7 cinetique et stochiometrie
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Cinétique et stochiométrie
A. GarnierGCH-2103A-2010
Cinétique et stochiométrie
Définition Les termes de base Les modes d’opération Les relations de base Détermination théorique Détermination expérimentale
– Taux initiaux– Cuvée– Chemostat– Stop flow
Croissance cellulaire - variables
X S PTaux de variation(kg/(m3.s)
dX/dt dS/dt dP/dt
Taux de production /consommation
rx rs rp
Taux spécifique(kg/(kg.s)
= rx/X qs= -rs/X qp= rP/X
Rendement (kg/kg) Yx/s = rx/rs = /qp
Yp/x, Yp/s
Mode d’opération
Système fermé: cuvée (batch)
•Aucune entrée ou sortie
•Régime transitoire
•dX/dt = rX, dS/dt = rS
•À t = 0, X = X0, S = S0
Cuvée alimentée (Fed-batch)
•Alimentation seulement
•Régime transitoire
•À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0
•F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc
•Si S est constant, le sera aussi, = c
F(t), Sin
V, X, S
Chemostat (continu, CSTR)
F, Sin
V, X, S, P
F, S, X, P
•Une entrée, une sortie
•Mélange idéal: Xout = X, Sout = S, Pout = P
•Après une période initiale d’adaptation, ce système atteindra un régime permanent:
V= cst, X= cst, S= cst, P= cst
Chemostat avec recirculation
F F(1+w)
V, X
Bioréacteur Décanteur
F(1+w)
wF, Xx
Fc, Xc
Fex, Xx
•Permet de concentrer les cellules dans le bioréacteur•Permet de repousser le lavage•Développement pour X seulement
Croissance cellulaire –type de modèles
STRUCTURÉ/SÉGRÉGÉ
NON-STRUCTURÉ
STRUCTURÉ
NON-SÉGRÉGÉ
+ simple
SÉGRÉGÉ
Structuré: Tient compte de métabolites intra-cellulairesSégrégé: Tient compte d’une distribution de population
Modèles de croissance
Du plus simple au plus compliqué– Exponentiel (ordre 0!!)– Linéaire (logistique)– Monod– Autres
Phénomènes connexes– Maintenance– Mortalité
Production– Luedeking-Piret combiné aux différents modèles
Modèle enzymatique - Monod
SKS
S
MAX
XdtdX
XYXqsdtdS
SX
/
-Une variable indépendante, 3 variables dépendantes, trois équations = Une solution!
(1)
(2)
(3)
-Pour un système fermé (cuvée) en supposant YX/S constant:
Modèle de Monod
Équation 3 n’est peut-être pas nécessaire:
dtdX
YdtdX
YX
YdtdS
sxsxsx ///
11
Xmax-X = Yx/s * S
Alors:
XXX
YK
XXY
dtdX
MAXSX
S
MAXSX
MAX
)(1
)(1
/
/
X
XXYKXX
MAXSXS
MAXMAX
)()(
/
Modèle de Monod
XXXYK
XXdtdX
MAXSXS
MAXMAX
)()(
/
t
MAX
X
XMAX
MAXSXS dtdXXXX
XXYK0
/
0 )()(
t
MAX
X
XMAX
MAX
MAX
SXS dtdXXXX
XXXXX
YK0
/
0 )()(
)(
Modèle de Monod
t
MAX
X
XMAX
SXS dtdXXXXX
YK0
/
0
1)(
axax
xax)ln(ln
)(1
Sachant que:
tXX
XXXYK MAX
X
XMAX
MAXSXS
0
)ln()ln(ln/
tXXXX
XYK
XX
XXYK
MAXMAX
MAX
MAX
SXS
MAX
MAXSXS
)()(lnln
0
/
0
/
Modèle de Monod
tXXXX
XYK
XX
XXYK
MAXMAX
MAX
MAX
SXS
MAX
MAXSXS
)()(lnln
0
/
0
/
Modèle de Monod
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8
temps (-)
X (-)
0
4
8
12
16
20
24
S (-)S = (Xmax-X)/Yx/s
Données
max= 1
Ks= 5
Yx/s= 0,5
So= 20
Xo= 0,1
Détermination théorique
Cinétique…
Rendement: modèles structurés (stochiométriques et autres)
Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire
[C6H12O6]n C6H12O6 G3P
glycerol
purines
pyruvate Acétyl-CoA
lactate
Acides gras
éthanol
Lipides
Ac.aminéspyrimidinesCycle de
Krebs
Acides nucléiques
protéinesNAD+ATPH2O
NADHADPO2
Chaîne respiratoire
Le catabolisme génère de l’ATP et du NADH
Modèle stochiométrique (cliquez ici)
Autres valeurs du coefficient de rendement
(Bailey&Ollis, McGraw-Hill, 1986)
Détermination expérimentale
Coefficient de rendement
Cinétique– Taux initiaux– Stop-flow– Cuvée– Chemostat
Détermination expérimentale du coefficient de rendement - YX/S constant
tXXXX
XYK
XX
XXYK
MAXMAX
MAX
MAX
SXS
MAX
MAXSXS
)()(lnln
0
/
0
/
Modèle de Monod
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8
temps (-)
X (-)
0
4
8
12
16
20
24
S (-)S = (Xmax-X)/Yx/s
Données
max= 1
Ks= 5
Yx/s= 0,5
So= 20
Xo= 0,1
Estimation des rendements en cuvée
Modèle de Monod -X vs S
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20
S (-)
X (-)
