuite un plateau et est maintenue au moins durant une heure. Nous

avons donc, pour la suite des expériences, choisi une durée de stimulation de

30 minutes.

Les résultats de l’analyse nano-LC-MS/MS étant parfois ambigus, notamment

sur la position précise des acides aminés phosphorylés, en particulier pour le

récepteur de rat, nous avons voulu évaluer la phosphorylation des thréonines

de chaque mutant par Western Blot (figure 42). La phosphorylation des

récepteurs mutés induite par le 1DMe, évaluée après normalisation avec la

quantité totale de récepteur immunoprécipité, est fortement réduite pour tous

les mutants. Cette diminution est de 81% ± 10 pour le mutant 372, de 88% ± 1

pour le mutant 412 et de 70% ± 15 pour le mutant 414. Ces résultats

confirment ceux obtenus en MS/MS et démontrent la phosphorylation du

112 Résultats

récepteur sur les résidus T372 du doublet 372TS373 et T412 et T415 du cluster

412TNST415, après traitement par l’agoniste.

Figure 42: Analyse de la phosphorylation des récepteur rNPFF2 WT et mutants sur les thréonines par Western Blot. Sur la gauche : Western Blot représentatif de la phosphorylation sur les thréonines des récepteurs rNPFF2 WT et mutants. Les cellules ont été traitées ou non au 1DMe 1µM, pendant 30 minutes et le récepteur immunoprécipité avec l’anticorps anti-T7. Panneau de droite : Quantification de la phosphorylation des thréonines des récepteurs WT et mutants normalisée par rapport au récepteur total, et exprimée en pourcentage de la phosphorylation induite par le 1DMe dans les mutants par rapport au WT (100%). * : p<0.05, *** : p< 0.001 dans un T-test comparé par rapport au récepteur WT. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM de trois expériences réalisées de façon indépendante.

Nous avons ensuite voulu identifier la ou les kinase(s) impliquée(s) dans ces

phosphorylations. Afin de considérer l’implication générale de chaque kinase

dans la phosphorylation des thréonines du récepteur induite par le 1DMe,

nous avons mesuré l’effet de l’inhibition des kinases sur le récepteur sauvage

(WT) (figure 43). La phosphorylation des thréonines du récepteur WT est

partiellement inhibée (de 53% ± 13) après traitement des cellules 18h avec la

toxine pertussique (PTX, 100ng/ml), montrant que la phosphorylation du

récepteur nécessite l’activation d’une protéine Gi/o.

113

Figure 43: Analyse de l’implication des protéines Gi et des kinases dans la phosphorylation sur les thréonines du récepteur rNPFF2 par Western Blot. Panneau de gauche : Western Blots représentatifs montrant la phosphorylation sur les thréonines du récepteur T7-rNPFF2 exprimé dans les cellules SH-SY5Y et immunoprécipité grâce à un anticorps anti-T7. En haut les cellules ont été traitées à la PTX, 18h,

100ng/ml ou à l’inhibiteur GRK2 (ARK1i), 50µM pendant 2h, ou non traitées (condition contrôle). L’agoniste a ensuite été appliqué durant 30 minutes à 1µM. Après immunoprécipiation du récepteur, l’immunoblot est réalisé avec, d’abord l’anticorps anti-phosphothréonine puis anti-T7 pour le récepteur total. En bas : les cellules ont été traitées ou non (contrôle) avec l’inhibiteur de la calcium calmoduline (W7, 20µM) et l’inhibiteur de la PKC (chélérythrine, 10µM) pendant 30 minutes avant la stimulation de 30 minutes par l’agoniste. Sur la droite : Quantification de la phosphorylation des thréonines normalisée par rapport à l’intensité intégrée des bandes correspondant au récepteur total (Blot T7) et exprimée en pourcentage de la phosphorylation induite par le 1DMe dans la condition contrôle. * : p<0.05 dans un T-test comparé par rapport au contrôle. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM de trois

expériences réalisées de façon indépendante.

La phosphorylation du récepteur WT est aussi diminuée (de 59% ± 8) après le

traitement des cellules par l’inhibiteur GRK2, ARKi, confirmant les résultats

obtenu lors de l’analyse MS/MS suggérant l’implication de la GRK2 dans la

phosphorylation du C-terminal du récepteur NPFF2. En revanche, la

phosphorylation n’est pas inhibée par les inhibiteurs W7, ou chélérythrine,

excluant l’implication respective de la CaM Kinase II et de la PKC dans le

processus de phosphorylation du récepteur NPFF2.

L’étape suivante était d’identifier et de déterminer précisément l’implication de

chaque kinase dans la phosphorylation d’un résidu spécifique. Nous avons

donc commencé à étudier les phosphorylations des thréonines des récepteurs

mutants, en commençant par le récepteur 414. Les cellules exprimant le

récepteur mutant 414 ont été traitées à la PTX et à l’inhibiteur de la calcium

calmoduline, comme précédemment avec le récepteur sauvage (figure 44). La

phosphorylation des thréonines du récepteur 414 est fortement diminuée (de

70%) après traitement à la PTX. Elle reste inchangée après traitement à

l’inhibiteur W7.

114 Résultats

PTX W7

0

50

100

150

1D

Me in

du

ced

Th

r P

ho

sp

ho

ryla

tio

n

(%co

ntr

ol)

Figure 44: Western Blot des thréonines phosphorylées du récepteur mutant 414. Panneau de gauche : Western Blots montrant la phosphorylation sur les thréonines du récepteur mutant 414 exprimé dans les cellules SH-SY5Y et immunoprécipité grâce à un anticorps anti-T7. Les cellules ont été traitées à la PTX, 18h, 100ng/ml ou à l’inhibiteur de la calcium calmoduline (W7, 20µM, pendant 30 minutes), ou non traitées (condition contrôle). L’agoniste a ensuite été appliqué durant 30 minutes à 1µM. Après immunoprécipitation du récepteur et l’immunoblot est réalisé, d’abord avec l’anticorps anti-phospho-thréonine puis anti-T7 pour le récepteur total. Sur la droite : Quantification de la phosphorylation de thréonines normalisée par rapport à l’intensité intégrée des bandes correspondant au récepteur total (Blot T7) et exprimée en pourcentage de la phosphorylation induite par le 1DMe par rapport à la condition contrôle. Les données représentées ici sont issues d’une expérience unique.

Les données sont issus d’une expérience unique n’ayant pas pu être répétée

car le fournisseur de l’anticorps anti-phospho-thréonine n’est plus parvenu à le

produire. Cependant, ces résultats confirment l’absence d’implication de la

calcium calmoduline kinase dans la phosphorylation du récepteur NPFF2. Les

sites de phosphorylation toujours présents dans le mutant 414 étant la T412 et

la T372, nous pouvons supposer que la ou les kinase(s) impliquée(s) dans la

phosphorylation d’au moins un de ces deux résidus dépendent de la protéine

Gi.

L’analyse des autres kinases et autres mutants qui était prévue n’a pas pu être

réalisée à cause de la pénurie d’anticorps.

I.3 Effet de la mutation des sites de phosphorylation sur la

signalisation du récepteur rNPFF2

Après création de la lignée stable SH-SY5Y exprimant les récepteur rNPFF2

sauvage (WT) et mutants, la caractérisation des lignées a été réalisée par

études de liaison. Les expériences de saturation à l’équilibre avec le ligand tritié

[3H]EYF ont révélé qu’aucune des mutations des sites de phosphorylation

n’affecte l’affinité du récepteur pour l’agoniste (tableau 9). Les taux

115

d’expression des récepteurs varient dans un intervalle de 1.5 ± 0.7 pmol/mg de

protéine pour le mutant 382, à 13.2 ± 3 pmol/mg de protéine pour le mutant

414 qui a le plus fort taux d’expression.

Binding [3H]EYF Dosage AMPc

KD (nM) Bmax (pmol/mg) CE50 (pM)

WT 4.1 ± 0.4 7.4 ± 0.4 32 ± 8

372 2.0 ± 0.2 4.1 ± 0.3 23 ± 5

382 1.9 ± 0.4 1.5 ± 0.7 134 ± 46 *

395 5.5 ± 2 9.7 ± 3 12 ± 3

414 5.2 ± 1 13.2 ± 3 31 ± 7

412 4.0 ± 0.8 3.3 ± 0.7 18 ± 4

Tableau 9: Propriétés de liaison et de signalisation des récepteur WT et mutants exprimés dans les cellules SH-SY5Y. Les paramètres de liaison ont été obtenus par binding du ligand [3H]EYF. Les paramètres de signalisation (CE50) ont été obtenus par mesure de l’inhibition de la production d’AMPc induite par la forskoline. * p<0.05 par rapport au WT dans le test de Student non apparié.

L’activité des récepteurs a été mesurée dans le test d’inhibition de l’adénylyl

cyclase (figure 45). Tous les récepteurs inhibent la production d’AMPc induite

par la forskoline de façon similaire (tableau 9 et figure 45). Lors de ces

expériences, le 1DMe s’est révélé particulièrement puissant dans l’inhibition de

l’adénylyl cyclase avec une CE50 de 32 pM pour le récepteur WT. Tous les

récepteurs mutants possèdent une CE50 similaire, excepté le mutant 382 qui

montre une CE50 (134 ± 46 pM) quatre fois plus élevée que le récepteur

sauvage. Ceci indique que les mutations des sites de phosphorylation

S382/S386 spécifiques du rat affectent la réponse de l’agoniste et que ceux-ci

semblent donc jouer un rôle dans la signalisation dépendante de la protéine Gi

et l’inhibition de l’adénylyl cyclase.

Figure 45: Inhibition de l’adénylyl cyclase. La mesure des taux intracellulaires d’AMPc a été réalisée après stimulation de

l’adénylyl cyclase par la forskoline en présence de concentrations croissantes de 1DMe sur les récepteurs rNPFF2 WT et mutants exprimés dans les cellules SH-SY5Y. La valeur contrôle (100%) représente l’accumulation d’AMPc induite par la Forskoline en absence

d’agoniste. Les courbes représentent la moyenne ± SEM d’au minimum trois expériences indépendantes effectuées en double. -12 -11 -10 -9 -8

0

50

100

WT

395

414

372

412

382

[1DMe] log (M)

FS

K i

nd

uced

accu

mu

lati

on

of

cA

MP

, %

of

co

ntr

ol

116 Résultats

Nous avons ensuite voulu évaluer la capacité des récepteurs à réguler des voies

de signalisation plus en aval de l’activation du récepteur. Nous avons donc

mesuré l’activation de la voie des MAPK en évaluant la phosphorylation de

ERK1/2, par Western Blot. Le traitement des cellules avec l’agoniste induit la

phosphorylation de ERK rapidement. Elle atteint son maximum après 10

minutes de stimulation et se maintient durant les 30 min de traitement (figure

46A et C). Cette activation est inhibée après traitement des cellules 18h à la

PTX (100ng/ml), suggérant que l’activation de la voie ERK est dépendante de

l’activité de Gi/o, même aux temps les plus longs (figure 46B). Aucune

différence significative (ANOVA à deux facteurs suivie d’un test post-hoc de

Bonferroni) n’a été observée dans l’activation de ERK à tous les temps de

traitement testés, entre les récepteurs mutants et WT, suggérant qu’aucune

des mutations effectuées n’affecte l’activation de la voie ERK par le récepteur

NPFF2.

Figure 46: Activation de ERK 1/2 induite par la stimulation du récepteur rNPFF2 par le 1DMe. (A) Western Blots représentatifs de la cinétique de phosphorylation de ERK1/2 (pERK) après activation par le 1DMe 1µM des récepteurs rNPFF2 exprimés dans les cellules SH-SY5Y. (B) Quantification de la phosphorylation de ERK après traitement par le 1DMe des cellules exprimant le récepteur WT et après traitement 18h à la PTX (100g/ml). Les valeurs sont normalisées par rapport à l’intensité de ERK total et exprimées en pourcentage de la phosphorylation basale à t=0. (C) Quantification de la phosphorylation de ERK induite par le 1DMe au cours du temps, dans les cellules exprimant les récepteurs WT et mutants. Les résultats sont traités de la même manière qu’en B. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM d’au minimum trois expériences indépendantes. p44 : ERK1, p42 : ERK2.

117

En conclusion, aucun des sites de phosphorylation mutés, conservés entre

l’homme et le rat n’est impliqué de façon majeure dans l’activation des voies de

signalisation intracellulaires du récepteur NPFF2. Seuls les sites de

phosphorylation spécifiques au rat (S382/S386) semblent jouer un rôle dans

l’efficacité du couplage du récepteur à la protéine Gi.

I.4 Rôle des sites de phosphorylation dans la désensibilisation

du récepteur NPFF2

Le rôle de la phosphorylation est crucial dans la désensibilisation des RCPG.

La désensibilisation du récepteur NPFF2 a été évaluée dans plusieurs essais.

Après un traitement de 120 minutes avec l’agoniste nous n’avons pas observé

de désensibilisation dans le test d’inhibition de l’adénylyl cyclase. La

stimulation de la liaison du [32S]GTPpar le 1DMe sur les différents récepteurs

WT et mutants a aussi été évaluée. Cependant nous avons observé une très

grande variabilité entre les différentes lignées et nous n’avons pas réussi à

trouver les conditions permettant de comparer tous les récepteurs.

Nous avons observé que le récepteur NPFF2 est capable d’induire la libération

de calcium intracellulaire dans les cellules SH-SY5Y. Nous avons donc évalué

les premières étapes de la désensibilisation du récepteur dans ce test. Le

traitement des cellules exprimant le récepteur WT par le 1DMe (1µM), induit

une forte augmentation du taux de calcium intracellulaire, mesuré grâce à

l’utilisation de la sonde fluorescente FLUO4-AM, qui diminue ensuite

progressivement jusqu'à atteindre le niveau basal après 5 min de traitement

suggérant une désensibilisation du récepteur (figure 47A). Afin de vérifier que

l’effet observé était bien de la désensibilisation homologue, nous avons mesuré

la libération du calcium intracellulaire après stimulation des récepteurs

muscariniques présent dans les cellules SH-SY5Y. Après 3 et 5 minutes de

perfusion au 1DMe, la stimulation des récepteurs muscariniques par le

carbachol induit toujours une augmentation du calcium intracellulaire,

confirmant que la désensibilisation observée pour le récepteur NPFF2 n’est pas

118 Résultats

due à un autre phénomène de régulation, mais bien à une désensibilisation

homologue.

Si chacun des récepteurs mutants est capable d’induire un pic calcique

d’intensité équivalente au récepteur WT après stimulation par le 1DMe, la

diminution du signal après 2 minutes de stimulation n’est pas aussi rapide

pour certains mutants (figure 47A) ce qui suggère une désensibilisation et/ou

une cinétique de désensibilisation différente. Afin de comparer les propriétés de

désensibilisation des récepteurs mutés, nous avons quantifié la perte du signal

calcique après 2.5 min et 5 min de perfusion avec le 1DMe (figure 47B et C). La

désensibilisation du récepteur mutant 372 est diminuée significativement

après 2.5 min de traitement mais est similaire au WT après 5 minutes, ce qui

suggère une différence de cinétique de désensibilisation entre ces deux

récepteurs. La désensibilisation est plus altérée pour les mutants 414 et 412,

puisque le signal calcique se maintient respectivement à 53% ± 13 et 43% ± 5,

au-dessus du niveau basal après 5 min de traitement.

Afin de confirmer ces résultats, nous avons utilisé un autre protocole de

désensibilisation basé sur deux traitements de 1 minute au 1DMe, séparés de

10 minutes de lavage du ligand. Dans les cellules exprimant le récepteur WT le

pic de stimulation induit par le 1DMe diminue de 84% ± 2 entre les deux

stimulations (figure 47D) alors que le carbachol reste actif (non montré)

suggérant que la désensibilisation observée est bien une désensibilisation

homologue. Parmi tous les récepteurs mutants, seuls les récepteurs 414 et 412

conservent une activité significativement supérieure comparé au récepteur WT

après la seconde stimulation par l’agoniste.

L’ensemble des expériences de mesure de la libération de calcium

intracellulaire suggère que le doublet 372TS373 et le cluster 412TNST415 du

récepteur rNPFF2 sont donc impliqués dans la désensibilisation de la réponse

calcique induite par le 1DMe, avec un rôle majeur des résidus S414 et T415.

119

Figure 47: Désensibilisation de la libération de calcium intracellulaire induite par l’activation du récepteur rNPFF2 par le 1DMe. (A) Courbes représentatives de la libération de calcium intracellulaire durant 5 min de traitement par le 1DMe (1µM) des cellules SH-SY5Y exprimant les récepteurs WT et mutants. La mesure des taux de calcium est réalisée grâce à l’utilisation d’une sonde calcique fluorescente, FLUO4-AM. L’intensité de fluorescence (F) a été normalisée par rapport à l’intensité moyenne mesurée 20 secondes avant le traitement par l’agoniste (F0). (B, C) Intensité de fluorescence à 2.5 min et 5 min de traitement par rapport au maximum d’intensité de fluorescence du pic de libération. (D) Rapport des maxima d’intensité des pics de fluorescence mesurés après stimulation au 1DMe 1 minute après le premier traitement et le lavage du ligand durant 10 minutes. Les résultats sont les

moyennes ± SEM des trois à quatre expériences réalisées indépendamment. * : p<0.05 ; ** : p<0.01 ; *** : p<0.001 par rapport au WT, mesuré lors d’une ANOVA à un facteur, suivie d’un test post-hoc de Bonferroni.

Comme la libération de calcium intracellulaire activée par le récepteur NPFF2

n’avait jusqu’ici jamais été décrite, nous avons ensuite voulu caractériser cette

voie de signalisation. Plusieurs mécanismes peuvent être à l’origine d’une

augmentation des taux intracellulaires de calcium. Le premier est l’entrée de

calcium venant du milieu extracellulaire par les canaux calciques

membranaires, le second est la libération de calcium via les canaux activés par

l’IP3 du réticulum endoplasmique. La PLC est impliquée dans le second

mécanisme et est activée par la protéine Gq ou par une G venant de Gi. Mais

le relargage des stocks de calcium peut aussi être effectué via une interaction

de G avec les canaux à IP3, indépendamment de la PLC. La première voie

120 Résultats

impliquant l’activation de la PLC par la protéine Gq ne serait pas affectée par

un traitement à la PTX, par contre la seconde, impliquant G venant de la

protéine Gi serait bloquée par l’inhibition de Gi par la PTX. Nous avons donc

traité les cellules avec la PTX (100ng/ml, 18h) ou un inhibiteur de la PLC

(U73122, 10µM, 10 min) (figure 48).