Avec des données de t, X, S, on peut calculer, Yx/s par un graphe de X vs S:
Ici, Yx/s = 0,5
Effet de maintenance
S = S(croissance) + S(maintenance)
rS = 1/YG* rX + m * X
qs = 1/YG* + m
1/Yx/s = qs/1/YG + m/
Effet de maintenance
1/Yx/s = qs/1/YG + m/
1/Yx/s vs 1/mu
22,05
2,12,15
2,22,25
0 0,5 1 1,5 2 2,5
1/mu
1/(Y
x/s)
Effet de mortalité
Le taux de mortalité cellulaire:
rd = - kd*X où kd=cste
Donc en cuvée:
dX/dt = *X – kd*X = (– kd)*X
En général, on néglige la maintenance et la mortalité en cuvée
Mécanisme de débordement: effet sur la cinétique et le rendement
glutamine
-Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma)
GLUCOSE PYRUVATE
TCA cycle,resp. chainlactate
glucose pyruvate
GLUTAMINE
GLUTAMATE
OU
NH3
NH3
glutamate
Détermination de la cinétique – Taux initiaux
Évaluation de qglc, qgln, qlact et qNH3
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Méthode de flux arrêté (Stopped-flow):
Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés.
Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop ».
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Moteur
Mélangeur
LumièreDétection
MoteurMoteur
Temps mort :
Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange)
De l’ordre de 1 milliseconde.
Réactif 1 Réactif 2
Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de :
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Photodiodes Dichroïsme circulaire Tube photomultiplicateur Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :
Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires.
Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :
Types d’étanchage :
Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M)
Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.
Moteur
Mélangeur
Moteur
Mélangeur
Récupération des fractions
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes
Chambre réactionnelle linéaire
Réactif 1 Réactif 2
Agent étanchant
Spectroscopie de masse « en ligne » Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse Électrophorèse sur gel, Comptage à scintillation, etc…
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Les fractions recueillies sont analysées par des méthodes non-optiques :
Estimation des paramètres de Monod en cuvée
Puis on peut reformuler l’équation de X pour isoler des termes reliés linéairement:
tXXXX
XYK
XX
XXYK
MAXMAX
MAX
MAX
SXS
MAX
MAXSXS
)()(lnln
0
/
0
/
÷t÷t
tXX
XXXX
XYK
tXX
MAX
MAX
MAX
SXSMAX
00/0
ln)()(lnln
Y = b + m X
Monod – estimation des paramètres
tXX
0
ln
tXX
XXXX
MAX
MAX
00
ln)()(ln
Modèle de Monod - Estimation des paramètres
y = 0,2475x + 1
0,50,550,6
0,650,7
0,750,8
0,850,9
-1,9 -1,7 -1,5 -1,3 -1,1 -0,9 -0,7 -0,5
max = 1
m = 0,2475 = Ks*Yx/s/Xmax
Ks= 0,2475*10,1/0,5
Ks= 5
Utilisation du Chemostat pour la détermination des paramètres cinétiques
Relation cinétique, par exemple Monod:
DSKS
S
MAX
1D
KD
KDSMAX
S
MAX
S
Modèle de Monod -=D vs S
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 5 10 15 20 25
S (-)
=
D(-)
Modèle de Monod - S vs D
0
5
10
15
20
25
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
D (-)
S
Prochain labo: Cuvée alimentée (Fed-batch)
•Alimentation seulement
•Régime transitoire
•À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0
•F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc
•Si S est constant, le sera aussi, = c
F(t), Sin
V, X, S
Cuvée alimentée (Fed-batch)
3 bilans seront nécessaires pour obtenir un modèle de ce système:
F
dtdV
dtFVVt
00
tV
VdtFdV
00
VXdt
XVd
VX
dtXdV
dtVdX
F
…. )()()()()()( tVtXdt
tXdtVtFtX
Cuvée alimentée (Fed-batch)
VXdt
VXd
dt
VXVXd
c
t
c
XV
VXdtVXd
VX 000
1
tVXVX
c
00
ln tceVXVX 00
Cuvée alimentée (Fed-batch)
VXY
SFdt
VSd
sx
cin
/
VXY
SFdtVdS
dtSdV
sx
cin
/
F0
VXY
SSFsx
ccin
/
cinsx
c
SSYVXF
/
t
cinsx
c ceSSY
VXF
/
00
Cuvée alimentée (Fed-batch)
tceVXVX 00
t
cinsx
c ceSSY
VXF
/
00
dtFVVt
00 dte
SSYVXVV
t t
cinsx
c c
0
/
000
11
/
00
t
cinsx
ceSSY
XVV
11/
0
0
t
cinsx
t
c
c
eSSY
XeXX