Figure 48: Libération de calcium intracellulaire des cellules SH-SY5Y exprimant les récepteurs WT. Les cellules exprimant le récepteur WT ont été traitées

par le 1DMe durant 1 min et la libération de calcium a été mesurée après prétraitement à

l’inhibiteur de la PLC (U73122, 10µM, 10 min), ou à la PTX, 100ng/ml, 18h ou sans prétraitement (contrôle). La courbe est représentative de deux expériences réalisées indépendamment.

L’inhibition de la PLC par l’U73122 abolit totalement le signal calcique induit

par le 1DMe (figure 48), de même que le traitement à la PTX. Ces résultats

suggèrent l’implication à la fois de Gi et de la PLC dans la libération des stocks

de calcium intracellulaire du réticulum endoplasmique par le récepteur

rNPFF2.

I.5 Rôle des sites de phosphorylation dans l’internalisation du

récepteur NPFF2

La phosphorylation est aussi très impliquée dans l’internalisation des RCPG.

Nous avons de ce fait voulu apprécier le rôle de chaque site ou cluster de

phosphorylation dans ce processus. L’internalisation des récepteurs WT et

mutants a donc été évaluée par immunofluorescence après traitement des

cellules 30 minutes avec 1µM de 1DMe, et observation au microscope confocal.

Le traitement au 1DMe des cellules exprimant le récepteur WT induit une forte

internalisation, 46% ± 7.5 des récepteurs disparaissent de la membrane

plasmique et se retrouvent dans des vésicules intracellulaires après 30 minutes

(figure 49). L’internalisation est fortement diminuée après traitement des

cellules 18h à la PTX. La fluorescence reste majoritairement membranaire et

0 50 100 150 2000

1

2

3

4

t, s

F/F

0

Contrôle

U-73122

PTX

1DMe 1 µM

121

seulement 17% ± 5 des récepteurs sont internalisés après stimulation par

l’agoniste en présence de la toxine. Ce résultat suggère qu’en plus d’être

impliquée dans la phosphorylation, comme nous l’avons vu précédemment, la

protéine Gi/o est impliquée dans le trafic intracellulaire du récepteur. Après

traitement par le 1DMe, le marquage correspondant aux récepteurs mutants

372 et 382 est majoritairement intracellulaire et il n’y a pas de différence

significative dans l’internalisation comparé au récepteur WT. Le marquage

reste par contre majoritairement membranaire pour les récepteurs mutants

395, 414 et 412. Ce marquage est comparable à celui observé après traitement

à la PTX. Après quantification, l’internalisation de ces récepteurs mutants est

de 12% ± 6 pour le récepteur 395, de 13% ± 11 pour le récepteur 414, et de

10% ± 4 pour le récepteur 412. L’internalisation de ces trois mutants est

significativement différente du récepteur WT. La S395 et le cluster 412TNST414

sont donc impliqués dans l’internalisation du récepteur rNPFF2.

Figure 49: Internalisation du récepteur rNPFF2. Images représentatives de l’internalisation du récepteur

visualisées au microscope confocal avec un objectif x60/NA1,4, à ex de 488 nm, après stimulation par le

1DMe, 1µM, 30 minutes. Le traitement à la PTX est réalisé durant 18h à 100ng/ml, avant le traitement par l’agoniste. La quantification est réalisée d’après trois expériences indépendantes, selon la méthode décrite dans les procédures expérimentales, grâce au logiciel Métamorph. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. * : p<0.05 comparé au WT, mesuré lors d’une ANOVA à un facteur suivie d’un test Post-hoc de Bonferroni.

122 Résultats

La phosphorylation de la partie C-terminale des RCPG contribue à

l’internalisation via le recrutement de la -arrestine. Nous avons donc évalué le

recrutement de la -arrestine 2 après transfection transitoire des cellules avec

la -arrestine 2 couplée à la GFP. Dans la condition contrôle, la fluorescence

est distribuée de façon homogène dans le cytoplasme des cellules (figure 50).

L’activation du récepteur WT induit la redistribution de la fluorescence et

l’accumulation dans les vésicules intra-cytoplasmiques, ce qui traduit sans

doute le recrutement de la -arrestine et l’internalisation, aboutissant à la

formation de points fluorescents intracellulaires après 30 min de traitement au

1DMe. Cette redistribution de la fluorescence est aussi observable pour les

cellules exprimant les récepteurs mutants 372 et 382 et aboutit, comme pour

le récepteur WT à la formation de points fluorescents intracellulaires. Dans les

cellules exprimant les récepteurs déficients en internalisation (395 et 414), la

fluorescence de la -arrestine 2 est visible à la membrane mais aussi sur des

vésicules cytoplasmiques (figure 50). Pour les cellules exprimant le récepteur

mutant 395, on observe une accumulation intra-cytoplasmique de la

fluorescence alors que, nous l’avons vu précédemment, ce récepteur mutant

est déficient en internalisation. Cette différence de comportement du récepteur

peut-être expliquée par la surexpression de la -arrestine. En ce qui concerne

les cellules exprimant le récepteur 414, également déficient en internalisation,

il y a un marquage en agrégats à la membrane et l’accumulation intracellulaire

est moindre.

123

Figure 50: Recrutement de la -arrestine 2 induit par

stimulation du récepteur NPFF2. Les cellules exprimant les récepteurs WT et mutants ont été

transfectées de façon transitoire avec la -arrestine 2

couplée à la GFP, puis traitées au 1DMe (1µM) 30 minutes à température ambiante. Après fixation au para-formaldéhyde, la fluorescence de la GFP a été visualisée au microscope confocal, à l’objectif

x60/NA1.4 et à ex de 488 nm.

L’étude des sites de phosphorylation par mutagénèse nous a donc permis de

caractériser des différences dans les rôles fonctionnels des sites et clusters de

phosphorylation du récepteur NPFF2. Le cluster 412TNST415 semble impliqué

dans la désensibilisation mais aussi dans l’internalisation du récepteur. Le

doublet 372TS373 joue un rôle dans la désensibilisation mais la mutation de ces

sites a des conséquences mineures sur l’internalisation. La S395 ne semble

pas impliquée dans la désensibilisation du récepteur, toutefois sa

phosphorylation est nécessaire pour assurer une internalisation efficace. Enfin,

les sites spécifiques du rat (S382/S386) influent sur l’efficacité du couplage à

la protéine G, cependant ils n’affectent pas la désensibilisation du récepteur ni

son internalisation.

382

WT

372

Control 1DMe 30’ Control 1DMe 30’

395

414

124 Discussion : Phosphorylation du récepteur NPFF2

Discussion

Lors de cette étude, nous avons combiné l’analyse protéomique par

spectrométrie de masse et la mutagénèse dirigée pour identifier le profil de

phosphorylation du récepteur NPFF2 et le rôle de chaque site de

phosphorylation dans la signalisation, la désensibilisation et le trafic

intracellulaire du récepteur, exprimé dans les cellules SH-SY5Y. Ainsi nous

avons pu identifier le cluster 412TNST415 à l’extrémité C-terminale du récepteur.

Ce cluster est le site majeur impliqué dans la désensibilisation, l’internalisation

du récepteur et est sans doute le substrat de la GRK2. Le cluster 372TS373 est

aussi impliqué dans la désensibilisation sans jouer un rôle essentiel dans

l’internalisation du récepteur. La S395 est impliquée dans l’internalisation et

les résidus spécifiques du récepteur de rat (S382/S386) semblent impliqués

dans le couplage à la protéine G. Ce travail a aussi permis de caractériser plus

précisément la signalisation du récepteur NPFF2 de rat.

Dans notre modèle cellulaire, le récepteur est couplé à une protéine Gi/o car

l’inhibition de l’adénylyl cyclase est sensible à la PTX. Il induit également

l’activation de la voie ERK ainsi que la libération de calcium intracellulaire via

la PLC. L’inhibition observée de l’adénylyl cyclase est cohérente avec les études

précédentes décrivant les récepteurs humain et de souris [312,399],

cependant, la puissance de ce couplage est beaucoup plus importante dans

notre modèle. En effet, les CE50 mesurées sur cellules CHO exprimant les

récepteurs de souris et humain étaient de 0.72 ± 0.18 nM et 2.7 ± 0.5 nM

respectivement, soit une différence d’un facteur 100 par rapport à nos résultats

sur le récepteur de rat exprimé dans les cellules SH-SY5Y. Cette augmentation

pourrait être due à la phosphorylation du résidu S386, car ce résidu n’est pas

conservé chez l’homme et la souris et sa mutation en alanine induit une

diminution de puissance. L’activation de ERK a précédemment été démontrée

dans les lignées cellulaires humaines SH-SY5Y et SK-N-MC [404,405]. Dans

cette étude nous confirmons que l’activation de cette voie dépend de l’activation

du récepteur NPFF2 dans un système d’expression hétérologue. Nous montrons

que cette activation de ERK dure au moins 30 minutes. Cette activation de

longue durée suggère quelle pourrait être médiée par la -arrestine [411].

Comme d’autres RCPG couplés Gi/o, l’activation de ERK apparait sensible à la

125

PTX, et est donc complètement dépendante de la protéine G. Le fait que les

voies de signalisation de la protéine G et de la -arrestine du récepteur NPFF2

ne soient pas complètement indépendantes est aussi confirmé par la sensibilité

de l’internalisation à la PTX. De plus notre étude est la première à démontrer

une libération de calcium intracellulaire via l’activation de la PLC, après

stimulation du récepteur par l’agoniste. Là encore l’effet est sensible à la PTX et

passe donc probablement par les sous-unités G de la protéine Gi/o [412].

Une stratégie par analyse protéomique a été utilisé afin d’identifier le profil de

phosphorylation du récepteur NPFF2 humain et de rat. Ce type d’analyse est

aujourd’hui assez répandu dans l’étude des modifications post-traductionnelles

des RCPG car cette méthode est précise, et permet de distinguer des différences

dans l’abondance des phosphorylations. Notre méthode de quantification

permet de plus de comparer les quantités relatives de peptides phosphorylés en

fonction des conditions de traitement. Cependant l’efficacité de cette analyse

dépend fortement du type de récepteur étudié, de la présence d’un tag efficace

pour la purification et de la répartition des sites de phosphorylation par

rapport aux sites de clivage par la trypsine. En effet, les études précédentes sur

le récepteur MOP ont permis d’identifier de façon claire les différents profils de

phosphorylation du récepteur exprimé dans des cellules modèles [249,251]

mais aussi in vivo [252]. Lors de notre étude, la couverture de séquence du

récepteur humain a été suffisamment bonne pour que l’on puisse étudier tous

les sites possibles de phosphorylation excepté la T157. Etant donné que les

Western Blots anti-phospho-thréonine ont montré une forte diminution de la

phosphorylation des thréonines chez les mutants T372, T412 et T415 nous

pouvons raisonnablement penser que la T157 n’est pas phosphorylée. Ainsi,

nous pouvons conclure que parmi les 22 sites de phosphorylation possibles

dans le récepteur, seulement 8 résidus de la partie C-terminale peuvent être

phosphorylés, 6 étant conservés entre l’humain et le rat (mais aussi chez la

souris) (figure 38) : les T372 (375 chez l’homme), S373 (376), S395 (398), T412

(415), S414 (417) et T415 (S418). De façon surprenante, si les résidus

conservés semblent être les meilleurs candidats pour la régulation de l’activité

du récepteur, nous avons aussi pu identifier des phosphorylations espèce-

spécifiques : S369 chez l’homme et S382/S386 chez le rat. Ces

phosphorylations pourraient être impliquées dans une régulation fine et rendre


compte de différences subtiles dans le couplage à la protéine G. Une fois les

phosphorylations identifiées, une question importante était de déterminer

lesquelles étaient induites par l’agoniste ou bien présentes à l’état basal du

récepteur. La quantification relative des données obtenues après l’analyse en

spectrométrie de masse a clairement indiqué que la phosphorylation des

résidus T375 et S376 était augmentée après stimulation par le 1DMe du

récepteur humain. Par contre les limitations techniques ne nous ont pas

permis de quantifier l’effet de la stimulation par l’agoniste sur les quatre

résidus restants. Cependant la phosphorylation in vitro par la GRK2 purifiée

du fragment C-terminal du récepteur humain fusionné à la GST suggère que

les résidus 414 à 418 sont des substrats de la GRK. Ces résultats sont en

accord avec la présence d’acides aminés acides en position N-terminale et C-

terminale de la région à phosphoryler, que l’on trouve dans la séquence

consensus de reconnaissance de la kinase [197].

La phosphorylation des thréonines au niveau des deux clusters 372TS373 et

412TNST414 a été confirmée pour le récepteur de rat, par Western Blot avec un

anticorps anti-phospho-thréonine, après stimulation par le 1DMe. La

phosphorylation des thréonines est fortement diminuée chez les mutants 372,

412 et 414. La phosphorylation est aussi fortement diminuée après inhibition

de la GRK2, ce qui confirme les résultats obtenus après phosphorylation in

vitro par la GRK2. De plus, la phosphorylation des thréonines est aussi

diminuée après traitement des cellules à la PTX ce qui démontre l’implication

de la protéine Gi dans cette phosphorylation. Les résultats préliminaires

obtenus après traitement des cellules exprimant le récepteur mutant 414

montrant une diminution de la phosphorylation des thréonines, suggèrent

aussi l’implication de la protéine Gi dans la phosphorylation des T372 et/ou

T412.

L’analyse de la séquence du récepteur avec le logiciel de prédiction de

phosphorylations GPS [199] identifie la CaMK et la PKC comme kinases

potentiellement impliquées dans la phosphorylation du site 372TS373.

Cependant l’utilisation d’inhibiteurs de la CaM et de la PKC n’a entrainé

aucune diminution de la phosphorylation, que ce soit sur le récepteur WT ou le

récepteur mutant 414. Au contraire, l’inhibiteur de la PKC, chélérythrine a

127

plutôt produit une augmentation de la phosphorylation du récepteur WT, bien

que non significative. La PKC est impliquée dans l’inhibition de la GRK5

[54,241], cette kinase pourrait donc être impliquée dans la phosphorylation du

site 372TS373. La phosphorylation des deux loci de phosphorylation identifiés,

372TS373 et le cluster 412TNST415, pourrait donc mettre en jeu des kinases de

type GRK. Les kinases de type GRK2/3 sont régulées par la sous-unité G, qui

permet leur localisation à la membrane plasmique proche du récepteur à

phosphoryler et très récemment, une étude a montré l’interaction directe de

Gi avec la GRK6. La protéine Gi/o pourrait donc être impliquée via G pour

l’activation de la GRK5/6 [225] et via G pour la GRK2/3 [413].

Pour conclure, ces résultats nous permettent d’identifier les résidus

phosphorylés suite à l’activation du récepteur NPFF2 et une des kinases

impliquées : le cluster 412TNSS414 probablement par la GRK2 et le site 372TS373

par une kinase encore non identifiée.

L’utilisation d’un anticorps anti-phospho-thréonine nous a permis d’établir par

Western Blot, la cinétique de phosphorylation du récepteur WT de rat. Comme

pour d’autres RCPG, notamment le récepteur MOP après stimulation par le

DAMGO [231,253] ou trans-phosphorylation après stimulation du récepteur

NPFF2 par le 1DMe [249], le récepteur NPFF2 de rat est rapidement

phosphorylé après stimulation par l’agoniste. Les mécanismes de régulation

des phosphorylations du récepteur MOP diffèrent en fonction du type de

stimulation. Après stimulation homologue, par le DAMGO, le récepteur est

rapidement phosphorylé sur la Ser375 et cette phosphorylation persiste, même

après lavage du ligand [253]. Dans le cas d’une transphosphorylation le

récepteur est déphosphorylé après une heure de traitement par le 1DMe [249].

Des expériences supplémentaires sont nécessaires afin de déterminer plus

précisément les cinétiques de phosphorylation/déphosphorylation du récepteur

NPFF2 de rat.

Aucune des mutations des sites de phosphorylation conservés n’a affecté la

signalisation du récepteur. Chacun des récepteurs est capable d’activer les

voies de signalisation dépendantes de la protéine G avec la même efficacité, ce

qui suggère que les phosphorylations du récepteur sont plutôt impliquées dans

la régulation de son activité après activation de la protéine G. Deux loci de


phosphorylation ont été identifiés comme étant impliqués dans la

désensibilisation du récepteur. La mutation du doublet 372TS373 ralentit le

processus de désensibilisation, mais le site majeur impliqué est le cluster final

de l’extrémité C-terminale 412TNST415 que nous avons identifié comme substrat

de la GRK2. Les mutations dans ce cluster ont abouti à une forte diminution

de la désensibilisation. Cette désensibilisation était comparable pour les deux

mutants 414 et 412, suggérant que les résidus les plus impliqués sont

vraisemblablement la S414 et la T415. Aucune désensibilisation du récepteur

NPFF2 n’a pu être mise en évidence dans les tests d’activité de l’adénylyl

cyclase ou de mesure d’activation de la voie ERK. Ces observations découlent

sans doute du fait que nous n’avons pas réussi à trouver les conditions

optimales pour ces tests car la désensibilisation des réponses de l’adénylyl

cyclase et ERK a pu être mise en évidence pour d’autres RCPG, comme

notamment, le récepteur MOP après stimulation par le remifentanyl ou la

morphine [414].

Chacune des mutations réalisées sur le récepteur a affecté son internalisation

après sa stimulation, mais aucune corrélation entre désensibilisation et

internalisation n’a pu être observé. La mutation du cluster final 412TNST415

affecte non seulement la désensibilisation mais aussi l’internalisation, la

mutation du doublet 372TS373 affecte la désensibilisation du récepteur mais n’a

qu’un effet mineur sur l’internalisation, et la mutation de la S395 n’affecte en

rien la désensibilisation alors que l’internalisation est fortement diminuée. Le

fait que les différents sites de phosphorylation ne soient pas forcement

impliqués à la fois dans l’internalisation et la désensibilisation a déjà été décrit

précédemment, notamment pour le récepteur MOP [415] et le récepteur CB1

[416]. Alors qu’un seul cluster de phosphorylation joue le rôle principal dans la

désensibilisation du récepteur, notre étude démontre qu’il n’existe pas de site

de phosphorylation privilégié responsable de l’internalisation du récepteur

comme c’est aussi le cas pour le récepteur MOP [251]. En effet, pour le

récepteur MOP, la phosphorylation d’un simple résidu, la S375 du cluster

STANT, est l’évènement principal de la désensibilisation du récepteur [253].

Cependant cette phosphorylation, bien que nécessaire, n’est pas suffisante

pour provoquer l’internalisation du récepteur [230,247]. Les agonistes, comme

la morphine, qui induisent exclusivement cette phosphorylation, provoquent la

129

désensibilisation du récepteur sans pour autant l’internaliser, alors que les

agonistes induisant des phosphorylations supplémentaires permettent

l’internalisation [417].

Comme pour le récepteur NPFF2 humain [249,310], le récepteur NPFF2 de rat

activé recrute la -arrestine. L’interaction RCPG--arrestine dépend de la

phosphorylation de résidus situés dans l’extrémité C-terminale des RCPG,

permettant ainsi de créer des points de contact stabilisant la conformation du

complexe [264]. Il est probable que si les mutations que nous avons réalisées

sur le récepteur n’abolissent pas la capacité du récepteur à interagir avec la -

arrestine, cette interaction n’est pas suffisamment stable pour permettre une

internalisation efficace. Elle pourrait cependant être suffisante pour activer les

voies de signalisation de type ERK. La signalisation dépendante de la protéine

G est rapide et transitoire alors que la signalisation médiée par la -arrestine

est plus lente mais plus persistante [112,113,237,411]. L’activation durable de

ERK après une stimulation prolongée du récepteur NPFF2 suggère que cette

activation est dépendante de la -arrestine. Ces voies médiées par la protéine G

et la -arrestine ne sont pourtant pas indépendante car l’inhibition de la

protéine Gi/o par la PTX inhibe la phosphorylation de ERK même après un

traitement de longue durée qui correspondrait plutôt à une signalisation

médiée par la -arrestine. Dans le cas des récepteurs couplés Gi l’implication

simultanée des protéines Gi et -arrestine est fréquente [121,180,418,419]. La

durée de traitement à laquelle nous observons la phosphorylation de ERK

correspond à la durée pour laquelle le récepteur NPFF2 est internalisé. La -

arrestine pourrait donc agir en tant que protéine d’échafaudage afin de

stabiliser l’activation de la voie des MAPK, et permettre une signalisation via les

endosomes. Ce type de signalisation a précédemment été décrit pour le

récepteur PAR2 [114], 2AR [419] et ATII [119] et permet une seconde vague de

signalisation visible notamment dans l’activation soutenue de ERK. Les

mutants déficients en internalisation restent capables de maintenir cette

activation prolongée, ce qui est cohérent avec leur capacité à recruter la -

arrestine.

Dans notre étude, trois loci du C-terminal semblent être impliqués dans

l’internalisation, ce qui peut suggérer la nécessité d’une multi-phosphorylation


de l’extrémité C-ter pour permettre une internalisation efficace. Ces

observations rappellent des études précédentes sur le récepteur MOP,

montrant que la multi-phosphorylation du cluster 375STANT379 était nécessaire

à l’internalisation induite par le DAMGO [251].

Si la spectrométrie de masse a été d’une grande précision pour d’autre RCPG

tels que le récepteur MOP, permettant la détection de différences dans la

proportion de récepteur phosphorylé et l’abondance des résidus phosphorylés

[251], des limites techniques ne nous ont pas permis de le faire pour le

récepteur NPFF2. L’analyse protéomique se révèle également trop lourde et pas

suffisamment quantitative pour suivre les différences de cinétique et/ou de

déphosphorylation attendues pour chacun des sites. La génération d’anticorps

phosphospécifiques permettrait d’évaluer ce type de régulation fine. Ces outils

ont beaucoup aidé à évaluer les rôles distinctifs de chaque résidu phosphorylé,

la cinétique, leur hiérarchie de phosphorylation dans le cas du récepteur MOP

[231,247,271]. Des anticorps phosphospécifiques du récepteur NPFF2

pourraient nous permettre d’étudier plus avant les phosphorylations identifiées

lors de cette étude, de déterminer les différentes cinétiques de phosphorylation

de chaque résidu dans des systèmes d’expression hétérologue comme notre

modèle, mais aussi in vivo comme cela a déjà été réalisé pour le récepteur MOP

sur des extrait de cerveau [254] et de moelle épinière [254,420]. Des anticorps

spécifiques des résidus phosphorylés du récepteur NPFF2 pourraient également

permettre de visualiser le récepteur activé dans des structures et des situations

où l’interaction système opioïde / système NPFF a été démontrée, comme par

exemple, dans la tolérance à la morphine [10].

Lors de cette étude nous avons donc identifié par spectrométrie de masse les

résidus phosphorylés après stimulation des récepteurs NPFF2 humain et de

rat. Tous les résidus conservés entre les deux espèces jouent un rôle dans la

régulation de l’activité du récepteur. Les résidus espèce-spécifiques identifiés

semblent ne pas être régulés par le ligand chez l’homme (S369) et semblent

être responsables de différences fines dans l’efficacité du couplage à la protéine

G chez le rat (S382/S386). Nous avons de plus identifié le cluster final de

phosphorylation comme étant substrat de la GRK2. Aucun des résidus

phosphorylés ne semble jouer de rôle dans l’activation des premières étapes de

131

la signalisation protéine G-dépendante, ni même plus en aval. Le cluster final

de phosphorylation 412TNST415 s’est révélé crucial dans la désensibilisation du

récepteur alors que le doublet 372TS373 semble en déterminer la cinétique.

Enfin, bien qu’aucune des mutations réalisées n’empêche le recrutement de la

-arrestine, le fait que la simple mutation du résidu S395 et les mutations du

cluster final inhibent l’internalisation suggère que l’internalisation efficace du

récepteur NPFF2 nécessite la multi-phosphorylation du récepteur. La

génération d’anticorps phosphospécifiques permettra, dans le futur, d’examiner

les caractéristiques précises de ces différentes phosphorylations notamment in

vivo dans des conditions où les systèmes NPFF et opioïde interagissent.

133

II. Caractérisation d’un ligand photoactivable de haute

affinité pour le marquage covalent des récepteurs

NPFF2

Introduction

Le système NPFF est un système multi-ligands/multi-récepteurs. Les ligands

NPFF identifiés dans le cerveau des mammifères [421], sont issus de deux

précurseurs : Pro-NPFFA et Pro-NPFFB et possèdent une séquence

caractéristique en partie C-terminale : PQRFa. Les peptides NPFF n’agissent

pas sur les récepteurs opioïdes [422] pourtant une relation proche entre les

systèmes opioïdes et NPFF a clairement été démontrée, notamment dans la

perception de la douleur [423]. L’injection de NPFF au niveau supra spinal

(injection icv) chez la souris [315,358,424] et chez le rat [332] inhibe l’analgésie

induite par la morphine, alors que lors d’une injection spinale (intra-théquale)

le 1DMe, analogue stable du NPFF, potentialise l’effet analgésique de la

morphine[340,341,425]. L’injection icv de NPFF chez le rongeur diminue aussi

les propriétés motivationnelles des opioïdes [360].

Les peptides NPFF agissent sur deux récepteurs couplés aux protéines G :

NPFF1 et NPFF2 [309]. Les peptides dérivant du pro-NPFFA possèdent une

meilleure affinité pour le récepteur NPFF2 alors que ceux dérivant du pro-

NPFFB agissent préférentiellement sur le récepteur NPFF1. Chacun a été cloné

dans plusieurs espèces y compris l’homme. Chaque récepteur est couplé Gi/o

dans les cellules CHO, HEK ou SH-SY5Y [7,303,310] et certains effets, comme

l’effet anti-opioïde, sont partagés par les deux récepteurs NPFF. La localisation

de chacun des deux récepteurs a été évaluée grâce à l’utilisation des peptides

les plus affins et sélectifs marqués radioactivement [311] dans des aires du

système nerveux impliquées dans la nociception. Cependant les résultats

peuvent être sujets à caution car la sélectivité de ces ligands par rapport à

chacun des récepteurs reste relative.

Afin de déterminer les effets respectifs de chaque récepteur et de permettre la

localisation précise des récepteurs la synthèse de nouveaux ligands est

134 Caractérisation d’un ligand photoactivable

indispensable. Comme nous l’avons vu précédemment, différentes études de

structure-activité de ligands NPFF tronqués, allongés ou bien même modifiés

[314,426,427] ont permis de caractériser des agonistes plus sélectifs de chacun

des récepteurs, qui sont aujourd’hui utilisés par l’équipe dans l’étude des

mécanismes de l’activité NPFF. Une autre approche utilisée dernièrement a été

de muter le récepteur afin d’évaluer la liaison des ligands et identifier les

résidus spécifiques impliqués dans l’interaction ligand/récepteur [389].

Cependant cette approche est relativement lourde et longue à mettre en place.

Le mode de liaison des ligands sur un RCPG, peut aussi être déterminé grâce à

l’utilisation de ligands marqués, capable de lier le récepteur de façon covalente

après photoactivation en combinaison avec la modélisation du site d’interaction

ligand/récepteur [428]. Après digestion par des endoprotéinases, les fragments

marqués, liés au ligand permettent de déterminer précisément les domaines

d’interaction du récepteur. Ce type de caractérisation biochimique n’a jamais

été réalisé sur le récepteur NPFF2 et serait d’une grande utilité dans l’étude du

mode de liaison des ligands sur ce récepteur. Nous avons donc synthétisé un

ligand, le YE(Bpa)WSLAAPQRFa, iodable et pouvant se lier de façon irréversible

au récepteur NPFF2, après irradiation aux UV, grâce à l’incorporation d’une p-

benzoyl-l-phénylalanine (Bpa). Dans cette étude nous avons caractérisé les

propriétés de liaison du ligand sur le récepteur NPFF2 en système hétérologue,

exprimé dans des cellules SH-SY5Y, mais aussi sur membranes de tissu

cérébral de souris.

Analytical Biochemistry 453 (2014) 50–54

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Analytical Biochemistry

journal homepage: www.elsevier .com/locate /yabio

A high-affinity, radioiodinatable neuropeptide FF analogue incorporatinga photolabile p-(4-hydroxybenzoyl)phenylalanine

http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2014.02.0290003-2697/� 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.

⇑ Corresponding author. Fax: +33 05 61 17 59 94.E-mail address: [email protected] (J.-M. Zajac).

1 Abbreviations used: NPFF, neuropeptide FF; CHO, Chinese hamster ovary; Bpa,p-benzoyl-L-phenylalanine; dNPA, dNP(NMe)AFLFQPQRF-NH2; HPLC, high-perfor-mance liquid chromatography; BSA, bovine serum albumin; SDS–PAGE, sodiumdodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis; DTT, dithiothreitol; UV, ultravi-olet; EFW–NPSF, EFWSLAAPQRFamide.

Lauriane Bray a, Lionel Moulédous a, Jean A.M. Tafani b, Maryse Germanier a, Jean-Marie Zajac a,⇑a Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS/Université de Toulouse, UMR 5089, 31077 Toulouse Cedex, Franceb INSERM U825, Imagerie Cérébrale et Handicaps Neurologiques, CHU Purpan, F-31024 Toulouse Cedex 3, France

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 24 January 2014Received in revised form 25 February 2014Accepted 26 February 2014Available online 5 March 2014

Keywords:Neuropeptide FFReceptorAffinity labelingRadioiodination

a b s t r a c t

A new radioiodinated photoaffinity compound, [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFNH2, derived from a peptidepresent in the rat neuropeptide FF (NPFF) precursor was synthesized, and its binding characteristics wereinvestigated on a neuroblastoma clone, SH-SY5Y, stably expressing rat NPFF2 receptors tagged with the T7epitope. The binding of the probe was saturable and revealed a high-affinity interaction (KD = 0.24 nM)with a single class of binding sites. It was also able to affinity label NPFF2 receptor in a specific and efficientmanner given that 38% of the bound radioligand at saturating concentration formed a wash-resistantbinding after ultraviolet (UV) irradiation. Photoaffinity labeling with [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamideshowed two molecular forms of NPFF2 receptor with apparent molecular weights of 140 and 95 kDa ina 2:1 ratio. The comparison of the results between photoaffinity labeling and Western blot analysis sug-gests that all receptor forms bind the probe irreversibly with the same efficiency. On membranes of mouseolfactory bulb, only the high molecular weight form of NPFF2 receptor is observed.[125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide is an excellent radioiodinated peptidic ligand for direct and selectivelabeling of NPFF2 receptors in vitro.

� 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.

Neuropeptide FF (NPFF,1 FLFQPQRF-NH ) is a peptide representa- [9], localized in brain areas involved in pain perception [10].
2
tive of a neurotransmitter system acting as a modulator of endoge-nous opioid functions [1–3]. Peptides of the NPFF family identifiedin the brain of mammals [4] are issued from two precursors, NPFFA

and NPFFB, which can generate peptides that share the C-terminalPQRF-NH2 sequence [5]. Although neuropeptide FF analogues donot interact with opioid receptors [6], a close relationship betweenNPFF and opioid systems has been clearly demonstrated, especiallyin pain perception [1,7]; in mice, intracerebroventricular (i.c.v.)injection of 1DMe, a stable NPFF analogue, inhibits morphine-induced analgesia [1]. Injection of NPFF analogues in rodents hasalso been shown to modulate motivational properties of opioiddrugs [3]; therefore, the NPFF system is considered to be an opi-oid-modulating system involved in homeostasis that counteractsthe action of opioids [8].

NPFF analogues act on two G-protein-coupled receptors,NPFF1 and NPFF2, cloned in several species, including human

Both NPFF1 and NPFF2 are able to couple with Gi/o proteinwhen expressed in Chinese hamster ovary (CHO) [11,12], humanembryonic kidney (HEK 293) [13], or human SH-SY5Y neuroblas-toma cells [14].

In a neuroblastoma-derived cell line, SH-SY5Y, stably transfec-ted NPFF2 receptors are negatively coupled to adenylyl cyclaseand voltage-gated N-type calcium channels through hetero-trimeric Gi/o proteins [14]. Furthermore, the activation of transfec-ted NPFF2 receptors inhibits the opioid modulation of Ca2+

channels and reproduces the cellular anti-opioid activity observedin isolated neurons [15]. Our recent data on this neuroblastomamodel demonstrate the existence of an NPFF receptor-induced het-erologous desensitization of opioid receptor signaling mediated byGRK2 and possibly involving a transphosphorylation within a het-eromeric receptor complex [16].

To gain insights into the mechanism of ligand binding tomembrane-embedded NPFF2 receptors, we have synthesized aphotoaffinity labeling ligand that incorporated p-benzoyl-L-phen-ylalanine (Bpa) to produce a photoreactive analogue. In this work,we describe the biological characterization of this probe and itsability to be radioiodinated and to photoaffinity label in vitrorodent NPFF2 receptor on a neuroblastoma cell line and in braintissue.

http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.ab.2014.02.029&domain=pdf

http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2014.02.029

mailto:[email protected]

http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2014.02.029

http://www.sciencedirect.com/science/journal/00032697

http://www.elsevier.com/locate/yabio

Affinity labeling of NPFF receptors / L. Bray et al. / Anal. Biochem. 453 (2014) 50–54 51

Materials and methods

Chemicals

YE(Bpa)WSLAAPQRFamide and dNPA (dNP(NMe)AFLFQPQRF-NH2) were synthesized by standard solid-phase peptide synthesismethods using an automated peptide synthesizer (Applied Biosys-tems model 433A) as described previously [17]. Purity of thepeptide was assessed using analytical high-performance liquidchromatography (HPLC) and high-resolution mass spectrometry.

Radioiodination of probe

YE(Bpa)WSLAAPQRFamide was radioiodinated oxidatively inposition 1, on the tyrosine residue, using Na125I and a 45-s expo-sure to oxidant 1,3,4,6-tetrachloro-3,6-diphenylglycouril (Iodo-gen). The products were purified by reversed-phase HPLC; thespecific activity of the radioidinated probe was assumed to beidentical to that of Na125I (74 TBq/mmol).

Cell culture

SH-SY5Y cells stably expressing T7-tagged rat NPFF2 receptors(N-terminal tag in pRC/CMV vector) were grown in Dulbecco’smodified Eagle’s medium (DMEM) containing 10% fetal calf serum(FCS), 50 lg/ml gentamicin, and 400 lg/ml G418 in a 37 �C humid-ified atmosphere containing 5% CO2.

Membrane preparation

Cells were harvested by centrifugation at 1000g for 15 min at4 �C in phosphate-buffered saline (PBS) and frozen at �80 �C for1 h, and the pellet was homogenized in 50 mM Tris–HCl (pH 7.4)in a Potter–Elvehjem tissue grinder. After centrifugation at 1000gfor 15 min at 4 �C, the nuclear pellet was discarded and the mem-brane fraction was collected on centrifugation of the supernatantat 100,000g for 30 min at 4 �C. The pellet was resuspended in50 mM Tris–HCl (pH 7.4) and homogenized, and aliquots (0.6–1.3 mg/ml protein) were stored at –80 �C. Protein concentrationwas determined by the Bradford method with bovine serum albu-min (BSA) as standard.

Membrane of olfactory bulb

Mice (C57 black, male, 20 g) were killed by decapitation, andolfactory bulbs were quickly dissected, weighed, and homogenizedin 12 volumes (1 g/12 ml) of ice-cold 50 mM Tris–HCl buffer (pH7.4) containing 60 mM NaCl and 0.1% BSA with a Dounce homoge-nizer. The tissue homogenate was centrifuged for 30 min at100,000g (4 �C), and the resulting pellet was homogenized againin an excess of buffer and centrifuged as before. The final pelletwas resuspended in the initial volume of buffer, yielding a proteinconcentration of 3 to 4 mg/ml.

NPFF receptor binding assay

Binding of [3H]EYF (EYWSLAAPQRFamide) and [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide was measured by rapid filtration as describedpreviously [17]. Briefly, membranes (1–10 lg protein) were incu-bated in polypropylene tubes in a final volume of 500 ll containing50 mM Tris–HCl (pH 7.4), 60 mM NaCl, and 0.1% BSA (Sigma,France). The nonspecific binding was determined in the presenceof 1 lM dNPA. After 1 h of incubation at 25 �C, samples were rap-idly filtered on Whatman GF/B filters preincubated in 0.3% poly-ethylenimine. The filters were rinsed three times with 4 ml of

ice-cold buffer containing 0.1% BSA, and the bound radioactivitywas counted in a liquid scintillation spectrophotometric counter.

Western blot analysis

SH-SY5Y T7–rNPFF2 cells (8 x 106) were lysed in 50 mM Tris,150 mM NaCl, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and1% Triton X-100 and were submitted to ultracentifugation(20,000g). Samples were solubilized in sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) sample buffer con-taining 5% b-mercaptoethanol and heated for 5 min at 100 �C(whole cell extract) or containing 80 mM dithiothreitol (DTT) andheated for 30 min at 37 �C (SH T7–rNPFF2 membranes). Between40 and 150 lg of total proteins was subjected to SDS–PAGE on 8to 10% polyacrylamide gels, followed by liquid transfer on polyvi-nylidene difluoride (PVDF) membranes (Immobilon-P, Millipore,Bedford, MA, USA) and blotted with T7-tag monoclonal antibody(Merck Millipore, 1:10,000). Immunoreactivity was revealed withperoxidase-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin G (IgG)(Jackson ImmunoResearch) using the ECL Plus Western blottingdetection kit (GE Healthcare).

Photoaffinity labeling of NPFF2 receptor

Photoaffinity labeling was conducted using SH-SY5Y cell mem-branes or mouse olfactory bulb membranes and the radioiodinatedphotolabile [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide analogue, between 0.1and 2 nM, in the absence and presence of increasing amounts ofcompeting dNPA. Incubations were performed for 60 min at25 �C. After binding, membranes were ultraviolet (UV) irradiatedon a 24-well Nunclon plate for various times at 4 �C at 365 nm(10 mW/cm2) using a Black Ray lamp (model B-100 AP, UltravioletProducts). Membranes were then washed by centrifugation twotimes during 30 min at 120,000g. The final pellet was solubilizedunder the conditions described by Laemmli [18] (i.e., 62,6 mMTris–HCl, 2% [w/v] SDS, 10% glycerol, 0,01% [w/v] bromophenolblue, and 80 mM DTT), incubated for 30 min at 37 �C, and subjectedto SDS–PAGE (8–10%). Gels were dried, receptor labeling was de-tected with a Molecular Dynamics PhosphorImager, and the rela-tive intensities of detected bands were determined usingdensitometry and quantified with ImageJ software.

Results

Binding activity of probe

Photoaffinity labeling is a powerful approach for direct elucida-tion of residue–residue proximity as a ligand bound to its receptor.A new radioiodinated probe derived from a peptide present in therat NPFF precursor, EFWSLAAPQRFamide (EFW–NPSF), was de-signed to photolabel NPFF2 receptor. Because the C terminus ofNPSF analogues is essential to the affinity and the selectivity, aprobe was synthesized by the substitution of the phenylalaninein position 2 of EFWSLAAPQRFamide, a peptide exhibiting a highaffinity and selectivity toward NPFF2 receptor [19], with a photore-active amino acid p-benzoyl-phenylalanine, YE(Bpa)WSLAAPQRFa-mide. The addition of a tyrosine residue able to be radioiodinatedby electrophilic substitution on the aromatic ring yields[125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide.

The N-terminal modifications of EFW–NPSF conduct to a slightincrease in affinity to stably expressed T7-tagged rat NPFF2 recep-tors in SH-SY5Y cells; the Ki value of YE(Bpa)WSLAAPQRFamide is0.077 ± 0.022 nM (n = 3) (Fig. 1A) versus 0.34 nM for the parentpeptide EFW–NPSF on rat spinal cord [20] and 0.21 nM on humanNPFF2 receptor expressed in CHO cells [19]. [125I]YE(Bpa)

Fig.1. Affinity of reversible and irreversible binding of YE(Bpa)WSLAAPQRFamideon SH-SY5Y membranes transfected with T7–NPFF2 receptor. (A) Competitionbinding profile of YE(Bpa)WSLAAPQRFamide against [3H]EYF binding on transfectedSH-SY5Y with rat T7-tagged NPFF2 receptors. [3H]EYF was used at 0.5 nM. Thevalues are means ± standard errors of three experiments. (B) Saturation bindingisotherm of [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide to T7–NPFF2 receptors on SH-SY5Ymembranes. Total binding is shown as closed symbols, and nonspecific binding(open circles) was determined in the presence of 1 lM unlabeled dNPA. Each pointrepresents the mean ± standard error of triplicate determinations. (C) Densitomet-ric quantitation of NPFF2 receptor labeling by [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide(1 nM) in the presence of increasing concentrations of dNPA. Reversible binding ofthe radioiodinated probe (open symbols) measured at equilibrium is shown.Irreversible binding (closed symbols) corresponding to the 140-kDa form (circles)and the 95-kDa form (triangles) was measured on SDS–PAGE after irradiation. B/B0

is the ratio of specific binding in the presence of unlabeled dNPA to maximalspecific binding calculated on the 140-kDa form. Error bars are omitted for the sakeof clarity (n = 3).

Fig.2. Photoaffinity labeling with 1 nM [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide of SH-SY5Ycell membranes expressing rat T7–NPFF2 receptor. Samples were analyzed by SDS–PAGE (8% acrylamide), and radiolabeled bands were detected with a PhosphorIm-ager. Autoradiograms showing photolabeling by [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide ofSH-SY5Y cell membranes after 5 days of exposure are shown. Lanes 1 and 2:membranes from wild-type cells; lanes 3 and 4: membranes from cells expressingNPFF2 receptor. The results shown are typical autoradiograms representative of atleast five independent experiments, where 50 lg of membrane protein was run perlane. Lanes 1 and 3 represent total binding, and lanes 2 and 4 represent nonspecificbinding in the presence of 1 lM dNPA. On the right, densitometric profiles of thelanes 3 and 4 are reported as percentages of maximal gray level. The molecularmasses were estimated relative to standards indicated in kilodaltons (kDa).

52 Affinity labeling of NPFF receptors / L. Bray et al. / Anal. Biochem. 453 (2014) 50–54

WSLAAPQRFamide binding reached equilibrium after 45 min at25 �C; the radioiodinated ligand interacted with a single class ofbinding sites, and the binding parameters calculated by nonlinearregression yielded a KD value of 0.24 ± 0.05 nM and a maximalbinding capacity of 1.79 ± 0.22 pmol/mg protein (mean ± standarddeviation of three independent experiments). The nonspecificbinding varied from 8 to 30% of total binding from 0.01 to 1 nM(Fig. 1B).

Photolabeling analyses of T7-tagged rat NPFF2 receptor

As shown in Fig. 2, the photolabile radioiodinated analoguecovalently labeled the T7-tagged rat NPFF2 receptor, and two broadand diffuse bands were resolved on SDS–PAGE, centered at 95 and140 kDa. The formation of the irreversible binding to both specieswas prevented by the presence of cold dNPA in a dose-dependentmanner (Fig. 1C and Fig. 2, lane 4), identifying them as NPFF2 bind-ing sites. Furthermore, these bands were not present in samplesprepared from non-receptor-bearing parental SH-SY5Y cell mem-branes (Fig. 2, lane 1). Specific irreversible binding in both bandswas induced by UV rays in a dose-related manner and reached amaximum after 60 min of irradiation (data not shown). Densito-metric quantification showed that after irradiation, 38 ± 6%(n = 4) of the radioactivity bound to the membrane preparationafter washing of the free ligand was retained in the gel and shouldbe considered as covalently bound. At a final concentration of1 nM, the maximal specific binding of [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFa-mide to the 140-kDa form was 2.2 ± 0.3 (n = 4) fold higher thanthat to the 95-kDa form. As shown in Fig. 1C, the photolabile radi-oiodinated ligand covalently labeled irreversibly the two forms ofNPFF2 receptor with the same apparent affinity. The Ki value ofdNPA on the specific reversible binding of [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide is 0.11 ± 0.10 nM (n = 2), a value identical to

Affinity labeling of NPFF receptors / L. Bray et al. / Anal. Biochem. 453 (2014) 50–54 53

the one determined on human NPFF2 receptor [17] After irradiationand formation of an irreversible binding, the apparent Ki values ofdNPA preventing the irreversible binding correspond to0.26 ± 0.12 nM for the 140-kDa form and 0.24 ± 0.14 nM for the95-KDa form.

The potency of a photoaffinity radioligand depends on its dissoci-ation rate rather than on affinity measured at equilibrium [21]. Thekinetics of ligand dissociation of a pre-bound [3H]EYF on NPFF2

receptor in the presence of an unlabeled ligand was determined tobe 0.012 min�1, whereas the apparent constant was 0.070 min�1

after an infinite dilution of the radioligand concentration. The slowdissociation rate of the radioligand, close to 10 times, in favorableexperimental conditions to rebinding probably explains the highlyefficient formation of binding complexes by increasing the residencetime of the probe in receptors by promoting the irradiation efficacy.

Fig.3. Immunoblot analyses of membranes from SH-SY5Y cells stably transfectedwith complementary DNA (cDNA) encoding rat T7–NPFF2 receptor. (A) Immuno-detection, using an anti-T7 antibody, of a whole cell extract of SH-SY5Y cellsexpressing rat T7–NPFF2 receptor. (B) T7 immunoblot of membranes prepared fromSH-SY5Y cells expressing rat T7–NPFF2 receptor photolabeled with 2 nMYE(Bpa)WSLAAPQRFamide and solubilized in Laemmli buffer (100 lg protein).

Fig.4. Densitometric tracing of [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide labeling on membraneprotein) was analyzed by SDS–PAGE (8% acrylamide) after photolabeling by [125I]YE(Bpa)trace) and nonspecific binding (bottom trace) were reported as relative gray level of theImageJ software. The molecular masses of standards are reported in kilodaltons (kDa).

Immunoblot analyses of T7-tagged rat NPFF2 receptor

Western blots of total extracts or membranes from SH-SY5Ycells expressing the rat T7–NPFF2 receptor revealed after solubili-zation in 2% SDS or 1%Triton X-100 two predominant species atapproximately 95 and 140 kDa (Fig. 3). In membrane preparationphotolabeled with the cold probe and revealed by immunoblotting(Fig. 3B), two diffuse bands were observed at molecular weightsand with a relative distribution that correspond strictly to theradiolabeling of [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide, indicating thatall species labeled by the radioligand possessed the T7 tag and rep-resented different forms of NPFF2 receptor. The densitometric anal-ysis revealed that the density of the 140-kDa form is 2.1 times thatof the 95-kDa form.

NPFF receptors of mouse olfactory bulb

To determine whether different forms of NPFF receptors exist inmammalian brain, we have photolabeled with [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide membranes of the mouse olfactory bulb that ex-hibit, in the external plexiform layer, the richest source of NPFF2

binding sites [10,22]. The specific binding of [125I]YE(Bpa)WSLAAPQRFamide to mouse olfactory bulb membranes at 25 �Cwas saturable between 0.02 and 2 nM, and the nonlinear regressionanalysis of the saturation curves showed the occurrence of only oneclass of binding sites (Bmax = 13 ± 4 fmol/mg protein), displaying ahigh affinity (KD = 0.9 ± 0.4 nM). Although this tissue has the high-est density of NPFF2 receptors, the relatively low number of bindingsites necessitated using high content of protein that gave only 24%of specific binding (determined in the presence of 1 lM dNPA) atthe KD concentration. After irradiation and solubilization of mem-brane proteins in SDS, a low quantity of irreversible specific bindingcould be measured after migration in SDS–PAGE, as illustrated inFig. 4. Only the labeling of the proteins with an apparent molecularweight superior to 130 kDa was specific given that it was decreasedto basal gray level in the presence of 1 lM dNPA.

Discussion

The N-term of NPFF analogues is an interesting position withinthe pharmacophore given that previous results demonstrated,according to the message address concept, that C-terminal aminoacids of NPFF would be essential for biological response, whereasthe N-terminal segments allow the formation of the appropriateconformation required for the interaction with the receptor [23].The C-terminal amide function, an aromatic ring oriented in a

of the mouse olfactory bulb analyzed by SDS–PAGE. Sample (150 lg membraneWSLAAPQRFamide (2 nM). The densitometric measurements of total binding (upperradioactivity detected in a PhosphorImager after 35 days exposure and analyzed by

54 Affinity labeling of NPFF receptors / L. Bray et al. / Anal. Biochem. 453 (2014) 50–54

hydrophobic pocket and an oriented guanidino group, is the mes-sage domain conferring high affinity and activity, whereas the res-idues in the N-terminal part seem to be important to createselectivity between NPFF1 and NPF2 receptors [24].

The YE(Bpa)WSLAAPQRFamide Bpa derivative was developed toallow direct radioiodination of the ligand and maintained a highaffinity toward NPFF2 receptor. The moiety modified with Bpawas correctly positioned to efficiently covalently label the receptor.

Photoaffinity labeling of NPFF2 receptor revealed, for the firsttime, different protein species consisting of functional NPFF2

receptor capable of binding an NPFF agonist with the same appar-ent affinity. The predicted molecular mass of the rat NPFF2 receptorwith the T7 tag engineered onto the N terminus is 48,808 Da; theimmunoreactive species of 95 kDa likely represented a monomericglycosylated receptor. The interference of negatively charged car-bohydrate moieties with the protein denaturing effects of SDS[25] is known to produce a ‘‘hump’’ rather than a discrete peakin SDS–PAGE [26]. The higher molecular weight species revealedvia photoaffinity labeling could represent the receptor at differentstages of its life cycle in different oligomerization states with otherproteins or additional posttranslational modifications. Immunoblotanalysis of rat T7–NPFF2 receptors from total SH-SY5Y extractsconfirmed the detection of different molecular species, suggestingthat NPFF2 receptor could exist in SDS in different forms. Many G-protein-coupled receptors can form homodimers and/or heterodi-mers in the membrane [27] and appear as higher order complexeswith the appearance of multiple bands on SDS–PAGE. However,detergents can also promote nonphysiological oligomerization oraggregation of membrane proteins, and many hydrophobic mem-brane proteins are susceptible to SDS resistance and may aggregatethrough the formation of new hydrophobic interactions during thesolubilization process [27].

In membrane preparation, the relative proportion of the twomajor forms detected by the photolabel was exactly the same asthat observed on the immunoblot, suggesting that the radioiodin-ated probe binding capability of each species was equivalent. Inter-estingly, the fact that a similar high molecular weight form ofNPFF2 receptor was observed in the membrane of olfactory bulbsuggests that this form prevails in native tissue and was not theonly artifactual SDS-resistant oligomeric species due to a high levelof heterologous expression of receptors. In contrast, the low quan-tity of binding sites in the tissue might not permit detection of theminor 95-kDa form.

To conclude, the current study is the first report of affinity label-ing of the NPFF2 receptor. We demonstrated that an NPSF deriva-tive acting as an NPFF2 receptor selective ligand could beradioiodinated to achieve a high specific activity without loss ofaffinity and is an adequate radioligand in vitro, able to photolabelwith high efficacy several forms of NPFF2 receptors. This new li-gand should be appropriate for examination of the rate of deliveryof receptors to the cell surface and recycling of the receptors aswell as the identification of residues in NPFF2 receptor in interac-tion with the bound ligand. In addition, because of its very highspecific activity and selectivity, the radioligand will be importantfor autoradiographic localization at the cellular level of receptorspostulated to be important in the in vivo modulation of opioidactivity.

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http://refhub.elsevier.com/S0003-2697(14)00086-4/h0005

























































































135

Discussion, Conclusion

Lors de cette étude, nous avons caractérisé les propriétés de liaison du ligand

iodable YE(Bpa)WSLAAPQRFa sur le récepteur NPFF2 de rat exprimé dans des

cellules SH-SY5Y. Ce ligand possède les caractéristiques permettant une haute

affinité puisqu’il possède le C-terminal amidé commun aux peptides NPFF. De

plus il possède l’extension N-terminale importante dans la sélectivité envers le

récepteur NPFF2 [313]. Ce ligand, développé afin d’être marqué à l’125I, possède

une forte affinité pour le récepteur NPFF2. La position de la modification

réalisée avec le Bpa permet au ligand de lier le récepteur de façon covalente.

Ainsi nous avons pu détecter le récepteur exprimé dans des cellules modèles

mais aussi sur membranes de bulbes olfactif de souris. Ce ligand pourra, après

caractérisation fonctionnelle, aider à la compréhension du mode de liaison des

ligands sur le récepteur NPFF2 et à la connaissance des domaines d’interaction

ligand/récepteurs. Ce ligand pourrait se révéler d’un grand intérêt dans la

recherche de ligands spécifiques du récepteur NPFF2.

136 Conclusion générale et perspectives

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

137

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Les récepteurs couplés aux protéines G sont impliqués dans la réponse à de

nombreux stimuli. Ils sont aussi le site d’action de beaucoup de médicaments

aujourd’hui sur le marché. L’étude de la régulation de leur activité est

déterminante pour l’amélioration des traitements utilisés ou bien pour la

découverte de nouvelles options thérapeutiques.

Les opioïdes sont, aujourd’hui encore, les meilleurs mais aussi les principaux

analgésiques utilisés en clinique. Cependant, leur utilisation est limitée par la

survenue d’effets indésirables tels que la tolérance et la dépendance. Les

opioïdes tels que la morphine exercent leurs effets en agissant

préférentiellement sur les récepteurs MOP. Le traitement chronique à la

morphine induit des adaptations cellulaires mais aussi une modification de la

réponse des récepteurs. La modification de l’équilibre homéostasique provoque

la libération de peptides s’opposant à ses effets, comme le NPFF. Le NPFF fait

partie d’un système de neuropeptides régulant l’activité des opioïdes. Au

niveau cellulaire, cet effet modulateur a été démontré comme étant un effet

anti-opioïde.

L’activité des RCPG est fortement régulée par la phosphorylation. Celle-ci est

réalisée par des kinases spécifiques comme les GRK, impliquées dans la

désensibilisation homologue, ou bien par les PKA ou PKC, pour les principales,

activées par les messagers secondaires et impliquées dans la désensibilisation

hétérologue. Ces phosphorylations, selon le schéma classique de régulation des

RCPG, augmentent l’affinité pour la -arrestine, qui, recrutée, découple le

récepteur de la protéine G et donc termine la signalisation intracellulaire. La -

arrestine recrute elle-même la protéine adaptatrice AP2 puis la machinerie

d’endocytose. Le récepteur est alors internalisé. Dans le cytoplasme, les

phosphatases déphosphorylent les récepteurs, l’acidification du milieu dans les

endosomes permet la libération de l’agoniste. Le récepteur peut alors suivre

deux voies différentes, la voie de la dégradation par les lysosomes ou bien le

recyclage à la membrane. Les phosphorylations du récepteur MOP ont

dernièrement été largement étudiées. Les résidus phosphorylés ont d’abord été


identifiés par mutagénèse dirigée des résidus potentiellement phosphorylables

[253] puis par spectrométrie de masse [249,251]. La spectrométrie de masse

est aujourd’hui fréquemment utilisée pour étudier ce type de modification post-

traductionnelle car elle permet une approche précise des résidus phosphorylés

que ce soit au niveau basal ou après activation par l’agoniste [249]. Elle permet

de plus de distinguer la proportion de récepteurs phosphorylés sur des résidus

particuliers [251]. Lors de ma thèse nous avons donc choisi cette méthode

d’identification. La technique de quantification label-free permet la

comparaison des phosphorylations du récepteur entre les conditions contrôle

et traité. Cependant, la taille des différents fragments générés par le clivage à la

trypsine dépend fortement de la séquence du récepteur. De plus, les

modifications elles-mêmes, comme l’oxydation, peuvent influer sur l’efficacité

du clivage et la détection des peptides. Les problèmes techniques rencontrés ne

nous ont pas permis d’identifier clairement les phosphorylations induites par le

1DMe sur le récepteur NPFF2 de rat. Nous avons donc choisi une autre espèce

en considérant que les résidus conservés seraient les plus susceptibles d’être

impliqués dans la régulation de l’activité du récepteur. L’identification des

phosphorylations du récepteurs NPFF2 humain a donc été effectuée. L’analyse

protéomique a permis d’identifier des sites de phosphorylations régulés par

l’agoniste : le doublet 375TS376 et la S369 phosphorylée à l’état basal. La

phosphorylation in vitro du fragment C-terminal du récepteur par la GRK2

purifiée a ensuite permis d’identifier le cluster 414TTNSS418 comme substrat de

la kinase. Les thréonines phosphorylés ont ensuite été étudiées sur le

récepteur de rat par Western Blot grâce à l’utilisation d’un anticorps anti-

phospho-thréonine. Les immunoblots ont permis de confirmer une régulation

par l’agoniste pour les T372, T412 et T415.

L’ensemble de ces résultats nous permettent de conclure que sur les 8 résidus

de la partie C-terminale phosphorylés (à l’état basal ou régulé par l’agoniste)

chez l’homme, 6 sont conservés chez le rat: T372 (375 chez l’homme), S373

(376), S395 (398), T412 (415), S414 (417), T415 (S418).

Nous avons, de plus, identifié la GRK2 comme responsable de la

phosphorylation du cluster final 412TNST415. Il est intéressant de constater que

cette kinase, recrutée par le récepteur NPFF2, est celle reportée par Moulédous

139

et al comme étant responsable de la trans-phosphorylation du récepteur MOP

par le NPFF2 [249]. En effet, le traitement par l’agoniste NPFF, 1DMe, induit la

phosphorylation du résidu S377 du récepteur MOP humain (Ser375 chez le rat)

exprimé dans les cellules SH-SY5Y. La phosphorylation de ce résidu avait

précédemment été démontré comme étant impliquée dans la désensibilisation

du récepteur opioïde après stimulation homologue [253]. Elle pouvait aussi être

impliquée dans la désensibilisation du récepteur MOP après stimulation

hétérologue et jouer un rôle dans l’effet anti-opioïde, puisque la durée de

phosphorylation corrélait avec la durée de cet effet. Moulédous et al ont

démontré lors de cette étude que la trans-phosphorylation était inhibé par la

PTX, comme dans notre cas [249]. Le knock-down de la GRK2 par siRNA leur a

de plus permis de mettre en évidence le rôle de la GRK2 dans cette trans-

phosphorylation. D’après ces résultats deux hypothèses pouvaient donc être

formulées. La première était que la stimulation du récepteur NPFF2 par le

1DMe, induisait le recrutement de la GRK2 par le récepteur MOP permettant

ainsi sa phosphorylation. La seconde était que le récepteur NPFF2 activé

recrutait lui-même la GRK2, qui phosphorylait le récepteur MOP. Notre étude

supporte donc la seconde hypothèse selon laquelle le NPFF2 recruterait la

GRK2 de façon dépendante de l’agoniste et de la protéine G, la kinase

transphosphorylerait ainsi le récepteur MOP (figure 51).

Figure 51: Modèle proposé de transphosphorylation du récepteur MOP par le NPFF2 (Adapté de Maurice 2011)[167]. Le récepteur MOP (en jaune) activé recrute une GRK impliquée dans sa désensibilisation en phosphorylant le résidu S375. La stimulation du récepteur NPFF2 (en orange) par le 1DMe, induit la formation du dimère MOP-NPFF2 [143], le récepteur NPFF2 recrute la GRK2 qui phosphoryle le récepteur sur son cluster final 412TNST415. La GRK2 phosphoryle aussi le récepteur MOP (en jaune) sur la S375, résidu impliqué dans sa désensibilisation. M : morphine.


Etudier le rôle des phosphorylations du récepteur NPFF2 dans la

désensibilisation de l’effet anti-opioïde serait particulièrement intéressant. En

effet sur cellules modèles SH-SY5Y [7] et sur neurones isolés des ganglions de

la racine dorsale [9] et du noyau dorsal du raphé [407], l’effet anti opioïde a été

démontré comme un antagonisme fonctionnel des récepteur MOP sur les

conductances calciques induites par la dépolarisation. Cet effet médié par le

récepteur NPFF2 est désensibilisé après 60 minutes de traitement à l’agoniste

NPFF et est relié à la déphosphorylation de la S377 du récepteur hMOP [249].

La comparaison de la désensibilisation de l’effet anti-opioïde dans les cellules

exprimant les récepteurs WT et mutants pourrait permettre d’évaluer le rôle

des sites de phosphorylation dans l’effet anti-opioïde et/ou dans la

désensibilisation de cet effet.

Notre étude suggère l’implication d’une autre GRK (GRK5/6) dans la

phosphorylation du doublet 372TS373, mais son implication reste à démontrer.

L’utilisation de si-RNA GRK5 et GRK6 pourrait le permettre et de plus, ce type

d’outil est utilisable dans ce modèle [249].

La mutagénèse dirigée nous a ensuite permis d’évaluer le rôle de ces

phosphorylations dans la régulation de l’activité du récepteur. La signalisation

du récepteur n’a pas été affectée par les mutations réalisées sur les sites

conservés. Cependant, la mutation des sites spécifiques au rat, S382 et S386 a

permis de montrer un rôle de ces sites dans l’efficacité du couplage à la

protéine G. Le cluster final 412TNST414 et dans une moindre mesure le doublet

372TS373 jouent un rôle dans la désensibilisation. Aucune mutation des sites de

phosphorylation n’a affecté le recrutement de la -arrestine. Toutefois cette

méthode de visualisation du recrutement reste qualitative et pourrait être

renforcée par une étude plus quantitative comme le BRET ou le FRET qui

permettrait une approche plus précise de ce recrutement. Nos résultats

suggèrent que l’internalisation du récepteur nécessite la muti-phosphorylation

de la partie C-terminale du récepteur, au moins sur les résidus S395, S414,

T415.

Un doute subsiste pourtant quant à la phosphorylation des S414 et S373, car

nous n’avons malheureusement pas pu évaluer la phosphorylation des sérines

à cause du manque d’outils disponibles. La génération d’anticorps

141

phosphospécifiques pourrait confirmer ou non la phosphorylation de ces

résidus.

Les résultats obtenus durant notre étude nous permettent en effet de

considérer la production d’anticorps phosphospécifiques, non seulement pour

étudier les caractéristiques précises de ces sites de phosphorylation (leur

cinétique, leur localisation, leur déphosphorylation), mais aussi pour envisager

l’étude de ces phosphorylations dans des situations physiopathologiques

comme la tolérance à la morphine. La production d’anticorps

phosphospécifiques nécessite au préalable la synthèse de peptides

phosphorylés sur le résidu ciblé. Les peptides les plus fréquemment utilisés

sont constitués au maximum d’une vingtaine d’acides aminés, la taille optimale

étant de 10 à 15 acides aminés [231,247,429]. En parallèle, les peptides ne

portant pas la modification doivent aussi être synthétisés afin de sélectionner

et de purifier les anticorps phosphospécifiques. D’après nos résultats nous

pouvons d’ores et déjà proposer la synthèse de plusieurs peptides (figure 52).

Figure 52: Proposition de peptides pour la production d’anticorps phosphospécifiques. Sur le haut de la figure est représenté la séquence de l’extrémité C-terminale du récepteur NPFF2 de rat et les sites phosphorylés identifiés durant cette étude, avec en rouge les sites phosphorylés conservés et en bleu les

sites phosphorylés spécifiques au récepteur de rat. En dessous, cinq propositions de peptides prévus pour induire une reconnaissance envers la phosphorylation du résidu noté à droite du peptide. Le résidu portant la phosphorylation est coloré en rouge.

Les peptides synthétisés doivent être purifiés par HPLC. Généralement, les

peptides sont trop petits pour induire une réponse immunitaire satisfaisante

chez les animaux. Afin de permettre une réponse immunitaire suffisante, le

peptide doit être fixé sur une macromolécule qui sert de vecteur, comme la

protéine KLH (keyhole limpet haemocyanin)[247]. L’immunogène ainsi préparé

doit être purifié pour ne pas induire de réponse immunitaire dirigée contre les

contaminants. Enfin l’immunogène est injecté à l’animal (le plus fréquemment

le lapin, la souris ou le cobaye). Deux injections sont généralement réalisées,

363RAKRNLDINTSGLLVHEPASQNPSGENLGCRKSADNPTQESLMEETGEATNSTET

417

Peptide 1: 367NLDIN(pT)SGLLV

377 T372

Peptide 2: 390LGCRK(pS)ADNPT

400 S395

Peptide 3: 407ETGEA(pT)NSTET

417 T412

Peptide 4: 407ETGEATN(pS)TET

417 S414

Peptide 5: 407ETGEATNS(pT)ET

417 T415


espacées de 4 semaines. La co-injection d’adjuvant permet d’augmenter

l’immunogénicité de l’antigène et favorise la présentation de l’antigène au

système immunitaire. Plusieurs types d’adjuvants peuvent être utilisés comme

par exemple l’adjuvant complet de Freund. Une fois les antisera obtenus, la

spécificité peut être vérifiée par dot-blot [247] puis les anticorps doivent être

sélectionnés et caractérisés. La purification peut être réalisée par

chromatographie, sur colonne d’affinité sur laquelle sont fixés les peptides non

phosphorylés ou phosphorylés. Les anticorps sont ensuite caractérisés par

SDS-PAGE et Western Blot. Les anticorps polyclonaux sont généralement

préférés aux anticorps monoclonaux car leur délai d’obtention est moins

important (environ deux à trois mois). Ce type d’outils serait particulièrement

intéressant car il n’en existe aujourd’hui aucun permettant la détection des

récepteurs NPFF2 activés.

La signalisation du récepteur NPFF2 était peu documentée. Ici nous confirmons

l’activation de ERK après stimulation du récepteur et montrons que cette

activation se maintient lors de longues stimulations par l’agoniste ce qui

suggère l’implication de la -arrestine. En effet pour le récepteur opioïde MOP,

l’activation de ERK est maintenue jusqu’à une heure de traitement par

l’agoniste. Cependant la signalisation G-protéine dépendante est très

rapidement désensibilisée, au bout de 5 min, à cause du découplage induit par

la -arrestine (ce qui est cohérant avec notre observation de désensibilisation

du récepteur NPFF2 au bout de 5 min). L’activation de ERK se maintient par la

suite grâce à la formation du complexe -arrestine-ERK. Cette hypothèse

pourrait être vérifiée par mesure de l’activation de la voie ERK après knock-

down de la -arrestine par siRNA. Pour aller plus loin, l’activation de la voie

ERK pourrait être mieux caractérisée. Pour le récepteur AT1 le complexe -

arrestine-ERK rend possible une signalisation dans les endosomes [119]. Ce

type de signalisation pourrait être évalué dans le cas du récepteur NPFF2 en

visualisant la localisation de ERK activé après stimulation du récepteur, car le

maintien de l’activation de ERK coïncide avec les durées de traitement pour

lesquelles nous observons de l’internalisation.

Nous avons de plus démontré la libération de calcium intracellulaire médiée

par l’activation de la PLC après stimulation du récepteur. Le fait que cette

143

libération soit dépendante à la fois de la protéine G et de la PLC suggère une

activation de la PLC par la protéine G. L’isoforme impliquée pourrait donc être

une PLC, dont le mécanisme d’activation dépend de la sous-unité G. Cette

hypothèse pourrait être vérifiée par l’utilisation de siRNA spécifique de cette

isoforme. Cette voie de signalisation n’avait jusqu’ici jamais été décrite et

renforce donc notre connaissance de la signalisation du récepteur NPFF2.

Parallèlement à l’étude des phosphorylations, nous avons caractérisé un

nouveau ligand photoactivable pour le récepteur NPFF2. Ce ligand iodable

permet justement de détecter les récepteur NPFF2 sur membranes de cellules

modèles mais aussi sur membranes de bulbe olfactif de souris. Il pourra, dans

le futur, permettre une meilleure compréhension du mécanisme de liaison et

des domaines impliqués dans la formation du site de liaison du récepteur

NPFF2. Il reste cependant à caractériser ce ligand plus précisément,

notamment en terme de fonctionnalité sur ce récepteur, mais aussi sur le

récepteur NPFF1 en déterminant sa sélectivité. Ce ligand pourrait se révéler

d’un intérêt majeur dans l’étude des récepteurs NPFF.

L’étude des sites de phosphorylation du récepteur NPFF2 s’inscrit dans une

volonté de comprendre les mécanismes généraux régulant l’activité des

récepteurs couplés aux protéines G, mais aussi de consolider notre

connaissance du système NPFF et plus particulièrement des mécanismes

impliqués dans la régulation de son activité. Cette étude rend possible la

génération d’anticorps phosphospécifiques dont l’utilisation a beaucoup aidé

l’étude et la compréhension de la signalisation et des mécanismes de régulation

de nombreux RCPG. Notre étude permet également de connaitre plus en détail

la signalisation de ce récepteur et conforte notre modèle du mécanisme de

régulation de l’activité opioïde. La caractérisation du ligand photoactivable

constitue, quant à elle, une première étape dans l’étude du mode de liaison sur

le récepteur NPFF2 et pourrait se révéler essentielle dans la synthèse de

nouveaux ligands. Ces résultats pourront, dans leur ensemble, être d’une

grande utilité dans l’étude du système NPFF. La compréhension des

mécanismes d’action et de régulation de ce système est fondamentale au regard

des nombreuses fonctions physiologiques dans lesquelles il est impliqué.

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173

ANNEXE

Lionel MoulédousJean-Marie Zajac, Catherine Mollereau andCédric Candotto, Odile Burlet-Schiltz, Lauriane Bray, Carine Froment, Pierre Pardo,

Receptor2Sites of the Neuropeptide FFCharacterization of the Phosphorylation Identification and FunctionalSignal Transduction:

doi: 10.1074/jbc.M114.612614 originally published online October 17, 20142014, 289:33754-33766.J. Biol. Chem.

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http://www.jbc.org/

Identification and Functional Characterization of thePhosphorylation Sites of the Neuropeptide FF2 Receptor*

Received for publication, September 17, 2014, and in revised form, October 10, 2014 Published, JBC Papers in Press, October 17, 2014, DOI 10.1074/jbc.M114.612614

Lauriane Bray, Carine Froment, Pierre Pardo, Cédric Candotto, Odile Burlet-Schiltz, Jean-Marie Zajac,Catherine Mollereau1,2, and Lionel Moulédous1,3

From the Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale, UMR5089 CNRS, Université de Toulouse, 31077 Toulouse, France

Background: G protein-coupled receptor functions are regulated by phosphorylation.Results: Mass spectrometry was used to map the phosphorylation sites of the NPFF2 neuropeptide FF receptor, and site-directedmutagenesis permitted the identification of their role in receptor regulation.Conclusion: Sites involved in desensitization and internalization do not fully overlap.Significance: This is the first mapping of NPFF2 receptor phosphorylation.

The neuropeptide FF2 (NPFF2) receptor belongs to the rho-dopsin family of G protein-coupled receptors and mediates theeffects of several related RFamide neuropeptides. One of themain pharmacological interests of this system resides in its abil-ity to regulate endogenous opioid systems, making it a potentialtarget to reduce the negative effects of chronic opioid use. Phos-phorylation of intracellular residues is the most extensivelystudied post-translational modification regulating G protein-coupled receptor activity. However, until now, no informationconcerning NPFF2 receptor phosphorylation is available. In thisstudy, we combined mass spectrometric analysis and site-di-rected mutagenesis to analyze for the first time the phosphory-lation pattern of the NPFF2 receptor and the role of the variousphosphorylation sites in receptor signaling, desensitization, andtrafficking in a SH-SY5Y model cell line. We identified themajor, likely GRK-dependent, phosphorylation cluster respon-sible for acute desensitization, 412TNST415 at the end of the Cterminus of the receptor, and additional sites involved in desen-sitization (372TS373) and internalization (Ser395). We thus dem-onstrate the key role played by phosphorylation in the regula-tion of NPFF2 receptor activity and trafficking. Our data alsoprovide additional evidence supporting the concept that desen-sitization and internalization are partially independent pro-cesses relying on distinct phosphorylation patterns.

Neuropeptide FF2 (NPFF2)4 receptor belongs to the rhodop-sin family of G protein-coupled receptors (GPCR) (1, 2). It

mediates the effects of several RFamide neuropeptides pro-duced from two precursors called proNPFFA and proNPFFB(3). The NPFF system is involved in a variety of physiologicalprocesses affecting cardiovascular function and pain percep-tion, among other processes (4). One of its main pharmacolog-ical interests resides in its ability to regulate endogenous opioidsystems, making it a potential target to reduce the negativeeffects of chronic opioid use (5–7). Indeed, the NPFF receptorantagonist RF9 has been shown to prevent the development oftolerance and hyperalgesia induced by chronic heroin treat-ment in rats (8), as well as morphine tolerance and physicaldependence in mice (9). The signaling properties of the NPFF2receptor have been studied in several cellular models. Thereceptor was demonstrated to couple to Gi/o heterotrimericproteins to inhibit adenylyl cyclase (10) and N-type voltage-gated calcium channels (11) and activate G protein-regulatedinwardly rectifying potassium channels (12), as well as a puta-tive delayed rectifier K� channel (13). It was also shown toactivate MAPK pathways (14). However, the mechanisms reg-ulating NPFF2 receptor signaling and trafficking have not beenstudied in detail.

Phosphorylation of intracellular residues is the most exten-sively studied post-translational modification regulating GPCRactivity. After agonist binding, homologous phosphorylation ofactivated GPCR, mediated by kinases belonging to the GPCRkinase family (GRK), results in G protein uncoupling, the firststep of receptor desensitization (15, 16). Recent evidence sug-gests thatGRKcouldalsobe involved inheterologousphosphor-ylation (meaning, upon activation of another GPCR) anddesensitization (17, 18). Second messenger-dependent kinasessuch as PKA or PKC can also promote desensitization (15, 16).Phosphorylation of activated receptors then triggers therecruitment of �-arrestin1 and/or arrestin2 proteins (alsocalled arrestin2 and arrestin3, respectively) (19), which contrib-utes to G protein uncoupling and clathrin-coated pit-mediatedreceptor internalization but can also elicit G protein-indepen-dent signaling (20). In recent years, it has appeared that phos-phorylation was not a simple on/off switch for GPCR activitybut that, depending on ligand or cell type, various patterns ofreceptor phosphorylation, sometimes referred to as barcoding,could regulate receptor function in different ways (21–24).

* This work was supported in part by grants from the Fondation pour laRecherche Médicale (programme Grands Equipements), the Région Midi-Pyrénées, Infrastructures en Biologie, Santé et Agronomie, and FondsEuropéens de Développement Régional.

1 These authors contributed equally to this work.2 To whom correspondence may be addressed: Inst. de Pharmacologie et Biologie

Structurale, UMR5089 CNRS, Université de Toulouse, 205 route de NarbonneBP64182, 31077 Toulouse, France. E-mail: [email protected].

3 To whom correspondence may be addressed: Inst. de Pharmacologie etBiologie Structurale, UMR5089 CNRS, Université de Toulouse, 205 route deNarbonne BP64182, 31077 Toulouse, France. E-mail: [email protected].

4 The abbreviations used are: NPFF2, neuropeptide FF2; GPCR, G protein-coupledreceptor; GRK, GPCR kinase; PTX, pertussis toxin; KRH, Krebs-Ringer-HEPES;CID, collision-induced dissociation; ETD, electron transfer dissociation.

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 289, NO. 49, pp. 33754 –33766, December 5, 2014© 2014 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Published in the U.S.A.

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From a fundamental point of view, it is thus important tomap the phosphorylation pattern of GPCR and to characterizethe specific contribution of each phosphorylated site to the reg-ulation of receptor activity (25, 26). Agonist-dependent phos-phorylation sites can also be targeted to generate phospho-spe-cific antibodies useful to study receptor activation in vivo (27).In the case of rodent NPFF receptors such tools are lacking andcould be very helpful for understanding physiological activationof these receptors. However, to date, the potential phosphory-lation sites of NPFF2 receptors have never been studied.Depending on the species, 20 or more Ser, Thr, or Tyr candi-dates are present in the intracellular domain of the receptor(Fig. 1). Because of this potential complexity, we first undertooka mass spectrometry approach to map phosphorylated residuesin the human and rat NPFF2 receptors in a SH-SY5Y neuroblas-toma cellular model (18). Site-directed mutagenesis was thenperformed to study the role of phosphorylated residues/clus-ters in receptor signaling, desensitization, and trafficking.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Materials—Oligonucleotides were synthesized by SigmaGenosys. Restriction enzymes were purchased from New Eng-land Biolabs (Ozyme, France). Anti-T7 monoclonal antibodywas from Merck Millipore. Rabbit anti-p44/42 MAPK and anti-

phospho(Thr202/Tyr204)-p44/42 MAPK antibodies were fromCell Signaling Technology (Ozyme, France). Alexa Fluo 488goat anti-mouse, rabbit anti-phosphothreonine and monoclo-nal mouse anti-GFP (mAb3E6) antibodies were from Invitro-gen. HRP-coupled goat anti-rabbit IgG and anti-mouse IgGwere purchased from Jackson ImmunoResearch. 1DMe ([D-Tyr1, (NMe)Phe3]NPFF) (28) was synthesized with an auto-mated peptide synthesizer (model 433A; Applied Biosystems).Pertussis toxin (PTX) and chelerythrin were from Sigma. PLCinhibitor (U73122), calmodulin inhibitor (W7), and �-ARK1inhibitor were from Calbiochem (Merck Millipore). [3H]ad-enine (26 Ci/mmol) was purchased from GE Healthcare. TheNPFF2 receptor-selective radioligand [3H]EYF (Glu-Tyr-Trp-Ser-Leu-Ala-Ala-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2) was tritiated byTritec (Switzerland) as described (29). All other reagents werefrom Sigma or Euromedex (France).

Vector Construction and Site-directed Mutagenesis—T7-rNPPF2 receptor: PCR was used to amplify a cDNA coding therat NPFF2 receptor from a pCDN vector (generous gift from Dr.S. Krief). PCR primers were designed to introduce an AfeIrestriction site at the 5� end (catataagcgctatgggcaagagatgggactc-aaactct) and a stop codon and a XbaI site at the 3� end (aatcctcta-gactaagtctcagtactgttggtagcttctccc) of the amplified fragment. The

FIGURE 1. Sequence alignments of human and rat NPFF2 receptors. A, full sequences. Gray shading indicates sequence similarity between species. Black shadingshows all the putative phosphorylation sites. B, alignment of the C-terminal NPFF2 receptor sequences found to be phosphorylated in SH-SY5Y cells expressinghNPFF2-YFP or T7-rNPFF2 receptors or to be in vitro phosphorylated by GRK2 within the GST-thrombine-hNPFF2 C-terminus construct. Black shading indicates thephosphorylated sites unambiguously identified by nanoLC-MS/MS except for those specific to rat, which are highlighted with gray shading. Bold italic characters showthe trypsin cleavage sites. Small italic capitals correspond to the sequence of the linker plus the first YFP residues fused to the hNPFF2 receptor C terminus. The positionsof alanine substitutions in the different T7-rNPFF2 mutant receptors are presented. The simplified name of each mutant is in brackets.

Functional Mapping of NPFF2 Receptor Phosphorylation

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fragment was then cloned in frame with a T7 peptide tag inpRc/CMV vector. Phosphosites/alanine exchange: site-di-rected mutations were introduced in the T7-rNPPF2 sequenceby PCR using the QuikChange Lightning site-directed muta-genesis kit (Stratagene, Agilent Technologies Company,France) according to the manufacturer’s instructions. Thefollowing primers were used: TS372AA (sense, acgcaacctggac-ataaacgcagctggcctgttggtc; antisense, gaccaacaggccagctgcgtttat-gtccaggttgcgt), S382A/S386A (sense, gtccatgaacctgcagctcaaaa-cccagctggggaaaacttgg; antisense, ccaagttttccccagctgggttttgagc-tgcaggttcatggac), S395A (sense, tggggaaaacttgggatgtagaaaagct-gcagacaatccc; antisense, gggattgtctgcagcttttctacatcccaagttttcc-cca), ST414AA (sense, aaacgggagaagctaccaacgctgctgagacttagt-ctagaggg; antisense, ccctctagactaagtctcagcagcgttggtagcttctccc-gttt), and TNST412ANAA (sense, aaacgggagaagctgccaacgctgc-agagacttagtctag; antisense, ctagactaagtctctgcagcgttggcagcttctc-ccgttt). For the GST-hNPFF2 C terminus construct, PCR wasused to amplify a cDNA coding the last 85 amino acids of the Cterminus of the human NPFF2 receptor. PCR primers weredesigned to introduce a BamHI restriction site at the 5� end(cgcggatccttcaacgagaacttc) and a stop codon and an EcoRI siteat the 3� end (ggaattcttaaatctcactgctgttag) of the amplified frag-ment. The fragment was then cloned in frame with GSTfollowed by a thrombin cleavage site in the pGEX2T vector (GEHealthcare). All constructs were verified by sequencing (Mille-gen, Toulouse, France).

Cell Culture and Transfection—Human neuroblastomaSH-SY5Y cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle’smedium (4.5 g/liter glucose, GlutaMAX) containing 10% FCSand 50 �g/ml gentamicin (all from Invitrogen), in a 37 °Chumidified atmosphere containing 5% CO2. All stable cDNAtransfections were performed according to the manufacturer’sinstruction using FuGENE 6 (Roche Diagnostics). After trans-fection of WT or mutant T7-rNPFF2 receptors, 500 �g/mlG418 (Invitrogen) was added to the culture medium for selec-tion of clones. For SH-SY5Y cells transfected with hNPFF2-YFPreceptor (30), 5 �g/ml blasticidin (Cayla, Invivogen, France)was added to the culture medium. All cells were usedundifferentiated.

Binding and cAMP Measurement Assays—SH-SY5Y cellsstably expressing WT or mutant T7-rNPFF2 receptors werecharacterized by [3H]EYF binding on membrane preparationsand by cellular cAMP assays, as described previously (29, 31).

Receptor Immunoprecipitation—Cells grown to 80% conflu-ence in 140-mm culture dishes were incubated in medium con-taining 0.5% FCS for 2 h. After a wash in Krebs-Ringer-HEPES(KRH) buffer (124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM MgSO4, 1.5mM CaCl2, 1.25 mM KH2PO4, 25 mM HEPES, 8 mM glucose, 0.5mg/ml bovine serum albumin, pH 7.4), the cells were incubatedwith the agonist 1DMe (1 �M) in KRH buffer for 30 min at roomtemperature. They were then scraped directly on ice and cen-trifuged at 1000 � g for 10 min at 4 °C. The pellet was incubatedfor 1 h at 4 °C under gentle agitation in lysis buffer (50 mM

Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NonidetP-40) containing protease and phosphatase inhibitor mixtures(Complete EDTA-free and PhosphoStop, respectively; RocheDiagnostics). The homogenate was then centrifuged at20,000 � g for 2 min at 4 °C, and the supernatant was collected.

hNPFF2-YFP receptors were immunoprecipitated by usingmonoclonal anti-GFP antibodies exactly as described in Ref. 18.T7-rNPFF2 receptors were immunoprecipitated by overnightincubation at 4 °C with T7 tag agarose beads (EMD MilliporeMerck) followed by three washes in 50 mM Tris-HCl, 0.5% Non-idet P-40, 5 mM EDTA. For mass spectrometry analysis, sam-ples were resuspended in 2� Laemmli sample buffer containing30 mM DTT, boiled for 5 min at 100 °C, and alkylated in 90 mM

iodoacetamide for 30 min in the dark. For standard Westernblots, samples were resuspended in 2� Laemmli sample buffercontaining 5% mercaptoethanol and boiled for 5 min at 100 °C.

GST-hNPFF2 C Terminus Purification and in Vitro Phos-phorylation—GST fusion proteins were purified using theMicroSpin GST Purification Module (GE Healthcare) accord-ing to the manufacturer’s instructions. Following inductionwith 0.2 mM isopropyl �-D-thiogalactopyranoside, transformedBL21 E. coli were lysed by sonication in a buffer containing 50mM Tris, 2 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mg/ml lysozyme,and protease inhibitors (Complete EDTA-free cocktail; RocheDiagnostics). After centrifugation of the lysate, the supernatantwas loaded on a Microspin GST column that was washed withPBS, then with PBS with 0.1% Triton X-100, and finally withPBS with 400 mM NaCl. The protein of interest was eluted in 50mM Tris-HCl, pH 8, containing 10 mM glutathion. The purifiedfragment (4 �g) was submitted to in vitro phosphorylation withGRK2 (0.4 �g, a generous gift from Prof. J. Benovic, ThomasJefferson University, Philadelphia, PA) in a buffer containing 20mM HEPES, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, and 200 �M

ATP for 2h at 30 °C in a final volume of 20 �l. The sample wasthen prepared for proteomic analysis as described above.

In-gel Tryptic Digestion and NanoLC-MS/MS Analysis—Pro-teins were separated by SDS-PAGE on 10% polyacrylamidegels. Gels were stained with colloidal Coomassie Blue (17%(w/v) ammonium sulfate, 34% (v/v) methanol, 3% (v/v)orthophosphoric acid, and 0.1% (w/v) Brilliant Blue G-250) for24 h. Bands corresponding to T7-rNPFF2 (95 kDa) receptor,hNPFF2-YFP receptor (130 kDa) or GST-hNPFF2 C terminus(36 kDa) were excised and subjected to in-gel tryptic digestionas described previously (18). The hNPFF2-YFP and T7-rNPFF2dried peptide extracts obtained were then analyzed by on-linenanoLC using an Ultimate 3000 System (Dionex, Amsterdam,The Netherlands) coupled to an electron transfer dissociation(ETD)-enabled LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer(Thermo Fisher Scientific) for an alternative decision tree-driven collision-induced dissociation (CID)/ETD fragmenta-tion acquisition (27). For GST-Thrombin-hNPFF2 C terminusdried peptide extracts, online nanoLC-MS/MS analyses wereperformed using an Ultimate 3000 system (Dionex) coupled toan nanospray LTQ Orbitrap XL mass spectrometer (ThermoFisher Scientific). The LTQ Orbitrap XL was operated in data-dependent acquisition mode with the XCalibur software (ver-sion 2.0 SR2; Thermo Fisher Scientific), using a 60-s dynamicexclusion window to prevent repetitive selection of the samepeptide. The survey scan MS was performed in the Orbitrap onthe 300 –2000 m/z mass range with the resolution set to a valueof 60,000 at m/z 400. The five most intense ions per survey scanwere selected for MS/MS fragmentation, and the resulting frag-



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ments were analyzed in the linear trap (parallel mode). Thenormalized collision energy was set to 35%.

Database Search and Determination of NPFF2 Receptor Phos-phopeptide Abundance Ratio—Peak lists extraction from Xcali-bur raw files were automatically performed using ProteomeDiscoverer software (version 1.4, Thermo Fisher Scientific,France). Parameters were set as previously described (18) withthe following modifications. Peak lists were searched againstSwissProt and TrEMBL human or rat databases implementedwith the YFP-tagged hNPFF2, T7-tagged rNPFF2, or GST-Thrombin-hNPFF2 C terminus sequence and using Mascotsoftware (version 2.3.01; Matrix Science). Up to three missedtrypsin cleavages were allowed. Mass tolerances in MS andMS/MS were set to 10 ppm and 0.6 Da, respectively, forhNPFF2-YFP and T7-rNPFF2. For GST-Thrombin-hNPFF2 Cterminus, mass tolerances were set to 10 ppm and 0.8 Da. Thephosphorylation site localization of identified phosphopeptideswas performed by phosphoRS algorithm 3.1 (32) implementedin Proteome Discoverer. A site localization probability of atleast 0.75 was used as the threshold for the phosphoresiduelocalization. Peak areas were automatically measured fromextracted ion chromatograms of each peptide (sum of allobserved charge states) in the nanoLC-MS raw file using thelabel-free module of the in-house developed MFPaQ version4.0.0 software (33). To calibrate the amounts of NPFF receptorin the different samples, normalization was performed based onthe sum of the extracted ion chromatogram areas of identifiedNPFF receptor reference peptides (unmodified and unequivo-cally cleaved peptides, always present in all samples). The ref-erence peptides for the hNPPF2-YFP receptor were: 200TSPV-YWCR207 in the NPFF2 receptor sequence and 428GEELFTG-VVPILVELDGDVNGHK450, 451FSVSGEGEGDATYGK465,470FICTTGK476, 565LEYNYNSHNVYIMADK580, 593HNIEDG-SVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSK630 in theYFP sequence.

Western Blot Analysis of NPFF2 Receptor and ERK Phosphory-lation—Cells expressing WT or mutant T7-rNPFF2 receptorswere grown to 80% confluence in 100-mm culture dishes or in24-well plate for ERK phosphorylation assay. After 2 h of incu-bation in medium containing 0.5% FCS, the cells were incu-bated in KRH buffer containing the agonist 1DMe (1 �M) for2–30 min at room temperature. For the pharmacological inhib-itor tests, PTX (100 ng/ml) was applied to the cells for 16 –18 h,the �ARK1 inhibitor (50 �M) was added during the 2-h incuba-tion in deprived serum, and the PKC inhibitor chelerythrine (10�M) and the calmodulin inhibitor W7 (20 �M) were appliedtogether with the agonist. The cells were scraped on ice andprocessed for T7 immunoprecipitation as described above ordirectly scrubbed in Laemmli sample buffer for ERK phosphor-ylation assay. Proteins were separated by SDS-PAGE on 10%polyacrylamide gels and transferred to PVDF membrane forimmunoblotting under standard conditions in Tris-bufferedsaline (20 mM Tris, pH 7.6, 137 mM NaCl) containing 0.2%Tween and 1% BSA for rabbit phosphothreonine antibody(Invitrogen; 1 �g/ml) and 5% BSA for the other primary anti-bodies. Immunoreactivity was revealed with peroxidase-conju-gated goat anti-rabbit or anti-mouse IgG antibodies using thePierce ECL2 Western blotting substrate (Thermo Fisher Scien-

tific). X-ray films were scanned using a GS-800 or GS-900 cal-ibrated densitometer (Bio-Rad). Blots were quantified usingQuantity One software (Bio-Rad) with total T7-NPFF2 receptoror total ERK as internal standards.

Calcium Imaging—Measurement of [Ca2�]i was performedin perfused WT and mutant receptor expressing SH-SY5Y cellsby quantitative photometry using the fluorescent Ca2� indica-tor Fluo-4-AM as described previously (31).

Immunocytochemistry—Cells were seeded on glass coverslipsin 24-well plates the day before the experiment. The cells werewashed with KRH buffer and incubated for 30 min in KRH(control) or KRH containing 1 �M 1DMe at room temperature.The cells were then rinsed three times with ice-cold PBS, fixed,and permeabilized in ice-cold PBS containing 3.7% paraformal-dehyde and 0.2% Triton X-100. After three washes, cells wereincubated in PBS containing 10% FCS, 2% BSA for 1 h at roomtemperature, and then incubated with anti-T7 antibody(1/2000) in PBS, 2% FCS overnight at 4 °C. After three washes,cells were incubated with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse anti-bodies for 1 h at room temperature in the dark. The cells werewashed three more times, mounted in Vectashield medium(Vector Laboratories, AbCys, France), and observed on anOlympus (FV1000) inverted confocal microscope with a 60�/NA1.4 objective at 488-nm excitation wavelength. Images wereprocessed with ImageJ (National Institutes of Health). Quanti-fication of internalization was performed using Metamorph(Molecular Devices). For each cell, the average fluorescenceintensity at the membrane and the average fluorescence inten-sity of the whole cell were measured. Then for each experimentthe internalization level was calculated as follows: 100 �[((1DMe plasma membrane fluorescence/1DMe total cell fluo-rescence) � 100)/(control plasma membrane fluorescence/control total cell fluorescence)].

�-Arrestin2 Recruitment—Transient transfection of �-arres-tin2-GFP (generous gift from Dr. S. Allouche, Université deCaen, Caen, France) was realized by using the Nucleofectortechnology (Lonza Cologne AG) according to the manufac-turer’s instructions. After electroporation, the cells were seededon glass coverslips in 24-well plates. 48 h post-transfection, thecells were incubated in medium containing 0.5% FCS for 2 h.After a wash in KRH buffer, the cells were incubated at roomtemperature in the presence of the agonist 1DMe (1 �M) for 30min and then fixed, mounted, and observed on an Olympus(FV1000) inverted confocal microscope with a 60-/NA1.4objective.

Data Analysis—Nonlinear regressions and statistical ana-lyses of the data were performed using Prism 5 (GraphPad Soft-ware Inc.) as described in the figure legends.

RESULTS

Mass Spectrometric Analysis of NPFF2 Receptor Phosphory-lation—To characterize the phosphorylation pattern of thehuman NPFF2 receptor, we used a stable SH-SY5Y cell lineexpressing the receptor fused to YFP at its C terminus. Thereceptor was purified by GFP immunoprecipitation followed bySDS-PAGE for subsequent mass spectrometry analysis. Fig. 2Ashows the hNPFF2-YFP receptor detected with a GFP antibodyafter GFP immunoprecipitation (left panel) and a preparative



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Coomassie gel used to isolate the immunoprecipitated receptorfor nanoLC-MS/MS analysis. Data-dependent decision tree-based CID/ETD analyses associated to phosphoRS algorithmcalculation were used for more confident localization of phos-phorylation sites. The peptides specific to the hNPFF2-YFPreceptor corresponded to 25 � 4% of the total MS signal (n �10). CID gave a coverage of the receptor sequence ranging from38 to 51%, whereas ETD gave a coverage between 19 and 43%.

To characterize the agonist-induced phosphorylation of theNPFF2 receptor, cells were treated with or without 1DMe, astable NPFF analog (28) (1 �M) for 30 min at room temperaturebefore receptor isolation and nanoLC-MS/MS analysis. The listof identified phosphorylated peptides together with theirunphosphorylated counterparts is given in Table 1. Except forThr157 in the second intracellular loop, all the putative phos-phorylation sites (Fig. 1) were covered by the analysis. Phosphor-ylated residues were detected only in the last part of the recep-tor C terminus. Examples of spectra obtained with eachdissociation mode are given in Fig. 2C.

The first peptide, SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETL-LYR, was sometimes extended by two residues (AK) at its Nterminus because of a missed cleavage. It was present in differ-

ent forms: unphosphorylated, phosphorylated either on Ser369,Thr375, or Ser376, or finally dually phosphorylated on a combi-nation of those three residues. Agonist treatment increased theabundance of peptides phosphorylated on Thr375 and/orSer376, whereas that of unphosphorylated or Ser369-phosphor-ylated peptides was decreased (Table 1). This indicates thatbasal phosphorylation of Ser369 is not regulated by the agonist,whereas receptor activation induces the phosphorylation of the375TS376 doublet.

Data concerning the last receptor fragment (fused to the firstresidues of YFP), KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEIESAM-VSK, were more difficult to interpret. Trypsin digestion was notfully efficient, giving rise to peptides of various sizes with up tothree missed cleavages (Table 1). Among these peptides, onlytwo phosphorylation sites could be reproducibly identified:Ser398 and Ser418. Unexpectedly, agonist treatment induced astrong decrease in the abundance of all peptides, independentlyof their phosphorylation status (Table 1). One hypothesis is thatadditional modifications occur in this region upon agonisttreatment, leading to peptides no longer detectable using ourtechnique. New database searches considering variable ubiq-uitinated lysine modification did not reveal the presence of this

FIGURE 2. MS/MS analysis of human NPFF2 receptor phosphorylation. A, isolation of NPFF2 receptors. On the left is shown a representative GFP Western blotafter hNPFF2-YFP receptor immunoprecipitation. On the right is shown a representative Coomassie-stained gel obtained from the immunoprecipitatedsample. The dotted line delimits the gel piece that was cut and trypsin-digested for nanoLC-MS/MS analysis. B, representative Coomassie-stained gel showingthe 36-kDa band corresponding to the GST-thrombin-hNPFF2 C terminus fusion protein. C, the CID MS/MS spectrum of the diphosphorylated peptide,369SHVLINpTpSNQLVQESTFQNPHGETLLYR396 (triply charged precursor ion, MH3�, at m/z 1129.1885) displays series of b- and y-ions, indicating that Thr375 andSer376 are phosphorylated. Sequence and phosphorylated position are indicated. D, the ETD MS/MS spectrum of the monophosphorylated peptide, 397pSAEK-PQQELVMEELK412 (triply charged precursor ion, MH3�, at m/z 613.6251) displays series of c- and z-ions, indicating that Ser398 is phosphorylated. Sequence andphosphorylated position are indicated.

TABLE 1List of the phosphorylated hNPFF2 receptor peptides, their unphosphorylated counterparts identified by nanoLC-MS/MS in SH-SY5Y cells, andthe peptides found to be phosphorylated in vitro by GRK2 within the GST-thrombin-hNPFF2 C terminus constructPhosphorylation sites are in bold and underlined, with parentheses pointing out ambiguity on the position. Peptides were quantified using the label-free module imple-mented in the MFPaQ v4.0 software, and their amounts were calibrated in each sample, based on the NPFF receptor reference peptides described under “ExperimentalProcedures.” The peptide ratio 1DMe/control corresponds to the ratio of the calibrated pairwise peak intensities from agonist over buffer-treated cells and are expressed asmeans � S.E. (n) indicates how many times the peptide was identified over five experiments. In the case where a peptide identified in one condition was not identified in theother one, a value corresponding to the peak area of the peptides of the lowest abundance (5th percentile) among all the peptides identified in the sample was assigned to themissing data. In vitro phosphorylation data are representative of two independent experiments. MC, missed cleavage; Theo. mass, theoretical mass; Position, amino acidpositions in each construct (full-length receptor fused to YFP or receptor C terminus fused to GST).

Theo. mass MC Positions Sequence Phospho-residuePeptide ratio

(1DMe/control)

hNPFF2-YFP3423.753489 1 367–396 AKSHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 1.279661 (1)3503.719818 1 367–396 AKSHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 1P Ser(P)369 0.46591 � 0.240 (3)3583.686148 1 367–396 AKSHVLIN(T)(S)NQLVQESTFQNPHGETLLYR 2P Ser(P)369 and Thr(P)375 or Ser(P)376 65.4386 (1)3224.621415 0 369–396 SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 0.57760 � 0.232 (5)3304.587744 0 369–396 SHVLIN(T)(S)NQLVQESTFQNPHGETLLYR 1P Thr(P)375 or Ser(P)376 6.23368 � 3.291 (3)3304.587744 0 369–396 SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 1P Ser(P)376 13.4880 � 5.246 (2)3384.554074 0 369–396 SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 2P Thr(P)375 and Ser(P)376 10.43478 (1)3384.554074 0 369–396 SHVLINTSNQLVQESTFQNPHGETLLYR 2P Ser(P)369 and Ser(P)376 32.2807 (1)1757.886929 1 398–412 SAEKPQQELVMEELK 0.59079 � 0.123 (5)1837.853258 1 398–412 SAEKPQQELVMEELK 1P Ser(P)398 0.52069 � 0.165 (5)1885.981889 2 397–412 KSAEKPQQELVMEELK 0.38205 � 0.050 (5)1965.9482 2 397–412 KSAEKPQQELVMEELK 1P Ser(P)398 0.28522 � 0.062 (2)3479.701103 3 397–427 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEIESAMVSK 0.14200 � 0.072 (5)3559.677252 3 397–427 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEIESAMVSK 1P Ser(P)398 0.04044586 (1)3351.606143 2 398–427 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEIESAMVSK 0.21746 � 0.059 (5)3431.572472 2 398–427 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEIESAMVSK 1P Ser(P)398 0.13638 � 0.071 (2)1611.729779 0 413–427 ETTNSSEIESAMVSK 0.23246 � 0.039 (5)1691.696108 0 413–427 ETTNSSEIESAMVSK 1P Ser(P)418 0.36032 � 0.136 (3)

hNPFF2 C-terminal/in vitro GRK22827.319763 3 288–311 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P Thr(P)415

2827.319763 3 288–311 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P Thr(P)414

2827.319763 3 288–311 KSAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P Ser(P)417

2907.286087 3 289–311 KSAEKPQQELVMEELKETTN(S)(S)EI 2P Thr(P)415 and Ser(P)417 or Ser(P)418

2699.224808 2 289–311 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P Thr(P)415

2699.224808 2 289–311 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P Ser(P)417

2699.224808 2 289–311 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 1P Ser(P)418

2779.191132 2 289–311 SAEKPQQELVMEELKETTNSSEI 2P Thr(P)415 and Ser(P)418



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kind of post-translational modification in the hNPFF2 receptorC terminus. Alternatively, a strong heterogeneous polyphos-phorylation could produce a large number of differentiallyphosphorylated peptides, each of them falling below the detec-tion limit of our analysis.

By using the GPS software (34) to predict putative kinaseconsensus sites on the hNPFF2 receptor, we found a high scorefor GRK2 at the TTNSS cluster. This was further confirmed byin vitro phosphorylation experiments with the purified kinase.GRK2 and the receptor C terminus (last 85 amino acids) fusedto GST were mixed for 2 h in the presence of ATP, and thereceptor fragment was then isolated by SDS-PAGE (Fig. 2B).The trypsin digest was analyzed by nanoLC-MS/MS similarlyto the full size receptor. The list of the identified phosphory-lated peptides is given in Table 1. As predicted by the consensussequence search, GRK2 phosphorylation was restricted to theTTNSS cluster. Peptides bearing a single phosphorylation onThr414, Thr415, Ser417, or Ser418 and a dual phosphorylation onThr415 and Ser417 or Ser418 were identified, confirming our sus-picion of a possible heterogeneous polyphosphorylation in thiscluster.

Taken together, these MS/MS analyses identified phosphor-ylation sites only in the C-terminal tail of the hNPFF2 receptor.Except for Ser369, all of these residues are conserved betweenhuman and rat (Fig. 1B). Therefore, in the second part of thestudy, these amino acids were mutated to alanine in the ratNPFF2 receptor to evaluate their function in the regulation ofreceptor signaling and trafficking (Fig. 1B). Thr372 and Ser373

(corresponding to Thr375 and Ser376 in human) were mutated

in the TS372AA construct (called 372 in the simplified nomen-clature). Ser395 (Ser398 in human) was substituted in the S395Amutant (395). Ser414 and Thr415 (Ser417 and Thr418 in human)were replaced by alanine in the ST414AA construct (414),whereas the whole TNST cluster was replaced in theTNST412ANAA mutant (412). Finally, two residues, Ser382 andSer386, absent from the human sequence but suspected to bephosphorylated in preliminary MS experiments on the ratreceptor, were also substituted by alanine in the S382A/S386Adouble mutant (382).

Western Blot Analysis of the Rat NPFF2 Receptor Phosphory-lation on Threonines—Before studying the role of each set ofphosphorylated residues, we used a second approach to moni-tor the rat receptor phosphorylation. Cells were treated with orwithout 1 �M 1DMe, and receptors were immunoprecipitatedusing anti-T7 tag antibodies. Serine residue phosphorylationcould not be studied because of the lack of efficient antibodies.In contrast, we identified an anti-phosphothreonine antibody(Invitrogen), which detected a strong increase in receptor phos-phorylation after 1DMe treatment (Fig. 3A). Phosphorylationwas maximal after 20 min of treatment and was then stable forat least 1 h (data not shown). It was partly inhibited in cells thathad been treated overnight with PTX, indicating that the acti-vation of heterotrimeric Gi/o proteins by the receptor was nec-essary for its optimal phosphorylation. Receptor phosphoryla-tion was also strongly reduced by a GRK2 inhibitor (�ARK1i),confirming our in vitro MS data, which suggested that thereceptor could be a GRK2 substrate. On the contrary, 1DMe-induced phosphorylation was unaffected or tended to increase

FIGURE 3. Western blot analysis of NPFF2 receptor phosphorylation on threonines. A, left panel, representative Western blots showing 1DMe-induced WTNPFF2 receptor phosphorylation on threonines in the absence or presence of G protein or kinase inhibitors. Cells were treated with 1 �M 1DMe for 30 min,receptors were immunoprecipitated using anti-T7 tag antibodies and phosphorylation detected using anti-phosphothreonine antibodies as described under“Experimental Procedures.” PThr, anti-PThr antibody; T7, anti-T7 tag antibody; �ARK1i, GRK2 inhibitor. Right panel, quantification of 1DMe-induced phosphor-ylation. The results were normalized to the total amount of immunoprecipitated receptors (anti-T7 WB) and are expressed as a percentage of the phosphor-ylation induced in the absence of inhibitors. The values are means � S.E. of three or four independent experiments. *, p � 0.05, one sample t test compared with100. B, left panel, representative Western blot showing 1DMe-induced receptor phosphorylation on threonines on WT and mutant NPFF2 receptors. Right panel,quantification of three independent experiments. Experiment, quantification, and statistics were performed as in A except that the results are expressed aspercentages of the 1DMe-induced phosphorylation of WT receptors. ***, p � 0.001.



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in the presence of W7 or chelerythrin, respectively, ruling outthe involvement of calmodulin kinase or PKC isoforms in thisprocess. Finally, after normalization to the total amount ofimmunoprecipitated receptors, threonine phosphorylation fol-lowing activation appeared to be strongly reduced in all threo-nine mutants, namely 372, 414, and 412 mutant receptors (Fig.3B). This confirms that, as suggested by MS analysis of thehuman receptor, agonist treatment induces the phosphoryla-tion of three conserved threonines in the rat NPFF2 receptor:Thr372 in the 372TS373 doublet and Thr412 and Thr415 in the412TNST415 cluster.

The Loss of Phosphorylation Sites Has a Minor Impact onNPFF2 Receptor Acute Signaling—Saturation binding experi-ments using [3H]EYF on membrane preparations from stableSH-SY5Y cell lines expressing WT or mutant rNPFF2 receptorsrevealed that removal of phosphorylation sites does not affectreceptor affinity for the agonist except for mutant 372, whichshowed a small but significant 2-fold decrease in Kd (Table 2).Expression levels of the various constructs were in the picomo-lar range (from 1.5 to 13.2 pmol/mg of membrane proteins).cAMP assays were then performed as a first test of the signalingproperties of mutant receptors (Fig. 4). All receptors were ableto fully inhibit forskolin-induced cAMP accumulation. 1DMeinhibited cAMP production with a similar high potency in cellsexpressing mutant receptors except for the 382 mutant, whichshowed a small but significant 4-fold reduction in agonistpotency. We then studied ERK activation to investigate anotherpathway located more downstream of NPFF2 receptor signal-ing. As shown in Fig. 5, treatment of SH-SY5Y cells expressingWT receptors with 1 �M 1DMe for up to 30 min induced asustained increase in ERK1 and ERK2 phosphorylation. Pre-treating the cells with PTX (100 ng/ml) for 18 h fully inhibitedthe effect of 1DMe, indicating that Gi/o protein activity isrequired to promote ERK phosphorylation, even at late timepoints (Fig. 5B). Compared with the WT receptor, mutants didnot show any significant difference in their ability to induceERK phosphorylation at any time point (two-way analysis ofvariance followed by Bonferroni post hoc tests). Althoughexperimental variability might have prevented us from detect-ing subtle changes, this result suggests that phosphorylation ofthe mutated residues is not involved in the regulation of NPFF2-dependent ERK signaling. Overall these results show that noindividual phosphorylation site/cluster is mandatory for Gi/o-dependent NPFF2 receptor signaling.

Role of Phosphorylation Sites in NPFF2 Receptor Desensiti-zation—The ability of NPFF2 receptor activation to induceintracellular calcium release was used to study acute receptordesensitization. Treatment of cells expressing the WT ratNPFF2 receptor with 1 �M 1DMe induced a strong increase inintracytoplasmic calcium ([Ca2�]i), as measured using theFluo4-AM fluorescent probe. This effect was sensitive to PTXpretreatment (data not shown). Calcium levels progressivelydecreased over the course of 1DMe perfusion, going back tobaseline levels after 5 min (Fig. 6A). This decrease was for mostpart due to homologous desensitization because cells were stillresponsive to the muscarinic agonist carbachol after 3 and 5min of 1DMe perfusion (data not shown). The desensitizationprofile was different between WT and several mutant receptors(Fig. 6A). To quantify the desensitization properties of the WTand mutant receptors, we determined the amount of [Ca2�]isignal remaining after 2.5 and 5 min of 1DMe perfusion (Fig. 6,B and C, respectively). The 372 mutant showed a slower desen-sitization, with a decrease in response that was significantlydifferent from WT after 2.5 but not 5 min of treatment. Thedesensitization of the 414 and 412 mutants was also impaired,with a [Ca2�]i signal remaining 50% above basal values after 5min of 1DMe perfusion. To confirm these results, we used adifferent desensitization paradigm based on two stimulationswith 1DMe for 1 min, separated by 10 min of washing. In cellsexpressing WT receptors, 1DMe lost 85% of its maximaleffect between the two stimulations (Fig. 6D). In contrast, car-bachol was still active (data not shown), indicating again that wewere monitoring homologous desensitization. Among all mod-ified receptors, only the 414 and 412 mutants conserved anactivity significantly higher than that of the WT in response tothe second 1DMe treatment. Overall these data identified the372TS373 and 412TNST415 phosphorylation clusters as beinginvolved in acute NPFF2 receptor desensitization, with Ser414

and Thr415 playing the major role.Role of Phosphorylation Sites in NPFF2 Receptor Internali-

zation—We next studied WT and mutant NPFF2 receptorinternalization following exposure to 1 �M 1DMe for 30 min. Asshown in Fig. 7, 1DMe treatment induced a strong internaliza-

TABLE 2Binding properties of 1DMe in cells expressing WT and mutant rNPFF2receptorsThe results are expressed as means � S.E. of at least three independent experimentsperformed in duplicate.

[3H]EYF bindingKD Bmax

nM pmol/mgWT 4.1 � 0.4 7.4 � 0.4372 2.0 � 0.2a 4.1 � 0.3382 1.9 � 0.4 1.5 � 0.7395 5.5 � 2 9.7 � 3414 5.2 � 1 13.2 � 3412 4.0 � 0.8 3.3 � 0.7

a p � 0.05 compared to WT, unpaired Student’s t test.FIGURE 4. Adenylyl cyclase inhibition following NPFF2 receptor activa-tion. Inhibition by 1DMe of forskolin (FSK)-induced cAMP accumulation inrecombinant SH-SY5Y cells expressing the WT and the different mutant ratNPFF2 receptors. Cells were treated with FSK � 1DMe for 10 min, and cAMPcontents were evaluated as described under “Experimental Procedures.”Control refers to accumulated cAMP in the absence of agonist. Each pointrepresents the mean � S.E. of at least three independent experiments per-formed in duplicate. *, p � 0.05 compared with WT, unpaired Student’s t test.



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tion of the WT receptor, which tended to disappear from theplasma membrane and was found in intracellular vesicles after30 min (46% decrease in normalized membrane level). Thiseffect was significantly inhibited by PTX pretreatment (63%inhibition), indicating that Gi/o protein activation also contrib-uted to receptor trafficking, in addition to receptor phosphor-ylation. All mutant receptors showed a trend for a lower level ofinternalization after 30 min of 1DMe. However, the impair-ment was only significant for mutant receptors 395 (74% inhi-bition), 414 (72%) and 412 (78%) (Fig. 7). The 412TNST415 clus-ter thus appears to be important for both desensitization andinternalization. In contrast, the 372TS373 doublet contributes todesensitization without playing a major role in internalization,whereas Ser395 phosphorylation is only necessary for efficientinternalization.

The phosphorylation of GPCR C terminus contributes tointernalization through the recruitment of �-arrestins. We thusmonitored this recruitment by transiently transfecting �-arres-tin2-GFP in our cells. GFP fluorescence was homogeneouslydistributed in the cytoplasm in control cells (Fig. 8). Activationof WT receptors induced a strong clustering of �-arrestin2-GFP, resulting in the detection of numerous intracellular fluo-rescent punctae after 30 min of 1DMe treatment. �-Arrestin2recruitment was also evident in mutant receptors. However, incells expressing the internalization-deficient mutant receptors395 and 414, �-arrestin2 fluorescence was present at the plasma

membrane in addition to intracellular vesicles (Fig. 8), indicat-ing that although it is recruited, the protein is less efficient inpromoting internalization.

DISCUSSION

In this study, we combined mass spectrometric analysis andsite-directed mutagenesis to analyze for the first time the phos-phorylation pattern of the human and rat NPFF2 receptors andthe role of the various phosphorylation sites in rat receptorsignaling, desensitization, and trafficking in a SH-SY5Y modelcell line. More precisely, we identified the major, likely GRK-dependent, phosphorylation cluster responsible for acutedesensitization: 412TNST415 at the end of the C terminus of thereceptor. In addition, our study is the first to fully characterizerat receptor signaling.

In our cell model, NPFF2 receptors appear to couple to PTX-sensitive Gi/o proteins to inhibit adenylyl cyclase, induce intra-cellular calcium release, and activate ERK1/2. Negative cou-pling to adenylyl cyclase is consistent with what has beendescribed for human and mouse receptors (35, 36). However,the potency of 1DMe is increased by more than 1 order of mag-nitude in the rat species. ERK activation by NPFF2 receptors hasbeen demonstrated previously in rat and human cell lines thatwere shown to endogenously express the receptor (14, 37, 38).Here we confirm the specificity of this effect by using recombi-nant cells. We also show that ERK activation by 1DMe lasts for

FIGURE 5. ERK1/2 activation induced by NPFF2 receptor activation. A, representative Western blots showing 1DMe-induced ERK activation in SH-SY5Y cellsexpressing WT and mutant NPFF2 receptors. Cells were treated with 1 �M 1DMe for the indicated time and phosphorylated (pERK), and total ERK 1 and 2 weredetected as described under “Experimental Procedures.” B, quantification of 1DMe-induced ERK phosphorylation in cells expressing WT receptors pretreatedor not with PTX (100 ng/ml, 18 h). The results were normalized to the total amount of ERK and are expressed as percentages of the basal phosphorylation at time0. C, quantification 1DMe-induced ERK phosphorylation in cells expressing WT or mutant NPFF2 receptors. The results are expressed as in B. The values aremeans � S.E. of three or four independent experiments. p44, ERK1; p42, ERK2.



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at least 30 min. Similarly to several other Gi/o-coupled recep-tors (39), ERK activation appears to be PTX-sensitive and thusfully dependent on G protein activation. The involvement of�-arrestins in the late phase of ERK phosphorylation remains to

be tested. Finally, to the best of our knowledge, our study is thefirst one to demonstrate a direct effect of NPFF2 receptor acti-vation on intracellular calcium release without the need forconcomitant activation of a Gq-coupled receptor (31).

FIGURE 6. Desensitization of 1DMe-induced intracellular calcium release. A, representative traces showing intracellular calcium release during 5 min oftreatment with 1 �M 1DMe in cells expressing WT or mutant NPFF2 receptors. Calcium levels were monitored using the fluorescent Ca2� indicator Fluo-4-AM,and fluorescence intensity was normalized using the average intensity measured during 20 s before addition of the agonist (F/F0). B and C, intracellular calciumlevel after 2.5 and 5 min of 1DMe treatment, respectively, compared with the peak of release. D, response to 1 min treatment with 1 �M 1DMe compared withthe response to a first stimulation performed 10 min before. The values are means � S.E. of three or four independent experiments. *, p � 0.05; **, p � 0.01; ***,p � 0.001 compared with WT; one-way analysis of variance followed by Bonferroni post hoc tests.

FIGURE 7. 1DMe-induced receptor internalization. Representative confocal images of receptor internalization. Cells expressing WT or mutant NPFF2 recep-tors were treated with 1 �M 1DMe for 30 min at room temperature before formaldehyde fixation and anti-T7 immunofluorescence. Confocal images were takenwith a laser scanner confocal microscope and quantified as described under “Experimental Procedures.” The results in the histogram are expressed as means �S.E. of at least three independent experiments. *, p � 0.05 compared with WT; one-way analysis of variance followed by Bonferroni post hoc tests.



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A mass spectrometry strategy was used to map the phosphor-ylated residues in the human and rat NPFF2 receptors. The highsequence coverage obtained with the human receptor enabledus to study all the putative phosphorylation sites, except Thr157

in the second intracellular loop. Because Western blot datashowed that threonine phosphorylation is strongly reduced bymutation of Thr372, Thr412, and Thr415 to alanine, we canassume that Thr157 is not phosphorylated. We can thus con-clude that among 19 putative phosphorylation sites in thehuman receptor intracellular domain, only eight residues,located in the C-terminal part, can be phosphorylated either inthe basal state or after agonist treatment. Six residues are con-served in the rat (and also the mouse) sequence (Fig. 2): Thr372

(375 in human), Ser373 (376), Ser395 (398), Thr412 (415), Ser414

(417), and Thr415 (Ser418). Intriguingly, although these con-served phosphorylation sites represent the best candidates formediating NPFF2 receptor regulation, species specific siteswere also identified in human (Ser369) and rat (Ser382 andSer386). The rat-specific residues did not play a significant rolein receptor desensitization and internalization, but as discussedabove, they might contribute to subtle species differences in Gprotein coupling. Once phosphorylation sites are identified, animportant question is whether these modifications are presentin the basal state or result from receptor activation. Label-freerelative quantification of the MS data clearly indicated that thephosphorylation of Thr375 and Ser376 is increased in the humanreceptor after 1DMe treatment. Unfortunately, technical limi-tations did not allow us to confidently quantify the effect ofagonist treatment on the remaining four conserved residues.However, in vitro experiments using purified GRK2 and thehuman NPFF2 receptor C terminus fused to GST suggested thatthe 414 – 418 cluster is a GRK substrate, in agreement with thepresence of acidic amino acid in both the N and C termini ofthis region (40). Taken together our MS data support the ago-nist-induced phosphorylation of the 414TTNSS418 by GRK2and of the 375TS376 doublet by an unknown kinase in the humanNPFF2 receptor.

Agonist-induced phosphorylation of these two loci was con-firmed in the rat sequence using anti-phosphothreonine anti-bodies. Mutating Thr372, Thr412, and/or Thr415 to alanine

strongly reduced the amount of phosphothreonine after 1DMetreatment. In agreement with the in vitro data, part of this phos-phorylation was prevented in the presence of a GRK2 inhibitor.We also showed by using PTX that G protein activation con-tributed to agonist induced phosphorylation. GPS analysis (34)of the sequence surrounding Thr372 revealed that the best can-didates to phosphorylate this residue were PKC and calmodulinkinase. However, the calmodulin inhibitor W7 and the PKCinhibitor chelerythrin did not reduce phosphorylation of recep-tor threonines. On the contrary, chelerythrin tended toincrease it, maybe by counteracting the inhibitory effect of PKCon a kinase responsible for receptor phosphorylation. BecausePKC is known to inhibit GRK5 activity (41), the latter couldthus be suspected to phosphorylate the 372TS373 doublet.Therefore, GRKs could mediate agonist-induced phosphoryla-tion of both the 372TS373 doublet and the 412TNST415 cluster. Gprotein activation could contribute to this effect via the G�subunit for GRK5/6 (42) and the G�� subunits in the case ofGRK2/3 (43). siRNA knockdown of each GRK subtype shouldbe combined with the analysis of the phosphorylation of indi-vidual threonine mutants to confirm these hypothesis.

The removal of individual conserved phosphorylation sitesdid not strongly affect NPFF2 receptor signaling. Most mutantreceptors remained able to activate Gi/o-dependent signalingpathways with equivalent potency, indicating that NPFF2receptor phosphorylation is mainly involved in receptor regu-lation following G protein activation. However, the 382 mutantshowed a 4-fold decrease in potency in the cAMP assay. Thissuggests that the phosphorylation of Ser386, present only in therat sequence, could be in part responsible for the increase inpotency observed for the rat receptor compared with its humanand mouse counterparts, as mentioned above. One might alsosuggest that the lower potency of the 382 mutant is due to itslower expression level. However, this explanation appearsunlikely because the Bmax of the 412 mutant is also more than2-fold lower than that of the WT, whereas its potency isnot lower, demonstrating that there is no correlation betweenEC50 and Bmax in the cAMP assay under our experimentalconditions.

Two agonist-regulated phosphorylation loci were foundimplicated in acute receptor desensitization. Mutation of the372TS373 doublet significantly slowed down desensitization.However, the main phosphorylation site responsible for recep-tor desensitization appears to be the 412TNST415 cluster at theextreme C terminus that we identified as a GRK2 phosphory-lation site in vitro. Alanine mutation within this cluster had astrong impact on desensitization, similar for the 412 and 414mutants, suggesting that the principal residues responsible forhomologous desensitization of the NPFF2 receptor are Ser414

and Thr415. Again, the observed changes cannot be attributedto changes in expression level because they are similar for thetwo mutants, whereas their Bmax are twice lower (412) andtwice higher (414) than that of the WT receptor.

Agonist-induced receptor internalization was affected byalanine mutation of some sites or clusters, but there was nodirect correlation between the behavior of a given mutantin terms of desensitization and of internalization. The412TNST415 cluster played a major role in both events, whereas

FIGURE 8. 1DMe-induced �-arrestin2 recruitment. Representative confo-cal images of �-arrestin2-GFP distribution. Cells expressing WT or mutantNPFF2 receptors were transiently transfected with �-arrestin2-GFP andtreated 48 h post-transfection with 1 �M 1DMe for 30 min at room tempera-ture before formaldehyde fixation and imaging of the GFP fluorescence. Con-focal images were taken with a laser scanner confocal microscope asdescribed under “Experimental Procedures.”



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preventing phosphorylation of the 372TS373 doublet had a sig-nificant effect on desensitization but did not significantly affectinternalization. On the contrary, the S395A mutant desensi-tized normally but showed impaired internalization. This is inagreement with previous data showing that residues involved inGPCR desensitization and internalization do not strictly over-lap (44 – 47). Thus in contrast with desensitization, whichdepends on the phosphorylation of a particular cluster, our dataconfirm the lack of a “master” phosphorylation event (48) suf-ficient to trigger GPCR internalization. The case of the mu opi-oid receptor offers a good illustration of this concept. The maindesensitizing event is the phosphorylation of a single residue,Ser375 located in a STANT phosphorylation cluster near theend of the receptor C terminus. However, this modification isnecessary but not sufficient to induce internalization. Agonistssuch as morphine, which induce Ser375 phosphorylation but donot efficiently trigger the phosphorylation of additional resi-dues in the C terminus, produce desensitization without signif-icant internalization (49). As previously shown for the humanreceptor (2, 18), we show here that the rat NPFF2 receptor acti-vation induces the recruitment of �-arrestin2. The interactionof arrestin with GPCR depends in part on phosphorylated res-idues in the C terminus making individual contacts with thescaffolding protein, each contributing to the stability and theconformation of the complex (24, 50). It is thus probable thateach of our mutants, despite having retained the ability torecruit �-arrestin2, interacts with the scaffolding protein withlower affinity, thus reducing the efficiency of the internalizationprocess.

In conclusion, the present work identified the phosphoryla-tion pattern of NPFF2 receptors. Further characterization of theresidues involved in desensitization (412TNST415 cluster and372TS373 doublet) and internalization (412TNST415 cluster andSer395) of the receptor indicated that these two regulatory pro-cesses do not rely on strictly overlapping post-translationalmodifications. Finally, Ser414 and Thr415 appear to be the bestcandidates to develop phospho-specific antibodies to detectactivated NPFF2 receptors.

Acknowledgments—We thank Dr. S. Krief for providing the rat NPFF2

receptor, Prof. J. Benovic (Thomas Jefferson University, Philadelphia,PA) for providing purified GRK2 protein, and Dr. S. Allouche (Uni-versité de Caen, Caen, France) for providing �-arrestin2-GFP.

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doi: 10.1074/jbc.M114.612614 originally published online October 17, 20142014, 289:33754-33766.J. Biol. Chem.

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AUTEUR : Lauriane BRAY

TITRE : IDENTIFICATION DES PHOSPHORYLATIONS IMPLIQUEES DANS LA REGULATION DE

L’ACTIVITE DU RECEPTEUR NPFF2

DIRECTEURS DE THESE : Dr Catherine MOLLEREAU-MANAUTE, Dr Lionel MOULEDOUS

LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : vendredi 21 novembre 2014, Université Paul Sabatier, Toulouse III

RESUME :

L’activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) induit la phosphorylation de résidus Serine (S) et Thréonine (T) dans les domaines intracellulaires des récepteurs. Ces phosphorylations sont impliquées dans la désensibilisation du récepteur, son internalisation mais aussi dans le choix de la voie de signalisation activée. Le neuropeptide FF appartient à une famille de neuropeptides impliqués dans la modulation de l’activité analgésique des opioïdes en activant le récepteur NPFF2, un récepteur couplé aux protéines Gi. Il inhibe l’adénylyl cyclase, active la voie des MAP Kinases et la libération de calcium intracellulaire. Afin d’étudier le rôle des phosphorylations induites par l’agoniste dans la régulation de l’activité du récepteur, nous avons déterminé par spectrométrie de masse le profil de phosphorylation des récepteurs humain et de rat exprimé dans les cellules SH-SY5Y. Les phosphorylations ont été identifiées dans l’extrémité C-terminale (T372/S373, S382, S386, S395, T412 et S414/T415). La phosphorylation in vitro du fragment C-terminal du récepteur humain par la GRK2 a permis d’identifier le cluster 414TTNSS418 comme substrat de la kinase. Les sites conservés entre espèces (TS372AA, S395A, TNST412ANAA, ST414AA) ainsi que les sites spécifiques au rat (S382A/S386A) ont été remplacés par des alanines et les récepteurs de rat mutés transfectés dans des cellules SH-SY5Y. Leurs propriétés de liaison, signalisation, désensibilisation et internalisation ont ensuite été comparées au récepteur sauvage (WT). Aucune des mutations réalisées n’affecte la capacité du récepteur à inhiber l’adénylyl cyclase excepté la mutation des résidus rat-spécifiques. Ce qui suggère un rôle de ces résidus dans l’efficacité du couplage à la protéine G. Chacun des récepteurs mutés active la voie des MAPK de façon comparable au WT. L’activation de cette voie est donc indépendante de la phosphorylation des sites mutés. La libération de calcium intracellulaire induite par activation du récepteur a été examinée par imagerie calcique. Une diminution de la désensibilisation a été observée pour trois des récepteurs mutants: TS372AA, ST414AA et TNST412ANAA. Le rôle des phosphorylations dans l’internalisation du récepteur après stimulation par l’agoniste 1DMe a été évalué par immunocytochimie. L’internalisation des récepteurs S395A, ST414AA et TNST412ANAA est diminuée par rapport au WT. Ces sites de phosphorylation sont donc impliqués dans le trafic intracellulaire du récepteur. Pourtant, ces récepteurs restent capables de recruter la β-arrestine-GFP, probablement avec une efficacité moindre. La phosphorylation des résidus T372, T414 et T415 a été confirmée par Western Blot comme étant induite par liaison du 1DMe. La phosphorylation du récepteur WT est diminuée après traitement à la toxine pertussique et/ou à l’inhibiteur βARK1, montrant le rôle de Gi et de la GRK2 dans la phosphorylation du récepteur. Parallèlement à ce travail, afin de produire de nouveaux outils pour l’étude du récepteur NPFF2, nous avons caractérisé un ligand peptidique : le YE(Bpa)WSLAAPQRFNH2. Ce ligand iodable se lie au récepteur avec une haute affinité et de façon irréversible après irradiation aux UV. Cette étude a permis d’identifier par spectrométrie de masse et Western Blot les résidus phosphorylés suite à l’activation du récepteur NPFF2 par l’agoniste ainsi qu’une des kinases impliquées. Les études fonctionnelles réalisées après mutagénèse montrent l’implication du résidu S395 et du cluster TNST412 dans l’internalisation du récepteur, des résidus TS372 et du cluster TNST412 dans sa désensibilisation. Aucun des sites conservés, mutés ne joue de rôle dans la signalisation du récepteur, alors que les sites rat-spécifiques semblent jouer un rôle dans l’efficacité du couplage à la protéine G. Ces résultats apportent une nouvelle preuve du rôle spécifique de la phosphorylation de résidus particuliers dans la régulation de l’activité des RCPG et permettent d’envisager la production d’anticorps phosphospécifiques destinés à l’étude in vivo de l’activation du récepteur NPFF2.

MOTS CLES : Récepteur couple aux protéines G, neuropeptide FF, phosphorylation, spectrométrie de masse, mutagénèse, signalisation. DISCIPLINE : Pharmacologie LABORATOIRE : Institut de pharmacologie et de biologie structurale, IPBS CNRS-UMR 5089 205 Route de Narbonne, 31077 Toulouse cedex 4.

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